Castellote Jessie. mémoire biblio.

CASTELLOTE
Jessie
ANNEE 2008
Mémoire bibliographique du Master 2 Recherche
« Elaboration de la Qualité et Sécurité Alimentaire »
Méthodes d’étude de la barrière intestinale:
Mise au point de culture d’explants
intestinaux chez le porc.
Effets des mycotoxines sur l’intestin
Responsable du stage : Martine KOLF-CLAUW
Lieu du Stage : Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
Table des matières
RESUME ................................................................................................................................................. 2
INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 3
I.
LES DIFFERENTES METHODES D’ETUDE DE LA BARRIERE INTESTINALE :...................... 4
1.
LES METHODES SUR L’ANIMAL : IN VIVO ET IN SITU: ........................................................................ 4
Les méthodes in vivo : ........................................................................................................... 4
Méthodes in situ : ................................................................................................................... 5
2.
METHODES IN VITRO : ................................................................................................................... 6
a. Modèles cellulaires : ............................................................................................................... 6
a.
b.
•
•
b.
c.
3.
II.
Exemple des cellules Caco-2 : ..................................................................................................................... 6
Cellules porcines IPEC-1 : ............................................................................................................................ 7
Les sacs intestinaux éversés : ................................................................................................ 8
Chambre d’Ussing : ................................................................................................................ 8
BILAN DES DIFFERENTES METHODES : ........................................................................................... 9
METHODE IN VITRO : CULTURE D’EXPLANT ......................................................................... 10
A.
B.
PRESENTATION DE LA METHODE .................................................................................................. 10
QUELQUES ETUDES UTILISANT LA METHODE: ............................................................................... 11
•
•
•
C.
BROWNING T.H. and TRIER J.S. : ................................................................................................................ 11
NIETFELD et al. :............................................................................................................................................ 13
GIRARD et al. :............................................................................................................................................... 14
COMPARAISON DES METHODES DE DIFFERENTES ETUDES :........................................................... 16
CONCLUSION : .................................................................................................................................... 18
REFERENCES : .................................................................................................................................... 19
ANNEXES : ........................................................................................................................................... 21
Figure A1 : Schéma des différentes parties de l’intestin grêle. ....................................................................... 21
Figure A2 : Schéma de l’organisation d’une partie de l’intestin grêle. ........................................................... 21
Figure A3 : Schéma de la structure de 2 valvules conniventes. ..................................................................... 21
Figure A4 : schéma représentant les différentes cellules de l’épithélium intestinal. .................................... 22
Tableau A1 : Conditions de culture pour l’utilisation des cellules Caco-2. .................................................... 22
Tableau A2 : Composition du milieu de culture pour les cellules porcines IPEC-1.. ................................... 22
Tableau A3 : Avantages et limites des différents modèles d’étude de la barrière intestinale..................... 23
Tableau A4 : Corrélation entre différentes techniques d’étude de la barrière intestinale............................ 23
Table des illustrations :
Figure 1: Schéma de montage d'une méthode in situ.
Figure 2: Représentation schématique d'une culture de cellules Caco-2.
Tableau 1 : Avantages et limites des différentes méthodes.
Tableau 2 : Composition des milieux des trois études.
Tableau 3 : Résumé des différentes études utilisant la culture d’explants.
5
7
10
15
17
1
Résumé
Les filières de l’alimentation animale et humaine sont de plus en plus
soucieuses de la qualité sanitaire des matières qu’elles utilisent. Les mycotoxines,
comme le déoxynivalénol (DON), sont des contaminants de la chaîne alimentaire.
Ces contaminations sont donc un facteur de risque important pour la santé humaine
et animale. En effet, des études épidémiologiques, ont montré un lien entre le DON
et des maladies gastro-intestinales. Le porc est un animal très sensible aux effets
des mycotoxines, de plus la structure de la barrière intestinale des porcs est similaire
à celle de l’homme. C’est donc un animal modèle et approprié pour étudier les effets
de ces contaminants sur la barrière intestinale. Des techniques ont donc été
développées afin d’étudier la fonction d’absorption et le pouvoir entéropathogène des
bactéries sur cette barrière. Différentes méthodes existent passant de l’in vivo à l’in
vitro. Les méthodes in vitro sont nombreuses, nous aborderons ici les cultures
cellulaires, les sacs éversés et la chambre d’Ussing. Cette étude bibliographique
abordera rapidement ces études, et nous centrerons ce mémoire sur une autre
méthode in vitro qui est la culture d’explants intestinaux sur le porc. Cette méthode
sera mise au point dans notre laboratoire afin d’étudier les effets du DON associé à
d’autres mycotoxines sur la barrière intestinale.
2
Introduction
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires fongiques, qui peuvent
contaminer l’alimentation animale et humaine, à toutes les étapes de la chaîne
alimentaire. Cette contamination est un facteur de risque important pour la santé
humaine et animale. En effet, plus de 25% des cultures mondiales peuvent être
contaminées par ces mycotoxines [5,15]. Elles se développent aussi bien sur les
plantes au champ ou en cours de stockage. Ces toxines restent stables même après
la disparition des moisissures et peuvent être thermostables, on peut donc les
retrouver dans les produits finis comme la farine, pain, gâteaux…[1] Le
déoxynivalénol (DON) est l’une des mycotoxines les plus répandus, il appartient au
groupe des trichothécènes, qui sont produits par des Fusarium [1]. Des études
épidémiologiques ont montrées un lien entre le DON et des maladies gastrointestinales. C’est pourquoi, les filières de l’alimentation animale mais aussi de
l’alimentation humaine sont de en plus soucieuses de la qualité sanitaire des
matières qu’elles utilisent, dont la teneur en mycotoxines.
Le porc est un animal très sensible aux effets des mycotoxines, à une
concentration de 1mg de DON/kg d’aliment, il y a une baisse de la consommation
des aliments par l’animal. Lorsque les doses sont plus fortes, le DON contenu dans
l’alimentation peut avoir des effets sur la performance de croissance, la reproduction,
les paramètres sanguins (taux d’hématocrite, hémoglobine, hormones circulantes…)
et des effets sur la fonction immunitaire [1]. On peut donc considérer que le porc est
un animal approprié pour l’étude des effets de ces mycotoxines. Par ailleurs, c’est
aussi un animal modèle pour l’homme, en effet, leur tractus gastro-intestinal est
similaire du point de vu structural [11].
