Functional Characterization of Auricular Cartilage in Tissue

Diss. ETH No. 22374
Functional Characterization
of Auricular Cartilage in
Tissue Engineering
and Regenerative Medicine
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Luc Georges Nimeskern
M.Sc. ETH BMT, Ingénieur des Arts et Manufactures
born on 13.04.1986, citizen of France
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ralph Müller
Examiner
Prof. Dr. Paul Gatenholm Co-examiner
Dr. Kathryn S. Stok
2015
Co-examiner
Summary
Auricular (AUR) cartilage, the main component of the external ear, is classified as
elastic cartilage. Similar to hyaline cartilage, elastic cartilage is an avascular soft
tissue maintained by chondrocytes and composed of a hydrated network of typeII collagen and proteoglycan aggregates (PGA). Elastic cartilage is, however, the
only cartilage subtype that displays additionally an extensive network of branching
and interconnecting elastin (ELN) fibers. It is therefore expected to present unique
mechanical properties.
The growing interest in tissue-engineering (TE) in the last decade has led numerous research groups to focus on TE strategies aimed at regenerating damaged ear
cartilage. Indeed AUR cartilage TE is hypothesized to circumvent issues encountered during state-of-the-art ear reconstructive surgery. Namely, it is expected to
reduce donor site morbidity, lower the rejection risk as compared to alloplastic implants, and improve patient satisfaction thanks to TE implants with patient-specific
3D ear shapes.
Whereas many investigations have been performed on the mechanical properties of
hyaline or fibrocartilage, little information is available on ELN-rich AUR cartilage.
Thus, several key questions remain to be addressed in order to target TE outcomes
for AUR cartilage that match both the functional properties and the appearance,
i.e. the 3D shape of the native tissue. Imaging strategies to acquire the desired
patient-specific ear cartilage shape should be developed. The specific mechanical
and biochemical characteristics of native AUR cartilage, especially human AUR
cartilage, remain to be characterized. Appropriate cell sources and biomaterials
able to provide a suitable environment for cell proliferation and ECM production
must be identified.
Therefore three aims, to be addressed in this work, are formulated:
1. to develop an architectural, mechanical and biochemical map of AUR cartilage
vii
Summary
in order to define requirements for TE purposes,
2. to investigate the role of elastin in maintaining mechanical integrity and shape
in AUR cartilage, and
3. to mechanically evaluate and monitor tissue-engineered AUR cartilage.
In order to address the first aim, an imaging strategy for acquiring patient-specific
ear cartilage shape combining clinical MRI imaging (fat saturated spoiled gradientecho) with manual segmentation is proposed and evaluated. Good inter- and intrarater reproducibility of volume (Cg.V), surface (Cg.S) and thickness (Cg.Th) are
measured demonstrating the precision of the method (precision errors <4% for Cg.S
and <9% for Cg.V and Cg.Th). Good intraclass correlations for Cg.V and Cg.S
(>0.82), but low for Cg.Th (<0.23) due to similar average Cg.Th between patients
are obtained, however Pearsons coefficients show that the ability to detect local
cartilage shape variations is unaffected. Additionally, good correlation (R > 0.95)
between cadaveric auricles imaged using the proposed protocol and high resolution
micro-CT demonstrates the accuracy of the method. In conclusion, the precision
and accuracy of the proposed method is high enough to detect patient-specific variation in ear cartilage geometry. This part of the work provides therefore a clinical
strategy to access the information required for the production of 3D ear cartilage
scaffolds for TE purposes; including detailed patient-specific shape. Furthermore,
the protocol is applicable in daily clinical practice with existing infrastructure. Additionally, in a separate study, the spatial variation of mechanical and biochemical
properties between various region of the human auricle as well as the influence of
patient gender and age are investigated on fresh human material. For this purpose,
stress-relaxation indentation and biochemical analysis are performed on various locations of the human auricle, as well as on human hyaline nasoseptal (NAS) cartilage.
