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THÈSE
Pour l'obtention du grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS
UFR des sciences fondamentales et appliquées
Ecologie et biologie des interactions - EBI (Poitiers)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École doctorale : Sciences pour l'environnement - Gay Lussac (La Rochelle)
Secteur de recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Emilie Portier
Rôle du fer sur Legionella pneumophila et
sur sa persistance dans les biofilms naturels
Directeur(s) de Thèse :
Yann Héchard, Jérôme Labanowski
Soutenue le 17 octobre 2014 devant le jury
Jury :
Président
Pierre Grève
Professeur des Universités, Université de Poitiers
Rapporteur
Christine Roques
Professeur des Universités, Université Paul Sabatier de Toulouse 3
Rapporteur
Christophe Gilbert
Maître de conférences, Université de Lyon 1
Membre
Yann Héchard
Professeur des Universités, Université de Poitiers
Membre
Jérôme Labanowski
Chargé de recherche CNRS, Université de Poitiers
Membre
Carmen Buchrieser
Directeur de recherche, Institut Pasteur de Paris
Pour citer cette thèse :
Emilie Portier. Rôle du fer sur Legionella pneumophila et sur sa persistance dans les biofilms naturels
[En ligne]. Thèse Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Poitiers : Université de Poitiers, 2014.
Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>
THESE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(FACULTE DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUEES)
(Diplôme National- Arrêté du 7 août 2006)
Ecole doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac
Secteur de Recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Emilie PORTIER
Rôle du fer sur Legionella pneumophila
et
sur sa persistance dans les biofilms complexes
Directeur de thèse : M. Yann Héchard
Co-directeur de thèse : M. Jérôme Labanowski
Soutenue le 17 octobre 2014, devant la commission d’examen :
Rapporteurs :
Mme Christine Roques
M. Christophe Gilbert
Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse
Maître de Conférences HDR, Université Lyon 1
Examinateurs :
Mme Carmen Buchrieser
M. Pierre Grève
M. Jérôme Labanowski
M. Yann Héchard
Directeur de Recherche, Institut Pasteur, Paris
Professeur, Université de Poitiers
THESE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(FACULTE DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUEES)
(Diplôme National- Arrêté du 7 août 2006)
Ecole doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac
Secteur de Recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Emilie PORTIER
Rôle du fer sur Legionella pneumophila
et
sur sa persistance dans les biofilms complexes
Directeur de thèse : M. Yann Héchard
Co-directeur de thèse : M. Jérôme Labanowski
Soutenue le 17 octobre 2014, devant la commission d’examen :
Rapporteurs :
Mme Christine Roques
M. Christophe Gilbert
Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse
Maître de Conférences HDR, Université Lyon 1
Examinateurs :
Mme Carmen Buchrieser
M. Pierre Grève
M. Jérôme Labanowski
M. Yann Héchard
Directeur de Recherche, Institut Pasteur, Paris
Remerciements
Cette étude a été réalisée dans l’équipe de Microbiologie de l’Eau, du Laboratoire Ecologie
et Biologie des Interactions, UMR CNRS 7267, dirigée par Monsieur Didier Bouchon . Je
tiens à lui adresser mes sincères remerciements pour m’avoir permis de réaliser ces travaux
au sein de son laboratoire.
J’adresse tous mes remerciements à Madame Christine Roques, Professeur à l’Université
Paul Sabatier de Toulouse et à Monsieur Christophe Gilbert, Maître de Conférences à
l’Université de Lyon, de m’avoir fait l’honneur d’être rapporteurs de ce travail.
Je remercie également Madame Carmen Buchrieser, Directeur de Recherche à l’Institut
Pasteur de Paris, et Monsieur Pierre Grève, P rofesseur à l’Université de Poitiers, d’avoir
accepté participer à ce jury de thèse.
Je tiens à remercier tout particulièrement mes directeurs de thèse, Yann Héchard et Jérôme
Labanowski. Merci pour les discussions et les précieux conseils que vous m’avez apporté tout
au long des ces quatre dernières années. Je vous présente également toute ma reconnaissance
pour votre confiance. Merci de m’avoir permis d’aller travailler chez nos collaborateurs.
C’est une chance que je n’aurai jamais espéré.
Je remercie très sincèrement, Madame Carmen Buchrieser et Monsieur Nicholas Cianciotto ,
Professeur à l’Université de Chicago, pour m’avoir accueillit dans leurs Laboratoires de
Recherches. Et bien sûr, je souhaite dire un grand merci à toutes les personnes qui ont
participé au projet, Tobias Sahr, Huaixin Zengh, Denise Burnside, Jessica Tyson et Celeste
Malama.C’est un honneur pour moi d’avoir travaillé avec vous, merci à tous pour votre aide
très précieuse.
Un grand merci également à Jean-Marc Berjeaud et à Julien Verdon pour tout, les conseils,
les discussions scientifiques, leur soutient et le reste…
Un clin d’œil à toutes les personnes qui m’ont entouré pendant ces dernières années, Clém,
Marie-Claude, Didi, Laurence, Karine, Dada, Nawel, Renaud, Stéph , Christophe, Luce et
Ascel, ainsi que tous les membres du CHU . Chacun d’entre vous mériterait un paragraphe
mais je ne vais pas m’en sortir…
Anne, merci pour tous les conseils que tu m’as apporté et pour tes encouragements. Nono, ça
a été un grand plaisir de partager mon bureau avec toi, et n’oublies pas, c’est nous les
Warriors !
Petite dédicace, à Elo, Vincent, Jéjé et Lucille (et vos moitiés), on a passé de bon moment
tous ensemble… Bon courage pour la suite, et au plaisir de vous voir dans le grand nord…
Je garde les meilleurs pour la fin, mes parents et mon fréro , qui malgré toutes les épreuves
qu’on a pu traverser ces dernières années ont toujours été là pour moi, m’ont poussé,
encouragé et soutenu. C ’est aussi grâce à vous que j’en suis là aujourd’hui. Merci !
Sommaire
Liste des abréviations ................................................................................................................. 1
Liste des figures ......................................................................................................................... 3
Liste des tableaux ....................................................................................................................... 5
Introduction Générale ......................................................................... 7
Partie 1. Etude bibliographique ....................................................... 13
1. Legionella pneumophila ................................................................................................ 14
1.1. Le genre Legionella ..................................................................................................... 14
1.1.1. Généralités ........................................................................................................ 14
1.1.2. Ecologie ............................................................................................................ 17
1.1.3. La légionellose .................................................................................................. 20
1.2. Les facteurs de virulence ............................................................................................. 23
1.2.1. Internalisation de L. pneumophila et formation des vacuoles réplicatives ....... 23
1.2.2. Rôle du système Dot/Icm.................................................................................. 25
1.2.3. Différenciation de L. pneumophila .................................................................. 27
1.2.4. Réponse stringente ............................................................................................ 29
1.2.5. Régulation du passage en phase transmissive .................................................. 31
1.2.6. Rôle du système de sécrétion de type II .......................................................... 34
2. Rôle du fer chez L. pneumophila .................................................................................. 38
2.1. Rôle du fer chez les bactéries ...................................................................................... 38
2.2. Les sidérophores.......................................................................................................... 42
2.2.1. Découverte des sidérophores ............................................................................ 42
2.2.2. Production de la légiobactine............................................................................ 43
2.2.3. Rôle des sidérophores dans l’infection ............................................................. 46
2.3. Transport du fer ferreux .............................................................................................. 46
2.4. Autres voies d’acquisition/assimilation du fer ............................................................ 48
2.4.1. Voie codée par les gènes iraA et iraB .............................................................. 48
2.4.2. Voie impliquant la maturation du cytochrome C ............................................. 48
2.4.3. Rôle de la pyomélanine dans l’acquisition du fer ............................................ 50
2.5. Relation entre le fer et la virulence ............................................................................ 51
3. L. pneumophila et les biofilms ...................................................................................... 53
3.1. Généralités sur les biofilms ......................................................................................... 53
3.1.1. Définition .......................................................................................................... 53
3.1.2. Structures .......................................................................................................... 54
3.1.3. Formation d’un biofilm..................................................................................... 56
3.1.4. Biofilms multi-espèces ..................................................................................... 59
3.1.5. Résistance aux traitements antibactériens ........................................................ 61
3.2. Interaction de L. pneumophila avec les biofilms ........................................................ 63
3.2.1. Les biofilms : niche écologique pour L. pneumophila ..................................... 63
3.2.2. Prolifération de L. pneumophila dans les biofilms ........................................... 66
3.2.2.1.
Implantation du biofilm ........................................................................ 66
3.2.2.2.
Croissance du biofilm ........................................................................... 67
3.2.3. Dernière étape : dissémination de L. pneumophila ........................................... 68
3.3. Impact du fer .............................................................................................................. 69
3.3.1. Sur les biofilms complexes multi-espèces naturels .......................................... 69
3.3.2. Sur les biofilms mono-espèces de L. pneumophila .......................................... 69
Partie 2. Matériel et méthodes .......................................................... 73
1. Méthodes de microbiologie ......................................................................................... 74
1.1. Souches bactériennes et cellulaires ............................................................................ 74
1.2. Milieux de cultures ..................................................................................................... 75
1.2.1. Culture de Legionella ....................................................................................... 75
1.2.2. Culture d’Escherichia coli ................................................................................ 76
1.2.3. Culture des amibes ............................................................................................ 76
1.2.4. Culture des cellules U937 ................................................................................. 76
1.3. Numération des microorganismes ............................................................................... 77
1.3.1. Numération des légionelles............................................................................... 77
1.3.1.1.
Par densité optique ................................................................................ 77
1.3.1.2.
Par numération des unités formant colonies (UFC) ............................. 77
1.3.2. Numération des cellules .................................................................................... 77
1.4. Tests d’infection .......................................................................................................... 78
1.4.1. Infection des macrophages ............................................................................... 78
1.4.2. Infection des amibes ......................................................................................... 79
1.5. Internalisation de L. pneumophila dans les amibes ..................................................... 79
2. Méthodes de biologie moléculaire ............................................................................... 81
2.1. Extraction des acides nucléiques ................................................................................. 81
2.1.1. Extraction ADN ................................................................................................ 81
2.1.2. Extraction ARN ................................................................................................ 81
2.2. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ............................................................ 82
2.3. PCR en temps réel (PCRq) ......................................................................................... 83
2.3.1. Principe ............................................................................................................. 83
2.3.2. Réalisation de la gamme étalon ........................................................................ 84
2.4. Analyse quantitative de l’expression des gènes par RT-PCRq ................................... 84
2.5. Analyses t-RFLP ......................................................................................................... 85
2.5.1. Principe ............................................................................................................. 85
2.5.2. Conditions expérimentales................................................................................ 85
2.6. Analyse Microarray..................................................................................................... 87
2.7. Transformation naturelle ............................................................................................ 88
2.7.1. Construction d’un fragment d’ADN ................................................................. 88
2.7.2. Préparation des bactéries .................................................................................. 89
2.8. Technique de clonage .................................................................................................. 90
2.8.1. Préparation des bactéries électrocompétentes .................................................. 90
2.8.2. Constructions plasmidiques .............................................................................. 91
2.8.3. Electroporation ................................................................................................. 92
3. Méthodes biochimiques ............................................................................................... 95
3.1. Test de la sensibilité à une carence en fer ................................................................... 95
3.2. Test NaCl .................................................................................................................... 95
3.3. Test H2O2 .................................................................................................................... 96
3.4. Activité des sidérophores ............................................................................................ 96
3.4.1. Production des sidérophores : Test Chrome Azurol S (CAS) ......................... 96
3.4.2. Test d’activité des sidérophores........................................................................ 97
3.4.3. Utilisation des sidérophores .............................................................................. 97
4. Formation des biofilms ................................................................................................ 98
4.1. Echantillonnage eau de rivière .................................................................................... 98
4.2. Culture des biofilms complexes en condition semi-statique ....................................... 98
4.3. Culture des biofilms complexes en condition de flux continu .................................... 99
5. Microscopie.................................................................................................................. 101
5.1. Microscopie confocale .............................................................................................. 101
5.2. Microscopie à illumination structurée (Apotome) ................................................... 101
6. Spectrométrie par torche à plasma ........................................................................... 102
6.1. Principe ..................................................................................................................... 102
6.2. Préparation des échantillons...................................................................................... 102
Partie 3. Résultats ............................................................................ 105
1. Rôle du fer sur l’implantation de L. pneumophila dans les biofilms complexes ... 106
1.1. Mise en place du modèle de biofilms complexes...................................................... 106
1.1.1. Mise en place des biofilms ............................................................................. 106
1.1.2. Stratégie de dopage des biofilms .................................................................... 108
1.2. Publication 1: Role of iron in the persistence of L. pneumophila in complex biofilms
................................................................................................................................... 110
1.3. Résultats complémentaires ........................................................................................ 140
1.3.1. Détection des amibes dans les biofilms .......................................................... 140
1.3.2. Formation des biofilms à 20 °C ...................................................................... 141
2. Rôle du fer sur l’expression des gènes de L. pneumophila ...................................... 143
2.1. Publication 2: IroT/MavN, a new iron-regulated gene involved in L. pneumophila
virulence against amoebae and macrophages ........................................................... 143
2.2. Résultats complémentaires ........................................................................................ 188
2.2.1. Analyse de l’expression des gènes de L. pneumophila cultivée en milieu BYE
vs. BYE sans fer ................................................................................................. 188
2.2.2. Relation entre la carence en fer et le passage de L. pneumophila en phase
transmissive........................................................................................................ 189
2.2.2.1.
Impact de la carence en fer sur l’expression des gènes induits lors du
passage en phase transmissive ................................................................... 190
2.2.2.2.
Test de résistance au NaCl ................................................................. 191
2.2.2.3.
Test de résistance au H2O2 .................................................................. 193
2.2.2.4.
Test d’entrée dans les amibes ............................................................. 194
2.2.2.5.
Test de mobilité................................................................................... 195
2.2.3. Implantation de lpw_30711 et lpp_2867 dans les biofilms complexes .......... 196
Partie 4. Discussion .......................................................................... 199
Conclusion générale et perspectives .............................................. 211
Références bibliographiques .................................................................................................. 219
Liste des abréviations
ACES: « N-2-acetamido-2-aminoethansulfonic acid »
BCYE: « Buffered Charcoal Yeast Extract »
BYE: « Buffered Yeast Extract »
CAS: « Chrome azurol assay »
Ccm: « Cytochrome c maturation »
CDM: « Chemical defined medium »
Cp: « Crossing point »
cy5, cy3: Cyanine 5/3
Da: Dalton
DFX: Deferoxamine mésylate
DIP: 2, 2’ dipyridyl
dNTP: Déoxynucléotides tri-phosphates
DO: Densité optique
EDTA: Acide éthylène diamine tétra-acétique
FAM: 6’ carboxyfluorescéine
GCAT: Glycerophospholipide cholesterol acyltransférases
HGA: « Homogentisic acid »
ICP: « Inductively coupled plasma »
InVs: Institut de Veille Sanitaire
LB: Luria Bertani
LCV: « Legionella containing vacuoles »
MFS: « Major Facilitator superfamily »
MIF: « Mature intracellular form »
Mip: « Macrophage infectivity potentiator »
Rôle du fer sur Legionella pneumophila et sur sa persistance dans les biofilms complexes
Page 1
MOI: « Multiplicity of infection »
Mpb: Méga paire de base
pb: Paire de base
PBS: « Phosphate Buffered saline »
PCRq: Réaction quantitative de polymérisation en chaîne
Pht: « Phagosomal transporter »
PMA: Phorbol-12- Myristate
PPF: Pyrophosphate de fer
QS: Quorum Sensing
RNAP: « RNA polymerase »
ROS: « Reactiv oxygen species »
Rpm: Rotation par minute
RT-PCR: Reverse transcription couplée à la réaction de polymérisation en chaîne
SPE: Substance polymérique extracellulaire
SVF: Sérum de veau fœtal
TAR: Tours aéroréfrigérantes
TIISS: Système de sécrétion de type II
TIVSS: Système de sécrétion de type IV
t-RFLP: « Terminal restriction fragment length polymorphisme »
UFC: Unité formant colonie
UG: Unité génome
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Liste des figures
Figure 1 : Images de Legionella pneumophila prises en microscopie électronique ................ 15
Figure 2 : Développement et libération de Legionella dans un système de distribution d’eau
.................................................................................................................................................. 18
Figure 3 : Evolution du nombre de cas et du taux annuel d’incidence des cas notifiés de
légionellose en France, entre 1988 et 2012 ............................................................................. 22
Figure 4 : Cycle de vie intracellulaire de L. pneumophila ...................................................... 24
Figure 5 : Système Dot/Icm .................................................................................................... 26
Figure 6 : Cycle de vie de L. pneumophila ............................................................................. 29
Figure 7 : Réponse stringente chez les bactéries ..................................................................... 31
Figure 8 : Modèles de régulation des phases réplicatives et transmissives ............................. 32
Figure 9 : Modélisation du système de sécrétion de type II .................................................... 35
Figure 10 : Représentation schématique du transport du fer ferrique chez les bactéries Gram
négatif, mettant en jeu des sidérophores ................................................................................. 39
Figure 11 : Représentation schématique du transport du fer ferreux par les protéines Feo, chez
E. coli ...................................................................................................................................... 40
Figure 12 : Représentation schématique de la régulation du fer par la protéine Fur, chez E.
coli. .......................................................................................................................................... 41
Figure 13 : Structures chimiques de quelques chélateurs de fer ............................................. 42
Figure 14 : Schéma récapitulatif des différentes voies métaboliques impliquées dans
l’acquisition du fer chez L. pneumophila ................................................................................ 44
Figure 15 : Représentation du système multiprotéique codé par l’opéron ccm et impliqué dans
la maturation des cytochromes de type C ................................................................................ 50
Figure 16 : Image de microscopie à contraste de L. pneumophila cultivée en présence ou non
de fer ........................................................................................................................................ 52
Figure 17 : Image de microscopie électronique de biofilms formés sur une surface en acier
dans un système d’eau industrielle et sur un dispositif médical implanté ............................... 54
Figure 18 : Observation au microscope à épifluorescence d’un biofilm complexe développé
sur une surface en acier dans un réacteur d’eau potable ......................................................... 55
Figure 19 : Développement d’un biofilm en cinq étapes ........................................................ 58
Figure 20 : Effets du PPF, à différentes concentrations, sur la formation des biofilms de L.
pneumophila Lens ................................................................................................................... 70
Page 3
Figure 21 : Construction du fragment d’ADN, visant à inactiver le gène lpp_2867 .............. 89
Figure 22 : Représentation schématique de la méthode utilisée pour cultiver les biofilms en
condition semi-statique ........................................................................................................... 99
Figure 23 : Représentation schématique du montage réalisé pour la croissance de biofilm en
flux continu ........................................................................................................................... 100
Figure 24 : Structure des biofilms formés dans l’eau de rivière en flux continu et en condition
semi-statique........................................................................................................................... 108
Figure 25 : Comparaison d’un ou plusieurs dopages sur la persistance de L. pneumophila dans
les biofilms complexes .......................................................................................................... 109
Figure 26 : Quantification des amibes dans les biofilms formés en présence de DIP .......... 140
Figure 27 : Comparaison de la persistance de L. pneumophila dans des biofilms formés à 37
°C ou à 20 °C.......................................................................................................................... 142
Figure 28 : Comparaison de la croissance de L. pneumophila dans du milieu BYE standard ou
carencé en fer ......................................................................................................................... 189
Figure 29 : Effets de la carence en fer sur la résistance de L. pneumophila au NaCl (100 mM).
................................................................................................................................................ 192
Figure 30 : Effets de la carence en fer sur la résistance de L. pneumophila au H2O2 (10 mM)
................................................................................................................................................ 194
Figure 31 : Entrée de L. pneumophila dans les amibes après traitements aux chélateurs ..... 195
Figure 32 : Effets du fer et des chélateurs, sur l’implantation des mutants lpw_30711 et
lpp_2867, dans les biofilms complexes ................................................................................. 197
Page 4
Liste des tableaux
Tableau 1 : Souches de bactéries utilisées au cours de l’étude ............................................... 74
Tableau 2 : Séquences des amorces utilisées en PCRq et en t-RFLP ..................................... 93
Tableau 3 : Séquences des amorces utilisées pour la construction des mutants ..................... 93
Tableau 4 : Séquences des amorces utilisées en RT-PCRq...................................................... 94
Tableau 5 : Gènes de la phase transmissive régulés lors de la carence en fer ....................... 191
Page 5
Page 6
Introduction générale
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L’une des thématiques de recherche du laboratoire de Microbiologie de l’Eau est l’étude de la
maîtrise du développement de Legionella pneumophila , ainsi que ces interactions avec les
biofilms et les amibes libres.
L. pneumophila est une bactérie pathogène de l’homme, présente dans les environnements
aquatiques naturels ou artificiels. La contamination se fait par inhalation de particules d’eau
contaminées par la bactérie et est responsable de la légionellose. Cette infection constitue un
problème de santé publique car elle cause chaque année environ 1300 cas, avec 12% de
mortalité, malgré les thérapies mises en place pour la traiter.
En effet, la survie et la prolifération de ce pathogène sont essentiellement conditionnées par la
présence de protozoaires tels que les amibes, au sein des biofilms. Les biofilms, présents sur
des surfaces en contact avec l’eau, sont constitués par des agrégats de microorganismes
enchâssés dans une matrice d’exopolymères. Ils procurent à L. pneumophila un
environnement lui permettant de résister au stress environnemental et aux traitements
biocides. La présence d’autres microorganismes est indispensable à la prolifération de L.
pneumophila , comme par exemple, les amibes, à l’intérieur desquelles elle se multiplie et
acquière certaines propriétés phénotypiques. Après son passage dans les amibes, L.
pneumophila développent un plus fort potentiel infectieux, elle est également plus résistante
aux biocides, aux traitements thermiques et chimiques. Après multiplication, L. pneumophila
est libérée dans le milieu extracellulaire, et peut ainsi se disséminer dans l’environnement
aquatique.
Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux interactions de L. pneumophila avec les
biofilms. En 2008, notre équipe a mené une étude transcriptomique visant à comparer
l’expression des gènes chez L. pneumophila à l’état de biofilm mono-espèce, et sous sa forme
planctonique. Parmi les gènes modulés, les gènes pvcA et pvcB ont été induits. Ces deux
gènes sont impliqués dans le métabolisme du fer. Leurs séquences présentent des similarités
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avec les gènes codant la biosynthèse de sidérophores (pyoverdine) chez Pseudomonas
aeruginosa. L’impact de fortes concentrations en fer, sur la formation de biofilms mono-
espèce de L. pneumophila, a également montré que l’ajout de fer ralentissait la croissance du
biofilm. Ces résultats ont permis de suggérer que le fer a un rôle dans la formation et le
développement des biofilms par L. pneumophila .
De plus, il est acquit que le fer est l’un des éléments indispensable à la croissance de L.
pneumophila . Il présente également un rôle important dans la pathogénicité et la physiologie
de la bactérie.
Au regard de ces résultats, il nous a semblé intéressant d’étudier l’impact du fer sur la
formation des biofilms de L. pneumophila .
Ainsi, les deux principaux objectifs de notre étude sont, dans un premier temps, de voir
l’impact du fer ou au contraire les conséquences d’une carence en fer sur l’implantation et la
persistance de L. pneumophila dans les biofilms complexes. Dans un second temps nous
voulions avoir une vision plus globale de l’effet du fer au niveau de l’expression des gènes de
L. pneumophila . Afin de réaliser ces objectifs, nous avons développé deux axes de recherche.
Le premier axe a été consacré à la mise en place d’un nouveau modèle de biofilms complexes,
ainsi qu’à l’étude de l’impact du fer sur la persistance de L. pneumophila dans ces biofilms.
Le second axe a été orienté sur la comparaison de l’expression des gènes de L. pneumophila ,
cultivée dans un milieu de culture classique ou carencé en fer. Les résultats de l’analyse
transcriptomique nous ont permis d’identifier un gène en particulier, induit par la carence en
fer : lpp_2867. La fin de l’étude a été consacrée à la caractérisation de ce gène, dans le but de
comprendre son rôle dans le métabolisme du fer et dans la virulence de L. pneumophila. Les
analyses transcriptomiques ont été réalisées dans le laboratoire de Carmen Buchrieser, à
l’Institut Pasteur, et dans lequel j’ai pu effectuer un stage de trois semaines. Les expériences
réalisées pour caractériser le(s) rôle(s) de la protéine codée par le gène lpp_2867 ont été
Page 9
effectuées, en partie, dans le laboratoire de Nicholas Cianciotto, à l’Université de Médecine
de Chicago. J’ai également eu l’opportunité d’y aller cinq semaines afin de réaliser une partie
des expériences.
Page 10
Page 11
Page 12
Partie 1. Etude bibliographique
Page 13
1. Legionella pneumophila
En 1976, une épidémie de pneumonie a frappé plusieurs membres de la légion américaine, à
Philadelphie en Pennsylvanie (McDade et al., 1977). Ce n’est qu’en janvier 1977 que l’agent
responsable de cette épidémie fût isolé par Joseph McDade et Charles Shepard. Le genre
Legionella fut ensuite établi en 1978 lors du premier symposium international sur la maladie
des légionnaires et la bactérie isolée fut nommée Legionella pneumophila, pour souligner sa
capacité à infecter les poumons (Brenner et al., 1979). La voie de transmission la plus
communément admise est l’inhalation d’aérosols contaminés par les bactéries (Yu, 1993),
pouvant atteindre les alvéoles pulmonaires (Muder & Yu, 2002; Newton et al., 2010). Le plus
souvent, les sources de contamination sont les installations artificielles telles que les tours
aéroréfrigérantes (TAR) (Abu Kwaik et al., 1998) ou les systèmes de climatisation. Des
niches naturelles existent également, comme les eaux des lacs et des rivières, dans lesquelles
se forment très souvent des biofilms susceptibles d’abriter L. pneumophila.
1.1. Le genre Legionella
1.1.1. Généralités
L. pneumophila appartient au genre Legionella et à la famille des Legionellaceae.
L’utilisation de la séquence du gène codant l’ARNr 16S a permis de confirmer que les
Legionellaceae forment un sous-groupe de la subdivision gamma des protéobacteries. Le
nombre de sérogroupes et d’espèces ne cesse d’augmenter. Environ 59 espèces sont connues à
ce jour, comprenant 70 sérogroupes du genre Legionella , et 24 d’entre eux ont été associés à
des pathologies humaines (Newton et al., 2006; Newton et al., 2010). L. pneumophila est
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responsable de 90% des cas de légionellose et 84% sont causés par le sérogroupe 1 (Newton
et al., 2010). En France, L. pneumophila sérogroupe 1 est retrouvée dans 95% des isolats
cliniques (Doleans et al., 2004). Son impact sur la santé publique oriente les recherches sur ce
sérogroupe en particulier. En Australie et Nouvelle Zélande, une autre espèce prédomine. Il
s’agit de L. longbeachae, responsable de 30% des cas de légionellose (Yu et al., 2002). Au
niveau mondial, les trois espèces L. longbeachae, L. bozomanae et L. micdadei causent 2 à
8% des cas de légionellose (Muder & Yu, 2002; Newton et al., 2010). Les espèces citées
précédemment, sont celles les plus souvent impliquées dans les cas d’infection. Les autres
espèces sont très rares, et très peu impliquées dans des cas de légionellose. Il existe aussi des
espèces proches, non cultivables en l’absence d’amibes, qui sont appelées « Legionella like
amoebal pathogens » (Benson & Fields, 1998).
Figure 1 : Images de Legionella pneumophila prises en microscopie électronique
(Brenner et al., 1979; Cazalet & Buchrieser, 2005).
L. pneumophila est un coccobacille Gram négatif (McDade et al., 1977), non sporulé et non
capsulé (Fig. 1). Cette bactérie peut mesurer entre 0,3 et 0,5 µm de large et 1 à 3 µm de long
(Rodgers et al., 1980), et adopter une forme filamenteuse pouvant atteindre une longueur de
10 à 20 µm. En fonction des conditions environnementales et de son état physiologique, elle
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peut être mobile grâce à la présence de flagelles (Byrne & Swanson, 1998), situé le plus
souvent en position monopolaire ou subpolaire (Rodgers et al., 1980).
L. pneumophila est aérobie stricte, catalase positive. Elle est aussi uréase négative et nitrate
réductase négative. Son enveloppe bactérienne est très hydrophobe car riche en acides gras
ramifiés et en ubiquinones (Moss et al., 1977).
Le fer et la cystéine sont deux éléments indispensables à la croissance optimale de L.
pneumophila . Elle se développe sur un milieu de culture qui lui est spécifique, le BCYE,
composé de fer, de L-cystéine, de tampon ACES (N-2-acetamido-2-aminoethansulfonic acid),
d’extrait de levure et de charbon actif. Le pH optimal de ce milieu doit être fixé à 6,9 (Feeley
et al., 1979; Pasculle et al., 1980). Elle utilise les acides aminés comme source de carbone et
d’énergie (Pine et al., 1979). Néanmoins, elle présente une auxotrophie pour deux d’entre
eux, la sérine et la thréonine (George et al., 1980; Tesh et al., 1983). Le glutamate fait partie
de ces principales sources d’énergie (Weiss & Westfall, 1984) contrairement au glucose qui
n’a aucun effet sur sa croissance (Pine et al., 1979). Legionella peut être isolée dans des
environnements où la température peut varier entre 5 et 63 °C, et un pH compris entre 5,0 et
9,2 (Fliermans et al., 1981). Cependant, sa prolifération est favorisée lorsque les températures
sont comprises entre 20 °C et 42 °C. Pour une croissance optimale, il est préférable de la
cultiver à 35 °C, à pH 6,9 (Diederen, 2008; Feeley et al., 1979; Fields et al., 2002). D’un
point de vue génomique, en 2004, les génomes complets de trois souches de L. pneumophila
ont été décrits. Il s’agit des souches Paris, Lens et Philadelphia 1 (Cazalet et al., 2004; Chien
et al., 2004). Elles possèdent chacune un seul chromosome circulaire d’environ 3,5 Mpb, 3,3
Mpb et 3,4 Mpb respectivement. De l’ADN plasmidique est retrouvé chez les souches Paris et
Lens, contrairement à la souche Philadelphie où aucun plasmide n’a été identifié. Le génome
contient environ 3000 gènes et parmi eux, 88% codent des protéines d’intérêt. L’étude du
génome de L. pneumophila a révélé une grande plasticité (de Felipe et al., 2005). De
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nombreux gènes semblent acquis par transfert horizontal et beaucoup d’éléments génétiques
mobiles ont été identifiés. Il semblerait que beaucoup de ces gène soient d’origine eucaryote,
ainsi qu’un grand nombre de protéines contenant des motifs de protéines eucaryotes ou ayant
des similarités avec celles-ci (Cazalet et al., 2004; Chien et al., 2004). Plus récemment, les
génomes complets de 5 autres souches de L. pneumophila ont été séquencés. Il s’agit des
souches Corby, Alcoy, 130b, Lorraine et HL0604 1035 (D'Auria et al., 2010; Ginevra et al.,
2008; Gomez-Valero et al., 2011a; Schroeder et al., 2010; Steinert et al., 2007). Toutes ces
souches de L. pneumophila , ont en commun un core-génome hautement conservé, comprenant
beaucoup de protéines semblables à des protéines eucaryotes. Les recombinaisons et les
transferts de gènes sont fréquents. Des analyses de la distribution du polymorphisme des
nucléotides ont suggéré que de larges fragments de chromosomes (environ 200 kb) sont
échangés entre les différentes souches de L. pneumophila et contribuent à la dynamique du
génome. Les plasmides jouent également un rôle dans la diversification du génome, par des
échanges entre les souches (Gomez-Valero et al., 2011b).
1.1.2. Ecologie
L. pneumophila est une bactérie ubiquiste, que l’on retrouve principalement dans des zones
humides. Elle est retrouvée dans l’environnement aquatique naturel. En effet, elle colonise les
eaux des lacs, des rivières et les eaux souterraines (Riffard et al., 2001). Néanmoins, peu de
cas de légionellose ont été associés à des sources naturelles (Taylor et al., 2009). En revanche,
des études ont permis d’identifier les installations hydriques artificielles comme étant les
principales sources de contamination (Nguyen et al., 2006; Philippe et al., 2006). Parmi elles,
nous pouvons citer les spas, les fontaines, les brumisateurs, les systèmes de douches, les
dispositifs médicaux, les plus importantes étant les TAR et les systèmes de climatisation
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(Koide et al., 1993). Dans ces installations, la formation de biofilms est très courante (Lau &
Ashbolt, 2009). Ces structures complexes représentent de véritables niches écologiques,
idéales pour la croissance et la multiplication de L. pneumophila . Finalement, ces installations
favorisent la libération des pathogènes via la formation d’aérosols. Les infections bactériennes
peuvent ainsi avoir lieu dans les habitations, les hôtels, mais également dans les hôpitaux
(Mermel et al., 1995).
La présence de L. pneumophila dans l’environnement est aussi conditionnée par la présence
d’autres microorganismes tels que les amibes qui constituent un facteur clé dans le
développement de ces pathogènes dans les réseaux (Molmeret et al., 2005) (Fig. 2).
Figure 2 : Développement et libération de Legionella dans un système de distribution
d’eau (Lau & Ashbolt, 2009; Mermel et al., 1995). Entrée de Legionella sp. et des
protozoaires dans les systèmes de distribution d’eau (1) ; fixation des microorganismes sur la
surface et développement de biofilms (2) ; prolifération de Legionella à l’intérieur des
biofilms (3a) ou à l’intérieur des protozoaires (3b) ; libération de Legionella lors du
décrochage de fragments de biofilms dans lesquels sont piégées les bactéries (4a) ; libération
de Legionella internalisée dans les protozoaires (4b), ou à l’intérieur de vacuoles relarguées
par les protozoaires (4c).
Ces protozoaires sont capables de se nourrir par phagocytose, de bactéries, d’algues ou de
levures, présentes en surface des biofilms. C’est en 1980 que Rowbotham à montrer la
prolifération intracellulaire de L. pneumophila dans les amibes du genre Acanthamoebae et
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Naegleria (Rowbotham, 1980). La présence du pathogène dans les eaux serait le résultat, dans
la majorité des cas, de leur prolifération à l’intérieur des amibes. Ce phénomène a pour
conséquence d’augmenter les risques de transmission et d’infections potentielles (Fields et al.,
2002). Les amibes jouent donc un rôle important dans la persistance de L. pneumophila dans
l’environnement et sur son pouvoir pathogène (Segal & Shuman, 1999).
La capacité de L. pneumophila à infecter les macrophages humains et à causer de graves
infections, peut être la conséquence de son adaptation au sein des amibes (Molmeret et al.,
2005). Lors de la co-évolution à l’intérieur des amibes, les bactéries sont capables d’acquérir
des gènes eucaryotes, leur permettant ainsi une meilleure adaptation au mode de vie
intracellulaire (Buchrieser, 2011; Gomez-Valero et al., 2011a). Les amibes procurent à L.
pneumophila , la capacité de persister dans l’environnement. Treize espèces d’amibes,
comprenant principalement les genres Hartmannella et Acanthamoebae, sont connues à ce
jour pour supporter la réplication intracellulaire de L. pneumophila (Molmeret et al., 2005).
Une fois internalisée, L. pneumophila se multiplie, protégée des conditions environnementales
par son hôte (Garcia et al., 2007). Après leur passage dans les amibes, les bactéries présentent
des caractéristiques phénotypiques différentes. Elles deviennent plus résistantes aux fortes
températures, à l’acidité et aux variations de pressions osmotiques. Elles résistent donc à des
conditions environnementales plus hostiles (Gao et al., 1998). Leur sensibilité aux
antibiotiques et aux agents chimiques est nettement diminuée (Barker et al., 1995). Elles sont
également plus virulentes, leur potentiel d’infection est plus important à l’encontre des amibes
et des macrophages (Cirillo et al., 1994). A la sortie des amibes, L. pneumophila présente
également une plus grande capacité à s’implanter dans les biofilms (Bigot et al., 2013).
Les amibes jouent donc un rôle essentiel dans la transmission de L. pneumophila (Molmeret et
al., 2005; Rowbotham, 1980). Lors des épidémies de légionellose, la présence du pathogène
est, dans la majorité des cas, corrélée à la présence d’amibes dans la source d’infection (Fields
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et al., 1990). Les interactions avec les amibes sont considérées comme l’origine de la
pathogénèse de L. pneumophila .
1.1.3. La légionellose
La contamination par L. pneumophila se manifeste par une pneumonie sévère, connue sous le
nom de maladie du légionnaire ou légionellose. Elle peut entrainer le décès du malade dans 10
à 20% des cas (Diederen, 2008). L’homme contracte l’infection en inhalant des particules
infectieuses, c'est-à-dire des micro-gouttelettes d’eau contenant le pathogène (Berk et al.,
1998) capable d’atteindre les alvéoles pulmonaires (Yu, 1993). Il est admit que la principale
voie de contamination se fait par inhalation d’aérosols contaminés. Aucune contamination
interhumaine n’a été démontrée à ce jour (Abu Kwaik et al., 1998).
Cette pathologie est une maladie émergente du XXème siècle. Ceci est essentiellement due au
développement et au vieillissement des systèmes de distribution de l’eau (McIntyre et al.,
1991). Afin de prévenir au mieux les cas de légionellose, il est important de cibler les sources.
Les principales sources de contamination auxquelles l’Homme est susceptible d’être exposé,
sont les installations artificielles utilisant de l’eau à température moyenne et générant des
aérosols, comme les douches, les climatiseurs et les spas (Breiman et al., 1990). La maladie se
déclare dans un délai de 2 à 10 jours, et les symptômes peuvent persister jusqu’à 7 jours.
L’infection cause des troubles digestifs qui se traduisent par des douleurs abdominales, des
vomissements, des diarrhées, des effets au niveau neurologique, causant des maux de tête, des
troubles de conscience, des céphalées et des effets au niveau hépatique induisant des
insuffisances rénales, un syndrome glomérulaire, de l’hyponatrémie, ou encore de
l’hypophosphorémie (Diederen, 2008).
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Il est également important de connaitre les principaux facteurs de risques afin de prévenir ces
infections. Les facteurs individuels sont l’âge, le sexe, le tabagisme, l’alcoolisme, le diabète,
la morbidité respiratoire et cardiovasculaire, l’immunodépression (Benhamou et al., 2005;
Borella et al., 2005). Les facteurs collectifs comprennent les lieux où les réseaux d’eaux sont
communs. Parmi les endroits les plus à risques nous pouvons citer les hôpitaux, les hôtels, les
campings, les stations thermales ou encore les TAR qui peuvent emmètre des nuages d’eau
contaminée dans l’atmosphère, et ceci sur plusieurs kilomètres. En Novembre 2003, une
épidémie localisée de légionellose est survenue à Harnes, dans le Pas-de-Calais, en France.