L’épithélium intestinal constitue la première barrière de défense lors de
l’ingestion des aliments. Il réduit les risques d’infection par des pathogènes et
d’ingestion de contaminants, en bloquant l’entrée de micro-organismes et de
molécules chimiques ingérées [16, 17]. Il joue également un rôle dans le système
immunitaire [16]. Cette barrière est composée de cellules épithéliales spécialisées
qui sont bien organisées notamment avec des structures intercellulaires, comme des
jonctions serrées et les jonctions d’adhérences [16,18]. Certains contaminants
alimentaires comme les mycotoxines ou les bactéries peuvent avoir des effets sur
cette barrière intestinale [3, 4, 6].
L’objectif de mon travail expérimental sera de mettre au point une technique
de culture d’explants intestinaux de porc, cette méthode permettra d’étudier les effets
3
des mycotoxines sur la barrière intestinale. Différentes méthodes d’études sont
proposées et l’utilisation de celles-ci diffère suivant la question qui est posée [13]. La
plupart des méthodes ont été développées pour l’étude de la fonction d’absorption
des xénobiotiques et du pouvoir entéropathogène des bactéries. On distingue trois
groupes de méthodes : les techniques in vivo, qui se réalisent directement sur
l’animal, les méthodes in situ, qui sont faites grâce à des préparations perfusées
dans un segment intestinal de l’animal et les méthodes in vitro [13, 17]. Nous
centrerons cette étude bibliographique sur les explants intestinaux après avoir
abordé d’autres méthodes in vitro nombreuses et diverses : les cultures cellulaires,
les sacs éversés et la chambre d’Ussing. La culture d’explants intestinaux permet de
préserver la structure histologique normale et la viabilité de la muqueuse en dehors
de l’animal [14]. Elle se situe donc entre les méthodes in vivo et les méthodes in
vitro.
I.
Les différentes méthodes d’étude de la barrière intestinale :
Dans ce premier chapitre, nous aborderons les méthodes autres que la culture
d’explants qui sera développée dans le second chapitre de cette étude
bibliographique.
1. Les méthodes sur l’animal : in vivo et in situ:
a. Les méthodes in vivo :
Elles sont réalisées par des administrations de composés chez l’animal de
manières différentes : voie orale, voie intraveineuse et autres voies. L’animal le plus
fréquemment utilisé pour ces études est le rat [13, 17]. En effet, celui-ci reflète mieux
la situation humaine en respectant l’espace paracellulaire et le métabolisme par
rapport au chien qui était utilisé précédemment [13].
Le principal avantage de cette méthode est que tous les facteurs pouvant
avoir un effet sur la barrière intestinale sont présents ici. L’inconvénient de ce modèle
est qu’il est impossible de séparer les variables impliquées dans le processus
d’absorption, c'est-à-dire qu’il n’est pas possible d’identifier les facteurs limitants [13].
Un autre inconvénient est que l’animal est parfois sacrifié afin d’évaluer les effets
provoqués par la substance testée. Cette méthode pose donc un problème du point
de vue économique mais aussi éthique, surtout lorsque ce sont des gros animaux qui
sont utilisés. De plus la mise en œuvre de cette technique est complexe [17].
4
b. Méthodes in situ :
Ces méthodes consistent à injecter un composé par perfusion dans un
segment intestinal. Elles permettent l’étude du transport et du métabolisme intestinal,
l’étude de la perméabilité et la cinétique de nouvelles molécules, voire
éventuellement la sécrétion de certains composés dans la lumière intestinale après
une administration par intraveineuse [13, 17]. Pour réaliser ce modèle, l’animal doit
être anesthésié afin d’atteindre la cavité abdominale et d’installer une perfusion d’une
solution contenant une substance à tester, en concentration connue, dans un
segment intestinal cathétérisé en boucle fermée ou ouverte [13]. On observe ensuite
la disparition de la substance afin de calculer l’absorption intestinale [17]. Le schéma
de montage de cette technique est présenté en figure 1.
Figure 1: Schéma de montage d'une méthode in situ: principe de
la perfusion intestinale [17].
L’avantage de cette méthode est que l’on conserve la vascularisation et
l’innervation des segments intestinaux étudiés mimant ainsi les conditions du in vivo
et permettant le contrôle de la perfusion à tout niveau (concentration, pH, débit,
région intestinale…) [17]. L’avantage par rapport à l’in vivo est que l’on évite le
passage du composé par l’estomac et donc de la forte acidité qui pourrait précipiter
les substances [13].
Ce modèle est limité du fait que la disparition du composé est considérée
comme l’indicateur de l’absorption. Or cette disparition ne représente pas toujours le
taux d’absorption par l’intestin, en effet certaines substances peuvent subir un
métabolisme pré-systémique [17]. Une autre limitation de cette technique est le
grand nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des données significatives
statistiquement [17]. D’autre part, il a été montré que l’intervention chirurgicale
pouvait provoquer une modification significative du débit sanguin et donc modifier le
taux d’absorption [13, 17].
5
2. Méthodes in vitro :
Les méthodes in vitro comportent les modèles s’appuyant sur la culture
cellulaire et tissulaire [13, 17]. Concernant les cellules, seront abordés exclusivement
les cellules Caco-2 et les cellules porcines IPEC-1. Concernant les tissus, les sacs
éversés et la chambre d’Ussing seront décrits.
a. Modèles cellulaires :
L’épithélium digestif est en perpétuel renouvellement qui suit un axe temporospatial bien défini. Au niveau des cryptes, des cellules indifférenciées se multiplient
puis migrent vers le haut des villosités en se différenciant en cellules de villosités afin
de former l’unité tissulaire essentielle de l’absorption. On a donc une organisation de
l’épithélium intestinal permettant une optimisation du transport des nutriments et des
solutés depuis la lumière intestinale vers les compartiments internes de l’organisme.
La figure A4 des annexes présentent les différents types cellulaires présents dans
l’épithélium intestinal [17].
•
Exemple des cellules Caco-2 :
Il existe différentes lignées permettant l’étude de la perméabilité intestinale
chez l’homme, elles sont toutes issues d’adénocarcinomes coliques humains
(cancers) [13, 17]. Les cellules Caco-2 sont des cellules qui se différencient
spontanément, en culture, en cellules intestinales polarisées, possédant à son pôle
apical une bordure en brosse (entérocytes) et des jonctions serrées avec les cellules
adjacentes. Elles expriment également des transporteurs à leur surface [13, 17].
