pp._276-282_Bornert_.. - Société Vétérinaire Pratique de France

C o m m u n i c a t i o n
Etude du comportement de Listeria
monocytogenes dans des «salades
traiteur» conditionnées
sous atmosphère modifiée
par G. Bornert
Vétérinaire biologiste en chef, Spécialiste du Service de santé
Groupe de secteurs vétérinaires interarmées
Quartier FOCH, BP 16, 35998 Rennes Armées
D. Leroux
Vétérinaire biologiste principal, Assistant du Service de santé
Groupe de secteurs vétérinaires interarmées
Quartier Osterode, B.P. 21, 69998 Lyon Armées
Y. Bouhda
Vétérinaire capitaine (Forces armées royales du Maroc)
Ecole d’application du Service de santé des armées
1, Place Alphonse Laveran
75230 PARIS Cedex 05
RÉSUMÉ
Afin de préciser le comportement de Listeria monocytogenes dans des salades composées
réfrigérées industrielles commercialisées en grande distribution, des tests d’ensemencement
volontaire ont été réalisés, avec conservation des échantillons à + 4 °C durant quinze jours
après inoculation.
Une décroissance significative de la population de Listeria monocytogenes est observée
dès le quatrième jour dans le cas des carottes râpées et du taboulé. Le même effet est constaté
avec la salade piémontaise à partir du neuvième jour d’entreposage.
Ces résultats démontrent que les salades traiteur ne constituent pas des denrées «à risque»
au regard du danger Listeria et permettent d’envisager d’alléger les plans de surveillance
en place dans l’industrie dans le cadre de la prévention de la listériose humaine.
Mots-clés
Listeria monocytogenes - Réfrigération - Salades composées
276
Bull. Soc . Vét. Prat. de France , novembre/décembre 2001, T. 85, n° 5
Introduction
M
aladie qualifiée d’émergente, en raison
de la multiplication récente des cas chez
l’homme, la listériose constitue l’une
des grandes préoccupations d’actualité
dans le domaine de la sécurité des aliments.
Largement médiatisées, les épidémies survenues
récemment en France ont motivé la mise en place, dans l’industrie agro-alimentaire, de plans de
prévention très contraignants, pouvant aller jusqu’au contrôle microbiologique de chaque lot de
produits avant commercialisation.
L’analyse du danger, préalable indispensable à la
définition d’un plan d’action cohérent, reste parfois difficile par manque de données bibliographiques en ce qui concerne l’écologie de Listeria
monocytogenes. C’est le cas en particulier dans le
domaine des produits carnés de troisième transformation. Il en résulte une tendance à classer
comme «à risque» de très nombreuses denrées, en
l’absence de données spécifiques.
Ce type d’approximation peut s’avérer préjudiciable au plan économique s’il conduit à une «surprévention». A l’inverse, il se révèle dangereux
pour le consommateur dès lors que le risque est
anormalement minimisé.
Les résultats d’une étude visant à évaluer le comportement de Listeria monocytogenes dans des
produits réputés «sensibles», les salades composées réfrigérées, sont présentés.
Tableau n° I
Caractéristiques physico-chimiques
des carottes râpées assaisonnées
Composition moyenne
Carottes fraîches, râpées : 75 %
Assaisonnement à base d’huile
et de jus de citron : 25 %
Paramètres
physico-chimiques
pH
Aw
Valeur à JO
4,42
0,981
Valeur à J4
4,40
0,980
Valeur à J9
4,30
0,963
Valeur à J15
4,34
0,967
Tableau n° II
Caractéristiques physico-chimiques de la salade piémontaise
Composition moyenne
Pommes de terre cuites, sans peau : 50 %
Jambon cuit standard : 10 %
Œufs durs écalés : 5 %
Tomates : 5 %
Cornichons : 5 %
Mayonnaise : 25 % (77 % d’huile, 6 % de
jaune d’œuf, vinaigre, persil
Paramètres physicochimiques
pH
Aw
Valeur à JO
4,74
0,998
Valeur à J4
4,75
0,993
Valeur à J9
4,52
0,971
Valeur à J15
4,51
0,975
1. Matériels et méthodes
1.1 Echantillonnage
Les échantillons sont des barquettes de salades
composées, d’un poids net de 200 grammes, destinées à la vente en grande distribution. Ces denrées sont présentées conditionnées sous atmosphère modifiée. Le mélange gazeux utilisé est
composé de 70 % d’azote et de 30 % de dioxyde
de carbone, avec une teneur résiduelle en oxygène garantie inférieure à 3 %.