D’après le rapport d’investigation de l’institut de veille sanitaire (InVS), la souche
responsable de cette épidémie était la souche L. pneumophila Lens, sérogroupe 1. Au total, 86
cas ont été détectés, et parmi eux, 18 sont décédés. L’épidémie a été exceptionnelle de par son
ampleur, mais aussi sa durée (plus de deux mois), et sa dispersion géographique (12 km
autour de la ville de Harnes). Les TAR d’une des usines de la ville ont été incriminées comme
étant à l’origine de cette épidémie. L. pneumophila c’est donc propagée dans l’environnement,
piégée dans les gouttelettes d’eau contaminées, pendant le fonctionnement des installations de
l’usine. La concentration en L. pneumophila sur ce site avait été estimée à 108 UFC/L
(Rapport d’investigation de l’InVs). Par la suite, plusieurs circulaires et arrêtés ont été mis en
place afin de prévenir au mieux les risques de contamination (Benhamou et al., 2005).
Depuis 1987, la légionellose fait partie des pathologies à déclaration obligatoire (Benhamou et
al., 2005). L’InVS a présenté un bilan des cas de légionellose survenus en France en 2012 et
1298 cas ont été comptabilisés. Parmi eux, 98% étaient des cas confirmés, dont 95% dus à L.
pneumophila sérogroupe 1. Le taux d’incidence des cas notifiés étaient de 1,98 pour 100 000.
Le nombre de cas a augmenté de 11% entre 2011 et 2012 (Fig. 3). Cependant, une baisse de la
mortalité est observée ces dernières années s’expliquant par une meilleure prévention des
risques et des traitements plus efficaces (Carbonne & Astagneau, 2005).
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Afin de pallier à cette infection, une thérapie optimale a été mise en place contre L.
pneumophila , basée sur l’activité intrinsèque de certains agents, ainsi que sur leur profil
pharmacocinétique et pharmacodynamique. Dans le cas de la légionellose, l’érythromycine,
qui était l’antibiotique de référence depuis 1976, a été remplacé par les macroazalides et les
fluoroquinolones. Ils figurent en première ligne des traitements. Le choix de la thérapie et les
doses à appliquer, dépendent de la gravité de l’infection. La durée du traitement est également
variable. Chez un individu immunocompétent, le traitement dure en moyenne 14 à 21 jours,
tandis que chez un immunodéprimé ou dans le cas d’infection sévère, il peut durer jusqu’à 30
jours (Benhamou et al., 2005).
Figure 3: Evolution du nombre de cas et du taux annuel d’incidence des cas notifiés de
légionellose en France, entre 1988 et 2012 (d’après l’InVS).
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1.2. Les facteurs de virulence
L. pneumophila est le plus souvent associée à la flore bactérienne des biofilms (Newton et al.,
2010), où elle sert de nourriture à certains protozoaires comme les amibes et les protozoaires
ciliés. Elles ont développé des moyens leur permettant d’échapper à la digestion par ces
organismes (Greub & Raoult, 2004; Hilbi et al., 2007). La résistance aux amibes constitue un
mécanisme basé sur la virulence de L. pneumophila (Hilbi et al., 2001). Elle est capable de
résister à la phagocytose par les amibes ou les macrophages, grâce à des protéines sécrétées
par son système de sécrétion de type IV encore appelé, système Dot/Icm (Berger & Isberg,
1994; Brand et al., 1994). Une fois le pathogène phagocyté, il injecte une grande quantité de
protéines dans la cellule hôte (effecteurs), détournant ainsi la phagocytose (Isberg et al., 2009;
Zhu et al., 2011). Alors, plutôt que d’être dégradée par les lysosomes, L. pneumophila se
multiplie à l’intérieur de vacuoles connues sous le nom de « Legionella Containing
Vacuoles » (LCV). Après leur réplication, les bactéries sont libérées en extracellulaire suite à
la lyse de leur cellule hôte (Horwitz & Silverstein, 1980). Elles possèdent un second système
de sécrétion, appelé système de sécrétion Lsp de type II, également impliqué dans les
interactions hôtes-pathogènes (Hales & Shuman, 1999; Liles et al., 1999). Ce système est
indispensable à la croissance intra-amibes et intra-macrophages, et il sécrète un grand nombre
d’enzymes, telles que des protéases, des aminopeptidases et des phospholipases (Rossier &
Cianciotto, 2001; Rossier et al., 2008).
1.2.1. Internalisation de L. pneumophila et formation des vacuoles réplicatives
La fixation et l’internalisation de L. pneumophila sont les deux premières étapes du processus
d’infection (Fig. 4-1). La liaison de L. pneumophila aux cellules cibles est rendue possible
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grâce à des adhésines présentes à leur surface : RtxA, PilEL, EnhC et Hsp60. Des récepteurs,
capables de reconnaitre ces protéines ont été identifiés à la surface des cellules hôtes, A.
castellanii ainsi que les cellules épithéliales (Cirillo et al., 2001; Garduno et al., 1998).
D’autres facteurs bactériens sont impliqués dans l’invasion, incluant, LpnE, LvhB2, LaiA, Lcl
et Htp, certains jouant un rôle direct dans la capture de L. pneumophila (Chang et al., 2005;
Newton et al., 2006; Ridenour et al., 2003; Vandersmissen et al., 2010). L’internalisation de
L. pneumophila par les amibes ou par les macrophages est initialement régulée par le système
de sécrétion de type IV délivrant approximativement 300 effecteurs à l’intérieur de la cellule
hôte (Gomez-Valero et al., 2011a). Une fois les bactéries attachées à leurs hôtes, elles sont
internalisées par phagocytose (Horwitz, 1984), décrit pour les macrophages et Dictyostelium
discoideum (Peracino et al., 2010; Watarai et al., 2001) (Fig. 4-2).
Figure 4: Cycle de vie intracellulaire de L. pneumophila (Franco et al., 2009).
(1) Internalisation de L. pneumophila par phagocytose, (2) inhibition de la voie endocytaire,
(3) interaction de la LCV avec des mitochondries et inhibition de la fusion phagosomelysosome, (4) recrutement du réticulum endoplasmique et des ribosomes sur la LCV pour
former une vacuole réplicative, (5) réplication de L. pneumophila et formation du flagelle, (6)
libération des bactéries dans le milieu extracellulaire et infection de nouvelles cellules hôtes.
Page 24
Il y a ensuite un recrutement des mitochondries ainsi que des protéines du réticulum
endoplasmique de la cellule hôte (Fig. 4-3), puis formation de vacuoles contenant L.
pneumophila (LCV) (Fig. 4-4). Ces vacuoles ont la capacité de résister à l’acidification et de
ce fait leur maturation en phagolysosome est rendue impossible (Horwitz, 1984). Enfin, la
réplication bactérienne est observée après la formation de ces compartiments, semblables à
des réticulums endoplasmiques rugueux.
1.2.2. Rôle du système Dot/Icm
Comme de nombreuses bactéries pathogènes, L. pneumophila possède un système de
sécrétion qui lui est indispensable pour survivre et se répliquer à l’intérieur des protozoaires
ou des cellules humaines qu’elle a infecté. Elle utilise ce système de sécrétion pour délivrer
des protéines effectrices à l’intérieur des cellules cibles ayant pour conséquence une
modulation des fonctions cellulaires chez l’hôte. Le système de sécrétion Dot/Icm (Defect in
Organelle Trafficking ; Intracellular Multiplication), appartenant à la famille des systèmes de
sécrétion de type IV, est codé par 27 gènes. Il forme une aiguille moléculaire qui traverse les
membranes intracellulaire et extracellulaire (Fig. 5). Les protéines constituant cette structure
sont nombreuses. La protéine DotA est une protéine de la membrane interne qui sert de
protéine échafaud. DotB est une protéine cytoplasmique associée à la membrane interne,
possédant une activité ATPase. Son rôle est très important dans la formation du système car il
permet le transport des substrats via l’hydrolyse de l’ATP. Les protéines DotF-G-H-C-D
forment le core transmembranaire du système. DotU et IcmF, intramembranaires, permettent
le maintien du système sous sa forme active et jouent un rôle protecteur contre sa dégradation.
Certaines protéines sont responsables de la régulation du flux de substrat de part et d’autre de
la membrane. Il s’agit de la protéine IcmQ, responsable de la formation des pores dans la
membrane de L. pneumophila suite à son contact avec la cellule hôte. La principale fonction
Page 25
du système est donc de délivrer des protéines à travers la membrane de la cellule hôte, pour
ainsi favoriser la prolifération de L. pneumophila .
Les protéines sécrétées par ce système sont nommées effecteurs. Ils modulent de nombreux
processus cellulaires chez l’hôte tels que la formation des LCV, le trafic vésiculaire, le
recrutement du réticulum endoplasmique. Ils sont également nécessaires dans différentes
étapes du processus infectieux et dans la réplication intracellulaire (Cianciotto, 2005; Isberg et
al., 2009).
Figure 5 : Système Dot/Icm
(Isberg et al., 2009). Représentation de la localisation
membranaire du système Dot/Icm et des relations entre les protéines qui le constituent. Cette
représentation est basée sur l’étude de la stabilité des protéines suite à des mutations par
délétion (Buscher et al., 2005). Les lettres individuelles correspondent aux noms des protéines
Dot. Les lettres précédées de la lettre « i » indiquent le nom des protéines Icm.
Environ 300 effecteurs ont été identifiés à ce jour. Les pricipales protéines identifiées comme
étant impliquées dans le trafic vésiculaire sont VipA/D/E (Shohdy et al., 2005), mais aussi
LegA8/AnkX/AnkN, LegC2/YlfB et Leg7/YlfA (de Felipe et al., 2005; de Felipe et al.,
2008), SetA (Heidtman et al., 2009). D’autres protéines ont été désignées comme étant
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responsables du recrutement des protéines du réticulum endoplasmique. Il s’agit des protéines
SidC et SidJ. L’effecteur Rab1 est un régulateur du transport membranaire impliqué dans la
biogénèse des LCV. Les fonctions de Rab1 sont modulées par d’autres effecteurs, tel que
l’inhibiteur LepB. LidA, en se liant à Rab1, stimule la formation de vacuoles réplicatives
(Conover et al., 2003; Derre & Isberg, 2005). La protéine RalF, induit le recrutement de Arf1
(GTPase impliquée dans la régulation du transport membranaire) aux LCV. De la même
façon, la protéine SidM/DrrA, permet le recrutement de la protéine Rab1 aux LCV. Des
effecteurs ont pour rôle d’affecter la synthèse protéique chez la cellule hôte, ils constituent
ainsi des facteurs de virulence et favorisent la dissémination de L. pneumophila :
LegU2/LubX, Lgt1, LegC8/Lgt2, LegC5/Lgt3 (Kubori et al., 2008). D’autres ont aussi un
rôle dans la survie de la cellule hôte. Nous pouvons citer SdhA, SidF et DimB. Une mutation
de l’un de ces gènes se traduit par un défaut de la réplication intracellulaire (Laguna et al.,
2006; Losick & Isberg, 2006). Finalement nous pouvons aussi mentionner les protéines LepA
et LepB, impliquées dans la réplication intracellulaire et la protection de la cellule hôte contre
la lyse, lors de la libération des bactéries en extracellulaire (Chen et al., 2004).
1.2.3. Différenciation de L. pneumophila
Au cours de son développement intracellulaire, L. pneumophila passe par deux phases
distinctes. Ces deux phases sont également observables lorsqu’elles sont cultivées en milieu
liquide (Molofsky & Swanson, 2004). La première phase est la phase de réplication suivie par
la phase de transmission (Fig. 6).
Lorsque les conditions environnementales sont favorables L. pneumophila est capable de
proliférer, c’est la phase réplicative. Elle présente des caractéristiques phénotypiques
spécifiques. Les bactéries ne sont pas flagellées donc non mobiles, elles ne sont pas
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cytotoxiques et sont résistantes au sodium. Les caractères spécifiques de la phase transmissive
sont réprimés (Fig 6-2,3). Dès lors que le milieu s’appauvrit en nutriment, les carences
induisent la différenciation de L. pneumophila qui passe en phase transmissive (Fig. 6-4). La
multiplication est réprimée, mais d’autres caractères sont exprimés. L. pneumophila devient
plus virulente, mobile, cytotoxique et flagellée (Byrne & Swanson, 1998), ce qui facilite sa
sortie de la cellule hôte (Fig. 6-5). La libération se déroule en deux étapes. Il y a une première
étape durant laquelle la membrane du phagosome se rompt, libérant les bactéries dans le
cytoplasme (Molmeret et al., 2004; Molmeret et al., 2010), puis une étape de lyse de la
membrane plasmique, probablement suite à la formation de pores (Molmeret & Abu Kwaik,
2002). Ainsi les bactéries sont libérées dans le milieu extracellulaire (Fig. 6-6). Une autre
proposition a été faite pour expliquer ce phénomène. La destruction de la cellule hôte aurait
lieu grâce à un processus d’apoptose (Santic et al., 2007).
En milieu de culture liquide, L. pneumophila se multiplie de manière exponentielle, tant que
les ressources nutritives sont suffisantes. Lorsque le milieu commence à s’appauvrir, elle se
différencie et entre en phase stationnaire, sa croissance est stoppée (Fig. 6-8). Pendant cette
phase, elle présente plusieurs caractéristiques. Elle est plus mobile, elle résiste aux UV, à la
chaleur, et aux changements de pressions osmotiques, elle possède aussi un potentiel
infectieux plus important (Molofsky & Swanson, 2004).
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Figure 6 : Cycle de vie de L. pneumophila (Molofsky & Swanson, 2004). L. pneumophila
sous forme transmissive est phagocytée (1), lorsque les conditions sont favorables, la bactérie
est en phase réplicative, elle se multiplie, les traits de transmission sont réprimés (2). L.
pneumophila termine sa réplication, les traits de transmission sont de nouveau exprimés et
une forme particulière, hautement résistante et infectieuse (Mature Intracellular Form : MIF)
peut apparaître (4). La cellule hôte est lysée (5), la bactérie peut alors aller se loger dans un
biofilm où elle peut rencontrer une nouvelle cellule hôte et démarrer un nouveau cycle (7). La
bactérie en culture liquide peut également exprimer les facteurs de la phase réplicative et
transmissive lors des phases exponentielle et stationnaire, respectivement (8).
1.2.4. Réponse stringente
Beaucoup de bactéries utilisent la réponse stringente pour activer des facteurs de virulence et
persister dans des environnements hostiles : Mycobacterium tuberculosis, Listeria
monocytogenes, Staphilococcus aureus, Streptococcus typhimurium (Godfrey et al., 2002;
Magnusson et al., 2005).
La réponse stringente est utilisée par L. pneumophila , pour s’adapter à une carence
nutritionnelle. Même si la composition exacte en nutriments, contenues dans les vacuoles
réplicatives, est encore inconnue, plusieurs éléments ont indiqué que la présence d’acides
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aminés dans l’environnement est indispensable à la croissance de L. pneumophila . Une
variation de leur concentration peut affecter leur état physiologique. En effet, les acides
aminés constituent leur seule source de carbone et d’énergie (Tesh et al., 1983). Elles utilisent
des transporteurs spécifiques, appelés Pht (Phagosomal transporters) qui leur permettent de
détecter la disponibilité de ces acides aminés dans leur environnement (Sauer et al., 2005).
Une carence en acides aminés, induit certains changements chez L. pneumophila. Elle utilise
la réponse stringente pour induire un ensemble de caractères lui permettant d’échapper à son
hôte, de survivre dans l’environnement ou encore de réinfecter d’autres cellules. L.
pneumophila déclenche la réponse stringente lorsqu’elle subit un stress métabolique ou
nutritif (carence en acides aminés, carbone, nitrogène ou phosphate) (Magnusson et al., 2005).
De nombreux phénomènes physiologiques sont induits suite à ces carences comme
l’inhibition de la croissance, la répression de la synthèse nucléique et protéique, la production
de protéines de dégradation, l’induction de la synthèse et du transport des acides aminés (Fig.
7). La réponse stringente résulte d’une accumulation d’ARNt non chargés, au niveau du site A
des ribosomes, due au manque d’acides aminés.
L’enzyme RelA associée aux ribosomes est activée pour synthétiser le ppGpp, ainsi que son
précurseur le pppGpp, par phosphorylation du GDP et du GTP. Le ppGpp est capable de lier
directement les sous unités β et β’ de l’ARN polymérase (RNAP), modifiant l’expression de
certains gènes (Magnusson et al., 2005). Il agit donc comme un régulateur et module de
nombreux processus cellulaires et physiologiques.
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Figure 7 : Réponse stringente chez les bactéries (Magnusson et al., 2005). Deux voies
métaboliques permettent la formation du pppGpp (qui est par la suite converti en ppGpp) à
partir d’ATP et de GTP, en réponse à plusieurs signaux de stress. Bien que le ppGpp
interagisse avec l’ARN polymerase (RNAP), il réprime de nombreuses voies métaboliques (indique une inhibition; + indique une stimulation).
1.2.5. Régulation du passage en phase transmissive
Afin de comprendre le changement de phase, le transcriptome de L. pneumophila a été étudié,
comparant l’expression des gènes entre la phase réplicative et la phase transmissive.
L’expression de plus de la moitié du génome est modulée lors du passage en phase
transmissive. Ce résultat a été observé lors de la croissance intracellulaire mais aussi lors de la
croissance en milieu de culture (Bruggemann et al., 2006; Faucher et al., 2010).
Le gène relA est désigné comme étant le gène codant l’enzyme indispensable à la synthèse du
ppGpp (Zusman et al., 2002). Par analogie avec d’autres bactéries, le (p)ppGpp agit comme
une alarmone qui coordonne certains mécanismes permettant à L. pneumophila d’échapper
aux conditions défavorables que lui procure son hôte, et facilitant sa persistance dans
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l’environnement par l’infection d’autres phagosomes. Beaucoup de procaryotes possèdent une
seconde enzyme nommée SpoT, qui en fonction des conditions expérimentales, agit comme
une ppGpp synthase ou une ppGpp hydrolase (Chatterji & Ojha, 2001). Lorsque les
conditions de croissance sont favorables, SpoT et RelA agissent ensemble pour maintenir un
niveau basal de ppGpp dans le cytosol, grâce à leur activité hydrolase (Fig. 8-A). Puis lors
d’un stress induisant la réponse stringente, elles utilisent leur activité synthase, pour produire
le nucléotide (Magnusson et al., 2005) (Fig. 8-B).
Figure 8 : Modèles de régulation des phases réplicatives et transmissives (Molofsky &
Swanson, 2004). Le ppGpp et les facteurs sigma contrôlent l’expression des phénotypes des
voies transmissive et réplicative. A partir des données génétiques obtenues, ce modèle d’étude
à pu être réalisé. Il présente les différentes voies de régulations, les interactions, directes et
indirectes, entre les protéines. (A) Phase réplicative : CsrA réprime les caractères de la phase
transmissive et induit la réplication. CsrA inhibe également la formation des flagelles, la
résistance aux stress environnants ainsi que la sensibilité au sodium ; (B) Phase transmissive :
la carence en acides aminés induit la production de ppGpp, alarmone induisant l’expression
de plusieurs protéines et menant à l’expression des caractéristiques de la phase transmissive
telle que la production de flagelles, l’augmentation de la capacité à infecter les cellules hôtes,
la sensibilité au sodium.
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Pour réguler l’expression des gènes impliqués dans la différenciation, l’activité de la RNAP
est modifiée par altération du facteur sigma (Nystrom, 2004). Il existe six facteurs sigma chez
L. pneumophila : RpoD, RpoE, RpoH, RpoN, RpoS et FliA. Ils sont impliqués dans la
régulation du passage en phase transmissive (Bachman & Swanson, 2001; Molofsky et al.,
2005). De récentes études ont permis de montrer que le ppGpp contrôle la capacité du facteur
sigma à lier la RNAP. Il contrôle aussi la production et l’activité de certains de ces facteurs
(Magnusson et al., 2005). Lors d’une carence nutritive, la réponse stringente régule la
compétition entre les différents facteurs sigma ainsi que d’autres aspects de la transcription,
modifiant ainsi le profil d’expression des gènes. Plus précisément, le facteur sigma, RpoS,
spécifique de la phase stationnaire, présente un rôle dans la sensibilité au sodium, l’expression
de la flagelline, l’évasion des lysosomes. Il est nécessaire pour la multiplication de L.
pneumophila à l’intérieur des amibes (Hales & Shuman, 1999). Il coopère avec d’autres
facteurs pour induire les caractères de virulence qui permettent une multiplication importante
à l’intérieur des macrophages (Bachman & Swanson, 2001) et induit l’expression de gènes
impliqués dans la phase transmissive (Fig. 8-B). Lorsque le gène rpoS est présent en
beaucoup de copies, il induit une répression des gènes csrA, letE, fliA et flaA, et inhibe la
mobilité, l’infectivité, mais aussi la cytotoxicité (Bachman & Swanson, 2004a). Ajouté aux
facteurs FliA et RpoS, le système à deux composants LetA/LetS, régule la mobilité de L.
pneumophila , la cytotoxicité, l’infectivité et l’évasion des lysosomes dans les macrophages
(Bachman & Swanson, 2004a; Hammer et al., 2002) ainsi que dans les amibes (Lynch et al.,
2003). Après leur entrée en phase stationnaire, LetA active des facteurs de la phase
transmissive en inhibant l’expression du facteur CsrA, répresseur des gènes codant pour ces
facteurs (Fettes et al., 2001; Molofsky & Swanson, 2003). CsrA est une protéine
indispensable qui régule le cycle de croissance biphasique de L. pneumophila . La protéine
activatrice LetE induit l’expression de gènes impliqués dans la phase stationnaire et
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dépendante du système LetA/LetS, mais induit aussi la cytotoxicité ainsi que l’infection des
macrophages (Bachman & Swanson, 2004b; Hammer et al., 2002). La fin de la phase
réplicative est également caractérisée par une surexpression des gènes codant des effecteurs
du système de sécrétion Dot/Icm. Certains gènes sont induits lors de ce changement d’état,
comme flaA, mip, dotH, dotO (Hammer & Swanson, 1999; Watarai et al., 2001). Ces
caractéristiques ont été observées aussi bien en culture liquide qu’en culture intracellulaire
(Byrne & Swanson, 1998).
1.2.6. Rôle du système de sécrétion de type II
Chez les bactéries Gram négatif, le système de sécrétion de type II, T2SS, constitue l’un des
six systèmes permettant l’export de protéines du milieu intracellulaire vers le milieu
extracellulaire ou vers une cellule cible. Des analyses génomiques ont révélé que les gènes
codant le T2SS sont communs à de nombreuses bactéries Gram négatif mais ne sont pas
universels (Cianciotto, 2005). Des études fonctionnelles ont indiqué que ce système est
promoteur de la virulence de pathogènes humains, de pathogènes ciblant les animaux mais
aussi ceux ayant pour cible les plantes (Cianciotto, 2005).
Il y a deux étapes dans le processus d’utilisation de ce système (Fig. 9) (Filloux, 2004). Lors
de la première étape, les protéines destinées à l’export sont transloquées à travers la
membrane interne via les protéines Sec et Tat et leurs extrémités N-ter sont clivées par des
peptidases. Dans la seconde étape, les protéines clivées sont transloquées du périplasme vers
le milieu extracellulaire grâce à l’action de complexes protéiques spécifiques, qui permettent
la formation de pores dans la membrane extracellulaire. Le complexe T2SS est constitué par
12 composants protéiques. Nous pouvons citer la sécrétine de la membrane externe (T2S D),
une ATPase cytoplasmique (T2S E), une protéine de la membrane interne (T2S F), des
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pseudopilines (T2S G, H, I, J, K), des protéines facilitant la liaison d’ATPases à la membrane
interne (Filloux, 2004; Peabody et al., 2003). Après translocation à travers la membrane
interne, une protéine destinée à l’export est clivée et son extrémité N-terminal est méthylée
par une pré-pseudopiline peptidase, aussi connue sous le nom de PilD. Le système de
reconnaissance des protéines qui transitent au travers de ce système n’est pas encore connu.
Les protéines quittent la cellule au travers des pores (sécrétine). Ce processus nécessite la
formation de pseudopilines formant une structure semblable à celle d’un pilus qui agit comme
un piston pour éjecter les protéines à l’extérieur de la cellule par la sécrétine.
Figure 9 : Modélisation du système de sécrétion de type II (Cianciotto, 2005). Les
substrats sont transloqués à travers la membrane interne via la protéine Sec (ou Tat). Une fois
dans le périplasme, ils sont reconnus par l’appareil de sécrétion de type II. Ensuite, l’énergie
générée au niveau de la membrane interne est utilisée pour générer un pilus capable de
s’étendre et de se rétracter. Ce pilus est formé par les protéines T2S G, H, I, J et K qui
agissent comme un piston pour pousser les substrats vers la membrane externe. Les protéines
T2S I, J et K forment la pointe du pseudopilus, la protéine T2S G constitue l’arbre, mais les
interactions avec la protéine T2S H sont encore inconnues. La protéine O de la membrane
interne clive et méthyle les pseudopilines avant leur intégration au système de sécrétion.
C–M: Protéines core constituant le système; D: Sécrétine Dodécamérique; G: Pseudopiline
majeure ; H–K: Pseudopilines mineures; O: Prépiline peptidase.
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C’est en 1998 que le système T2SS a été mis en évidence chez L. pneumophila (Liles et al.,
1998). Dans cette étude, ils ont identifié un opéron pilBCD , codant la pré-pseudopiline
peptidase T2S O (PilD) ainsi que les protéines PilB et PilC, spécifiquement dédiées à la
biogénèse de pilus de type IV (Liles et al., 1998). Une mutation du gène pilD réduit le taux de
protéines sécrétées dans le surnageant de culture. Des analyses génomiques ont révélé que les
gènes codant T2SS existent également chez d’autres espèces de Legionella (Rossier et al.,
2004). Le séquençage du génome de plusieurs souches a montré la présence de gènes codant
les systèmes Sec et Tat, importants pour la translocation de protéines à travers la membrane
interne vers le périplasme (Cazalet et al., 2004; Chien et al., 2004; Rossier et al., 2004). Un
grand nombre de mutants spécifiques de T2SS ont été construits et caractérisés. Tous les
mutants prolifèrent normalement dans un milieu BYE standard ainsi que sur gélose BCYE
(Rossier et al., 2004). Cependant, ces mutations modifient la capacité de L. pneumophila à
infecter les macrophages humains (Liles et al., 1999; Rossier et al., 2004). Face à ces
résultats, il a été établit que le système T2SS contrôle en partie l’infection des macrophages
ainsi que la survie de L. pneumophila dans les cellules hôtes. Ces deux caractéristiques font de
lui un important facteur de virulence.
La plupart des effecteurs sécrétés par T2SS ont été caractérisés comme étant des enzymes
(Banerji et al., 2005; Cianciotto, 2005; Rossier et al., 2004). Parmi elles, nous pouvons citer
LspDE, LspF, LspG, LspH ou encore PilD (Aragon et al., 2000; Aragon et al., 2002; Hales &
Shuman, 1999; Liles et al., 1999; Rossier et al., 2004). Ces protéines possèdent des activités
de phosphatases, de phospholipases A, de lypophospholipases A, de glycerophospholipide
cholesterol acyltransférases (GCAT), de lipases, de ribonucléases ou encore de protéases
(Aragon et al., 2000; Aragon et al., 2002; Banerji et al., 2005; Hales & Shuman, 1999; Liles
et al., 1999; Rossier et al., 2004). Parmi les protéines identifiées et caractérisées, nous
pouvons citer la phosphatase Map (Aragon et al., 2001), PlcA, une phospholipase C (Aragon
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et al., 2002), PlaA, une phospholipase A (Flieger et al., 2002), PlaC, une GCAT (Banerji et
al., 2005), les lipases LipA et LipB (Aragon et al., 2002), ainsi que ProA et Msp, des zinc
métalloprotéases (Hales & Shuman, 1999; Liles et al., 1999). Des mutants ont été construits
afin de savoir si ces effecteurs étaient impliqués dans le contrôle de l’infection. Aucune
modification phénotypique n’a pu être observée. En effet, la mutation d’un des gènes codant
un effecteur n’inhibe pas intégralement la fonction qui lui est associée. Ceci suggère une
redondance des effecteurs. Si une enzyme est inactivée, une autre est capable de compenser
son absence grâce à son activité similaire.
Le rôle du système de sécrétion de type II a également été évalué dans la formation, la
colonisation et la persistance de L. pneumophila dans les biofilms (Lucas et al., 2006).
Page 37
2.
Rôle du fer chez Legionella pneumophila
2.1. Rôle du fer chez les bactéries
Pour de nombreuses bactéries, le fer est un élément indispensable à leur survie (Ratledge &
Dover, 2000; Reeves et al., 1981; Schaible & Kaufmann, 2004; Weinberg, 1978). Il est
impliqué dans un grand nombre de réactions cellulaires, jouant le rôle de cofacteur dans des
réactions enzymatiques telles que la respiration, la réponse au stress oxydant, la réplication de
l’ADN... Dans la nature, le fer existe sous deux formes distinctes, le fer ferreux (Fe2+)
(Weinberg, 1978) et le fer ferrique (Fe3+) (Aisen, 1976a). A pH 7, Fe2+ est en solution et peut
être assimilé par les bactéries via des transporteurs de cations divalents. Cependant, sous cette
forme, Fe2+ est spontanément oxydé en Fe3+, suivant la réaction de Fenton (H2O2 + Fe2+ →
OH + OH- + Fe3+) (Imlay et al., 1988). Mais cette réaction induit la production de molécules
toxiques, les Reactive Oxygen Species (ROS). Ce sont des sous produits de la respiration
aérobique (Storz & Imlay, 1999), générés intracellulairement. Les principales molécules
connues sont les superoxydes (O2–), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et les radicaux
hydroxyles (OH). Les espèces H2O2 et O2– sont produits lors des réactions de respiration
cellulaire. Elles peuvent être dégradées par l’action d’enzymes telles que des superoxydes
dismutases ou des catalases. Au contraire, aucune réaction enzymatique n’existe pour
dégrader les radicaux hydroxyles, c’est pour cette raison qu’ils sont les plus dangereux et les
plus toxiques pour les bactéries. En effet, ces espèces sont capables d’endommager les
membranes lipidiques, les protéines ainsi que les molécules d’ADN (Imlay, 2003).
Dans l’environnement ou à l’intérieur de cellules hôtes, les ions Fe3+ sont capables de former
des complexes stables d’oxydes de fer hydratés ou de lier des protéines telles que les
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hémoprotéines, la ferritine, la transferrine ou encore la lactoferrine. Ces complexes limitent
ainsi la mobilité du fer (Raymond et al., 2003).
Chez les bactéries, l’homéostasie du fer implique la capture et l’utilisation des différentes
formes de fer. Différentes voies d’acquisition existent, qu’il soit sous la forme de fer ferreux
ou de fer ferrique. Les bactéries Gram négatif sont capables d’assimiler les ions Fe3+, grâce à
de petites molécules (<1kDa) qu’elles sécrètent, appelées sidérophores (Fig. 10).
Figure 10 : Représentation schématique du transport du fer ferrique chez les bactéries
Gram négatif, mettant en jeu des sidérophores (Wandersman & Delepelaire, 2004). Les
ions Fe3+ libres dans le milieu extracellulaire, sont chélatés par les sidérophores. Les
complexes Fe3+/sidérophores sont internalisés dans le périplasme via des récepteurs
membranaires. Ils traversent ensuite la membrane interne grâce à des protéines membranaires
de type ABC. Dans le cytoplasme, le fer ferrique est oxydé en fer ferreux, et il semblerait que
les sidérophores soient redirigés vers le milieu extracellulaire.
Ces chélateurs présentent une forte affinité pour les ions Fe3+. Lorsque le complexe fersidérophore est formé, il traverse la membrane externe, grâce à des protéines de transport.
Une fois dans l’espace périplasmique, le complexe se lie à une nouvelle protéine qui lui
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permet d’être internalisée. Les protéines de transport situées sur la membrane interne sont le
plus souvent des transporteurs de type ABC. Lorsque le complexe est finalement en
intracellulaire, le fer se libère du sidérophore. Pour cela, deux mécanismes sont possibles. Le
premier met en jeu des réductases, les ions Fe3+ sont réduits en Fe2+. Le second mécanisme
permet la libération du fer suite à une hydrolyse du complexe, faisant intervenir des enzymes
spécifiques.
Il existe aussi la voie d’acquisition des ions Fe2+ (Fig. 11). Le transport de ces ions est le plus
souvent retrouvé chez les bactéries qui se développent en présence de faibles concentrations
en oxygène, ou dans des environnements acides, ainsi, le fer ferreux reste stable. Son
acquisition est possible grâce aux protéines de transport FeoAB. Ce sont des protéines de la
membrane interne. FeoB est une perméase, ATP/GTP dépendante (Cartron et al., 2006).
Figure 11 : Représentation schématique du transport du fer ferreux par les protéines
Feo, chez E. coli (Cartron et al., 2006). Les ions Fe2+ diffusent dans le périplasme via un
système de pore membranaire. Il est ensuite transporté à travers la membrane cytoplasmique
par le transporteur FeoB. Ce transport est ATP/GTP dépendant. La protéine FeoA est
indispensable à l’activité de FeoB et semble être impliquée dans l’hydrolyse du GTP.
Page 40
Une autre voie de transport des ions Fe2+ fait intervenir les molécules d’hème. Ces molécules
chargées en fer sont reconnus spécifiquement par des récepteurs membranaires de type TonB.
Une fois dans l’espace périplasmique, le complexe se lie à un transporteur de la membrane
interne de type ABC. Une fois internalisé, le complexe se dissocie, l’hème est catabolisé et le
fer est libéré.
L’une des principales voies que les bactéries utilisent pour capter le fer met en jeu des
molécules capables de fixer le fer telles que la lactoferrine, la ferritine, l’hème. Cette voie
d’acquisition nécessite la présence de récepteurs spécifiques de ces molécules. Une fois fixé,
le fer peut être libéré en intracellulaire (Wandersman & Delepelaire, 2004). Il existe un point
commun entre la plupart des protéines impliquées dans le métabolisme du fer. Des données
génétiques ont permis d’identifier un répresseur transcriptionnel, la protéine Fur, identifiée
pour la première fois chez E. coli (Hickey & Cianciotto, 1994; Kammler et al., 1993). Dans
un milieu enrichit en fer, la protéine Fur capture les molécules de fer, plus précisément les
ions Fe2+, se dimérise et se fixe sur la séquence promotrice de certains gènes empêchant leur
transcription (Hickey & Cianciotto, 1994; Hickey & Cianciotto, 1997; Litwin & Calderwood,
1993) (Fig. 12). La région promotrice de Fur contient des séquences homologues au site de
liaison de la protéine suggérant que Fur est capable de s’autoréguler.
Figure 12: Représentation schématique de la régulation du fer par la protéine Fur, chez
E. coli (Litwin & Calderwood, 1993).
Page 41
Chez L. pneumophila , la quantité de fer requise pour sa croissance optimale doit être
supérieure à 20 µM (Johnson et al., 1991; Liles et al., 2000; Reeves et al., 1983). Lorsqu’elles
sont cultivées en milieu de culture, celui-ci est supplémenté en fer, le plus souvent ajouté sous
la forme de pyrophosphate de fer. L. pneumophila est capable de lier et d’utiliser l’hème
comme source de fer (O'Connell et al., 1996). Comme d’autres bactéries, elle utilise le fer
comme cofacteurs d’enzymes, telles que la superoxyde dismutase et l’aconitase (Mengaud &
Horwitz, 1993). Le fer est également un élément essentiel dans la pathogénèse (Cianciotto,
2001). En effet, l’infection des macrophages, ou autres cellules hôtes, est conditionnée par les
quantités de fer présentent dans l’environnement (Byrd & Horwitz, 2000; Viswanathan et al.,
2000).
2.2. Les sidérophores
2.2.1. Découverte des sidérophores
Des travaux menés en 1983 avaient suggéré que L. pneumophila ne produisait pas de
sidérophore (Reeves et al., 1983). Cette conclusion, basée sur le test d’Arnow et Csaky, ne
prenait pas en considération le fait que des structures hydroxamate et catécholate, capables de
chélater les ions métalliques, pouvaient exister (Fig. 13 A-C). Ce n’est que huit ans plus tard,
grâce à un autre test mis au point, que les sidérophores ont pu être mis en évidence. Ce test,
encore utilisé aujourd’hui, est connu sous le nom de test Chrome Azurol S (CAS), et permet
la détection des chélateurs de fer, soient des sidérophores non hydroxamate et non catécholate
(Goldoni et al., 1991). La réactivité au test CAS varie selon les conditions physiologiques
dans lesquelles se trouvent les bactéries. Le test CAS apparait positif lorsque L. pneumophila
est cultivée dans un milieu minimum carencé en fer, dans des conditions aérobies. A l’inverse,
Page 42
il n’y a pas de réactivité lorsque le milieu est enrichit en fer. Un surnageant positif au test
CAS suggère la présence de sidérophores. Il facilite ainsi la croissance des souches sauvages
de L. pneumophila sur un milieu BCYE supplémenté en chélateur d’ions Fe2+, le 2,2’
dipyridyl (DIP) (Allard et al., 2006). L’activité chélatante du surnageant de L. pneumophila
provient du sidérophore nommé légiobactine, spécifique de cette espèce (Liles et al., 2000).
C’est en 2009 que la légiobactine fût extraite et purifiée à partir d’un échantillon de
surnageant de culture (Allard et al., 2009).
Figure 13 : Structures chimiques de quelques chélateurs de fer. (A) Groupement
catécholate ; (B) Enterobactine, sidérophore produit par E. coli ; (C) Groupement
hydroxamate (Stintzi et al., 2000).
2.2.2. Production de la légiobactine
Des analyses génétiques ont été réalisées afin d’identifier le ou les gènes responsables de la
production de la légiobactine. Le premier gène qui a été identifié comme « promoteur » de sa
production est le gène frgA, pour « ferric regulated gene A » (Hickey & Cianciotto, 1997)
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(Fig. 14 A). FrgA est un homologue de plusieurs hydroxamates synthétases, incluant des
enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’aérobactine, sidérophore spécifique des bactéries
E. coli et Shigella , l’alcaligin chez Bordetella … (Hickey & Cianciotto, 1997). Cependant, la
mutation du gène frgA présente une réactivité positive au test CAS, de la même façon que la
souche sauvage (Liles et al., 2000).
