Cours N°7 et 8, 2014 - Université François Rabelais

Biologie Cellulaire
&
Biologie Moléculaire
Cours n° 7-8 : mardi 30 septembre et mardi 7 octobre 14h-16h
Chap. IV Cycle cellulaire
L3
UE 5.2 EP1
2014-2015
183
Cycle cellulaire
Quiescence
Go
Différenciation
184
Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours
Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Technique 5 : Analyse des phases du cycle cellulaire par
Cytométrie
Cytométrie
1
Incubation des cellules avec un fluorophore (intercalant de l’ADN)
2
Analyse de l’intensité de fluorescence émise par cellule (proportionnelle à
la quantité d’ADN)
3
Représentation nombre de cellules en fonction de l’intensité de
fluorescence
4
Détermination du pourcentage de cellules en fonction des phases du cycle
Objectif : connaître le « statut prolifératif » d’une population cellulaire ou
la proportion des cellules dans chacune des phases du cycle.
185
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Analyse du cycle cellulaire et synchronisation
Quantité d’ADN par cellule
2N
4N
1
2
186
Régulation du cycle cellulaire
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Epigénétique (état de méthylation de H4K20)
Organisation génomique Histones
Régulation de l’expression PCNA, Orc1
Phosphorylation/déphosphorylation cdk-cyc
Interactions protéine/protéine cdk-cyc, p53
Intégration (molécules, complexes) p53
187
Cell cycle regulated establishment of the different H4K20 methylation states.
HMT
Protection des H4K20me1
SUV4-20H1
SUV4-20H2
HMT
H4K20me3
H4K20me1 sur nouvelles histones
H4K20me2
Peu de H4K20me1 sur nouvelles histones
Jørgensen S et al. Nucl. Acids Res. 2013;nar.gkt012
© The Author(s) 2013. Published by Oxford University Press.
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188
Technique 6 : Northern blot
Northern blot
analyse des ARN (principalement les ARN messagers)
1
Purification d’ARN totaux ou d’ARN polyadénylés
2
Dénaturation
3
Electrophorèse (dénaturante) en gel d’agarose
4
Transfert sur membrane
5
Hybridation avec une sonde nucléotidique marquée (radioactive, …)
6
Révélation (autoradiographique, …)
Contrôles
• Coloration bromure d’éthydium du gel d’agarose
(vérification de l’état des ARN et normalisation des quantités déposées)
• Hybridation avec un gène de ménage
(validation de l’expérience)
189
Northern blot
Régulation de l’expression de Orc1
Heures après
induction de la
prolifération
cellulaire
Northern blot
migration
Sonde Orc1
+
Sonde GAPDH
Contrôle :
Dépôts des ARN totaux
ARNr 28S
ARNr 18S
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Phosphorylation/déphosphorylation
Un facteur universel : le MPF
M-Phase promoting factor
Cdk : « Cycline dependant kinase »
Cycline
Phosphoryle sérine et thréonine
P34
Cdc2
cdk1
Cycline B
Site actif
Deux familles : eucaryotes supérieurs
Cdk 1 à 20
Cyclines A – L , O, T, Y
Jeux de régulations multiples
191
Régulation du cycle cellulaire par les
complexes hétérodimériques cdk-cyclines
c-fos, c-jun
192
•  Régulation de l’activité des complexes cdkcyclines
–  Localisation
–  Phosphorylation
–  Inhibiteur
•  Substrats
–  Lamine
–  Origines de réplication
–  pRb
193
P
Régulation par localisation : Cycline B
G2/M
S
G1
Accumulation cellulaire
Localisation : cytoplasme puis noyau
Activité MPF
194
P
Régulation du MPF
cdk7-cycline H
CDKI
kinase du système de
contrôle de l’intégrité de l’ADN
Site de fixation
de la protéine 14-3-3
Réponse aux lésions ADN
et
au stress environnemental
195
Substrat du MPF : division cellulaire
Enveloppe nucléaire
Membrane interne
Lamina nucléaire
Lamines A, B et C
Chromosome (interphasique)
Séquence de 10 000 pb
Domaines régulateurs
Matrice nucléaire
Séquences d’insertion de 140 pb
(dans la matrice nucléaire ex. boucle 1 :
)
5
4
3
2
1
Lamines : substrat du MPF cdk1-cycB
dissociation de la lamina nucléaire
destruction de l’enveloppe nucléaire
nécessaire pour la division cellulaire
Phosphatase
196
Régulation du cycle cellulaire par les
complexes hétérodimériques cdk-cyclines
Ex. Désactivation des origines de réplication : phosphorylation de cdt1 par cdk2cyc A pour induire sa dégradation et cdc6 pour induire sa relocalisation
cytoplasmique.
