Co-culture

Utilisation de la co-culture
amibienne pour la détection
de Legionella spp. dans
l’environnement
V. Gaia - CNR Legionella
Bellinzona - Suisse
Introduction
-  La co-culture est utilisée pour l’enrichissement de
Legionella spp. à partir d’échantillons cliniques et
environnementaux, en particulier pour
-  des échantillons cliniques contaminés par d’autres
bactéries
-  des composts et des terreaux de jardin
-  des eaux pluviales (flaques, puits)
-  des stations d’épuration
-  des aérosols
Introduction
-  A. castellani (Neumeister 1997)
•  L. pneumophila
•  L. longbeachae sg1
Aucune
croissance en
•  L. jordanis
co-culture
•  L. anisa
•  L. oakrisgensis
-  A. castellani (Schalk 2012)
•  L. pneumophila Mab3/1-positifs
•  L. pneumophila Mab3/1-négatifs Aucune
•  L. anisa
croissance en
co-culture
-  L. pneumophila ATCC 33152
But
-  Déterminer la limite de détection de la co-culture
avec Acanthamoeba polyphaga
-  Comparer la co-culture avec la culture traditionnelle
pour l’isolement de Legionella pneumophila dans des
composts et des échantillons d’air artificiellement
contaminés.
-  Evaluation des deux méthodes en parallèle pour la
détection de Legionella spp. dans des échantillons
prélevés dans l’environnement.
Méthodes
-  Des échantillons de compost et d’air ont été
ensemencés avec des concentrations connues de L.
pneumophila sérogroupe 1
-  La culture directe et la co-culture avec des
Acanthamoeba polyphaga ont été utilisées en
parallèle pour la détection des légionelles.
-  Des courbes standard ont ensuite été établies pour
chaque type de matériel
Méthodes
Préparation des échantillons
-  Stérilisation du compost et des échantillons d’air
(10ml PAGE)
-  Inoculation avec une souche de L. pneumophila
sérogroupe 1 (ATCC 33152)
à 1 - 108 cellules/5g compost
à 1 - 108 cellules/1 m3 air (10 ml solution PAGE)
-  Suspension de 5g compost dans 10 ml PAGE
Méthodes
Culture (ISO 11731)
-  Traitement acide
-  Ensemencer sur GVPC
Co-culture
-  Acanthamoeba polyphaga (ATCC 50362):
-  env. 105 cellules/ml
-  Ajouter 0.1 ml d’échantillon
-  Incubation à 36°C pendant 7 jours
-  Choc thermique 30 min à 50°C
-  Ensemencer 100µl sur GVPC
Méthodes
Identification des légionelles
-  MALDI-TOF MS
-  Séquençage du gène mip
Résultats – échantillons encemencés
-  La co-culture s’est montrée plus sensible par rapport
a la culture
-  Co-culture: 102-103 L. pneumophila cellules dans
1 g de compost ou 1 m3 d’air
-  Culture: 105-106 L. pneumophila cellules dans 1 g
de compost ou 1 m3 d’air
Co-culture
Culture
COMPOST
Co-culture
Culture
AIR
Echantillons prélevés dans
l’environnement
-  Composts (5g)
-  Aérosols (1m3)
-  88 prélèvements
dans des stations
de compostage au
Tessin
Résultats – échantillons prélevés
-  L’analyse des échantillons prélevés dans
l’environnement, a montré que la co-culture est
-  Plus performante lorsque les concentrations en
légionelles sont très faibles
-  la variabilité des espèces récoltées est plus
limitée par rapport a la culture traditionnelle
Analyse des composts (n=88)
Espèce
POS avec culture
POS avec co-culture
Lp1
22 (25%)
10 (11%)
Lp2-15
53 (60%)
49 (56%)
L. bozemanii
35 (40%)
6 (7%)
L. londiniensis
23 (26%)
-
L. micdadei
11 (12%)
1 (1%)
L. oakridgensis
10 (11%)
-
L. feelei
3 (3%)
2 (2%)
L. jamestowniensis
2 (2%)
-
L. birminghamensis
1 (1%)
-
L. cincinnatiensis
1 (1%)
-
L. sainthelensi
1 (1%)
-
L. longbeachae
-
1 (1%)
Analyse de l’air (n=88)
Espèce
POS avec Culture
POS avec Co-culture
Lp1
-
2 (9%)
Lp2-15
-
9 (39%)
L. bozemanii
-
1 (4%)
L. londiniensis
-
-
L. micdadei
-
-
L. oakridgensis
-
-
L. feelei
-
-
L. jamestowniensis
-
-
L. birminghamensis
-
-
L. cincinnatiensis
-
-
L. sainthelensi
-
-
L. longbeachae
-
-
Discussion
-  Avec des échantillons cliniques (Descours 2012)
aucune différence significative a été détectée entre
les rendements de A. castellani et A. polyphaga
-  Dans cette étude, la variabilité des espèces
récoltées dans les échantillons de l’environnement
est inférieure par rapport à la culture traditionnelle et
est probablement influencée par l’espèce utilisée (A.
polyphaga)
Conclusions
-  La co-culture amibienne est une méthode utile et
sensible pour l’enrichissement de L. pneumophila
dans des échantillons environnementaux qui
contiennent des concentrations très faibles de
légionelles
-  L’utilisation de la culture traditionnelle en parallèle
permet d’obtenir des résultats plus complets