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L’efflux actif comme mécanisme potentiel d’interactions médicamenteuses: Compétition entre Fluoroquinolones et Antiviraux dans un modèle de macrophages J774 Laetitia Garcia L’efflux actif L’efflux actif est un processus ubiquitaire de protection des cellules vis-à-vis de substances étrangères amphiphiles Ì Concentration cellulaire Ì Activité pharmacologique La Ciprofloxacine, une Fluoroquinolone O F O C OH N N HN Antibiotique amphiphile et diffusible % initial conc. Concentration Initiale (%) La Ciprofloxacine, une Fluoroquinolone substrat d’une pompe à efflux Contrôle control ++ Gemfibrozil gemfibrozil 100 80 control Contrôle 60 40 20 0 0 10 20 30 Temps Time(Minutes) (min) Antibiotique amphiphile et diffusible, substrat d’une pompe à efflux Marquez et al. 2008, soumis pour publication Les transporteurs MRPs (Multidrug Resistance Proteins) 8 Phylogénie et structure MRPs longues MRP1 MRP3 MRP 2 MRP6 MRP7 MRP5 MRPs courtes MRP8 MRP9 MRP 2 Tammur et al. ,Gene (2001) 273: 89‐96 Deeley et al., Physiol. Rev. (2006) 86 : 849‐899 Identification du transporteur de la Ciprofloxacine Cellules sauvages (WT) Exposition chronique à la Ciprofloxacine cellular concentration Concentration Cellulaire (ng/mg prot) (ng/mg de protéines) 1000 WT RS 750 500 250 0 CT Contrôle + Gem + Gemfibrozil Cellules résistantes (RS) Michot et al. AAC (2006) 50:1689‐1695 Identification du transporteur de la Ciprofloxacine ARNm des Mrps (RS versus WT) 30 Types cellcellulaires type 25 20 15 10 Mrp1 Mrp3 Mrp5 Mrp2 Mrp4 Mrp6 Mrp7 WT RS 0 5 20 40 60 80 100 gene distribution Distribution des gènes 7 M rp 6 M rp 5 M rp 4 M rp 3 M rp 2 M rp 1 0 M rp Facteur d’augmentation versus fold(RS increase (RSWT) versus WT) 8 Les cellules résistantes surexpriment Mrp2 et Mrp4, mais Mrp4 prédomine Marquez et al. 2008, soumis pour publication Les transporteurs MRPs (Multidrug Resistance Proteins) 8 Multiplicité de substrats: Compétition pour le transport? Deeley et al., Physiol. Rev. (2006) 86 : 849‐899 But du travail 8 • • Etude de la compétition potentielle entre La Ciprofloxacine Différents substrats préférentiels de MRP2 ou de MRP4 8 • • Afin de : Mieux caractériser le transporteur de Ciprofloxacine; Mettre en évidence des « interactions médicamenteuses » potentielles par compétition pour un même transporteur. Ciprofloxacine O F O C O- N N HN PMEA et MRP4 Saquinavir et MRP2 PMEA [Adéfovir] Saquinavir 9-(2-PhosphonylMethoxyEthyl)Adenine Reid et aL; Mol Pharmacol. 2003 63:1094-103 Imaoka et al. Mol Pharmacol. 2007 71:619-27. Hydrolyse du Bis(POM)PMEA Bis(POM)PMEA 9-[2-(BisPivaloyolOxyMethyl)PhosphoMEthoxy]Adenine [Bis(POM)PMEA ou Adefovir Dipivoxil] H Mono(POM)PMEA PMEA Résultats : Bis(POM)PMEA 9-[2-(BisPivaloyolOxyMethyl)PhosphoMEthoxy]Adenine [Bis(POM)PMEA ou Adefovir Dipivoxil] Accumulation de Bis(POM)PMEA, Mono(POM)PMEA et PMEA Cellules sauvages Bis(POM)PMEA 0-200 µM pdt 2 heures Dosage des contenus cellulaires en Bis(POM)PMEA, Mono(POM)PMEA et PMEA