Significant differences between AUR and NAS cartilage are observed (lower instantaneous modulus, Ein , maximum stress, σmax , equilibrium modulus, Eeq , sulfated
glycosaminoglycan, sGAG, content; and higher relaxation half-life time, t1/2 , and
DNA content are observed in AUR cartilage). No effect of gender is observed for
either AUR or NAS samples. For AUR samples significant regional variations are
observed for Ein , σmax , Eeq , t1/2 , thickness (h), DNA, and sGAG, while age was
additionally significant for h, sGAG and hydroxyproline content (HYP). No agerelated differences are observed for NAS cartilage. This work presents a spatial map
of the mechanical and biochemical properties of human ear cartilage, thus establishing the first comprehensive benchmark for the quantitative evaluation of functional
competency in ear cartilage TE.
viii
Summary
In order to address the second aim and with that to unravel how elastin influences
the mechanical behavior of AUR cartilage, tension and stress-relaxation indentation
experiments on enzymatically depleted bovine cartilage are performed. The results
confirm that the dense ELN network of AUR cartilage is, along with sGAG and
collagen, a key element contributing to AUR cartilage mechanical behavior leading
to a different viscoelastic behavior compared to articular (ART) cartilage. More
precisely, while native ART cartilage exhibits a more viscous behavior with higher
Ein but lower Eeq , AUR cartilage displays a more elastic behavior with a lower
viscous dissipation of strain energy.
A major challenge in AUR cartilage TE is to provide an appropriate cell source
that is capable of generating a stable and functional matrix. In order to address the
third aim, the performance of culture-expanded human chondrocytes from ear (EC),
nose (NC) and articular joint (AC), as well as bone-marrow-derived and adiposetissue derived mesenchymal stem cells are evaluated both in vitro and in vivo. Mechanical and biochemical evaluation show ACs possess the highest chondrogenic capacity in vitro, while ECs and NCs are most potent in vivo, leading to higher sGAG
content and elastic modulus, making them attractive cell sources for cartilage repair.
Another challenge in AUR cartilage TE is the development of a suitable scaffold
material. A novel non-degradable biocompatible material, bacterial nanocellulose
(BNC), is investigated showing that Ein , Eeq , and σmax correlate to BNC cellulose
content. Despite significantly different relaxation kinetics, Ein , Eeq and σmax of BNC
at 14% cellulose content reached values equivalent to ear cartilage. This work also
shows that BNC can be fabricated into patient-specific auricular shapes. In conclusion, BNC has the capability to reach mechanical properties of relevance for ear
cartilage replacement, and can be produced in patient-specific ear shapes.
In response to the aims, this thesis develops a protocol for clinical imaging of the
patient-specific AUR cartilage 3D shape, establishes a benchmark of the mechanical/biochemical properties of human AUR cartilage, characterizes the mechanical
role of ELN in AUR cartilage, and finally applies mechanical characterization to the
evaluation and monitoring of AUR cartilage TE. Together - these elements provide a
functional characterization of AUR cartilage to be used as guidance for future AUR
cartilage TE.
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Résumé
Le cartilage auriculaire, i.e. le principal composant de l’oreille externe, est classifié
comme cartilage élastique. A l’instar du cartilage hyalin, le cartilage élastique est un
tissu mou, avasculaire, formé de chondrocytes inclus au sein d’une matrice extracellulaire largement hydratée et constituée de collagène de type-II et de protéoglycanes.
En revanche, le cartilage élastique est le seul type de cartilage présentant également
un large réseau de fibres élastiques ramifiées et interconnectées. Il est par conséquent
supposé que ce type de cartilage possède des propriétées mécaniques propres.
L’engouement sucité par l’ingéniérie tissulaire au cours de la dernière décennie a
amené de nombreuses équipes scientifiques à mettre sur pied des protocoles visant
à regénérer post-trauma le cartilage auriculaire. En effet, l’ingéniérie tissulaire a le
potentiel de résoudre plusieurs des inconvénients majeurs affectant les procédures
chirurgicales actuelles. Une comorbidité réduite est attendue ainsi que des risques
de rejet inférieurs à ceux résultant de l’utilisation d’implants alloplastiques, et de
surcroı̂t une satisfaction accrue des patients grâce à des implants tissulaires ayant
une géométrie individualisée et spécifique à chaque patient.
