Thèse GILLIER Sandrine - Thèses

ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT
Année 2013
COMPARAISON DE DEUX MÉTHODES
D’EXTRACTION D’ARN POUR IDENTIFIER
DES MARQUEURS PRÉCOCES DE GESTATION
CHEZ LES RUMINANTS
THÈSE
Pour le
DOCTORAT VÉTÉRINAIRE
Présentée et soutenue publiquement devant
LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL
le……………
par
Sandrine GILLIER
Née le 4 avril 1988 à Paris 18ème
JURY
Président : Pr.
Professeur à la Faculté de Médecine de CRÉTEIL
Membres
Directeur : Mme Fabienne CONSTANT
Maître de conférences à l’ENVA
Assesseur : Mme Marie Abitbol
Maître de conférences à l’ENVA
REMERCIEMENTS
A notre jury de thèse
Au président du Jury de la faculté de médecine de Créteil
Qui nous a fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse
Veuillez accepter mon hommage respectueux.
Madame le Docteur Fabienne CONSTANT,
Maitre de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort
Reproduction animale
Qui m’a guidée dans ce travail
Veuillez considérer ma reconnaissance et mon plus profond respect.
Madame le Docteur Marie ABITBOL,
Maitre de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort
Génétique médicale et moléculaire
Qui m’a fait l’honneur d’accepter de faire partie du jury de thèse
Sincères remerciements.
A ma famille
A mes parents pour votre soutien dans mes longues et parfois difficiles études et pour
votre patience dans ma vie étudiante. A mes sœurs, Sophie et Laura, pour les bêtises
partagées, les discussions sans fin d’adolescentes et le soutien dans les moments
difficiles. A mes grands parents pour votre amour et votre présence depuis toujours. A
Justine, ma sœur de cœur depuis presque 20 ans, pour me connaître mieux que personne.
A mes amis
Aux vétos : A Jérem, mon meilleur ami et mon confident de chaque instant. A Hélo, ma
poulotte, pour la relation exceptionnelle qu’on a pu tisser. A mes M&M’s, Marion et
Mathieu Brouty, qui me manquent chaque jour. A Ben et Chachou, pour votre amitié
profonde. A Laura, mon hémi cerveau, souvent discrète et indépendante mais toujours là.
A Stan, mon carré, pour ton soutien et ton amitié sincère depuis 7 ans. A Flo, pour tout le
respect que j’ai pour toi mais aussi pour ta bonne humeur et tous les fous rires.
A mon groupe de clinique, le groupe 9, Jerem, Ben, Chachou, Laura, Marie-Aude,
Stan, Gaëlle, Chloé et Matthias, parce que choisir c’est renoncer et qu’il faut respecter
le protocole. A la team Mongolie, pour ce superbe projet. A mes poulottes adoptives,
Marina, Anaïs et Oriane, pour m’aider à ne pas vieillir trop vite. A la promo 2012, les
Nocasses, en particulier Karine, Sandrine, LaureJ, Nishou, Julie, pour ces cinq années
merveilleuses. A la promo 2015, les Ramonasses, vos Anciens sont fiers de vous. Aux
toulousains, pour avoir si bien accueilli Blondie l’alforienne dans son école d’adoption.
Aux fidèles : A mes amis, depuis longtemps ou pas, mais pour longtemps encore. Nadja,
Ju, Nanou, Noémie. Aux saucisses, Eva, Claire, Mika, Nicot, Greg, Elise, Nico, pour
les vacances, les soirées, mais surtout les fous rires !
Et puis
A Claudio, pour me rendre si heureuse. A Martine, Isabelle et à l’Orchestre de Flûte
du Val de Marne pour la bouffée d’oxygène que je viens chercher au conservatoire
depuis plus de 15 ans. A Clm, pour m’avoir appris à avoir et à croire en mes rêves. A
Céline, pour notre rencontre toulousaine et tous ces moments passés dans la ville rose. A
Sandra, pour ta présence essentielle à ma nouvelle vie, en espérant que tu trouveras la
sérénité dans ce coin de verdure. A tous les autres, Laurène, Marie-Laure, Sylvain,
Anaëlle, Tony, Amy, Neil…
Au Docteur Verlut et à l’équipe de la SELARL des Trois Vallées, pour vos
enseignements et votre soutien dans mes début de véto.
Aux animaux Jessie, Heaven, Doudou, Oscar, Elliot, Dipsy, Elice, Bibou, Genny,
Zaïa, Samba, Nougat, Zaya, Goumitt, Woody et les autres.
TABLE DES MATIERES
LISTE DES FIGURES
5
LISTE DES TABLEAUX
7
LISTE DES ABREVIATIONS
9
INTRODUCTION
11
PREMIERE PARTIE : PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
13
I)
13
Méthodes de diagnostic de gestation actuelles et perspectives
A) Rappel : cycles ovariens et mise en place de la gestation chez la vache
13
1)
Cycles ovariens chez la vache
13
2)
Mise en place de la gestation chez la vache
14
B) Méthodes de diagnostic de gestation actuelles : avantages et inconvénients
1)
Diagnostics cliniques
14
14
a.
Palpation transrectale
14
b.
Echographie par voie rectale
15
2)
Diagnostics de laboratoire
15
a.
Dosage de la progestérone
15
b.
Dosage des PAG (Pregnancy Associated Glycoproteins)
16
c.
Dosages non utilisés en routine
17
3)
Intérêt du développement d’une nouvelle méthode de diagnostic de gestation
C) L’interféron tau : rôles et intérêt pour le diagnostic de gestation
1)
Rôles de l’interféron tau dans la reconnaissance de la gestation
17
18
18
a.
Inhibition de la cascade lutéolytique
18
b.
Réaction immunitaire locale
20
1
2)
Mécanismes d’action de l’interféron tau
20
a.
Action paracrine de l’interféron tau
20
b.
Action endocrine de l’interféron tau
21
3)
La famille des ISG
22
D) Application au diagnostic de gestation
1)
22
Utilisation de la Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction
(RT-qPCR) sur un échantillon sanguin : intérêts
22
2)
22
Mesure de l’ARN messager (ARNm) des ISG sur un prélèvement
II) Facteurs influençant la quantification des ARNm
25
A) La technique de RT-PCR en temps réel : fiabilité de la mesure de la quantité réelle
d’ARNm
25
1)
RT-PCR : principe [1]
25
2)
Défauts de mesure liés à la rétrotranscription : importance du choix des primers 28
3)
Défauts de mesure liés à la réaction de PCR
28
4)
Méthodes de normalisation utilisées
28
a.
Normalisation de la taille des prélèvements
29
b.
Normalisation par rapport à la quantité d’ARN total
29
c.
Normalisation par rapport à l’ADN génomique
29
d.
Utilisation de gènes de référence
29
e.
Normalisation par rapport à une molécule artificielle
30
B) Modification de la quantité réelle d’ARNm dans le prélèvement
30
1)
Dégradation des ARN au cours du temps
30
2)
Activation génique ex vivo
31
a.
Mise en évidence d’une modification de l’expression génique au sein d’un
prélèvement conservé à température ambiante, en l’absence de stabilisateur
31
b.
33
Hypothèses explicatives
III) Stabilisation de l’ARN et méthodes d’extraction
35
A) Stabilisation des ARN au cours du stockage des prélèvements
1)
2)
2
35
Congélation des prélèvements sanguins
Ajout d’un stabilisateur avant conservation : les tubes PAXgene
35
®
35
a.
Description
35
b.
Comparaison de la conservation du matériel génétique dans les tubes PAXgene®
et les tubes contenant de l'EDTA : quantité et qualité de l’ARN total
35
c.
Conservation de l’expression génique spécifique
36
a.
Répétabilité
38
b.
Adaptation aux conditions de température
38
B) Isolement des leucocytes avant extraction de l’ARN
38
1)
Comparaison de l’expression génique des leucocytes par rapport au sang total
38
2)
Isolement des leucocytes mononucléés circulants (LMC) par la méthode Percoll 39
a.
Principe
39
b.
Comparaison Percoll / Ficoll [75, 53]
40
3)
Influence de la séparation des LMC sur l’expression génique
41
4)
Conservation des LMC
41
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPÉRIMENTALE
43
I)
43
Matériel et méthodes
A) Animaux et prélèvements
43
B) Conservation des échantillons
43
C) Extraction des ARN
44
D) Rétrotranscription
47
E)
PCR en temps réel
48
F)
Analyses statistiques
49
II) Résultats
A) Qualité des PCR
51
51
B) Comparaison des quantités moyennes d’ARN mesurées pour chaque méthode
d'extraction
51
C) Corrélations entre les deux types de prélèvement
53
III) Discussion
55
CONCLUSION
59
3
4
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Cycles ovariens chez la vache
p 13
Figure 2 : Persistance du corps jaune en cas de gestation chez la vache
p 14
Figure 3 : Evolution de la progestéronémie en fonction du statut physiologique
de la vache
p 16
Figure 4 : Inhibition de la cascade lutéolytique par l’INFT
p 19
Figure 5 : Etapes constituant un cycle de PCR
p 25
Figure 6 : Amorces utilisables en RT-PCR
p 26
Figure 7 : Comparaison des deux techniques de fluorescence : SYBR® Green
et TaqMan®
p 27
Figure 8 : Evolution au cours du temps de la quantité d’ARN dans du sang
total, prélevé sur EDTA et conservé à température ambiante
p 30
Figure 9 : Evolution au cours du temps du niveau d'expression du TNFα,
rapportée à l’expression de l’actine, l’ARN 18S, la GAPDH ou la concentration
totale d’ARN, dans un prélèvement de sang total prélevé dans un tube avec
EDTA
p 32
Figure 10 : Effet des conditions de conservation de sang total sur l’expression
relative à T0 au cours du temps (T0+4 h ; T0+8 h ; T0 + 24 h ; T0 + 3 j. ; T0 +
5 j.) de 25 gènes
p 37
Figure 11 : Obtention d’un gradient de densité avec du Percoll, permettant de
séparer les cellules sanguines humaines
p 40
Figure 12 : Protocole d’extraction des ARN à partir des leucocytes
mononucléés circulants (LMC) isolés utilisant le RNEASY MINI KIT®
(Qiagen, Courtaboeuf, France)
p 45
Figure 13 : Protocole d’extraction des ARN à partir de sang prélevé dans les
tubes PAXgene® à l’aide du PAXGENE BLOOD RNA KIT® (Qiagen,
Courtaboeuf, France)
p 46
Figure 14 : Protocole de rétrotranscription à l’aide du kit Superscript® II
Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)
p 47
5
Figure 15 : Niveaux d’expression de plusieurs gènes selon la méthode de
prélèvement et d’extraction des ARN
p 52
Figure 16 : Niveau d'expression observé avec les prélèvements en tube
PAXgène® en fonction du niveau d'expression observé après isolement des
LMC (Percoll) pour chacun des gènes étudiés
p 54
Figure 17 : Profils cellulaires des deux types de prélèvement (isolement des
leucocytes par la méthode « Percoll » et sang total avec le tube PAXgene®)
p 56
6
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Comparaison des tests de diagnostic de gestation par
quantification d’ARNm d’ISG avec un test à la progestérone
p 23
Tableau 2 : Gènes correspondants, orientation, séquence, température de
fusion des amorces utilisées pour les réactions de RT-qPCR et taille attendue
des amplicons
p 49
Tableau 3 : Quantités moyennes d’ARN mesurées pour chaque méthode
d’extraction
p 51
Tableau 4 : Coefficients de corrélation des niveaux d'expression de chaque
gène, selon la méthode de prélèvement et d'extraction des ARN
p 52
7
8
LISTE DES ABREVIATIONS
ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire
ARN : Acide RiboNucléique
ARNm : Acide Ribonucléique messager
BAX = BCL-2-associated X protein.
