Isotopes

Spectrométrie de masse – Introduction
Intérêts de la Spectrométrie de masse :
•
Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions )
•
Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction
ions molécule, cinétique des réactions.
•
Progrès technologique rapide
1
Spectrométrie de masse –
Introduction - Principes
-
Un spectromètre comprend :
-
Système d’introduction ( GC, LC , sas d’intro direct, … )
-
Source d’ionisation
-
Analyseur ( un ou plusieurs )
-
Détecteur pour compter les ions
-
Système de traitement de donnée
Introduction,
GC, LC
Ionisation,
EI, CI
ESI, APCI
FAB, …
Analyseur
SQ D,TQD,
EB, TOF
Détecteur
Logiciel
2
Spectrométrie de masse –
Introduction - Principes
Principes de la MS :
•
1er étape : Produire des ions
•
La quantité de fragments produit dépend de la « force » de l’ionisation
Les ions sont ensuite séparés d’après leur masse et leur charge dans le système
dispersif
Ils sont ensuite détectés.
Introduction,
GC, LC
Ionisation,
EI, CI
ESI, APCI
FAB, …
Analyseur
SQ D,TQD,
EB, TOF
Détecteur
Logiciel
3
Spectrométrie de masse –
Analyse de Biomolécules
-
Electrospray (ESI)
4
Spectrométrie de masse - QQQ
Introduction,
GC, LC
-
Ionisation,
EI, CI
ESI, APCI
FAB, …
Analyseur
SQ D,TQD,
EB, TOF
Détecteur
Logiciel
MS : mode « Full scan »
Balayage d ’Ions moléculaires
-
MS : mode « Product ION »
Balayage d ’ions fragments
5
Ion moléculaire ou pseudopseudo-moléculaire
Electrospray
Ion pseudopseudo-moléculaire :
En mode positif : ajout d’un proton sur M : (M+H)+
En mode négatif : perte d’un proton : (M(M-H)-
(masse : M+1, charge+1)
(masse : MM-1, charge -1)
1. Massifs isotopiques
•
Isotopes : atomes d’un même élément qui contiennent un nombre identique de protons mais
un nombre différent de neutrons
•
Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d’un élément dans la nature
•
Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique apparaissant sur le tableau périodique et
qui tient compte des isotopes et de leur abondance
Exemple : nbre de
nbre de
protons : nucléons :
nbre
nbre de
atomique
masse
Chlore-35
17
35
Chlore-37
17
37
nbre
neutrons
35-17 = 18
37-17 = 20
masse
abondance
isotopique en % (1)
34,97
75,8%
36,97
24,2%
abondance
relative(2)
100
32,5
Masse moyenne pondérée du chlore = (0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma
(1)
(2)
= nombre moyen d’isotope cité pour 100 atomes de l’élément
= nombre moyen d’isotope cité pour 100 isotopes majoritaires
7
Principaux isotopes en chimie organique
Elément
isotope
%
Masse
isotopique
isotope
%
Masse
isotopique
isotope
%
Masse
isotopique
Masse
moyenne
C
12C
100
12.0000
13C
1.1
13.0033
12.011
H
1H
100
1.0078
2H
0.015
2.0140
1.0079
N
14N
100
14.0031
15N
0.37
15.0001
14.0067
O
16O
100
15.9949
17O
0.04
16.9991
18O
0.20
17.9992
15.9994
S
32S
100
31.9721
33S
0.789
32.9715
34S
4.44
33.9679
32.066
F
19F
100
18.9984
Cl
35Cl
100
34.9688
37Cl
31.98
36.9659
35.453
Br
79Br
100
78.9183
81Br
97.28
80.9163
79.904
Calcul de masses exactes
Soit la molécule
d’eicosane C20H42 :
Masse exacte M :
(12C20 1H42)
(20 * 12.000)
+ (42 * 1.0078)
= 282,33
nbre
A
masse
isotopique
masse
moyenne
Hydrogène-1
Hydrogène-2
1
2
1.0078
2.0140
1.0079
Carbone-12
Carbone-13
12
13
12.0000
13.0034
12.011
Masse exacte M+1
avec un 13C :
(19 * 12.000)
+ (1 * 13.0034)
+ (42 * 1.0078)
= 283,33
Masse exacte M+1
avec un 2H :
(20 * 12.000)
+ (41 * 1.0078)
+ (1 * 2.0140)
= 283,33
282
Masse moyenne :
(20 * 12.011)
+ (42 * 1.0079)
= 282,55
La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : ∆ entre
MM et M = ± 1 Da / 1500 Da
Calcul de l’abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour
des petites molécules
Type
d’élément
Q
Abondance relative du 2ème isotope*
Caractéristiques
Exemple
1! Isotope ou
plusieurs isotopes
dont un est majoritaire
(A > 99,9%)
F
I
P
H
0,015
Isotope M+1
N
C
0,37
1,08
Isotope M+2
Cl
O
S
31,98
Br
0,2
4,43
Q+1
négligeable
Q+2
négligeable
Satellite M+1 :
Satellite M+2 :
* Abondance
de l’isotope
non
majoritaire
= 100
non
97,28
M+1 ≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N )
100
M
M+2 ≈ (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + ……
100
M
analyse de spectres de masse
10
Massifs isotopiques complexes
Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl
En Conclusion :
Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est propre
Pour des molécules de masse < 500 Da :
L’abondance des pics « M+1 » renseigne sur le nombre d’éléments Q+1 :
M+1/M ≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100
L’abondance des pics « M+2 » et suivants renseigne sur la présence d’éléments Q+2 (S,
Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :
analyse de spectres de masse
12
Spectrométrie de masse –
Analyse de Biomolécules
Q1
Q2
Q3
Source
ESI
Détecteur
Spectrométrie de masse - QQQ
-
Possibilité de la spectrométrie de masse pour l’analyse de biomolécules.