Elles sont issues du côlon humain, et sont bien adaptées pour l’étude de la
différenciation intestinale mais aussi pour le transport et le passage des composés
[13].
Les cellules Caco-2 sont mises en croissance en une monocouche de cellules
différenciées formant ainsi une membrane semi-perméable. Ainsi, on peut séparer le
compartiment apical du compartiment baso-latéral afin d’étudier les mouvements des
produits testés [13]. Cette technique est robotisée, il donc possible d’étudier entre
500 et 2000 composés par mois et l’utilisation de plaques 24 puits couplés à
l’analyse de chromatographie liquide et spectrométrie de masse (LC/MS) permet de
réduire les quantités de produit utilisé [17]. Le schéma de montage d’une culture de
cellules Caco-2 est présenté en figure 2.
6
Figure 2: Représentation schématique d'une culture de cellules
Caco-2 sur un filtre avec des micropores [13].
Cette technique comporte de nombreuses limites bien qu’elle soit le modèle le
plus utilisé pour le moment pour l’étude de l’absorption de médicaments. Elle est en
cours de validation par l’ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative
Methods) [13]. Le principal inconvénient est qu’une culture demande généralement 3
semaines comprenant 8 à 9 ensemencements, les conditions de culture sont
résumées dans le tableau A1 des annexes [13,17]. Cette méthode peut conduire à
des faux-négatifs en sous estimant la perméabilité due à l’adsorption aux structures
en plastiques. Une autre limite est que l’utilisation de solvant organique même à
faible dose peut diminuer l’intégrité des jonctions serrées [17].
•
Cellules porcines IPEC-1 :
Sur le même principe des cellules Caco-2 des cellules épithéliales intestinales
porcines peuvent être utilisées pour étudier la barrière intestinale du porc, les cellules
IPEC-1 [3]. L’effet de certaines mycotoxines (fumonisine B1 par exemple) est étudié
en utilisant ces cellules, on peut citer les études de S. BOUHET et I. P. OSWALD [3,
4,5]. Ces cellules sont issues d’une lignée de cellules épithéliales intestinales
dérivées de l’intestin grêle d’un porc (Mini-Porc New Hampshire) nouveau né. Les
cellules sont cultivées en atmosphère saturée en eau, à 5% de CO2 et à 37°C. Le
milieu de culture est présenté dans le tableau A2 des annexes [3].
Ces cellules sont capables de se différencier afin de mimer un épithélium
intestinal. Ainsi le même système de culture sur filtre que celui utilisé pour les
cellules Caco-2 est possible. Ces cellules sont donc ensemencées sur des filtres de
Tranwells poreux (porosité de 0,4 µM ; Becton Dickinson Labware). Elles sont
amenées à confluence et les milieux apicaux et basaux sont remplis de milieu
complet sans sérum, mais contenant de la dexaméthasone (50 µg/ml, Sigma) afin
que les cellules puissent se différencier [3].
7
b. Les sacs intestinaux éversés :
Cette technique à été mise au point par W ILSON et W ISEMAN en 1954, sur des
rats et des hamsters, pour l’étude du transport de sucres et d’acides aminés de la
muqueuse à la surface de la séreuse [17,19]. L’intestin est prélevé de l’animal et est
retourné sous forme de sacs et la région étudiée est plongée dans un milieu salin
avec les molécules à étudier. L’oxygénation du milieu permet d’augmenter la viabilité
du tissu au-delà de 2h [13,17]. Cette technique peut être utilisée pour l’étude du
transport des molécules mais aussi pour déterminer les paramètres cinétiques avec
une grande fiabilité et reproductibilité [13].
L’avantage de ce modèle est de permettre l’étude des mécanismes
d’absorption de molécules qui sont réalisés par des transports actifs ou des
diffusions passives. D’autre part le volume du compartiment séreux étant assez
faible, on a une accumulation rapide du composé à étudier. C’est une technique
simple et rapide [13,17].
Cependant
elle
a
quelques
inconvénients,
comme
l’absence
de
vascularisation et d’innervation, l’éversion du tissu intestinal qui peut provoquer des
lésions morphologiques. De plus la présence de la couche musculaire de la
muqueuse qui n’est généralement pas enlevée de ces préparations ne reflète pas la
barrière intestinale chez l’animal [13,17].
c. Chambre d’Ussing :
Cette technique a été mise au point par USSING et ZEHRAN en 1951 pour
l’étude du transport actif du sodium comme source de courant électrique dans un
petit circuit isolé de la peau de grenouille [13,17]. Plus tard ce modèle est utilisé pour
étudier le transport d’ion à travers différentes membranes. De nos jours, elle est plus
utilisée pour l’étude de transport intestinal [13,17].
Cette technique est réalisée en isolant des tissus intestinaux qui sont
découpés en bandes de taille appropriée. Après ablation de la couche musculaire le
fragment d’intestin est placé entre deux compartiments où l’on pourra mesurer le
passage d’une molécule à travers cette barrière. Les deux cotés sont plongés dans
une solution isoosmotique et isobare vis-à-vis du tissu. La température est
maintenue à 37°C pendant toute l’expérience, le tis su est oxygéné avec 95% d’O2 et
5% de CO2, permettant également l’homogénéisation des milieux. La viabilité du
tissu est observée grâce à deux paires d’électrodes dans chaque compartiment afin
de mesurer la résistivité de la préparation. Le composé étudié peut être placé dans le
8
compartiment muqueux mais aussi du coté séreux [17]. Le schéma de montage
d’une chambre d’Ussing est présenté en figure 3.
Figure 3: Schéma de montage d'une chambre d'Ussing. Source: site
internet de l'Oroxcell, partenaire biopharmaceutique des sciences du
vivant. http://www.oroxcell.com
Cette technique permet d’étudier les différences d’absorption en fonction des
différents segments intestinaux, on peut également étudier les différences de la
barrière intestinale entre les espèces. On peut également étudier les effets de
certains composés sur les paramètres électro-physiologiques de la barrière
intestinale [13].