BCL = B-cell lymphoma 2
CJUN = Proto-oncogene c-Jun
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
COX = Cyclo-oxygénase
CRE = Causing REcombination
CYP2D6 = Cytochrome P450 2D6
DUSP1 : Dual Specificity Protein Phosphatase 1
ECF : Early Conception Factor
EDTA : Ethylene Diamine Tétraacétic Acid
EIA : Enzyme ImmunoAssay
ENOS = Endothelial Nitric Oxide Synthase
FOS = Finkel-Biskis-Jinkins osteosarcoma oncogene
GAPDH : Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase
HPRT : Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transférase
HSP = Heat Shock Protein
ICAM = Intercellular Adhesion Molecule
ICE = Interleukin-1 beta-Converting Enzyme
IL : Interleukine
INFtau : Interféron tau
INRA : Institut National de Recherche Agronomique
IRF : Interferon Regulatory Factor
ISG : Interferon Stimulated Gene
LMC : Leucocyte Mononucléé Circulant
MMP = Matrix MetalloProteinase
MYC = Myelocytose
MX = Myxovirus resistance
NFKB = Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
OAS-1 : 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1
P53 = Protéine 53
PAG : Pregnancy Associated Glycoprotein
PBEF1 : Pre-B-cell colony-Enhancing Factor 1
PCR : Polymerase Chain Reaction
PGE2 : Prostaglandine E2
Mis en forme : Anglais (États-Unis)
9
PGF2α : Prostanglandine Fα
PLAC8 : Placenta Specific Gene 8
PMNC : Polymorphonuclear Cells
PSPB : Pregnancy Specific Protein B
RBC : Red Blood Cells
RIA : Radioimmunoassay
RIN : RNA Integrity Number
RPL19 : Ribosomal Protein L 19
RT : Rétrotranscription
RT-qPCR : RetroTranscription quantitative Polymerase Chain Reaction
SDHA : Succinate dehydrogenase A
STAT = Signal Transducer and Activator of Transcription
TGF = Transforming growth factor
TH : T-Helper
TNF = Tumor Necrosis Factor
UNCEIA = Union Nationale des Coopératives agricoles d’Elevage et d’Insémination Animale
UPA = Urokinase-type plasminogen activator
YWHAZ = Tyrosine 3-monooxygenase/trytophan 5 monooxygenase activation protein,14-3-3
10
INTRODUCTION
« Un veau par vache et par an » : tel est l’objectif de tout éleveur de bovins, dans un
contexte d’optimisation de la production. Mais ces dernières années l’augmentation de la
production laitière individuelle des animaux s’est accompagnée d’une nette baisse des
performances dans le domaine de la reproduction.
En conséquence de la diminution de la fertilité et de la fécondité constatée ces
dernières années chez les vaches laitières, plusieurs inséminations successives sont
régulièrement nécessaires pour aboutir à une gestation. Suite à l’échec de la première tentative
d’insémination, il est en principe possible de recommencer trois semaines après, au début du
nouveau cycle de la vache. Mais, pour cela, l’éleveur ne dispose actuellement que d’un seul
moyen pour savoir à temps que la vache n’est pas gestante : l’observation des chaleurs. Or,
cela représente souvent une contrainte : l’éleveur a de moins en moins de temps à accorder à
l’observation de ses animaux. De plus, les vaches elles-mêmes expriment parfois peu leurs
chaleurs pour de nombreuses raisons : sol inadapté, problèmes de pied, …. C’est pour cette
raison que le diagnostic de non gestation se fait fréquemment à l’aide d’une échographie ou
d’un dosage de PAG (Pregnancy Associated Glycoproteins) vers le trentième jour après
l’insémination. La deuxième insémination intervient alors 42 jours après la première, au lieu
de 21 jours dans l’idéal. Il serait donc intéressant de développer une méthode de diagnostic de
gestation précoce, pouvant être utilisée vers le 18ème jour du cycle.
Or, dès le 14ème jour de gestation chez la vache, l’embryon signale sa présence par la
production d’interféron tau, induisant une réaction immunitaire qui va permettre l’acceptation
par l’organisme maternel du corps étranger que représente le conceptus. Celle-ci passe
notamment par l’induction de cytokines produites par les leucocytes mononucléés sanguins.
Cela constitue une voie de recherche très étudiée depuis quelques années pour établir un
diagnostic de gestation précoce et non invasif chez la vache. Les ARN (Acides
ribonucléiques) présents au cœur des cellules étant le reflet de l’expression génique en
réponse à un changement environnemental ou intrinsèque, un diagnostic de gestation pourrait
donc exploiter la quantification de l’expression d’un ou de plusieurs de ces gènes afin de la
comparer aux résultats connus chez un animal gravide.
Une étude dont l'objectif est d'identifier des marqueurs précoces de la gestation dans
les leucocytes circulants est actuellement en cours à la station INRA de Jouy-en-Josas. Mais
la méthode d'extraction des ARN utilisée n'est pas réalisable en élevage. Afin que ce test soit
utilisable en élevage, il est nécessaire trouver une méthode de prélèvement non invasive
permettant un traitement des échantillons simple et rapide. La prise de sang est un geste
courant et facilement réalisable. Mais le prélèvement utilisé doit permettre la conservation des
11
ARN afin que ceux-ci représentent l’état physiologique réel de l’animal. C’est pourquoi nous
avons voulu comparer deux méthodes de prélèvement et d’extraction des ARN qui
permettraient d’identifier des marqueurs de gestation précoce chez la vache.
Dans une première partie, après avoir revu rapidement les méthodes de diagnostic de
gestation actuelles, nous nous intéresserons aux perspectives qu’offre le rôle de l’interféron
tau au début de la gestation, ainsi que les contraintes liées à la conservation des ARN dans un
prélèvement sanguin et au moment de leur extraction. Puis, nous présenterons les résultats de
l’expérience dont l'objectif était de comparer deux types de prélèvements : à l'aide d'un tube
avec anti-coagulant tel que le citrate, duquel les cellules mononucléées ont été isolées, ce qui
est la méthode couramment employée, et le tube PAXgene® qui contient un conservateur des
ARN et duquel on peut extraire ces derniers directement à partir du sang total.
12
PREMIERE PARTIE : Partie bibliographique
Il ne s’agit pas ici de réaliser une synthèse exhaustive, ni des méthodes usuelles de
diagnostic de gestation, ni des mécanismes physiologiques mis en jeu en début de gestation,
mais de simplement situer le contexte dans lequel a été réalisée cette étude. Pour plus
d’informations, il est possible de se référer aux thèses vétérinaires de Laura SILVA
(Recherche de marqueurs précoces de la gestation dans les cellules immunitaires circulantes
chez les ruminants, 2012) et Stéphanie INGHELS (Etude de marqueurs potentiels précoces de
la gestation chez la brebis, 2012).
I) Méthodes de diagnostic de gestation actuelles et perspectives
A) Rappel : cycles ovariens et mise en place de la gestation chez la vache
1) Cycles ovariens chez la vache
Chaque cycle ovarien dure en moyenne 21 jours et est composé de trois vagues folliculaires :
en effet,
tant que le corps jaune résultant de l’ovulation est présent et produit de la
progestérone, les follicules dominants des deux premières vagues ne peuvent ovuler et
persistent. Lors de la lyse du corps jaune par les prostaglandines PGF2α, le follicule dominant
de la troisième vague ovule et forme à son tour un corps jaune (Figure 1).
Figure 1 : Cycles ovariens chez la vache, d’après [16]
0
7
14
21 Temps
(en jours)
Légende :
Petits follicules
Follicules moyens
Follicule dominant
PGF2α : prostaglandine F2α
13
2) Mise en place de la gestation chez la vache
En cas d’insémination fécondante, le corps jaune persiste, mais les vagues folliculaires
continuent également (Figure 2).
Figure 2 : Persistance du corps jaune en cas de gestation chez la vache, d’après [45]
0
Légende :
7
14
21
Temps
(en jours)
Petits follicules
Follicules moyens
Follicule dominant
B) Méthodes de diagnostic de gestation actuelles : avantages et inconvénients
La qualité d’un diagnostic de gestation est couramment évaluée par plusieurs critères
qui sont la précocité, l’exactitude (nombre de diagnostics positifs/nombre de vaches
gestantes), la sensibilité (nombre de diagnostics positifs exacts/nombre de vaches gestantes),
la spécificité (nombre de diagnostics négatifs exacts/nombre de vaches non gestantes), la
valeur prédictive positive (nombre de diagnostics positifs exacts/nombre de diagnostics
positifs) et la valeur prédictive négative (nombre de diagnostics négatifs exacts/nombre de
diagnostics négatifs).
1) Diagnostics cliniques
a. Palpation transrectale
Le diagnostic de gestation par palpation transrectale est réalisable à partir de 35 jours
après l’insémination mais il ne devient vraiment pertinent qu’entre 40 et 50 jours [23], date à
laquelle on peut détecter avec certitude la fluctuation des liquides fœtaux dans l’utérus. Il a
14
comme avantage d’être simple et peu coûteux (le prix du gant et du gel lubrifiant). Son
exactitude varie selon l’opérateur et son expérience.
Toutefois, outre sa date de faisabilité tardive, il comporte des risques : la palpation
transrectale réalisée vers 45 jours après l’insémination pourrait faire passer le taux de
résorption fœtale à 90 jours de 4,3% à 11,4% [17].
b. Echographie par voie rectale
L’échographie par voie rectale est généralement réalisée à partir de 28-30 jours pour
les génisses, 30-35 jours pour les vaches. Elle a pour principaux avantages de pouvoir
présenter immédiatement le résultat à l’éleveur et une innocuité totale [24]. Contrairement à la
palpation transrectale, elle permet également de différencier un pyomètre d’un début de
gestation puisque le liquide apparaît alors non échogène. A 30 jours, on obtient une sensibilité
proche de 98% et une spécificité de près de 88% [41].
Son inconvénient principal est le coût de l’échographe et de la formation de
l’opérateur.
2) Diagnostics de laboratoire
Chez la femme ou la jument, un diagnostic de gestation plus ou moins précoce est
possible grâce à la détection d’une gonadotropine chorionique éliminée dans l’urine ou
détectable dans le sang. Malheureusement, aucune hormone de ce type n’a été mise en
évidence chez les autres espèces de mammifères [47], ce qui oblige à utiliser d’autres
molécules marqueurs de la gestation chez la vache.
a. Dosage de la progestérone
Ce diagnostic est fondé sur le maintien de la progestéronémie à la fin du cycle, lié à la
présence du corps jaune. En effet, le taux de progestérone chez la vache passe de 0,3 à 0,6
ng/mL pendant l’œstrus, à 6 à 9 ng/mL entre le 7ème et le 10ème jour du cycle [8]. Lors de
gestation, le taux se maintient à ce niveau élevé au lieu de baisser comme il le fait à la fin du
cycle. Il faut donc doser la progestérone entre les jours 19 et 23 (Figure 3). En pratique, on
réalise ce dosage entre les jours 21 et 23, ce qui est particulièrement contraignant.
15
Figure 3 : Evolution de la progestéronémie en fonction du statut physiologique de la vache,
d’après [65]
Cycle 1
Cycle 2
Le dosage de la progestérone peut se faire soit par radio-immunologique (RIA) soit par
une méthode immuno-enzymatique (EIA), sur plasma ou sérum, ou sur du lait dans un pot
contenant un conservateur, en début de traite du matin car la mesure de la concentration de la
progestérone varie selon la teneur en graisses du lait.
Sur plasma, le test est positif au-dessus de 2 ng/mL et négatif en-dessous de 1 ng/mL
[65]. Il existe donc des cas dits « douteux », entre 1 et 2 ng/mL.
