Studying TERRA-Associated Functions Using a Human Cellular

DISS. ETH NO. 20693
Studying TERRA-Associated
Functions Using a Human Cellular
System, in Which the Transcription
of a Unique Telomere Can Be
Induced at Will
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
CATHERINE MARIE CHARLOTTE BRUN
Master of Science in Molecular Biology, University of Basel, Switzerland
Born May 4th, 1983
Citizen of Switzerland
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Claus M Azzalin, examiner
Prof. Dr. Ulrike Kutay, co-examiner
Prof. Dr. Matthias Peter, co-examiner
2012
Abstract
Telomeres protect the ends of linear eukaryotic chromosomes from being recognized and processed as double-stranded breaks in the DNA. In addition to
their fundamental role in genome stability telomeres also set the lifespan of
human somatic cells thus preventing their immortalization and cancer development. Indeed telomeres shorten at each cell cycle and eventually reach a
critically short length that induces cellular senescence. Although telomeres are
highly heterochromatic they are transcribed into the long non-coding telomeric repeat-containing RNA (TERRA). TERRA remains associated to telomeres
post-transcriptionally and has been proposed to contribute to telomere length
regulation and to telomere integrity. TERRA biogenesis has been relatively
well characterized but its functions remain largely undefined. In order to follow
the putative effects of telomere transcription we developed a human cellular
system, in which the transcription of unique telomeres can be induced at will.
The generation of these transcriptionally inducible telomeres (tiTELs) relies
on the ability of cloned linear human telomeric DNA to generate or seed new
telomeres in vivo and on the ”Tet-ON” technology to obtain an inducible transcription system. Among the different independent clones that we isolated, we
chose three for further characterization. All these three clones displayed newly
seeded tiTELs at the tip of one or two chromosomes and tiTELs transcription was fully induced after 24 hours. Previous in vitro data have suggested
that TERRA might inhibit the activity of telomerase, the reverse transcriptase
that replenishes telomeric DNA at each cell cycle. However, using our tiTEL
system, we could demonstrate that prolonged telomeric transcription induction does not substantially affect telomere length. Furthermore, telomerase
can elongate tiTELs independently of their transcription levels. These results
argue against an effect of telomere transcription on telomerase activity and
more generally on telomere length regulation. Furthermore, we could show
that subtelomeric silencing is not substantially affected by tiTEL transcription,
suggesting that the heterochromatic state of tiTELs is likely not altered upon its
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Abstract
transcription. We also developed an alternative tiTEL system, suitable for liveimaging assays and followed telomere movements upon transcription. Using
this inducible system as well as complementary approaches we could demonstrate that telomere transcription increases telomere dynamics. Finally, telomere transcription does not seem to interfere with telomere replication and
might even support it. Our tiTEL cellular system represents a unique and valuable tool for understanding the functions that are associated to TERRA and to
telomere transcription.
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Résumé
Les télomères protègent les extrémités des chromosomes eucaryotes afin
qu’elles ne soient pas reconnues et traitées comme des coupures double-brin
dans l’ADN. En plus de leur rôle fondamental dans la stabilité génomique, les
télomères établissent la durée de vie des cellules somatiques prévenant ainsi
leur immortalisation et un développement cancéreux. En effet, les télomères
racourcissent à chaque cycle cellulaire pour finalement devenir critiquement
courtes et induire la sénescence cellulaire. Bien que les télomères soient
fortement hétérochromatiques, elles sont transcrites en long ARN non-codant
appelé TERRA. TERRA reste associé aux télomères après transcription et a
été suggéré comme étant un régulateur de la longueur des télomères ainsi
que de leur intégrité. La biogenèse de TERRA a été relativement bien caractérisée, mais les fonctions exercées par TERRA et par la transcription des
télomères per se restent plutôt incomprises. Dans le but de comprendre
les effets putatifs de la transcription des télomères sur leur maintient, nous
avons développé un système cellulaire humain dans lequel la transcription de
télomères spécifiques peut être induite à n’importe quel moment. La créaction
de ces télomères dont la transcription est inductible (tiTELs) repose sur la capacité de l’ADN télomérique cloné, une fois linéarisé, de créer de nouvelles
télomères in vivo, ainsi que sur la technologie appelée ”Tet-ON”, nous permettant d’obtenir un système de transcription inductible. Parmis les différents
clones indépendants que nous avons isolés, nous en avons chois trois pour
une caractérisation complémentaire. Des données in vitro antérieures à
notre travail ont suggéré que TERRA inhibe l’activité de la télomérase qui
est la transcriptase inverse reconstituant l’ADN télomérique à chaque cycle
cellulaire. Cependant, en utilisant notre système de tiTELs, nous avons pu
démontrer qu’une induction prolongée de la transcription n’affecte pas de
manière détectable la longueur des télomères. De plus, la télomérase peut
rallonger les tiTELs indépendament du niveau de leur transcription. Nous
avons également trouvé que l’élongation des télomères par la télomérase
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Résumé
n’était pas altérée dans un système cellulaire alternatif, dans lequel TERRA
est massivement exprimé. Ces résultats argumentent contre un effet de la
transcription des télomères sur l’activité de la télomérase, mais aussi plus
généralement sur la régulation de la longueur des télomères. De plus, dans
notre système de tiTELs, nous avons pu démontrer que l’inhibition de la transcription subtelomérique n’est pas affectée par la transcription des tiTELs, ce
qui indique que l’hétérochromatine des tiTELs ne semble pas être altérée lors
de leur transcription. Nous avons également développé un système de tiTELs alternatif adapté pour de l’imagerie in vivo et avons suivi le mouvement
des télomères lors de leur transcription. Grâce à ce système inductible ainsi
qu’à des approches complémentaires, nous avons pu démontrer que la transcription télomèrique augmente la dynamique des télomères. Finalement, la
transcription des télomères ne semble pas interférer avec la réplication des
télomères et pourrait même avoir un effet positif. Notre système de tiTELs
représente un outil unique et précieux nous permettant de comprendre les
fonctions associées à la transcription des télémères et à TERRA.
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