HPLC: 4°C, flux de 1 mL/min, volume d’injection 25 µL. Phase stationnaire: colonne Agilent C8 (4,6x250mm) Phase mobile A : Acétonitrile Phase mobile B : 900 mL de tampon [10 mM KH2PO4 et 2 mM (But)4N+ HSO4-] et 50 mL Acétonitrile. Accumulation de Bis(POM)PMEA, Mono(POM)PMEA et PMEA Le profil de dégradation du Bis(POM)PMEA est caractérisé par : • Une dégradation quasi complète du Bis(POM)PMEA ; • Une importante formation de Mono(POM)PMEA ; • Une production faible et saturable de PMEA. Compétition entre CIPRO et Bis(POM)PMEA Cellules sauvages Cellules résistantes CIPRO 50 µM Bis(POM)PMEA 10-1000 µM Dosage du contenu cellulaire en CIPRO Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm Compétition entre CIPRO et Bis(POM)PMEA Concentration Cellulaire de CIPRO (% par rapport au contrôle ds les WT) Accumulation de Ciprofloxacine Cellules sauvages Cellules résistantes Cellules sauvages Cellules résistantes 2 heures 4 heures 300 2 heures 4 heures 300 200 200 100 100 0 0 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Bis(POM)PMEA 3.0 2.7 GEM Log Concentration Extracellulaire (µM) 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Bis(POM)PMEA 3.0 2.7 GEM Log Concentration Extracellulaire (µM) L’accumulation de CIPRO est augmentée en présence de Gemfibrozil ou de Bis(POM)PMEA dans les deux types cellulaires Compétition entre Bis(POM)PMEA et CIPRO Cellules sauvages Cellules résistantes CIPRO 500 µM Bis(POM)PMEA 50 µM Dosage du contenu cellulaire en Mono(POM)PMEA et PMEA HPLC: 4°C, flux de 1 mL/min, volume d’injection 25 µL. Phase stationnaire: colonne Agilent C8 (4,6x250mm) Phase mobile A : Acétonitrile Phase mobile B : 900 mL de tampon [10 mM KH2PO4 et 2 mM (But)4N+ HSO4-] et 50 mL Acétonitrile. Compétition entre Bis(POM)PMEA et CIPRO Accumulation de Mono(POM)PMEA Concentration Cellulaire de Mono(POM)PMEA (% par rapport au contrôle ds les WT) Cellules sauvages sauvages Cellules Contrôle + CIPRO + GEM 250 B 200 B 150 100 Cellules résistantes résistantes Cellules Contrôle + CIPRO + GEM 250 b* 200 c* 150 A A A A 50 100 50 0 a* a* a* a* 0 120 240 Temps (Minutes) 120 240 Temps (Minutes) L’accumulation de Mono(POM)PMEA n’est pas affectée par la CIPRO mais l’est par le Gemfibrozil dans les cellules sauvages et résistantes Compétition entre Bis(POM)PMEA et CIPRO Accumulation de PMEA Concentration Cellulaire de PMEA (% par rapport au contrôle ds les WT) Cellules sauvages Cellules sauvages Cellules résistantes Cellules résistantes Contrôle + CIPRO + GEM 300 B B 200 A A Contrôle + CIPRO + GEM 300 b b 200 A b A 100 c 100 a* 0 a* 0 120 240 Temps (Minutes) 120 240 Temps (Minutes) L’accumulation de PMEA est augmentée en présence de Gemfibrozil ou de CIPRO et ce, surtout dans les cellules résistantes CIPRO versus Bis(POM)PMEA/PMEA : Conclusion de ces compétitions Accumulation Paramètre Cellules CIPRO PMEA < BIS(POM)PMEA RS vs WT Ì Ì Effet du Gemfibrozil WT Ê (Ê) Effet du médicament compétiteur WT Ê (Ê) Effet du Gemfibrozil RS Ê Ê Effet du médicament compétiteur RS Ê Ê Accumulation Le Bis(POM)PMEA a un effet similaire à celui du Gemfibrozil… Mais y a-t-il compétition pour l’efflux? Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine Cellules sauvages Cellules résistantes Incubation en présence de 50 µM de CIPRO Incubation en présence de 50 µM de CIPRO + 300 µM de Bis(POM)PMEA Lavages Réincubation en présence ou non de 1000 µM de Bis(POM)PMEA Dosage du contenu cellulaire en CIPRO Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine Cellules résistantes Cellules sauvages Cellules résistantes CIPRO 125 CIPRO + BIS(POM)PMEA 100 t ½ : 1,30 min t ½ : 2,94 min 75 50 25 0 0 10 20 Temps (Minutes) 30 Concentration Extracellulaire de CIPRO (% par rapport au contrôle ds les WT) Concentration cellulaire en CIPRO (% par rapport au contrôle ds les WT) Cellules sauvages CIPRO 125 CIPRO + BIS(POM)PMEA t ½ : 0,12 min t ½ : 2,14 min 100 75 50 25 0 0 10 20 30 Temps (Minutes) Le PMEA inhibe l’efflux de la CIPRO dans les 2 types cellulaires Compétition entre Ciprofloxacine et PMEA Cellules sauvages Cellules résistantes CIPRO 50 µM PMEA 10-1000 µM Dosage du contenu cellulaire en CIPRO Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm Compétition entre Ciprofloxacine et PMEA Accumulation de Ciprofloxacine Concentration Cellulaire de CIPRO (% par rapport au contrôle ds les WT) Cellules sauvages Cellules résistantes Cellules sauvages Cellules résistantes 2 heures 4 heures 300 2 heures 4 heures 300 200 200 100 100 0 0 0 1.0 1.5 2.0 PMEA 2.5 3.0 2.7 GEM Log Concentration Extracellulaire (µM) 0 1.0 1.5 2.0 PMEA 2.5 3.0 2.7 GEM Log Concentration Extracellulaire (µM) L’accumulation de CIPRO n’est pas (ou peu) affectée par le PMEA dans les cellules sauvages et résistantes CIPRO versus Bis(POM)PMEA/PMEA: Conclusions générales 8 8 8 Le PMEA n’a quasi effet sur l'accumulation de CIPRO dans les cellules sauvages et résistantes Le Bis(POM)PMEA Ê l’accumulation de CIPRO Ì l’efflux de CIPRO La CIPRO Ê l’accumulation de PMEA Conclusions générales Bis(POM)PMEA PMEA O F O C CIPRO OH N O N F HN O C OH N N HN Le PMEA est substrat du transporteur MRP de la CIPRO et inhibe également son efflux Ciprofloxacine O F O C O- N N HN PMEA et MRP4 Saquinavir et MRP2 PMEA [Adéfovir] Saquinavir 9-(2-PhosphonylMethoxyEthyl)Adenine Huisman et al. AIDS. 2002 16:2295-301. Williams et al . AAC. 2002 46:3456-62. Compétition entre Ciprofloxacine et SQV Cellules sauvages Cellules résistantes CIPRO 50 µM SQV 10-300 µM Dosage du contenu cellulaire en CIPRO Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm Compétition entre Ciprofloxacine et SQV Concentration Cellulaire de CIPRO (% par rapport au contrôle ds les WT) Accumulation de Ciprofloxacine Cellules sauvages Cellules résistantes Cellules sauvages Cellules résistantes 500 500 2 heures 4 heures 400 2 heures 4 heures 400 300 300 200 200 100 100 0 0 0 0.0 0.5 1.0 1.5 SQV 2.0 2.5 2.7 GEM Log Concentration Extracellulaire (µM) 0 0.0 0.5 1.0 1.5 SQV 2.0 2.5 2.7 GEM Log Concentration Extracellulaire (µM) L’accumulation de CIPRO est augmentée en présence de Gemfibrozil ou de SQV dans les deux types cellulaires Compétition entre SQV et Ciprofloxacine Cellules sauvages Cellules résistantes CIPRO 500 µM SQV 50 µM Dosage du contenu cellulaire en SQV HPLC: 25°C, gradient isocratique, flux de 1 mL/min. Phase stationnaire : colonne Agilent C8 (4,6x250mm) Phase mobile : 45% Acétonitrile / 55% de tampon [3,042 g KH2PO4 et 0,6 mL Triethylamine /L, ajusté à pH 3,1] Compétition entre SQV et Ciprofloxacine Accumulation de Saquinavir Concentration Cellulaire de SQV (% par rapport au contrôle ds les WT) Cellules sauvages Cellules sauvages Cellules résistantes Cellules résistantes Contrôle + CIPRO + GEM 150 A 150 A a A 100 Contrôle + CIPRO + GEM A B 100 a a a b b B 50 50 0 120 240 Temps (Minutes) 0 120 240 Temps (Minutes) L’accumulation de SQV n’est augmentée ni par la CIPRO ni par le Gemfibrozil dans les cellules sauvages et résistantes CIPRO versus SQV : Conclusion de ces compétitions Accumulation Paramètre Cellules CIPRO SQV RS vs WT Ì - Effet du Gemfibrozil WT Ê - Effet du médicament compétiteur WT Ê - Effet du Gemfibrozil RS Ê - Effet du médicament compétiteur RS Ê - Accumulation Le SQV a un effet similaire à celui du Gemfibrozil… Mais y a-t-il compétition pour l’efflux? Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine Cellules sauvages Cellules résistantes Incubation en présence de 50 µM de CIPRO Incubation en présence de 50 µM de CIPRO + 30 µM de SQV Lavages Réincubation en présence ou non de 300 µM de SQV Dosage du contenu cellulaire en CIPRO Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine Cellules sauvages Cellules résistantes CIPRO CIPRO CIPRO SQV CIPRO + +SQV 100 t ½ : 2,19 min t ½ : 3,50 min 75 50 25 0 Cellules résistantes Concentration Extracellulaire de CIPRO (% par rapport au contrôle des RS) Concentration cellulaire de CIPRO (% par rapport au contrôle des WT) Cellules sauvages CIPRO CIPRO CIPRO + SQV CIPRO + SQV 100 t ½ : 1,25 min t ½ : 2,27 min 75 50 25 0 0 10 20 Temps (Minutes) 30 0 10 20 Temps (Minutes) Le SQV inhibe l’efflux de la CIPRO dans les deux types cellulaires 30 CIPRO versus SQV: Conclusions générales 8 Le Saquinavir Ê l’accumulation de CIPRO 8 Ì l’efflux de CIPRO La CIPRO n’a aucun effet sur le Saquinavir Conclusions générales SQV O F O C OH N CIPRO N HN O F O C OH N N HN Le Saquinavir est un puissant inhibiteur du transport de la CIPRO Perspectives 8 Etudes à court terme : • Mécanisme d’inhibition par le Saquinavir : Compétitif ou non ? → Etudes pharmacocinétiques: - • Accumulation de SQV à de plus faibles concentrations; Etudes de la capture et de l’efflux du SQV. Interaction du Saquinavir : MRP2 ou MRP4 ? - Compétition entre le Bis(POM)PMEA et le SQV; Etude de l’accumulation des antiviraux et de leur pouvoir inhibiteur sur le transport de la Ciprofloxacine dans des cellules surexprimant spécifiquement MRP2 ou MRP4. 8 Etudes à long terme : • • Implications pharmacocinétiques; Conséquences toxicologiques et pharmacologiques.