L’inconvénient majeur de cette technique de diagnostic est la variabilité de la durée du
cycle de la vache. Ainsi, l’absence de progestérone assure à presque 100% que la vache n’est
pas gestante, mais un taux encore élevé de progestérone peut être lié à un retard du cycle ou à
un cycle court et ne garantit qu’à 65-75% la gestation [15]. De plus, c’est un test onéreux.
b. Dosage des PAG (Pregnancy Associated Glycoproteins)
Les PAG sont des glycoprotéines sécrétées par les cellules binucléées du
trophectoderme (cellules qui migrent vers et fusionnent avec les cellules épithéliales utérines,
permettant le passage de ces protéines qui passent dans la circulation générale maternelle).
Actuellement, on peut les détecter par dosage radio-immunologique à partir de 30
jours de gestation. A partir de cette date, leur taux augmente avec le poids du placenta,
d’abord progressivement jusqu’à la 35ème semaine, puis plus rapidement jusqu’à la fin de la
gestation où leur maximum se situe autour de 2,5 g/mL. Ces tests sont fiables et précis assez
tôt : par exemple, il a été montré que le dosage de PSPB (une PAG) avait une sensibilité de
92%, une spécificité de près de 83%, une valeur prédictive positive proche de 82%, et une
valeur prédictive négative de 92,5% à 30 jours [80].
Toutefois, après le vêlage et l’expulsion du placenta, les PAG restent détectables
(> 2 ng/mL) entre 70 et 100 jours [40], du fait de leur demi-vie relativement longue (environ 8
16
jours). Ainsi, sur une vache multipare, le dosage ne peut s’effectuer que si l’on se trouve à
plus de 100 jours après le dernier vêlage.
A ce jour, seuls trois laboratoires en France réalisent ce dosage (UNCEIA MaisonsAlfort, INRA Tours Nouzilly, INRA Jouy en Josas).
c. Dosages non utilisés en routine
Le dosage des œstrogènes (œstrone, œstradiol, sulfate d’œstrone) n’est possible qu’à
partir d’environ 100 jours de gestation, ce qui n’a pas d’intérêt pour un diagnostic de gestation
précoce. En revanche, il permet d’évaluer la viabilité fœtale au cours de la gestation [34, 3].
L’Early Conception Factor (ECF) est une glycoprotéine présente dans le sérum dès 48
heures de gestation. Une tentative de diagnostic de gestation très précoce a été réalisée par
dosage de l’ECF à 6 jours de gestation, mais les résultats obtenus étaient décevants, avec une
sensibilité de 86% mais une spécificité de 4% [17].
L’hormone lactogène placentaire, ou hormone chorionique somatomammotrope,
produite également par les cellules binucléées du trophectoderme, comme les PAG, n’est
détectable avec certitude dans le sérum des vaches gestantes qu’à partir du 110ème jour de
gestation, ce qui ne présente pas d’intérêt en routine [64].
3) Intérêt du développement d’une nouvelle méthode de diagnostic de
gestation
Le cycle œstral de la vache dure 21 jours, et chacune des méthodes décrites ci-dessus
n’apporte pas de résultat fiable avant trois semaines. Ainsi, en cas d’échec d’une première
insémination, à moins de surveiller attentivement le retour en chaleur de la vache (ce qui ne
garantit pas de le voir), il est nécessaire d’attendre le cycle suivant pour réaliser une nouvelle
tentative. Il serait donc intéressant de mettre en place une technique de diagnostic simple et
précoce, comparable au test de grossesse réalisé chez la femme par dosage de la
gonadotrophine.
Toutefois, le taux de résorption embryonnaire étant élevé en début de gestation (40%
entre le 15ème et le 17ème jour de gestation [80]), il faudrait pouvoir le différencier d’un défaut
de fertilité ou de cyclicité. Il serait donc également intéressant de pouvoir évaluer la viabilité
de l’embryon et la qualité de son implantation. Pour cela, il faut s’interroger sur les
mécanismes moléculaires et hormonaux qui régissent la gestation et trouver un ou des
marqueurs précoces de l’implantation de l’embryon dans l’utérus.
17
C) L’interféron tau : rôles et intérêt pour le diagnostic de gestation
1) Rôles de l’interféron tau dans la reconnaissance de la gestation
a. Inhibition de la cascade lutéolytique
Afin de permettre l’implantation de l’embryon, l’endomètre utérin subit de
nombreuses modifications. Celles-ci sont permises par la production d’hormones par les
glandes endométriales, situées dans l’espace intercaronculaire, sous l’influence de la
progestérone produite par le corps jaune [66]. Cette dernière stimule également l’élongation
de l’embryon [67].
La persistance du corps jaune, et donc l’inhibition de la cascade lutéolytique en fin de
cycle œstral, est donc essentielle à la poursuite de la gestation. Ceci est permis par la
production d’interféron tau (INFT) [72, 35, 41]. Il s’agit d’un interféron de type I, produit par
les cellules mononucléées du trophectoderme [67] entre les jours 12 et 15 chez les ovins et 14
à 17 chez les bovins [31]. Il agit de deux manières dans l’inhibition de la lutéolyse (Figure 4) :
- De manière directe sur le corps jaune [6], en inhibant la production de PGF2α ou
en détruisant la PGF2α lutéale.
De manière indirecte : il inhibe la transcription des gènes codant les récepteurs alpha aux
œstrogènes situés dans la lumière et sur l’épithélium glandulaire. Les œstrogènes stimulant la
production des récepteurs à l’ocytocine et donc la production de prostaglandines PGF2α,
l'IFNT entraine donc une diminution de la production de prostaglandines PGE2α, ce qui
augmente le rapport PGE2/PGF2 [31].
18
Figure 4 : Inhibition de la cascade lutéolytique par l’INFT
PGF2
R
OCYT
Cellule
endométriale
CJ
R
E2
INFT
Cellule mononucléée
du trophectoderme
Légende
CJ : corps jaune
PGF2 : prostaglandine F2α
OCYT : ocytocine
E2 : œstrogène
INFT : interféron tau
R : récepteur
: production
: inhibition
directe
indirecte
: stimulation
19
b. Réaction immunitaire locale
L’arrivée d'un embryon dans l'utérus, corps étranger vis-à-vis de l'organisme maternel,
entraîne une réaction immunitaire locale qui permet une tolérance de l'embryon et protège la
gestation d'éventuels organismes pathogènes.
Cette réaction immunitaire locale se traduit notamment par la production d’INFT
puisque, tout comme les autres interférons, l’INFT possède également des propriétés
antivirales, antiprolifératives et immunomodulatrices [57]. Ainsi, l’INFT intervient
directement dans les mécanismes de mise en place de la gestation et serait donc une molécule
pertinente à doser pour un diagnostic de gestation précoce. Toutefois, aucune méthode à ce
jour ne permet de le détecter dans la circulation sanguine [64]. Les molécules dont la
production est induite par cet interféron représentent donc des pistes à explorer.
2) Mécanismes d’action de l’interféron tau
a. Action paracrine de l’interféron tau
Knickerbocker et al. [43] ont étudié la localisation des récepteurs à l’INFT chez la
brebis. Ils sont répartis uniformément sur l’ensemble de l’endomètre, sans qu’il y ait de
différence de concentration entre les zones cotylédonaires et intercotylédonaires, que ce soit
dans la corne controlatérale ou ipsilatérale au corps jaune. L’occupation de ces récepteurs par
l’INFT varie au cours du cycle et selon le statut physiologique. En effet, elle est maximale au
4ème jour du cycle et diminue jusqu’au 12ème jour. A ce moment là, elle continue de diminuer
chez un animal non gestant mais augmente en cas de gestation, tout comme l’affinité de ces
récepteurs pour l’INFT [43].
De plus, il a été mis en évidence que lors d’injection d’INFT dans une corne utérine de
brebis, l’autre ayant été ligaturée pour empêcher la circulation des fluides, seuls les gènes
codant pour les récepteurs aux œstrogènes de la corne injectée étaient inhibés [65]. L’INFT
agit donc de manière locale sur l’endomètre dès le début de la gestation, induisant
l’expression de certains gènes. Ainsi, chez la brebis, on a retrouvé une forte expression du
gène ISG15 (Interferon Stimulated Gene 15), dès le 13ème jour de gestation dans l’épithélium
luminal mais aussi les cellules du stroma situées juste en dessous, ainsi que dans l’épithélium
glandulaire superficiel [39]. Au 15ème jour de gestation, les ARNm de ce gène sont présents
plus profondément dans l’épithélium et jusque dans le myomètre utérin [39]. Le même
phénomène a été décrit chez la brebis par Ott et al. [55] pour un autre gène, MX (Myxovirus
resistance), induit par l’INFT. En effet, en cas de gestation, ce gène est surexprimé dès le
13ème jour dans l’épithélium glandulaire et dans le stroma, puis dans le myomètre au 15ème
jour.
20
L’INFT induit donc, dès le 13ème jour de gestation chez la brebis, l'expression de
certains gènes. Cette induction a lieu progressivement dans toute l’épaisseur de la paroi
utérine, de la surface de l’endomètre à la profondeur du myomètre. Il s’agit donc de
phénomènes paracrines.
b. Action endocrine de l’interféron tau
Chez la brebis, au 15ème jour de gestation, ISG15 et OAS-1 (2’-5’-oligoadenylate
synthetase 1) sont surexprimés dans les cellules sanguines issues de la veine et de l’artère
utérines, ainsi que dans le corps jaune [48]. L’induction des ISG par l’INFT a donc aussi lieu
en dehors de l’endomètre. De plus :
- L’injection d’INFT dans le corps jaune n’induit pas de surexpression d’ISG15 [48,
78], contrairement à une injection d’INFT par voie sous-cutanée, ce qui suppose
l’existence d’un mécanisme autre que paracrine au niveau du corps jaune ;
- Au 15ème jour de gestation, l’activité antivirale de l’INFT dans la veine utérine est
500 à 1000 fois plus importante que dans l’artère utérine. Toutefois, la
concentration des gènes stimulés par les interférons (Interferon Stimulated Genes =
ISG) tels que ISG15 est la même dans la veine utérine, dans l’artère utérine et dans
la veine jugulaire [48] ;
- L’induction des leucocytes mononucléés au moment de leur passage dans l’utérus
avant d’être drainés par voie lymphatique a été exclue car l’expression d’ISG15
dans les LMC est identique dans les nœuds lymphatiques utérins et périphériques
[48].
Ces observations chez la brebis permettent de supposer que la stimulation de
l'expression de ces gènes ailleurs que dans l'utérus n’est pas uniquement paracrine mais fait
intervenir des intermédiaires dans la circulation périphérique [6]. Ainsi, l'IFNT est sécrété par
le trophectoderme et passe dans la circulation générale par la veine utérine où il stimule les
ISG par voie endocrine.
Notons qu’aucune augmentation de la concentration des protéines codées par ISG15 et
OAS-1 n’a été observée dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, les
érythrocytes et les granulocytes neutrophiles [48]. On obtiendra donc probablement une
meilleure sensibilité si l’on recherche une augmentation de l’expression de ces gènes dans les
lymphocytes mononucléés isolés plutôt que sur du sang total.
21
3) La famille des ISG
Les gènes stimulés par les interférons, et notamment l’INFT, ont été regroupés sous le
nom d’ISG. Plus de 100 ISG ont été mis en évidence [24]. Parmi eux, on trouve le gène de la
OAS-1, [48], PBEF1 (pre-B-cell colony-enhancing factor 1 ou visfatine) [60], STAT-1 et
STAT-2 (signal transducers and activators of transcription) qui sont des facteurs de
transcription [31], certains gènes du complexe majeur d’histocompatibilité de classe 1
(CMH1) et le gène de la β2-microglobuline [59], des facteurs de régulation des interférons
IRF1 et IRF2 (Interferon Regulator Factors) [31, 15], MX2 et ISG15 [30, 14].
