Nouveaux Développements du couplage CCM- SM
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Nouveaux Développements du couplage CCM- SM
Nouveaux Développements du couplage CCMSM-ELSD : retour d’expérience; commentaires. Mr François Bretin, Chimie Médicinale Oncologie, Sanofi-aventis Sanofi aventis R & D Vitry-sur-Seine Vitry sur Seine Mr Francis Maquin, Analytical Sciences Paris, S Sanofi-aventis fi ti R & D Vit Vitry-sur-Seine S i Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience; p ; commentaires La configuration que nous retenons est CCM-CAMAG-split-ELSD/SM : 2 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p Optimisation p solvant et débit MeOH/H2O/HCOOH (95/5/0.5%) à 0.4 ml/mn Choix du piston (piston ovale) Plus adapté aux produits proches Rétention de la silice M i t Maintenance plus l fréquente fé t 3 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p Piston rond La silice reste sur la plaque (désorption) Maintenance moins fréquente Mais moins adapté aux produits très proches 4 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p Problèmes majeurs j (utilisateurs) ( ) Passage de 4 LC/MS à 3 LC/MS + CCM/MS O il complémentaire Outil lé i de d la l LC/MS C/MS (avantages) ( ) Rapidité: durée d’analyse de 1.5 mn Visualisation instantanée de la masse pendant l’acquisition Récupération de l’analyse sur l’intranet 5 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p 6 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p X OH HO B OTf + A catalyseur au Pd X Cs2CO3/Dioxane/H2O C B Suivi de réaction par CCM et LC/MS 7 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p 3: DAD: TIC 2.5e+008 (16) 82% 421.00 421.00 2.43 100 % (8) 8% 1.69 (18) 6% 2.81 (17) 4% 2.54 0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 1:MSES+ 1.8e+007 Combine (694:724-(640:655+773:788)) 366.20 100 Time 4.00 3.75 42226 422.26 254.22 322.19 % 0 101.03 110.14 154.24 100.00 150.00 253.19 210.27 255.34 196.15 211.37 310.34 323.35 367.35 423.44 421.60 425.32 369.29 619.64 m/z 200.00 250.00 300.00 350.00 8 400.00 450.00 500.00 550.00 600.00 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p 3: DAD: TIC 2.5e+008 (16) 82% 421.00 421.00 2.43 100 % (8) 8% 1.69 (17) 4% 2.54 (18) 6% 2.81 0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 9 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 Time 4.00 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p ELSD-Sedex-65 5.0e+005 (1);100%;0.30 100 % 0 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 Combine (15:21) 44420 444.20 100 Time 1.50 1.40 1:MSES+ 69e+007 6.9e+007 % 44 21 445.21 91.01 446.19 127.23 294.32 332.30 0 m/z 100.00 150.00 200.00 250.00 10 300.00 350.00 400.00 450.00 Nouveaux Développements du couplage CCM-SMELSD : retour d’expérience p Technique complémentaire à la LC/MS Transposition plus rapide pour la purification Pas de problème d’inversion de pics S Sensibilité ibilité très t è intéressante i té t car moins i de d dilution dil ti 11 Couplage CCMCCM-SM ou CCMCCM-SMSM-ELSD (DAD) Francis MAQUIN O t b 2010 Octobre Couplage CCMCCM-SM ou CCM CCM--SM SM--ELSD (DAD) l’absence de hypothèses : signal SM-électrospray d’un spot donne plusieurs ☺ la pression LC est élevée (sup à 40bars ) bouchage du piston : nettoyage ultrasons/inversion éluant pour éliminer le dépôt de silice sur piston (voir manuel instruction Camag). Après cette intervention, intervention la pression LC doit revenir dans une plage du type 4-15 bars. CCM-SM la pression LC est normale : la configuration CCM SM ne permet pas d’estimer le rendement d’extraction du spot CCM ; la concentration du spot CCM est insuffisante ; le spectromètre de masse est la cause du p g des p q ((domaine problème ; mauvais p paramétrage paramètres d’acquisition de masse ; polarité positif/négatif) ; structures associées au spot ne s’ionisant pas sous SM-électrospray (hydrocarbures ; aliphatiques ; ) structures volatiles..). 