rapport de stage

Université Joseph Fourier
Département Licence Sciences & Technologie
RAPPORT DE STAGE
« EFFET DE L’HYPOXIE SUR LA LIBERATION
CALCIQUE DES CELLULES MUSCULAIRES LISSES »
CHAPELAIN Sarah
Nom du laboratoire : HP2
Directeur du laboratoire : Patrick LEVY
Maitre de stage : Eric ESTEVE
Licence Biologie 2ème année – Parcours Biologie
Année universitaire : 2013/2014
SOMMAIRE
Présentation du Laboratoire ............................................................................................................. 2
Introduction ........................................................................................................................................ 3
Matériel et méthodes .......................................................................................................................... 4
Modèle vivant ................................................................................................................................................. 4
Hypoxie intermittente ..................................................................................................................................... 4
Entrainement Intensif ..................................................................................................................................... 4
Sacrifice et prélèvements ................................................................................................................................ 5
Anneaux de vaisseaux .................................................................................................................................... 5
Culture cellulaire ........................................................................................................................................ 5-6
Microscopie à Fluorescence ....................................................................................................................... 6-7
Résultats .............................................................................................................................................. 8
Conclusion et perspectives................................................................................................................. 9
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PRESENTATION DU LABORATOIRE
Le laboratoire HP2 (Hypoxie PhysioPathologie cardiovasculaire et respiratoire) étudie, suivant
différents angles d’approche, les conséquences de l’hypoxie intermittente sur les tissus de
l’organisme. En effet, ce laboratoire est composé de trois équipes différentes, la première équipe
composée de médecins mène une recherche clinique au niveau du CHU de Grenoble ; la seconde
équipe située à l’Institut Jean Roget développe une recherche fondamentale (modèle murins) ; enfin
la dernière composante située à l’UFR APS évalue les mécanismes réduisant la performance d’un
effort. L’équipe clinique, quant à elle, diagnostique et traite les maladies chroniques respiratoires,
tandis que l’équipe fondamentale étudie les mécanismes physiologiques misent en place chez les
individus atteints du Syndrome d’Apnées Obstructives du Sommeil (SAOS).
L’équipe fondamentale est constituée de 10 chercheurs statutaires, 6 doctorants et 3 assistants
ingénieurs.
Ce laboratoire associé à l’INSERM ainsi qu’à la structure de l’UJF est dirigé par Patrick LEVY.
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INTRODUCTION
Le syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une maladie respiratoire causant des
troubles du sommeil, peu connue du grand public. Des études montrent que 5 % de la population
d'âge moyen serait atteinte (jusqu'à 20 % selon les tranche d'âge) par cette pathologie dont les
conséquences peuvent être très graves pour l’intégralité de l’organisme. Cette maladie, sousdiagnostiquée, résulte de l'obstruction de la voie respiratoire au niveau du pharynx : ce phénomène
a pour conséquence d’empêcher l'air de passer correctement et peut mener à une apnée obstructive.
L'obstruction est due à un relâchement musculaire qui entraîne une perturbation du sommeil. La
personne atteinte d’apnées voit son sommeil perturbé plusieurs fois par nuit : ces perturbations
nuisent à la qualité du sommeil en réveillant ou perturbant les états de conscience du sujet qui
atteint plus rarement un sommeil profond.
Cette altération du sommeil provoque, d’une part des somnolences importantes pendant la journée,
et d’autre part de l'hypertension artérielle favorisant le développement de maladie cardiovasculaire
grave chez les personnes atteintes. Pour ces raisons, cette maladie est apparentée à un problème de
santé publique et demande une expertise pour comprendre sa mise en place et élaborer des
traitements adéquats. L’hypertension issue de la vasoconstriction des vaisseaux reste la conséquence
la plus préoccupante, ainsi la compréhension des mécanismes misent en place pourrait permettre la
production d’un médicament contrant l’hypertension. Pour ces raisons l’équipe dans laquelle j’ai
fait mon stage étudie la libération calcique des cellules musculaires lisses des vaisseaux sanguins.
En effet, l’activité des cellules musculaires nécessite la gestion de calcium notamment venant du
réticulum pour moduler l’état des vaisseaux en fonction de l’environnement (vasoconstriction /
vasodilatation). Un des symptômes notables du SAOS est l’hypertension artérielle dont une partie
du phénomène passe par la tunique musculaire des vaisseaux.
