Effet immobilisant des spermatozoïdes par les extraits des feuilles

Journal de Gynécologie Obstétrique et Biologie de la Reproduction (2011) 40, 211—215
TRAVAIL ORIGINAL
Effet immobilisant des spermatozoïdes par les
extraits des feuilles du Cestrum parqui
Sperm immobilizing effect of leaves extracts of Cestrum parqui
S. Jellad a,∗, S. Kamoun a, M. Mehdi a, S. Zakri b,
M. Trabelsi a, A. Saad a, M. Ajina a
a
b
Laboratoire de cytogénétique et de biologie de reproduction, CHU Farhat-Hachad, Sousse, Tunisie
Laboratoire d’histologie et d’embryologie, faculté de médecine, Tunis, Tunisie
Reçu le 15 juillet 2010 ; avis du comité de lecture le 17 décembre 2010 ; définitivement accepté le 23 décembre 2010
Disponible sur Internet le 26 janvier 2011
MOTS CLÉS
Activité spermicide ;
Cestrum parqui ;
Mobilité
spermatique ;
Contraceptive
∗
Résumé
But. — L’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel spermicide des extraits de feuilles
Cestrum parqui en étudiant ses effets sur la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes in vitro.
Matériels et méthodes. — Les spermes ont été préparés par centrifugation sur un gradient de
densité PureSperm® (90 et 45 %) puis incubés avec des concentrations variables des saponines
extraites du Cestrum parqui (40—250 ␮g/mL) à 37 ◦ C et sous 5 % de CO2 . L’activité spermicide
a été évaluée en étudiant la mobilité et la vitalité des spermatozoïdes à différents intervalles
de temps allant de cinq à 240 minutes. Les modifications morphologiques des spermatozoïdes
exposés aux saponines ont été évaluées à l’aide d’un microscope électronique à transmission.
Résultats. — Un effet dose- et temps-dépendant de cet extrait sur la mobilité et la vitalité des
spermatozoïdes est observé. La concentration moyenne effective des extraits qui induit une
immobilisation irréversible des spermatozoïdes est de 250 ␮g/mL. La microscopie électronique
a révélé une altération des membranes cytoplasmiques nucléaires et acrosomales.
Conclusion. — Notre étude montre que cet extrait naturel possède une activité spermicide
in vitro et peut donc remplacer le nonoxynol-9 dans les contraceptifs par voie vaginale.
© 2011 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Auteur correspondant.
Adresse e-mail : jallad [email protected] (S. Jellad).
0368-2315/$ – see front matter © 2011 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
doi:10.1016/j.jgyn.2010.12.008
212
KEYWORDS
Spermicidal;
Cestrum parqui;
Sperm mobility;
Contraceptive
S. Jellad et al.
Summary
Objective. — The leaves extracts of Cestrum parqui were reported to have spermicidal activity.
The current investigation identified the spermicidal component of the extracts and evaluated
its spermicidal potential in vitro, particularly the effects on sperm motility and vitality.
Methods. — Sperms were prepared by discontinuous buoyant density gradient centrifugation and
incubated with varying concentrations of extract from C. parqui (40—250 ␮g/ml) at 37 ◦ C and 5%
CO2 . The mode of spermicidal action was evaluated by sperm motility and vitality at different
intervals ranging from 5 to 240 minutes. Morphological changes in human spermatozoa after
exposure to the extract were evaluated under transmission electron microscope.
Results. — A dose- and time-dependent effect of this extract on sperm motility and viability was
observed. The mean effective concentration of extracts that induced irreversible immobilization was 250 ␮g/ml. Transmission electron microscope revealed a significant damage to sperm
membrane in head and acrosomal membranes, notable swelling and disruption.
Conclusion. — Our study indicates that this natural extract has potential spermicidal effect in
vitro. It can adequately replace nonoxynol-9 in vaginal contraceptives to make them more
vaginally safe and ecofriendly.
© 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
Introduction
Les spermicides, largement employés à des doses élevées peuvent provoquer des ulcérations génitales pouvant
accroître le risque de transmission des maladies sexuellement transmissibles. Cependant, il s’avère utile de tester
de nouvelles molécules plurivalentes, spermicides et antibactériennes à partir des produits naturels tels que les
saponines qui retiennent l’attention aussi bien pour leurs
exploitations industrielles que pour leur propriétés pharmacologiques. C’est un vaste groupe d’hétérosides composés
d’une chaîne glucidique hydrosoluble et d’une structure
triterpénique ou stéroïdique liposoluble, très fréquent
chez les végétaux, quelques animaux marins et certaines
bactéries[1].