Tandis que de nombreuses études ont été réalisées sur les propriétées mécaniques
du cartilage hyalin et du cartilage fibreux, peu de données sont disponibles sur le
cartilage auriculaire ou sur les autres cartilages riches en élastine. Ainsi, plusieurs
obstacles doivent être surmontés avant d’être en mesure de développer des implants
de cartilage auriculaire possèdant à la fois les propriétés fonctionnelles requises et
une géométrie adaptable à chaque patient. Des techniques d’imageries capables
d’acquérir la géométrie du cartilage auriculaire spécifique au patient doivent être
développées. Les propriétées mécaniques et la composition biochimique du cartilage
auriculaire humain reste à caractériser. Des sources de cellules adéquates ainsi que
des biomatériaux suceptibles d’assurer la prolifération de ces cellules et la génération
d’une matrice extracellulaire fonctionelle doivent être identifés.
xi
Résumé
Dans ce but, trois objectifs pour ce travail doctoral sont formulés:
1. développer une cartographie architecturale, mécanique et biochimique du cartilage auriculaire afin de définir les charactéristiques requises pour obtenir des
implants de cartilage auriculaire fonctionnels,
2. définir le rôle de l’élastine dans le maintien de l’intégrité mécanique et de la
géométrie des structures cartilagineuses de l’oreille externe,
3. évaluer et contrôler les propriétés mécaniques de cartilages auriclaires artificiels
développés en parallèle de ce travail.
En particulier, une stratégie pour une aquisition personnalisée de la géométrie
tri-dimensionelle des structures cartilagineuses du pavillon de l’oreille combinant
imagerie par résonnance magnétique (“fat saturated spoiled gradient-echo MRI sequence”) et segmentation manuelle est proposée et évaluée. Une repoducibilité interopérateurs et intra-opérateurs satifaisante pour le volume (Cg.V), la surface (Cg.S)
et l’épaisseur (Cg.Th) des structures cartilagineuses est obtenue, démontrant ainsi
la précision, i.e. la fidélité, de la méthode (incertitude sur la précision < 4 % pour
Cg.S et < 9 % pour Cg.V et Cg.Th). Des coefficients de corrélation intra-classe
satisfaisants pour Cg.V et Cg.S (>0.82), mais faibles pour Cg.Th (< 0.23), dus aux
faibles variations de ce paramète entre patients, sont obtenus. Cependant les coefficients de Pearsons mesurés démontrent que la capacité à détecter des variations
locales d’épaisseur n’est pas affectée. De plus, le faible biais, i.e. la justesse, de la
méthode est démontré par une corrélation élevée (R > 0.95) entre des échantillons
cadavériques caractérisés avec le protocol développé et une méthode de référence disposant d’une résolution supérieure (microtomographie à rayons X, “micro-CT”). En
conclusion, la fidélité et la justesse de la méthode developpée sont suffisantes pour
détecter des variations géométriques entre patients des stuctures cartilagineuses de
l’oreille externe. Par conséquent cette méthode constitue un nouveau procédé clinique donnant accès aux informations nécessaires pour la fabrication d’implants tissulaires tri-dimensionnels avec une géométrie adaptée à chaque patient. De plus
cette nouvelle méthode ne requiert aucune instrumentation spécifique, et est par
conséquent immédiatement applicable en milieu hospitalier. En outre, dans une
seconde étude, les variations spatiales des propriétés mécaniques et biochimiques
entre différentes régions de l’oreille humaine ainsi que l’influence de facteurs tels
que le sexe et l’âge sont analysés à l’aide d’échantillons humains. A cette fin, des
tests d’indentation avec relaxation de contrainte et des analyses biochimiques sont
realisés en différentes régions de l’oreille, ansi que par souci de comparaison, sur
du cartilage hyalin humain (cartilage nasoseptal). Des différences significatives sont
xii
Résumé
observées (pour le cartilage auriculaire, module instantané, contrainte maximale,
module d’équilibre, concentration en glycosaminoglycanes sulfatés inférieures, temps
caractéristique de relaxation, concentration en ADN supérieurs). Aucune influence
du sexe des donneurs n’est observée ni pour le cartilage auriculaire ni pour le cartilage nasoseptal. Pour le cartilage auriculaire, des variations régionales sont observées
pour le module instantané, la contrainte maximale, le module d’équilibre, le temps
caractéristique de relaxation et l’épaisseur du tissu, de plus l’âge des donneurs est
un paramètre significatif pour l’épaisseur, la concentration en glycosaminoglycanes
sulfatés et en hydroxyproline. Aucun effet dû à l’âge des donneurs n’est observé pour
le cartilage nasoseptal. Cette cartographie des variations spatiales des propriétées
mécaniques et biochimiques du cartilage auriculaire humain est la seule disponible
à ce jour et est dediée à la production de cartilage auriculaire artificiel.