13 Couplage CCMCCM-SM ou CCM CCM--SM SM--ELSD (DAD) Afin d’éviter de longues heures à tenter d’identifier l’absence de résultats SM, il faut envisager une configuration du type CCM-SM-ELSD. (d’après (d après nos essais, essais le signal UV est trop peu sensible/représentatif des structures isolées par CCM). L’ELSD S (détecteur ( à diffusion ff de lumière, www.sedere.com / Sedere S Sedex 85 LT) est idéal pour le couplage CCM-SM : sensibilité optimale pour débit 0, p 0,1 à 0,6 ml/minutes / ; compatible p tous solvents ; réponse p assurée pour aliphatiques ; phtalates ; lipides ; terpenes ; volatils…. 14 Couplage CCMCCM-SM ou CCM CCM--SM SM--ELSD (DAD) Comme démontré par Mr F. Bretin, nous suivons en simultanée les profils d’évaporation SM, ELSD : x x l’absence de profil ELSD signifie la non désorption du spot CCM via l’interface CCM. La présence de profil ELSD en l’absence de signal SM s’explique par : la non ionisation de la structure, un défaut de fonctionnement du spectromètre de masse… (L’intensité du profil ELSD nous donne une indication sur la concentration associée au spot CCM). 15 Evolution & Développement possibles pour l’interface CCM--SM Camag CCM C Francis MAQUIN Octobre 2011 16 Evolution & Développement possibles pour l’interface CCMCCM-SM Camag ✔Piston rond/ovale : mise en place de tests après fabrication pour limiter des problèmes du type “décollement de la silice” autour du spot selectionné : à discuter avec Chromacin (P.B Savary) et Camag (Support & Service, Service Mr. Mr U. U Bloesch) Bloesch). ✔Remplacement optionel de la vanne rheodyne manuelle de l’interface Camag par une vanne rheodyne automatique OEM (Original Equipment Manufacturer) (= rheodyne MXP 7900-000 sans son boîtier) les contacts closures servant à l’automatisation l automatisation de l’ensemble l ensemble CCM-SM. Avec cette vanne rheodyne OEM, il serait toujours possible de travailler en mode manuel via un montage électrique basic associant un interupteur par exemple. 17 Evolution & Développement possibles pour l’interface CCMCCM-SM Camag ✔ Etude détaillée de l’éluant entrant dans l’interface CCM-SM Camag : methanol/eau/acetonitrile/isopropanol ; pourcentage du melange ; debit de l’éluant ; ajout ou non d’acide formique,TFA ; influence du pourcentage d’eau d eau sur la découpe du spot via le piston Camag (= Camag plunger). A notre connaissance, aucune publication/note d’application n’est disponible sur ce sujet : dommage … ✔Pompe LC optionnelle (pompe binaire,tertiaire ou quaternaire) spécifiquement adaptée aux conditions expérimentales de l’interface CCM-SM Camag(débit inferieur à 0,6 ml/minute) ✔ Optimisation de visualisation spot CCM : micro lampe, camera 18 Evolution & Développement possibles pour l’interface CCMCCM-SM Camag ✔ Automatisation du déplacement de la plaque CCM (avec visualisation des spots intéressante via micro-camera et autres..) lé t i d d OEM : complexité l ité d complémentaire de lla vanne Rh Rheodyne de ce système, prix, faisabilité, fiabilité … 19 Remerciements : Club de chromatographie CCM : Mme Louise Vicard ; Mr Pierre Bernard-Savary y (chromacim-Camag France). MMs Claude Kugel & Bertrand Monégier, Monégier Sciences Analytiques Paris, Paris Sanofi-aventis R & D, Vitry-sur-Seine. MMs Vincent Leroy, Laurent Schio, Chimie Médicinale Oncologie, Sanofi-aventis R & D, Vitry-sur-Seine. 20 20