Figure 14 : Schéma récapitulatif des différentes voies métaboliques impliquées dans
l’acquisition du fer chez L. pneumophila . (A) FrgA est une protéine intracellulaire,
impliquée dans la synthèse de sidérophore ; (B) Voie d’acquisition du fer ferrique, mettant en
jeu les protéines LbtA/B/C/U ; (C) Voie d’acquisition du fer ferreux impliquant les protéines
FeoA/B ; (D) Le transporteur intra-membranaire IraB est responsable du transport de peptides
chargés en fer, à travers la membrane interne de L. pneumophila.
Un autre gène exprimé par le genre Legionella et responsable de la production de
légiobactine, fût mis en évidence en 2005. Ce gène, nommé lbtA, pour « legiobactin gene A »
Page 44
code une protéine homologue à des hydroxamates synthétases. Après avoir été cultivées dans
un milieu minimum, carencé en fer, la réactivité du surnageant de culture de la souche mutée
sur lbtA, présente une baisse de 50% comparée à la souche sauvage. Ce résultat sous entend
que la quantité de légiobactine produite est diminuée sous l’effet de la mutation du gène, d’où
son importance dans la production de la légiobactine (Allard et al., 2006). Le gène lbtA
appartient à un opéron sur lequel est également retrouvé le gène lbtB. Ce dernier est aussi
impliqué dans l’expression de sidérophores. Le gène lbtA a un rôle dans la biosynthèse de la
légiobactine, tandis que lbtB est plutôt responsable de l’export du sidérophore (Allard et al.,
2006). En effet, LbtB appartient à la famille des protéines transmembranaires associées à
l’export de petites molécules telles que les sidérophores. En amont de la séquence du gène
lbtA, une boîte Fur est présente suggérant que l’expression de ces gènes est contrôlée par le
fer. Plus récemment, d’autres gènes ont été identifiés et caractérisés. Il s’agit des gènes lbtU et
lbtC (Chatfield et al., 2011; Chatfield et al., 2012). Ils appartiennent au même opéron que
lbtA et lbtB. En 2011, une analyse de la séquence d’ADN a révélé la présence d’un gène,
réprimé en présence de fer, lbtU. Il se situe en amont des gènes lbtA et lbtB. Des études in
silico, ont permis de désigner la protéine LbtU comme une protéine de la membrane externe,
constituée par de nombreux domaines transmembranaires et extracellulaires, ainsi qu’une
petite extrémité périplasmique. Comme le gène lbtA, lbtU est important pour la croissance en
milieu carencé en fer. L’ensemble des résultats montrent que LbtU est impliquée dans
l’assimilation de la légiobactine et du fait de sa localisation, elle joue probablement le rôle de
récepteur des ferrisidérophores spécifiques de L. pneumophila (Chatfield et al., 2011). C’est
ensuite en 2012, que d’autres analyses ont mis en évidence un quatrième gène, lbtC , présent
sur le même opéron. Comme les autres, lbtC est contrôlé par le fer, et se situe en aval des
gènes lbtA/B/U. Après des études in silico, il semble que la protéine LbtC soit une protéine de
la membrane interne des bactéries, et qu’elle appartiendrait à la famille des Major Facilitator
Page 45
Supermily (MFS) qui est l’une des principales familles de protéines de transport. LbtC est
impliquée dans l’assimilation de la légiobactine, et de par sa localisation, il est très probable
que cette protéine permette le transport du complexe Fe3+/légiobactine à travers la membrane
interne de L. pneumophila (Fig. 14 B) (Chatfield et al., 2012).
Grâce à ces dernières découvertes, le transport des sidérophores et du fer apparait plus clair.
Cependant, d’autres questions restent en suspens comme le mode d’interaction entre les
protéines LbtU et LbtC avec les complexes Fe3+/légiobactine, facilitant leur transport au
travers de l’enveloppe cellulaire.
2.2.3. Le rôle des sidérophores dans l’infection
Afin d’identifier le rôle de LbtA dans l’infection cellulaire, des mutants de ce gène ont été
créés et ont permis de constater que l’expression de lbtA n’est pas indispensable à la
croissance intracellulaire de L. pneumophila (Allard et al., 2006). Chez ces mutants, l’absence
de la légiobactine est compensée par une autre voie métabolique mettant en jeu un autre
sidérophore. A l’inverse, chez des mutants du gène frgA, la croissance intracellulaire est
inhibée (Hickey & Cianciotto, 1997). Ces résultats suggèrent la possibilité que L.
pneumophila code un sidérophore qui, contrairement à la légiobactine, est nécessaire pour une
croissance intracellulaire optimale.
2.3. Le transport du fer ferreux
Le fer ferreux constitue la forme prédominante de fer dans les cellules eucaryotes (Breuer et
al., 1995; Epsztejn et al., 1997). Lorsque L. pneumophila infecte des cellules, le fer est donc
disponible, elle peut ainsi l’utiliser pour proliférer. Afin de déterminer le rôle du transport des
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ions Fe2+ chez L. pneumophila lors de la pathogénèse, des analyses génétiques ont été
réalisées et le gène feoB a été isolé, identifié puis muté (Robey & Cianciotto, 2002). Les
séquences des protéines FeoB de L. pneumophila et de E. coli, ont été comparées. Elles sont
identiques à 44% et présentent 61% de similarités.
FeoB possède dix domaines transmembranaires, et est localisée sur la membrane interne. La
région promotrice du gène comporte un site de liaison pour la protéine Fur, suggérant que
l’expression du gène est régulée par le fer. La mutation de ce gène entraine une baisse de
l’acquisition du Fe2+ tandis que celle du Fe3+ est inchangée (Robey & Cianciotto, 2002). La
croissance de L. pneumophila dans un milieu de culture standard n’est pas altérée par la
mutation du gène feoB. Cependant, dans un milieu carencé en fer, la protéine est
indispensable à sa prolifération (Robey & Cianciotto, 2002). Sur milieu gélosé carencé en fer,
la croissance du mutant ΔfeoB est restaurée s’il y a un apport en Fe3+. A l’inverse, aucune
croissance n’est observable en présence de Fe2+. Il y a également prolifération, lorsque les
mutants sont mis en contact avec du surnageant de culture riche en sidérophores. L’ensemble
de ces données indiquent donc que la protéine FeoB et le transport du Fe2+ sont indispensables
à la croissance de L. pneumophila , dans des conditions où le milieu est carencé en fer. Même
si, en condition aérobie le Fe3+ prédomine, Fe2+ est tout de même présent dans les cultures.
FeoB est responsable du transport du Fe2+ généré dans le périplasme suite à la réduction des
ions Fe3+ par des ferriques réductases. Le rôle de FeoB dans la croissance intracellulaire a été
mis en évidence chez les amibes et les macrophages infectés par L. pneumophila (Robey &
Cianciotto, 2002). FeoB n’est pas indispensable ni à la croissance ni à la survie des bactéries
dans les amibes. Cependant, ces tests ont été répétés dans des conditions où le milieu de coculture était carencé en fer, par l’ajout de DIP, chélateur des ions Fe2+. Les résultats ont
indiqué que la protéine FeoB est nécessaire pour la croissance et la survie du pathogène à
l’intérieur des amibes. Dans les macrophages (lignée U937) la mutation du gène feoB à un
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impact direct sur la croissance et la survie de L. pneumophila . Afin de faire la corrélation
entre le niveau en fer dans les macrophages et l’arrêt de la croissance du mutant ΔfeoB, le test
a été réalisé dans des conditions où le milieu était carencé en fer. Le mutant ΔfeoB est
hypersensible à la déplétion en fer. Ceci suggère donc l’importance du transport de Fe2+ pour
ces microorganismes, notamment dans la réplication intracellulaire (Fig. 14 C).
2.4. Autres voies d’acquisition/assimilation du fer
2.4.1. Voie codée par les gènes iraA et iraB
En 1996, des études ont permis d’identifier le locus iraAB (iron acquisition/assimilation) chez
L. pneumophila (Pope et al., 1996; Viswanathan et al., 2000). Des mutations sur le gène iraA
entrainent un ralentissement de la croissance intracellulaire des bactéries ainsi qu’une baisse
du taux d’infection et de prolifération dans les macrophages infectés. Cette diminution de la
croissance intracellulaire est exacerbée lorsque les co-cultures sont réalisées dans du milieu
carencé en fer par l’ajout de chélateurs de fer ferrique, tel que la déféroxamine mésylate
(DFX). Ces observations ont permis de confirmer que la mutation du gène iraA altère
l’assimilation du fer en intracellulaire (Pope et al., 1996; Viswanathan et al., 2000). Il code
une protéine de 272 acides aminés. Elle présente des similarités avec des méthyltransférases
qui utilisent la S-adénosylméthionine. Le gène iraB code une protéine de 501 acides aminés.
Elle est similaire aux protéines appartenant à la famille de PTR2 (transporteur peptidase) et à
des transporteurs di- ou tri-peptides. IraB est considérée comme une protéine de la membrane
interne, et possède 12 domaines membranaires. Après avoir réalisé des études sur des mutants
de ce gène, les résultats ont permis de conclure sur l’importance de la protéine pour la
croissance de L. pneumophila dans un milieu carencé en fer.
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Pour résumer, l’expression de iraA est nécessaire pour la croissance intracellulaire, mais son
rôle précis n’a pas encore été déterminé, tout comme sa place dans la voie
d’assimilation/acquisition du fer. A l’inverse, l’expression de iraB est importante pour la
croissance du pathogène dans des conditions de carences en fer. IraB peut être impliquée dans
une nouvelle voie de transport du fer, par l’import de peptides chargés de molécules de fer.
Ceux-ci seraient alors utilisés comme sources de fer (Fig. 14 D).
2.4.2. Voie impliquant la maturation du cytochrome C
L’étude du métabolisme du fer a également permis de mettre en évidence le rôle des gènes,
appartenant au locus ccm (cytochrome c maturation). Chez L. pneumophila , et d’autres
espèces bactériennes, le locus ccm est constitué par 8 gènes, allant de ccmA à ccmH. Ils
codent un système multiprotéique capable de transporter l’hème à travers la membrane interne
qui se lie ensuite aux apocytochromes présents dans le périplasme. Ceci constitue la dernière
étape de maturation des cytochromes C (Cianciotto et al., 2005; Kranz et al., 2009; Sanders
et al., 2010) (Fig. 15).
Chez L. pneumophila, la mutation des gènes ccm entraine une baisse de la croissance lors
d’une carence en fer. La première observation fût faite après mutation du gène ccmC. En
effet, la croissance de ce mutant sur milieu gélosé carencé en fer était altérée. Ceci a ensuite
été montré pour les mutants ΔccmB et ΔccmF (Naylor & Cianciotto, 2004). La croissance
intracellulaire de ces trois mutants est également sévèrement modifiée, à la fois dans les
macrophages, mais aussi chez les amibes Hartmanella vermiformis (Naylor & Cianciotto,
2004; Polesky et al., 2001; Viswanathan et al., 2002). Cet impact sur la prolifération
intracellulaire est exacerbé lorsque les cellules hôtes sont débarrassées de leur réserve de fer
par traitement au chélateur tel que le DFX (Viswanathan et al., 2002). Ces données permettent
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donc de conclure sur l’importance des protéines Ccm dans l’acquisition et l’assimilation du
fer en intra et extracellulaire. Des études plus récentes ont également montré le lien entre les
protéines Ccm et l’expression de la légiobactine. Une seule mutation sur l’un des huit gènes
inhibe la production du sidérophore (Yip et al., 2011). Des travaux ont aussi portés sur les
cytochromes de type C issus de la maturation. Il s’avère que l’un de ces cytochromes, le
cytochrome c4, détient un rôle important dans la production de la légiobactine, ainsi que dans
la croissance intracellulaire et donc la virulence de L. pneumophila (Yip et al., 2011).
Figure 15 : Représentation du système multiprotéique codé par l’opéron ccm et impliqué
dans la maturation des cytochromes de type C (Cianciotto et al., 2005).
2.4.3. Rôle de la pyomélanine dans l’acquisition du fer
Lorsque la croissance de L. pneumophila atteint la fin de la phase exponentielle, le pathogène
produit un pigment brun qu’il libère dans son surnageant de culture (Orrison et al., 1981). Les
molécules responsables de cette coloration ont été mises en évidence. Il s’agit de l’acide
homogentisique (HGA) et l’HGA-mélanine (Steinert et al., 2001). Ces deux molécules sont
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sécrétées par le pathogène et leur rôle dans le métabolisme du fer a aussi été mis en évidence
(Zheng et al., 2013). En effet, elles sont capables de réduire les ions Fe3+ en Fe2+, la forme
assimilable par L. pneumophila via la protéine FeoB (Chatfield & Cianciotto, 2007). De plus,
des quantités significatives de Fe3+ et de Fe2+, sont associées à la sécrétion d’HGA et d’HGAmélanine. Lorsque le milieu de culture commence à s’appauvrir, ou que les bactéries sont
cultivées dans un milieu carencé en fer, les deux molécules stimulent la croissance
bactérienne. Enfin, la comparaison entre les niveaux d’HGA et d’HGA-mélanine sont
inversement liés au niveau d’activité des sidérophores (Chatfield & Cianciotto, 2007). Une
nouvelle voie d’acquisition du fer a donc été mise en évidence. Elle met en jeu des réactions
de réduction de Fe3+ en Fe2+ par HGA et HGA-mélanine, les ions Fe2+ sont ensuite utilisés
pour activer la voie d’acquisition incluant les protéines FeoAB (Zheng et al., 2013).
2.5. Relation entre le fer et la virulence
Plusieurs études s’accordent pour dire que le fer est un nutriment indispensable à la croissance
de L. pneumophila. Pour une croissance optimale, la concentration en fer exigée par ces
bactéries doit être comprise entre 3 µM et 20 µM. Dans le cas d’une carence en fer, la
concentration en fer est considérée comme étant inférieure à 3 µM. Des modifications
morphologiques sont observables dès lors que la disponibilité en fer diminue. En effet, les
bactéries adoptent une forme plus raccourcie, alors que dans les conditions de culture
standard, elles ont une forme de bacille, plus filamenteuse (James et al., 1995) (Fig 16).
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Figure 16 : Image de microscopie à contraste de L. pneumophila cultivée en présence ou
non de fer. (a) Dans un milieu de culture enrichit en fer, les bactéries sont plus ou moins
filamenteuses. (b) Dans un milieu de culture carencé en fer, les bactéries ont une forme
raccourcie (James et al., 1995).
Outre une réponse morphologique et physiologique, la carence en fer semble avoir un effet
sur la virulence de L. pneumophila . Il a été montré que leur culture dans un milieu pauvre en
fer sont moins virulentes que celles cultivées dans un milieu de culture standard supplémenté
en fer (James et al., 1997). Pour compléter ces observations, des tests d’infection ont été
réalisées sur des macrophages. L. pneumophila cultivées dans un milieu pauvre en fer, donc
théoriquement avirulentes, présentent une capacité à infecter nettement plus faible que des
pathogènes virulents cultivés en présence de fer. Néanmoins, une fois phagocytées et
internalisées, L. pneumophila avirulente ne perd pas sa capacité à détourner la machinerie
cellulaire de son hôte, ni son efficacité de prolifération.
La croissance intracellulaire est dépendante du fer disponible à l’intérieur de la cellule hôte,
et elle peut être inhibée par l’ajout de chélateurs de fer. Pour résumer, le fer à un rôle
important aux niveaux morphologique, physiologique, mais surtout au niveau de la virulence
de L. pneumophila . De nombreuses théories impliquent aussi de multiples facteurs
environnementaux participant à la régulation des différents processus biologiques.
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3. Legionella pneumophila et les biofilms
3.1. Généralités sur les biofilms
3.1.1. Définition
Les biofilms sont définis comme un assemblage de microorganismes (principalement des
bactéries mais aussi des algues, des protozoaires,…) fixés à une surface (Costerton et al.,
1995). Les microorganismes se fixent préférentiellement sur une surface ou une interface
riche en nutriments qui leur procurent les besoins nécessaires à la croissance et à la survie du
biofilm. Dans cette structure, les microorganismes sont enchâssés dans une matrice constituée
d’exopolymères comme des polysaccharides (Marshall et al., 1989), mais d’autres composés
organiques (proteines, lipides, ADN...) et des composants inorganiques (oxydes, carbonates,
particules d’argiles, particules issues de la corrosion…) s’y ajoutent. La présence ainsi que la
nature de ces différents composants dépendent de l’environnement dans lequel se forme le
biofilm. C’est un système biologique très complexe et dynamique et ce mode de persistance
représente la forme d’existence microbienne la plus répandue dans la nature (Remis et al.,
2010).
De nombreux types de surface peuvent être colonisés. Il peut s’agir de tissus vivants, de
débris végétaux, de roches, des canalisations de systèmes d’adduction d’eaux potables et de
rejets industrielles, des dispositifs médicaux implantés, ou n’importe quelle surface en contact
avec l’eau (Fig. 17).
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Figure 17 : Image de microscopie électronique de biofilms formés sur une surface en
acier dans un système d’eau industrielle (A) (échelle 10 µm) et sur un dispositif médical
implanté (B) (échelle 20 µm) (Donlan, 2002; Donlan & Costerton, 2002).
3.1.2. Structures
Les biofilms peuvent adopter des formes variables, en fonction des microorganismes, du
milieu et des conditions de flux existantes dans le milieu. Ils sont essentiellement constitués
de microorganismes qui produisent une matrice principalement composée par des substances
polymériques extracellulaires (SPE) (Allison et al., 1998).
Ces dernières représenteraient 50% à 90% de la quantité totale en carbone organique du
biofilm (Flemming & Wingender, 2010; Sutherland, 2001a). Les SPE peuvent varier au
niveau de leur composition chimique et de leurs propriétés physiques. Le principal élément
constituant ces SPE correspondent aux polysaccharides. La plupart sont neutres ou
polyanioniques comme c’est le cas chez les bactéries Gram négatif. La présence d’acide
uronique et de pyruvate leurs confèrent notamment des propriétés anioniques (Sutherland,
2001a; Sutherland, 2001b). Cette dernière propriété est importante car elle permet
l’association de cations divalents tels que le calcium et le magnésium, à des polymères,
procurant ainsi de meilleures forces de liaisons dans le développement d’un biofilm
(Flemming & Wingender, 2010).
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Chez les bactéries Gram positif, la composition chimique des SPE peut être très différente, et
principalement cationique (Hussain et al., 1993). Les SPE présentent aussi un taux
d’hydratation très élevé, car elles peuvent incorporer de grande quantité de molécules d’eau à
l’intérieur de leurs structures par la formation de liaisons hydrogène. Ces substances
possèdent néanmoins deux propriétés fondamentales : i) leur composition n’est généralement
pas uniforme et peut être modifiée suivant l’environnement et le stade d’existence du biofilm ;
ii) leur production est également modulée par ces mêmes facteurs et dépend aussi du modèle
bactérien étudié. Leur production peut être affectée par la présence de nutriments dans le
milieu de culture. Par exemple, l’excès de carbone, les faibles concentrations en nitrate,
potassium et phosphate induisent la production des SPE.
Les SPE ont aussi la capacité de s’associer aux cations divalents et à d’autres macromolécules
telles que les protéines, les molécules d’ADN, les lipides, les substances humiques (Flemming
& Wingender, 2010).
Figure 18 : Observation au microscope à épifluorescence d’un biofilm complexe
développé sur une surface en acier dans un réacteur d’eau potable (Donlan, 2002). Les
microorganismes sont enchâssés dans la matrice, les zones plus sombres représentent les
canaux dans lesquels circulent l’eau chargée en nutriments, en oxygène ou en molécules
antibactériennes.
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Chaque biofilm est unique, de par sa composition chimique et biologique, sa structure, sa
dynamique (Tolker-Nielsen & Molin, 2000). Cependant les mêmes types d’éléments
(bactéries, SPE, composés organiques, minéraux, cations) restent communs à l’ensemble de
ces structures complexes. La structure des différents biofilms présente des points
d’organisation similaires. Les biofilms ne sont pas de simples couches déposées sur des
surfaces. En effet ils sont décrits comme des structures très hétérogènes composées par des
micro-colonies de bactéries enchâssées dans la matrice et séparées des autres colonies par des
canaux (Yang et al., 2000) (Fig. 18).
Dans ces canaux circulent de l’eau chargée en nutriments, en oxygène, ou encore en
molécules antibactériennes (Sandt et al., 2007). Ce modèle d’hétérogénéité est décrit non
seulement pour les biofilms naturels, formés dans l’environnement, mais aussi dans le cas de
biofilms formés en milieux hospitaliers, sur des dispositifs médicaux ou encore liés à des
maladies infectieuses. Les microorganismes constituant les biofilms, donnent leur forme à ces
structures. L’épaisseur du biofilm est également fonction du type et du nombre de
microorganismes qui le colonise (Stoodley et al., 2002b). L’architecture du biofilm évolue
également dans le temps et l’espace. Beaucoup de paramètres entrent en jeu, à la fois des
facteurs environnementaux, mais aussi des paramètres biologiques internes aux biofilms
(Tolker-Nielsen & Molin, 2000).
3.1.3. Formation d’un biofilms
La formation d’un biofilm simple se déroule en cinq étapes (Fig. 19). La première est l’étape
d’adhésion des cellules qualifiées de colonisateurs primaires (Taylor et al., 2009). Les
bactéries initialement planctoniques se différencient en bactéries sessiles (attachées au
support). Ceci implique de nombreux changements morphologiques, physiologiques et
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génétiques. Elles développent, en effet, des fimbriae et des pili afin de faciliter leur fixation au
substrat (Fig. 19-1). Chez P. aeruginosa, le pili de type IV lui permet de se déplacer, grâce à
ces capacités à s’étendre et à se rétracter (Stoodley et al., 2002a).
Dans un second temps, il y a l’étape de colonisation, qui correspond à une prolifération des
cellules adhérées et à la production de matrice qui rend leur fixation au support très stable
(Mayer et al., 1999) (Fig. 19-2, 3). Une fois que cette première couche est mise en place,
d’autres microorganismes peuvent venir s’y fixer, ils sont appelés colonisateurs secondaires
(Watnick & Kolter, 2000). Puis le biofilm se développe d’un point de vue architectural, les
microorganismes prolifèrent, et produisent d’avantage de matrice. La maturation du biofilm
conduit à une structure dont l’architecture devient complexe (Fig. 19-4), il y a formation de
canaux, de pores, et il y a redistribution des bactéries un peu plus éloignées du substrat
(Davies et al., 1998). Une analyse protéomique réalisée sur des biofilms de P. aeruginosa
(Sauer et al., 2002) a permis de comparer le profil protéique de bactéries sessiles et
planctoniques. Une différence de 300 protéines a été détectée, toutes exprimées chez les
bactéries sessiles, mais pas chez les bactéries planctoniques. Les protéines ont été identifiées
et classées en cinq catégories : les protéines impliquées dans le métabolisme, les
phospholipides et les lipopolysaccharides, les protéines de transport et de sécrétion
membranaire, les protéines ayant un rôle dans les processus d’adaptation, et celles impliquées
dans les mécanismes de protection. La dernière étape après la maturation du biofilm, est la
dispersion (Fig. 19-5). Des bactéries ou des fragments de biofilms peuvent être libérés dans
l’environnement. Plusieurs explications peuvent justifier ce phénomène. Chez P. aeruginosa à
l’état de biofilm, une enzyme est produite, l’alginate lyase. Un arrêt de la production de cette
protéine entraîne le décrochage rapide de portion de biofilm (Boyd & Chakrabarty, 1994).
Chez P. fluorescence à l’état de biofilm, le décrochage de fragments de biofilms est causé par
une baisse de la quantité de SPE (Allison et al., 1998).
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Figure 19 : Développement d’un biofilm en cinq étapes (Bjarnsholt et al., 2013). Les
cellules se déposent sur la surface (1) et adhèrent de manière « irréversible » (2). Les cellules
s’enchâssent dans une matrice d’exopolymères qu’elles produisent (3) puis le biofilm se
développe (4). Le biofilm mature libère des cellules suivant deux mécanismes mis en
évidence. Les bactéries sessiles sont libérées suite à une hydrolyse locale de la matrice, ou
suite à des forces physiques responsables de la libération de fragments de biofilms. Ainsi
libérées, les bactéries retrouvent leur état planctonique et sont capables de coloniser de
nouvelles surfaces (5).
Le phénomène de quorum sensing (QS) peut aussi être à l’origine du détachement des
fragments de biofilms. C’est un système de communication utilisé par les bactéries, qui leur
confère la capacité d’estimer la densité de la population en mesurant l’accumulation de
molécules signales spécifiques sécrétées par l’ensemble de la communauté microbienne.
Lorsque la densité de la population est élevée, l’accumulation des signaux libérés dans le
milieu extracellulaire est suffisante pour activer une réponse. Parmi les signaux, nous pouvons
citer les composés chimiques appartenant à la famille des homosérines lacones (AHL), le
furanosyl borate diester (AI2), les acides gras insaturés et les peptides. Une corrélation a été
établit entre le détachement de portion de biofilm et l’induction du QS. Ces deux phénomènes
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sont déclenchés lorsque, dans la plupart des cas, les nutriments ou d’autres sources d’énergie
sont épuisés ou lorsque les déchets s’accumulent (Bjarnsholt et al., 2013).
Des forces mécaniques peuvent aussi être responsables de la libération des fragments de
biofilms et de cellules dans l’environnement qui reviennent à un état planctonique (Costerton
et al., 1999).
Une fois libérées du biofilms, les bactéries sont à nouveau capables de coloniser d’autres
surfaces, et d’établir à nouveau des biofilms (Stoodley et al., 2002a).
3.1.4. Biofilms multi-espèces
Dans l’environnement, les biofilms sont essentiellement multi-espèces, c’est-à-dire qu’ils sont
formés par un consortium d’espèces bactériennes, capables d’interagir ensemble de manières
synergique ou antagoniste. A l’inverse, les biofilms implantés sur les dispositifs médicaux par
exemple, sont, dans la majorité des cas, constitués par une seule espèce bactérienne, piégée
dans une matrice composée de SPE (Allison et al., 1998; Donlan, 2002). Bien que les biofilms
soient très étudiés, très peu d’études ont été réalisées sur les biofilms complexes.
Lors de leur formation, une compétition se met en place entre les différentes espèces,
favorisant ou non la présence de certaines d’entre elles. Les bactéries interagissent alors entre
elles et finissent par former des agrégats (Sharma et al., 2005; Yamada et al., 2005). Ainsi
rassemblées, elles se protègent mutuellement contre les stress environnementaux, ou la
présence de composés toxiques comme les traitements antibactériens, les métaux…(Leriche et
al., 2003).
Les bactéries apparaissent aussi plus résistantes aux stress chimiques, comme par exemple
certains antibiotiques, le peroxyde d’hydrogène, le SDS (Lee et al., 2014) ou encore les
traitements de désinfection au chlore (Schwering et al., 2013). La matrice de SPE baignant
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autour des bactéries assure également une protection physique vis-à-vis des changements des
conditions du milieu.
Les formations de microcolonies donnent également lieu à des brassages génétiques par
transfert horizontal de gènes (Ghigo, 2001; Madsen et al., 2012). L’étude de ces transferts de
gènes est complexe (Madsen et al., 2012) car les conséquences sont variables pour le biofilm.
Dans certains cas les échanges induisent la formation des biofilms, tandis que dans d’autres
études, ils auraient tendance à inhiber leur développement. Ceci provient des propriétés
génétiques des plasmides transférés, et de l’hôte qui reçoit les plasmides (Krol et al., 2013;
Roder et al., 2013). Les brassages génétiques peuvent devenir problématiques pour la santé
humaine (Burmolle et al., 2008). En effet, les biofilms multi-espèces favorisent les
changements phénotypiques. Des souches bactériennes, initialement incapables de recevoir
des plasmides, acquièrent cette capacité dès lors qu’elles sont implantées dans un biofilm
multi-espèces (de la Cruz-Perera et al., 2013). Les molécules d’ADN extracellulaires,
présentent dans la matrice du biofilm, sont également une source importante de matériel
génétique, qui peuvent potentiellement être intégrées par les bactéries du biofilm (Hannan et
al., 2010).
Le QS semble également jouer un rôle important dans le développement de la structure et
dans la maturation de biofilms multi-espèces (Bigot et al., 2013; Kolenbrander et al., 2010;
Saito et al., 2008). Il est important pour les interactions inter-espèces, incluant la
communication et la coordination entre les bactéries du biofilm. La faible proximité entre les
cellules et la structure du biofilms favorisent le QS (Parsek & Greenberg, 2005).
D’autres types d’interactions ont été mis en évidence comme affectant les fonctions et les
structures des biofilms multi-espèces : le co-métabolisme et la synthrophie. Ceci se traduit par
le fait que deux bactéries ont la capacité de se développer uniquement lorsqu’elles sont
associées l’une à l’autre (Hansen et al., 2007). Il a été montré que des cellules bactériennes de
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la même espèce peuvent coopérer pour augmenter leur forme invasive (Griffin et al., 2004).
La coopération entre les cellules reste difficile à expliquer notamment lorsqu’il y a des
compétitions pour les nutriments (Foster & Bell, 2012; Mitri et al., 2011).
3.1.5. Résistance aux traitements antibactériens
Les cellules à l’état de biofilms sont physiologiquement et phénotypiquement différentes des
cellules planctoniques. L’une des principales caractéristiques de ces bactéries sessiles, dans
les biofilms matures, est leur résistance aux agents antibactériens, plus importantes comparé
aux cellules planctoniques (Stewart & Costerton, 2001). La présence de biofilms est souvent
la raison pour laquelle un traitement antibactérien échoue. Plusieurs mécanismes sont
impliqués dans la tolérance aux agents antibactériens : 1) la structure du biofilm peut
empêcher la pénétration des molécules à l’intérieur de ces structures ; 2) la présence de
traitements peut modifier le micro-environnement à l’intérieur du biofilm, induire un stress et
favoriser la présence d’une population extrêmement tolérante appelée « persisters » (Lewis,
2010). Ces cellules peuvent tolérer et survivre à certains agents antibactériens (Stewart &
Costerton, 2001). De plus, à l’intérieur des biofilms, le taux de transfert horizontal des gènes
est plus élevé qu’entre les cellules planctoniques (Madsen et al., 2012). Ainsi, les transferts de
gènes de résistance aux antibiotiques ont été observés dans les biofilms de divers organismes
comme S. aureus (Savage et al., 2013).
L’ajout d’agents antibactériens, à des doses létales, induit des changements biochimiques au
sein du biofilm, créant un environnement favorable à la production de ROS. Ces espèces
chimiques stimulent des réactions en chaînes, aboutissant à la formation de radicaux
hydroxyle capables d’endommager les macromolécules et conduire à la mort cellulaire
(Dwyer et al., 2009; Kohanski et al., 2007). Cependant, elle n’est induite que dans certaines
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conditions de culture et diffèrente selon les microorganismes constituant le biofilm. Les
microorganismes développent ce mécanisme de résistance au stress oxydant afin de diminuer
l’activité des agents antibactériens et permettre ainsi la survie des biofilms (Van Acker et al.,
2014). Ce mécanisme de résistance est également différent entre les bactéries sessiles et
planctoniques.
Au sein des biofilms, les pompes à efflux ont aussi été mises en évidence dans la résistance
aux agents antibactériens. L’efflux des drogues est un mécanisme clé dans la résistance aux
antibactériens des bactéries Gram négatif. De nombreuses études ont été réalisées sur ces
bactéries, notamment chez P. aeruginosa (Gillis et al., 2005), Burkholderia cenocepacia
(Rushton et al., 2013) et chez certains champignons comme Candida albicans (Taff et al.,
2013). Les travaux réalisés sur C. albicans ont montré une corrélation entre les traitements
antibactériens appliqués, et l’induction de l’expression des systèmes de pompes à efflux pour
la survie des biofilms (Soto, 2013). Ces systèmes pompent les solutés à l’extérieur des
cellules et permettent ainsi de réguler l’environnement interne des microorganismes, en
éliminant les substances toxiques comme les agents antibactériens, les métabolites, les
molécules signales du QS (Pearson et al., 1999). Les pompes existent à la fois chez les
cellules sessiles mais aussi chez les cellules planctoniques.
Il est aussi avéré que la structure du biofilm peut empêcher la pénétration des molécules à
l’intérieur de ces structures. Les SPE sont notamment reconnues comme étant une barrière
aux traitements. La pénétration se fait de manière progressive, et du fait de la structure du
biofilm, les molécules n’ont pas accès à toutes les cellules (Stewart, 1996; Stewart et al.,
1996). Des analyses physicochimiques ont démontré que le retard de pénétration est lié à la
nature de l’agent antibactérien, et/ou à la structure du biofilm (Stewart, 1996; Stewart, 2003).
La présence des canaux, au contraire, faciliterait la diffusion des molécules au cœur des
biofilms (Jefferson et al., 2005). Mais leur action reste très localisée, affectant essentiellement
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les cellules proches de la source d’antibactériens, les plus éloignées sont protégés par les SPE
qui bloquent leur diffusion (Stewart, 2003). Il leur est aussi difficile de pénétrer à l’intérieur
de microcolonies.
3.2. Interaction de L. pneumophila avec les biofilms
3.2.1. Les biofilms : une niche écologique pour L. pneumophila
Précédemment, nous avons précisé que la croissance de L. pneumophila est conditionnée par
la présence, dans son milieu de culture, de nutriments, incluant le fer ainsi qu’un certain
nombre d’acides aminés, en particulier la L-cystéine (Edelstein, 1982). L. pneumophila est
très souvent retrouvée dans les environnements aquatiques oligotrophes, où les concentrations
en nutriments sont relativement faibles. Ceci suggère que les quantités d’acides aminés et de
matières organiques suffisent pour procurer au pathogène l’énergie dont il a besoin pour
survivre et s’implanter dans les biofilms et/ou que ces besoins peuvent être rencontrés dans
des micro-environnements. L. pneumophila est capable de former des biofilms mono-espèces
uniquement lorsque les conditions de culture sont contrôlées (Mampel et al., 2006;
Pecastaings et al., 2010; Piao et al., 2006). Jamais de biofilms mono-espèces de L.
pneumophila n’ont été retrouvés dans la nature (Mampel et al., 2006; Piao et al., 2006).
L. pneumophila est capable de former des biofilms sur plusieurs types de surface comme le
verre, le polystyrène, le polypropylène, dans des conditions statiques, mais également lorsque
la surface est soumise à un flux. Les biofilms formés en conditions statiques montrent une
plus grande fragilité de leur structure, comparée à des biofilms formés en flux qui présentent
une résistance bien plus importante (Mampel et al., 2006). La température de formation peut
être variable, 25 °C, 37 °C ou encore 42 °C, contrôlant l’épaisseur et la structure du biofilm.
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A 25 °C, les biofilms sont principalement colonisés par des bactéries flagellées, et ont un
aspect filamenteux parcouru de canaux aqueux. A 37 °C ou 42 °C, les structures sont plus
complexes, plus épaisses du fait d’une augmentation de la densité cellulaire et L. pneumophila
présente une forme filamenteuse.
Considérant toutes ces observations, et en tenant compte des besoins nutritionnels de L.
pneumophila, il n’est pas très étonnant que ces bactéries ne soient pas les colonisateurs
primaires d’un biofilm (Taylor et al., 2009). Elles ont besoin de s’associer, de manière
transitoire à d’autres microorganismes déjà fixés à la surface et qui ont déjà initié la formation
d’un biofilm, on les retrouvera donc dans des biofilms complexes (Watnick & Kolter, 2000).
Le concept désignant une espèce bactérienne comme colonisateur primaire induisant
l’adhésion puis la formation de biofilms avec d’autres espèces a été démontré pour P.
aeruginosa . En effet cette espèce contrôle et induit la formation de biofilm de E. coli
O157 :H7. L. pneumophila est capable de s’associer à des biofilms mono-espèces pré-établis
par Empedobacter breve, Mycobacterium sp., Acinetobacter baumanii, Klebsiellae
pneumoniae, P. fluorescens, dans un milieu de culture défini (Stewart et al., 2012). En
revanche, elle n’est pas capable de s’associer à des biofilms constitués par P. aeruginosa ,
Corynobacterium glutamicium (Stewart et al., 2012). Ceci suggère que certaines espèces
bactériennes s’opposent à l’implantation de L. pneumophila dans les biofilms (Klayman et al.,
2009). Dans la nature, la majorité des biofilms formés sont des structures complexes multiespèces. Des modèles expérimentaux ont été mis en place afin de mimer au mieux les
conditions environnementales. Grâce à ces systèmes, il a été démontré que L. pneumophila est
capable de coloniser rapidement des biofilms complexes (Declerck et al., 2007; Murga et al.,
2001; Vervaeren et al., 2006). Declerck a estimé le temps mis par ce pathogène pour se fixer,
inférieure à 2 heures (Declerck et al., 2007).
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Deux phénomènes sont à l’origine de la fixation de L. pneumophila dans les biofilms. Il s’agit
d’un phénomène physique mettant en jeu des structures cellulaires, comme des protéines
d’adhésion, mais aussi le QS. L. pneumophila présente de nombreuses protéines de surface et
est capable de produire des adhésines lui facilitant le passage de la forme planctonique à la
forme sessile (Mallegol et al., 2012). Bien sûr, les facteurs environnementaux contrôlent cette
production ainsi que les propriétés des surfaces cellulaires (Donlan, 2002). En effet, plusieurs
structures favorisent l’adhésion des bactéries. Nous pouvons citer les pilis, les fimbriaes, les
flagelles, les polysaccharides de surface (Donlan, 2002). Chez L. pneumophila , le système de
sécrétion T2SS a été décrit comme étant impliqué dans les phénomènes d’adhésion. Grâce à
ce système, les bactéries exportent le matériel protéique nécessaire à la fabrication des pilis,
mais aussi pour transloquer des facteurs de virulence contribuant à la maturation des biofilms
(De Buck et al., 2005 ; Liles et al., 1999 ; Lucas et al., 2006).
Le phénomène de QS a également été démontré chez L. pneumophila . Des études récentes ont
permis de mettre en évidence une molécule de signalisation, un autoinducteur noté LAI-1
(pour Legionella Autoinducer-1). Cette molécule appartient à la famille des alphahydroxykétone, molécule de signalisation intercellulaire (Spirig et al., 2008). Cette famille est
commune à d’autres espèces bactériennes. Il est donc possible que la communication se fasse
entre L. pneumophila et d’autres bactéries, et pas seulement entre bactéries du genre L.
pneumophila.
La formation des biofilms peut se faire dans des conditions statiques, lorsque l’eau est
stagnante, ou dans des conditions plus dynamiques, comme dans les conduites d’eau où le
flux est continu. Des études ont été menées dans les deux conditions afin de comparer
l’implantation de L. pneumophila . Il s’avère que la colonisation des biofilms est plus
importante en conditions dynamiques. L’explication apportée à ces observations tient sur le
rôle du flux qui permet un renouvellement continu de l’oxygène et des nutriments, favorisant
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ainsi la persistance de L. pneumophila dans les biofilms. A l’inverse, lorsque les biofilms sont
formés dans des conditions où l’eau est stagnante et n’est pas renouvelée, le milieu
s’appauvrit en oxygène et en nutriments. Le micro-environnement n’est donc pas propice à la
formation des biofilms (Liu et al., 2006).