Les études menées actuellement portent sur l’effet d’un entrainement intensif sur les modèles rats
soumis à un environnement d’hypoxie intermittente ou de normoxie. Ainsi nous étudions la
possibilité d’intégrer l’entrainement au traitement des patients suivis au CHU.
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MATERIEL ET METHODE
Modèle vivant : les rats
Nous utilisons des rats Wistar pour l'étude, ils sont mis en hypoxie à l'âge de 7 semaines et sont
sacrifié après 3 semaines dans le laboratoire. Les rats sont séparés en deux groupes de façon
aléatoire : le premier groupe – considéré comme contrôle - est mis en condition normoxique
pendant 21 jours dans les mêmes conditions (système de soufflerie mais avec un air à 21 %
d’oxygène). Le deuxième groupe, est quant à lui, soumis à l’hypoxie intermittente pendant la durée
de 21 jours. Le rat est un modèle vivant bien adapté pour cette étude car il a un rythme de vie
nocturne, ainsi il dort la journée et nous pouvons les mettre en hypoxie pendant leur sommeil et
contrôler les conditions d’hypoxie.
Hypoxie Intermittente
Les cages de rats sont reliées à un système de soufflerie d'air dont nous pouvons contrôler le taux
d'oxygène. Ainsi les rats sont mis en condition d'hypoxie intermittente pendant 8 h durant l'aprèsmidi. Les cycles de variations du taux d'oxygène durent 1 min et le taux passe de 21 % à 5 %. (Cf.
figure 1)
Figure 1 : Variation du taux d’oxygène dans le système de soufflerie. Cycle sur plusieurs minutes et détail d’un cycle
pendant 1 min.
Entraînement intensif
Avant de commencer l’entraînement intensif, les rats sont habitués au tapis de course pendant une
semaine avec des vitesses et des temps d’entraînement réduits.
Les rats sont entraînés le matin, hors horaire d'hypoxie. L’entraînement est constitué de deux parties
de 24 min séparée par une pause de 30 min. Pendant les cycles d’entraînement la vitesse est
incrémentée de la façon suivante. (Cf. figure 2)
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Figure 2 : Tableau d’entrainement suivi sur 15 jours (5 jours par semaine) et diagramme d’incrémentation de
la vitesse.
Sacrifice et prélèvement de l'aorte
Il existe deux méthodes dans le laboratoire pour sacrifier les rats, la première par inhalation de CO 2
et la deuxième par injection de penthiobarbital. La deuxième méthode est appliquée pour ce
protocole permettant le prélèvement de différents organes pour les différentes études liées à
l'hypoxie. Après le sacrifice des rats, l'aorte est prélevée afin de faire de la culture cellulaire afin
étudier la libération du calcium. Le prélèvement est également utilisé pour l’étude physiologique de
contraction des vaisseaux, ainsi que pour des western-blot et des q-PCR.
Les anneaux de vaisseaux
Après avoir prélevé et dégraissé l'aorte du rat à la loupe binoculaire, une partie du vaisseau est
découpée en anneaux de 2 mm de largueur. Le but de l’expérience est de tester la capacité de
contraction des vaisseaux ainsi que leur sensibilité à différents vasoconstricteurs : pour cela les
vaisseaux sont montés sur un système qui va mesurer l'augmentation de la tension exercée par la
contraction des vaisseaux.
Les anneaux sont immergés dans du liquide physiologique pendant l’expérience, auquel différentes
solutions sont ajoutées.
Une solution de phényléphrine est la première à être ajouté au bain de 10 ml de liquide
physiologique ; sa concentration (de 10-8 à 10-4 mol/l) est augmentée grâce à des ajouts de solution
toutes les 20 min. La concentration optimale de phényléphrine est ensuite déterminée et un lavage
au liquide physiologique est réalisé pendant 45 min. Par la suite, une solution d’acétylcholine est
ajoutée de façon croissante, augmentant ainsi sa concentration, tandis que la concentration de
phényléphrine reste constante (10-6 mol/l). Puis un deuxième lavage est réalisé et l’effet de
l’endothéline est testé pour des concentrations variant de 10-10 à 10-7 mol/l.
La phényléphrine est un vasoconstricteur des vaisseaux et l'acétylcholine est un neurotransmetteur
qui se fixe sur des récepteurs spécifiques des cellules musculaires et entraîne une contraction ou une
dilatation selon les tissus. L'endothéline est un neuropeptide sécrété par l'endothélium vasculaire qui
a un effet vasoconstricteur.
