Polymorphismes de l`ADN

Introduction
Polymorphismes de
l’ADN
•
Recherche de gènes responsables de maladies
génétiques :
Analyse de pedigrees où la maladie est présente
Sur quel chromosome ?
• À quel endroit du chromosome ?
• …
• Séquence du gène, fonction de la protéine…
•
•
Présentation et mise en évidence
•
Nécessité d’avoir des repères le long des
chromosomes pour aller à la pêche…
C. Camus 2008
Introduction
•
Chromosome 21
Carte des marqueurs connus
C. Camus 2008
•
Les marqueurs polymorphes sont des loci
présentant plusieurs allèles (de 2 à beaucoup) qui
vont servir de balises le long des chromosomes
Ce sont rarement des gènes, mais tous se
transmettent entre générations comme des gènes
C. Camus 2008
1
I- Les Marqueurs polymorphes
1.
2.
3.
4.
RFLP bi-allèliques
Minisatellites
Microsatellites
SNP (single nucleotide polymorphism)
1-RFLP bi-allèliques
•
Restriction Fragment Length Polymorphism
À un locus donné, un site de restriction va être
soit présent soit absent
•
Mise en évidence : Southern blot ou PCR
•
•
Une mutation ponctuelle suffit
C. Camus 2008
C. Camus 2008
1-RFLP bi-allèliques :
1 kb
Allèle 1
Southern blot
2 kb
Allèle 1
3 kb
Allèle 2
Digestion par l’enzyme
Southern blot avec une sonde (
1/1
Allèle 2
) recouvrant le RFLP
2/2
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1-RFLP bi-allèliques : PCR
1/2
PCR avec 2 amorces encadrant le RFLP
Digestion par l’enzyme puis électrophorèse
1/1
2/2
1/2
3 kb
1 kb
2 kb
0,6 kb
1 kb
0,4 kb
C. Camus 2008
2
1-RFLP bi-allèliques : localisation
•
•
Dans toute séquence non codante (97% ADN)
Dans une séquence codante sans conséquence sur
la fonction du gène
•
Si le polymorphisme touche la 3ème base du codon
•
•
•
•
•
•
Allèle 1 CAG
Gln
Allèle 2 CAA
Gln
ATC
Ile
ATC
Ile
TTA (site BglII AGATCT)
Leu
TTA (site BglII absent)
Leu
Si le changement d’acide aminé n’a pas d’effet sur la fonction
Cas particulier : la mutation étudiée crée un
polymorphisme (cf diagnostic direct)
2-Minisatellites
= RFLP multi-allèliques
= VNTR (variable number of tandem repeats)
CTGGATTAGCTTAAGCGT
CTTAGTAGGATGGATGGA
GGAGGTTCAGGTGAT--GGAGGTTCAGGTGATGGA
GGAGGTTCAGGTGATGGG
GGAGGTTCAGGTGATGGG
GGAGGTTCAGGTGATGGG
GGAGGTTCAGGTGATGGA
GGAGGTTCAGGTGAT--ACCTGGGATTCTTCGATC
C. Camus 2008
2- minisatellites
•
•
•
•
Répétitions en nombre variable d’une séquence de
10 à 50 pb à un locus donné
Une même séquence de minisatellite va se
retrouver à différents loci sur tout le génome
Analyse locus par locus
Analyse de la répartition d’un minisatellite sur le
génome entier
C. Camus 2008
minisatellite
PS3 porcin
allèle à 7
répétitions
C. Camus 2008
2-Minisatellites - mise en
évidence des allèles à un locus
•
•
•
Le contexte autour du minisatellite est spécifique
d’un locus
Analyse par Southern blot ou PCR
La sonde ou les amorces s’hybrident autour du
minisatellite : locus-spécifiques
C. Camus 2008
3
2-minisatellites : Southern blot
2-minisatellites : PCR
2 kb
Allèle 1
Allèle 1
3 kb
Allèle 2
Digestion par l’enzyme
Southern blot avec une sonde (
= spécifique d’un LOCUS
1/1
Allèle 2
) adjacente au minisatellite
2/2
PCR avec 2 amorces encadrant le minisatellite
= spécifique d’un LOCUS
1/2
1/1
2/2
1/2
3 kb
2 kb
C. Camus 2008
C. Camus 2008
Exemple
sonde
2-Minisatellites - mise en évidence
des allèles sur tout le génome
•
•
•
C. Camus 2008
Analyse par Southern blot uniquement (PCR =
locus spécifique)
La sonde s’hybride sur le minisatellite
Applications : médecine légale, tests de paternité
C. Camus 2008
4
chromosomes
2- Minisatellites - empreinte génétique
Nb répet.
