Biofilm de L. pneumophila

Biofilm de L. pneumophila : analyse
globale de l’expression des gènes et
relation avec le Fer
Thomas Hindré1, Holger Bruggeman2,
Carmen Buchrieser2 et Yann Héchard1
1 Laboratoire de Chimie de l'Eau et de l'Environnement
Equipe Microbiologie Fondamentale et Appliquée, UMR CNRS 6008, Poitiers
2 Unité de Génomique Moléculaire des Pathogènes, Institut Pasteur, Paris
Legionella pneumophila
Genre Legionella (Fraser et al., 1977; Brenner et al.,1979)
- Établi en 1979 suite à une épidémie de pneumonie lors d’une réunion de la Légion Américaine
- Légionellose : pneumonie sévère, environ 1000 cas/an en France
- Bacille Gram négatif, aérobie, flagellé
- 48 espèces identifiées (Fields et al., 2002)
Espèce Legionella pneumophila (15 sérogroupes)
- 98,6% des isolats cliniques du genre Legionella en France (Aurell et al., 2003)
- Sérogroupe 1 : 80% des cas de légionellose avérés
- Trois génomes connus : L. pneumophila Lens, Paris (Cazalet et al., 2004) et Philadelphia (Chien et al.,
2004)
Colonisatrice des milieux d'eau douce
- environnements naturels (lacs, rivières…)
- environnements artificiels (réseaux d’eau, spas, climatisation, tours aéroréfrigérantes…)
Cycle biologique de L. pneumophila
D’après Molmeret et. al 2004
Forme intracellulaire
- dans les protozoaires : amibes libres…
- dans les macrophages alvéolaires humains :
→ infection par inhalation d’aérosols contaminés
Forme libre
- planctonique : cellules libres
- sessile : colonisation des biofilms
Les amibes libres
- Protozoaires (Acanthamoeba, Hartmanella,
Naegleria…) se nourrissant de bactéries,
en particulier dans le biofilm, par
phagocytose
- Certaines bactéries, comme Legionella,
résistent à la digestion et se multiplient
dans l’amibe
-
Seule niche de multiplication connue de
Legionella
-
Rôle dans la protection contre les
traitements
-
Terrain d’entraînement pour les bactéries
infectant les macrophages
Legionella pneumophila et les biofilms
Étude des biofilms naturellement présents dans l'eau :
- Micro-colonies en absence de protozoaires (Rogers et al., 1992)
→ croissance extracellulaire au sein des biofilms ?
- Pas de multiplication en absence de protozoaires (Kuiper et al.,
10µm
2004)
→ persistance au sein des biofilms
Rogers et al., 1992
Étude de biofilms mono-espèce modèles : (Piao et al.,
2006)
→ variation selon les espèces et les souches
→ différences de structure du biofilm :
37 et 42°C = croissance en structure "micellaire "
25°C = croissance en structure "champignon "
1µm
Piao et al., 2006
Pas/peu d'étude de l'état physiologique des cellules sessiles
Pas d'étude de l'expression génétique des cellules sessiles
Objectifs de l’étude
Caractérisation moléculaire de l’adaptation de L.
pneumophila dans un biofilm
1- Comparaison de l’expression des gènes dans les
cellules sessiles par rapport au cellules planctoniques
2- Comparaison de la formation de biofilm par L.