Plusieurs effets biologiques ont été attribués aux saponines tels que l’activité cytotoxique [2,3] et anticancéreuse
[4], l’activité antifongique, molluscucide et insecticide [5].
Les saponines sont aussi recommandées dans le traitement
des hypercholestérolémies [6]. Les saponosides de quelques
plantes sont utilisés dans la formulation contraceptive,
comme des agents ayant une activité sur les cellules spermatiques ou comme substances spermicides [7—9].
Matériels et méthodes
Les saponines sont extraites à partir des feuilles du Cestrum parqui prélevées à partir du jardin de l’Institut
national agronomique de Tunisie, séchées dans une étuve
à 40 ◦ C pendant trois à quatre jours. Les feuilles sont
ensuite finement broyées jusqu’à obtenir une poudre.
Cent grammes de cette poudre sont delipidés par l’éther
de pétrole et soumis à trois extractions au méthanol
(3 × 300). Le mélange est évaporé dans un évaporateur rotatif à 40 ◦ C et le résidu concentré est laissé à l’air libre
pour séchage. Un gamme de ce résidu est dissout dans
100 mL de méthanol et additionné d’un volume équivalent
d’éther éthylique pour provoquer une précipitation. Le précipité obtenu par filtration est ensuite mis en séchage
à l’air ambiant et le produit final obtenu est un solide
jaune-vert qui brunit avec le temps : saponines brutes
(SB).
Cinquante spermes ont été recueillis au laboratoire
par masturbation, après liquéfaction à 37 ◦ C pendant
30 minutes, les différentes paramètres spermatiques ont
été analysés. Un autre groupe de 50 spermes avec des
bonnes caractéristiques spermatiques obéissant aux normes
de l’OMS (au moins 20 millions de numération avec une
mobilité progressive d’au moins 50 % de spermatozoïdes
60 minutes après l’éjaculation) est considéré comme un
groupe témoin.
Les spermes ont été ensuite traités selon la technique de
séparation par un gradient de densité PureSperm® 90 et 45 %
(Nicadon, JCD, Lyon, France) et le culot final est suspendu
dans 300 ␮L de Ferticult (Fertipro JCD) et utilisé pour les
divers tests.
Les extraits bruts à différentes concentrations (40, 62,5,
100, 150, 250 ␮g/mL) ont été ajoutés à des spermatozoïdes préalablement traités. L’effet spermicide a été
évalué par le Sonder-Cramer test [10]. Cent microlitres de
sperme traité sont examinés à des intervalles de temps
allant de cinq à 240 minutes afin d’estimer la mobilité
par microscopie optique et déterminer la concentration
effective EC100 : la concentration minimale du spermicide
capable de tuer 100 % des spermatozoïdes après 30 minutes
d’exposition.
L’appréciation de la vitalité a été faite par le test à
l’éosine-nigrosine (test de Williams) qui consiste à mélanger 20 ␮L de sperme traité avec un volume égal d’éosine
à 1 % et un double volume de nigrosine puis déterminer
le pourcentage de spermatozoïdes viables et non viables
(têtes colorées) en comptant au moins 100 spermatozoïdes
par patient.
Une fraction du sperme est centrifugée puis fixée par
une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon
cacodylate 0,2M à pH 7,4 pendant deux heures à plus de
4 ◦ C, ensuite lavée trois fois dans la solution tampon. La
post-fixation est réalisée à l’acide osmique à 4 % pendant
45 minutes. La déshydratation s’effectue par des passages
Effet immobilisant des spermatozoïdes par les extraits des feuilles du Cestrum parqui
213
Tableau 1 Effets de différentes concentrations des extraits des feuilles de Cestrum parqui sur la mobilité des spermatozoïdes
en fonction du temps d’exposition.
Effect of different concentrations of leaves extract of Cestrum Parqui on spermatozoal motility depending of the time exposure.
Concentration de
saponines (␮g/mL)
Temps d’exposition
125
200
250
5 min(%)
10 min(%)
30 min(%)
60 min(%)
50
20
10
25
10
0
10
0
0
0
0
0
successifs dans des bains d’alcool, la polymérisation est
réalisée d’abord à 45 ◦ C pendant 48 heures poursuivie de
24 heures à 60 ◦ C. Les coupes ultrafines (90 nm) réalisées à
l’aide d’un microtome Reichert Ultracute sont contrastées
en combinant l’acétate d’uranyle et le citrate de plomb.
L’observation des coupes est faite avec une microscopie à
transmission.