Trois recettes ont été retenues, considérées comme représentatives de la diversité de cette gamme
de produits :
• une préparation de végétaux crus, les carottes
râpées assaisonnées (cf. tableau I) ;
Tableau n° III
Caractéristiques physico-chimiques du taboulé
Composition moyenne
Semoule de blé dur, grain moyen,
réhydratée : 68 %
Poivron rouge : 5 %
Poivron vert : 5 %
Tomate : 5 %
Raisins secs : 2 %
Assaisonnement à base de menthe et
de jus de citron : 15 %
Paramètres physicochimiques
pH
Aw
Valeur à JO
4,21
0,983
Valeur à J4
4,15
0,973
Valeur à J9
4,12
0,950
Valeur à J15
4,15
0,954
277
• un mélange de végétaux et de denrées d’origine animale, la salade piémontaise (cf. tableau
II) ;
• un mélange de végétaux crus et de semoule
cuite, le taboulé (cf. tableau III).
Pour chaque recette, trente échantillons élémentaires ont été prélevés au sein d’un lot de fabrication, sur la chaîne de production d’une entreprise
industrielle implantée en Bretagne.
1.2 Ensemencements
Une suspension bactérienne a été préparée à partir d’une souche de Listeria monocytogenes provenant de la «souchothèque» du Centre technique de
la salaison, de la charcuterie et des conserves de
viandes à Maisons-Alfort.
Figure 1 - Chaîne de production.
La souche a été cultivée durant 24 heures à
+ 30 °C en bouillon tryptone soja, puis entreposée
à + 3 °C pendant 24 heures afin de placer les cellules bactériennes dans un état physiologique de
«stress froid». A l’issue, il a été réalisé une dilution
de la culture bactérienne dans une solution
aqueuse stérile de chlorure de sodium à 0,9 %.
L’inoculation des échantillons à l’aide de cette suspension bactérienne a été effectuée par piqûre au
travers de septums autocollants fixés sur les barquettes, afin de ne pas modifier la composition du
mélange gazeux au contact du produit. Le taux de
contamination initial recherché était de 106 unités
formant colonies environ par gramme de produit.
Pour chaque recette, il a été procédé à l’ensemencement de vingt-cinq échantillons, tandis que
cinq échantillons étaient inoculés à l’aide d’une
solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 %, à
titre de témoins.
Les échantillons élémentaires ont été regroupés
par séries de six échantillons, soit pour chaque série un témoin et cinq barquettes ensemencées.
La première série a été analysée immédiatement
après constitution (série J0), tandis que les autres
échantillons ont subi un entreposage à + 4 °C
(± 1 °C) avant analyse, durant 1 (série J1), 4 (série
J4), 9 (série J9) ou 15 (série J15) jours.
1.3 Analyses microbiologiques
Figure 2 - Salade piémontaise.
278
Les analyses microbiologiques avaient pour objet
de procéder au dénombrement des Listeria monocytogenes dans les échantillons de denrées.
Ces dénombrements ont été effectués conformément à la méthode normalisée «de routine» décrite dans la norme expérimentale XP V 08-062 (3).