Si la fonction de ces gènes est en général connue, leur rôle exact dans la gestation n’est
pas vraiment déterminé. Par exemple, on sait que la protéine ISG15 se lie à des protéines
intracellulaires précocement durant la gestation [38], supposant qu’elle module leur
conformation et leur expression, sans comprendre réellement son mode d’action.
D) Application au diagnostic de gestation
1) Utilisation de la Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain
Reaction (RT-qPCR) sur un échantillon sanguin : intérêts
L'IFNT n'étant pas quantifiable dans le sang, la mise en évidence de sa présence par la
quantification du niveau d'expression des ISG afin de diagnostiquer une gestation est
envisagée. La quantification du niveau d’expression, sous forme d’ARN messager, d’un gène,
peut être effectuée à l’aide de la technique de RT-qPCR, également appelée RT-PCR en
temps réel (voir II).
De plus, on a vu que la surexpression des ISG lors de gestation était mesurable dans
les cellules endométriales dès le 13ème jour de gestation chez la brebis. Toutefois, un
diagnostic de gestation faisant intervenir une biopsie utérine ne présentant aucun intérêt, des
études ont été menées pour mesurer cette surexpression sur des prélèvements sanguins. Cela
présente l’avantage d’une innocuité totale.
2) Mesure de l’ARN messager (ARNm) des ISG sur un prélèvement
Il a été montré que des gènes comme ISG15 ou OAS-1 étaient surexprimés dans les
cellules sanguines de la circulation périphérique au 15ème jour de gestation chez la vache [6].
De même, différentes études sur des vaches et des brebis ont montré que, dans les LMC, le
niveau d'expression de MX2 augmentait largement à J16 et celui d'ISG15 à 18 jours par
comparaison à des femelles non gestantes [27, 67, 79]. En revanche, l’augmentation du niveau
d'expression de MX1 n'était pas significative à J20 et aucune modification du niveau
d'expression d'IRF1 et IRF2 n’a été observée [27].
22
Suite à ces observations, des tests de diagnostic de gestation sur des vaches à 18 jours
de gestation ont été évalués, soit par la quantification des ARNm d’ISG15 sur sang total
prélevé sur un tube EDTA (Ethylene Diamine Tétraacétic Acid) par Han et al. [30], soit par la
mesure du niveau d’expression de MX2 dans les LMC par Stevenson et al. [68]. Le tableau 1
expose les résultats de ces essais. Comme pour le dosage de progestérone, les résultats de Han
et al. étaient meilleurs en réalisant une série de prélèvements sanguins sur plusieurs jours.
La faible fiabilité de ces tests a amené les chercheurs à s’orienter vers des gènes ne
dépendant pas de l’IFNT.
Notons toutefois que l’expression d’ISG15 et de MX2 peut également être reliée à la
viabilité de l’embryon. Ainsi, un faible niveau d’expression de ce gènes à 18 jours est corrélé
à un plus fort taux de résorption embryonnaire [43, 79].
Tableau 1 : Comparaison des tests de diagnostic de gestation par quantification
d’ARNm d’ISG avec un test à la progestérone [30, 68]
Test
Sensibilité
Spécificité
Valeur prédictive
positive
Valeur prédictive
négative
Progestérone
[32]
/
/
Han et al. (2006)
/
/
Stevenson et al.
(2007)
57%
63%
47%
62%
63%
100%
89%
57%
23
24
II) Facteurs influençant la quantification des ARNm
Le niveau d’expression des gènes à un moment donné peut donc donner des
informations précises sur le statut physiologique de l’animal. Toutefois, les quantités
d’ARNm mesurées sont elles le véritable reflet de l’expression génétique au moment du
prélèvement ?
A) La technique de RT-PCR en temps réel : fiabilité de la mesure de la quantité réelle
d’ARNm
1) RT-PCR : principe [1]
La RT-PCR comporte deux étapes : une première étape de rétrotranscription, où
l’ARN est transformé en ADN complémentaire (ADNc) beaucoup plus stable, puis une étape
de PCR où l'ADNc correspondant au gène choisi est amplifié grâce à des amorces spécifiques
(Figure 5).
Figure 5 : Etapes constituant un cycle de PCR, d’après [1]
A
B
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
C
Légende : A : séparation des brins
B : hybridation des amorces
C : élongation du brin complémentaire par la Taq polymérase
Trois types d’amorces (ou primers) peuvent être utilisés pour la première étape qui
transforme l’ARN en ADNc (Figure 6) :
- des oligonucléotides dT qui se fixent sur la queue polyA des ARN,
- des amorces random qui amplifient des ADNc de grande taille sous forme de
fragments,
- des amorces spécifiques de la séquence que l’on souhaite transformer en ADNc.
25
Figure 6 : Amorces utilisables en RT-PCR
A
C
B
L’intérêt de la RT-PCR en temps réel est la mesure quantitative de l’ARN initial, grâce
à l’observation de la cinétique de la réaction de PCR. Pour cela, plusieurs techniques de
fluorescence existent pour mettre en évidence le nombre de copies d’ADN au cours du temps
(Figure 7) :
- les agents intercalants qui s’insèrent entre les deux brins de l’ADN (donc de tous
les ADN amplifiés par PCR) lorsqu’ils sont appariés, le plus utilisé étant le
SYBR® Green (Applied Biosystems, Carlsbad, USA),
- les sondes : ce sont des amorces spécifiques des brins amplifiés qui émettent un
signal fluorescent après s’être liées à l’ADN d’intérêt. Les plus employées sont les
sondes TaqMan® (Applied Biosystems, Carlsbad, USA).
26
Figure 7 : Comparaison des deux techniques de fluorescence : SYBR® Green et TaqMan®
(Applied Biosystems, Carlsbad, USA), d’après [70].
A
B
ADN
1)
1)
ADN
ADN
ADN
ADN
2)
2)
ADN
ADN
ADN
ADN
3)
3)
ADN
ADN
Légende :
A : Fluorescence en utilisant une sonde TaqMan®
1) Un rapporteur fluorescent et un quencher sont fixés respectivement aux extrémités 3’ et
5’ de la sonde TaqMan®.
2) Quand la sonde est intacte, le rapporteur n’émet pas de fluorescence.
3) Au moment de la polymérisation de l’ADN double brin, le rapporteur est clivé et,
séparé du quencher, il devient fluorescent.
Sonde TaqMan®
Rapporteur fluorescent
Quencher
B : Fluorescence en utilisant le SYBR® Green
1) Lorsque les brins de nucléotides ne sont pas appariés, le SYBR® Green n’émet pas de
fluorescence.
2) Au cours de la polymérisation de l’ADN double brin, la fluorescence augmente.
3) Lorsque le brin d’ADN est entièrement polymérisé, la fluorescence est maximale.
SYBR® Green
27
2) Défauts de mesure liés à la rétrotranscription : importance du choix des
primers
Au moment de la rétrotranscription, quel que soit l’amorce utilisée, des amorces
endogènes peuvent modifier l’ADNc rétrotranscrit et aboutir, après la PCR, à un résultat
inférieur à la quantité réelle d’ARNm initiale [11].
Lors de l’utilisation d’amorces random, la majorité des ARN transcrits est constituée
d’ARN ribosomaux, ce qui peut poser problème si l’ARN cible est présent en très petite
quantité. Dans ce sens, l’utilisation d’oligo dT est plus spécifique puisqu’elle ne rétrotranscrit
pas les ARN ribosomaux ; toutefois l’inconvénient de ces amorces est la nécessité d’un ARN
d’excellente qualité puisqu’il doit avoir conservé sa queue polyA.
L’utilisation d’amorces spécifiques est la méthode donnant de meilleurs résultats,
notamment pour des ARN rares car cela évite la rétrotranscription des autres ARN qui diluent
les ARN d’intérêt. Toutefois, dans le cas de l’amplification de plusieurs gènes, elle nécessite
plusieurs réactions séparées, ce qui a, bien sûr, des conséquences pratiques et financières.
3) Défauts de mesure liés à la réaction de PCR
La première limitation de la PCR est l’effet "Monte Carlo" qui limite l’amplification
des fragments d’ADNc présents en petite quantité : plus la concentration d’un élément est
faible, moins sa concentration après amplification sera proche de la réalité [11].
La deuxième limite vient de l’analyse de la fluorescence émise. Lors de l’utilisation
d’un agent intercalant, la fluorescence sera d’autant plus grande que le fragment d’ADN est
long, ce qui rend imprécis le nombre de copies déduites de cette fluorescence. De plus, les
amplifications non spécifiques émettent également de la fluorescence. Lors de l’utilisation
d’une sonde, la fluorescence émise est spécifique de la cible qui est amplifiée, mais une
simple mutation peut empêcher la sonde de se fixer et donner ainsi de faux négatifs [11].
4) Méthodes de normalisation utilisées
Afin de s’assurer de la fiabilité de la comparaison des résultats, plusieurs méthodes de
normalisation peuvent être utilisées [35]. Leur but est de corriger la variabilité des résultats
due aux différentes étapes de l’analyse des prélèvements : tailles d’échantillon différentes,
qualité de la conservation de l’ARN, efficacité de la synthèse d’ADNc.
28
a. Normalisation de la taille des prélèvements
La première méthode, pour s’assurer que les mesures d’ARN de deux prélèvements
sont comparables, est de réaliser des échantillons de même taille. On réalise ainsi des
prélèvements sanguins de même volume ou le cas échéant des prélèvements de tissus de
même taille et poids. Cette technique ne présente toutefois pas toujours une bonne fiabilité.
Par exemple, deux prélèvements sanguins ne contiennent pas toujours la même quantité de
cellules [19]. Il est alors difficile de comparer l’expression d’un gène entre ces deux
prélèvements.
b. Normalisation par rapport à la quantité d’ARN total
Cette technique consiste à rapporter les quantités d’ARNm variables des gènes
d’intérêt à la quantité totale d’ARN dans le prélèvement. La majorité des ARN totaux est
constituée d’ARN ribosomaux, et on s’appuie alors sur l’hypothèse que ceux-ci représentent
80% de l’ARN total et que ce rapport ne change pas.
Mais cette technique présente des inexactitudes puisque les ARNm mesurés ne
représentent que 1 à 5% des ARN totaux et que leur concentration peut ainsi changer sans
modifier la quantité d’ARN total. De plus, Johansson et al. [37] ont montré que la proportion
d’ARNm par rapport aux ARN totaux variait selon les techniques d’extraction des ARN
utilisées.
c. Normalisation par rapport à l’ADN génomique
On peut normaliser les quantités d’ARNm à la quantité d’ADN génomique, qui reste
stable selon le statut physiologique de l’animal et est moins fragile que l’ARN. Cette
technique pose l’inconvénient de nécessiter une réaction supplémentaire pour mesurer la
quantité d’ADN. De plus, la mesure de la quantité d’ADN peut inclure l’ADN de bactéries
qui est parfois non négligeable dans certains prélèvements [69].
d. Utilisation de gènes de référence
Le principe de cette méthode repose sur la mesure de l’expression de gènes de
référence, appelés également gènes de ménage, connus pour avoir une expression forte et
stable, dans toutes les cellules nucléées de l’organisme, quel que soit le statut physiologique
de l’animal prélevé. Les mesures de quantité d’ARN de gènes cibles sont rapportées à la
quantité d’ARN de ces gènes de référence [37].