Les données ont été saisies et analysées à l’aide d’un
logiciel SPSS (10.0). Le test d’appariement t a été utilisé
pour la comparaison des moyennes sur des séries appariées
avec un seuil de signification fixé à 5 %.
Résultats
Analyse de la mobilité
La mobilité a été mesurée après l’action des extraits de
C. parqui. Un effet spermicide total et instantané a été
observé pour des concentrations dépassant les 250 ␮g/mL.
À 250 ␮g/mL, 90 % perdent leurs mouvements après cinq
minutes et deviennent entièrement immobile au bout de
dix minutes. Pour 200 ␮g/mL, la majorité des spermatozoïdes acquièrent des mouvements lents puis s’immobilisent
au bout de 30 min alors que pour 125 ␮g/mL, les spermatozoïdes mobiles fléchants s’immobilisent en 60 minutes. À
des faibles doses, l’effet spermicide se manifeste plus lentement, les spermatozoïdes s’immobilisent après 120 minutes
Tableau 2 Effets de différentes concentrations des
extraits des feuilles de Cestrum parqui sur la mortalité spermatique en fonction du temps d’exposition.
Effect of different concentrations of leaves extract of Cestrum parqui on spermatozoal mortality depending of the
time exposure.
Concentrations des
saponines (␮g/ml)
0
40
62,5
100
125
200
250
Temps d’exposition
10 min(%)
30 min(%)
240 min(%)
10
20
30
50
70
90
100
12
35
55
0
100
100
100
20
80
100
100
100
100
100
pour une dose de 100 ␮g/mL et au bout de 240 minutes à
62 ␮g/mL (Tableau 1).
La vitalité spermatique
Comparées aux témoins, les courbes de mortalité
(Tableau 2) montrent une augmentation régulière de
la mortalité des spermatozoïdes suite à l’action des faibles
concentrations de saponines, respectivement 40, 62,5 et
100 ␮g/mL. Pour 40 ␮g/mL, la mortalité est de 20 % après
dix minutes (10 % pour les témoins) puis augmente pour
atteindre 80 % après quatre heures d’essai ; pour des
concentrations supérieures (62,5 et 100 ␮g/L), on constate
une augmentation constante de la mortalité qui devient
totale après quatre heures d’essai. La mortalité totale
des spermatozoïdes est atteinte en 30 minutes pour des
concentrations de 125 et 200 ␮g/mL et seulement en dix
minutes en utilisant 250 ␮g de saponines.
Étude ultrastructurale
Le spermatozoïde humain présente à la microscopie électronique une tête ovalaire avec une chromatine dense,
l’acrosome couvre les deux tiers antérieurs et le tiers postérieur du noyau. Il est limité par une membrane et reste
à une certaine distance de la membrane plasmique et de la
membrane nucléaire. La pièce intermédiaire est rétrécie et
courte, on reconnaît les colonnes segmentées, le centriole
proximal et l’anneau mitochondrial entourant le complexe
axonémal. Comparés aux témoins, les spermatozoïdes traités avec les saponines montrent des modifications touchant
principalement la tête. Ainsi la membrane plasmique recouvrant la tête est largement dilatée et complètement séparée
du noyau qui paraît vacuolé avec une chromatine moins
dense.
Ces altérations morphologiques sont amplifiées chez
les spermatozoïdes traités avec 200 ␮g/L de saponines.
La membrane plasmique est fortement endommagée avec
des boursouflures sous forme de vésicules membranaires,
voire même interrompue par endroit avec une vacuolisation
nucléaire plus intense (Fig. 1).
Discussion
Les saponines extraites du C. parqui possèdent plusieurs
activités biologiques prouvées chez plusieurs mammifères.
On leur attribue à la fois l’activité hypocholestérolémiante,
214
Figure 1 Aspect des spermatozoïdes traités avec 200 ␮g/ml
des extraits en microscopie électronique à transmission.
Transmission electron microscope of spermatozoa treated with
200 ␮g/ml of extract.
insecticide, molluscucide, cytotoxique, anticancéreuse,
voire antivirale [4]. Ces activités découlent de l’interaction
des saponines avec le cholestérol membranaire et la
formation de complexes insolubles saponine—cholestérol
engendrant un phénomène de formation de pores et de perte
de l’intégrité cellulaire.
Ce travail rapporte l’effet spermicide des extraits des
feuilles de C. parqui contre les spermatozoïdes humains.
Cette activité dépend à la fois de la concentration et du
temps d’exposition de l’extrait avec les spermatozoïdes.
Ainsi, une concentration supérieure à 250 ␮g/mL semble
avoir un effet instantané (en dix minutes) sur la mobilité
et la vitalité des spermatozoïdes, cela nous permet de définir une fourchette d’activité étroite dose-active/intervalle
de temps.