3.2.2. Prolifération de L. pneumophila dans les biofilms
3.2.2.1.
Implantation du biofilm
Afin de s’implanter dans les biofilms pré-établis, les bactéries libres doivent se différencier en
bactéries sessiles. Ceci implique des modifications phénotypiques résultant d’un grand
nombre de changements au niveau de leur métabolisme, en particulier au niveau de
l’expression des gènes comme par exemple l’inhibition des gènes contrôlant la synthèse des
flagelles (Watnick & Kolter, 2000).
Une analyse transcriptomique a été réalisée pour la première fois en 2008, par notre équipe,
sur L. pneumophila à l’état de biofilms (Hindre et al., 2008). Au total, l’expression de 2932
gènes était modulée, et 2,3% présentait un fold change multiplié par deux. Parmi les gènes qui
ont été induits, nous pouvons citer : les gènes homologues à pvcA et pvcB responsables de la
production de la pyoverdine chez P. aeruginosa ; des gènes impliqués dans la virulence,
lpl_0820, code la protéine CsrA, impliquée dans l’inhibition du passage en phase transmissive
(Molofsky & Swanson, 2003) ; lpl_0497, codant les protéines IcmJ/DotN, appartenant au
système de sécrétion TIVSS. Des gènes réprimés ont aussi été identifiés : lpl_1059-1060
codent des protéines similaires à la protéine EhnC impliquée dans la virulence et exprimée par
L. pneumophila lors de son entrée dans la cellule hôte ; des gènes codant pour la synthèse des
flagelles (fliA, flaA, fliS) ; des gènes codant pour des substrats du système de sécrétion TIVSS
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(ralF, sdeA, sdcA, sidC ) ; le gène ehnC normalement induit pour permettre l’entrée des
bactéries dans leur cellule hôte. Ces résultats suggèrent que les voies de régulations
permettant le passage de la phase réplicative à la phase transmissive sont modifiées chez L.
pneumophila à l’état de biofilm. En effet, le gène codant la protéine CsrA n’est pas exprimé
chez les bactéries sessiles (Hindre et al., 2008). Pourtant, les gènes codant les protéines du
flagelle, normalement induit en phase transmissive chez leur hôte A. castellanii, sont induit
chez les bactéries sessiles. La protéine CsrA est connue pour réprimer l’expression des gènes
codant les protéines du flagelle (Fettes et al., 2001). Les voies de régulations seraient donc
modifiées chez les bactéries sessiles.
3.2.2.2.
Croissance du biofilm
La croissance du biofilm correspond à la seconde phase du processus de formation. Durant
cette phase, les colonisateurs secondaires s’implantent et prolifèrent afin de former des
microcolonies (Donlan, 2002). Par des techniques de marquage immunofluorescents (Rogers
& Keevil, 1992), des micro-colonies de L. pneumophila ont pu être visualisées dans les
biofilms naturels environnementaux. Leur croissance entraine une augmentation de la taille et
du volume des biofilms. Les microcolonies s’enchâssent dans la matrice renforçant ainsi la
structure des biofilms. La quantité de SPE produite, dépend des espèces bactériennes
présentent au sein du biofilm. L’étude de Piao en 2006 a révélé que L. pneumophila était
capable de produire des SPE (Piao et al., 2006).
Dans les biofilms multi-espèces, la compétition pour les nutriments est très grande. Certaines
bactéries peuvent se voir avantagées si elles possèdent plusieurs moyens d’assimiler des
nutriments. L. pneumophila est capable d’assimiler les nutriments provenant directement du
biofilm. Ils sont apportés par d’autres microorganismes constituants le biofilm, comme les
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algues, les bactéries hétérotrophes, qui produisent des nutriments en excès. Lors de la
croissance intracellulaire de L. pneumophila , les peptides et les protéines de la cellule hôte
sont dégradés et peuvent également être utilisés comme sources de nutriments par les
bactéries (Lau & Ashbolt, 2009; Stoodley et al., 2002a).
3.2.3. Dernière étape : la dissémination des bactéries
Après la maturation, des portions du biofilm sont capables de se détacher et de se disperser
dans l’environnement (Stoodley et al., 2001; Wilson et al., 2004). Ce phénomène est souvent
la conséquence d’une carence en nutriment, ou de l’application d’un flux en surface des
biofilms. Il peut aussi être induit par le phénomène de QS. Parfois le détachement ne concerne
que quelques cellules, mais dans d’autres cas, des portions de biofilms peuvent être libérées
(Peyton & Characklis, 1993).
Lorsque un flux d’eau laminaire est appliqué (mime le flux existant dans les canalisations
d’eau), une érosion permanente à la surface des biofilms de L. pneumophila se produit (Storey
et al., 2004). Dans cette étude, ils ont comparé les résultats obtenus à partir de biofilms multi-
espèces formés en flux laminaire, à ceux obtenus après l’application d’un flux plus
dynamique et apportant d’avantage de turbulences. Environ 90% des L. pneumophila se sont
détachées de leur substrat. La phase de détachement des biofilms de L. pneumophila est
particulièrement étudiée car elle est souvent la cause de dissémination des pathogènes dans
l’environnement et par ce biais là, une source d’infection pour l’Homme.
Lors du détachement de fragments de biofilms, des amibes peuvent également être relarguée.
Si les protozoaires sont infectés par L. pneumophila , il peut y avoir un risque de dissémination
du pathogène qui finit par ce libérer de sa cellule hôte (Lau & Ashbolt, 2009).
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3.3. Impact du fer
3.3.1. Sur les biofilms complexes multi-espèces naturels
Les biofilms jouent un rôle important dans le transport d’éléments chimiques, organiques, de
minéraux, pour la plupart, nécessaires au développement des bactéries constituant ces
structures (Lovley, 1991). Certains métaux, comme le fer, sont essentiels pour la croissance
de la plupart des microorganismes vivant au sein des biofilms. Le fer joue le rôle de donneur
d’électrons dans le métabolisme énergétique des bactéries lithotrophes, mais aussi d’accepteur
d’électrons pour leur respiration anaérobique (Emerson & Moyer, 1997). Le fer est surtout
utilisé par des cofacteurs lors de nombreuses réactions enzymatiques.
3.3.2. Impact du fer sur les biofilms mono-espèces de L. pneumophila
Le fer est un des éléments indispensable à la croissance des microorganismes, à leur survie, en
milieu de culture ou dans les biofilms. Ceci est vrai pour les bactéries du genre L.
pneumophila mais également pour la très grande majorité des bactéries. La régulation du fer
dans la formation des biofilms a été démontrée chez de nombreuses espèces bactériennes.
Chez P. aeruginosa , E. coli, Vibrio cholerae, le fer est indispensable pour la formation des
biofilms (Banin et al., 2005; Mey et al., 2005; Wu & Outten, 2009). En revanche, chez les
espèces L. pneumophila ou encore S. mutans, de trop grandes concentrations en fer
préviennent la formation des biofilms (Berlutti et al., 2005; Hindre et al., 2008).
Une étude a été réalisée au sein de notre laboratoire, sur l’impact du fer sur la formation de
biofilms mono-espèces de L. pneumophila (Hindre et al., 2008). En présence de fortes
concentrations en pyrophosphate de fer (PPF ; 1,25 g/l), l’adhésion des cellules était
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nettement diminuée (Fig. 20). Le niveau de fer disponible pour les bactéries serait donc un
signal pour le développement du biofilm.
Figure 20 : Effets du PPF, à différentes concentrations, sur la formation des biofilms de
L. pneumophila Lens (Hindre et al., 2008).
Ces données ont conduit à des questionnements sur l’effet du fer sur le contrôle de
l’expression des gènes entre les cellules planctoniques et les cellules à l’état de biofilm, tout
comme cela a été observé pour la morphologie du biofilm. Il a alors été montré une
surexpression des gènes codant les protéines similaires à PvcA et PvcB, en présence de 0,25
g/l et 1,25 g/l de PPF. Ces deux protéines sont similaires à des protéines impliquées dans la
biosynthèse de la pyoverdine, sidérophore capable de capter les molécules de fer. Néanmoins,
elles ne sont pas impliquées dans la formation des biofilms, quelques soient les concentrations
en fer dans le milieu car les mutants de ces gènes ont présenté les mêmes phénotypes que la
souche sauvage. Les voies de régulation ne sont pas exprimées de la même façon chez les
cellules sessiles et chez les cellules planctoniques.
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Partie 2. Matériel et Méthodes
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1. Méthodes de microbiologie
1.1. Souches bactériennes et cellules
Les souches de bactéries qui ont été utilisées lors de cette étude sont référencées dans le
Tableau 1.
Une souche d’amibe A. castellanii (ATCC 30234) et des monocytes humains U937 (ATCCCRL-1593.2) ont également été utilisés pour les tests d’infectiosité.
Tableau 1 : Souche de bactéries utilisées au cours de l’étude
Souches
Legionella pneumophila Paris
Sources
Sélection
Equipe C. Buchrieser
Legionella pneumophila Paris lpp_2867
Cette étude
GenR
Legionella pneumophila Paris lpp_2867 + EP44
Cette étude
GenR - CamR
Legionella pneumophila Paris + EP44
Cette étude
CamR
Legionella pneumophila 130b
Equipe N. Cianciotto
Legionella pneumophila 130b lpw_30711
Cette étude
GenR
Legionella pneumophila 130b lpw_30711 + EP48
Cette étude
GenR - CamR
Legionella pneumophila 130b + EP48
Cette étude
CamR
Legionella pneumophila NU269 (∆feoB)
KanR
Legionella pneumophila NU229 (∆frgA)
KanR
Legionella pneumophila NU244 (∆iraB)
KanR
Legionella pneumophila NU302 (∆lbtA)
KanR
Legionella pneumophila NU311 (∆lbtA/frgA)
KanR - GenR
Legionella pneumophila NU383 (∆lbtU)
KanR
Escherichia coli DH5α
Page 74
1.2. Milieux de cultures
1.2.1. Culture de Legionella
Les différentes souches de L. pneumophila ont été cultivées à 37 °C en milieu liquide BYE
(Buffered Yeast Extract) ou sur milieu gélosé BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract). Le
milieu BYE est composé, pour 1 litre, de 10 g d’ACES, 10 g d’extrait de levure et 1 g
d’alpha-cétoglutarate. Le pH est ajusté à 6,9 avec du KOH. Après filtration sur membrane de
0,22 µm, le milieu est supplémenté avec de la L-cystéine filtrée sur 0,22 μm (0,4 g/l final) et
du pyrophosphate de fer (PPF) filtré sur 0,22 μm (0,25 g/l final).
Le BCYE est préparé, à partir de BYE non filtré, par ajout de charbon actif à 1,5 g/l et d’agar
à 15 g/l. Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes puis complémenté comme
précédemment avec de la L-cystéine et du PPF.
En fonction des souches, le milieu peut être supplémenté en antibiotique tels que la
kanamycine (Kan 25 µg/ml), la gentamicine (Gen 2,5 µg/ml), ou le chloramphénicol (Cam 5
µg/ml).
La culture de L. pneumophila en condition de carence en fer a été réalisée dans du milieu
minimum noté CDM (Chemical Defined Medium). Il est composé, pour un litre, de 10,466 g
de MOPS, 0,212 g de KH2PO4, 2,926 g de NaCl, 20 ml d’une solution d’acides aminés 10 X,
4 ml d’une solution de métaux 50 X, 4 ml d’une solution de Zinc 50 X, 0,1 g de glutathione,
0,1 g de cystine (Chatfield & Cianciotto, 2013). Le pH du milieu est ajusté à 6,5 avec du
KOH, il est ensuite stérilisé par filtration sur membrane de 0,22 µm.
Page 75
1.2.2. Culture d’E. coli
La bactérie a été cultivée en milieu liquide LB (Luria-Bertani) à 37 °C, sous agitation à 200
rpm, ou sur milieu LB gélosé. Le milieu est composé, pour 1 litre, de 10 g de tryptone, de 5 g
d’extrait de levure, de 10 g de NaCl et de 15 g d’agar pour le milieu gélosé uniquement. Le
milieu est ensuite autoclavé à 121 °C pendant 15 minutes pour être stérilisé. Suivant les
conditions, le milieu peut être supplémenté en antibiotique tels que la gentamicine (Gen 2,5
µg/ml), ou le chloramphénicol (Cam 5 µg/ml).
1.2.3. Culture des amibes
Les amibes du genre A. castellanii ont été cultivées dans du milieu PYG, à 35 °C, dans des
flasques de 25 cm². Le milieu PYG est composé, pour 1 litre, de 20 g de protéase peptone, 1 g
d’extrait de levure, 1 g de citrate de sodium dihydraté, 10 ml de MgSO4 7 H2O à 0,4 M, 8 ml
de CaCl2 à 0,05 M, 10 ml de Fe(NH4)2(SO4)2 à 0,005 M, 10 ml de Na2HPO4 dibasique à 0,25
M, et de 10 ml de KH2PO4 monobasique à 0,25 M. Le pH de la solution doit être ajusté à 6,5
avec du KOH. Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121 °C pendant 15 min. Il est
finalement supplémenté avec du glucose à 0,1 M, stérilisé par filtration sur membrane de 0,22
µm.
1.2.4. Culture des cellules U937
Les cellules U937 ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 contenant de la L-glutamine et
supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF), de la pénicilline (200 U/ml), de la
streptomycine (100 µg/ml). Les flasques de cellules ont été incubées à 37 °C dans une étuve à
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5% de CO2. Pour les expérimentations, les cellules ont été différenciées en macrophages en
présence de Phorbol-12-myristate-13 Acétate (PMA) à 50 ng/ml, pendant 48 heures à 37 °C
sous 5% de CO2.
1.3. Numération des microorganismes
1.3.1. Numération des bactéries
1.3.1.1.
Par densité optique
La concentration bactérienne d’une suspension peut être estimée par spectrophotométrie à 600
nm. Une densité optique (DO) égale à 1 correspond à une concentration de 109 bactéries/ml.
1.3.1.2.
Par numération des unités formant colonies (UFC)
Le comptage des bactéries se fait par le dénombrement des UFC. Un échantillon de volume
connu est déposé sur milieu gélosé et après incubation de la boîte, 3 à 4 jours, à 37 °C, le
nombre de colonies est compté. Celui-ci correspond au nombre de bactéries cultivables
présentes dans l’échantillon.
1.3.2. Numération des cellules
La numération des amibes et des monocytes a été réalisée sur des cellules de comptages «
Fast-read » (Bioblock). La cellule a été remplie avec 10 μl de suspension et observée au
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microscope inversé (Axiovert 40 CFL, ZEISS), à l’objectif x10. La cellule « Fast-read » est
formée par une grille de 10 carrés, le volume d’un carré équivalant à 0,1 μl.
1.4. Tests d’infection
1.4.1. Infection des macrophages
Après la différenciation des monocytes en macrophages, les cellules ont été cultivées 2 jours
dans du milieu RPMI / 10% SVF, jusqu’à atteindre la confluence. Les cellules devenues
adhérentes sont décollées par ajout du mélange PBS 1 X / EDTA 5% (0,171 g/mol). Les
macrophages ont été repris dans du milieu RPMI / SVF 10% et la concentration a été ajustée à
2 x 106 cellules/ml. Dans des microplaques 24 puits, 500 µl de la suspension à 2 x 106
cellules/ml ont été répartis dans chaque puits, et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant
24 heures (la veille de l’infection). Ce temps d’incubation suffit aux macrophages pour
adhérer au fond des puits. Trois jours avant l’infection, les différentes souches de L.
pneumophila ont été isolées sur BCYE. Les bactéries ont ensuite été mises en suspension dans
du BYE, à la concentration de 4 x 106 bactéries/ml. Dans les microplaques ensemencées avec
les macrophages, 500 µl de suspension de L. pneumophila ont été ajoutés afin d’obtenir une
MOI (Multiplicity of infection) de 0,5. Après 2 heures d’incubation à 37 °C, nécessaires pour
l’internalisation des bactéries, les puits ont été rincés puis remplis par 1 ml de RPMI / 10%
SVF. A l’instant 0, puis après 24, 48 et 72 heures, le contenu de chaque puits (1 ml) a été
traité avec 10 µl de saponine 10%, afin de lyser les cellules et libérer les bactéries
intracellulaires. Pour estimer la viabilité bactérienne, 100 µl ont été prélevés dans chaque
puits et des dilutions sérielles ont été réalisées dans du milieu RPMI / 10% SVF. Les
Page 78
suspensions ont été étalées sur milieu BCYE. Les géloses ont été placées à l’incubateur, à 37
°C, pendant 3 à 4 jours avant le comptage des colonies.
1.4.2. Infection des amibes
Les amibes ont été mises en culture 3 jours avant la mise en contact avec les bactéries. Le jour
de l’infection, les amibes ont été reprises dans du PYG non supplémenté en glucose (ce milieu
permet de maintenir les amibes en vie sans qu’elles se multiplient). La concentration de la
suspension a été ajustée à 1 x 105 cellules/ml. Dans des microplaques 24 puits, 1 ml de
suspension a été déposé dans chaque puits. Les microplaques ont été incubées 1 heure avant
l’ajout des bactéries. Trois jours avant l’infection, les différentes souches de L. pneumophila
ont été isolées sur BCYE puis mises en suspension dans du BYE, la concentration a été
ajustée à 1 x104 UFC/ml. Après l’incubation des microplaques, 1 ml de suspension
bactérienne a été ajouté dans chaque puits afin d’obtenir une MOI 10. A l’instant 0, puis après
24, 48 et 72 heures, 100 µl ont été prélevés dans chaque puits et des dilutions sérielles ont été
réalisées dans du milieu PYG non supplémenté en glucose. Les dilutions ont été étalées sur
milieu BCYE, et les boîtes de milieu ont été incubées à 37 °C pendant 3 à 4 jours avant le
comptage des colonies.
1.5. Internalisation de L. pneumophila dans les amibes
L’infection a été réalisée dans des flasques de 25 cm². Trois jours avant l’infection, les amibes
ont été mises en culture dans du PYG, à 35 °C. Les trophozoïtes ont été collectés et reprit
dans du PYG sans Fe(NH4)2(SO4)2 et sans glucose. La concentration a été ajustée à 105
amibes/ml, et 5 ml ont été répartis dans chaque flasque prévue pour les infections. Deux
Page 79
heures d’incubation à 35 °C sont nécessaires pour que toutes les amibes soient adhérées au
fond des flasques.
L. pneumophila ont été isolées sur BCYE puis inoculées dans du BYE à DO 0,01. A DO 0,8,
les bactéries ont été traitées avec les chélateurs de fer, DFX (20 µM) et DIP (100 µM). Après
4 heures, la concentration de chacune des suspensions a été ajustée à 1 x 104 UFC/ml dans du
PYG non supplémenté en fer, ni en glucose, et 5 ml ont été ajoutés dans les flasques d’amibes
afin d’obtenir une MOI de 0,1. Les flasques ont été placées à 35 °C pendant 6 heures.
Afin d’éliminer les bactéries extracellulaires, une série de lavages a été effectuée. Les amibes
ont ensuite été décollées et collectées. La suspension a été centrifugée à la vitesse maximale
de 10 000 g pendant 10 min suivi d’une minute de vortex de manière à faire éclater les amibes
et libérer les L. pneumophila dans le milieu. Afin de dénombrer les bactéries, des dilutions
sérielles ont été effectuées dans du PYG non supplémenté en fer, ni en glucose. Les dilutions
ont été étalées sur milieu gélosé BCYE, et les boîtes de milieu ont été incubées à 37 °C
pendant 3 à 4 jours avant le comptage des colonies.
Page 80
2. Méthodes de biologie moléculaire
2.1. Extraction d’acides nucléiques
2.1.1. Extraction ADN
L’ADN génomique a été extrait grâce au kit d’extraction d’ADN «High Pure PCR Template
Preparation Kit » (Roche®) en suivant les recommandations du fournisseur. A la fin de
l’extraction, l’ADN a été récupéré dans 200 μl de tampon d’élution et stocké à -20 °C avant
utilisation.
2.1.2. Extraction ARN
Des extractions d’ARN ont été réalisées sur des culots de L. pneumophila , en vue d’une
analyse transcriptomique.
Avant l’extraction des ARN, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans du tampon
(Tris 12,5 M, EDTA 5 mM, glucose 10%). Immédiatement après, 0,5 ml de phénol (pH 4,6)
et 400 mg de microbilles en verre (0,2-0,3 mm de diamètre) ont été ajoutés à la suspension.
Les bactéries ont été lysées en réalisant deux cycles de 30 s, vitesse 6,0 m/s, au « Fast Prep »
(Thermo scientific). Après centrifugation (13 000 g, 5 min, 4 °C), le surnageant a été transféré
dans un tube propre et 1 ml de Trizol (Ambion) a été ajouté. Après incubation 5 min à
température ambiante, les échantillons ont été centrifugés à 13 000 g, pendant 5 min et à 4 °C.
Les
surnageants
ont
été
récupérés
avant
d’être
traités
avec
un
mélange
de
chloroforme/isoamyl alcool 24 : 1 (v/v). La précipitation des ARN se fait pendant 1 heure
Page 81
dans 0,5 ml d’isopropanol, sur glace. Les ARN sont finalement rincés avec 1 ml d’éthanol
75% puis 1 ml d’éthanol 95%, et stockés à -80 °C.
2.2. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
La PCR est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier in vitro, une région
ciblée d’un ADN. Elle permet ainsi d’obtenir, à partir d’un échantillon faiblement concentré,
de plus grandes quantités d’un fragment d’ADN spécifique. Le principe de cette technique
repose sur une succession de plusieurs étapes. La première est une étape de dénaturation
initiale (2 min, 95 °C). Elle permet de dénaturer les molécules d’ADN doubles brins en ADN
simples brin, et d’activer les ADN polymérases présentent dans le mélange réactionnel. Après
cette étape, plusieurs cycles vont se succéder (30 à 35 cycles). Chaque cycle comprend trois
étapes : une étape de dénaturation (1 min, 95 °C), une étape d’hybridation où la température
est spécifique des amorces (1 min, 42 °C à 65 °C), et une étape d’élongation (1 min/kb, 72
°C) pendant laquelle les ADN polymérases synthétisent les brins d’ADN complémentaires.
Une fois les cycles terminés, la PCR se termine par une élongation finale (5 min à 72 °C).
La température d’hybridation dépend des amorces choisies et se calcule en prenant en compte
leur composition en bases GC et AT. La température d’élongation est également variable, en
fonction de la taille des fragments à amplifier.
Les conditions générales de températures et de durée de chaque étape sont spécifiques des
ADN polymérases utilisées.
Page 82
2.3. PCR en temps réel (PCRq)
2.3.1. Principe
La PCR quantitative ou PCRq est basée sur le même principe que la PCR. Le but est
d’amplifier une région d’ADN ciblée. La PCR se déroule en 3 grandes étapes :
la dénaturation initiale, à 95 °C, pendant 10 min
30 cycles d’amplification, chaque cycle comprenant une étape de dénaturation à 95 °C
pendant 10 s, une étape d’hybridation, pendant 10 s et une étape d’élongation à 72 °C,
pendant 15 s. A cette température, la Taq polymérase fonctionne de manière optimale
en synthétisant un brin complémentaire à partir du brin matrice.
Construction d’une courbe de fusion permettant de vérifier la spécificité des produits
qui ont été amplifiés : étape à 65 °C pendant 60 s.
La température d’hybridation varie en fonction des amorces utilisées et le temps d’élongation
dépend de la taille des fragments à amplifier.
La PCRq, à la différence d’une PCR classique, permet de quantifier l’ADN présent dans les
différents échantillons grâce au SYBR green, une molécule qui s’intercale entre les deux brins
d’ADN. Lorsque le SYBR green est fixé, il émet une fluorescence à 530 nm dont l’intensité
est proportionnelle à la quantité d’ADN double brin. La mesure de la fluorescence au cours du
temps permet d’obtenir une estimation de la quantité d’ADN présente dans l’échantillon. Une
valeur de cycle seuil est aussi mesurée (Crossing Point ou Cp) et correspond au cycle de PCR
à partir duquel la fluorescence émise est supérieure au bruit de fond. Cette valeur dépend de la
quantité d’ADN présente dans l’échantillon au départ, plus la quantité est grande, plus cette
valeur sera faible. L’appareil de PCRq utilisé dans notre étude, est le thermocycleur
Page 83
LightCycler de Roche® 1.5, et le kit LightCycler FastStart DNA MasterPLUS Sybr Green I
(ROCHE). Les amorces utilisées sont listées dans les Tableaux 2-4.
2.3.2. Réalisation de la gamme étalon
Afin de quantifier de manière absolue la quantité d’ADN en Unité Génome (UG)/ µl une
gamme étalon a été réalisée à partir d’ADN de L. pneumophila Paris, dont la taille du génome
est connue (3,9 x 106 pb). Le calcul a été effectué après extraction de l’ADN d’un culot de
cellules et quantification de la concentration d’ADN au BioSpec-nano.
Une gamme étalon a donc été préparée en réalisant des dilutions en série. La quantité d’ADN
de référence étant connue, une quantité absolue a pu être assignée à chaque échantillon testé.
2.4. RT-PCRq
Le principe de la RT-PCRq est le même que celui de la PCRq excepté la première étape. En
effet, les échantillons de départ ne sont pas des molécules d’ADN mais des ARN, donc
simples brins. Ainsi, la première étape est une étape de reverse transcription, qui a lieu avant
la dénaturation initiale.
Afin de normaliser l’expression des gènes, le gène codant l’ARNr 16S a été utilisé comme
gène référence. Le niveau d’expression des gènes est évalué en déterminant le Cp, c'est-à-dire
le cycle auquel la courbe d’amplification atteint le seuil de détection. D’après l’étude de Livak
de 2001, les changements relatifs de l’expression des gènes ont été déterminés par le calcul de
2-ΔΔCp, avec ΔCp= Cp du gène cible - Cp du gène de référence (ARNr 16S) et ΔΔCp = ΔCp
échantillon traité – ΔCp échantillon non traité. Les couples d’amorces qui ont été utilisés sont
listés dans le Tableau 4 (Livak & Schmittgen, 2001).
Page 84
2.5. Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (t-RFLP)
La t-RFLP permet d’étudier le polymorphisme de longueur de fragment de restriction. Cette
technique a été utilisée afin de comparer les populations bactériennes dans les différents
biofilms formés dans l’eau de rivière.
2.5.1. Principe
Le principe de la t-RFLP est basé sur une amplification, par PCR, ciblant le gène codant
l’ARNr 16S, avec un couple d’amorces spécifiques. L’amorce sens est marquée sur son
extrémité 5’ par la 6-carboxyfluorescein (FAM). Après l’amplification, les fragments ont été
digérés par des enzymes de restriction, et les produits issus de la digestion ont été séparés par
électrophorèse capillaire (Applied Biosystems Instruments [ABI] Prism, USA). Après la
migration, la longueur des fragments fluorescents a été déterminée par comparaison avec un
standard interne grâce au logiciel Genscan (ABI).
2.5.2. Conditions expérimentales
Le couple d’amorces utilisé pour amplifier le gène codant l’ARNr 16S comprend les amorces
8F-FAM couplée à la fluorescéine en 5’ et 1492-R (Séquences répertoriées dans la Tableau
2). Elles amplifient un fragment de 1500 pb. Les réactions de PCR sont réalisées avec la
GoTaq DNA polymerase (PROMEGA). Le mélange réactionnel est composé par du tampon
PCR 1 X, 0,2 mM de chaque déoxyribonucléotide triphosphate (dNTP), 1,5 mM de MgCl2,
les amorces ajoutées sont concentrées à 1 µM et la Taq polymérase à 1,25 U. La concentration
finale d’ADN ajoutée au mélange est de 20 pg/µl. Les réactions de PCR ont été réalisées dans
Page 85
le « Thermocycleur Vapo-protect » (Eppendorf). Les différentes étapes de l’amplification
sont : la dénaturation initiale (2 min à 95 °C), suivie par 30 cycles comprenant une étape de
dénaturation (45 s à 95 °C), d’hybridation (45 s à 58 °C), et d’extension (1 min à 72 °C), puis
la dernière étape est l’extension finale (10 min à 72 °C). Après avoir vérifié les produits issus
de l’amplification sur gel d’agarose 1%, les produits ont été purifiés à l’aide du kit
NucleoSpin®Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) et élués dans un volume final de 30 µl.
Les échantillons ont ensuite subit une digestion enzymatique par HaeIII à 37 °C pendant 3
heures. Puis les fragments sont séparés en électrophorèse capillaire. L’appareil utilisé dans le
cadre de cette étude est le séquenceur automatisé 3130 de chez Applied Biosystems
Instruments [ABI] Prism.
Chaque produit digéré (1 µl à 80 ng d’ADN digéré) a été mélangé avec 0,25 µl d’un standard
de taille, GeneScan™ 500 ROX™ (Applied Biosystems) et 18,75 µl de formamide déionisé
(Hi-Di™ Formamide). La taille des fragments d’ADN présents dans la solution standard sont
35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, et 500 bases. Chaque
échantillon a été incubé à 95 °C pendant 3 min et stocké à -20 °C avant le passage en
électrophorèse. Les informations obtenues sont analysées avec le logiciel « StatFingerprints »
qui permet de convertir les résultats en données, soumises à l’analyse en composante
principale (ACP), fournissant une coordination des communautés bactériennes dans un plan
factoriel sur la base des scores des deux premières composantes principales. Les analyses
informatiques ont été réalisées par Anne Mercier, post-doctorante au Laboratoire de
Microbiologie de l’Eau.
Page 86
2.6. Analyse microarray
L’ensemble des analyses de transcriptomique a été réalisé à l’Institut Pasteur dans le
laboratoire de Biologie des Interactions Bactériennes, sous la direction de Carmen Buchrieser.
L’analyse par microarray a été utilisée pour analyser l’impact de la carence en fer sur
l’expression des gènes chez L. pneumophila. Le principe des puces à ADN est basé sur la
possibilité de quantifier rapidement les différences d’expression des gènes, à l’échelle d’un
génome complet.
Après extraction des ARN, 1 µg/µl de chaque échantillon a été utilisé pour la synthèse
d’ADNc, grâce au kit Superscript indirect cDNA (Invitrogen) et marqués avec la Cyanine 5
(Cy5) et la Cyanine 3 (Cy3) selon les recommandations du fournisseur (Amersham
Biosciences). Chaque échantillon a été marqué à la fois avec la Cy5 et la Cy3. L’hybridation
sur les puces (Bruggemann et al., 2006) a été réalisée avec 250 pmol d’ADNc marqué à la
Cy3 et Cy5. Ainsi, les ADNc de chaque échantillon ont été comparés l’un à l’autre, et deux
hybridations distinctes ont été réalisées sur les lames en effectuant une permutation des
colorants, plus communément appelé le dye-swap.
Après incubation les puces ont été scannées grâce à un appareil de lecture associé au logiciel
GenePix 4000A (Axon Instruments). Les résultats ont été traités par le logiciel Genepix Pro
4.0. La normalisation des données ainsi que les analyses différentielles ont été réalisées grâce
au logiciel R (http://www.r-project.org). Les analyses informatiques ont été effectuées par
Tobias Sahr, chercheur à l’Institut Pasteur.
Page 87
2.7. Transformation naturelle
L. pneumophila
est naturellement compétente. Elle est capable d’incorporer, par
recombinaison homologue, des fragments d’ADN construits de façon à inactiver un gène.
2.7.1. Construction d’un fragment d’ADN
Le principe de la mutation est basé sur le remplacement du gène d’intérêt par une cassette
antibiotique (confèrant une résistance à la gentamicine) qui doit présenter à ses extrémités
environ 500 pb du gène à inactiver, pour permettre la recombinaison homologue. Cette
construction a été réalisée en deux étapes, soient deux réactions de PCR. L’ADN polymérase
utilisée ici est la « One Taq Hot Start DNA Polymerase » (New England Biolab) car elle
permet de réaliser des amplifications de long fragment avec une très haute fidélité. Le
programme spécifique à cette polymérase est le suivant : dénaturation initiale (30 s, 94 °C),
35 cycles comprenant une première étape de dénaturation (30 s, 94 °C), l’hybridation (1 min,
45°C à 68 °C) puis l’élongation (1 min/kb, 68 °C) et enfin l’élongation finale (5 min, 68 °C).
La première PCR a permis d’amplifier les trois fragments principaux : les régions 5’ et 3’ du
gène d’interêt ainsi que la cassette antibiotique codant la résistance à la gentamicine. Les
couples d’amorces utilisés sont respectivement lpp2867-F1/lpp2867-Gen-R1, lpp2867-GenF2/lpp2867-R2 et K7-Gen-F1/ K7-Gen-R2. Les séquences sont répertoriées dans le Tableau
3. Les amorces lpp2867-Gen-R1 et lpp2867-Gen-F2 possèdent une région complémentaire de
la cassette antibiotique. De la même façon, le couple K7-Gen-F1/ K7-Gen-R2 présente des
régions complémentaires du gène lpp_2867. Après l’amplification, une seconde PCR a été
réalisée avec les 3 fragments purifiés, mélangés de manière équimolaire (10 nM) et les deux
amorces extérieurs lpp2867-F1 et lpp2867-R2 (Fig. 21).
Page 88
Figure 21 : Construction du fragment d’ADN, visant à inactiver le gène lpp_2867. (I)
Amplification indépendante des trois fragments : les deux extrémités du gène d’intérêt ainsi
que la cassette antibiotique. (II) Après la première PCR, les fragments sont mélangés de
manière équimolaire (10 nM). (III) La seconde PCR permet l’association des fragments entre
eux et ainsi former le fragment entier.
2.7.2. Préparation des bactéries
L. pneumophila a été isolée sur BCYE est mise en culture 3 jours à 37 °C. Une fois la phase
stationnaire atteinte, les bactéries ont été inoculées dans 50 ml de BYE à DO600 0,01. Elles ont
été incubées à 37 °C, sous agitation à 170 rpm, pendant 18 à 20 heures, jusqu’à obtenir des
bactéries en fin de phase exponentielle et entrant en phase stationnaire. A ce stade de culture,
les bactéries sont naturellement compétentes. Un volume de 5 ml a été prélevé. Après
centrifugation, les bactéries ont été reprises dans 3 ml de milieu. Une quantité de 10 µg
d’ADN a été ajoutée. Les bactéries ont ensuite été incubées à 30 °C pendant 24 heures sans
agitation avant d’être centrifugées à 2500 rpm, pendant 5 min, à 30 °C. La totalité du
Page 89
surnageant n’est pas retiré, seuls 2,5 ml sont éliminés et les bactéries sont reprises dans les
500 µl de milieu restant. La totalité de la suspension a été étalée sur milieu BCYE
supplémenté en gentamicine (2,5 µg/ml) et les géloses ont été incubées à 37 °C pendant 2 à 3
jours. Des PCR sur colonies ont été réalisées afin de confirmer la recombinaison homologue
du fragment construit dans le génome de L. pneumophila . Les amorces utilisées pour ce
contrôle sont lpp2867-F3 et lpp2867-R3 (Tableau 3).
2.8. Techniques de clonage
2.8.1. Préparation de bactéries électrocompétentes
Pour rendre L. pneumophila électrocompétentes, les bactéries ont été cultivées sur BCYE
pendant 3 jours, à 37 °C. Elles ont ensuite été inoculées dans 50 ml de milieu BYE à 1 x 10 8
UFC/ml et placées à 37 °C, sous agitation (170 rpm) pendant 12 heures. Lorsqu’elles ont
atteint la phase stationnaire (DO600 ≈ 2), les bactéries ont été collectées puis centrifugées
(10 000 g, 5 min, 4 °C). Le culot a été reprit dans 50 ml de glycérol 10% conservée à 4 °C.
Trois lavages ont ensuite été effectués, dans 50, 25, puis 12,5 ml de glycérol froid. Ils
permettent d’éliminer toutes traces de milieu de culture et les sels, afin d’éviter toutes
interférences possibles avec le choc électrique de l’électroporation. Après le dernier rinçage,
le culot bactérien est remis en suspension dans un volume adéquat de glycérol 10% froid afin
d’avoir une DO600 = 100.
Pour rendre E. coli électrocompétentes, la même méthode que celle décrite pour L.
pneumophila a été suivie, excepté la culture de départ qui se fait dans du milieu LB.
Page 90
2.8.2. Constructions plasmidiques
Des constructions de plasmides ont été réalisées afin de complémenter les souches mutantes
lpp_2867 et lpw_30711. Des fragments d’ADN contenant le gène d’intérêt et son promoteur
ont été amplifiés par PCR avec les amorces lpp2867-pro-comp-XbaI-F/R (Tableau 3). Lors
de leur construction, nous avons veillé à inclure le site de restriction ciblé par l’enzyme XbaI.
Les fragments obtenus après PCR présentent donc, à leurs deux extrémités,
le site de
restriction XbaI. Par la suite, une étape de ligation a été réalisée dans un plasmide pGemTeasy
(PROMEGA). Le mélange réactionnel est composé par 1 µl de T4 DNA Ligase, 5 µl de
tampon « Rapid Ligation Buffer », 1 µl de pGemTeasy, et 1 µl de produit PCR. Après 1 heure
d’incubation à température ambiante, les constructions obtenues pEP12 et pEP19, codant
respectivement les gènes lpp_2867 et lpw_30711, ont ensuite été réintroduites dans E. coli
DH5α. Après 24 heures d’incubation, des préparations plasmidiques ont été réalisées suivant
les instructions du kit « Pure linkTM Quick Plasmid Miniprep Kit ». Les extractions
plasmidiques ont été digérées par l’enzyme de restriction XbaI (3 h, 37 °C) et les produits
issus de cette digestion ont été purifiés en suivant les instructions du kit Wizard®SV Gel and
Clean-Up System (Promega). Les inserts issus de cette digestion ont été clonés dans le
plasmide pMMB2002. La réaction de ligature est la même que celle décrite précédemment.
Les plasmides obtenus, nommés EP44 et EP48 et codant respectivement les gènes lpp_2867
et lpw_30711, ont été introduits dans les souches L. pneumophila Paris et 130b
respectivement.
Page 91
2.8.3. Electroporation
Une aliquote de bactéries électrocompétentes (100 µl) a été mélangée avec 1 µl d’ADN
plasmidique purifié concentré à 1 µg, dans une cuve d’électroporation (Gene Pulser® Cuvett
Biorad). La préparation a été incubée 2 minutes sur glace afin d’homogénéiser le contenu de
la cuve. Elle a ensuite été électroporée (MicropulserTM Biorad) grâce à l’application d’un choc
électrique de 2,5 kV. Immédiatement après, 900 µl de milieu BYE (pour L. pneumophila ) ou
LB (pour E. coli), préalablement placés à 4 °C, ont été ajoutés. Les cuves ont été incubées à
37 °C pendant 1 à 3 heures, sans agitation et les bactéries ont été étalées sur géloses
sélectives.