Pour tenir compte de la relative hétérogénéité des
produits, le volume de la prise d’essai a été porté
à 80 grammes. Pour chaque échantillon, la suspension-mère a été réalisée par dilution de la prise d’essai dans 240 ml d’eau peptonée tamponnée
(dilution au 1/4). Après une étape de revivification, soit une heure à + 20 °C, des dilutions décimales ont été réalisées pour procéder à l’ensemencement d’un milieu de type OXFORD et d’un
milieu de type PALCAM.
statistique. Ces trente échantillons ont été répartis
en cinq sous-populations de six échantillons, dont
un témoin non ensemencé.
Pour chaque durée de conservation, il a été obtenu une série de cinq résultats de dénombrement
de Listeria monocytogenes. Ces résultats ont été
analysés à l’aide du logiciel de traitement de données EXCEL 97ND. La moyenne et l’écart-type ont
été calculés pour chaque série (J0, J1, J4, J9 et
J15), en distinguant les résultats obtenus sur milieu OXFORD de ceux observés sur milieu PALCAM. La comparaison des moyennes ainsi obtenues a été réalisée par un test de Student à n-1
degrés de liberté avec échantillons appariés.
En ce qui concerne les témoins, il a été effectué
une vérification de l’absence de contamination par
Listeria spp. (moins de 1 unité formant colonie par
gramme) par la méthode de recherche «de routine», selon la norme NF V 08-055 (2).
2. Résultats
Toutes les analyses ont été effectuées par un laboratoire accrédité par le Comité français d’accréditation.
2.1 Dénombrements bactériens
Pour chaque recette et pour chaque milieu de dénombrement utilisé, les moyennes des dénombrements sont indiquées (cf. tableaux IV et V).
1.4 Examens physico-chimiques
1.5 Analyse statistique
Les résultats obtenus pour les séries J0 ont été
comparés à ceux des séries J1, J4, J9 et J15. Les
analyses statistiques pratiquées mettent ainsi en
évidence, avec un risque de 5 %, une décroissance de la population de Listeria monocytogenes, significative dès le quatrième jour dans le cas du taboulé et des carottes râpées, et dès le neuvième
jour dans le cas de la salade piémontaise.
Pour chaque recette, les trente échantillons identiques prélevés au sein d’un même lot de fabrication ont été considérés comme une population
Par ailleurs, les résultats des dénombrements
réalisés sur milieu OXFORD et sur milieu PALCAM
ne sont pas significativement différents, au seuil
de 5 %.
Les paramètres potentiel hydrogène (pH) et activité de l’eau (Aw) des différentes recettes ont été
mesurés sur les échantillons témoins à J0, J4, J9 et
J15, afin d’apprécier les conditions écologiques offertes aux Listeria.
Tableau n° IV
Résultats des dénombrements (moyenne et écart-type par séries de cinq mesures)
effectués sur milieu PALCAM (x 105 UFC par gramme)
Taboulé
Carottes râpées
Salade piémontaise
Moyenne
Ecart-type
Moyenne
Ecart-type
Moyenne
Ecart-type
JO
18,50
7,22
12,75
1,26
23,88
14,07
J1
13,96
9,19
21,83
25,78
20,56
16,73
J4
6,30
2,60
6,48
2,20
9,34
5,08
J9
1,63
1,81
2,80
0,67
4,68
1,10
J15
0,38
0,25
1,25
0,38
4,28
3,34
279
2.2 Caractéristiques physico-chimiques
d’infection humaine (10), seule l’espèce Listeria
monocytogenes présente un pouvoir pathogène significatif chez l’homme et chez l’animal.
Les trois recettes étudiées présentent une acidité
marquée (cf. tableaux I, II et III). Le taboulé est le
produit le plus acide, avec un pH égal à 4,2 à J0.
Au plan réglementaire, les critères microbiologiques applicables, pour Listeria monocytogenes
(1), prennent en compte l’avis formulé le 8 septembre 1992 par le Conseil supérieur d’hygiène
publique de France (cf. tableau VI). Pour les produits tels que les salades composées, qui ne font
pas l’objet d’un traitement assainissant au cours de
leur élaboration, l’objectif des industriels doit rester l’absence de Listeria monocytogenes dans les
denrées alimentaires. Cependant, une contamination au stade de la production («présence dans 25
grammes») est considérée comme tolérable si le
fabricant peut démontrer que le produit respecte
le critère «moins de 100 UFC par gramme» jusqu’au
stade de la consommation. L’application de cette
tolérance réglementaire implique donc de
connaître précisément les possibilités de survie,
voire de croissance des Listeria dans le produit
considéré.