L’avantage de cette méthode est que les quantités de composés utilisées sont
faibles et les échantillons recueillis sont propres simplifiant le travail analytique
ultérieur. Le manque d’innervation et de vascularisation et la perte de viabilité au
cours de l’expérience représentent les points négatifs de cette méthode. Un autre
inconvénient est le changement morphologique et fonctionnel du tissu au cours du
prélèvement et du montage dans les chambres [13].
3. Bilan des différentes méthodes :
Dans le tableau 1, ci-après, sont résumés les avantages et les limites des différentes
méthodes, le tableau original est présenté en annexe : tableau A3. Il existe des
corrélations également entre les différentes méthodes, ce qui est présenté dans le
tableau A4 des annexes [17].
9
Techniques
Avantages
Limites
Intègre les aspects du passage et du métabolisme.
Technique in situ
(rat)
Tous les facteurs qui influencent le passage sont
Pas utilisé en routine
présents.
L’augmentation de la pression hydrostatique
Etudes d’absorption dans les sites particuliers de
de la lumière pendant l’expérience peut
l’intestin.
influencer la perméabilité intestinale.
Etudes des effets directs de composés sur
C’est un modèle animal
l’absorption intestinale.
Méthode relativement simple et rapide.
Facteurs physiologiques influençant le
Un modèle flexible
passage ne sont pas présent (mucus, sels
Culture cellulaire :
Etudes des mécanismes de transport
biliaires, cholestérol)
Caco-2
Exposition des composés du côté apical ou baso-
Modèle statique
latéral
Cellules d’origine tumorale
Cellules humaines
Modèle avec seulement un type de cellule
Tous les types cellulaires et la couche de mucus
Ce n’est pas un modèle perfusé.
Sac intestinal
sont présents
Les composés peuvent traverser la barrière
éversé (rat)
Technique relativement rapide et pas chère
intestinale entière.
Etudes du mécanisme d’absorption
C’est un modèle animal.
Absorption et passage de composés spécifiques à
Techniques de mesure doivent être sensibles
un site de l’intestin est possible.
Viabilité cellulaire limitée
Chambre d’Ussing
Composés à étudier peut être ajoutés du coté apical
Les composés peuvent traverser la barrière
(rat)
ou baso-latéral.
intestinale entière.
Etudes du métabolisme sont possibles
Disponibilité de tissus humains limitée
Modèle humain et animal
Tableau 1 : Avantages et limites des différentes méthodes.
Traduit à partir du tableau de l’étude de l’ECVAM [17].
II.
Méthode in vitro : Culture d’explant
a. présentation de la méthode
La culture d’explants est une méthode permettant de préserver la structure
histologique normale et la viabilité de la muqueuse en dehors de l’animal [14]. Ce
modèle d’étude a été mis au point par BROWNING et TRIER en 1969 à partir de
l’intestin grêle humain. En ce temps-là, la préservation des tissus de l’intestin grêle
était un sérieux problème, en effet, elle était limitée par la durée des expériences in
vitro, comme les sacs éversés. L’intégrité des cellules épithéliales était maintenue à
court terme car la destruction des tissus se produisait quand la culture était
prolongée au-delà de 2 ou 3h. Des études permettant la culture de certains tissus
existaient mais elles n’étaient pas appropriées à des cultures d’organes comme c’est
le cas ici [7].
Grâce à ces pionniers de la culture d’explants intestinaux, la culture d’organe
est devenue une méthode bien établie pour les études de différents aspects du
métabolisme de l’intestin grêle. En effet, contrairement aux sacs éversés qui sont
performants sur des intervalles courts de 1 ou 2h, les explants peuvent être gardés
viables pour des périodes de 24 à 48h [8]. La culture d’explants intestinaux a été
appliqué à de nombreuses espèces : homme, lapin, cobaye, rat, souris, porc… [8] et
10
différentes parties de l’intestin peuvent être utilisées comme le duodénum, jéjunum,
l’iléon ou encore le colon [9]. La survie des explants grâce aux systèmes de culture
diffèrent suivant les espèces et le protocole utilisé. Les explants d’humains, primates,
lapins, cobayes et porcs peuvent être maintenus pendant 24 à 48h, alors que des
explants de rats adultes, souris et hamsters dégénèrent rapidement [14]. L’âge du
donneur est également important pour la survie des explants. Par exemple, Chez le
rat, au niveau néonatal, les explants peuvent être préservés pendant 48 à 72h de
culture. Pour des rats âgés de 21 jours, les explants après 24h de culture présentent
des modifications morphologiques comparables à ceux de rats âgés de 4 à 13 jours
après 48h de culture [14].
Le grand avantage de cette technique est qu’à partir d’un seul animal on peut
avoir un large nombre d’explants [14]. D’autre part, contrairement aux méthodes in
vitro qui utilisent un seul type de cellules, les explants sont une barrière intestinale
très proche de l’intestin in vivo [9]. Les chambres d’Ussing utilisaient déjà des
segments d’intestin pour les études mais ces derniers étaient détériorés au cours de
l’expérience qui durait peu de temps. On peut étudier de nombreux effets sur ces
explants intestinaux, comme la pathogénie des bactéries [2, 9, 10, 20].
De nombreuses études utilisent ce modèle avec diverses espèces et pour une
espèce donnée le système de culture peut différer d’une étude à l’autre. Car les
protocoles ne sont pas standardisés et présentent de nombreuses différences. Les
études, pour lesquelles cette technique est utilisée, sont également très variées.
Nous essaierons donc de résumer les méthodes décrites dans quelques unes de ces
études.
b. Quelques études utilisant la méthode:
Nous nous intéresserons surtout à trois études dont dérivent pratiquement
toutes les autres. La dernière méthode de ces trois études sera celle que nous
utiliserons pour la mise au point de la culture d’explants de porc au laboratoire. Celleci s’est inspirée des deux premières méthodes présentées ci-dessous.
Les différents milieux de culture des différentes études sont résumés dans le
tableau 2 à la fin de ce chapitre.
•
BROWNING T.H. and TRIER J.S [7]:
L’une des premières cultures d’explants intestinaux d’animaux adultes a été
réalisée par BROWNING et TRIER, en 1969, qui ont décrit une méthode pour maintenir
des biopsies de muqueuses humaines in vitro pour une période de 24h. Ils ont
11
appliqué la méthode de culture d’autres organes de TROWELL, avec quelques
modifications. Ils décrivent aussi des études initiales de prolifération cellulaire et
l’absorption de lipides par les biopsies en culture. Les biopsies ont été obtenues sur
de jeunes hommes adultes volontaires après 12h de jeûne, à partir de la jonction
duodénojéjunale. Les biopsies sont placées dans un système de culture d’organe 1 à
5 minutes après leur excision longitudinale.