Les gènes de ménage les plus couramment utilisés sont les gènes codant la β-actine, la
Glyceraldéhyde-3-Phosphate
Déshydrogénase
(GAPDH),
l’Hypoxanthine-Guanine
29
Phosphoribosyl Transférase (HPRT) ou l’ARN ribosomal 18S. Ils ont été choisis pour la RTPCR en temps réel car leurs qualités de gènes de référence avaient été historiquement
prouvées pour le Northern Blot et la RT-PCR conventionnelle notamment [37].
e. Normalisation par rapport à une molécule artificielle
Cette méthode repose sur l’incorporation, au moment de la rétrotranscription, d’une
concentration connue d’une molécule d’ARN clonée in vitro ou synthétisée. Actuellement,
l’utilisation de cette méthode reste limitée du fait de son coût élevé [37].
Des techniques existent donc pour rendre les résultats de la RT-PCR en temps réel les
plus représentatifs possibles de la quantité d’ARNm présente dans le prélèvement au moment
de la réaction. Mais cette quantité est-elle le reflet exact du statut physiologique de l’animal,
autrement dit, est-elle identique à celle que l’on mesurerait in vivo ?
B) Modification de la quantité réelle d’ARNm dans le prélèvement
1) Dégradation des ARN au cours du temps
La conservation de sang total dans un tube avec EDTA entraîne une dégradation
rapide et importante de la quantité d’ARN total [56, 50]. Ainsi, Pahl et Brune ont montré que
la quantité d'ARN était divisée par deux en moins de 24 heures, comme l’illustre la figure 8
[50].
Concentration en ARN
(%)
Figure 8 : Evolution au cours du temps de la quantité d’ARN dans du sang total, prélevé sur
EDTA et conservé à température ambiante, d’après [50].
Temps (jours)
Légende : * p<0,05 ; ** p< 0,01 par rapport à la quantité initiale
30
L’hypothèse la plus probable pour expliquer cela est la libération d’endonucléases lors
de la lyse des cellules sanguines consécutive à la prise de sang.
2) Activation génique ex vivo
a. Mise en évidence d’une modification de l’expression génique
au sein d’un prélèvement conservé à température ambiante, en
l’absence de stabilisateur
La conservation d’un prélèvement sanguin pendant une nuit à température ambiante
modifie de manière spécifique les quantités d’ARN mesurées. En effet, Baechler et al. [4] ont
identifié 2034 gènes dont l’expression subissait des variations plus ou moins importantes dans
les premières heures. Selon les gènes, on observe une activation ou une inhibition de
l’expression.
La plupart de ces gènes sont connus pour intervenir dans des situations de stress et
jouent un rôle dans la transcription, l’apoptose, la réponse immunitaire ou le cycle cellulaire
[28, 18]. On peut noter que deux des gènes choisis pour la partie expérimentale du travail
présenté ici, le gène oncogène FOS (Finkel-Biskis-Jinkins osteosarcoma oncogene) et STAT1, avaient un niveau d’expression respectivement multiplié par plus de 1000 et divisé par 10
en une nuit, et font ainsi partie des gènes sensibles aux conditions de conservation.
De plus, une importante réaction inflammatoire, objectivée par différents phénomènes,
tels qu'une augmentation de la synthèse de cytokines et une modification de l'expression de
gènes par les cellules leucocytaires mononucléées dès les premières heures qui suivent le
prélèvement sanguin, a été mise en évidence.
Ainsi, Pahl et Brune [50] ont montré que l'expression de TNFα (Tumor Necrosis
Factor) sur un prélèvement réalisé sur un tube avec EDTA et conservé à température
ambiante augmentait de manière importante, quelle que soit la méthode de normalisation
utilisée (Figure 9).
31
ARNm du TNFα
(expression relative)
Figure 9 : Evolution au cours du temps du niveau d'expression du TNFα, rapportée à
l’expression de l’actine, l’ARN 18S, la GAPDH ou la concentration totale d’ARN, dans un
prélèvement de sang total prélevé dans un tube avec EDTA, d’après [46].
Temps (jours)
Légende : ** = p< 0,01 par rapport à l’ARN total au moment de la prise de sang
RNA conc = concentration totale d’ARN
Une modification de l’expression d’autres gènes codant pour des cytokines a
également été observée. Par exemple :
- l'expression des interleukines (IL) IL-6 et IL-8 [50, 28] subissaient une forte
augmentation,
- l'expression d’IL-1β diminuait les six premières heures, augmentait pendant 3 jours
puis diminuait jusqu’à atteindre sa valeur initiale au septième jour [50].
Ils ont également montré des modifications des proportions des différentes populations
cellulaires. L’étude du ratio de l’expression d’INFγ (Interferon gamma) sur IL-4 suite à un
prélèvement sanguin sur anticoagulant a mis en évidence une modification au cours du temps
de l’expression des gènes de la population lymphocytaire, traduisant une augmentation de
l’expression génique des lymphocytes T helper 1 (TH-1) par rapport à celle TH-2 [50].
De même, on observe une augmentation de l’expression des gènes spécifiques des
monocytes et des lymphocytes T régulateurs, prouvée par une augmentation de la production
d’IL-10 [50], dans les 24 heures suivant le prélèvement.
Ainsi, suite à un prélèvement sanguin, les leucocytes mononucléés circulants
modifient leur profil d’expression et sont plus ou moins activés selon les populations.
Ces modifications de l’activité génique se produisent très rapidement puisqu’on en
observe les effets dès les deux premières heures après le prélèvement [28]. Pahl et K. Brune
[50] ont également montré que l’ajout d’actinomycine D, inhibiteur de la transcription, ne
stabilisait la quantité d’ARN de TNFα que si l'ajout avait lieu le premier jour. Ainsi, les
32
modifications d'expression de gènes consécutives au prélèvement ont lieu essentiellement
dans les premières 24 heures.
b. Hypothèses explicatives
Plusieurs hypothèses ont été énoncées pour expliquer cette réaction des cellules
immunitaires. La première est la modification du milieu plasmatique, caractérisée par :
- une situation d’hypoxie, avec une diminution de la pression de dioxygène et une
augmentation de la pression de dioxyde de carbone [28]. En effet, l’expression de
DUSP1 (Dual specificity protein phosphatase 1), codant pour une protéine
(phosphatase) exprimée dans des conditions de stress oxydatif, est augmentée lors du
stockage du prélèvement sanguin pendant une nuit [4],
- une diminution du glucose et une augmentation du lactate,
- une diminution du pH [28].
A cela s’ajoute une modification de l’environnement sanguin : le contact avec les
parois du tube est différent de celui des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins [56, 50].
On peut citer également le contact avec l’hémoglobine libérée lors de la lyse des globules
rouges [56] ainsi qu’une éventuelle légère coagulation involontaire lors du prélèvement [56].
Des études ont également montré que les conditions de prélèvement influent sur la
qualité des échantillons. Ainsi, la vitesse de prélèvement a des conséquences sur la production
de cytokines. En effet, Härtel et al. [32] ont montré que l’augmentation importante du flux
sanguin lors de la prise de sang était liée à une augmentation significative de l’expression
d’IL-2, IL-4 et de TNFα dans les premières 24 heures, par rapport à un prélèvement réalisé
lentement.
De plus, Marteau et al. [44] ont montré que la qualité et la quantité de l’ARN total
mesurées étaient meilleures lorsque le prélèvement sanguin avait été effectué sur un tube avec
EDTA plutôt que sur un tube avec héparine.
33
34
III) Stabilisation de l’ARN et méthodes d’extraction
A) Stabilisation des ARN au cours du stockage des prélèvements
1) Congélation des prélèvements sanguins
La congélation des prélèvements sanguins entraîne la lyse d’un grand nombre de
cellules, libérant des endonucléases qui détruisent le matériel génétique. De plus, l’ARN est
ensuite difficile à isoler puisque qu’il est emprisonné dans les débris cellulaires [9]. Des
stabilisateurs de l’ARN ont donc été mis au point.
2) Ajout d’un stabilisateur avant conservation : les tubes PAXgene®
L’ajout de Trizol (solution chimique contenant du thiocyanate de guanidine et du
phénol) stabilise les concentrations d’ARNm spécifique [50]. Toutefois, ajouter quelques
millilitres d’une solution de Trizol dans un tube avec EDTA immédiatement après le
prélèvement est difficilement réalisable lors de prélèvements de routine. Des tubes contenant
déjà un stabilisateur du matériel génétique ont donc été développés : les tubes PAXgene®
(Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France).
a. Description
Ces tubes pouvant recevoir 2,5 mL contiennent un stabilisateur du matériel génétique.
Un kit spécial, le PAXgene Blood RNA Kit® (Qiagen, Courtabœuf, France) doit être utilisé
pour l’extraction des ARN sur sang total.
b. Comparaison de la conservation du matériel génétique dans
les tubes PAXgene® et les tubes contenant de l'EDTA :
quantité et qualité de l’ARN total
Il a été montré que les tubes PAXgene® permettaient la conservation de la quantité
d’ARN total. En effet, Beekam et al. [36] ont travaillé sur des échantillons qui avaient été
congelés immédiatement après le prélèvement. Des tubes PAXgene® ont été incubés une
journée à température ambiante alors que des tubes EDTA ont décongelé pendant 2 heures
dans de la glace. Suite à ces traitements, les tubes PAXgene® contenaient 40 fois plus d’ARN
que les tubes avec EDTA.
Jia et al. [56] ont également montré qu’après 30 jours de congélation, on mesurait 100
à 120% de l’ARN total initial sur les tubes PAXgene® contre 20% sur des tubes avec EDTA.
35
Beekman [9] a également montré que la qualité de l’ARN total était bien meilleure
avec les tubes PAXgene®, en utilisant trois paramètres :
- Le RIN (RNA Integrity Number) est une mesure de la qualité (valeur de 1 à 10, 10
équivalant à des ARN de très grande qualité) fondée sur la marque électrophorétique
de l’ARN. Il était en moyenne proche de 10 pour les ARN provenant des tubes
PAXgene® alors qu’il n’a pu être déterminé pour les ARN provenant des tubes avec
EDTA.
- La taille de l’ARN : elle avoisinait les 1500 bases en moyenne pour les ARN
provenant des tubes PAXgene®, contre 250 bases en moyenne pour les ARN
provenant des tubes avec EDTA.
- Le ratio GAPDH 3’/5’ est obtenu en ajoutant des sondes se fixant sur les extrémités 3’
et 5’ des ARNm de GAPDH et permet ainsi d’évaluer la quantité d’ARNm ayant
entièrement été transcrits. Il augmente donc lorsque la qualité des ARN diminue
(recommandations : inférieur à 3). Il était en moyenne proche de 1 pour les ARN
provenant des tubes PAXgene® et en moyenne supérieur à 4 pour les ARN provenant
des tubes avec EDTA.
c. Conservation de l’expression génique spécifique
Il a été montré que la conservation des prélèvements à température ambiante pendant
plusieurs jours ne modifiait pas les concentrations des ARN spécifiques. En effet, Rainen et
al. [56] ont comparé l’évolution sur cinq jours, de la quantité d’ARNm spécifiques de 25
gènes dans du sang total prélevé dans un tube avec EDTA et dans un tube PAXgene® et
conservé 24 heures à température ambiante. Ils ont démontré la stabilité des ARNm
spécifiques conservés dans des tubes PAXgene®, par rapport à ceux conservés dans des tubes
avec EDTA (figure 10).