-
MS², quantification.
Balayage d ’Ions moléculaires
Balayage d ’ions fragments
14
Spectrométrie de masse –
Quantification
La sensibilité = recherche de la limite de détection(LOD) et Quantification (LOQ).
En analyse Qualitative, la LOD est la quantité minimal d’échantillon nécessaire à
l’obtention d’un spectre de masse de qualité.
En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d’une molécule par
rapport au bruit de fond.
LOD = 3 S/N
LOQ = 10 S/N
Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ :
- Paramètre de source du spectromètre de masse
- La technique d’ionisation
- les solvants et tampon en ESI
15
Spectrométrie de masse –
Analyse de Biomolécules
MRM, des limitations …
1.
2.
3.
4.
5.
La molécule doit s’ioniser, surtout en ESI
La molécule doit fragmenter, mais pas trop
Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )
Précision des mesures : 10%
LOD , LOQ variable en fonction des molécules, des appareil et des modes
d’acquisition.
6. Répétabilité des aires : mauvais d’un jour à l’autre
1. lié à l’encrassement
2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ).
On préfère toujours la solution de l’étalon interne à la courbe de calibration
externe
Idéalement, l’étalon interne est la molécule marqué iso topiquement (
Testostérone D3, Carnitine D3.
Spectrométrie de masse –
Quantification
La spectrométrie de masse apporte :
-
Spécificité
-
La sensibilité
La spécificité est obtenu par :
-
La préparation de l’échantillon pour séparer la molécule cyble des interférences.
-
Le spectromètre de masse en lui même
La sensibilité est obtenu par :
-
La technologie employée
-
Les modes du spectromètre de masse
17
Spectrométrie de masse –
Quantification
La spécificité est obtenu par :
-
La purification de l’échantillon
- Extraction ( liquide liquide )
- SPE / MIP
- La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d’intêret et
ciblage d’ion caractéristique de masse supérieur.
-
Le spectromètre de masse.
-
-
Augmenter la résolution
-
R= 2000 TQD
-
R= 20 000 Q-TOF
- mode SRM ( Single Reaction Monitoring ) .
18
Spectre “Produit” de l’Atrazine à Ce =5, 19,33,47 eV
Spectre “Produit” de l’Atrazine-D5 à Ce =5, 19,33,47 eV
Transition M.R.M pour l’ATRAZINE et son étalon interne
MRM
Compound Name
ISTD?
Energy
Cell Accelerator Voltage
ATRAZINE-D5
True
7
Positive
ATRAZINE-D5
True
7
Positive
ATRAZINE
False
7
Positive
ATRAZINE
False
7
Positive
Precursor Ion MS1 Res
Polarity
221.1
Unit
Product Ion
MS2 Res
Dwell
Fragmentor
Collision
179.1
Unit
200
120
17
221.1
Unit
69.1
Unit
200
120
41
216.1
Unit
174.1
Unit
200
110
13
216.1
Unit
104
Unit
200
110
29
HPLC : colonne type C18 2.1 x 50 mm, 1.8µm
Debit
500µl/min
Solvant A
H2O 0.1% FA
Solvant B
Méthanol
QQQ.
Vcap
GAS Temp
Drying gaz
Nebuliseur
Fragmenteur
ESI
Temps
3500 V
350 °C
12 L/min
45 psi
120 V
Positif
B%
0
10
3
4
4.01
5
90
90
10
10
Qualitatif
1. Définir les Transitions MRM -> Spectre « Produit »
1. Isolation de la molécule sur MS1
2. Fragmentation sur MS2 ( chambre de collision à l’Azote)
3. Définition des fragments ( intérêt et intensité) pour la quanti et la qualification.
2. Définir les paramètres optimaux de sources.
3. Réaliser la Courbe de calibration
1. Toujours la même quantité d’étalon interne dans les 200µl
2. Faire varier la quantité
4. Comparer le rapport de l’aire de l’atrazine / Aire de l’atrazine D5.
Quantitatif
IS-1 ( 1,9mg/L) : Diluer 100µl IS-0 (19mg/L) dans 900µl MEOH
Courbe étalon :
-Préparer les LEVEL : 20,10,5,2,0.5,0.1ng dans
200µl de MeOH
- Recalculer la concentration réel après ajout IS.
Echantillon :
- Prélever 250 ml Eau de ville
- Ajouter 20 µl IS-1
SPE – C18 :
Mélanger :
-180µl solution STD-Lx
- 20µ solution IS-1
-Injecter 20µl en LC-MSMS
- Equilibrer : 2x5 ml Acétone , 2x5ml H2O MilliQ
- Percolation : 250 ml D’eau +IS
- Lavage : 6 ml H2O MilliQ
- Séchage 10 min
- Elution : 3x3 ml Acétone dans ballon
Evaporation:
- Evaporation sous vide
Reprise:
- Reprendre par 200 µl de MeOH
LC-MS/MS:
- Injecter 20µl en LC-MSMS
Quantitatif
1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d ’étalon interne.
2. Concentré l’échantillon avec la même quantité d’étalon interne que pour la calibration
3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d’étalon interne.
Quantitatif
Cpd
# Formula
RT
Mass
[M+H]+
DEDIA
C3H4N5Cl
145.0155
146.0227
DIA
C5H8N5Cl
173.0468
174.0540
DEA
C6H10N5Cl
187.0625
188.0697
ATRAZINE
C8H14N5Cl
5.01
215.0938
216.1010
ATRAZINE-D5
C8H9D5N5Cl
5.02
220.1252
221.1324