Le système de culture est composé de disques en plastiques, stériles de 5,5
cm de diamètre (Falcon Plastics, Los Angeles, Calif.). Ceux-ci ont un puits central de
2 cm dans lequel le milieu de culture est placé et qui supporte une grille en acier
inoxydable. Ce puits central est entouré par un autre puits qui contient un coton
saturé avec une solution NaCl à 0,9%. Les biopsies sont orientées avec les villosités
vers le haut et la surface coupée vers le bas, donc vers la grille. Du milieu est ajouté
dans le puits central jusqu’à atteindre le haut des villosités par l’action de capillarité.
Les disques sont couverts, placés sur une étagère en acier et maintenus à 37°C
(température constante). Une oxygénation, 95% d’O2 et 5% de CO2, de 20 minutes
est réalisée puis les disques sont rebouchés. Le milieu est renouvelé et oxygéné
après 6h ou 12h de culture.
L’étude de la prolifération cellulaire est réalisée in vitro par ajout de thymidine
tritiée (New England Nuclear Corp., Boston, Mass.). Les biopsies sont ensuite fixées
(chrome-osmium froid, 4 minutes) après 6h ou 12h de culture. Puis elles sont
découpées en tranche de 1mm dans la largeur et fixées à nouveau 1h. Les tissus
sont ensuite placés dans un tampon de formol neutre à 10% pendant 30 minutes,
déshydratés dans des concentrations croissantes d’alcool, et enrobés dans une
résine époxy. Ils sont, par la suite, découpés à l’aide d’un microtome (1µm, Ivan
Sorvall, Inc., Norwalk, Conn.), colorés au bleu de toluidine. Pour l’étude auto
radiographique, les tissus non colorés sont plongés dans une émulsion d’Ilford L-4
(Ilford, Ltd., Essex, England) diluée (1 :1) dans l’eau distillée. Après le séchage, les
coupes sont stockées dans des boîtes en présence de sulfate calcique anhydre. Les
lames sont incubées dans le réfrigérateur pour 6-8 semaines et ensuite développées
avec le développeur Kodak D-19 (4 minutes), fixées, lavées, séchées et colorées au
bleu de toluidine.
Ils ont obtenu des tissus maintenus normaux dans ces cultures in vitro, avec
des villosités plus courtes après 24h de culture comparées à celles fixées
directement après l’excision. Ils constatent également que les cellules de la lamina
propia sont moins nombreuses, au bout de 24h de culture. Des quantités variables
de matériel hétérogène (mucus, débris cellulaire) sont présents à la surface de
12
l’épithélium de quelques villosités et dans la lamina de certaines cryptes. Ils trouvent
des zones de nécroses cellulaires qui sont moins présentes dans les biopsies fixées
au bout de 12h de culture et rares après 6h de culture in vitro. Du point de vue
cellulaire, les structures colonnaires et les cellules épithéliales avec leur bordure en
brosse (entérocytes) étaient bien maintenues et quelques mitoses étaient présentes
dans les cryptes même après 24h de culture. La microscopie électronique,
permettant de voir les cellules plus en détail, confirme que la morphologie cellulaire
est maintenue formant ainsi un épithélium normal au bout de 24h de culture.
•
NIETFELD et al. [14] :
Suite à BROWNING et TRIER [7], différentes études se sont inspirés de cette
méthode avec quelques modifications, c’est le cas de cette étude de NIETFELD et al.
Des études antérieures de W ILLIAMS et al. ont réussi à maintenir des explants de
porcs, âgés de moins de 7 jours, pendant plus de 5 jours. L’objectif de cette étude
est de caractériser la culture et les modifications morphologiques dans les explants
de muqueuse intestinale de porcs sevrés âgés de 4-10 semaines. Sur la base de
certaines études préliminaires utilisant des explants d’intestin grêle de hamster,
différents milieux de culture ont été utilisés. La composition exacte des milieux est
résumée dans le tableau 2.
Des segments d’iléons sont récupérés sur des porcs âgés de 3 semaines et
n’ayant aucune pathologie. Les tissus sont coupés en sections de 3 cm de long,
ouverts le long de la bordure mésentérique, lavés dans du RPMI 1640 froid et
plongés dans le même milieu le temps du transport au laboratoire. La muqueuse, par
la suite, est disséquée et laissée dans le froid (hypochlorite de sodium à 0,04% dans
une solution saline de tampon phosphate) afin de réduire la contamination
microbiologique. Les sections sont par la suite rincées dans du RPMI 1640 froid,
redécoupées en fragments de 3X5 mm. Ces derniers sont placés avec les villosités
vers le haut sur des éponges de gélatine de 1cm2 (2 explants/éponge). Les éponges
sont ensuite placées dans des boites de Pétri de 60 mm, et le milieu de culture est
ajouté jusqu’à atteindre la base des explants, et l’action de capillarité tire le milieu à
la surface villositaire. Les explants sont incubés à 37°C dans une chambre à
atmosphère contrôlée (5% de CO2 et 95% d’O2). Pour les explants cultivés avec le
milieu de Leibovitz L-15 sans NaHCO3 la culture est réalisée avec 100% d’air à 37°C.
Les explants sont incubés sur une plate-forme stationnaire ou sur une bascule
d’agitation à 6 cycles /min. Le milieu de culture est changé après 6h de culture, puis
à des intervalles de 24h. Les explants des 2 premiers porcs sont fixés après 6,12 et
13
24h d’incubation, puis à des intervalles de 24h pour 7 jours. Les explants du 3éme
porc sont fixés à 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 et 96h de culture
La fixation des explants est réalisée dans le formol à 10% pendant 24 à 48h.