36
Figure 10 : Effet des conditions de conservation de sang total sur l’expression relative à T0 au
cours du temps (T0+4 h ; T0+8 h ; T0 + 24 h ; T0 + 3 j. ; T0 + 5 j.) de 25 gènes, d’après [52]
Légende : A : conservation dans un tube avec EDTA ; B : conservation dans un tube PAXgene®
IL = Interleukine ; INF = Interféron ; TGF = Transforming growth factor ; TNF = Tumor Necrosis
Factor ; COX = Cyclo-oxygénase ; ICE = Interleukin-1 beta-converting enzyme ; CJUN = Protooncogene c-Jun ; MMP = Matrix metalloproteinase ; UPA = Urokinase-type plasminogen activator ;
HSP = Heat shock protein ; CRE = Causing recombination ; ICAM = Intercellular Adhesion Molecule
; FOS = Finkel-Biskis-Jinkins osteosarcoma oncogene ; MYC = Myelocytose ; CYP2D6
= Cytochrome P450 2D6 ; NFKB = Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells ;
STAT = Signal Transducer and Activator of Transcription ; P53 = Protéine 53 ; BCL = B-cell
lymphoma 2 ; ENOS = Endothelial nitric oxide synthase ; BAX = BCL-2-associated X protein.
37
a. Répétabilité
Feezor et al. [21] ont montré une répétabilité satisfaisante des niveaux d'expression de
gènes mesurés par analyse transcriptomique à partir de sang total prélevé dans des tubes
PAXgene®.
b. Adaptation aux conditions de température
Thach et al. [71] ont montré que conserver les tubes PAXgene® à température
ambiante quelques heures (jusqu’à neuf heures) avant de les congeler n’altérait pas la qualité
de l’ARN et n’avait qu’une influence minime sur la variabilité des niveaux d’expression des
gènes étudiés.
Ces résultats sont donc en faveur d’une utilisation simple et rapide des tubes
PAXgene® dans le cadre d’études épidémiologiques ou diagnostiques, grâce à la qualité de la
conservation du matériel génétique du sang total, notamment à température ambiante.
Toutefois, on se place ici dans le cadre de la quantification de l’expression de gènes en
lien avec l’immunité et principalement exprimés par les leucocytes. On peut donc envisager
l’isolement de ceux-ci afin de mesurer plus efficacement les modifications de leur expression.
B) Isolement des leucocytes avant extraction de l’ARN
1) Comparaison de l’expression génique des leucocytes par rapport au sang
total
Hammerle-Fickinger et al. [29] ont comparé la quantité et la qualité des ARN extraits
à partir de sang total ou après isolement des leucocytes par lyse des érythrocytes. Ils ont
obtenu avec l'isolement des leucocytes purifiés une plus grande quantité et une meilleure
qualité d’ARN total.
De même, Feezor et al. [21] ont voulu déterminer si 2 méthodes d'extraction des ARN
(extraction des ARN après isolement des leucocytes prélevés dans un tube avec héparine et
extraction des ARN à partir de sang total collecté dans un tube PAXgene®) avaient les mêmes
capacités pour détecter des modifications de niveaux d'expression suite à une stimulation ex
vivo (par ajout de l'entérotoxine B staphylococcique juste après le prélèvement de sang), grâce
à une analyse transcriptomique. Ils ont constaté que la première méthode (isolement des
leucocytes) était significativement plus fiable que la seconde. Cette différence serait
majoritairement liée aux gènes spécifiques des érythrocytes, très abondants dans le sang total.
Toutefois, l’utilisation de la RNase H associée à des marqueurs spécifiques des principaux
gènes de l’hémoglobine afin d’éliminer l’expression de ces gènes n'a pas suffit à conduire à
38
des résultats identiques à ceux obtenus avec les leucocytes isolés, ce qui suggère que d’autres
gènes, comme ceux associés aux thrombocytes, constituaient aussi des artefacts.
Ainsi, il semble avantageux de mesurer l’expression génétique uniquement sur les
leucocytes afin d’éviter les imprécisions liées aux gènes liés spécifiquement aux autres
éléments figurés du sang (érythrocytes et thrombocytes).
2) Isolement des leucocytes mononucléés circulants (LMC) par la méthode
Percoll
a. Principe
Le principe consiste à séparer les différentes populations cellulaires du sang par un
gradient de densité et de taille.
Pertoft et al. [54] ont décrit en 1979 la méthode suivante :
- Mélange de 10 mL de Percoll dilué à 70% dans du NaCl (support de gradient de
densité, voir après) à 0,15 mmol/L, centrifugés pendant 15 minutes dans un rotor
d’angle 14° à 20 000 g.
- Deux mL de ce gradient sont retirés du fond du tube et 2 mL de sang dilué à 50% dans
du NaCl à 0,15 mmol/L est déposé au dessus.
- L’ensemble est centrifugé comme indiqué sur la figure 11.
39
Figure 11 : Obtention d’un gradient de densité avec du Percoll, permettant de séparer les
cellules sanguines humaines [12]
Légende : MNC = Mononuclear Cells (LMC) ; PMNC = Polymorphonuclear Cells
Polynucléaires ; RBC = Red Blood Cells Globules rouges ; Platelets = Plaquettes ;
Density gradient = Gradient de densité
La distance depuis le ménisque, mesurée en centimètres (distance from the
meniscus cm) est spécifique des différentes populations cellulaires du sang
b. Comparaison Percoll / Ficoll [75, 53]
Le Percoll et le Ficoll sont les deux supports de gradient de densité les plus utilisés. Le
Percoll est constitué de particules de silicate colloïdales de 15 à 30 nm de diamètre,
recouvertes de polyvinylpyrrolidone pour protéger les cellules de la toxicité de ces particules.
Le Ficoll est un polysaccharide.
L’augmentation de la densité est associée, surtout pour le Ficoll, à une augmentation
de l’osmolarité qui est néfaste aux cellules que l’on souhaite séparer. Le Ficoll est donc
habituellement associé à un composé iodé (Ficoll-Hypaque par exemple) afin de le stabiliser.
Toutefois, le faible poids moléculaire des composés iodés leur permet de passer les
membranes cellulaires et d’entrer dans les cellules. L’osmolarité du Percoll reste faible malgré
l’augmentation de densité.
40
Un autre avantage du Percoll par rapport au Ficoll est qu’il ne modifie pas la densité
des monocytes, ce qui permet, après isolement des LMC, de séparer plus précisément les
monocytes des lymphocytes si besoin [75].
3) Influence de la séparation des LMC sur l’expression génique
Härtel et al. [29] ont montré que la simple séparation des LMC par la méthode FicollHypaque entrainait une augmentation significative de la quantité d’ARNm spécifiques de
l’IL-2, l’IL-4 et du TNFα. En revanche, l’augmentation de l’expression génique de l’INFγ
n’était pas systématique et n’était pas significative. De même, les marqueurs Cluster de
différentiation (CD) CD69 et CD25, exprimés lors de l’activation des lymphocytes T,
n'étaient pas plus nombreux suite à la séparation des LMC [32].
Ainsi, la séparation des LMC peut provoquer la synthèse de cytokines éventuellement
responsable d'une préactivation des leucocytes et ainsi d'une modification de l’expression
génique traduisant l’état physiologique de l’animal.
4) Conservation des LMC
Marteau et al. [44] ont montré que la congélation à -80 °C pendant 15 mois des LMC
issus de sang collecté dans un tube avec EDTA n’altérait ni la quantité ni la qualité de l’ARN
total.
On peut ainsi envisager deux méthodes de prélèvement et de conservation des ARN
des leucocytes sanguins afin de mesurer des modifications des niveaux d'expression de gènes
durant la gestation : soit à partir de sang total prélevé dans un tube PAXgene® afin de
stabiliser l’ARN, soit dans les LMC uniquement, isolés directement après un prélèvement
dans un tube contenant un anticoagulant.
41
42
DEUXIEME PARTIE : Etude expérimentale
De nombreuses études recherchent actuellement des gènes différentiellement exprimés
au début de la gestation chez la vache. Certaines de ces études, comme celle présentée dans la
thèse de Laura SILVA (2012), sont réalisées à l’aide d’échantillons sanguins prélevés dans
des tubes contenant un anti-coagulant et de la méthode « Percoll ». Afin d’alléger les
protocoles opératoires en élevage, il s’agissait, dans cette étude, de vérifier que les résultats
obtenus par la méthode « Percoll » étaient transposables à des prélèvements sanguins réalisés
dans des tubes PAXgene®.
I) Matériel et méthodes
A) Animaux et prélèvements
Les prélèvements ont été réalisés sur dix brebis de race Préalpes du Sud à la station
INRA de Jouy-en-Josas. Par le fait du hasard, toutes les brebis se sont avérées gestantes
depuis 12 jours. Leur gestation a été constatée à l’abattage par observation directe des
conceptus.
Chaque animal a subi une prise de sang à la veine jugulaire afin de prélever 20 mL de
sang dans des tubes contenant du citrate (Buffered Na3-citrate 5 mL VENOJECT®, Terumo
France, Guyancourt, France) et 2 x 2,5 mL de sang dans des tubes PAXgene® (Becton
Dickinson, Le Pont de Claix, France).
B) Conservation des échantillons
Les LMC ont été isolés à partir du sang prélevés avec anti-coagulant, immédiatement
après la prise de sang, par la méthode Percoll (thèse S. Inghels, 2012), puis congelés à
-80 °C dans du Trizol LS® (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) jusqu'à l'extraction des ARN.
Selon les instructions du fabricant, les tubes PAXgene® ont été laissés à température
ambiante pendant 2 heures, puis congelés à -20°C jusqu’à l’extraction des ARN.
43
C) Extraction des ARN
Après décongélation et homogénéisation des LMC à l’aide d’une aiguille 18 gauge et
d’une seringue de 2 mL, l’extraction des ARN a été réalisée selon le protocole schématisé sur
la figure 12 en utilisant le RNEASY MINI KIT® (Qiagen, Courtaboeuf, France). De même, la
figure 13 résume le protocole d’extraction de l’ARN à partir des tubes PAXgene® décongelés,
à l’aide du PAXGENE BLOOD RNA KIT® (Qiagen, Courtaboeuf, France).
Les ARN ont ensuite été quantifiés par spectrophotométrie (NANODROP ND-3300,
Labtech, Wilmington, USA). Leur qualité a été évaluée par l'AGILENT 2100 BIOANALYZER
(Agilent, Santa Clara CA, USA).
44
Figure 12 : Protocole d’extraction des ARN à partir des leucocytes mononucléés circulants
(LMC) isolés utilisant le RNEASY MINI KIT® (Qiagen, Courtaboeuf, France)
Légende : RDD, RPE, RW1 = tampons spécifiques du RNEASY MINI KIT®
composition non publiée ;
RNase = Ribonucléase ; ADNase I = Désoxyribonucléase I
45
Figure 13 : Protocole d’extraction des ARN à partir de sang prélevé dans les tubes PAXgene®
à l’aide du PAXGENE BLOOD RNA KIT® (Qiagen, Courtaboeuf, France)
46
Légende : RDD, BR1, BR2, BR3, BR4, BR5 = tampons spécifiques du PAXGENE BLOOD RNA
KIT®, composition non publiée ; Colonnes SHREDDER et PAXGENE RNA fournies
avec le PAXGENE BLOOD RNA KIT®
RNase = Ribonucléase ; ADNase I = Désoxyribonucléase I
D) Rétrotranscription
Les ARN ont ensuite été rétrotranscrits par le kit Superscript® II Reverse Transcriptase
(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) d’après le protocole décrit figure 14. Les ADNc ainsi
obtenus ont été dilués 5 fois, 200 fois (échantillons utilisés pour étudier les gènes d’intérêt) et
500 fois (échantillons utilisés pour étudier les gènes de référence).
Figure 14 : Protocole de rétrotranscription à l’aide du kit Superscript® II Reverse
Transcriptase (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)
Légende : Buffer 5X First Strand, DTT 0,1 M, Superscript II : fournis avec kit
Superscript® II Reverse Transcriptase ; H20 = eau sans ribonucléases ; qsp = quantité
suffisante pour.