sonde
= Empreinte génétique
Chr 1
-
Chaque individu
a une empreinte
différente (sauf
les jumeaux
monozygotes) :
Utilisation en
médecine légale
Chr 12
-
Chaque bande présente
chez un individu doit
l’être également soit
chez sa mère soit chez
son père :
test d’exclusion de
paternité
(M= mother, C= child, F=
father)
-
Chr 6
Chr 19
Chr 9
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2-Minisatellites - récapitulation
•
C. Camus 2008
3-Microsatellites
Les minisatellites sont
•
•
•
•
Poly-alléliques : grand nombre d’allèles différents à un locus donné (en
fonction du nombre de répétitions de la séquence)
Multi-locus : une même séquence de minisatellite va se trouver à
différents endroits dans le génome (à chaque fois avec différents allèles
possibles)
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1-6pb répétées n fois (5≤n≤40)
•
•
•
•
Ex : TGTGTGTGTG…..
≥ 50 000 microsatellites (TG)n dans tout le génome humain
Présents sur tout le génome
Mise en évidence par PCR exclusivement
Migration en gel d’acrylamide (plus résolutif que
l’agarose)
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5
3-microsatellites : PCR
3-microsatellites : PCR
Allèle 1
Allèle 2
PCR avec 2 amorces encadrant le microsatellite
= spécifique d’un LOCUS
1/1
2/2
1/2
C. Camus 2008
C. Camus 2008
Lahiri et al, biochemical and molecular medicine 60, 70–75 (1997)
3-microsatellites : PCR
4- Single Nucleotide
polymorphism = SNP
Test de paternité
Amorces fluorescentes et analyse
informatique (lecture laser)
Bandes bleues : marqueur ms11
Bandes vertes : marqueur ms152 et ms 131
Bandes jaunes : marqueur ms63
Bandes rouges : standard de taille interne
- Causés par mutagénèse chimique ou erreurs de
réplication
- bi-alléliques
- ratio des allèles : 99,99:0,01 → 50:50
- Nb loci identifiés chez l’Homme >> 5 millions
- taux de mutation 1.109 /génération
- en conséquence, peu de mutations nouvelles dans
l’espèce
Analyse médico-légale
D12S256
D5S168
D2S187
D6S798
Victim‘s
DNA
6,7
15,8
12,13
7,7
Killer’s
DNA
8,8
13,2
12,11
4,6
Suspect’s
DNA
8,8
13,2
12,11
4,6
C. Camus 2008
C. Camus 2008
6
4- Single Nucleotide
polymorphism = SNP
Mise en évidence :
Les marqueurs polymorphes
•
qu’ils soient poly-alléliques (plutôt mini, microsatellites, SNP que RFLP
bi-alléliques)
 Que chaque allèle soit bien représenté :

- idéal : le polymorphisme correspond à un RFLP
- PCR-SSCP
- Micro-arrays
- séquençage
-…

C. Camus 2008
II- Applications
1.
2.
Cartographie et clonage positionnel
Diagnostic de maladies génétiques
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Diagnostic indirect par analyse de liaison
Diagnostic direct
Médecine légale
Contrôles de filiation
Sélection assistée par marqueur génétique
Gestion de la variabilité génétique
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Pour être informatifs, il faut :
Si sur 6 allèles, un allèle représente 98%, la majorité de
la population sera homozygote pour cet allèle
C. Camus 2008
1- Cartographie et clonage positionnel
•
•
Plus on connaît de marqueurs polymorphes sur
un génome, plus la localisation des gènes va être
facilitée
On recherche des liaisons génétiques entre un
caractère ou une maladie, et des marqueurs
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7
Banques de données
Banques de données
http://dga.jouy.inra.fr/cgi-bin/lgbc/summary.operl?BASE=cattle
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Banques de données : CEPH
http://www.cephb.fr/cephdb/
•
•
•
•
The Foundation Jean Dausset-Centre d'Etude du Polymorphisme
Humain (CEPH) maintains a database of genotypes for genetic
markers that have been typed on the CEPH reference family
resource for linkage mapping (Genomics 6: 575-577, 1990; Science
265: 2049-2054, 1994).The present version of the database (V10.0 November 2004) contains genotypes for 32,356 genetic markers.