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Mise en culture cellulaire
La mise en culture ne concerne que les cellules musculaires lisses de l'aorte, il y a donc un protocole
qui permet d'isoler ces cellules du reste de l'aorte :
 Dégraissage de l’aorte prélevée dans une solution d’HBSS contenant 1 % d’antibiotique et
d’antifongique (HBSS +AA 1 %) sous la loupe binoculaire.
 Bain de collagénase d’une concentration de 1 mg/ml à 37°C pendant 1 h (ce bain permet de
digérer l’adventice).
 Décollement manuel de l’adventice dans une solution d’HBSS + AA 1% sous la loupe
binoculaire.
 Ouverture de l’aorte dans le sens de la longueur afin de gratter la surface interne
(décollement des cellules de l’intima).
 Découpage du prélèvement en fine dentelle, pour une meilleure efficacité du second bain.
 Bain de papaïne (0,5 mg/ml final) + collagénase (0,3 mg/ml final) + acide aminé cystéine (5
mM) et HBSS à 37°C pendant 30 min.
 Suspension du tissu dans 3 ml d’HBSS+AA 1% pour rincer (étape répétée deux fois).
 Dissociation mécanique grâce à des pipettes (dont la surface a été tapissée de silicone) dans
2,5 ml d’HBSS + AA 1 % (les frottements du passage de l’échantillon, dans la pipette,
permettent de libérer les cellules musculaires lisses).
 Récupération de la solution contenant les cellules.
 Centrifugation pendant 5 min à 250 g.
 Suspension du culot dans 320 µl de milieu complet à 37°C.
 Dépôt de 40 µl dans 8 puits d’une plaque de 24 puits (à fond de verre et préparée avec du
collagène).
 Incubation de la plaque à 37°C pendant 1 h (fixation des cellules au collagène déposé au
fond des puits).
 Ajout de 400 µl de milieu complet à 37°C (pour permettre aux cellules de passer 16 h – 24 h
dans des conditions optimales avent l’observation au microscope à épi-fluorescence).
Microscopie à fluorescence
Afin d'analyser la libération de calcium pour nos cultures cellulaires, le Fluo4-AM est utilisé
comme indicateur calcique fluorescent. Il se fixe sur le calcium et émet une fluorescence qui
marque la présence du calcium (plus la concentration est importante, plus la fluorescence
augmente). Pour que le Fluo-4 entre dans la cellule et se fixe, 250 µl de solution de fluo4 diluée
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avec du HBSS (2 µM) sont mis dans chaque puits de la plaque contenant des cellules ; la plaque est
alors mise à 37°C pendant 20 min. Les puits sont ensuite rincés et remplis avec 300 µl de solution
de Krebs, la révélation se fait avec un microscope à fluorescence. Pour engendrer une libération
calcique, les récepteurs à la ryanodine sont activés grâce à l’ajout de 300 µl de caféine à 20 mM.
Le microscope à fluorescence possède une source lumineuse puissante, dont une gamme de
longueur d’onde spécifique peut être choisit, afin d’exciter le fluorochrome utilisé sur l’échantillon
(Cf. figure 3). Le fluorochrome est dans un état excité après avoir absorbé l’énergie lumineuse
d’excitation. Il retrouve son état stable en émettant à son tour de la lumière d’une longueur d’onde
supérieure à celle d’excitation. Pour le Fluo4-AM la longueur d’onde d’excitation est de 492 nm et
celle d’émission de 514 nm. (Cf. figure 4).
Figure 3 : Schéma explicatif du fonctionnement du microscope à fluorescence
Figure 4 : Spectre d’excitation et d’émission du Fluo4-AM
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RESULTATS
Paramètres physiologiques
Certains paramètres physiologiques du rats sont notés afin d’avoir une meilleure visibilité des effets
de l’hypoxie ; ainsi la fréquence cardiaque et la pression artérielle sont enregistrés grâce à
l’introduction d’un cathéter dans la carotide, et un prélèvement de sang permet de réaliser
l’hématocrite (pourcentage du volume de globule rouge par rapport au volume de sang). Ces paramètres changent sous l’effet de l’hypoxie et permettent ainsi de mettre en évidence les individus
normoxiques de ceux qui ont subi l’hypoxie : c’est un moyen de vérifier que les symptômes de
l’hypoxie sont bien en place chez ces modèles.