47
E) PCR en temps réel
Les gènes utilisés pour comparer les deux méthodes d’extraction des ARN ont été
choisis à partir des gènes répertoriés dans la littérature et identifiés à partir d'une analyse
transcriptomique réalisée dans le laboratoire, montrant que leur expression est modifiée
pendant la gestation de la brebis. Nous avons donc choisi comme gènes de référence ceux
utilisés classiquement c’est-à-dire RPL19 (Ribosomal Protein L 19), GAPDH
(Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase) et β-actine. Nous avons ajouté cinq gènes
d’intérêt : FOS (Finkel-Biskis-Jinkins osteosarcoma oncogene), MX1 (Myxovirus resistance
1), PLAC8 (Placenta Specific Gene 8), PBEF1 (Pre-B-cell colony-enhancing factor 1) et
STAT1 (Signal Transducer and Activator of Transcription).
Les amorces utilisées pour chaque gène et présentées dans le tableau 1 ont été
dessinées
à
l’aide
de
l’application
«Primer
Blast»
(NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast), synthétisées et fournies par Eurogentec
(Liège, Belgique).
L’efficacité de ces couples d’amorces a été testée sur une gamme de référence créée à
partir d’un mélange d’échantillons représentant les différents stades physiologiques liés à la
gestation, après dilutions successives (dilutions au ¼) de la solution mère issue de la
rétrotranscription (RT). Les produits de PCR ont été analysés par migration dans un gel
d’agarose à 2 % en Tris/Borate/EDTA concentré une fois (TBE 1X), suivie d’une coloration
au bromure d’éthidium (BET ; Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) et d’une lecture au
phospho-imageur FLA-3000 (Fujifilms France, Bois d’Arcy, France). La taille des fragments
a été mesurée et comparée à la taille attendue des amplicons, puis les produits de PCR ont été
séquencés au laboratoire Beckman Coulter Genomics (Takeley, Royaume-Uni) afin de
vérifier que l’amplicon obtenu correspondait au gène d’intérêt.
Les échantillons ont été déposés en dupliquas sur des plaques 96 puits (Applied
Biosystems, Carlsbad, USA), chaque puits contenant :
- 5 µL d’échantillon
- 10 µL de Mix PCR :
• 7,5 µL de Master Mix (SYBRGreen®, Applied Biosystems, Carlsbad,
USA)
• Soit 0,15 µM d’amorces sens et antisens pour PBEF1, FOS, soit
0,30 µM d’amorces pour β-actine, STAT1, PLAC8, GAPDH, MX1 et
RPL19
• 1,9 µL d’H20 RNase free.
Les réactions de PCR ont été réalisées avec un appareil de type Step One plus
(Applied Biosystems, Carlsbad, USA) en utilisant le programme suivant :
- 10 min à 90°C
48
- 45 cycles de 15 secondes à 95°C suivis par 1 min à 60°C
- Dissociation des amorces : 15 secondes à 95°C, 20 secondes à 90°C puis 15 secondes
à 95°C.
Le niveau d’expression des transcrits, déterminé à l’aide de la courbe standard (gamme
de référence), a ensuite été rapporté à un facteur de normalisation généré par le logiciel
Qbaseplus (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgique) à partir des trois gènes de ménage (GAPDH,
RPL19 et β-actine).
Tableau 2 : Gènes correspondants, orientation, séquence, température de fusion des amorces
utilisées pour les réactions de RT-qPCR et taille attendue des amplicons
Nom du
gène
GAPDH
β-ACTINE
RPL19
MX1
STAT1
FOS
PLAC8
PBEF1
Sens
Séquence de l’amorce
( 5’ vers 3’ )
Température
de fusion
(°C)
Sens
Antisens
Sens
Antisens
Sens
Antisens
Sens
Antisens
Sens
Antisens
Sens
Antisens
Sens
Antisens
Sens
Antisens
GCTGACGCTCCCATGTTTGT
TCATAAGTCCCTCCACGATGC
GCTTTACCACCACAGCCGAG
CGACGCAGCAGTCATCT
CCCCAATGAGACCAATGAAATC
CAGCCCATCTTTGATCAGCTT
CCACCACCGACAGCTCCCCT
GCAGGTGTGGGCGTGAAGCA
GTGGCGGAGAGTCTGCAGCA
GGTGAGTTGGCATGCAGGGC
TCATCCTAGCGGCTCACCGACC
CCTCAGATTCAGGGGTGGCAGC
GCCACAAGACACAGCTGCCCA
CGCTTGCAACTCCGGGCTGA
CCTGACGGCTCTGTCATTCC
TGATTGGATACCAGGACTGAACA
67,4
66,1
69,8
61,5
66,2
65,3
68,0
66,0
66,0
66,0
55,3
55,3
53,6
66,0
64,0
48,4
Taille
attendue
de
l’amplicon
243 pb
100 pb
73 pb
167 pb
190 pb
126 pb
123 pb
121 pb
F) Analyses statistiques
Les données ont été traitées avec le logiciel GRAPH PAD PRISM (Version 4.0 ;
GrapPad Software, La Jolia, USA). Pour chaque gène, nous avons procédé à un calcul du
coefficient de Spearman pour évaluer la corrélation entre les deux prélèvements de chaque
brebis, ainsi qu’à un test de Student pour comparer les moyennes obtenues sur chaque type de
tube. Ces calculs ont été faits à partir du logarithme décimal des quantités d’ARN mesurées.
49
50
II) Résultats
Suite à la coagulation du sang prélevé dans plusieurs tubes PAXgene® de trois des dix
brebis, seules sept brebis ont été analysées. Le RIN des ARN obtenus, estimant leur qualité,
était compris entre 8 et 9,5 et comparable entre les deux types de prélèvements.
A) Qualité des PCR
Avant d’exploiter les résultats de chaque PCR, nous avons contrôlé la qualité de la
réalisation des dépôts et de la réaction de PCR. Pour cela, nous avons vérifié trois
paramètres :
- La qualité de la courbe standard avec un r² > 0,98, une pente proche de –3,4 et une
efficacité comprise entre 90 et 110%.
- Une absence de fluorescence dans le puits contenant le témoin négatif (eau), ou au
moins une fluorescence inférieure à celle mesurée dans le puits contenant l’échantillon
de la gamme le plus dilué.
- Une courbe de fusion ne présentant qu’un seul pic par gène étudié.
B) Comparaison des quantités moyennes d’ARN mesurées pour chaque méthode
d'extraction
Les moyennes étaient significativement différentes au risque 5% pour tous les gènes,
sauf pour β-actine, comme le montre le tableau 3. La distribution des valeurs est présentée
dans la figure 15.
Tableau 3 : Quantités moyennes d’ARN mesurées pour chaque méthode d’extraction
FOS
Percoll
Moyenne +/- écart-type
2,31 +/- 1,35
PAXgene
Moyenne +/- écart-type
0,31 +/- 0,15
<0,05
MX1
1,35 +/- 2,38
4,41 +/- 8,49
<0,05
PLAC8
2,11 +/- 0,97
0,79 +/- 0,25
<0,05
PBEF1
2,04 +/- 0,78
0,89 +/- 0,50
<0,05
STAT1
1,73 +/- 0,95
1,03 +/- 0,34
<0,05
RPL19
1,54 +/- 0,25
0,78 +/- 0,10
<0,05
GAPDH
0,98 +/- 0,17
1,54 +/- 0,25
<0,05
β-ACTINE
0,70 +/- 0,19
0,86 +/- 0,19
0,58
Gène
p
51
Figure 15 : Niveaux d'expression de plusieurs gènes selon la méthode de prélèvement et
d'extraction des ARN
MX1
*
FExpression
old change exp
ression
relative
Expression
relative
Fo
ld change exp
ression
FOS
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
20
15
10
5
0
Percoll
Percoll
Paxgene
STAT1
*
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
FoExpression
ld change exp
ression
relative
Expression
Fold
change exprelative
ression
PLAC8
*
4
3
2
1
0
Percoll
Percoll
Paxgene
PBEF1
ACTINE
*
Fold
change expression
Expression
relative
4
3
2
1
0
Percoll
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
Percoll
Paxgene
*
1.5
1.0
0.5
0.0
Paxgene
RPL19
Fold changerelative
expression
Expression
GAPDH
2.0
Lot
Paxgene
Lot
Lot
Percoll
Paxgene
Lot
Lot
Expression
relative
Fo
ld change ex
pression
Paxgene
Lot
Lot
Expression
Fold changerelative
expression
*
25
*
2
1
0
Percoll
Paxgene
Lot
Légende : Percoll : isolement des leucocytes mononucléés circulants après prise de sang sur
tube avec citrate ; Paxgene : prise de sang sur tube PAXgene® ; chaque carré ou triangle
représente une brebis ; la barre horizontale représente la moyenne ; * = p < 0,05
52
C)
Corrélations entre les deux types de prélèvement
Aucune corrélation significative n’a été observée, sauf pour MX1 (tableau 4). La figure
16 présente le niveau d'expression observé avec les prélèvements en tube PAXgène® en
fonction du niveau d'expression observé après isolement des LMC (Percoll) pour chacun des
gènes étudiés.
Tableau 4 : Coefficients de corrélation des niveaux d'expression de chaque gène, selon la
méthode de prélèvement et d'extraction des ARN
Gène
Coefficient de Spearman
P
0,61
NS
FOS
0,89
< 0,05
MX1
0,61
NS
PLAC8
0,32
NS
PBEF1
0,64
NS
STAT1
0,21
NS
GAPDH
-0,46
NS
β-ACTINE
-0,39
NS
RPL19
*NS = Non significatif
53
Figure 16 : Niveau d'expression observé avec les prélèvements en tube PAXgène® en fonction
du niveau d'expression observé après isolement des LMC (Percoll) pour chacun des gènes
étudiés
MX1
25
0.5
20
0.4
Paxgene
Paxgene
FOS
0.6
0.3
0.2
15
10
5
0.1
0
0.0
0
1
2
3
4
5
0
6
1
2
5
6
7
8
2.0
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1.5
Paxgene
Paxgene
4
STAT1
PLAC8
1.0
0.5
0.0
0
1
2
3
4
5
0
6
1
2
3
4
Percoll
Percoll
ACTINE
PBEF1
1.2
2.5
1.1
Paxgene
2.0
Paxgene
3
Percoll
Percoll
1.5
1.0
1.0
0.9
0.8
0.7
0.5
0.6
0.5
0.4
0.0
0
1
2
3
4
5
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
Percoll
Percoll
GAPDH
RPL19
2.00
0.95
0.90
Paxgene
Paxgene
1.75
1.50
0.85
0.80
0.75
0.70
1.25
0.65
1.00
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
Percoll
Légende : chaque carré représente une brebis
54
0.60
1.00
1.25
1.50
1.75
Percoll
2.00
2.25
III) Discussion
L'un des axes de recherche du laboratoire dans lequel ce travail a été réalisé est
l'identification de marqueurs sanguins précoces de la gestation chez les ruminants. Jusqu'à
présent, le matériel biologique utilisé est constitué des leucocytes mononucléés circulants
(LMC) isolés à partir du sang total par une méthode au Percoll. Cette méthode d'obtention des
échantillons n'est pas compatible avec une application en élevage. Les tubes PAXgene®, qui
contiennent un stabilisateur des ARN, sont tout à fait indiqués pour cela. Mais il fallait
s'assurer, dans un premier temps, que l'utilisation de ces tubes pouvait se substituer
parfaitement à l'isolement des LMC. Pour cela, nous avons comparé les niveaux d'expression
de plusieurs gènes d'une même brebis, en prélevant du sang avec le tube PAXgene® et le tube
avec anti-coagulant suivi d'un isolement des LMC (méthode « Percoll ») au même moment et
dans les mêmes conditions. Les gènes choisis étaient cinq gènes d’intérêt, qu'une analyse
transcriptomique réalisée au laboratoire a montré différentiellement exprimés dans les LMC
entre des brebis non gestantes et des brebis gestantes à J15 [61] : MX1, PBEF1, PLAC8,
STAT1 et FOS. Trois gènes de référence, a priori non liés à l’état physiologique de l’animal et
exprimés en grande quantité ont également été étudiés : GAPDH, RPL19 et β-actine.