Page 92
Tableau 2 : Séquences des amorces utilisées en PCRq et en t-RFLP
Amorces
Séquences
Sources
515-F
5’ GTGBCAGCMGCCGCGGTAA 3’
786-R
5’ CTACCAGGGTATCTAATC 3’
Mip A1
5’ GCATTGGTGCCGATTTTGG 3’
Mip A2
5’ G[CT]TTTGCC ATCAAATCTGAA 3’
8F-FAM
FAM-5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’
1492-R
5’TACGGHTACCTTGTTACGACT 3’
Amo_1400_F 5’ATGCCGACCARSGATYMGGAG 3’
Amo_1540_R 5’CAAGSTGCYMGGGGAGTCAT 3’
Vahl_560_F
5’AGGTAGTGACAAGMYRTAGYGACT 3’
Vahl_730_R
5’GGGCGTTTTAACTACARCAGTATTA 3’
(Isenbarger et al., 2008)
(Wellinghausen et al., 2001)
(Gurtler & Stanisich, 1996)
(Le Calvez et al., 2012)
(Le Calvez et al., 2012)
Tableau 3 : Séquences des amorces utilisées pour la construction des mutants
Amorces
Séquences
lpp2867-F3
5’ GTTGGAGCAAGCCTGATAC 3’
5’ CTGGGTTCGTGCCTTCATCAAAGGCC
GGCAACTAAACTAAA 3’
5’CCTAACAATTCGTTCAAGCCGTGACCTAC
AATGCCGTTACCG 3’
5’ CAACGAGTGCGGAAAGAATC 3’
5’TTTAGTTTAGTTGCCGGCCTTTGATGAAGG
CACGAACCCAG 3’
5’GGTAACGGCATTGTAGGTCACGGCTTGAA
CGAATTGTTAGG 3’
5’ TCCAAATACGCCAGGGAAC 3’
lpp2867-R3
5’ TGGCAGAACAATCCCAGAG 3’
lpp2867-F1
lpp2867-Gen-R1
lpp2867-Gen-F2
lpp2867-R2
K7-Gen-F1
K7-Gen-R1
lpp2867-pro-comp-XbaI-F 5’TCTAGAGATACTACCTGATGAAACGAAT 3’
5’CTAGAGTAAGGAGTATCATTAACTGAAC
lpp2867-pro-comp-XbaI-R
3’
5' TCGGCTCGTATAATGTGTGG 3'
OR77
OR78
5' ACCGCTTCTGCGTTCTGATT 3'
Sources
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Equipe N.
Cianciotto
Equipe N.
Cianciotto
Page 93
Tableau 4 : Séquences des amorces utilisées en RT-PCRq
Amorces
Séquences
lpp2867-F
5’ GCCCATTATCATCCTTCCC 3’
lpp2867-R
5’ GGTAACGGCATTGTAGGTC 3’
lpp1224-F
5’ CAGAGGGCATCAGTTCTTG 3’
lpp1224-R
5’ CTGTTACCGGCCATAGTTG 3’
lpp2846-F
5’ CAGTTTGAGGCATCCCTATC 3’
lpp2846-R
5’ ACTTTGGCCTGGAATTCG 3’
lpp0656-F
5’ TTGCGGGAACTTTACCAGG 3’
lpp0656-R
5’ TCCATCGCATGGTGGTTAC 3’
lpp1739-F
5’GGAATGAACGCCGAGATGTTTG 3’
lpp1739-R
5’TTCAGCACCAGGGTATTGATCC 3’
lpp1117-F
5’ TGCAACAAGCGGTTTCGAC 3’
lpp1117-R
5’ ACCTACCCACGCTAAAGACTG 3’
lpp1280-F
5' CAGCCGATGTATTCTCGAATGC 3’
lpp1280-R
5’ TTGTTGTTGGGCTTCCAACG 3’
lpp0148-F
5’ CCCGTCGTCTTGATTATCTGG3’
lpp0148-R
5’ CTCCGCTTCTTCCTCAGTAAC 3’
lpp0419-F
5’ AGGCCGAGTCGCCCTATAAAG 3’
lpp0419-R
5’ AAGCATTGCCGAGGGTGTG 3’
lpp1677-F
5' GATGCTGGCCACTCTTATG 3’
lpp1677-R
5’ CGGGCAGATCAATTCGTTC 3’
lpp0381-F
5’ CGTTCACAGGACCAATTC 3’
lpp0381-R
5’ GCGCAAACACAAAGACTC 3’
lpp2821-F
5’ AAGGGTACAAGCGGTTTC 3’
lpp2821-R
5’ GCAGGGTTATCATCCCATAG 3’
lpp3053-F
5’ CAGCCGACATTAGCAGAG 3’
lpp3053-F
5’ GGTGATGGGTCAGTCAAG 3’
lpp2006-F
5’ TCCGCTTGAGAAGTAAAGGG 3’
lpp2006-R
5’ GCATAGCAAATCGCCTTGTC 3’
Sources
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Page 94
3. Méthodes biochimiques
3.1. Test de sensibilité à une carence en fer
Les bactéries ont été cultivées pendant 3 jours sur gélose de BCYE standard, puis inoculées à
1 x 109 UFC/ml, dans du tampon stérilisé par filtration, composé par 10,466 g/l de MOPS
(Acide 3-(N-Morpholino) propanesulfonic ), 0,212 g/l de KH2PO4, 2,926 g/l de NaCl, et de
pH fixé à 6,5. Ensuite, des dilutions sérielles au 1/10ème ont été réalisées dans du PBS
(Phosphate Buffered Saline) pour chaque échantillon, et 10 µl de chaque dilution ont été
déposés sur les géloses de BCYE, BCYE - Fer et BCYE - Fer + DFX 16 µM. Les différences
de croissance ont été observées après 3 à 4 jours d’incubation à 37 °C.
3.2. Test NaCl
Les bactéries ont été inoculées dans du BYE - Fer, à DO600 0,01, et incubées à 37 °C, sous
agitation (170 rpm). Lorsque la DO600 a atteint 0,8, les suspensions ont été traitées aux
chélateurs de fer. Une cinétique de prélèvements a été mise en place sur 8 heures. Toutes les 2
heures, la DO600 de chaque condition a été mesurée, et des dilutions en séries ont été
effectuées dans de l’eau ultra-pure stérile. Après les dilutions en séries, 10 µl de chaque
dilution ont été déposés sur des géloses de BCYE - Fer supplémentées ou non en NaCl 100
mM. Les boîtes ont été incubées à 37 °C, pendant 3 à 4 jours.
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3.3. Test H2O2
Les bactéries ont été préparées de la même façon que pour le test de sensibilité au NaCl.
Après les dilutions en séries, 10 µl de chaque dilution ont été déposés sur des géloses de
BCYE - Fer supplémentées en H2O2 à 10 mM. Les boîtes ont été incubées à 37 °C, pendant 3
à 4 jours.
3.4. Activité des sidérophores
3.4.1. Production de sidérophores : Test Chrome Azurol S (CAS)
Le test CAS à pour objectif de détecter la production de sidérophores par les bactéries. Le
principe de ce test repose sur de la colorimétrie. En absence de sidérophore dans le milieu, la
couleur du complexe Fer-CAS est bleue. Lorsque des sidérophores sont présents, ils vont
venir fixer les molécules de fer liées au CAS. Un changement de couleur s’opère, le milieu
devient orange.
Les différentes souches de L. pneumophila ont été mises en culture dans du milieu minimum
CDM (Chatfield & Cianciotto, 2013), à 37 °C, sous agitation (225 rpm) pendant 18 à 24
heures. Après centrifugation (5000 g, 10 min), les surnageants ont été collectés, puis filtrés
sur membrane de 0,22 µm. La quantité de sidérophores a été mesurée. Pour cela, une gamme
étalon a été réalisée avec une solution de DFX. Les échantillons ont été déposés en triplicat
dans une microplaque 96 puits. La solution CAS (Chatfield & Cianciotto, 2013) a été ajoutée
et la plaque a été incubée à température ambiante et à l’obscurité pendant 30 min. Le
changement de couleur a été enregistré par lecture de DO630. L’activité équivalente de la
Page 96
chélation du fer, c'est-à-dire l’activité des sidérophores dans le surnageant, a été déduite par
comparaison avec la gamme étalon du DFX.
3.4.2. Test d’activité des sidérophores
La détection de sidérophores par le test CAS peut être complétée par un test d’activité. Un
tapis de L. pneumophila mutées sur le gène feoB, a été étalé sur des géloses de BCYE non
supplémentées en fer. Le gène feoB code une protéine de membrane intracellulaire,
responsable du transport des ions Fe2+. Le mutant est donc capable d’assimiler les ions Fe3+
mais pas les ions Fe2+. L’absence de croissance du mutant sur gélose BCYE non
supplémentée en fer est rétablit par l’apport d’ions Fe3+ ou de surnageant contenant des
sidérophores. Les surnageants collectés et filtrés précédemment ont été testés afin de voir si
leur activité était capable de rétablir la croissance du mutant ΔfeoB. Un volume de 50 µl de
chaque échantillon a été déposé dans des puits formés au centre des géloses ensemencées avec
ΔfeoB.
3.4.3. Utilisation des sidérophores
Les bactéries mutantes ont été resuspendues dans du tampon et 1 x 104 UFC/ml ont été étalées
sur des boîtes de BCYE et de BCYE - Fer + DFX 10 µM. Une solution de surnageant
contenant de la légiobactine a été déposée au centre de chaque gélose, dans des puits
préformés. Les boîtes ont été incubées 3 à 4 jours à 37 °C.
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4. Formation des biofilms
La réalisation de biofilms complexes a pour objectif d’étudier l’implantation de L.
pneumophila dans des conditions proches des conditions naturelles. Les deux méthodes
décrites ci-dessous, ont fait l’objet d’un chapitre dans le livre : « Legionella , Methods and
Protocols » (Portier & Hechard, 2013).
4.1. Echantillonnage eau de rivière
Les expériences ont été réalisées avec de l’eau de rivière naturelle prélevée dans la Vienne
(localisation : N46°40’57’’/E00°34’17’’). Lors de l’échantillonnage, l’eau a été filtrée sur un
tamis de 50 µm afin d’éliminer un maximum de particules organiques et de débris végétaux.
Elle a été stockée dans des containers en polypropylène, en chambre froide, à 4 °C. La
conservation de l’eau n’a pas excédé un mois.
4.2. Culture de biofilms complexes en condition semi-statique
Les biofilms ont été formés à partir d’une eau de rivière pendant 28 jours, à 37 °C, dans des
microplaques 12 puits en polystyrène (Nunclon Microwell Plates, Nunc), en renouvelant l’eau
tous les 2 jours. Durant les 14 premiers jours de culture, les biofilms se sont développés dans
l’eau de rivière. Au 14ème jour, l’eau de rivière renouvellée a été supplémentée en L.
pneumophila concentrées à 106 bactéries/ml. Cette concentration a été choisie afin de mimer
un accident biologique. Différentes solutions ont également été rajoutées à l’eau de rivière le
14ème jour afin de modifier la disponibilité du fer dans le biofilm. L’eau de rivière a été
renouvelée ainsi, tous les 2 jours, jusqu’au 28ème jour du développement du biofilm. Les
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solutions ajoutées sont, du PPF (335 µM), un chélateur de fer ferrique, le DFX, concentré à 20
µM ou le chélateur de fer ferreux, DIP, concentré à 100 µM (Fig. 22).
Après 28 jours de culture, les biofilms ont été rincés 3 fois avec de l’eau ultra-pure stérile. Ils
ont ensuite été grattés au moyen d’un scalpel (Cell scrap) et repris dans 1 ml de PBS. Les
échantillons ont été centrifugés à vitesse maximale, à 4 °C, pendant 15 min. Le culot de
biofilm a été remit en suspension dans 200 µl de PBS, puis l’ADN en a été extrait.
Figure 22 : Représentation schématique de la méthode utilisée pour cultiver les biofilms
en condition semi-statique. Pendant les 14 premiers jours de culture, les biofilms se
développent dans des microplaques, l’eau de rivière est renouvelée tous les 2 jours. A T 14 j,
l’eau de rivière est supplémentée en L. pneumophila concentrées à 1 x 106 bactéries/ml, et en
PPF (335 µM), DFX (20 µM) ou DIP (100 µM). La culture des biofilms est prolongée de 14
jours, l’eau est renouvelée tous les 2 jours, supplémentée ou non avec les solutions citées
précédemment.
4.3. Culture des biofilms complexes en flux continu
La culture en « flow cell » (7,7 cm3, Stovall, Life science, Inc) a été testée afin de mimer au
mieux les conditions environnementales. Les « flow cell » ont été raccordés à un réservoir
d’eau de rivière au moyen de tubulures. Le montage a été réalisé de manière à travailler en
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circuit fermé. Une pompe péristaltique a été connectée afin d’ajuster la vitesse du flux d’eau à
230 ml/h (Fig. 23).
Les biofilms se sont développés pendant 14 jours dans l’eau de rivière, puis l’eau a été
supplémentée en L. pneumophila , concentrées à 1 x 106 bactéries/ml. La croissance des
biofilms a été prolongée pendant 14 jours, avant qu’ils soient observés en microscopie
confocale.
Figure 23 : Représentation schématique du montage réalisé pour la croissance des
biofilms en flux continu. L’eau de rivière contenue dans le réservoir circule dans les
« flow cell » grâce à une pompe péristaltique reliée au montage. Les biofilms se sont
développés pendant 14 jours dans l’eau de rivière, puis l’eau a été supplémentée en L.
pneumophila concentrées à 1 x 106 bactéries/ml. Le développement des biofilms c’est
poursuivi pendant 14 jours supplémentaires.
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5. Microscopie
5.1. Microscopie confocale
Les observations par microscopie confocale (Olympus Tokio Japan) ont été réalisées après
marquage au Syto 9 (Molecular Probes, InVitrogen), à l’objectif x20. Ce marqueur
fluorescent permet de visualiser toutes les bactéries Gram positif et négatif (vivantes ou
mortes). Les longueurs d’ondes d’excitation et de détection sont respectivement 488 nm et
500-530 nm.
Après l’ajout du Syto 9 (5 µM) et 15 min d’incubation à température ambiante et à
l’obscurité, les lames ont été observées. Cette technique de microscopie a été utilisée pour
observer les biofilms formés sur les lames de verre des « flow cell ».
5.2. Microscopie à illumination structurée (Apotome)
Les observations ont été réalisées avec un microscope à épifluorescence Axio Observer A1
(Zeiss) équipé d’un filtre spécifique pour le Syto 9, à l’objectif x32 (Zeiss). Les images ont
été prises en utilisant le logiciel Axiovision et traitées avec le logiciel Imagis 7.4.1.
Cette technique a été utilisée pour observer les biofilms formés dans les microplaques en
polystyrène. Pour le marquage, les puits ont été rincés avec de l’eau stérile, puis les biofilms
ont été marqués avec le Syto 9 (6,7 µM) mélangé à du Citifluor AF1 (Biovalley). Après 15
min d’incubation, les observations ont été réalisées directement dans les puits.
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6. Spectrométrie par torche à plasma
6.1. Principe
L’ICP (Inductively Coupled Plasma) est une technique d’analyse utilisée pour quantifier les
métaux dans des échantillons environnementaux. L’échantillon liquide est nébulisé puis
transmis dans un plasma d’Argon où il subit des transformations conduisant à une excitation
des atomes. Après excitation, les atomes contenus dans l’échantillon peuvent émettre de la
lumière dont la longueur d’onde leur est caractéristique. La lumière est ensuite analysée via
un spectromètre d’émission optique couplé à l’ICP (Optical Emission Spectrometer, Optima,
4300 DV). La mesure est basée sur le fait que chaque atome ionisé, lorsqu’il retourne à l’état
fondamental, émet un photon dont l’énergie est caractéristique de l’élément. La lumière émise
par le plasma est analysée par un ou plusieurs monochromateurs. Celle émise par l’élément
est alors détectée et mesurée, et son intensité est comparée à la lumière émise par le même
élément contenu dans un échantillon de concentration connue et analysée dans les mêmes
conditions.
Pour calculer les concentrations des principaux métaux dans les échantillons, une gamme
étalon est construite à partir des dilutions de deux solutions. L’une d’elle contient 40 mg/l
d’aluminium (Al), 2000 mg/ml de sodium (Na), 2600 mg/l de calcium (Ca), 600 mg/ml de
potassium (K), 1000 mg/ml de magnésium (Mg), 60 mg/ml de fer (Fe), 4 mg/ml de
manganèse (Mn). La seconde solution est composée de 40 mg/l de silice (Si).
6.2. Préparation des échantillons
Avant l’analyse par ICP, les biofilms cultivés en microplaques ont subit une étape de
minéralisation (ou dissolution acide).
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Pour cela, après élimination du milieu de culture, les biofilms ont été rincés avec de l’eau
ultra-pure de manière à éliminer tout ce qui n’était pas ancré à la matrice. Un mélange acide,
composé d’eau oxygénée (30%) et d’acide nitrique (60%), a été déposé au contact du biofilm.
Après 15 minutes d’incubation, la minéralisation a été réalisée à plus haute température (105
°C pendant 2 heures). Après cette étape, l’échantillon a été ramené à un volume connu pour
être analysé en ICP.
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Partie 3. Résultats
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1. Rôle du fer sur l’implantation de L. pneumophila dans les biofilms complexes
L’étude réalisée par Hindré et al., en 2008 a montré que le fer avait une influence sur L.
pneumophila et sa capacité à former des biofilms mono-espèces. Cependant, le modèle de
biofilm mono-espèce est très éloigné des conditions réelles et il était difficile d’obtenir des
biofilms facilement reproductibles avec L. pneumophila seule.
L’objectif de cette première partie était de mettre en place un modèle de biofilm complexe,
dans l’eau de rivière, afin de mimer au mieux les conditions naturelles, et de contrôler
l’implantation de L. pneumophila . Plusieurs conditions ont été testées. Comme le fer est un
élément clé pour la survie de L. pneumophila , nous avons modulé les concentrations en fer
dans l’eau de rivière afin de déterminer son impact sur la présence du pathogène dans les
biofilms complexes. L’eau a été supplémentée en fer ou en chélateurs de fer, le DFX
(chélateur de fer ferrique) ou le DIP (chélateur de fer ferreux). Dans cette étude, des mutants
ont également été testés pour leur capacité à s’implanter dans les biofilms. Ces souches sont
mutées sur des gènes codant des protéines impliquées dans le métabolisme du fer. La grande
majorité des résultats sont présentés dans la publication 1.
1.1. Mise en place du modèle de biofilm complexe
1.1.1. Mise en place des biofilms
Avant de commencer les différentes expérimentations sur la persistance de L. pneumophila
dans les biofilms, des études préliminaires ont été réalisées afin de définir un modèle de
formation de ces biofilms. Beaucoup de méthodes ont été développées pour établir des
biofilms mono-espèces ou des biofilms complexes. Le choix de la technique varie selon le
support que l’on souhaite utiliser et selon le milieu de culture. Les biofilms peuvent être
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formés dans un flux d’eau continu, en condition statique ou en semi-statique. La plupart des
biofilms qui ont déjà été mis en place avec L. pneumophila sont des biofilms mono-espèces,
formés dans un milieu de culture défini ou en BYE, en condition de flux ou statique. L.
pneumophila n’est pas un colonisateur primaire, ni majoritaire, ces biofilms mono-espèces
sont donc difficiles à obtenir.
Nous avons cherché à mettre au point un modèle de biofilms, facilement reproductible, et
plus proche des conditions naturelles dans lesquelles sont retrouvées les bactéries du genre L.
pneumophila et mimant les conditions de contamination d’un circuit d’eau. Pour cela, nous
avons choisi de former les biofilms dans de l’eau de rivière, à la fois dans des conditions de
flux, mais aussi dans des conditions semi-statiques (où l’eau est renouvelée tous les 2 jours).
Les deux types de biofilms obtenus présentent de grandes différences d’un point de vue
structural (Fig. 24). La croissance en flux génère un biofilm dont la structure est très
hétérogène. En effet, la totalité de la surface n’est pas recouverte, et la répartition des
microorganismes se fait le plus souvent en amas (Fig. 24A). Les biofilms obtenus en
conditions semi-statiques présentent une architecture très différente de celle observée pour les
biofilms formés en flux continu (Fig. 24B). En effet, ils sont formés par un enchevêtrement de
structures filamenteuses, donnant un aspect plus dense au biofilm. Néanmoins, certaines
zones restent plus sombres, zones où les microorganismes ne se sont pas implantés.
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Figure 24: Structure des biofilms formés dans l’eau de rivière en flux continu et en
condition semi-statique. Les biofilms ont été formés durant 28 jours, en flux continu (A) et
en condition semi-statique (B) (avec un renouvellement de l’eau tous les 2 jours). Au bout de
14 jours de formation, L. pneumophila a été ajoutée. Puis 14 jours plus tard, les biofilms ont
été observés au microscope confocale, après marquage au Syto 9.
1.1.2. Stratégie de dopage des biofilms
Dans cette étude préliminaire, nous nous sommes interrogés sur la stratégie à adopter lors de
l’apport en L. pneumophila dans les biofilms.
Comme décrit précédemment, les biofilms ont été préformés pendant 14 jours dans de l’eau
de rivière naturelle, puis L. pneumophila a été ajoutée. Dans une des conditions, la croissance
du biofilm est prolongée de 14 jours, avec un renouvellement de l’eau tous les 2 jours, mais
cette eau est systématiquement dopée en bactéries. Dans une seconde condition, la croissance
des biofilms est prolongée de 14 jours, l’eau a été renouvelée tous les 2 jours, mais sans avoir
été supplémentée en L. pneumophila . A la fin des 28 jours de culture, les biofilms ont été
récupérés. L’ADN a été extrait et le nombre de bactéries quantifié par PCRq.
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Figure 25 : Comparaison d’un ou plusieurs dopages sur la persistance de L.
pneumophila dans les biofilms complexes. Les biofilms ont été formés pendant 14 jours
dans de l’eau de rivière naturelle, renouvelée tous les 2 jours. Puis l’eau de rivière a été
supplémentée en L. pneumophila pendant 2 jours. Pendant les 14 jours de culture
supplémentaires, l’eau de rivière a été renouvelée tous les deux jours, supplémentée (A) ou
non (B) en L. pneumophila . Les données représentent la moyenne +/- l’erreur standard à la
moyenne de triplicats provenant de deux expériences indépendantes (DL : limite de détection)
(p > 0,05 (test Mann Whitney)).
Les résultats obtenus ont permis de constater une différence d’implantation de L.
pneumophila d’environ 2 log entre les biofilms formés dans l’eau dopées en bactéries tous les
2 jours (Fig. 25A) et ceux formés dans l’eau supplémentée une seule fois en L. pneumophila
(Fig. 25B).
Nous avons choisit de reproduire les biofilm formés dans de l’eau de rivière dopée une seule
fois en L. pneumophila car les quantités de bactéries détectées sont suffisantes, et une
contamination ponctuelle est plus représentative de ce qui se produit dans la réalité.
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1.2. Publication I : Role of iron in the persistence of L. pneumophila in complex
biofilms
La publication 1 présentée ci-dessous a été soumise dans le journal « Applied Environmental
Microbiology ».
Résumé : L. pneumophila est une bactérie ubiquitaire des environnements aquatiques,
principalement retrouvée au sein des protozoaires, mais aussi dans les biofilms. Le fer est l’un
des éléments indispensable à la croissance de ce pathogène. En 2008, une étude a été réalisée
au sein de notre équipe montrant une modulation de l’expression des gènes entre L.
pneumophila à l’état planctonique, et à l’état de biofilm. Dans cette même étude, l’ajout de
forte concentration en fer (1,25 g/l), dans le milieu de culture des biofilms, a révélé une
inhibition de leur développement. Le fer présente donc un rôle dans l’établissement de
biofilms mono-espèces de L. pneumophila .
Afin de mimer les conditions naturelles, nous avons développé un modèle de biofilms, formés
à partir d’eau de rivière. Dans un premier temps nous avons suivi l’implantation de la flore
bactérienne afin de vérifier la stabilité et la reproductibilité de notre modèle d’étude. Pour cela
nous avons réalisé, en parallèle, des observations microscopiques et des quantifications par
PCRq. Dès le deuxième jour de culture, les observations microscopiques ont indiqué une
implantation importante de la biomasse. Ces résultats ont été corrélés avec ceux obtenus par
PCRq. Les données ont permis de constater que dès le deuxième jour, la totalité de la
biomasse était déjà implantée et n’évoluait pas au cours du temps.
La persistance de L. pneumophila dans les biofilms a été étudiée dans des conditions où la
concentration en fer dans l’eau de rivière était modulée, par ajout de fer ferrique ou au
contraire par ajout de chélateurs, le DFX ou le DIP. La souche L. pneumophila 130b ainsi que
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plusieurs de ces mutants ont été testées, les mutations visant des protéines impliquées dans le
métabolisme du fer.
Dans un premier temps, la concentration en fer au sein des biofilms a été mesurée par ICP.
Les résultats suggèrent que le fer capté par les chélateurs serait resté piégé dans le biofilm
tandis que dans les biofilms formés en présence de pyrophosphate de fer, la concentration en
fer est nettement supérieure. Cette supplémentation n’a cependant eu aucun impact sur la
persistance de L. pneumophila , exceptée, et faiblement, sur celle du mutant ΔfeoB (protéine
FeoB impliquée dans le transport du fer ferreux).
L’ajout de DFX n’a eu aucun effet sur la présence de L. pneumophila dans les biofilms
contrairement au DIP, qui a induit une augmentation de la concentration. Il semblerait que le
fer ferreux ait un impact sur la persistance de L. pneumophila dans les biofilms, et ceci,
indépendamment des voies d’acquisition du fer. Le DIP pourrait avoir un effet direct sur L.
pneumophila, ou un effet indirect entrainant une modification de la composition microbienne
du biofilm. Des analyses par t-RFLP ont réfuté cette seconde hypothèse. L’ensemble des
résultats obtenus, suggèrent que le fer ferreux pourrait avoir un effet néfaste sur la persistance
L. pneumophila dans les biofilms.
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PUBLI CATION 1
Role of iron in the persistence of L. pneumophila
in complex biofilms
Soumise dans
« Applied Environmental Microbiology »
Page 113
Role of iron in the persistence of L. pneumophila in complex biofilms
Emilie PORTIER1, Joanne BERTAUX2, Jérôme LABANOWSKI3 & Yann HECHARD1#
1 Université de Poitiers, Laboratoire Ecologie et Biologie des Interactions, UMR CNRS 7267,
Equipe Microbiologie de l'Eau, Poitiers, France
Equipe Ecologie Evolution Symbiose, Poitiers, France
3 Université de Poitiers, UMR CNRS 7285, Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de
Poitiers, Poitiers, France
Running title: Iron and L. pneumophila persistence in biofilm
# Corresponding author
Address: Lab. Ecologie et Biologie des Interactions, UMR CNRS 7267
Equipe Microbiologie de l'Eau, Bat B36/37
1 Rue Georges Bonnet
TSA 51106
86073 POITIERS Cedex 9
Tél : +33(0)5.49.45.40.07
Fax : +33(0)5.49.45.35.03
Email : [email protected]
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ABSTRACT
Legionella pneumophila is a pathogenic bacteria found in water and more precisely in
biofilms. Iron is a key nutrient for L. pneumophila growth and has been suggested as
important for formation of biofilm by this bacterium. In this study, a model of complex
biofilm was developed during 28 days with river water. Quantitative PCR measurements
indicate that the number of total bacteria was rather steady over the 28 days while
microscopic observations describe a maturation of the biofilm during this period. In order to
study the role of iron on persistence of L. pneumophila in complex biofilm, the river water
was spiked with L. pneumophila and with either iron pyrophosphate or an iron chelator to
modulate iron availability. Iron pyrophosphate, or DFX chelator addition poorly modified the
persistence of L. pneumophila in the biofilms. On the contrary, DIP chelator had a beneficial
effect on the persistence of L. pneumophila in the biofilms. As DIP specifically chelates
ferrous iron, we hypothesized that DIP might protect L. pneumophila from deleterious effect
of ferrous iron, likely via production of reactive oxygen species. In conclusion, ferrous iron
seems important for biofilm development of L. pneumophila in complex biofilms. However,
further studies are necessary to better understand the role of ferrous iron on growth behavior
of this bacterium in the environment.
Page 115
INTRODUCTION
Legionella pneumophila is a waterborne bacterium responsible for legionnaire’s disease (1-3).
This bacterium is transmitted to man by inhalation of contaminated aerosols and has the
ability to grow within lungs, due to its potential resistance to macrophage phagocytosis (4, 5).
In the water environment, this pathogen can be found as planktonic cells and mainly as sessile
cells associated with biofilms (6-10). Biofilms are microbial sessile communities attached to a
substratum, embedded in a secreted extracellular matrix and exhibiting a specific phenotype
(11). In the environment, the majority of microorganisms live attached to surfaces, forming
complex biofilm structures (12, 13). It is not clear whether L. pneumophila is able to multiply
freely or not in biofilms (9, 10, 14). Rather, the main site of multiplication is likely within
protozoan hosts such as free living amoebae (13, 15). L. pneumophila is able to resist amoeba
phagocytosis and even to multiply within these amoebae (16). Iron is a critical nutrient for L.
pneumophila , as its growth depends on the presence of iron in its culture medium (17-20).
Also, iron plays a key role in pathogenesis (21, 22). Until now, several iron acquisition
pathways have been described in L. pneumophila, like the ferric iron pathway involving
lbtA/B/C/U genes (23-26), the ferrous iron pathway involving feoA/B genes (27), frgA gene,
involved in siderophore production (23, 24, 28), and iraA/B genes encoding proteins able to
transport iron loaded peptides in the cytoplasm (29). For a review on iron metabolism in L.
pneumophila see (21). Recently, we performed a transcriptomic analysis in iron limitation
conditions to identify new iron-regulated genes (30). In a previous study, we performed a
transcriptomic analysis in order to determine which gene expression was modulated between
planktonic and sessile cells (31). pvcA and pvcB genes were induced in L. pneumophila
biofilms. They were supposed to be related to iron metabolism as they share similarities with
genes involved in siderophore biosynthesis (pyoverdin) in Pseudomonas aeruginosa (32). In
Page 116
the same study, the addition of high iron pyrophosphate concentration was detrimental to L.
pneumophila biofilm formation (31). Thus, we hypothesize that iron would be important for
biofilm formation by L. pneumophila. This is indeed the case for other bacteria, but iron effect
was found to be either detrimental or beneficial, like with the model bacteria for biofilm
formation of P. aeruginosa (33, 34). This is not surprising as iron is a key nutrient for
bacteria, but in excess, iron may lead to the production of toxic compounds such as reactive
oxygen species. Thus, iron homeostasis should be finely tuned (35).
L. pneumophila behavior has been mainly studied in a mono- or multispecies biofilms (31,
36-39). Such biofilms are convenient for mechanistic studies but do not reflect the complexity
found in natural environmental biofilms. Indeed, L. pneumophila likely represents a minor
species in environmental biofilms and other bacteria may have an impact on L. pneumophila
occurrence within a complex biofilm and/or on iron availability. Thus, in order to better
understand L. pneumophila development in the environment a more complex model should be
established.
The aim of our study was to evaluate the role of iron in the establishment of L. pneumophila
in complex biofilms. A new model of complex biofilms was established with river water, in
order to be close to the natural conditions. L. pneumophila was spiked in river water and
biofilm formation was monitored, mainly using qPCR, with water supplemented with iron
pyrophosphate or iron chelators to modulate iron availability.
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MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains and growth conditions.
L. pneumophila 130b strain ATCC BAA-74 (also known as Wadsworth or AA100) and six L.
pneumophila 130b mutants, deficient in iron acquisition, were used in this study: NU269
(ΔfeoB), NU229 (ΔfrgA), NU244 (ΔiraB), NU302 (ΔlbtA), NU383 (ΔlbtU), NU311
(ΔlbtA;frgA) (Table1).
The L. pneumophila strains were cultured in filter-sterilized BYE (5 g/l ACES, 10 g/l yeast
extract; pH 6.9) supplemented with L-cysteine at 0.4 g/l and iron pyrophosphate at 0.25 g/l, at
37 °C, under agitation at 150-200 rpm. Solid medium BCYE was obtained by adding charcoal
(2 g/l) and agar (15 g/l) to non-filtered BYE. The resulting medium was autoclaved 15 min at
121 °C. And then, the medium was supplemented with L-cysteine and iron pyrophosphate as
above. When required, antibiotics were used at the following final concentrations: kanamycin
at 25 µg/ml, gentamicin at 2.5 µg/ml.
Table 1 : L. pneumophila mutants used in this study
Name
Mutated gene
Role of the protein
References
NU269
ΔfeoB
Inner membrane transporter of ferrous
iron to the cytoplasm
27
NU229
ΔfrgA
Intracellular protein involved in
siderophore production chelating Fe3+
23, 24, 28
NU244
ΔiraB
Inner membrane transporter of iron
loaded peptides to the cytoplasm
29
NU302
ΔlbtA
Intracellular protein
legiobactine production
NU383
ΔlbtU
Outer membrane receptor
complex legiobactin-Fe3+
NU311
ΔlbtA/frgA
Intracellular proteins both involved in
siderophore production
involved
of
in
the
23-26
26
24
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Biofilms formation.
Complex biofilms were formed in natural river water, sampled in the Vienne River (sampling
location 47° 12 45 North latitude, 0° 4 31 East longitude), in France. Their formation was
performed in polystyrene 12-wells microtiter plates (3.5 cm²) (Nunclon Microwell Plates,
Nunc), at 37 °C, during 28 days. The incubation temperature was chosen to mimic hot water
systems that could be infected by L. pneumophila . Every two days, the water was renewed.
During the first 14 days of culture, only river water was used for biofilm formation. Then
river water was spiked with L. pneumophila at 106 CFU/ml and supplemented or not with
ferric iron pyrophosphate at 335 µM, deferoxamine mesylate at 20 µM (DFX: Ferric iron
chelator) or 2,2’-dipyridyl at 100 µM (DIP: Ferrous iron chelator) and left for 2 days in the
plates. During the last 14 days, river water without L. pneumophila but supplemented or not
with ferric iron pyrophosphate (335 µM), DFX (20 µM) or DIP (100 µM) was renewed every
2 days.
Isolation of genomic DNA from biofilms.
After biofilm formation, wells from microtiter plates were washed three times with sterile
water to remove non-adherent cells and particles. Then biofilms were scraped off and
collected in 1 ml of sterile distilled water. DNA was extracted from biofilm suspensions using
a commercial kit (High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche) following the
manufacturer’s instructions.
Quantitative PCR.
Quantitative PCR assays were carried out using the LightCycler FastStart DNA MasterPLUS
Sybr Green I mix (Roche Applied Science) with a LightCycler 1.5 apparatus (Roche Applied
Science). The concentration of the total bacteria were analyzed by quantification of 16S
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ribosomal RNA gene using the primers 515F (5’ GTGBCAGCMGCCGCGGTAA 3’) and
786R (5’ CTACCAGGGTATCTAATC 3’) (Isenbarger et al., 2008). For the L. pneumophila,
specific primers were Mip A1 (5’ GCATTGGTGCCGATTTGG 3’) and Mip A2 (5’
G[CT]TTTGCCATCAAATCTTTCTGAA 3’), leading to an amplicon of 186 pb (41). The
PCR mixture contained 2 µl of sample DNA, 0.5 µl of each primer (final concentration 0.5
µM), 2 µl of Master Mix and PCR-grade sterile water to a final volume of 10 µl. The run of
quantification started with an initial denaturation at 95 °C during 10 min followed by 45
cycles of repeated denaturation (10 s at 95 °C), annealing (10 s at 60 °C), and polymerization
(10 s - 15 s at 72 °C). A positive control (L. pneumophila DNA) and a negative control
(purified PCR-grade water) were included in all PCR assays. A standard curve was obtained
with serial 10-fold dilutions of a known amount of L. pneumophila genomic DNA.
Microscopy.
Biofilm formation was followed using the fluorescence microscope Axio observer A1 (Zeiss)
using a filter specific for Syto 9 (Zeiss Filter Set 44), at 32x objective (Zeiss). Images were
taken using the Axiovision Software and processed with the Software Imagis 7.4.1. To stain
biofilms, wells were washed with sterile water to remove floating particles and planktonic
cells. Syto9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain 6.7 µM (Molecular Probes, InVitrogen),
mixed with Citifluor AF1 (Biovalley), was used to stain microorganisms in biofilms. After 15
min of incubation, biofilms were observed directly in wells.
Terminal restriction fragment length polymorphism (t-RFLP).
The diversity of the bacterial community in biofilms was analyzed by t-RFLP of 16S rRNA
gene. The primers 8F-FAM (FAM-5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’) labelled at the 5’end with 6-carboxyfluorescein (6-FAM), and 1492R (5’TACGGHTACCTTGTTACGACT
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3’) were used to amplify a 1500 bp fragment of the 16S rRNA gene (42). PCR reactions were
performed in 50 µl reaction mixture containing 1 X PCR Buffer, deoxynucleoside
triphosphate at a final concentration of 0.2 mM for each, MgCl2 at 1.5 mM, primer at a final
concentration of 1 µM for each, Go Taq®DNA polymerase at 1.25 U (Promega, USA), and 2
µl of a 0.5 ng/µl DNA diluted template. DNA amplification was performed with the “
Vapo.Protect Thermocycler ”(Eppendorf), using the following program: initial denaturation (2
min at 95 °C), followed by 30 cycles consisting of denaturation (45 s at 95 °C), annealing (45
s at 58 °C), extension (1 min at 72 °C) and a final extension (10 min at 72 °C). Amplified
DNA was checked by electrophoresis in 1% agarose gel in 0.5 X TBE (Tris Borate EDTA).
Fluorescently labelled PCR products (200 µl) were purified by using NucleoSpin ®Gel and
PCR Clean-up (Macherey-Nagel, Germany) and were eluted in a final volume of 30 µl.