Afin d’élucider le rôle de l’élastine dans les propriétés mécaniques du cartilage
auriculaire, des tests de tension et d’indentation avec relaxation de contrainte sont
réalisés sur des échantillons de cartilage bovin préalablement soumis à des traitements enzymatiques destinés à extraire sélectivement différents composants du tissu
(glycosaminoglycanes sulfatés et élastine). Les résultats obtenus confirment que le
dense réseau d’élastine présent dans le cartilage auriculaire est, avec les glycosaminoglycanes sulfatés et le collagène, un élément clé des propriétés mécaniques du tissu,
ceci résultant en des propriétés viscoélastiques différentes par rapport au cartilage
articulaire. Plus précisemment, tandis que le cartilage articulaire présente un comportement avec une composante visqueuse importante, i.e. module instantanné
élevé et module d’équilibre faible, le cartilage auriculaire présente une composante
élastique plus importante avec une disspation visqueuse d’énergie plus faible.
Finalement, un des défis majeurs pour la production de cartilage élastique artificiel
est le choix d’une source de cellules capable de générer une matrice extracellulaire
stable et fonctionnelle. Dans ce but, les performances après expansion en culture de
chondrocytes auriculaires, nasoseptaux et articulaires humains ainsi que de cellules
souches mesenchymateuses humaines dérivées de moelle osseuse et de tissu adipeux
ont été évaluées in vivo et in vitro. Les caractérisations mécaniques et biochimiques
réalisées montrent que les chondrocytes articulaires humains possèdent une capacité
chondrogénique plus élevée in vitro, tandis que les chondrocytes auriculaires et nasoseptaux sont les plus performants in vivo, notamment grâce à une production
accrue de glycosaminoglycanes et à un module élastique supérieur, ce qui en fait des
candidats de choix pour l’ingéniérie tissulaire de cartilage auriculaire. Le potentiel
d’un nouveau biomatériau biocompatible et non-biodégradable destiné à l’ingéniérie
tissulaire, la nano-cellulose bactérienne, est également étudié. Le module instan-
xiii
Résumé
tané, à l’équilibre ainsi que la contrainte maximale corrèlent avec la concentration
en cellulose de ce matériau. Malgré des constantes de relaxation significativement
différentes, le module instantané, à l’équilibre ainsi que la contrainte maximale pour
des concentrations en cellulose de l’ordre de 14% sont similaires au cartilage élastique
humain. De plus il est démontré que des implants en nanocellulose bactérienne peuvent être fabriqués de façon à reproduire la géométrie complexe de l’oreille humaine.
Ceci prouve que la nanocellulose bactérienne a un potentiel élevé pour être utilisée
pour la fabrication d’implants tissulaires visant à imiter les propriétés mécaniques
et la géométrie de l’oreille humaine.
En conclusion, ce travail doctoral développe, en réponse aux objectifs définis, un
protocole clinique permettant une aquisition personnalisée de la géométrie des stuctures cartilagineuses de l’oreille externe, il établit une caractérisation systématique
des propriétés mécaniques et biochimiques du cartilage auriculaire humain, il caractérise le rôle mécanique de l’élastine au sein de ce tissu, et finalement, les caractérisations mécaniques établies sont appliquées à l’évaluation et au contrôle de
différents travaux d’ingéniérie tissulaire de cartilage auriculaire. L’ensemble de ces
éléments constitue une caractérisation fonctionnelle du cartilage auriculaire humain
ayant vocation à être utilisée par les tentatives futures d’ingéniérie tissulaires de
cartilage auriculaire.
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