Pour l’examen en microscopie optique, les explants sont traités de manière
classique, c’est-à-dire, enrobés dans la paraffine, sectionnés à 3 µm et colorés à
l’Hémalun-éosine (H&E). Pour l’observation en microscopie électronique, les
explants sont découpés en sections de 1mm3, rincées au tampon phosphate puis
fixées au tétraoxyde d’osmium, déshydratées dans l’alcool et enrobées dans une
résine époxy. Elles sont ensuite sectionnées pour atteindre 1µm, colorées au bleu de
toluidine et examinées en microscopie optique. Les sections ultra fines des zones
sélectionnées sont coupées et colorées avec du citrate de plomb et montées sur des
grilles de nickel couvertes avec un film.
Le résultat majeur de cette étude était que les explants survivaient plus
longtemps dans une condition précise qui permettait la conservation des
caractéristiques morphologiques des tissus. Le milieu permettant cette conservation
est le RPMI 1640 avec du tampon HEPES et les différents additifs ajoutés au milieu.
Mais les inhibiteurs d’espèces activées d’oxygène comme la superoxide dismutase
(SOD) et la catalase n’ont pas permis l’amélioration des caractéristiques
morphologiques de la muqueuse. Les explants ont une architecture intacte au niveau
des cryptes villositaires et de l’épithélium intestinal après 48h de culture. Dans cette
étude, l’acide ascorbique ajouté au milieu prolonge la survie de la muqueuse en
inhibant probablement les dommages cellulaires par réduction des radicaux libres
formés pendant l’oxygénation des explants.
•
GIRARD et al. [9] :
L’étude de GIRARD et al. s’est inspirée des méthodes de ZHU et al. [20] qui
s’inspiré lui-même de la méthode de NIETFELD et al. [14] avec quelques modifications
qui vont être décrites par la suite. Le sujet de cette publication était de voir le rôle de
l’intimine et des protéines Tir dans l’adhérence de Escherichia coli productrice de
Shiga toxine sur la muqueuse intestinale du porc. Pour cela des segments du
duodénum, jéjunum, iléon, caecum et colon de porcs nouveau-nés privés du
colostrum (1er lait maternel) ont été utilisés.
La séreuse des segments intestinaux est enlevée ainsi que le mucus de
manière stérile. Les tissus sont ensuite découpés en segments de 9mm2 et placés
avec la muqueuse vers le haut sur des coussinets de mousse (Curtin Matheson
Scientific, Inc., Texas) qui sont dans une plaque de culture tissulaire de 4 puits
14
Nunclon Delta Surface (Invitrogen life technologies, Burlington, Ontario, Canada),
avec 3 explants par mousse. Le milieu de culture est ajouté dans les puits. Pour
étudier l’effet des bactéries sur les segments intestinaux, ces derniers sont ensuite
inoculés avec un bouillon de culture à la surface de la muqueuse, à trois reprises, à
des intervalles d’une heure. L’incubation est réalisée à 37°C sous agitation avec une
oxygénation à 95% d’O2 et 5% de CO2 pour 8h et le renouvellement du milieu est
réalisé toutes les heures en commençant 2h après l’inoculation initiale des segments
afin de maintenir le pH constant et de limiter la croissance bactérienne.
Afin de vérifier que les effets des bactéries sur les segments intestinaux, une
étude d’histopathologie est réalisée. La fixation est réalisée après rinçage des tissus
au tampon salin phosphate stérile, par du formol à 10%. Les tissus fixés sont ensuite
placés dans des sacs de nylon, puis couverts de paraffine, sectionnés en tranches
de 5µm et colorés à l’hématoxyline, phloxine et safranine (HPS). Les sections sont
observées en microscopie afin de voir des lésions d’attachements et d’effacement de
la barrière intestinale.
Dans cette étude, il n’y a aucune description des segments non inoculés avec
les bactéries, mais on imagine qu’ils étaient maintenus normaux tout le long des
expériences, qui sont de durée moyenne (8h).
Auteurs
Milieux
Milieu T-8 de Trowell (9 parts)
BROWNING and TRIER
Sérum de veau fœtal (1part)
Pénicilline G cristalline (10 000U/100ml) et Sulfate de streptomycine (0,01g/100ml) pour limiter
la croissance bactérienne et fongique.
CMRL 1066 ou RPMI 1640 avec HEPES ou Leibovitz L-15 +/- NaHCO3 ajusté à un pH entre 7,2
et 7,4
Pénicilline (100U/ml), Streptomycine (100µg/ml), Amphotericine B (0,1 µg/ml) et Gentamicine
NIETFELD et al.
(50µg/ml) pour limiter la croissance bactérienne et fongique.
Suppléments en quantités variables :
Sérum de veau fœtal inactivé, Hydrolysat de lactalbumine, Hydrocortisone, Insuline
Acide ascorbique (0,3 mg/ml) avec des inhibiteurs d’espèces activées d’oxygène : superoxide
dismutase (SOD, 20µg/ml) catalase (1mg/ml)
RPMI 1640
Sérum de veau fœtal (10%), Hydrolysat de lactalbumine (0,25%), Hydrocortisone (0,2µg/ml),
GIRARD et al.
Insuline (0,1µg/ml)
β-mercaptoéthanol (75mM)
D-mannose (1%), L-glutamate et L-aspartate (2mM)
Tableau 2 : Composition des milieux des trois études présentées
ci-dessus. Informations tirées de ces trois études [7, 9, 14].
15
c. Comparaison des méthodes de différentes études :
Dans le tableau 3 suivant, sont résumés d’autres études ayant utilisé la
méthode de culture d’explant sur des espèces autres que des rongeurs. Les études
utilisant cette technique sont très nombreuses, il était donc impossible de toutes les
prendre en compte ici. La première étude du tableau résume celle de GIRARD et al.
[9] qui a été présenté dans le chapitre précédent. Le sujet de la plupart des études
était d’étudier les effets entéropathogènes sur la barrière intestinale [2, 10, 12, 20]. Il
a été étudié également la réplication d’entérovirus [11] et la biosynthèse de protéines
dans les explants intestinaux [8].
On peut remarquer que le milieu généralement utilisé est soit le milieu utilisé
par BROWNING et TRIER, les pionniers de cette méthode, le milieu de Trowell soit le
RPMI 1640. Ici une étude, HEINZ et al. [11], a utilisé le milieu CMRL-1066 car ils
pensaient que la méthode de BROWNING et TRIER [7] n’était pas encore bien adapté
au tissus porcin. Cependant des études antérieures et d’autres plus tard ont utilisé le
milieu de Trowell et ont eu un bon maintien de la structure de la barrière intestinale.