Eighty ng of fluorescently labelled PCR products were digested with 2.5 U of HaeIII
(Promega) at 37 °C for 3 hours. The T-RFs (terminal restriction fragments) from the
amplified rRNA products were separated by electrophoresis with a model 3130 automated
sequencer (Applied Biosystems Instruments [ABI] Prism, USA) as follows. One of each
HaeIII-digested PCR product were mixed with 0.25 µl of GeneScan™ 500 ROX™ Size
Standard (Applied Biosystems, USA) and 18.75 µl of deionized formamide (Hi-Di™
Formamide). The sizes of the DNA fragments in the standard were 35, 50, 75, 100, 139, 150,
160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, and 500 bases. Each fluorescently labelled
HaeIII-digested PCR product was incubated at 95 °C for 3 min, chilled on ice prior
electrophoresis and were resolved by capillary electrophoresis in an ABI 3130 genetic
analyzer (Applied Biosystems Instruments, USA). T-RFLP electropherograms were analyzed
using the StatFingerprints Version 2 software (43). All t-RFLP profiles were aligned up to the
internal standard and to a common baseline. Profiles from 60 to 480 pb were normalized with
the minimum value equal to 0.
Page 121
Data obtained from the StatFingerprints software were converted into a data frame subjected
to Principal Component Analysis (PCA) providing an ordination of bacterial communities in a
factorial map based on the scores of the first two principal components. Statistical ellipses
representing 90% confidence were drawn over the replicates. PCA were performed using
ADE-4, R software (44, 45).
Iron quantification by Inductively Coupled Plasma (ICP).
After 28 days of growth, biofilms were washed with sterile water. Then an acidic mixture made of hydrogen peroxide (30% H2O2) and nitric acid (60% HNO3, Sigma-Dietrich) vol/vol
was added on each biofilms to dissolve them. The complete mineralization of biofilms was
achieved by heating at 105 °C for 2 hours. The amount of iron found in the different biofilm
samples was determined on a Perkin Elmer Optima 2000 DV ICP-OES (Inductively Coupled
Plasma - Optical Emission Spectrometer). Calibration solutions were used to calibrate the
instrument response with respect to analyte concentration. The calibration solutions were
prepared by diluting stock solution made of 40 mg/l Al, 2000 mg/ml Na, 2600 mg/l Ca, 600
mg/ml K, 1000 mg/ml Mg, 60 mg/ml Fe, and 4 mg/ml Mn (Multi Element Standard
CaPurAn, CPA CHEM).
Page 122
RESULTS
Kinetics of biofilm formation
Prior to follow the persistence of L. pneumophila in complex biofilms, we first set up a model
of complex biofilm formation with river water in microtiter plates. Biofilms were grown in
12-wells microtiter plates at 37 °C, with river water, renewed every 2 days, during 28 days.
To follow their establishment, biofilms were both analyzed by qPCR and microscopy. For
qPCR analysis, biofilms were harvested at different time points and total DNA were
extracted. Total bacteria were quantified by qPCR using 16S rRNA primers. Within the first 2
days of biofilms formation, the whole bacterial biomass was already established, around 1 x
107 GU/cm² of biofilm (Fig. 1).
Figure 1. Quantification of total bacteria in the biofilm over 28 days. Biofilms were
grown in microtiter plates with river water, renewed every 2 days, for 28 days, incubated at 37
°C, in static conditions. At different time points, biofilms were harvested. DNA was extracted
from biofilms. Total bacteria was estimated using 16S rRNA gene quantification by qPCR.
Data represent the mean +/- standard error of the mean (SEM) from triplicate of two
independent experiments.
Over the time, this concentration ranged between 1 x 107 and 1 x 108 GU/cm² of biofilm.
Therefore, the total bacterial biomass was rapidly established and rather steady over the time
course of the experiment.
Page 123
Microscopic experiments were performed to observe biofilms establishment and morphology.
Biofilms were washed and stained by Syto 9 after 2, 14, 21 and 30 days of biofilm formation.
Microscopic observations showed the establishment of the biofilm as early as 2 days of
incubation (Fig. 2).
Figure 2. Evolution of biofilm morphology over 28 days. Biofilms were grown in
microtiter plates with river water, renewed every 2 days, for 28 days, incubated at 37 °C, in
static conditions. At different time points (2 days, 14 days, 21 days) biofilm was stained with
Syto 9 and observed using fluorescence microscopy (size bar 200 µm).
By comparison with the biofilms observed at 14 days and at 21 days, there was an increase of
the complexity of the architecture and of the thickness of the biofilms. Beyond (at 28 days),
biofilms were too thick to take sharp images and the microscope adjustment was not possible.
Furthermore, biofilm structure was not uniform, on the whole surface (Fig. 2).
Page 124
Thus, over the course of biofilm formation, the bacterial number was rather stable while
biofilm structure was modified.
Impact of chelator supplementation on growth and iron concentration within biofilms
Iron chelator concentration was chosen by studying L. pneumophila growth at various
chelator concentrations. DFX, which preferentially chelates ferric iron, inhibited bacterial
growth at 10 and 20 µM (Fig. 3A). DIP, which preferentially chelates ferrous iron, inhibited
bacterial growth at 100 µM (Fig. 3B). These concentrations, corresponding to the minimum
inhibitory concentration (MIC), were used for further experiments.
Figure 3: Effects of DFX and DIP on L. pneumophila 130b growth. Bacteria were grown
in BYE unsupplemented with iron. The growth was followed by measure of the optical
density (OD) at 600 nm. At OD600nm 0.7 - 0.8, culture media was supplemented with different
iron chelator concentrations: (A) DFX and (B) DIP, in order to define their minimal inhibitor
concentration (MIC). Data represent the mean +/- standard deviation (SD) from triplicate of
three independent experiments.
Page 125
Iron concentrations in 28 days-old biofilms were determined in various set up conditions i.e.
control condition, supplemented with iron pyrophosphate, or supplemented with iron
chelators, DFX or DIP. In the biofilms formed only with river water (control condition), the
iron concentration was 799 µM/cm² (Fig. 4). In those grown with DFX or DIP, the
concentrations were in the same order, respectively 463 µM/cm² of biofilm and 2030 µM/cm²
of biofilm. Finally, the highest iron concentration was observed in biofilms formed with iron
pyrophosphate, 3.32 x 104 µM/cm² of biofilm.
Figure 4. Iron concentration in biofilms. Biofilms (BF) were formed with river water,
renewed every 2 days, for 28 days. At day 14, and for the next days, river water was
supplemented or not, with iron pyrophosphate (335 µM), DFX (20 µM) or DIP (100 µM). At
the end of the 28 days, biofilms were mineralized and iron concentrations were estimated
using ICP. Data represent the mean +/- SEM from triplicate of two independent experiments
(* p<0.05 ; **p<0.005 Mann Whitney test).
Role of iron on the persistence of L. pneumophila in complex biofilms
In order to test the role of iron in the establishment and persistence of L. pneumophila in
biofilms, biofilm formations were conducted with various L. pneumophila strains affected in
iron acquisition (L. pneumophila WT 130b versus its mutants (ΔfrgA, ΔiraB, ΔfeoB, ΔlbtA,
ΔlbtA/frgA and ΔlbtU)). Varying iron availability was achieved by supplementing the medium
or not with iron pyrophosphate, DFX chelator or DIP chelator. At the end of the experiment
Page 126
(28 days), biofilms were harvested by well scraping. DNA was extracted and analyzed by
qPCR to quantify L. pneumophila and total bacteria.
Iron supplementation had no significant effect on persistence in biofilm between all of the
strains, except for the feoB mutant, which quantity increased of about 1 log (p-value < 0.05,
Mann Whitney test) compared to the control condition (Fig. 5A). The L. pneumophila mutant
strains were found in the same amount as the wild type strain. The values ranged between 1 x
105 GU/cm² and 1 x 106 GU/cm² of biofilm. Besides, the addition of iron pyrophosphate
presented no significant effect on the persistence of total microbial community (Fig. 5B).
Figure 5. Effect of iron pyrophosphate on the persistence of L. pneumophila and total
bacteria. Biofilms were grown in microtiter plates with river water, renewed every 2 days,
and for 28 days. At day 14, L. pneumophila strains were added. And for the next 14 days,
river water was supplemented or not, with iron pyrophosphate (335 µM). At the end of 28
days, biofilms were harvested. DNA was extracted from biofilms. L. pneumophila (A) and
total bacteria (B) were estimated using mip and 16S rRNA genes quantification respectively,
by qPCR. Data represent the mean +/- SEM from triplicate of two independent experiments
(DL: detection limit) (** p<0.005 Mann Whitney test).
The influence of iron availability on L. pneumophila persistence in biofilm was also assessed.
The addition of DFX presented no significant effect on the establishment of L. pneumophila
in biofilm (Fig. 6A). It had no impact on the establishment of the different L. pneumophila
Page 127
mutant strains. On the contrary, the addition of DIP promoted L. pneumophila persistence in
biofilms: L. pneumophila concentration in biofilm increased significantly for all strains, by to
1 to 2 log (Fig. 6C). Besides, DFX and DIP had no significant effect on the establishment of
total bacterial biomass (Fig 6B-D). Thus DIP seems to have an effect that is independent of an
iron acquisition defect.
Figure 6. Effects of DIP and DFX on the persistence of L. pneumophila and total
bacteria. Biofilms were grown in microtiter plates with river water, renewed every 2 days, for
28 days. At day 14, L. pneumophila strains were added. And for the next 14 days, river water
was supplemented or not, with DFX (20 µM) (A-B) or DIP (100 µM) (C-D). At the end of 28
days, biofilms were harvested. DNA was extracted from biofilms. L. pneumophila (A-C) and
total bacteria (B-D) were estimated using mip and 16S rRNA genes quantification
respectively, by qPCR. Data represent the mean +/- SEM from triplicate of two independent
experiments (DL: detection limit) (* p<0.05 ; ** p<0.005 Mann Whitney test).
Page 128
Kinetic of L. pneumophila persistence in the presence of DIP
To further explain the DIP effect, a kinetic of L. pneumophila establishment during the 15
days after spiking was performed. After 16, 18, 21 and 28 days biofilms were harvested, DNA
extracted and L. pneumophila quantified by qPCR. Two days after spiking (day 16), the
concentration of L. pneumophila detected in biofilms formed without DIP, was maximum at
about 106 GU/cm² of biofilm (Fig. 7A). Interestingly, this concentration decreased during the
course of the experiment. However, this decrease was not observed in biofilms formed with
DIP (Fig. 7B). On the contrary, the concentration remained constant for the 14 days after the
addition of bacteria. It seems that DIP would help L. pneumophila to persist in these complex
biofilms either directly or indirectly.
Figure 7. Kinetic of establishment of L. pneumophila in biofilm with or without DIP (100
µM). Biofilms were grown in microtiter plates with river water, renewed every 2 days, for 28
days. At day 14, L. pneumophila 130b was added. And for the next 14 days, river water was
supplemented (B) or not (A), with DIP (100 µM). At different time points, biofilms were
harvested. DNA was extracted from biofilms. L. pneumophila was estimated using mip gene
quantification by qPCR. Data represent the mean +/- SEM from triplicate of two independent
experiments (* p<0.05 ; ** p<0.005 Mann Whitney test).
Page 129
Impact of iron on bacterial community structures in biofilms
As iron availability may have modified bacterial community structure, a t-RFLP analysis was
performed to compare microbial populations colonizing the different biofilms. The four
conditions were analyzed, i.e. control condition, with iron pyrophosphate, with DFX or DIP.
The principal component analysis (PCA) of t-RFLP profiles did not reveal any significant
discrimination between the bacterial communities within the different biofilms (Fig. 8). The
statistical ellipses indicating 90% confidence intervals drawn over the replicates of each
bacterial biofilm overlapped along PC1 and PC2. Low percentages of variance explaining
PC1 and PC2 were obtained. The structure of the bacterial community within biofilms was
not significantly affected by the different treatments. This result suggests that neither iron
pyrophosphate, nor DFX and DIP had a significant impact on bacterial community structure
at the end of the experiment.
Figure 8. Principal component (PC1 et PC2) factorial map generated from t-RFLP of
16S rRNA gene. Biofilms were grown in microtiter plates with river water, renewed every 2
days, for 28 days. At day 14, L. pneumophila 130b was added. And for the next 14 days, river
water was supplemented or not (), with iron pyrophosphate (335 µM) (), DFX (20 µM)
(⊞) or DIP (100 µM) (). At the end of the 28 days, biofilms were harvested. DNA was
extracted from biofilms. Bacterial community structure was analyzed by t-RFLP. Data
represent results from triplicates wells of one single representative experiment. Three repeat
Page 130
experiments gave similar results. Statistical ellipses drawn over the plot three replicates
represent 90% confidence. The percentages of explained variance for the first two principal
components are indicated in each ordination.
Page 131
DISCUSSION
L. pneumophila is a human pathogen found in natural and man-made aquatic habitats, where
it colonizes biofilms. Iron is one of the essential nutrients for bacterial growth, especially for
L. pneumophila and it also plays a central role for biofilm formation by various bacteria.
In a previous study, we have shown that expression of pvcA and pvcB genes, likely involved
in iron metabolism, was modulated between planktonic and sessile cells (31). In the same
study, we have shown that high iron concentration was detrimental to L. pneumophila biofilm
development. These results, together with the need of iron for L. pneumophila growth, suggest
that iron is likely important for the persistence of this bacterium in biofilm.
In order to be closer to natural conditions, we designed a model of biofilms in microtiter
plates with river water renewed every two days. Very few studies have been conducted on
complex biofilms. While it may be difficult to compare our results with data obtained in
monospecies biofilms, we believe that there is a need to test bacteria behavior in more
complex experimental design to better understand what is happening in the environment.
In a first step of our study, we checked whether the new model of complex biofilms was
stable, and reproducible. The kinetic performed to follow the establishment of the total
bacterial biomass shows that bacterial biomass was already high after two days. There was
little evolution over the course of the study, indicating that this model was rather steady. The
model of biofilms formation developed in this study lead to the formation of stable and
reproducible complex biofilms. However, microscopic observations revealed an increase of
the complexity of the architecture and of the thickness of the biofilms. Furthermore, the
biofilm structure was not uniform, on the whole surface. This would be explained by a
maturation of the biofilm where the number of bacteria was rather steady while the structure
and production of the extracellular matrix changed (46).
Page 132
Before testing the impact of iron supplementation or iron chelation on biofilm formation,
chemical analyses of biofilms show a high iron concentration in biofilms formed in river
water supplied with iron pyrophosphate while iron concentrations were lower, and close to
that of the control condition, with chelators. It suggests that the two chelators, DFX and DIP,
did not limit the fixation of iron in the biofilms. The highest effect observed for DIP, in
comparison to DFX and control experiments, suggests that the presence of this chelator may
favor the fixation of iron in the biofilm. Iron concentration was not highly modified but its
availability should be.
The main objective of our study was to test the impact of iron on the persistence of L.
pneumophila in biofilm. Accordingly different isogenic mutants of L. pneumophila 130b were
tested for their persistence in biofilm in order to known whether proteins involved in iron
metabolism were also involved in the persistence of L. pneumophila. Our results show that the
addition of iron pyrophosphate had no effect on the presence of L. pneumophila into the
biofilms, except for the ΔfeoB mutant which population increased of about one log. The
protein encoded by feoB gene, is involved in ferrous iron transport. Even if the effect was
minor, we could hypothesize that ferrous iron would be detrimental to persistence of L.
pneumophila in biofilms.
In the same conditions, we tested the addition of two chelators: DFX, a ferric iron chelator
and DIP, a ferrous iron chelator. Interestingly, DIP induced the persistence of all L.
pneumophila strains whereas DFX did not have any effect. This was surprising because it was
anticipated that chelators would prevent L. pneumophila to use iron and therefore have a
detrimental effect. Besides, there was no effect on the number of total bacteria in the biofilm.
Thus, it seems that ferrous iron has an impact on L. pneumophila persistence in biofilm, and
this independently from the iron transport genes. These findings lead to the hypothesis that
DIP might have a direct effect on L. pneumophila likely due to a decrease of reactive oxygen
Page 133
species (ROS) production. Indeed, ferrous iron is involved in the Fenton reaction that leads to
ROS production (47), these ROS having antimicrobial activity. Alternatively, DIP might have
an indirect effect via the modification of the biofilm population structure.
In order to know whether DIP induced proliferation of L. pneumophila into biofilms, a kinetic
of persistence of L. pneumophila into biofilms formed with or without DIP was performed. In
the absence of DIP, the number of L. pneumophila decreased over time. On the contrary, in
the presence of DIP, the concentration of L. pneumophila was rather steady. It suggests that
after the spike, the number of L. pneumophila normally decreased in the biofilm and that DIP
was able to prevent somehow this decrease. It seems the DIP induced persistence of L.
pneumophila into biofilms.
To check whether the bacterial population structure was changed by the addition of chelators
or iron pyrophosphate, we performed a t-RFLP experiment in presence of iron, DIP or DFX.
No significant differences between the bacterial communities of the different biofilms were
observed, suggesting that the population structure was not highly affected.
Accordingly, DIP might likely have a direct effect on L. pneumophila . We hypothesize that
DIP, by chelating ferrous iron, has a protective effect on L. pneumophila likely by inhibiting
production of ROS in the biofilm. The fact that only the ∆feoB mutant was affected in biofilm
formation supports this hypothesis. Also in our previous study, we have shown that an excess
of iron was detrimental to biofilm formation by L. pneumophila in a monospecies model (31).
In bacteria, iron homeostasis is tightly controlled (35) and a critical level of intracellular iron
serves as a signal for biofilm development (48). Thus, each bacteria species has its own
pathways to get iron in low concentration environment and to protect itself against excess of
iron. Thus, literature reports either a detrimental or a beneficial effect of iron on biofilm
formation by various bacteria.
Page 134
In conclusion, persistence of L. pneumophila in our complex biofilm model is modulated in
the presence of DIP, a ferrous iron chelator. It suggests that ferrous iron is a key molecule for
L. pneumophila survival in biofilms. Further experiments should be performed to describe the
role of ferrous iron in the production of ROS in L. pneumophila and how these ROS could be
used to control L. pneumophila growth.
Acknowledgments
Emilie Portier is supported by the Région Poitou-Charentes. We thank Anne Mercier for her
help with t-RFLP analysis.
Page 135
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48. Banin E, Vasil ML, Greenberg EP. 2005. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm
formation. Proc Natl Acad Sci U S A 102:11076-11081.
Page 139
1.3. Résultats complémentaires
1.3.1. Détection des amibes dans les biofilms
Les résultats obtenus suite à la quantification de L. pneumophila dans les biofilms formés en
présence de DIP, nous ont mené à poser l’hypothèse, que le DIP pourrait avoir un effet sur la
présence des amibes dans les biofilms, et ainsi, favoriser la multiplication de L. pneumophila
dans ces structures. Pour tester cette hypothèse, nous avons réalisé une PCRq, ciblant
spécifiquement les amibes (Amo 1400F/1540R ; Vahl 560F/730R ; Tableau 2), et nous avons
réalisé une comparaison entre des biofilms contrôle et ceux formés en présence de chélateur
DIP.
Figure 26 : Quantification des amibes dans les biofilms formés en présence de DIP. Les
biofilms ont été formés dans l’eau de rivière naturelle, pendant 14 jours. Puis, l’eau de rivière
a été supplémentée en DIP (100 µM) et en L. pneumophila, pendant 2 jours. Durant les 14
jours de culture supplémentaires, l’eau additionnée en DIP a été renouvelée tous les 2 jours. A
la fin des 28 jours de culture, les biofilms ont été récupérés. Les ADN ont été extraits, et
analysés en PCRq afin de quantifier spécifiquement les amibes. Les données représentent la
moyenne +/- l’erreur standard à la moyenne de triplicats de deux expériences indépendantes
(p < 0,05 (test Mann Whitney)).
Page 140
Les résultats obtenus n’indiquent pas de différence significative (test Mann Whitney) quant à
la présence d’amibes dans les biofilms formés en présence ou non de chélateur. Ce résultat
suggère donc que le DIP n’a pas une influence importante sur la présence d’amibes dans les
biofilms (Fig. 26).
1.3.2. Formation des biofilms à 20 °C
Les amibes se développent préférentiellement à des températures allant de 10 °C à 30 °C.
Nous avons testé la formation des biofilms à une température de 20 °C afin de favoriser la
prolifération des amibes. L’objectif était de comparer la persistance de L. pneumophila dans
des biofilms formés à 37 °C et à 20 °C.
Comme décrit précédemment, les biofilms ont été préformés pendant 14 jours dans de l’eau
de rivière naturelle, puis L. pneumophila a été ajoutée. La croissance des biofilms a été
prolongé de 14 jours, et l’eau a été renouvelée tous les 2 jours, mais sans avoir était
supplémentée en L. pneumophila . Trois souches ont été testées, la souche sauvage L.
pneumophila 130b, ainsi que deux de ses mutants, ΔfeoB et ΔlbtA. A la fin des 28 jours de
culture, les biofilms ont été récupérés. L’ADN a été extrait et quantifié par PCRq.
La formation des biofilms à 20 °C induit une baisse générale de la persistance de L.
pneumophila par rapport à 37 °C (Fig. 27). Elle varie significativement mais faiblement de
1,5 log pour la souche sauvage, et de 1 log pour la souche ΔfeoB. Il y a une baisse de presque l
log pour la souche ΔlbtA, mais ce résultat n’est pas significatif (test Mann Whitney). La
formation des biofilms à 20 °C ne favorise donc pas la croissance ou la persistance de L.
pneumophila dans notre modèle.
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Figure 27 : Comparaison de la persistance de L. pneumophila dans des biofilms formés à
37 °C ou à 20 °C. Les biofilms ont été formés pendant 14 jours, à 20 °C ou à 37 °C, dans de
l’eau de rivière naturelle, renouvelée tous les 2 jours. Puis l’eau de rivière a été supplémentée
en L. pneumophila pendant 2 jours. Pendant les 14 jours de culture supplémentaires, l’eau de
rivière a été renouvelée tous les 2 jours. Les données représentent la moyenne +/- l’erreur
standard à la moyenne de triplicats provenant de deux expériences indépendantes (*p < 0,05
(test Mann Whitney)).
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2. Rôle du fer sur l’expression des gènes de L. pneumophila
L’objectif de cette seconde partie était d’identifier les gènes modulés chez L. pneumophila ,
lors d’une carence en fer. Plusieurs gènes ont déjà été décrits comme étant contrôlés par le fer.
En réalisant cette étude nous avons cherché à en identifier d’autres gènes également modulés
par le fer. Une analyse transcriptomique a été réalisée afin de comparer l’expression des gènes
de L. pneumophila lorsque celle-ci subit une carence en fer. Parmi tous ceux qui ont été
modulés, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’un d’entre eux. Le gène
lpp_2867, encore inconnu de la littérature, a été mis en évidence, car il présentait en amont de
sa région promotrice, une boîte Fur, suggérant une régulation par le fer. Après avoir construit
le mutant de ce gène, des analyses ont été réalisées, afin de comprendre son rôle dans le
métabolisme du fer, ainsi que dans sa capacité à infecter des cellules hôtes, telles que les
macrophages et les amibes. L’implantation du mutant a également été testée dans les biofilms
complexes afin de voir si la protéine est nécessaire à la persistance de L. pneumophila dans
ces structures. D’autres gènes modulés ont permis de proposer l’hypothèse que la carence en
fer induisait le passage de L. pneumophila en phase transmissive. Nous avons donc cherché à
tester cette hypothèse par la réalisation d’autres expériences.
2.1. Publication 2: IroT/MavN, a new iron-regulated gene involved in Legionella
pneumophila virulence against amoebae and macrophages.
La publication 2 présentée ci-dessous a été acceptée dans le journal « Environmental
Microbiology ».
Résumé : Le fer est bien connu comme étant l’un des éléments indispensables à la croissance
de L. pneumophila dans l’environnement, mais également à l’intérieur de ces cellules hôtes.
Page 143
De nombreuses études ont été réalisées afin de comprendre comment cet élément est utilisé
par L. pneumophila, mais aucune approche globale n’a été entreprise.
Dans cette étude, une analyse transcriptomique a été effectuée, comparant l’expression des
gènes chez L. pneumophila Paris, dans des conditions de culture standard, ou dans des
conditions de carence en fer. De nombreux gènes ont été modulés et parmi eux, un nouveau
gène a été mis en exergue. Il s’agit du gène lpp_2867, induit par la carence en fer. Deux
souches mutées sur ce gène ont été construites afin de caractériser son rôle dans l’acquisition
du fer par L. pneumophila. Les expériences menées par la suite ont montré que le gène
lpp_2867 n’est impliqué ni dans la synthèse, ni dans l’utilisation des sidérophores. En
revanche, la croissance des mutants est altérée sur milieux appauvri en fer, et leur capacité à
capter le fer ferreux est diminuée. L’analyse de la séquence protéique du gène a révélé que
Lpp_2867 est une protéine de membrane, suggérant son implication dans le transport du fer
ferreux. La protéine a été nommée IroT, pour « Iron Transporter». Des tests d’infection ont
aussi été effectués. Les résultats ont permis de conclure sur l’importance de lpp_2867 dans
l’infection et la multiplication intra-amibes et intra-macrophages.
L’ensemble de ces résultats suggère que IroT a bien un rôle, direct ou indirect, dans le
transport du fer ferreux et dans la virulence de L. pneumophila .
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PUBLICATION 2
IroT/MavN, a new iron-regulated gene
involved in Legionella pneumophila virulence
against amoebae and macrophages
« Environmental Microbiology »
Page 145
IroT/mavN , a new iron-regulated gene involved in Legionella pneumophila virulence
against amoebae and macrophages.
Emilie PORTIER1, Huaixin ZHENG2, Tobias SAHR3, Denise M. BURNSIDE2, Celeste
MALLAMA2, Carmen BUCHRIESER3, Nicholas P. CIANCIOTTO2 and Yann HÉCHARD1*
Equipe Microbiologie de l'Eau, Poitiers, FRANCE
2 Department of Microbiology-Immunology, Northwestern University Medical School,
Chicago, IL, USA
3 Institut Pasteur, Biologie des Bactéries Intracellulaires and CNRS UMR 3525, Paris, France
* Corresponding author
Address: Lab. Ecologie et Biologie des Interactions, UMR CNRS 7267
Equipe Microbiologie de l'Eau, Bat B36/37
1 Rue Georges Bonnet
TSA 51106
86073 POITIERS Cedex 9
Tél : +33(0)5.49.45.40.07
Fax : +33(0)5.49.45.35.03
Email : [email protected]
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Summary
Legionella pneumophila is a pathogenic bacterium commonly found in water. Eventually, it
could be transmitted to humans via inhalation of contaminated aerosols. Iron is known as a
key requirement for the growth of L. pneumophila in the environment and within its hosts.
Many studies were performed to understand iron utilization by L. pneumophila but no global
approaches were conducted. In this study, transcriptomic analyses were performed, comparing
gene expression in L. pneumophila in standard vs. iron restricted conditions. Among the
regulated genes, a newly described one, lpp_2867, was highly induced in iron restricted
conditions. Mutants lacking this gene in L. pneumophila were not affected in siderophore
synthesis or utilization. On the contrary, they were defective for growth on iron depleted solid
media and for ferrous iron uptake. A sequence analysis predicts that Lpp_2867 is a membrane
protein, suggesting that it is involved in ferrous iron transport. We thus named it IroT, for iron
transporter. Infection assays showed that the mutants are highly impaired in intracellular
growth within their environmental host Acanthamoeba castellanii and human macrophages.
Taken together, our results show that IroT is involved, directly or indirectly, in ferrous iron
transport and is a key virulence factor for L. pneumophila .
Page 147
Introduction
Legionella pneumophila is a human pathogen responsible for Legionnaires’ disease, a serious
form of pneumonia (Fields et al., 2002). These Gram-negative bacteria are found in
freshwater environments, as well as in anthropogenic niches, like cooling towers, air
conditioning systems or hot water pipes (Borella et al., 2004; Koide et al., 1993). L.
pneumophila mainly multiplies within protozoa like amoebae (Rowbotham, 1980) and is also
able to colonize biofilms (Declerck et al., 2007). L pneumophila infects humans via inhalation
of contaminated aerosols (Steinert et al., 2002). Iron is a key nutrient for most bacteria in
particular for many pathogens (Leong et al., 1974; Ratledge & Dover, 2000; Reeves et al.,
1981; Schaible & Kaufmann, 2004; Weinberg, 1978). It is essential as a cofactor in various
enzymatic reactions like respiration, oxidative stress response or DNA replication, but can
also be a toxic element at elevated intracellular concentrations by catalyzing the Fenton
reaction. Thus, to better understand L. pneumophila growth in the environment and in the host
it is of primary importance to study how these bacteria are acquiring iron. It has been shown
that the ability of L. pneumophila to replicate in mammalian cells or in amoebae is dependent
upon iron (Cianciotto, 2007). This element is found in different chemical forms (i.e. ferric or
ferrous iron) for which bacteria have developed sophisticated pathways to assimilate it (Aisen,
1976b; Andrews et al., 2003).
In L. pneumophila , many genes are involved in iron acquisition pathways (for a review see
(Cianciotto, 2007)). The expression of most of them is regulated by the ferric uptake
regulator, Fur (Allard et al., 2006; Hickey & Cianciotto, 1994; Hickey & Cianciotto, 1997;
Liles et al., 2000). Fur forms a homodimer complex with ferrous iron and acts as a
transcriptional repressor by binding to specific DNA sequences (Fur boxes) in the operator
region of target genes (Escolar et al., 1999). Under low iron conditions, transcriptional
Page 148
repression is relieved, because ferrous iron is dissociated from the Fur complex, and affinity
for the Fur box is reduced.
For iron acquisition, many bacteria produce and secrete iron chelators, called siderophores
that are able to bind iron with high affinity. The ferric-siderophore complex is then
transported into the bacteria where the iron can be released in the cytoplasm. L. pneumophila
produces a siderophore named legiobactin (Liles et al., 2000) whose expression is dependent
on the lbtABC operon. The lbtA gene encodes a protein with high homology to siderophore
synthetases (Allard et al., 2006). Based on this homology, lbtA has been proposed to be
involved in the biosynthesis of legiobactin. The lbtB gene encodes a protein that is
homologous to members of the major facilitator superfamily (MFS) of multidrug efflux
pumps. Recently, it has been shown that LbtC is involved in the uptake of legiobactin and its
transport across the inner membrane (Chatfield et al., 2012). Also, the lbtU gene has been
described directly upstream of the lbtABC operon (Chatfield et al., 2011). Cell fractionation
experiments and in silico analysis indicated that LbtU is an outer membrane protein consisting
of a 16-stranded transmembrane-barrel, multiple extracellular domains, and a short
periplasmic tail. LbtU is a new type of receptor that likely participates in legiobactin uptake
(Chatfield et al., 2011). The Fur-regulated frgA gene encodes a protein that has sequence
similarity to LbtA. FrgA is not required for production of legiobactin but may be involved in
the production of another, yet-to-be-defined siderophore. FrgA mutants, unlike LbtA mutants,
are defective in macrophage infection suggesting a role for the protein in intracellular iron
acquisition (Allard et al., 2006; Hickey & Cianciotto, 1997; Liles et al., 2000). Another way
for L. pneumophila to assimilate ferrous iron is via the FeoA–FeoB complex. This inner
membrane complex participates in the ferrous iron transport and is involved in extracellular
growth and intracellular infection (Robey & Cianciotto, 2002). Also, L. pneumophila secretes
Page 149
a pyomelanin pigment that confers ferric reductase activity and thereby helps to promote
ferrous iron assimilation (Zheng et al, 2013).
In this study, we used a transcriptomic approach to investigate the effect of iron depletion on
the global gene expression in L. pneumophila and further analyzed the role of a newly
identified iron-regulated gene in iron acquisition and host cell infection.
Page 150
Results
Iron limitation results in induction of Fur-regulated and transmissive phase genes .
To identify additional iron regulated genes in L. pneumophila , we performed transcriptome
analyses using whole genome microarrays carrying all genes of strain L. pneumophila Paris
and Lens (Cazalet et al., 2004) and L. pneumophila strain Philadelphia (Chien et al., 2004) in
low iron medium. L. pneumophila Paris was grown in BYE-iron to OD600 0.8 and then the
iron chelator DFX 20 µM was added. After growth of 30 and 180 min in these iron-depleted
conditions, total RNA was isolated and used for microarray analysis. Microarray results are
based on three independent experiments hybridised in duplicates with dye swap. At 180 min,
113 genes were induced and 246 genes were repressed significantly (Supplementary Table S1
and S2 respectively). A selection of these genes is listed in Tables 1, 2 and 3.
Among the induced genes, those known to be regulated by iron were found the most highly
induced ones, already after 30 min of growth (Table 1). First, frgA (lpp_2846) corresponded
to the most highly induced gene in our conditions. FrgA is similar to LbtA and might be
involved in siderophore synthesis (Allard et al., 2006; Hickey & Cianciotto, 1997). Second,
lbtABC (lpp_1278-1280) were also highly induced. They are involved in the legiobactin
siderophore synthesis and transport (Allard et al., 2006; Chatfield et al., 2012). Third were
feoA and feoB (Chatfield & Cianciotto, 2007; Robey & Cianciotto, 2002) that form an operon.
FeoB is a ferrous iron transporter, important for extracellular and intracellular growth.
Fourth, lbtU (lpp_1281) encodes a legiobactin transporter allowing L. pneumophila to uptake
ferric iron (Chatfield et al., 2011). Fifth, the entire operon lpp_0651-0658 was induced, which
encodes proteins similar to SufABCDST and NifU. The Suf proteins are involved in ironsulfur cluster biogenesis (Roche et al., 2013). These clusters are found in the so called iron-
Page 151
sulfur proteins that are involved in various pathways such as electron transfer, redox catalysis
and regulation of gene expression (Py & Barras, 2010; Roche et al., 2013).
Many genes defined as transmissive phase genes (Bruggemann et al., 2006) were also induced
in our transcriptome results (Table 1). The transmissive phase of L. pneumophila is induced
due to nutritional deprivation, like it is the case at the end of the replication cycle within the
host. At this stage, bacteria become flagellated, more cytotoxic and infectious (Byrne &
Swanson, 1998; Molofsky & Swanson, 2004). Our data show that LetE and sigma 54 were
induced already in exponential growth phase as well as many genes involved in flagella
synthesis, suggesting that iron limitation triggers phase transition in L. pneumophila. Also,
enhC and rtxA expressions were significantly up-regulated. These genes have been described
to be involved in host entry (Cirillo et al., 2000). Finally, rir1 and rir2, encoding the
ribonucleoside diphosphate reductase, were induced even after 30 min. These enzymes are
usually iron-dependent and are involved in the reductive synthesis of deoxyribonucleotides
from their corresponding ribonucleotides. Recently, similar enzymes have been shown to be
also induced response to iron limitation in E. coli, these enzymes are Mn-dependent
(Andrews, 2011).
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Page 153
Iron limitation results in repression of translation and metabolic pathways.
Among the repressed genes, many are involved in protein biosynthesis (Table 2). Most
ribosomal proteins were repressed, even after 30 min. This suggests that iron limitation leads
to a quasi shutdown of the translation machinery. Also, many genes involved in membrane
bioenergetics (respiratory chain and ATP synthase) and in metabolism of carbon, lipids and
nucleotides were repressed (Table 3). Taken together, the genes identified as repressed
indicate that there is an arrest of the major metabolic activity in the bacteria in response to
iron limitation.
lpp_2867, a newly identified iron regulated gene
lpp_2867, which was not described to be regulated by iron in the literature, was actually one
of the highest induced genes (fold change 6.01 at 180 min) as seen by microarray analyses,
and was already induced even after 30 min (Table 1). As regulation of iron metabolism is
mainly controlled by the Fur regulator (Hickey & Cianciotto, 1994), we searched for Furboxes as described for E. coli, in the genome of L. pneumophila . Sequences highly similar to
putative Fur boxes were found upstream of genes already known to be iron regulated ( feoA,
frgA, lbtA, lbtU ) and, importantly, upstream of lpp_2867 (Fig. 1). Furthermore, when
comparing the location of the Fur-boxes and the transcriptional start sites (TSS) defined for
these genes by TSS mapping using directional RNAseq (Sahr et al., 2012) these correlated
perfectly. In order to confirm the regulation of these genes upon iron limitation, qRT-PCR
experiments were performed confirming the results obtained from our transcriptome analyses
(Table S3 Supporting information).
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Page 155
Page 156
Figure 1. Potential lpp_2867 Fur box as compared to the consensus Fur box. Alignments
of the putative Fur-boxes of all genes found to be iron-regulated are given. Conserved
residues are coloured in the same way.
Interestingly, a BLAST analysis shows that Lpp_2867 is conserved (identity >96%) in all L.
pneumophila genomes sequenced to date. This protein was also found in all Legionella sp.
genomes although less conserved (identity >56%) but not in other bacteria present in public
databases. This suggests that Lpp_2867 is a protein specific for the genus Legionella . The
ortholog of lpp_2867 in L. pneumophila 130b (98% identity), which is the best characterized
strain for iron metabolism, is designated lpw_30711. The genomic organization is conserved
in both strains (Paris and 130b) and they are monocistronic. Lpp_2867/Lpw_30711 is a
protein of 660 amino acids. The BLAST analysis predicted the presence of a conserved
domain of the DUF3816 family (Pfam database). This family of proteins includes membrane
transporters, suggesting that Lpp_2867/ Lpw_30711 might be a transporter.
lpw_30711 and lpp_2867 mutant strains are impaired in growth on iron-depleted solid
medium
In order to understand the role of lpw_30711 and lpp_2867, mutants of strains 130b and Paris
were made by allelic exchange. A gentamycin cassette was inserted in these two genes,
leading to disruption and deletion from positions 538 to 1326 of the genes. To determine the
capability of the mutants to grow on iron-restricted media, L. pneumophila Paris and 130b
were cultured on BCYE plates lacking iron supplementation with or without DFX (ferric iron
Page 157
chelator). The wild type strains and their mutants grew similarly on standard BCYE agar,
which is routinely supplemented with 0.25 g of ferric pyrophosphate per liter (Fig. 2A).
Figure 2. Growth of the lpw_30711 and lpp_2867 mutants is impaired on low iron BCYE
plates. Growth of L. pneumophila strains on BCYE plates with various amount of iron (A) on
standard BCYE plates, (B) on BCYE without iron supplementation, and (C) on BCYE
without iron supplementation and with 14 µM DFX. Dilutions of wild type 130b and Paris
strains, lpw_30771 and lpp_2867 mutants, or feoB mutant were spotted on each medium and
incubated for growth. To avoid interference between different strains, a single column of
each strain was spotted on one plate. The results are representative of three independent
experiments.
Page 158
The mutants also grew similarly to wild type when cultured on BCYE agar that lacks the iron
supplementation, suggesting that yeast extract contains traces of iron (Fig. 2B).
In contrast, an feoB mutant, used as a control, was impaired for growth on this medium.
Together, these data indicate that the mutants do not have a generalized growth defect.