Que ce soit pour les gènes de référence ou pour les gènes d’intérêt, les quantités
d’ARNm mesurées étaient significativement différentes entre les tubes PAXgene® et la
méthode « Percoll ». De plus, aucune corrélation entre les deux types de prélèvement n’a pu
être établie. Les deux méthodes ne semblent donc pas être équivalentes, bien qu'il faudrait
poursuivre l'expérience sur un plus grand effectif pour le confirmer. Il n'est donc pas sûr que
le ou les marqueurs de la gestation identifiés avec l'une des méthodes pourront être utilisés à
des fins diagnostiques avec l'autre méthode.
Plusieurs études ont constaté que le niveau d'expression des gènes était moins élevé
lorsqu’il était mesuré à partir de sang total qu'à partir des cellules mononucléées
préalablement isolées, indépendamment des conditions de prélèvement [46, 71]. Nos résultats
sont en accord avec cette observation, sauf pour MX1 (mais probablement à cause d'un
échantillon hors norme), GAPDH et l'actine. Pour ces deux derniers gènes, il est possible que
malgré leur utilisation en tant que gènes de référence, ils soient davantage exprimés par les
cellules qui sont éliminées dans la méthode "Percoll".
La principale raison permettant d'expliquer ces différences entre les deux méthodes est
donc la proportion des populations cellulaires dans les prélèvements : il n'y a que des
lymphocytes et des monocytes pour la méthode Percoll, alors qu'il s'agit de sang total pour les
tubes PAXgene® (figure 17).
55
Figure 17 : Profils cellulaires des deux types de prélèvement (isolement des leucocytes par
la méthode « Percoll » et sang total avec le tube PAXgene®), d’après [46]
A
B
B
Légende : A : tube PAXgene® ; B : méthode « Percoll »
LT = Lymphocytes T ; Lymphocytes B
Chaque type cellulaire possède sa propre expression génique. Par exemple, Min et al.
ont mesuré une forte expression des gènes liés au transport des gaz dans le sang total, qui sont
des gènes principalement exprimés par les érythrocytes. Les lymphocytes et monocytes, quant
à eux, expriment plus fortement les gènes de facteurs de transcription que les leucocytes
polynucléaires [18, 21, 51, 78]. Plus concrètement ici, les granulocytes neutrophiles
expriment largement le gène PBEF1 lors d’inflammation. Ainsi, la prise de sang en ellemême va entraîner une surexpression de PBEF1 qui ne devrait pas être mesurée avec la
méthode « Percoll ». Or l’expression de PBEF1 mesurée est plus élevée avec cette méthode,
ce qui laisse penser que d’autres facteurs sont en jeu. Par exemple, les granulocytes
éosinophiles, eux, contiennent une forte concentration de RNases, qui sont responsables de la
dégradation de l’ensemble des ARN [63].
L’effet Monte Carlo pourrait expliquer, au moins en partie, le plus faible niveau
d'expression avec les tubes PAXgene® : moins la concentration d’un ARN est élevée, moins
l’amplification sera le reflet de la concentration réelle. Dans le sang total, les ARN
leucocytaires sont dilués dans l’ARN total, notamment celui des réticulocytes, qui
représentent 1 à 4% des érythrocytes. Ainsi, chez un individu sain, on compte entre 5.107/mL
et 2.108/mL de réticulocytes contre 7.106/mL de leucocytes [56]. Une des méthodes
recommandées pour contrer l’effet Monte Carlo est d’utiliser de l’ARN spécifique plutôt que
de l’ARN total, mais l’élimination des ARN liés à l’hémoglobine ne permet pas d’obtenir des
résultats similaires à ceux obtenus sur des leucocytes préalablement isolés [21], probablement
du fait de l’ajout d’une étape supplémentaire favorisant la dégradation des ARN.
Enfin, certains composants sanguins tels que des composants de l'hème de
l’hémoglobine, qui sont présents lors d'utilisation des tubes PAXgene®, sont connus pour
56
inhiber la réaction de PCR [56]. Les étapes entre le prélèvement et l’isolement de l’ARN sont
également différentes selon les deux méthodes et peuvent influencer différemment la
dégradation des ARN ou l'expression des certains gènes des cellules. Par exemple, si la
congélation des leucocytes à -80°C n’influence ni la quantité ni la qualité de l’ARN, leur
isolement constitue une étape susceptible de les activer et d’augmenter l’expression des gènes
liés à l’inflammation [44].
Les trois gènes de référence utilisés dans cette étude sont classiquement utilisés lors de
PCR en temps réel, car ils sont supposés être fortement exprimés et ne présenter que de très
faibles variations. Or, ces gènes ont été choisis de manière historique, après que leur qualité
en tant que gènes de référence ait été démontrée pour le Northern Blot ou la RT-PCR
conventionnelle (techniques non ou semi quantitatives), sans qu’elles ne l’aient été pour la
RT-PCR en temps réel qui est une technique quantitative [35]. Il a même été montré que βactine et GAPDH notamment étaient différentiellement exprimés dans certains tissus [55, 10].
Si dans certains cas cette variabilité n’a que peu d’influence sur les résultats, l’utilisation de
ces gènes comme gènes de référence peut ne pas être appropriée lorsque les conditions
expérimentales interviennent dans leur régulation [74, 5]. Facci et al. [20] recommandent
l’utilisation de l’association GAPDH et β-actine lors de RT-PCR en temps réel lors
d'isolement des LMC, RPL19 et SDHA (Succinate dehydrogenase A) sur les lymphocytes T,
et RPL19 et β-actine sur les monocytes. Toutefois, Pelleto et al. [52] ont recherché les
combinaisons de gènes les mieux adaptées lors de RT-PCR en temps réel à partir de sang total
d’ovins et ont trouvé les associations suivantes : SDHA/HPRT (Hypoxanthine-Guanine
Phosphoribosyl Transférase), YWHAZ (Tyrosine 3-monooxygenase/trytophan 5
monooxygenase activation protein, 14-3-3)/GAPDH et SDHA/YWHAZ. Ces combinaisons
garantissaient l’utilisation de gènes fortement exprimés et stables quel que soit le statut
physiologique et clinique de l’animal. Il serait alors intéressant d'ajouter l'une de ces
combinaisons dans notre étude.
57
58
CONCLUSION
La comparaison des niveaux d'expression de huit gènes à partir de sang total prélevé
dans un tube PAXgene® et à partir de leucocytes mononucléés circulants (LMC) isolés du
sang total a permis de mettre en évidence l’importance d’un protocole standardisé pour la
réalisation d’une RT-PCR en temps réel à partir d’un échantillon sanguin. L’utilisation des
tubes PAXgene® présente des avantages évidents pour une réalisation en routine d’un
diagnostic de gestation puisqu’il permet une conservation des ARN à température ambiante et
évite l’étape supplémentaire de l’isolement des LMC. Toutefois, les gènes étudiés sont connus
pour avoir une expression différenciée dans les LMC entre des animaux gestants et des
animaux non gestants. Les différences de niveaux d'expression que nous avons observées
entre les deux méthodes de prélèvement sanguin et l’absence de corrélation entre les deux
méthodes montrent la nécessité de confirmer que le différentiel d'expression entre les animaux
gestants et non gestants obtenu avec la méthode de référence (isolement des LMC) sera
détectable à partir de sang total et les tubes PAXgene®.
Le profil cellulaire des prélèvements, l’expression génique de chaque type cellulaire et
leurs réactions aux conditions de prélèvement et de conservation, les étapes de traitement des
échantillons, sont autant de paramètres modifiant l’expression génique réelle et mesurée des
deux types de prélèvement, même sur des gènes de référence qui devraient être stables.
Pour la mise en place d’un test de diagnostic de gestation précoce par RT-PCR en
temps réel, il convient donc, non seulement de s’interroger sur les gènes que l’on va utiliser,
mais également sur la technique de traitement des prélèvements sanguins qui leur est associée,
tout en sachant que la fiabilité de la technique peut être partiellement ou entièrement liée au
gène étudié.
59
60
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COMPARAISON DE DEUX MÉTHODES
D’EXTRACTION D’ARN POUR IDENTIFIER DES
MARQUEURS PRÉCOCES DE GESTATION CHEZ LES
RUMINANTS
NOM et Prénom : GILLIER Sandrine
Résumé
Dans un contexte d’optimisation de la production laitière des vaches, il est important
de maintenir également les performances dans le domaine de la reproduction. Pour cela, une
méthode de diagnostic précoce de gestation permettrait, en cas d’échec de la première
insémination, de réaliser une seconde insémination dès la fin du cycle œstral. Des travaux
récents ont cherché à quantifier les ARN de marqueurs précoces de gestation dans les
lymphocytes mononucléés circulants. Jusqu’à présent, cela supposait de réaliser
préalablement un isolement des lymphocytes, méthode lourde inapplicable en élevage.
Cette étude a porté sur la comparaison des quantifications des ARN de cinq gènes
d’intérêt et trois gènes de ménage, réalisées sur deux types de prélèvements sanguins réalisés
sur dix brebis gestantes : un tube avec anticoagulant, tel que le citrate, suivi d’un isolement
des lymphocytes, et un tube PAXgène® qui contient un conservateur d’ARN. Les mesures
obtenues pour sept brebis (3 animaux exclus pour cause de coagulation du sang) étaient
significativement différentes pour tous les gènes d’intérêt et pour deux gènes de ménage, et
aucune corrélation entre les mesures n’a pu être déterminée. Ces deux méthodes ne semblent
donc pas être équivalentes et pouvoir être interverties, mais des données supplémentaires sur
des effectifs plus grands sont nécessaires pour conclure.
Mots clés
DIAGNOSTIC PRECOCE DE GESTATION / ARN / MARQUEUR PRECOCE DE
GESTATION / PAXGENE / PERCOLL / RUMINANT / OVIN / BREBIS
Jury :
Président : Pr.
Directeur : Dr. CONSTANT F.
Assesseur : Dr. ABITBOL M.
COMPARISON OF TWO METHODS OF RNA ISOLATION
TO IDENTIFY GENES FOR EARLY PREGNANCY
DIAGNOSIS IN CATTLE
SURNAME : GILLIER
Given name : Sandrine
Summary
In a context of optimizing the milk production by cows, it is also important to maintain
the reproductive performances. Therefore, a method of early pregnancy diagnosis would
allow, in case of failure of the first insemination, to carry out a second insemination as soon as
the estrous cycle ends. Recent studies have aimed at measuring the RNA of early gene
markers of gestation in circulating mononuclear lymphocytes. So far, a previous isolation of
the lymphocytes had remained necessary.
This study consisted in comparing the RNA measurement of 5 genes of interest and 3
housekeeping genes, in two different blood samples in ten pregnant ewe: on the one hand a
blood collection tube with an anticoagulant, such as citrate, then mononuclear cells isolation,
and on the other hand a blood collection tube called PAXgene® with a RNA preservative. The
results were significantly different for every gene of interest and for 2 of the housekeeping
genes. Besides, no correlation between these results could be determined. So these two
methods are not equal and cannot be compared.
Keywords
EARLY PREGNANCY DIAGNOSIS / RNA / EARLY GENE MARKERS OF
PREGNANCY / PAXGENE / PERCOLL / RUMINANT / OVINE / EWE
Jury :
President : Pr.
Director : Dr. CONSTANT F.
Assessor : Dr. ABITBOL M.