On peut observer tout de même que les études utilisant le RPMI 1640 comme milieu
de culture ont des durées d’expériences ne dépassant pas 12h [9, 10, 20] alors que
les autres études ont pu être prolongées jusqu’à 48h [2, 8, 11, 12]. Mais l’âge des
animaux peut influencer sur la survie des explants intestinaux.
Deux systèmes de culture sont utilisés, les explants peuvent être disposés sur
une grille d’acier inoxydable au dessus d’un puits contenant le milieu de culture [2, 8,
12]. Une autre méthode est de placer les explants sur des coussinets de mousse
dans des plaques de culture tissulaire contenant des puits avec le milieu de culture
[9, 10, 20]. Dans les deux cas le milieu atteint les villosités par capillarité.
Nous retiendrons pour notre mise au point la méthode de Girard et al. [9], bien
décrite, qui a été appliquée à diverses espèces et à différents segments de l’intestin
grêle avec de bons résultats [9, 10].
16
Modèle animal
Système de culture
milieux
Incubation
Porcs nouveau-
Mousse (3
RPMI 1640
37°C
nés :
explants/mousse)
Sérum de veau fœtal, Hydrolysat de
95% d’O2 et 5% de CO2
Duodénum,
dans les plaques
lactalbumine, Hydrocortisone, Insuline
Agitation
jéjunum, iléon,
4puits de culture
β-mercaptoéthanol
Changement de milieux toutes les
caecum, colon
tissulaire
D-mannose, L-glutamate et L-aspartate
Eponge de polyester
Porcs nouveau-
(2 explants/éponge)
nés :
dans une plaque de
iléon
culture tissulaire à 6
RPMI 1640 + HEPES
Sérum de veau fœtal, Hydrolysat de
lactalbumine, Hydrocortisone, Insuline
Porc femelle
CMRL-1066 ou Trowell T-8 ou DMEM ou
Yorkshire
NCTL
et 9-11 mois)
Non indiqué
Antibiotiques : Pénicilline, Streptomycine,
tétracycline
30cm de la fin
L-glutamine, sérum, hydrocortisone
de l’iléon
hemisuccinate, insuline bovine
Porc
Intestin grêle
(Danielsen et
al.)
Jéjunum (Kik et
al.)
Grille d’acier
colon terminal,
rectum terminal
ZHU et al.
12h
Non indiqué
(1995)
[20]
Architecture bien conservée
48h
Renouvellement milieu après 24h
avec le milieu CMRL-1066.
Nécrose évidente avec les
autres milieux
Heinz et al.
(1987)
[11]
Pas de modification structurale
Danielsen et al.
37°C
après 5h de culture
(1981)
Oxygénation (95% d’O2 et 5% de
Modifications mineures après
[8]
CO2) pendant 3min après 0, 5 et
24h
d’organe.
d’organe
Iléon terminal,
95% d’O2 et 5% de CO2
10h de culture
Iléon distal
(2005)
[9]
37°C
Sérum de veau fœtal
plaques de culture
Non indiqué
Changement de milieu toutes les
Antibiotiques : Pénicilline, Streptomycine
White)
(6-9 semaines)
Agitation (6cycles/min)
les plaques de culture
inoxydable dans des
Friesan
8h
95% d’O2 et 5% de CO2
explants/grille) dans
Grille d’acier
Taureau
GIRARD et al.
heures.
Trowell T-8
(New Zealand
Auteurs
37°C
inoxydable (10
Lapin albinos
Etats des explants
heures.
puits.
(4-6 semaines
Durée
Solution de Trowell
37°C
Pénicilline
95% d’O2 et 5% de CO2
48h
L-glutamine
10h et 24h de culture
Ultrastructure des entérocytes
Kik et al.
bien maintenues après 24h de
(1991)
culture.
[12]
Bordure en brosse intacte à
48h
Batt et al.
(1987)
[2]
Mousse (4
explants/mousse)
dans les plaques
4puits de culture
Milieu complet RPMI 1640 (référence :
étude de Girard et al. (2005))
37°C
95% d’O2 et 5% de CO2
8h
Préservation des tissus
excellente
Girard et al.
(2007)
[10]
tissulaire
Tableau 3 : Résumé des différentes études utilisant la culture d’explants.
17
Conclusion :
De nombreuses études existent afin d’étudier la barrière intestinale, elles
passent des essais sur l’animal, in vivo, aux cultures cellulaires, in vitro. Située à mis
chemin entre ces deux méthodes, on trouve la technique de culture d’explants. Celleci permet de maintenir en culture des organes ou des tissus. La méthode de culture
d’explant a été développée depuis de nombreuses années, elle est utilisée dans de
nombreuses études, sur différents animaux, sur différents organes. Différents
systèmes de culture, mais aussi différents milieux peuvent être utilisés. Le maintien
des structures et de la morphologie des organes dépend de nombreux facteurs
notamment l’espèce animale, l’âge de l’animal, la durée des expériences, le milieu
de culture…
Afin de voir les effets de certaines mycotoxines, comme le DON associé à
d’autres mycotoxines, sur le tractus intestinal, cette méthode de culture in vitro peut
être utilisée. Le modèle animal qui est le plus adapté pour ces études est le porc. En
effet, la similarité de structure du tube digestif, entre l’homme et le porc permet
d’extrapoler les résultats obtenus sur l’animal à l’humain.
La mise au point de la culture d’explants intestinaux de porc au laboratoire
sera réalisée en s’inspirant dans un premier temps de l’étude de GIRARD et al. [9] qui
a été réalisé sur différents segments du tube digestif de porc. Cette méthode a été
choisie par rapport aux autres, car elle a été utilisée dans des études diverses qui
ont été réalisées sur différentes espèces. De plus, les résultats obtenus avec cette
méthode ont montré un excellent maintien des explants en culture. D’autre part,
l’étude de Nietfeld et al., a comparé différents milieux de culture pour les explants et
a eu de meilleurs résultats en utilisant le RPMI 1640, comme milieu de culture. Ce
qui renforce notre choix de la méthode. Cependant si le maintien des explants n’est
pas concluant, certains paramètres de cultures pourront être modifiés afin que les
conditions de culture soient optimales. Une fois que les explants seront maintenus
viables assez longtemps, nous étudierons les effets des mycotoxines sur ces
explants. Une attention particulière sera portée sur les jonctions serrées des cellules
épithéliales intestinales et l’association de mycotoxine avec le DON.