pneumophila sauvage et mutantes
Projet soutenu par l’AFSSET
Biofilms modèles
Réalisation de biofilms modèles
-
-
Mono espèce : L. pneumophila
Support polystyrène : Microplaque 96 puits ou flasque
de culture cellulaire
Suivi croissance : coloration au cristal violet et
mesure DO 595 nm
Loin des conditions « naturelles » mais 1ère étape
indispensable pour l’étude de l’expression des gènes
Effet de la température sur la formation de biofilm
par L. pneumophila Lens et Paris
20°C
37°C
Croissance
DO595
1
1
Lens
Paris
0,1
0,01
Lens
Paris
0,1
48
96 144 192 240
48
96 144 192 240
0
Temps (h)
1,5
1,5
1
1
1
0,5
0,5
0,5
Paris
96 144 192 240
0
0
Lens
48
Temps (h)
1,5
0
Lens
Paris
0,1
0,01
0
Temps (h)
DO595 ratio
1
0,01
0
Formation
de biofilm
42°C
Lens
Paris
Lens
Paris
Les souches Lens et Paris diffèrent par leur capacité à former des biofilms
La formation de biofilm par la souche Lens est favorisée à 20°C
Influence de la phase de croissance sur l'adhésion
de L. pneumophila Lens et Paris à 20°C
0,7
Phase exponentielle
0,6
Phase stationnaire
0,5
Phase stationnaire tardive
DO595
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Lens
Paris
Figure 2 : Adhésion de L. pneumophila Lens et Paris à 20°C
Meilleure adhésion de la souche Lens quelque soit la phase de croissance
L'adhésion est favorisée après l'entrée en phase stationnaire de croissance
Analyse globale de l’expression des gènes
Biofilms en flasques de culture
Incubation 14 j à 20°C
Récolte de 3 échantillons de cellules :
cellules de départ « ensemencement »
cellules en « suspension » après incubation
cellules adhérées, « sessiles »
Microarrays (puces à ADN)
Préparation des ARN totaux
Transcription inverse en ADNc et marquage fluorescent
Hybridation sur microarrays : 3823 oligonucléotides (70-mer)
représentatifs des génomes de L. pneumophila Lens, Paris et Philadelphia
Analyse statistique des résultats d’hybridation
Gènes spécifiquement régulés au sein du biofilm
Ratio sessile versus
lpl number
Description
Inoculation
Suspension
lpl0660
lpl1853
Similar to hypothetical protein
Similar to hypothetical protein
0,16
0,23
0,15
0,19
lpl2916: atpB
lpl0236
lpl0237
lpl2271
lpl2272
lpl2032
lpl0482
lpl1129
lpl2462
lpl2719
lpl2728
lpl2780
Highly similar to H+-transporting ATP synthase chain a
Similar to pyoverdine biosynthesis protein PvcA
Similar to pyoverdine biosynthesis protein PvcB
Similar to alkyl hydroperoxide reductase AhpD
Similar to alkyl hydroperoxide reductase AhpC
Similar to transposase
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
6,31
3,21
3,95
10,74
30,72
4,77
3,87
3,15
3,08
3,59
3,12
3,14
3,06
4,10
3,71
9,78
23,30
3,64
4,03
6,78
5,44
4,09
4,27
3,45
14 gènes = 0,47% du génome (> ±3), 6 gènes avec une fonction potentielle
Alkylhydroperoxide réductase : protection contre les radicaux libres oxygène et/ou azote
Pyoverdine : système d’acquisition du Fer chez Pseudomonas
Pyoverdine et Pseudomonas
Pyoverdine
- ferrisidérophore
- permet l'acquisition du Fe(III)
- surexprimée en cas de carence en Fe
F
e
Gènes associés à la synthèse de la pyoverdine
Fonction
Gène
Synthèse du peptide
pvdD, pvdIJK
Synthèse du chromophore
pvcABCD
Modification du peptide
pvdA, pvdF
Régulation
pvdS, fpvI, fpvR
Récepteur
fpvA
Inconnue
pvdR, pvdE
Influence du fer sur la formation de biofilm par P. aeruginosa (Banin et al., 2005)
- Inhibition en milieu totalement dépourvu de fer
- Inhibition en milieu trop riche en fer (> 100µM)
Locus pvc chez P. aeruginosa et L. pneumophila
P. aeruginosa PAO1
P. aeruginosa : (Stintzi et al., 1996; 1999)
- opéron pvcABCD
- régulateur transcriptionel ptxR
- induction en milieu carencé en fer
L. pneumophila Lens
L. pneumophila :
- lpl0236 : pvcA like
- lpl0237 : pvcB like
- lpl0238 : similaire à FAD monooxygenase
- lpl0239 : similitude avec transporteurs
- lpl0240 : fonction inconnue
Les loci pvc diffèrent par leur organisation
Les gènes pvcC, pvcD et ptxR sont absents chez L. pneumophila
L. pneumophila ne produit pas la pyoverdine mais la légiobactine (Liles et al., 2000)
Rôle des gènes pvc chez L. pneumophila ?