Au cours du temps, une légère acidification est
observée, avec des valeurs de pH minimales à J9.
En ce qui concerne l’activité de l’eau, les valeurs
mesurées sont élevées, en particulier pour la salade piémontaise. Pour chaque produit, une diminution progressive de l’Aw est constatée au cours
de la phase d’entreposage, la valeur minimale
étant obtenue pour le taboulé, soit 0,95 à J9.
3. Discussion
3.1 Cadre réglementaire
Si Listeria seeligeri et Listeria ivanovii ont été incriminées de façon exceptionnelle dans des cas
Tableau n° V
Résultats des dénombrements (moyenne et écart-type par séries de cinq mesures)
effectués sur milieu OXFORD (x 105 UFC par gramme)
Taboulé
Carottes râpées
Salade piémontaise
Moyenne
Ecart-type
Moyenne
Ecart-type
Moyenne
Ecart-type
JO
18,70
7,74
12,75
2,36
17,78
12,42
J1
11,12
3,43
23,15
28,11
18,08
12,06
J4
6,28
2,43
7,60
2,20
7,20
3,43
J9
0,57
0,44
0,28
0,55
2,22
1,43
J15
5,28
4,73
2,60
3,54
1,47
0,31
Tableau n° VI
Critères réglementaires applicables aux denrées alimentaires en ce qui concerne Listeria monocytogenes (1)
Type de produit
Aliments spécialement destinés à une population
sensible, tels que les aliments pour bébés
ABSENCE dans 25 grammes
ABSENCE dans 25 grammes
Aliments ayant subi un traitement assainissant
dans leur conditionnement final ou conditionnés
aseptiquement après traitement
n=5 c=0
n=5 c=0
Autres produits (crus, manipulés après assainissement,
insuffisamment traités) sauf produits laitiers
Absence dans 25 g
n=5 c=0
Produits à base de lait sauf ceux visés précedemment
280
Limites numériques
et plan d’échantillonnage au stade
de la production
de la distribution
Tolérance possible (présence) si au stade de la
distribution le produit respecte les critères définis
m = 100/gramme
avec n = 5 et c = 0
(M = m)
Absence dans 25 grammes ou dans 1 gramme
(selon le produit)
n=5 c=0
m = 100/gramme
avec n = 5 et c = 0
(M = m)
3.2 Ecologie de Listeria monocytogenes
En l’absence d’études spécifiques, l’écologie de
Listeria monocytogenes dans de nombreux produits alimentaires, en particulier les mélanges
complexes, reste assez mal connue. Sa présence
dans les aliments végétaux bruts est considérée
comme «naturelle», ou du moins inévitable dans
des conditions normales de culture, dans la mesure où le biotope naturel de cette bactérie est le
sol, où elle se développe en saprophyte sur des
végétaux en décomposition (6). En ce qui concerne les viandes crues et les produits carnés, la
contamination s’effectue généralement à l’abattoir
ou dans les ateliers de transformation. Les Listeria
colonisent ces locaux humides et froids, au niveau
des matériels et des plans de travail, formant des
biofilms pouvant résister aux opérations de nettoyage et de désinfection (7). Préparations constituées de végétaux parfois mélangés à des produits
d’origine animale, les salades composées «traiteur»
sont donc des vecteurs potentiels de Listeria monocytogenes. Ce point de vue doit cependant être
précisé en fonction de la composition de chaque
produit. L’influence de l’assaisonnement, donc de
la recette de chaque salade, ne peut être négligée.