However, the two mutants were impaired for growth on BCYE plates lacking iron
supplementation and containing DFX (Fig. 2C), indicating that the lpp_2867 / lpw_30711
gene is required for optimal growth on iron-depleted conditions in both strains. Besides,
complemented strains were tested in the same conditions and there was no evidence of
complementation (data not shown). It could be that plasmid copy was toxic and actually
reduced growth in these conditions. In summary, Lpw_30711 and Lpp_2867 are not
absolutely required for extracellular growth in bacteriological media but, as iron becomes
restricted in agar media, the proteins are needed for optimal extracellular replication.
Mutants are not defective for siderophore production or utilization
As a first step towards understanding the impaired growth of the lpw_30711 and lpp_2867
mutants on low-iron media, we tested the strains for production of siderophore (Fig. 3). For
this purpose, the different strains were grown in deferrated CDM at 37 °C leading to the
production of legiobactin, and then at 24 h post-inoculation the cell-free supernatants were
filter-sterilized. Siderophore activity in the supernatants was confirmed using the CAS
(Chrome Azurol S) assay, with DFX serving as the standard (Allard et al., 2006). The CAS
assay did not show significant differences for the siderophore production between the wild
type and the mutant strains (Fig. 3A).
Page 159
Figure 3. lpw_30711 and lpp_2867 mutants are not impaired in siderophore production
or utilization. (A) CAS assay comparing wild type and mutant supernatants for levels of
siderophore activity. Data represent the mean +/- SD of duplicate cultures. Siderophore
activity of the mutants was not statistically different from that of its parental strains after three
independent experiments. (B) Siderophore production: the bioassay was performed on both
wild type strains and their respective mutants. Supernatants of each strain were tested for
siderophore biological activity by examining their ability to promote the growth of the NU269
feoB mutant on non-iron supplemented BCYE agar. The results are representative of three
independent experiments. (C) Siderophore utilization: wild type 130b and Paris strains and the
corresponding lpw_30771 and lpp_2867 mutants were spread on BCYE agar without iron
supplementation and containing 10 µM DFX. A well was made at the center of each plate and
75 µl of deferrated CDM (upper row) or legiobactin-containing supernatant (lower row) were
added to each well. Growth was recorded after 6 days of incubation at 37°C. The results are
representative of three independent experiments.
Page 160
Subsequently, the supernatants of cultures where L. pneumophila WT and mutants had been
grown were assessed for legiobactin bioactivity by examining their ability to rescue the
growth of an L. pneumophila ferrous transport (feoB) mutant on BCYE plates without iron
supplementation. The mutant supernatants had bioactivity comparable to wild type (Fig. 3B).
In order to analyse the ability of the L. pneumophila strains to use legiobactin, each strain was
spread on BCYE plates without iron supplementation but containing 10 µM DFX. A well was
made at the centre of each plate and 75 µl of legiobactin containing supernatant was added to
each well. Negative-control wells contained equal volumes of deferrated CDM. The CASpositive supernatant facilitated the growth of the strains (Fig. 3C) in iron limited condition.
Taken together, our data suggest that mutants are not impaired for siderophore production or
utilization.
lpw_30711 and lpp_2867 are required for optimal acquisition of ferrous iron
As a next step towards investigating the role of lpw_30711 / lpp_2867 in iron metabolism, we
compared the wild type, mutant strains and complemented strains in ferrous iron uptake
assays. Both the lpw_30711 and lpp_2867 mutants were impaired for ferrous iron uptake, but
not as much as the feoB mutant (Fig. 4A-B). The lpw_30711 / lpp_2867 mutants incorporated
radioactive ferrous iron at a level that was significantly below that of the wild-type after both
60 min and 120 min (Fig. 4). Also, the addition of lpw_30711 or lpp_2867 in trans (plasmid)
allowed to complement the transport defect. In the complemented strains the transport of
ferrous iron was largely higher than in wild type strains suggesting that the number of gene
copy influenced iron transport. These data indicate that lpw_30711 / lpp_2867, directly or
indirectly, promotes acquisition of ferrous iron.
Page 161
Figure 4. The lpw_30711 and lpp_2867 mutants are defective for ferrous iron uptake.
Strains 130b (A) and Paris (B), their respective mutant strains lpw_30711 and lpp_2867 and
the complemented strains with plasmids EP 48 or EP 44 were grown in deferrated CDM, and
resuspended in buffer mixed with 55FeCl3. The feoB mutant was also used as a control. After
60 and 120 min of incubation, the levels of intracellular radiolabelled Fe2+ were determined.
Data represent the mean +/- SEM from triplicate, and the results are representative of three
independent experiments. (*** p < 0.001 (t-test)).
Page 162
Growth of the lpw_30711 and lpp_2867 mutants is impaired in macrophages and A.
castellanii
Because iron acquisition and iron-related genes are important for intracellular infection, we
examined the relative ability of the lpw_30711 mutant and lpp_2867 mutant to infect
macrophages or A. castellanii. Both hosts were infected with L. pneumophila and the growth
was followed for 72 hours by CFU count (Fig. 5).
Figure 5. The lpw_30711 and lpp_2867 mutants are defective for intracellular growth.
(A) Intra-macrophage (U937 cells) growth or (B) intra-amoebal (A. castellanii) growth of the
wild-type strains 130b and Paris, their respective mutant strains lpw_30711 and lpp_2867 or
the complemented strains with plasmids EP 48 or EP 44. Intracellular growth was monitored
by CFU determination. Data represent the mean CFU +/- SEM from triplicate wells. The
results are representative of three independent experiments (p < 0.05 at both the 24- 48- and
72-hour time points in (A) and 48- and 72-hour time points in (B) (t-test)).
Page 163
The two mutants clearly showed a defect in intra-macrophage growth (Fig. 5A). Indeed, they
hardly grew even after 72 hours. The lpw_30711 mutant exhibited a 10-fold reduced growth
compared to the 130b strain at 24 hours, increasing to 104-fold at 48 and 72 hours. Results
were similar for the Paris strain and its mutant. Both of the mutants also displayed a
significant growth defect compared to wild type in A. castellanii, although the difference
between the mutant and the parental strains was less pronounced than in macrophages (Fig.
5B). Finally, complementation restored partly the infection ability in both macrophages and A.
castellanii. Taken together, these data indicate that lpw_30711 / lpp_2867 are essential to
infect both macrophages and amoebae.
Page 164
DISCUSSION
Iron is an essential nutrient for bacteria and for L. pneumophila in particular. This bacterium
needs iron for extracellular as well intracellular growth. Many studies have described iron
metabolism in L. pneumophila but no global approaches have been performed yet. Thus, here
we undertook transcriptome analyses on the whole genome level to extend our knowledge of
the iron response and the number of iron-regulated genes in L. pneumophila . Our whole
genome expression analyses under iron limiting conditions indeed identified the genes, which
had been previously described as iron regulated and we also identified, a new iron regulated
gene, lpp_2867, for which we show that it plays an important role in growth and virulence of
L. pneumophila .
A general analysis of the transcriptional response of L. pneumophila to iron limitation
revealed that lack of iron leads to a shutdown of the translation machinery and to the
induction of many transmissive phase genes as defined previously (Bruggemann et al., 2006).
These results suggest that iron limitation triggers the stringent response, similar to that
triggered in response to amino acid or fatty acid limitation (Dalebroux et al., 2009; Edwards
et al., 2009). A similar effect of iron limitation on stringent response has been described for E.
coli (Magnusson et al., 2005; Vinella et al., 2005). The stringent response is regulated in
bacteria by RelA and SpoT, which produce under different stress conditions the alarmone
(p)ppGpp. SpoT is the enzyme implicated in response to iron (Dalebroux & Swanson, 2012;
Vinella et al., 2005). In L. pneumophila , (p)ppGpp activates the LetA-LetS two component
system and the alternative sigma factor RpoS, both involved in the switch to transmissive
phase. Indeed, LetA induces expression of two small RNAs (RsmY and RsmZ) that inhibit
the activity of the global repressor CsrA (Sahr et al., 2009). It leads to relieve expression of
transmission traits. In agreement with this hypothesis, CsrA was repressed and LetE induced
in our study. Also, flagella expression, a well defined transmission trait, was induced.
Page 165
Iron metabolism is regulated by the global repressor Fur, which binds promoters, at Fur
boxes, in presence of iron (Escolar et al., 1999). In case of iron limitation this repression is
relieved. Our study identified already known Fur-regulated genes and a new Fur regulated
candidate, lpp_2867. This gene is highly induced under iron-deficient conditions and
furthermore, exhibits a potential Fur box sequence upstream its transcriptional start site.
In addition to its iron-regulation, several lines of evidence indicate that lpw_30711 / lpp_2867
is involved in ferrous iron acquisition. First, mutants lacking lpw_30711 or lpp_2867 were
defective for growth on solid media depleted for iron by the addition of DFX, a ferric iron
chelator. The lpw_30711 and lpp_2867 mutants grew similarly to the wild type bacteria in
standard BYE broth and BCYE agar, indicating that this mutant phenotype was not the result
of a generalized growth defect. Second, iron uptake assays showed that the lpw_30711 and
lpp_2867 mutants have decreased ferrous iron accumulation, although their decrease in iron
assimilation was less pronounced compared to a feoB mutant. The fact that the two mutant
phenotypes were observed for two independently derived mutants confirms that the observed
phenotypes are due to inactivation of the lpw_30711 / lpp_2867 gene rather than spontaneous
second-site mutation(s). That the lpw_30711 / lpp_2867 gene is monocistronic in strain 130b
and strain Paris further indicates that the mutant phenotypes are due to the specific loss of
lpw_30711 / lpp_2867 rather than any polar effect of the mutation. To confirm this
complementation was performed and the complemented strains had a restored phenotype.
Thus, the lpw_30711 / lpp_2867 gene is required, directly or indirectly, for optimal
extracellular growth on low-iron agar media and ferrous iron uptake. The fact that DFXtreated broth cultures of the lpp_2867 mutant attained wild-type levels of growth by stationary
phase indicates the ability of other iron acquisition systems to compensate, in some cases, for
the defect in Fe2+ uptake. CAS assay revealed that lpw_30711 / lpp_2867 is not involved in
siderophore production. This result was confirmed by the bioassay, in which the CAS-positive
Page 166
supernatant from the mutants were able to rescue the growth of the feoB mutant. Thus,
Lpw_30711 / Lpp_2867 plays a conditional role in extracellular growth under iron depleted
conditions and appears to be specifically involved in ferrous rather than ferric iron
assimilation. Based upon bioinformatic analyses of the Lpw_30711 / Lpp_2867 protein and
the iron-uptake defect, we would hypothesize that under extracellular growth conditions
Lpw_30711 / Lpp_2867 promotes iron assimilation by being (part of) a membrane transporter
of ferrous iron or by facilitating the formation of such a membrane transporter.
Our in vitro infection data demonstrate the importance of the lpw_30711 and lpp_2867 genes
in intracellular replication. The lpw_30711 and lpp_2867 mutants exhibited a 104-fold
decreased intracellular growth in human U937 cell macrophages. A defect was also noted in
A. castellanii co-culture conditions, but less important than in macrophages. The fact that two
independent mutants showed this intracellular growth defect coupled with the monocistronic
nature of lpw_30711 / lpp_2867 indicate that Lpw_30711 / Lpp_2867 is required, directly or
indirectly, for optimal intracellular infection by L. pneumophila . In addition, the
complemented strains had a restored phenotype. With respect to its role in infection, the
simplest hypothesis would be that Lpp_2867 / Lpw_30711 promote the membrane transport
of ferrous iron that is needed for intracellular growth. However, the orthologous protein
(MavN) in the L. pneumophila Philadelphia strain has been implicated as a possible substrate
for the Dot/Icm type IV secretion system (Huang et al., 2011), suggesting that Lpw_30711 /
Lpp_2867 might be secreted under some circumstances. Summarizing the results of our
mutant analysis, the lpw_30711 / lpp_2867 gene is required, directly or indirectly, for optimal
i) extracellular growth in low-iron agar media, ii) ferrous iron uptake, and iii) intracellular
infection of macrophages and amoebae.
In conclusion, Lpp_2867 in strain Paris and its homolog Lpw_30711 in strain 130b are
controlled by iron concentration in a Fur-dependent manner and promote iron assimilation by
Page 167
aiding in ferrous iron transport. Importantly, Lpp_2867 / Lpw_30711 are involved in L.
pneumophila virulence, and it is proposed that the proteins might be involved in scavenging
ferrous iron from host cells. Therefore, we suggest naming these proteins IroT/MavN for iron
transporter.
Page 168
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains and growth conditions
L. pneumophila strain Paris CIP 107629T and strain 130b ATCC BAA-74 (also known as
Wadsworth or AA100) and the mutants were grown in filter-sterilized BYE (10 g/l ACES, 10
g/l yeast extract, 1 g/l alpha-ketogluturate, pH 6.9) supplemented with L-cysteine at 0.4 g/l
and iron pyrophosphate at 0.25 g/l (Sigma, St Louis, MO) or on solid medium BCYE, which
is obtained by adding charcoal (1.5 g/l) and agar (15 g/l) to non-filtered BYE and autoclaved
15 min at 121 °C. The feoB mutant was constructed by insertion of a kanamycin resistance
cassette via allelic exchange as described previously (Robey 2002). E. coli DH5α was used as
the host for recombinant plasmids and was cultured on Luria Bertani broth (10 g/l tryptone, 5
g/l yeast extract, 10 g/l NaCl) or agar (15 g/l agar). When appropriate, media were
supplemented with the following antibiotics at final concentrations suitable for L.
pneumophila : gentamicin 2.5 µg/ml, chloramphenicol 5 µg/ml, kanamycin 25 µg/ml and for
E. coli: chloramphenicol 30 µg/ml.
To compare the ability to grow on iron-restricted solid media, L. pneumophila were cultured
on BCYE plates lacking iron supplementation with or without iron chelator DFX
(Deferroxamine mesylate) as described previously (Chatfield et al., 2011). BCYE lacking the
iron supplement contains approximately 14 μM iron, as determined by the ferrozine assay
(Riemer et al., 2004). Bacteria were precultured for 3 days on standard BCYE agar and
suspended in filtered sterilized base buffer (10.466 g/l MOPS, 0.212 g/l KH2PO4, 2.926 g/l
NaCl, pH6.5) to 1x109 CFU per ml, and then 10 µl aliquots taken from 10-fold serial dilutions
in PBS were spotted on the BCYE plates, BCYE-Fe plates, or BCYE-Fe plates with 10, 12,
14, or 16 µM DFX. Growth was recorded after 5 days of incubation at 37 °C.
Page 169
Total RNA isolation
For the transcriptomic analyses, L. pneumophila Paris was grown in BYE without iron, under
shaking (170 rpm), at 37 °C. When cells reached late exponential phase (OD600 0.8), 20 µM
of DFX were added. After 30 min, 60 min and 180 min, 10 ml of suspension were collected
and cells were pelleted and resuspended in 400 µl of resuspension buffer (12.5 mM Tris, 5
mM EDTA and 10% glucose). Then, 500 µl of acid phenol (pH 4.6) and 0.4 g of glass beads
(0.2–0.3 mm diameter; Sigma) were added. The cells were sheared mechanically using a
Fastprep apparatus (Thermo scientific). After centrifugation at 13,000 g for 5 min, the
supernatant was transferred to a fresh tube, and 1 ml of Trizol reagent (Invitrogen) was added.
The sample was incubated for 5 min at room temperature. Total RNA was extracted twice
with chloroform.
Microarray hybridization and data analysis
RNA was prepared in triplicates (three independent cultures) and each RNA sample was
hybridized twice to the microarrays (dye swap). RNA was reverse-transcribed and labelled
with Cy5 or Cy3. The design of microarrays containing gene-specific 70 mer oligonucleotides
based on all predicted genes of the genome of L. pneumophila strain Paris (CR628336) and its
plasmids (CR628338) was previously described (Bruggemann et al., 2006). Hybridization was
performed following the manufacturers’ recommendations (Corning) using 250 pmol of Cy3and Cy5-labelled cDNA. Slides were scanned on a GenePix 4000A scanner (Axon
Instruments). Laser power and/or PMT were adjusted to balance the two channels and the
resulting files were analysed using Genepix Pro 4.0 software. Spots were excluded from
analysis in case of high local background fluorescence, slide abnormalities or weak intensity.
Page 170
Quantitative RT PCR
Quantitative RT PCR was performed on a LightCycler (Roche), using the LightCycler
FastStart RNA MasterPLUS Sybr Green I kit (Roche), according to the manufacturer’s
instructions. The 16S rRNA gene was used as a reference gene to normalize gene expression.
The level of the gene expression was assessed by determining the crossing point (Cp), cycle at
which the amplification curve crossed the detection threshold. According to the study of
Livak (Livak & Schmittgen, 2001), the relative changes in gene expression were determined
by calculating 2-ΔΔCp, with ΔCp = Cp target gene - Cp reference gene (16S) and ΔΔCp = ΔCp
sample 1 – ΔCp sample 2.
lpw_30711 and lpp_2867 mutant constructions
L. pneumophila is naturally competent thus transformation and subsequent homologous
recombination of a DNA construct can be used for mutant construction (Lomma et al., 2010).
To prepare these naturally competent cells, bacteria were grown on standard BCYE agar for
three days at 37 °C, a colony was inoculated in BYE to obtain an OD600 0.01, and incubated at
37 °C, under agitation (170 rpm), up to the late exponential phase. For transformation, the
antibiotic cassette flanked by 500 bp upstream and downstream the gene to mutate, was
constructed by 3-step PCR using the one Taq Hot Start DNA polymerase (New England
Biolabs Inc). The first step was the amplification of the upstream and the downstream
extremities of the gene lpp2867. Primers used to perform the amplification of the upstream
extremity were lpp2867-F1 (5’ GTTGGAGCAAGCCTGATAC 3’) and lpp2867-Gent-R1 (5’
CTGGGTTCGTGCCTTCATCAAAGGCCGGCAACTAAACTAAA 3’). The 3’ extremity of
the reverse primer has complementarity with the upstream region of the gentamicin cassette.
Primers used to amplify the downstream extremity of the gene lpp_2867 are lpp2867-Gen-F2
(5’ CCTAACAATTCGTTCAAGCCGTGACCTACAATGCCGTTACCG 3’) and lpp2867-
Page 171
R2 (5’ CAACGAGTGCGGAAAGAATC 3’). The 5’ extremity of the forward primer has
complementarity with the 3’ extremity of the gentamicin cassette (Rolando et al., 2013). To
amplify
the
gentamicin
cassette,
the
two
primers
K7-Gent-F1
(5’
TTTAGTTTAGTTGCCGGCCTTTGATGAAGGCACGAACCCAG 3’) and K7-Gent-R1 (5’
GGTAACGGCATTGTAGGTCACGGCTTGAACGAATTGTTAGG 3’) were used. Then
the three PCR fragments (10 nM for each fragment) were mixed, followed by a PCR
amplification using the flanking primers (lpp2867-F1 and lpp2867-R2). The amplicon at the
correct size was gel purified and 10 µg of linear DNA containing the recombinant allele
carrying the antibiotic cassette (1885 pb) were added to the competent cells. After 24 hours at
30 °C, without shaking, potential mutants were selected on BCYE agar containing gentamicin
(2.5 µg/ml). To confirm homologous recombination and correct mutant construction, PCR
amplification was performed with primers lpp2867-F3 (5’ TCCAAATACGCCAGGGAAC
3’) and lpp2867-R3 (5’ TGGCAGAACAATCCCAGAG 3’).
Complementation of the lpw_30711 and lpp_2867 mutants
In order to complement mutant strains, a 2.2 kb fragment containing either the lpp_2867 or
lpw_30711 gene with their promoter was amplified with primers lpp2867-pro-comp-XbaI-F
(5’ TCTAGAGATACTACCTGATGAAACGAAT 3’) and lpp2867-comp-XbaI-R (5’
TCTAGAGTAAGGAGTATCATTAACTGAAC 3’). The amplicons were cloned into
pGemTeasy (PROMEGA; Madison, WI) to yield pEP12 and pEP19, encoding lpp_2867 and
lpw_30711, respectively. These fragments, lpp_2867 and lpw_30711 genes, were transferred
on XbaI fragments into pMMB2002, chloramphenicol resistant, to yield pEP44 and pEP48
plasmids.
Competent L. pneumophila cells were prepared as follows: L. pneumophila were grown on
standard BCYE for three days and inoculated in 50 ml of BYE at 108 cells/ml, under shacking
Page 172
(170 rpm), over night, at 37 °C. When cells were in stationary phase, cells suspensions were
centrifuged (5,000 g for 15 min at 4 °C). The supernatant was discarded and pellets were
washed four times with half a volume of cold 10% glycerol solution. Finally, cells were
concentrated at 1011 cells/ml in glycerol solution. For transformation, cells were transferred
into a cold electroporation cuvette, and 1 µg of purified plasmid was added. Electroporation
was performed using a Biorad Micropulseur apparatus (2.5 kV). After the pulse, cold BYE
was added and cuvettes were incubated at 37 °C, without shaking. After two or three hours,
100 µl of suspension were spread on BCYE plates containing 5 µg/ml of chloramphenicol.
Transformants were confirmed by the presence of plasmid DNA by electrophoresis on 0.8%
agarose gel.
Chrome Azurol S (CAS) assay to analyze siderophore production
In order to assess siderophore production, L. pneumophila strains were grown in deferrated
CDM (Reeves et al., 1983), at 37 °C, under shaking (225 rpm) for 18 – 24 h. Supernatants
were collected after centrifugation (5,000 g for 10 min) and filtered (0.2 µm). Siderophore
activities were quantified using the CAS assay, with DFX serving as standard (Allard et al.,
2006; Allard et al., 2009; Liles et al., 2000). Supernatants were tested for siderophore activity
by examining their ability to promote the growth of the NU269 feoB mutant on non-iron
supplemented BCYE agar (Allard et al., 2009). The gene feoB encode an intra-membrane
Fe2+ permease and thus the mutant NU269 is defective for uptake of Fe2+ but not Fe3+ (Robey
& Cianciotto, 2002). The mutant’s growth deficit can be reversed by the addition of Fe3+ salt
or supernatant containing siderophore.
Page 173
Siderophore utilization
In order to determine the ability to utilize legiobactin, bacteria (130b, lpw_30711, Paris and
lpp_2867) were pre-cultured on BCYE plates for 3 days, suspended in base buffer, and 1x104
CFU were spread on each BCYE plate (data not shown) or BCYE plate without iron
supplementation but containing 10 µM DFX. A well was made at the center of each plate, and
75 µl of supernatants containing legiobactin obtained from wild-type cultures grown in
deferrated CDM, were deposited into the wells. Negative-control wells contained equal
volumes of deferrated CDM. The plates were cultured for 6 days at 37 °C (Chatfield et al.,
2012).
Iron uptake
Following the method used by Zheng et al., bacterial strains were previously grown in noniron supplemented BYE broth until OD660 1.0 (Zheng et al., 2013). Bacteria were centrifuged
at 5,000 x g, washed, and resuspended in deferrated CDM medium to an OD660 of 0.3. After
13 hours of incubation, at 37 °C, with shaking (225 rpm), the bacterial cultures were
centrifuged and washed three times in base buffer (50 mM MOPS, 2 mM monobasic
potassium phosphate, 50 mM sodium chloride, pH 6.5). The final bacterial pellets were
resuspended in base buffer to an OD660 of 1.0, and 55FeCl3 (PerkinElmer, Boston, MA) in 10
mM HCl was added to a final concentration of 1 µCi/ml (37 kBq/ml). Vitamin C was added to
a final concentration 1 mM to reduce ferric iron to ferrous iron, and allow the measure of
ferrous iron uptake. After 0, 60, 120 min of incubation at room temperature, 1 ml of the
suspension (n=3) was filtered through a 0.45 µm-pore-size nitrocellulose membrane
(Millipore, Billerica, MA) and washed with 5 ml of 0.5% thioglycolic acid solution. The
number of counts per minute (cpm) of radioactivity associated with the bacteria was measured
with a Beckman LS6500 scintillation counter, and the mean of the counts per minute over a 5
Page 174
min period was recorded. The experiment was done three times and similar results were
obtained.
Infection assays
Assessment of the ability of the different L. pneumophila wild type and mutant strains to
establish an intracellular infection was performed in both human U937 macrophages (ATCC
CRL-1593.2) and A. castellanii (ATCC 30234). Growth kinetics of L. pneumophila in U937
macrophages were recorded as described previously (Robey & Cianciotto, 2002; Viswanathan
et al., 2000). Briefly, U937 macrophages were cultivated in RPMI 1640 medium with L-
glutamine (Cellgro) supplemented with 10% fetal bovine serum (Atlanta Biologicals) in a 5%
CO2 incubator, at 37 °C. 106 adherent U937 cells were infected with bacteria at a multiplicity
of infection (MOI) of 0.5. The bacterial inoculums had been grown for three days on BCYE
agar. After 2 hours, required to allow the bacterial internalization, extracellular bacteria were
removed by repeated washing, and then infected monolayers were incubated at 37 °C in a 5%
CO2 incubator. At 24, 48 and 72 hours post-inoculation, intracellular bacteria were released by
lysis of the monolayers with 10 µl of 10% saponin (Sigma). For estimation of viable cell
counts, serial 10-fold dilutions from triplicate wells for each strain were plated on standard
BCYE agar.
To perform co-culture with A. castellanii, amoebae were cultured in buffer made of 2%
protease bacto peptone, 0.1% yeast extract, 4 mM MgSO4, 0.5 M CaCl2, 0.1% sodium citrate
dihydrate, 0.05 mM Fe(NH4)2(SO4)2. 6 H2O, 2.5 mM Na2HPO4 dibasic, 2.5 mM KH2PO4
monobasic, pH 6.5, supplemented with 0.1 M of glucose. To harvest the amoebae, cultures
were centrifuged and pellets were resuspended in buffer without glucose, to a concentration of
1 x 105 cells/ml. 1 ml was placed in each well of a 24-wells culture dish (NUNC), and was
incubated at 35 °C. The amoebae were allowed to adhere to the wells before the addition of
Page 175
the bacteria. Next, 1 ml of 104 CFU/ml bacteria was added in each well. And for estimation of
viable cell counts, serial 10-fold dilutions from triplicate wells for each strain were plated on
standard BCYE agar.
Acknowledgments
Work in the Buchrieser lab was supported by the Institut Carnot-Pasteur MI, the Fondation
pour la Recherche Médicale (FRM), the French Region Ile de France (DIM Malinf) and grant
ANR-10-LABX-62-IBEID. Work in the Cianciotto lab was funded by NIH grant AI034937.
We thank Jessica Tyson for her help during experiments of amoeba infection. Emilie Portier
is supported by the Région Poitou-Charentes.
Conflict of interest
None to declare
Page 176
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2.2. Résultats complémentaires
2.2.1. Analyse de l’expression des gènes de L. pneumophila cultivée en milieu
BYE vs BYE sans fer
Dans la publication n°2, nous avons présenté les résultats d’analyses transcriptomiques
réalisées sur L. pneumophila cultivées dans du BYE pauvre en fer comparé à L. pneumophila
cultivées dans le même milieu mais chélaté en fer. Une autre comparaison avait été réalisée en
parallèle. Il s’agissait d’analyser la modulation de l’expression des gènes entre L.
pneumophila cultivées en milieu BYE pauvre en fer et L. pneumophila cultivées dans un
milieu BYE. Aucun gène ne présente d’expression significativement modifiée entre ces deux
conditions de culture (résultats non montrés). Pour expliquer ce résultat, des tests de
croissance de L. pneumophila, en milieu liquide, ont été réalisés afin de comparer la
prolifération des bactéries dans un milieu BYE sans fer, et du BYE standard. Les courbes de
croissance obtenues sont similaires (Fig. 28). Des analyses chimiques ont par la suite été
réalisées et ont permis de révéler la présence de fer dans le milieu BYE pauvre en fer. La
concentration mesurée est de 11 µM de fer total. Finalement, la quantité de fer déjà existante
dans le milieu semble être suffisante pour la croissance des bactéries. L’ajout de fer dans le
milieu n’a pas d’effet ni au niveau de la croissance, ni au niveau de l’expression des gènes. La
croissance de L. pneumophila se déroule en deux phases. La première est la phase réplicative
durant laquelle les bactéries prolifèrent. Elles sont non flagellées, résistantes au NaCl, mais
sensibles au stress oxydant et à la pression osmotique. Lorsque le milieu de culture commence
à s’appauvrir, les bactéries entrent en phase transmissive. A cet instant, les bactéries sont plus
mobiles, résistantes à la pression osmotique, sensibles au sodium et résistantes au stress
Page 188
oxydant. Elles présentent également un fort potentiel d’infectivité. Nous avons donc effectué
quelques tests afin de vérifier notre hypothèse.
Figure 28 : Comparaison de la croissance de L. pneumophila dans du milieu BYE
standard ou carencé en fer. La croissance de L. pneumophila a été effectué dans du milieu
BYE standard et dans du milieu BYE non supplémenté en fer, à 37 °C, et sous agitation à 170
rpm. Le suivi de la croissance a été réalisé par mesure de DO à 600 nm pendant 72 h.
L’inoculum de départ a été fixé à 107 UFC/ml.
Ces courbes représentent les résultats d’un suivi de croissance, qui a été répété trois fois.
2.2.2. Relation entre la carence en fer et le passage de L. pneumophila en phase
transmissive
Lors de l’analyse transcriptomique réalisée sur L. pneumophila cultivée dans un milieu de
culture carencé en fer, plusieurs gènes ayant trait à la phase transmissive (Table 1, Publication
2). Ces résultats, nous ont amené à poser l’hyptothèse que la carence en fer induirait le
passage en phase transmissive de la bactérie.
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La croissance de L. pneumophila se déroule en deux phases. La première est la phase
réplicative durant laquelle les bactéries prolifèrent. Elles sont non flagellées, résistantes au
NaCl, mais sensibles au stress oxydant et à la pression osmotique. Lorsque le milieu de
culture commence à s’appauvrir, les bactéries entrent en phase transmissive. A cet instant, les
bactéries sont plus mobiles, résistantes à la pression osmotique, sensibles au sodium et
résistantes au stress oxydant. Elles présentent également un fort potentiel d’infectivité. Nous
avons donc effectué quelques tests afin de vérifier notre hypothèse.
2.2.2.1.
Impact de la carence en fer sur l’expression des gènes exprimés lors
du passage en phase transmissive
L’analyse transcriptomique réalisée et présentée dans la publication 2, a révélé plusieurs
gènes spécifiques de la phase transmissive sont induits lors d’une carence en fer.
Parmi ces gènes (Tableau 5), nous pouvons citer les gènes lpp_0541 et lpp_0542-rpoN
codant le facteur sigma 54, impliqué dans la voie de biosynthèse des flagelles. Le gène
lpp_0602-letE code la protéine LetE, un régulateur du changement de phase. D’autres gènes
impliqués dans la biosynthèse des flagelles sont induits : lpp_1224-flgB, lpp_1230-flgH,
lpp_1294-flaA, lpp_1723-fliG, lpp_1725-fliE et lpp_1726-fleR.
Finalement, les gènes codant les protéines EhnC et RtxA ont également été induit par la
carence en fer. Au contraire, le gène lpp_0845-csrA, codant la protéine qui réprime le passage
des bactéries en phase transmissive, a été réprimé. Ces résultats suggèrent qu’une carence en
fer déclenche la réponse stringente, similaire à celle déclenchée par une carence en acides
aminés.
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Tableau 5 : Gènes de la phase transmissive régulés lors de la carence en fer
Gènes
FC
lpp_0542-rpoN
Description
Similar to putative sigma-54 modulation
protein
RNA polymerase sigma-54 factor (sigma-L)
lpp_0602-letE
Transmission trait enhancer protein LetE
1,57
lpp_1224-flgB
Flagellar basal-body rod protein FlgB
1,61
lpp_1230-flgH
Flagellar L-ring protein precursor FlgH
1,52
lpp_1294-flaA
Flagelline
1,32
lpp_1723-fliG
Flagellar motor switch protein
1,39
lpp_1725-fliE
Flagellar hook-basal body complex protein
1,60
lpp_1726-fleR
Similar to two-component response regulator
1,38
lpp_0699-rtxA
Structural toxin protein RtxA
1,24
lpp_2692-enhC
Enhanced entry protein EnhC
1,30
lpp_0845-csrA
Global regulator CsrA
0,78
lpp_0541
2.2.2.2.
1,64
1,25
Test de résistance au NaCl
Le but de ce test était de vérifier si carencer le milieu en fer par l’ajout de chélateur, modifiait
la résistance des bactéries au sodium. L. pneumophila a été cultivée dans du BYE non
supplémenté en fer, jusqu’à DO 0,8. Le milieu de culture des bactéries a ensuite été
supplémenté en fer (sous la forme de pyrophosphate de fer, 335 µM), ou avec des chélateurs
de fer, DFX ou DIP. Avant le traitement (t0), puis après 2 heures (t2h) et 4 heures (t4h), les
suspensions bactériennes ont été prélevées, des dilutions sérielles ont été réalisées et déposées
sur géloses de BCYE et BCYE + NaCl (100 mM).
Sur milieu BCYE, quel que soit le traitement appliqué aux cultures de L. pneumophila , la
croissance est inchangée entre le t0 (avant le traitement) et après 2 heures de traitement (Fig.
29A). Après 4 heures, il y a une perte d’1 log de croissance pour les bactéries traitées avec les
chélateurs.
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Figure 29 : Effets de la carence en fer sur la résistance de L. pneumophila au NaCl (100
mM). L. pneumophila est cultivée dans du BYE – Fer (Condition contrôle) jusqu’à DO600 0,8.
Puis le milieu de culture a été supplémenté en Fer (335 µM), en DFX (20 µM) ou en DIP (100
µM). Avant le traitement (t0), puis 2 heures (t2h) ou 4 heures (t4h) après l’ajout des
différentes solutions, des prélèvements ont été effectués, les suspensions bactériennes ont été
diluées et déposées sur géloses BCYE (A) et BCYE + NaCl (100 mM) (B). (Figure
représentative de trois expériences indépendantes).
En comparant la croissance des bactéries, à t0, sur BCYE et BCYE + NaCl (Fig 29AB), la
croissance des bactéries est nettement diminuée d’environ 2 log. A t2h, les bactéries issues
d’une culture en BYE - Fer (Condition contrôle) ou en BYE + Fer est similaire à celle
observée à t0. En revanche, pour celle ayant été traitées avec le DFX ou le DIP, le
ralentissement de la croissance est encore plus important car un abattement de 2 log est
nettement visible. Les traitements par les chélateurs ont donc rendu les bactéries plus
sensibles au NaCl.
Page 192
2.2.2.3.
Test de résistance à l’H2O2
L’objectif était de vérifier si carencer le milieu en fer par l’ajout de chélateur modifiait la
résistance au peroxyde d’hydrogène.
L. pneumophila a été cultivée dans du BYE non supplémenté en fer, jusqu’à DO 0,8. Le
milieu de culture des bactéries a ensuite été supplémenté en fer (sous la forme de
pyrophosphate de fer, 335 µM), ou avec des chélateurs de fer, DFX ou DIP. Avant le
traitement (t0) puis après 2 heures (t2h) ou 4 heures (t4h) de traitement, les suspensions
bactériennes ont été prélevées, des dilutions sérielles ont été réalisées et déposées sur géloses
de BCYE et BCYE + H2O2 (10 mM).
Sur milieu BCYE, quel que soit le traitement appliqué aux cultures de L. pneumophila , la
croissance est inchangée entre le temps t0, et les temps t2h et t4h (Fig. 30A). Après 2 heures
de traitement, L. pneumophila cultivée en milieu BYE (condition contrôle) ou BYE + Fer
présente une forte sensibilité au H2O2. En effet, un abattement de 3 à 4 log est observable
entre le t0, et le t2h. Au contraire, la croissance des bactéries dont le milieu a été supplémenté
avec les chélateurs de fer, présente un taux de croissance semblable sur les deux types de
géloses testées. A t4h, L. pneumophila cultivée en milieu BYE (condition contrôle) ou BYE +
Fer ont un taux de croissance plus important qu’à t2h. Ceci peut s’expliquer par le fait, que les
suspensions, en absence de chélateur, poursuivent leur croissance dans leur milieu de culture
liquide et atteignent la phase stationnaire. Les traitements par les chélateurs ont donc rendu les
bactéries plus résistantes au H2O2.
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Figure 30: Effets de la carence en fer sur la résistance de L. pneumophila au H2O2 (10
mM). L. pneumophila est cultivée dans du BYE – Fer jusqu’à DO600 0,8. Puis le milieu de
culture a été supplémenté en Fer (335 µM), en DFX (20 µM) ou en DIP (100 µM). Avant les
traitements (t0) puis 2 heures (t2h) et 4 heures (t4h) après l’ajout des différentes solutions, des
prélèvements ont été effectués, les suspensions bactériennes ont été diluées et déposées sur
géloses BCYE (A) et BCYE + H2O2 (10 mM) (B) (Figure représentative de trois expériences
indépendantes).
2.2.2.4.
Test d’entrée dans les amibes
Lors du passage en phase transmissive, L. pneumophila exprime de nombreux facteurs de
virulence et sa capacité à infecter les cellules est augmentée.
Nous avons décidé de tester le pouvoir infectieux de L. pneumophila sur les amibes du genre
A. castellanii.
Le nombre de CFU augmente dans les conditions où L. pneumophila a subit un traitement aux
chélateurs de fer (Fig. 31). En effet, il existe une différence significative de 1 log voire 1,5 log
par rapport aux conditions où les bactéries ont été cultivées dans du BYE supplémenté ou non
en fer. Les bactéries traitées par les chélateurs semblent donc plus infectieuses.
Page 194
Figure 31 : Entrée de L. pneumophila dans les amibes après traitements aux chélateurs.
Les bactéries ont été inoculées à 1 x 107 UFC/ml, dans 50 ml de BYE - fer (170 rpm, 37 °C).
A DO600 0,8, les bactéries ont été traitées avec des chélateurs de fer ou avec du fer (apporté
sous la forme de pyrophosphate). Deux heures après le traitement, 5 ml de chaque suspension,
ajustés à 1 x 106 UFC/ml, ont été mise en coculture avec les amibes afin d’obtenir une MOI de
0,1. Après 6 heures d’infection, des dilutions sérielles ont été effectuées et étalées sur milieu
gélosé BCYE afin de dénombrer les bactéries (incubation 3 à 4 jours à 37 °C). Les données
représentent la moyenne +/- l’erreur standard à la moyenne de trois expériences
indépendantes, chaque expérience a été réalisée en triplicat (***p<0,0001, t-test).
2.2.2.5.