Étude de l’expression des gènes pvcAB
chez L. pneumophila Lens
Taux d'induction déterminé par
Gene
lpl2036: pvcA
lpl2037: pvcB
Arrays
Sess. vs
Sess. vs
susp.
stat.
3.2
3.7
4.1
3.9
Expression relative
qRT -PCR
Sess. vs.
Sess. vs
susp.
stat.
23.4
46.2
3.3
3.1
Pyrophospate de Fer (g/l)
0
0.25
1.25
1
1
3.9
5.1
11.3
6.4
Validation des résultats de microarrays par RT-PCR quantitative
Induction de l’expression de pvcA et pvcB par le pyrophosphate de fer
Effet inverse de la production de sidérophore !
La disponibilité en fer influence l’expression des gènes pvc
La concentration en fer pourrait être supérieure dans le biofilm
Effet du fer sur la formation de biofilm
Croissance
Formation de biofilm
1
OD595 ratio
OD595
1,5
0,1
1
0,5
0
0,01
0
48
96 144 192 240
Time (min)
0
0
0,12
0,25
1,25 g/l
Iron concentration
Pas d'effet du fer sur la croissance planctonique
L'excès de pyrophosphate de fer inhibe la formation de biofilm
Et maintenant…
Relation entre pvc et ahp ? Stress oxydatif, Fe3+ peut induire la
formation de radicaux hydroxyl à partir de H2O2
Rôle des produits des gènes pvc chez Legionella
Analyse de la formation de biofilm modèles :
- mutants des gènes pvc et ahp
- mutagenèse aléatoire par transposition
- action du peroxyde d’hydrogène sur la formation de biofilm
Réalisation de biofilm complexes (multi espèces, eau naturelle…) pour
valider les premiers résultats obtenus :
- expression de pvc et ahp dans ces conditions
- rôle du fer et du peroxyde d’hydrogène sur la présence de Legionella
dans ces biofilms
Les biofilms
Communauté microbienne sessile (Donlan et al., 2002) :
- irréversiblement fixée à un support
- incluse dans une matrice extracellulaire sécrétée
- possédant un phénotype particulier en terme de vitesse de croissance et d'expression génétique
Substrate
Stephens et al., 2002
Mode de vie prédominant dans l'environnement:
- communautés microbiennes multi-espèces
- mode de vie sessile avantageux pour les bactéries du fait de la présence de la matrice
(concentration des nutriments, protection contre les aggressions extérieures)
- phénotype particulier : moins grande sensibilité aux agents antimicrobiens
Profil global d'expression génétique
Comparaison sessile versus ensemencement :
- 4,48% du génome (> ±3) :
- 32 gènes réprimés : fonction inconnue (27)
- 100 gènes induits :
ATP synthase (9), métabolisme (12),
réplication + transcription + traduction (48)
fonction inconnue (23)
Comparaison sessile versus suspension :
- 3,15% du génome (> ±3) :
- 44 gènes réprimés : métabolisme (6), membrane (5), transport/sécrétion (8)
fonction inconnue (17)
- 49 gènes induits :
métabolisme (5),
adaptation + détoxication (5), fonction inconnue (35)
Sélection des gènes dont l’expression est altérée de façon
similaire dans les deux comparaisons