La capacité fécondante du sperme dépend d’autres paramètres en plus de la mobilité, comme la vitalité et la
décondensation de la chromatine nucléaire, qui sont de plus
en plus appréciés pour prédire le succès de différentes techniques de l’assistance médicale à la procréation (AMP) [11].
Les saponines brutes semblent avoir un effet spermicide efficace en utilisant des doses beaucoup plus faibles qu’avec
d’autres agents spermicides connus [8].
La majorité des spermicides extraits des plantes
induisent une détérioration de l’intégrité fonctionnelle de
la membrane plasmatique spermatique [12].
Le principe actif utilisé par les spermicides vaginaux est
la rupture de lipides dans la membrane du sperme, particulièrement sur l’acrosome, causant la perte de la mobilité
et l’inactivation des enzymes qui jouent un rôle dans la fertilisation, comme l’acrosine et l’hyaluronidase, entraînant
un dégât de l’architecture membranaire avec une réduction
significative de la vitalité [13,14].
S. Jellad et al.
Dans ce travail, l’étude de la mortalité des spermatozoïdes traités par diverses concentrations de saponines
nous a montré parfois que le nombre des spermatozoïdes
morts est relativement supérieur à celui des immobiles
et qu’il existe même des spermatozoïdes roses gardant
un mouvement d’oscillation sur place, ce qui nous a permis d’admettre que les saponines endommagent l’intégrité
fonctionnelle de la membrane cellulaire du sperme sans
causer aucun dégât à son organisation structurelle. Des
tels spermicides vont probablement affecter le système de
transport membranaire aboutissant à une perturbation de
l’équilibre osmotique, ce qui accélère l’entrée du colorant
(éosine) dans les spermatozoïdes avant de perdre ultérieurement leur mobilité.
L’altération de l’intégrité membranaire a été confirmée
par l’étude ultrastructurale, notamment une atteinte évidente de la tête supposant une interaction possible des
saponines avec les lipides de la membrane plasmatique.
Il a été démontré que l’action des saponines sur la membrane des spermatozoïdes découle de la facilité de ces
dernières à interagir avec le cholestérol membranaire faisant des complexes saponines—cholestérol [15,16]. Il s’agit
d’une réaction chimique entre la génine saponique et les
sites lynphophiles du cholestérol [15—17]. L’effet spermicide est dû à la modification de l’un des paramètres clés
à la fertilisation, la formation de ce complexe perturbe la
perméabilité membranaire entraînant soit la sélectivité du
transport membranaire, soit la perte de l’activité biologique
de la cellule spermatique [15,18,19].
Plusieurs études ultrastructurales des spermatozoïdes
ont montré que l’altération peut toucher la tête, la pièce
intermédiaire et le flagelle [8,12,14,20—22]. Dans notre
étude nous avons noté des modifications au niveau de
la tête sans observer des altérations touchant la pièce
intermédiaire ou le flagelle. Ainsi, l’effet spermicide peut
probablement s’expliquer par le dommage de la tête dû
à l’interaction de la membrane avec les saponines. En
effet, l’exposition des spermatozoïdes aux conditions hypoosmotiques entraîne une augmentation du volume de la
cellule spermatique consécutive à une entrée d’eau, la
membrane s’éclate alors et le spermatozoïde perd son pouvoir fécondant [18,19]. Nos observations nous autorisent
de rapprocher nos résultats avec ceux de la littérature
puisque nous relevons la présence d’un gonflement de la
membrane plasmique et de la membrane de l’acrosome
entraînant sa vésiculisation (boursouflures membranaires et
de l’acrosome).
Conclusion
Les résultats de ce travail montrent que cet extrait naturel
avec double composante glucidique hydrosoluble et stéroïdique liposoluble est un puissant agent spermicide agissant
probablement par une détérioration de l’intégrité fonctionnelle de la membrane plasmique spermatique due à son
interaction avec les lipides membranaires entraînant sa perméabilisation exagérée. Les saponines sont des produits
naturels susceptibles d’être plus actifs et moins toxiques que
les spermicides de synthèse classiques puisque ces derniers
présentent une structure différente et sont formés à partir
des substances actives bactéricides telles que le chlorure
Effet immobilisant des spermatozoïdes par les extraits des feuilles du Cestrum parqui
de benzalkonium, le nonoxynol-9, l’actoxynol. En conséquence, cet extrait peut donc remplacer le nonoxynol-9 dans
les contraceptifs par voie vaginale [9].
Conflit d’intérêt
Aucun.
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