Test de mobilité
La nage des bactéries est conditionnée par la présence de flagelles à leur surface. Lors de
l’analyse transcriptomique (Publication 2), nous avons pu constater que la carence en fer
induisait l’expression des gènes codant des protéines impliquées dans la synthèse des
flagelles. Afin de confirmer ces résultats, un test de mobilité a été réalisé sur un milieu gélosé
faiblement concentré en agar afin de faciliter la nage des bactéries. L. pneumophila a été
cultivée en milieu BYE, puis à DO600nm 0,8, le milieu de culture a été supplémenté en
chélateur, DIP ou DFX, ou en fer. Deux heures après traitement, les suspensions ont été
Page 195
injectées dans la gélose molle. Après 4, 7 et 10 jours d’incubation à 37 °C, le déplacement des
bactéries à l’intérieur des géloses n’a pu être observé.
Des observations microscopiques ont également été effectuées, mais sans donner de résultats
concluants.
Contrairements aux résultats obtenus dans l’analyse transcriptomique, les résultats obtenus ici
ne nous ont pas permis de mettre en évidence une différence de mobilité des bactéries traitées
par les chélateurs.
2.2.3.
Implantation de lpw_30711 et lpp_2867 dans les biofilms complexes
Après avoir conclu sur le rôle des protéines Lpw_30711 et Lpp_2867, sur sa place dans le
métabolisme du fer ou encore dans l’infection des amibes et des macrophages, nous avons
voulu savoir si ces protéines pouvaient également être impliquées dans l’implantation de L.
pneumophila dans les biofilms complexes. Comme il a été décrit précédemment, les biofilms
ont été formés dans de l’eau de rivière, après 14 jours de formation, l’eau a été dopée en L.
pneumophila et supplémentée en pyrophosphate de fer ou en chélateurs de fer. Après 14 jours
de culture supplémentaire, les biofilms ont été récupérés, et les ADN ont été extraits puis
analysés en PCRq (Fig. 32).
Dans la condition contrôle, la persistance de la souche mutante lpw_30711 a significativement
diminué d’environ 1 log par rapport à la souche sauvage 130b. Dans les autres conditions de
traitement, aucune différence significative n’existe entre la souche sauvage et le mutant.
Cependant, nous pouvons constater une augmentation significative de la persistance des deux
souches, en présence de DIP. Il existe une différence d’environ 1,5 log pour la souche
sauvage et presque 2 log pour le mutant lpw_30711. Finalement, les résultats indiquent aussi
une augmentation significative de la quantité de la souche lpw_30711 de 1 log, dans les
Page 196
biofilms formés en présence de pyrophosphate de fer. Ces résultats demandent à être
confirmés par la répétition de l’expérience avec la souche complémentée, afin de vérifier si le
phénotype sauvage est restauré.
Dans le cas de la souche L. pneumophila Paris et son mutant, aucune différence
d’implantation n’est observable entre les deux. Néanmoins, l’effet du DIP est marqué par une
augmentation de la concentration en L. pneumophila d’environ 1,5 log par rapport à la
condition contrôle. Une fois de plus, l’effet du DIP est mis en exergue.
Figure 32 : Effets du fer et des chélateurs, sur l’implantation des mutants lpw_30711 (A)
et lpp_2867 (B), dans les biofilms complexes. Les biofilms ont été formés dans des
microplaques, avec de l’eau de rivière, pendant 14 jours. Puis, l’eau de rivière a été
supplémentée avec du pyrophosphate de fer (335 µM), du DFX (20 µM) ou du DIP (100 µM),
et L. pneumophila a été ajoutée. Après 14 jours, les biofilms ont été récupérés. L’ADN a été
extrait des échantillons de biofilms et analysés en PCRq, afin de quantifier spécifiquement L.
pneumophila . Les données représentent la moyenne, +/- l’erreur standard à la moyenne, de
triplicats de deux expériences indépendantes (* p-value < 0,05, Test Mann-Whitney).
Page 197
Page 198
Partie 4. Discussion
Page 199
L’objectif de ces travaux était de mettre en évidence le rôle du fer et des protéines impliquées
dans le métabolisme du fer sur l’implantation et la persistance de L. pneumophila dans les
biofilms complexes.
Dans notre étude, un modèle de biofilms complexes a été mis en place, formés dans des
conditions relativement proches de celles retrouvées dans les réseaux d’eau chaude. De l’eau
de rivière a été utilisée pour le développement de ces biofilms, néanmoins, sa composition
microbienne et chimique n’est pas précisément connue, et reste variable en fonction des
saisons de prélèvements. Très peu d’études ont été réalisées sur les biofilms complexes
naturels. La plupart portent sur des biofilms mono ou multi-espèces, développés dans des
conditions contrôlées, c'est-à-dire où le milieu de culture ainsi que la concentration
bactérienne sont clairement définis. Il est donc difficile de comparer les résultats obtenus ici
avec ceux de la littérature. En effet, la formation de biofilms mono-espèces de L. pneumophila
dans la nature, est très rare (Donlan et al., 2005). Elle est connue pour s’implanter dans les
biofilms complexes, constitués par d’autres microorganismes. C’est pour cette raison qu’elle
est appelée « colonisateur secondaire », car elle s’établit plus facilement dans un biofilm préimplanté, et profite des nutriments produits par les autres microorganismes du biofilms
(Taylor et al., 2009).
Pour établir le modèle de biofilm utilisé dans notre étude, des tests préliminaires ont été
effectués. Deux conditions ont été testées, la culture en « flow cell », parcourus par un flux
continu d’eau de rivière, et la culture en condition semi-statique, mimant une eau stagnante,
mais renouvelée régulièrement. Après 28 jours de culture, les structures des deux biofilms
apparaissent nettement différentes. Les biofilms formés en flux continu sont clairsemés à la
surface des « flow cell », les microorganismes forment des agrégats localisés, la structure est
Page 200
très hétérogène, et les biofilms ne recouvrent pas toute la surface du « flow cell ». L’action
mécanique du flux joue sur la fixation des microorganismes, et facilite le détachement de
certaines parties de biofilms (Peyton & Characklis, 1993; Stoodley et al., 2001; Wilson et al.,
2004). A l’inverse, les structures obtenues, dans la condition de culture en semi-statique, sont
plus denses, le biofilm est plus épais et recouvre la quasi totalité de la surface de façon plus
régulière que la condition présentée précédemment. Néanmoins, nous ne pouvons pas parler
de structure homogène, car certaines zones restent vides, non colonisées par les
microorganismes. L’étude a donc été poursuivie sur les biofilms formés en conditions semistatiques, dont les structures sont plus homogènes et plus denses sur l’ensemble de la surface,
que dans les conditions de flux continu.
Une cinétique d’implantation de la biomasse bactérienne totale a été réalisée par PCRq afin de
contrôler la stabilité et la reproductibilité des biofilms. Après 2 jours de formation des
biofilms, la totalité de la biomasse est déjà implantée, et sur 28 jours de culture, la
concentration n’évolue pas. Ceci suggère donc la stabilité du modèle, d’un point de vue
quantitatif. Des observations régulières des biofilms ont cependant montré des différences
architecturales. La complexité des structures s’accentue, l’architecture et la densité sont
modifiées, et donnent une forme plus hétérogène au biofilm. Il y a donc une maturation du
biofilm, résultant d’une production de matrice composée d’exopolymères par les
microorganismes et donnant cet aspect plus épais au biofilm. En 2003, Leriche et ses
collaborateurs ont montré que la population bactériennes des biofilms atteint rapidement un
seuil de croissance et d’implantation, tandis que les SPE sont synthétisées de façon continue
jusqu’à la fin de la période de développement, soit 28 jours (Leriche et al., 2003).
Page 201
Dans un second temps, l’implantation de L. pneumophila dans les biofilms complexes a été
analysée par PCRq. Le pathogène n’a pas été détecté, ni dans l’eau de rivière, ni dans les
biofilms développés dans cette eau. Il a donc fallu ajouter L. pneumophila , afin de tester son
implantation et sa persistance dans les biofilms. De manière à mimer un accident biologique,
une concentration de 106 bactéries/ml a été rajoutée dans l’eau de rivière. Dans un test
préliminaire, les biofilms préformés ont été dopés une seule ou plusieurs fois en L.
pneumophila. Après 28 jours de culture, la concentration en L. pneumophila dans les biofilms
dopés plusieurs fois est de l’ordre de 107 UG/cm² de biofilm. Elle diminue de 3 log dans les
biofilms dopés une seule fois. La biomasse totale du biofilm ne varie pas entre les deux
conditions. Néanmoins, un seul dopage en bactérie semble être suffisant pour observer une
implantation de L. pneumophila . Ce premier résultat suggère également qu’elle peut persister
dans les biofilms. Ceci est difficilement vérifiable dans les biofilms dopés plusieurs fois,
puisqu’il y a un apport régulier en L. pneumophila . Nous avons donc choisi de poursuivre
l’étude en n’effectuant qu’un seul dopage en bactéries.
Le modèle de biofilm complexe formé en condition semi-statique, et dopé en L. pneumophila ,
a donc été utilisé pour étudier l’impact du fer sur la persistance de ce pathogène dans les
biofilms.
L’implantation de la souche L. pneumophila 130b, ainsi que plusieurs de ses mutants
isogéniques, a été testée. Les mutations concernent les gènes impliqués dans le métabolisme
du fer tels que feoB, lbtA, lbtU, frgA contrôlés par la protéine Fur. Différents traitements ont
été appliqués pour moduler la concentration en fer dans les biofilms : le pyrophosphate de fer,
le DFX, chélateur de fer ferrique, et le DIP, chélateur de fer ferreux.
Les concentrations en fer total dans les différents types de biofilms ont été mesurées. La
concentration en fer dans les biofilms formés en présence de pyrophosphate de fer est 104 fois
Page 202
plus importante, que dans les biofilms contrôles. Dans les biofilms formés en présence des
chélateurs, la valeur de la concentration est du même ordre de grandeur que celle de la
condition contrôle. Ceci suggère que le fer ajouté, est probablement retenu dans le biofilm.
L’ajout des chélateurs avait pour but de piéger les traces de fer ferreux et de fer ferrique afin
de les rendre non disponibles pour les bactéries. Néanmoins, il est possible que le DFX et le
DIP captent le fer, mais que les complexes restent piégés dans la matrice du biofilm. Dans ce
cas, le fer est présent dans le biofilm, mais n’est pas disponible pour les bactéries.
L’ajout du fer, n’a pas d’effet sur la persistance de L. pneumophila , excepté pour la souche
ΔfeoB pour laquelle la concentration a été augmentée d’1 log. Le gène feoB, est un gène
codant un transporteur de fer. Parmi toutes les souches testées, elle est la seule à être mutée
sur une protéine impliquée dans le métabolisme du fer ferreux. De ce fait, il se pourrait que
les ions Fe2+, présents dans les biofilms, soient toxiques pour L. pneumophila .
La concentration en fer total dans l’eau de rivière est très faible, 4 µM en moyenne. En
ajoutant du pyrophosphate de fer (335 µM, concentration ajoutée dans les conditions de
culture en BYE ou en BCYE), nous nous attendions à voir une meilleure implantation et une
meilleure persistance de L. pneumophila . De plus, les analyses chimiques ont montré la
présence de fortes concentrations en fer dans ces biofilms formés en présence de fer. Ceci
suggère que L. pneumophila n’utilise pas le fer piégé dans le biofilm, pour proliférer. Le fer
déjà présent dans le biofilm contrôle (non supplémenté, ni en fer ni en chélateur), suffit à leur
survie.
Le fer est un élément indispensable à la croissance des bactéries. Les concentrations
nécessaires pour une croissance optimale sont souvent différentes d’une espèce à une autre.
Au dela d’un certain seuil, il peut néanmoins devenir toxique pour les cellules.
Son rôle dans la formation de biofilm est également variable selon les espèces bactériennes.
Chez E. coli, P. aeruginosa , V. cholerae, le fer favorise le développement des biofilms. En
Page 203
revanche, il agit en prévenant la formation des biofilms chez S. mutans (Banin et al., 2005;
Berlutti et al., 2005; Mey et al., 2005; Wu & Outten, 2009). Dans le cas de L. pneumophila ,
de fortes concentrations en fer perturbent le développement des biofilms mono-espèces
(Hindre et al., 2008). Dans cette même étude menée au laboratoire, il a été montré que
l’expression des gènes pvcA et pvcB potentiellement impliqués dans le métabolisme du fer, est
modulée entre L. pneumophila à l’état planctonique et à l’état sessile. L’ensemble de ces
données suggéraient l’importance du fer sur l’implantation et la persistance de L.
pneumophila dans les biofilms.
L’ajout de DFX, n’a pas eu d’impact sur la persistance de L. pneumophila . En revanche,
l’ajout du DIP a entrainé une augmentation de la concentration de L. pneumophila dans les
biofilms. Cette augmentation est visualisée pour la souche sauvage comme les mutants. En
ajoutant les chélateurs de fer, les résultats escomptés étaient une baisse de l’implantation et/ou
de la persistance de L. pneumophila , suite à la carence en fer. Pour expliquer ce phénomène
nous avons émis quelques hypothèses. Le DIP pourrait avoir un effet direct sur L.
pneumophila , en piégeant le fer ferreux et ainsi limiter la production de radicaux libres,
toxiques pour les bactéries (Dwyer et al., 2009). Le DIP pourrait également avoir un effet sur
la composition de la population microbienne du biofilm, induisant la mort cellulaire de
certaines espèces sensibles à cette molécule, et ainsi favorisant l’implantation de L.
pneumophila . Il existe de nombreuses compétitions entre les microorganismes au sein des
biofilms, notamment pour les nutriments, les métaux et les sources de carbone (Burmolle et
al., 2006). De plus, selon les espèces, la sensibilité à certains traitements peut être variable, et
certains microorganismes peuvent se retrouver protégés par ces espèces (Burmolle et al.,
2006). La composition de la biomasse et les concentrations en amibes sont semblables entre
les deux conditions. Ceci suggère que le DIP ne modifie pas la composition de la biomasse
totale du biofilm et n’influence pas la présence des amibes. La survie et la réplication
Page 204
intracellulaire de L. pneumophila au sein des biofilms sont deux points controversés dans la
littérature. Selon certains auteurs, L. pneumophila ne se multiplie qu’en présence des amibes
(Declerck et al., 2009; Kuiper et al., 2004; Murga et al., 2001). A l’inverse, d’autres ont
montré que la prolifération de L. pneumophila peut également avoir lieu sans la présence
d’amibes dans les biofilms, elles survivent et persistent grâce à un apport régulier en
nutriments (Andreozzi et al., 2014; Huws et al., 2005; Temmerman et al., 2006).
L’augmentation de la concentration en L. pneumophila dans nos biofilms ne serait donc pas la
conséquence d’une compétition inter-espèce, ni de sa prolifération intracellulaire. Il est plus
vraisemblable que le DIP agisse en diminuant l’effet toxique du fer ferreux qui en s’oxydant
induit la formation de ROS (H2O2, OH-, OH). Ces espèces chimiques sont toxiques pour les
bactéries et le plus souvent, induisent la mort cellulaire par l’altération des molécules d’ADN,
des lipides et des protéines membranaires (Dwyer et al., 2009). Ainsi, le DIP impacterait
directement L. pneumophila .
Une cinétique d’implantation a été réalisée afin de savoir si l’ajout du DIP induisait une
meilleure persistance de L. pneumophila . Dans la condition contrôle, la concentration du
pathogène diminue au cours du temps. Au contraire, dans les biofilms formés en présence de
DIP, la concentration en L. pneumophila est constante tout au long de la cinétique. La
diminution de l’implantation observée dans la condition contrôle peut s’expliquer par un
décrochage de portions de biofilms ou un phénomène de mort cellulaire qui n’est pas
compensé par la prolifération des bactéries. D’autre part, il semblerait que le DIP ait un effet
positif sur la persistance de L. pneumophila, lui procurant de meilleures conditions pour
survivre, et peut être une meilleure adhésion au biofilm. Ces données peuvent être mises en
corrélation avec le résultat obtenu pour l’implantation du mutant ΔfeoB dans les biofilms
formés en présence de fer.
Page 205
En conclusion de cette première partie, l’effet du DIP sur la persistance de L. pneumophila a
pu être mis en évidence. Le fer ferreux semble être un élément important à prendre en compte
dans la survie de L. pneumophila dans les biofilms. D’autre part, il semblerait que les
protéines impliquées dans le métabolisme du fer ne soient pas essentielles dans l’implantation
et la persistance de L. pneumophila dans ces biofilms complexes naturels.
Le second axe du projet est orienté sur la recherche de nouvelles protéines impliquées dans le
métabolisme du fer, et ayant un rôle potentiel dans la persistance de L. pneumophila dans les
biofilms. De nombreuses protéines ont déjà été décrites comme étant impliquées dans
l’acquisition du fer, mais aucune approche globale n’avait été réalisée. Une analyse
transcriptomique a donc été effectuée, afin de comparer l’expression des gènes chez L.
pneumophila cultivée dans des conditions standard (BYE), dans un milieu appauvrit en fer
(BYE sans fer) et dans un milieu chélaté en fer (DFX). Aucune différence d’expression n’a
été observée entre la condition standard, et la condition où le milieu est appauvrit en fer. La
solution de BYE sans fer contient initialement 11 µM de fer total (mesurée par ICP). Cette
concentration semble être suffisante pour la prolifération de L. pneumophila . Dans l’autre
partie de l’analyse transcriptomique, nous avons comparé l’expression des gènes de L.
pneumophila cultivée en milieu BYE sans fer et en milieu chélaté en fer. De nombreux gènes
sont modulés. Au total, 113 gènes sont significativement induits, et 246 gènes sont réprimés.
Parmi les gènes induits, on trouve plusieurs gènes déjà connus pour leur rôle dans
l’acquisition du fer comme feoB, lbtA/B, frgA. Un autre gène, lpp_2867 a été mis en évidence.
Il a la particularité de présenter une boîte Fur, en amont de sa région promotrice. La plupart
des protéines du métabolisme du fer sont contrôlées par la protéine Fur et donc contrôlées par
le fer (Escolar et al., 1999). Ceci suggère que le gène lpp_2867 serait lui aussi contrôlé par
Fur et probablement impliqué dans le métabolisme du fer. Le rôle de la protéine codée par ce
Page 206
gène a été étudié chez les deux souches L. pneumophila Paris et 130b. Chez la souche 130b, la
protéine est codée par un gène homologue, le gène lpw_30711. La séquence codant le gène
lpp_2867 est conservée sur l’ensemble des génomes de L. pneumophila séquencés à ce jour
(identité autour de 96%). Elle existe aussi chez Legionella sp. Mais la séquence est nettement
moins bien conservée (identité autour de 56%). En revanche, elle n’existe pas chez les autres
espèces bactériennes. Les deux protéines Lpp_2867 et Lpw_30711 présentent 98%
d’homologie, et sont spécifiques du genre Legionella .
La production de sidérophores ne dépend pas de ces gènes. En effet, la production est
similaire chez les souches sauvages comme les mutants. De plus, les sidérophores produits
sont actifs car ils restaurent la croissance de la souche mutante ΔfeoB, sur BCYE carencé en
fer par ajout du DFX.
D’autres tests ont permis de mettre en évidence le rôle de la protéine dans la croissance de L.
pneumophila dans un milieu carencé en fer. En effet, la croissance des mutants est altérée sur
milieu gélosé appauvrit en fer par l’ajout du chélateur de fer ferrique, le DFX, comparé à la
souche sauvage. Cependant, les mutants se comportent différemment en milieu liquide, ou la
croissance est inchangée même lors d’une carence en fer, suggérant l’utilisation d’autres voies
métaboliques pour capter le fer dans le milieu.
Une analyse de l’acquisition du fer en intracellulaire a également permis de voir une baisse de
la quantité de fer ferreux internalisée, cependant moins importante que pour la souche ΔfeoB.
Ces résultats suggèrent que les deux gènes homologues lpp_2867 et lpw_30711 codent des
protéines impliquées, de façon directe ou indirecte, dans le transport du fer ferreux et dans la
croissance sur milieu gélosé carencé en fer ferrique.
L’analyse BLAST a permis de prédire la présence d’un domaine conservé appartenant à la
famille DUF3816, comprenant des transporteurs membranaires. Une protéine orthologue a été
décrite chez L. pneumophila Philadelphia. Il s’agit de la protéine MavN caractérisée comme
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étant un substrat du système de sécrétion de type IV (Huang et al., 2011). Les protéines
Lpw_30711 et Lpp_2867 pourraient être sécrétées dans les mêmes conditions et être définis
comme étant des transporteurs membranaires de fer ferreux, ou facilitant la formation d’un
transporteur membranaire.
Souvent, les protéines impliquées dans le métabolisme du fer contrôlent également la
virulence des bactéries. Les données obtenues suggèrent que les gènes lpw_30711 et lpp_2867
ont un rôle dans l’infection et la multiplication intra-amibes et intra-macrophages.
Lors du 8ème congrès international sur Legionella , en 2013, le Professeur Isberg a présenté des
données concernant la protéine MavN, chez L. pneumophila Philadelphia. L’etude de la
séquence protéique a permis d’identifier un motif de 7 histidines, acides aminés capables de
former des liaisons avec des ions métalliques tels que les ions Fe2+. Il a également souligné le
rôle essentiel de cette protéine dans la virulence, ainsi que dans le transport du fer ferreux.
L’ensemble de ces données suggère donc que les protéines Lpw_30711 et Lpp_2867 sont
impliquées, directement ou indirectement, dans l’acquisition du fer ferreux, ainsi que dans la
virulence de L. pneumophila . Pour leur rôle dans le transport du fer, un nom a été proposé
pour cette nouvelle protéine : IroT, pour « Iron Transporter ».
Les deux mutants ont également été testés pour leur capacité à persister dans les biofilms
complexes naturels ou supplémentés en pyrophosphate de fer ou en chélateurs de fer. Dans la
condition contrôle, il y a une baisse significative de la persistance de la souche mutante
lpw_30711 dans le biofilm comparé à la souche sauvage, mais ceci n’est pas observé chez la
souche mutante lpp_2867. Ceci suggère néanmoins que la protéine Lpw_30711 pourrait avoir
un rôle, même mineur, dans la persistance de L. pneumophila dans les biofilms. La formation
des biofilms a également été réalisée en présence de pyrophosphate de fer. Une modification
de l’implantation a été observée, uniquement pour la souche mutante lpw_30711. La
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persistance de L. pneumophila est augmentée d’environ 1 log. Ce résultat est proche de celui
décrit précédemment pour le mutant ΔfeoB. Leur point commun est leur rôle dans le transport
du fer ferreux. La même conclusion peut donc être faite, le transport du fer ferreux est limité
chez ces souches mutantes, sa toxicité a donc moins d’impact et favoriserait leur persistance.
Ces résultats demandent néanmoins à être validés en testant les souches complémentées et
vérifier la restauration du phénotype sauvage.
En présence de DIP, la concentration en L. pneumophila est augmentée de manière
significative, ceci pour les deux souches 130b et Paris ainsi que leur mutant respectif, comme
dans les études précédentes. Le rôle du DIP est à nouveau mis en exergue.
L’analyse des données transcriptomiques a également mis en évidence une série de gènes
exprimés lors de la phase transmissive, tels que des gènes codant la synthèse des flagelles,
principale caractéristique phénotypique témoignant d’un changement de phase.
Lors d’une carence nutritive, ou d’un stress, la réponse stringente est déclenchée chez les
bactéries (Dalebroux et al., 2009; Edwards et al., 2009). Cette réponse est régulée par les
protéines RelA et SpoT, responsables de la production d’une alarmone, le ppGpp. La protéine
SpoT serait liée à la réponse au fer (Dalebroux & Swanson, 2012; Vinella et al., 2005). En
période de stress ou de carence, L. pneumophila produit une alarmone, le ppGpp. Elle
déclenche le passage des bactéries en phase transmissive. Elle induit aussi l’expression d’un
système à deux composants, LetA/LetS ainsi que la protéine RpoS. Ces protéines sont
impliquées dans le passage des bactéries de la phase réplicative à la phase transmissive. La
protéine RelA, surexprimée dans notre étude, est responsable de l’expression de petits ARN,
RsmY et RsmZ, qui inhibent l’activité du répresseur CsrA (réprimé dans cette étude).
Des tests complémentaires ont été réalisés afin de tester l’hypothèse du changement de phase.
Après traitement aux chélateurs de fer, la souche L. pneumophila est devenue sensible au
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NaCl, et résistante au H2O2. De plus, le pouvoir infectieux de L. pneumophila, traitée avec
l’un ou l’autre des chélateurs, est augmenté.
L’ensemble de ces résultats suggère fortement que la carence en fer déclencherait le passage
de L. pneumophila en phase transmissive.
Pour compléter cette étude, une mesure de la production de ppGpp permettrait d’apporter un
argument supplémentaire. Cette expérience a été envisagée mais n’a pu être mise en œuvre,
faute de temps et de moyens.
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Conclusion générale et perspectives
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Dans cette étude, nous avions pour objectif premier de déterminer le rôle du fer sur
l’implantation de L. pneumophila dans des biofilms complexes. Le second objectif était de
montrer l’impact du fer sur l’expression des gènes de L. pneumophila.
Dans la première partie de l’étude, nous avons commencé par mettre en place un modèle de
biofilms complexes stables et facilement reproductibles, formés en condition semi-statique,
dans l’eau de rivière. La persistance de L. pneumophila 130b, et certaines souches mutées sur
des gènes impliqués dans le métabolisme du fer, a ainsi été testée dans ces biofilms. Pour cela,
les concentrations en fer disponibles pour les bactéries ont été modulées par l’ajout de fer ou
de chélateurs.
Après développement des biofilms en présence de fer, la persistance de L. pneumophila n’est
pas modifiée, exceptée pour la souche ΔfeoB dont l’implantation est faiblement augmentée en
comparaison à la souche sauvage ou aux autres mutants. Le gène feoB est impliqué dans le
transport du fer ferreux. Ce résultat suggère un potentiel effet toxique du fer ferreux sur L.
pneumophila .
Deux chélateurs de fer ont été testés : le DFX chélateur du fer ferrique et le DIP chélateur du
fer ferreux. L’ajout de DFX n’a aucun impact sur la persistance de L. pneumophila dans les
biofilms. En revanche, les résultats obtenus par l’ajout de DIP étaient inattendus. En effet, le
chélateur favorise la persistance de L. pneumophila dans les biofilms. Ceci est vrai pour toutes
les souches testées, la sauvage comme les mutants. Les résultats obtenus sont contradictoires
avec ceux attendus car en ajoutant les chélateurs de fer, les résultats escomptés étaient une
baisse de l’implantation et/ou de la persistance de L. pneumophila , suite à la carence en fer.
Une analyse de la population microbienne a montré que le DIP n’a pas d’impact majeur sur la
composition en microorganismes dans les biofilms. L’augmentation de la concentration en L.
pneumophila n’est donc pas causée par le changement de communauté microbienne qui
pourrait influer sur son implantation. D’autre part, le DIP ne semble pas favoriser non plus la
Page 212
présence des amibes dans le biofilm. L’augmentation de la concentration de L. pneumophila
ne serait pas due à une multiplication intracellulaire plus importante.
La dernière hypothèse proposée pour expliquer l’augmentation de la persistance de L.
pneumophila dans les biofilms, est un effet protecteur du DIP contre les ions Fe2+. En effet,
ces molécules oxydées à l’intérieur des cellules, peuvent induire la production de ROS via la
réaction de Fenton, plus particulièrement les radicaux hydroxyles, très toxiques pour les
cellules. En captant le fer ferreux avec le DIP, les réactions d’oxydation seraient diminuées, et
la production de ROS serait limitée favorisant ainsi la survie de L. pneumophila et sa
persistance dans les biofilms.
Le dosage des ROS apporterait une information supplémentaire pour confirmer le rôle du
DIP. Des sondes moléculaires spécifiques d’une espèce chimique, comme par exemple les
radicaux OH, sont utilisées pour mesurer la quantité produite. L. pneumophila est capable de
prévenir l’action des ROS, en produisant des enzymes telles que des superoxydes dismutases,
capables de dégrader les radicaux superoxydes ou encore des alkyls hydroperoxydes
réductases, responsables de l’élimination des molécules de peroxyde d’hydrogène. Ces
enzymes sont codées par les gènes ahpC1, ahpC2, ahpD . La mesure du niveau d’expression
de ces gènes (par RT-qPCR), permettrait de vérifier indirectement si le DIP protège L.
pneumophila contre les produits issus de l’oxydation des ions Fe2+.
Notre étude dans les biofilms complexes présente néanmoins des limites, car le microenvironnement des biofilms n’est pas contrôlé, la composition exacte en minéraux,
nutriments, microorganismes sont variables selon les saisons. Il serait intéressant de connaitre
plus précisément les proportions de fer ferreux et de fer ferrique dans les biofilms puisque L.
pneumophila possède ces deux voies d’acquisition. La technique par colorimétrie (dosage à
l’orthophénantroline) a été testée, mais elle n’est pas suffisamment sensible pour cette étude.
D’autres techniques existent, plus sensibles, telle que l’électrophorèse capillaire qui permet la
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séparation des ions Fe2+, Fe3+, mais aussi des complexes Fer/Protéines chargés. La limite de
détection est de l’ordre du mg/L jusqu’à 10 µg/L. Il existe également la technique de
polarographie, utilisée pour étudier la spéciation du fer biodisponible, c'est-à-dire, qu’elle
permet de discerner les formes libres (Fe2+, Fe3+), ainsi que les formes labiles (complexes
Fer/Protéines). La limite de détection est comprise entre le mg/L et le µg/L.
D’autre part, l’ajout de fer sur l’implantation de L. pneumophila a été testé. La source utilisée
est du pyrophosphate de fer, où le pyrophosphate est lié à des molécules de fer ferrique. Il
serait donc intéressant de compléter cette étude en réalisant des biofilms avec une source de
fer ferreux. Suivant les résultats, ils pourraient confirmer l’hypothèse de la toxicité du fer
ferreux sur L. pneumophila .
Dans la seconde partie de l’étude, l’effet d’une carence en fer (par ajout de DFX) sur
l’expression des gènes de L. pneumophila a été étudié. La carence en fer induit l’expression
des gènes impliqués dans le métabolisme du fer, des gènes contrôlés par le fer, des gènes de
virulence, mais également de nombreux gènes qui ne sont toujours pas décrits dans la
littérature. Parmi eux, le gène lpp_2867 a plus particulièrement attiré notre attention. En effet,
une étude plus approfondie de sa séquence a révélé la présence d’un motif Fur, en amont de sa
séquence promotrice. La plupart des gènes impliqués dans le métabolisme du fer sont
contrôlés par la protéine Fur. Ces premiers éléments laissaient à penser que la protéine
Lpp_2867 serait impliquée dans le métabolisme du fer.
Nous avons montré son rôle dans l’assimilation du fer ferreux par L. pneumophila, après avoir
constaté une diminution de la croissance de la souche mutée sur ce gène, sur un milieu
carencé en fer ferrique, ainsi qu’une baisse de l’acquisition du fer ferreux. Des analyses
bioinformatiques ont aussi suggéré que cette protéine serait un transporteur membranaire. Il
semblerait donc que la protéine Lpp_2867 soit un transporteur impliqué dans l’assimilation
Page 214
d’une partie du fer ferreux, ou qu’elle ait un rôle dans la formation d’un transporteur
membranaire.
Les tests d’infections ont également montré le rôle essentiel de Lpp_2867 dans la réplication
intracellulaire, ce qui fait de cette protéine un facteur de virulence important.
Des analyses bioinformatiques ont permis d’identifier une protéine orthologue de Lpp_2867.
Il s’agit de la protéine MavN, produite par L. pneumophila Philadelphia. MavN est décrite
comme un effecteur du système de sécrétion de type IV. Il semblerait donc que Lpp_2867
soit, comme MavN, un substrat libéré par le système de sécrétion Dot/Icm.
Lpp_2867 présente donc un rôle dans l’acquisition du fer ferreux et dans la virulence. Cette
nouvelle protéine a été nommée IroT, pour « Iron Transporter ».
D’autres gènes ont été induits au cours de cette étude, notamment des gènes qui n’ont pas
encore été décrit dans la littérature comme les gènes lpp0988, lpp1047, lpp1105, lpp1452,
lpp1818, lpp2594. Il serait intéressant de les analyser et de construire des mutants afin de
tester leur rôle dans le métabolisme du fer et dans la virulence.
Par ailleurs, au vu des résultats obtenus avec le DIP, sur la persistance de L. pneumophila
dans les biofilms complexes, nous pourrions envisager une autre analyse transcriptomique,
comme celle réalisée avec le DFX, en utilisant le DIP comme chélateur de fer. Nous pourrions
ainsi comparer les résultats avec ceux déjà obtenus et peut être mettre à jour d’autres gènes
qui nous permettraient de mieux comprendre et expliquer les résultats obtenus.
Les résultats de l’analyse transcriptomique, ont également mis en exergue l’induction de
plusieurs gènes connus pour être exprimés lors du passage en phase transmissive, tels que :
rpoN, letE, rtxA ehnC , ainsi que des gènes impliqués dans la synthèse du flagelle. Au
contraire, le gène csrA, normalement exprimé lors de la phase réplicative, a été réprimé.
Page 215
Face à ces données il semblerait que la carence en fer, provoquée par l’ajout du DFX, induise
la phase transmissive. Pour confirmer cette hypothèse, différents caractères contrôlés par le
changement de phase ont été testés. La sensibilité de L. pneumophila au chlorure de sodium
ainsi qu’au peroxyde d’hydrogène a été testée. Finalement, les résultats indiquent une
augmentation de la sensibilité au chlorure de sodium et une plus grande résistance au
peroxyde d’hydrogène. Lors du passage en phase transmissive, L. pneumophila est également
connue pour être plus virulente. Et en effet, L. pneumophila présente une plus grande capacité
d’entrée dans les amibes après avoir subit un traitement au DFX ou au DIP. Ces résultats
suggèrent fortement que le fait d’induire une carence en fer entraine chez L. pneumophila le
passage en phase transmissive. D’autre part, la mise en évidence la production des flagelles
serait un argument supplémentaire pour confirmer notre hypothèse. Leur production peut être
révélé par immunofluorescence en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre la
flagelline par exemple, mais également par Western Blot.
Finalement, pour compléter cette étude, il serait intéressant de doser la quantité de ppGpp
produit par les bactéries. Cette alarmone, est synthétisée lors d’une carence nutritive ou d’un
stress et témoigne du déclenchement de la réponse stringente qui contrôle le passage en phase
transmissive.
Au final, cette étude a permis de voir qu’il existe vraisemblablement une relation entre les
ions Fe2+, la production de ROS et la persistance de L. pneumophila dans les biofilms
complexes. Le dosage des ROS ainsi que la spéciation du fer apporteraient probablement des
éléments de réponses pour expliquer leur rôle sur L. pneumophila dans les biofilms. D’autre
part, une nouvelle protéine IroT/MavN a été caractérisée. L’expression de cette protéine est
controllée par la présence de fer et elle semble impliquée dans le transport du fer ferreux.
Finalement, cette protéine est essentielle pour la virulence de L. pneumophila .
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Le fer étant un élément essentiel pour L. pneumophila , son transport et son utilisation sont
finement régulés dans la bactérie et des études supplémentaires sont nécessaires pour
comprendre la complexité de son utilisation dans le biofilm.
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Résumé
L. pneumophila est une bactérie ubiquitaire des environnements aquatiques, responsable de la
légionellose. Elle est principalement retrouvée au sein de protozoaires, mais aussi dans les biofilms. Il
est admit que le fer est l’un des éléments indispensable à la croissance de ce pathogène. En 2008, une
étude a été réalisée au sein de notre équipe montrant une modulation de l’expression des gènes entre L.
pneumophila à l’état planctonique, et à l’état de biofilm. Dans cette même étude, l’ajout de forte
concentration en fer (1,25 g/l), dans le milieu de culture des biofilms, a révélé une inhibition de leur
développement. Le fer présente donc un rôle dans l’établissement de biofilms monoespèces de L.
pneumophila . Nous avons développé un modèle de biofilms naturels, formés à partir d’eau de rivière,
afin de tester l’établissement de L. pneumophila , dans des conditions où l’eau de rivière est
supplémentée en fer ou au contraire appauvrit, par l’ajout de chélateurs, le deferoxamine mesylate
(DFX) ou le dipyridyl (DIP). Les ajouts de fer et de DFX n’ont eu aucun impact sur l’établissement
de L. pneumophila contrairement au DIP, qui a induit une augmentation de l’implantation de ces
bactéries.
Par ailleurs, nous avons effectué une analyse transcriptomique sur L. pneumophila cultivées en milieu
liquide supplémenté en DFX. L’ajout du chélateur a entrainé une induction de l’expression de 113
gènes et la répression de 246 gènes. Parmi les gènes induits, certains sont déjà connus comme étant
impliqués dans le métabolisme du fer ou contrôlés par le fer. Parmi eux, un gène a été surexprimé, il
n’a jamais été associé au fer et sa fonction est encore inconnue à ce jour. Il s’agit du gène lpp_2867.
Des investigations ont été réalisées afin de caractériser et de comprendre le rôle de la protéine pour
laquelle il code. Elle est notamment impliquée dans l’infection des amibes et des macrophages. Son
rôle dans le transport du fer ferreux a également été mis en avant. Cette protéine a été nommée IroT
pour « iron transporter ».
Mots Clés : Legionella , biofilms complexes, fer, chélateurs, transport, effecteurs, virulence.
Abstract
L. pneumophila is an ubiquitous bacterium found in aquatic environments, and responsible for
legionellosis. It is mainly found into both protozoa and biofilms. Iron is a key nutrient for an optimal
growth of this pathogen. In 2008, a transcriptomic analysis was carried out within our team, revealing
a differential expression of genes involved in iron metabolism between sessile and planktonic bacteria.
Also, this study showed that, for high iron concentrations (1.25 g/l), biofilm formation by L.
pneumophila was inhibited. It suggested that iron is important for biofilm formation by L.
pneumophila . To extend these observations in more natural conditions, a model of biofilm formation,
using natural river water, was developed. Water was spiked with L. pneumophila and supplemented
with iron or iron chelator, deferoxamine mesylate (DFX) or dipyridyl (DIP) . Addition of iron and
DFX did not have any effect on L. pneumophila establishment unlike the DIP which induced an
increase of L. pneumophila concentration into the biofilms.
Otherwise, we performed transcriptomic analysis on L. pneumophila grown in liquid medium
supplemented with DFX. The addition of this chelator led to the induction of 113 genes and 246 genes
were repressed significantly. Among the induced genes, some are involved in iron metabolism or
controlled by iron. There was an induced gene, lpp2867, never associated with iron metabolism and
whose function was still unknown. Investigations were realized to characterize and understand the role
of the protein encoded by this gene. It is involved in L. pneumophila virulence and in ferrous iron
assimilation. This new protein was named IroT for iron transporter.
Key words: Legionella , complex biofilms, iron, chelators, transport, effectors, virulence.

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