Listeria monocytogenes est considérée comme
l’une des bactéries pathogènes non sporulées les
plus résistantes à des conditions de milieu «hostiles», capable de se développer jusqu’à un pH de
4,3 et dans des aliments contenant jusqu’à 10 % de
chlorure de sodium (5). En ce qui concerne l’Aw,
les Listeria peuvent se développer jusqu’à 0,943
(8), mais leur croissance est optimale pour des valeurs supérieures à 0,97.
De nombreux facteurs sont susceptibles de moduler l’influence de ces paramètres sur le comportement des bactéries dans les aliments. En particulier, la tolérance au pH varie en fonction de la
nature de l’acidifiant utilisé (5), de la teneur en sel
et en matières grasses, et de l’activité de l’eau de
l’aliment (4, 9). De ce fait, seules des études spécifiques, sur la base de tests d’ensemencement volontaire, peuvent apporter des informations
fiables sur un produit donné.
3.3 Cas des salades «traiteur»
L’interprétation des résultats de cette étude révèle :
– dans un premier temps, une absence de
croissance de la population de Listeria
monocytogenes..
Figure 3 - Carottes râpées assaisonnées.
Le mode opératoire retenu dans cette étude plaçait Listeria monocytogenes en position de flore
bactérienne dominante. En effet, les examens microbiologiques «de routine» réalisés par l’industriel
dans le cadre des auto-contrôles permettent de situer le taux habituel de contamination des salades
composées en flore aérobie mésophile à + 30 °C
(«flore totale») entre 105 et 5.105 unités formant colonies par gramme. Malgré un très fort taux de
contamination initiale en Listeria, qui peut être
considéré a priori comme un avantage dans le
contexte de la compétition avec la flore saprophyte du produit, il n’a pas été observé de croissance de la population de Listeria monocytogenes.
– dans un second temps, une décroissance de
la population de Listeria monocytogenes..
Pour chacune des trois préparations, taboulé, carottes râpées et salade piémontaise, une diminution significative des résultats des dénombrements
est constatée, ce qui peut être interprété comme
le signe d’un effet létal des conditions de milieu
sur les Listeria. Cet effet est d’apparition précoce
dans le cas du taboulé et des carottes râpées, alors
qu’il n’est significatif qu’après neuf jours d’entreposage dans le cas de la salade piémontaise. Une
telle différence est vraisemblablement la conséquence des caractéristiques physico-chimiques de
la salade piémontaise, moins acide et d’Aw plus
élevée que les autres recettes.
281
Il faut enfin noter que l’acidification constatée au
cours du temps peut être considérée comme la
conséquence de la croissance d’une flore de type
lactique, homofermentaire et psychrotrophe, très
caractéristique des produits de ce type. Le pH initial étant toujours très bas, la croissance de cette
flore acidifiante est assez rapidement inhibée, de
sorte que les variations de pH observées restent
faibles.
Conclusion
Figure 4 - Le taboulé.
Quoique significative, cette décroissance reste limitée à moins de un logarithme à l’issue de quinze jours d’entreposage.
Les résultats de cette étude confirment donc les limites d’une approche trop simpliste de l’écologie
bactérienne, qui aurait conduit à considérer la salade piémontaise et les carottes râpées comme des
aliments favorables à la croissance des Listeria,
considérant leur pH supérieur à 4,3.
Les tests d’ensemencement volontaire réalisés permettent de constater une décroissance lente de la
population de Listeria monocytogenes dans les
trois recettes de salades composées étudiées, entreposées à + 4 °C. L’acidité de ces denrées constitue vraisemblablement le principal facteur à l’origine de l’effet létal constaté sur les Listeria.
Les salades traiteur peuvent donc être considérées
comme des préparations dysgénésiques pour Listeria monocytogenes.
Au plan pratique, au niveau des ateliers industriels
de production, il n’est pas utile de prévoir un plan
de prévention spécifiquement dédié au danger
Listeria monocytogenes. Le simple respect des
bonnes pratiques hygiéniques paraît suffisant. Les
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