197
cdk-cycline : phosphorylation de Rb
Phosphatase
(Lysine ou) Histone Méthyl Transférase : HMT
(Lysine ou) Histone Méthyl Transférase HMT
cdk1
cyclines A, D et E
ADN polymérase
α
histone H2A
PCNA
Rb
Topoisomérase II
MSH2
Régulation : phosphorylation + méthylation
198
Intégration des régulations
HMT : SET7
Méthylation
1• de protéines non-histone
(contrôle de l’expression génique)
2• des histones
(H3K4: activation)
Phosphorylation/Méthylation pour pRb
Méthylation : Histone/non histone
Contrôle de l’activité de E2F
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199
Substrats de méthylation non histones de la
HMT : SET7
HDM
HDM
HMT SET7 monométhyle H3K4 : chromatine active
mais aussi des protéines non-histone pour le contrôle de
l’expression génique :
SET7 méthyle p53 (sur K372) entrainant sa stabilisation
et sa localisation nucléaire
SET7 méthyle (sur K142) DNMT1 (DNA cytosine-5
methyltransferase 1) entrainant sa dégradation.
HAT
SET7 méthyle le récepteur des estrogènes (sur K302)
favorisant son action.
Action contrebalancée par la « Lysine-Spécifique
Déméthylase » (LSD).
200
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Intégration miARN et cycle cellulaire bis
C-myc : Facteur de Transcription pour un nombre important de gènes :
exemples EF2 et miR-17
SWI/SNF-like complex
C-myc peut recruter
Sur les promoteurs :
HAT
ARNm
protéine
Régulation précise de la synthèse de E2F pour éviter l’accumulation
de « Double Strand Breaks » suivi d’un blocage du cycle cellulaire
201
Hypothèse : miRNAs (miR-17) coordonnent la progression dans le cycle cellulaire
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P
Molécule intégrative : p53
Lésion ADN
p53
Interactions
complémentaires
p53
Transcription
Apoptose
P53-RP-A
P53-ADNlésé
Médiator
Répresseur de
nombreux gènes
Complexes avec TF IID
(p53-TBP, p53-TAF)
Facteur de transcription
Fixe module p53
Induit expression : p21 un inhibiteur de cdk
Inhibiteuer de cdk4-cycD, cdk2-cycE
Ne reconnaît pas cdk7-cycH et peu MPF
Induit inhibition de la phosphorylation de Rb
Arrêt du cycle cellulaire en G1
202
Molécule intégrative : p53
Acétylation
interactions
Méthylation
Phosphorylation
K372
K382ac
HMT : SET7/9 LSD
HDAC : SIRT1
interactions
203
Cartographie des « MPT » de p53
204
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Organisation génomique : gènes des histones
• 
• 
• 
• 
Domaine
Amas ou cluster Synthèse des histones nécessaire en phase S
Répétition
Extrémité 3’ non codante des messagers
205
Domaine régulateur : « Histone »
206
P
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Flêches : sites hypersensibles à la Dnase I
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207
Répétition en tandem des domaines « histones »
208
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Structure des ARNm « histones »
Pas de d’extension poly-adénylée
AAAA
©
5’ non codant
partie codante
3’ non codant
Séquence 3’ non-codante
régulatrice de la stabilité
de l’ARNm « histone »
Couplage avec la réplication
209