18
Références :
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chaînes alimentaires humaine et animale, 81 pages, 2006.
2. - BATT R.M., HART C.A., McLEAN L., SAUNDERS J.R.: Organ culture of rabbit
ileum as a model for the investigation of the mechanism of intestinal damage by
enteropathogenic Escherichia coli. Gut, 1987, 28, 1283-1290.
3. - BOUHET S., HOURCADE E., FIKRI A., MARTINEZ S., OSWALD I.P.: Effet de
la fumonisine B1, une mycotoxine inféodée au maïs, sur les cellules épithéliales
intestinales porcines. Journées Recherche Porcine, 2004, 36, 309-314.
4. - BOUHET S., HOURCADE E., LOISEAU N., FIKRY A., MARTINEZ S., ROSELLI
M., GALTIER P., MENGHERI E., OSWALD I.P. : The mycotoxin fumonisin B1
alters the proliferation and the barrier function of porcine intestinal epithelial cells.
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5. - BOUHET S., LE DORZE E., PERES S., FAIRBROTHER J.M., OSWALD I.P. :
Mycotoxin fumonisin B1 selectively down-regulates the basal IL-8 expression in
pig intestine: in vivo and in vitro studies. Food Chem. Toxicol. 2006, 44, 17681773.
6. - BOUHET S., OSWALD I. P. : The intestine as a possible target for fumonisin
toxicity. Mol. Nutr. Food Res., 2007, 51, 925-931
7. - BROWNING T.H., TRIER J.S.: Organ Culture of Mucosal Biopsies of Human
Small Intestine. J. Clin. Invest., 1969, 48, 1423-1432.
8. - DANIELSEN E.M., SJÖSTROM H., NOREN O., BRO B., DABELSTEEN E.:
Biosynthesis of intestinal microvillar proteins. Biochem. J., 1982, 202, 647-654.
9. - GIRARD F., BATISSON I., FRANKEL G.M., HAREL J., FAIRBROTHER J.M.:
Interaction of Enteropathogenic and Shiga Toxin-Producing Escherichia coli and
Porcine Intestinal Mucosa: Role of Intimin and Tir in Adherence. Infection and
Immunity, 2005, 73, 6005-6016.
10. - GIRARD F., DZIVA F., van Diemen P., PHILLIPS A.D., STEVENS M.P.,
FRANKEL G.: Adherence of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157, O26, and
O111 Strains to Bovine Intestinal Explants Ex Vivo. Applied and Environmental
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11. - HEINZ B.A., CLIVER D.O., DONOHOE B.: Enterovirus Replication in Porcine
Ileal Explants. J. gen. virol., 1987, 68, 2495-2499.
12. - KIK M.J.L., KONINKX J.F.J.G., van des Muysenberg A., HENDRKSEN F.:
Pathological effects of Phaseolus vulgaris isolectins on pig jejunal mucosa in
organ culture. Gut, 1991, 32, 886-892.
13. - LE FERREC E., CHESNE C., ARTUSSON P., BRAYDEN D., FABRE G.,
GIRES P., GUILLOU F., ROUSSET M., RUBAS W., SCARINO M.L. : In Vitro
19
Models of the Intestinal Barrier, The report and recommendations of ECVAM
Workshop. ATLA, 2001, 29, 649-668.
14. - NIETFELD J.C., TYLER D.E., HARRISON L.R., COLE J.R., LATIMER K.S.,
CROWELL W.A.: Culture and morphologic features of small intestinal mucosal
explants from weaned pigs. Am. J. Vet. Res. 1991, 52, 1142-1146.
15. - OSWALD I.P., DESAUTELS C., LAFFITTE J., FOURNOUT S., PERES S.Y.,
ODIN M., LE BARS P., LE BARS J., FAIRBROTHER J.M.: Mycotoxin fumonisin
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Environ. Microbiol., 2003, 69, 5870-5874.
16. - OSWALD I. P. : Role of intestinal cells in the innate immune defence of the pig
intestine. Vet. Res., 2006, 37, 359-368.
17. - Thèse: THIRION Catherine Claire Chantal: Evaluation et développement de
modèles expérimentaux de sélection des composes: approches in silico, in vitro,
in situ et in vivo de l’absorption intestinale. 75 pages, 2002.
18. - THIRIET M. (INRIA), (consulté le 18 décembre 2007), Intestin grêle. [en ligne],
http://www-rocq.inria.fr/who/Marc.Thiriet/Glosr/Bio/TubDigest/Intestinp.html.
19. - WILSON T.H., WISEMANG. : The use of sacs of everted small intestine for the
study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface.
J. Physiol., 1954, 123, 116-125.
20. - ZHU C., HAREL J., JACQUES M., FAIRBROTHER J.M. : Interaction with Pig
Ileal Explants of Escherichia coli O45 Isolates from Swine with Postweanning
Diarrhea. Can. J. Vet. Res., 59, 118-123.
20
Annexes :
Figure A1 : Schéma des différentes parties de l’intestin grêle [18].
Figure A2 : Schéma de l’organisation d’une partie de l’intestin
grêle [18].
Figure A3 : Schéma de la structure de 2 valvules conniventes
[18].
21
Figure A4 : schéma représentant les différentes cellules de
l’épithélium intestinal [18].
Tableau A1 : Conditions de culture pour l’utilisation des cellules
Caco-2 [13].
Milieu de culture
Compléments
DMEM/F12
Eurobio, les Ulis, France
Sérum de veau fœtal (5%)
Perbio Sciences, Bezons, France
L-glutamine (2mM)
Eurobio
Hépès (15 mM)
Eurobio
Epidermal growth factor (5 µg/l)
Becton Dickinson Labware, Le Pont de Claix, France
Sigma, St Quentin Fallavier, France
ITS (insuline, transférine, selenium)
Antibiotiques
Pénicilline (100 U/ml)
Eurobio
Streptomycine (50 µg/ml)
Tableau A2 : Composition du milieu de culture pour les cellules
porcines IPEC-1. Informations tirées de l’étude de BOUHET et al.
[3].
22
Tableau A3 : Avantages et limites des différents modèles d’étude
de la barrière intestinale. [13]
Tableau A4 : Corrélation entre différentes techniques d’étude de
la barrière intestinale [13].
23