These include data for a total of 21,480 bi-allelic markers, of which
17,512 may be assigned to dbSNP.
V10 also contains more than 9,900 microsatellite markers.
The mean observed heterozygote frequency of all the loci in V10.0
is 0.438, and for identifiable microsatellite loci 0.698, of which 56%
are highly polymorphic (obs.het. ｳ 0.70).
The CEPH database now manages 6,081,570 genotypes
C. Camus 2008
C. Camus 2008
2- Diagnostic de maladies génétiques
•
Diagnostic indirect par analyse de liaison
Marqueurs à proximité de la mutation responsable
de la maladie : liaison génétique
Suivre la ségrégation de la maladie au fil des
générations en suivant celle des marqueurs
Historique familial pour mettre en évidence des
recombinaisons
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8
2- Diagnostic de maladies génétiques
Ex : maladie autosomique récessive. Mutation inconnue mais marqueurs à proximité identifiés
7
m
A
2
N
C
×
×
6
m
D
5
N
E
2- Diagnostic de maladies génétiques
Quand c’est possible, étudier la ségrégation de
plusieurs marqueurs situés de part et d’autre de
la mutation responsable : haplotype
Haplotype : association d’allèles de loci contigus
sur un même chromosome
Permet de mettre en évidence des
recombinaisons
•
•
•
7
m
A
6
D
6
m
D
2
A
1er enfant malade
Microsatellite 1 (allèles = chiffres)
Microsatellite 2 (allèles = lettres)
2ème enfant : diagnostic prénatal ?
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2- Diagnostic de maladies génétiques
•
•
•
•
2- Diagnostic direct : exemples
Syndrome d’hyperthermie maligne
•
Diagnostic direct
•
C. Camus 2008
Rare mais très intéressant du point de vue diagnostique
RFLP bi-allèliques uniquement (dans phase codante)
La mutation responsable de la maladie fait apparaître (ou disparaître) un
site de restriction
La mise en évidence du site de restriction indique de façon certaine si la
mutation est présente ou pas
•
•
•
•
•
= sensibilité à l’halothane = syndrome de stress (porc)
Mutation ponctuelle : viande PSE (pale, soft, exsudative)
Mutation au nucléotide 1843 du gène ryr1 - (récepteur à la ryanodine) - récessif létal sous halothane
GCGCTC ➞ GTGCTC apparition d’un site BsiHKA1
Diagnostic : purification ADN, amplification par PCR puis digestion par BsiHKA1
et électrophorèse
N/N
N/m
m/m
N
BsiHKA1
m
C. Camus 2008
C. Camus 2008
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2- Diagnostic direct : exemples
II- Applications
BLAD : Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency
•
•
•
•
•
Race Holstein, récessif, létal
Mutation A ➞ G au nucléotide 383 du gène CD18 - (ß2 integrin - changement
aa128 Asp ➞ Gly)
apparition d’un site HaeII
Diagnostic : purification ADN, amplification par PCR puis digestion par HaeII et
électrophorèse
N/N
N/m
3.
Médecine légale
Empreintes génétiques par minisatellites ou microsatellites (un par un,
plusieurs loci)
4.
Contrôles de filiation
Elevages (canin, félins, chevaux, etc…)
m/m
N
HaeII
m
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II- Applications
5.
6.
Sélection assistée par marqueur génétique
Gestion de la variabilité génétique
Utilisation de marqueurs associés aux caractères d’intérêt. Pas besoin
d’attendre l’expression de ces caractères (qualité lait, viande, etc…)
pour savoir si l’animal les expriment
C. Camus 2008
Conclusion
•
•
•
•
C. Camus 2008
Outils importants
Chez l’Homme comme chez l’animal
Localisation des gènes responsables de maladies
ou de caractères
Diagnostic génétique
C. Camus 2008
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