PAS : pression artérielle systolique (maximale)
PAM : pression artérielle moyenne (PAM = 1/3 PAS + 2/3 PAD)
PAD : pression artérielle diastolique (minimale)
D’après le tableau ci-dessus, il est visible que l’hématocrite augmente lorsque les individus sont en
condition d’hypoxie intermittente (> 50 %). De plus pour les rats sédentaires, une augmentation
significative de la pression artérielle (PA) a été observée en condition hypoxique. Cependant cette
observation n’est pas reproductible chez les rats entrainés, qui ont une PA statistiquement égale,
qu’ils soient hypoxiques ou normoxiques. (Cf. figure 5).
Figure 5 : Graphique comparatif de la PAM. HI : Hypoxique sédentaire ; N : Normoxique sédentaire ; HIEI :
Hypoxique entrainé ; NEI : Normoxique entrainé.
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Imagerie calcique
L’étude de la fluorescence des cellules, avant et après ajout de la caféine, permet d’exploiter les
images récoltées grâce au microscope à fluorescence. Afin d’obtenir la valeur de la réponse calcique
d’une cellule, la valeur du pic de fluorescence est relevée (Cf. figure 6B) et soustraite à la valeur de
la fluorescence basale (Cf. figure 6A).
A
B
Figure 6 : Imagerie calcique des cellules musculaires lisses. A : fluorescence basale. B : fluorescence après
l’ajout de caféine (t=10s).
La comparaison des données montre que la libération calcique est significativement plus importante
chez les rats hypoxiques non entrainés que chez les rats normoxiques non entrainés. L’exposition à
l’hypoxie intermittente entraine donc une augmentation de la libération du calcium sarcoplasmique,
dans les cellules musculaires lisses de l’aorte. L'utilisation de la caféine permet de caractériser une
partie de la cascade intracellulaire à partir de laquelle se fait la libération de calcium cytoplasmique
dans le cadre du phénomène de contraction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV).
Figure 7 : Graphique comparatif de la réponse calcique, par mesure de fluorescence des cellules musculaires
lisses vasculaires après stimulation des récepteurs RyR par la caféine. Afu : unité arbitraire de fluorescence.
HI : Hypoxique sédentaire ; N : Normoxique sédentaire ; HIEI : Hypoxique entrainé ; NEI : Normoxique
entrainé ; 3 sem : rat sacrifié après 3 semaines d’exposition à l’hypoxie intermittente.
Cependant nous ne retrouvons pas cette même différence chez les rats entrainés ; en effet, la fluorescence enregistrée apparaît augmentée par rapport aux rats non entrainés normoxiques (et sensiblement identique aux rats non-entrainés hypoxiques). Ce phénomène d’augmentation de la réponse
calcique chez les rats entrainés doit donc être étudié : il est nécessaire à ce stade de décortiquer cette
signalisation, grâce à la biologie moléculaire (notamment, par western-blot), pour savoir quels sont
les modifications au niveau des acteurs de la gestion du calcium.
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DISCUSSION ET PERSPECTIVES
D’après les résultats présentés précédemment, l’hypoxie a pour effet d’augmenter la pression artérielle moyenne, ainsi que la libération du calcium du réticulum dépendant des récepteurs RyR. Des
mécanismes sont mis en place par l’organisme lorsqu’il est en condition d’hypoxie, afin que les flux
de calcium vers le cytoplasme soient plus importants ; cela peut provenir : 1) d’une modification de
l’expression des canaux, 2) d’une modification de l’activité de ces canaux, 3) d’une combinaison de
ces deux évènements.
Afin de vérifier ces hypothèses, des q-PCR seront réalisés pour analyser la quantité d’ARNm codant les RyR, ainsi que des western-blot pour quantifier la présence de certains canaux impliqués
dans la signalisation calcique (e.g. RyR) dans les cellules musculaires lisses.
L’entrainement, lui, engendre une augmentation de la réponse calcique chez les rats normoxiques,
cependant aucune différence n’a été observée entre les rats hypoxiques sédentaires et entrainés. Il
est donc possible que l’effort physique répété soit responsable d’une mise en place d’autres mécanismes qui ont des effets visibles uniquement sur les rats normoxiques.
L’étude de ces mécanismes de régulation de la pression artérielle pourrait permettre de mettre en
place un traitement pharmacologique, combiné au système de Pression Positive Continue (PPC),
seule thérapie de référence efficace utilisée à ce jour nécessitant un apprentissage afin d'éviter aux
patients d'abandonner l'utilisation de cet appareillage contraignant. (Cf. figure 8).
Figure 8 : Appareillage PPC
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