proto 2d v1.0 - pappso

Livret de PROTOCOLE
Protocole d’électrophorèse bidimensionnelle
version1.0
-1–
M.P.J.
UMR de Génétique Végétale, ferme du Moulon, 91190 Gif sur Yvette
http://www.moulon.inra.fr/
SOMMAIRE
Préparation des échantillons ................................................................................................................................... 3
1-Extraction des protéines .................................................................................................................................. 3
2-Dosage des protéines avec le kit Pharmacia , “PlusOne 2D Quant Kit ”....................................................... 4
Première dimension : IEF....................................................................................................................................... 4
1-Préparation des échantillons pour l’IEF.......................................................................................................... 4
2- Dépôt des échantillons sur IPG ..................................................................................................................... 5
3- Migration IEF................................................................................................................................................. 5
Deuxième dimension : SDS-PAGE........................................................................................................................ 5
1 - Préparation de la solution SDS PAGE .......................................................................................................... 5
2 - Préparation des plaques et coulage des gels SDS PAGE.............................................................................. 6
3 - Préparation de la cuve SDS PAGE ............................................................................................................... 6
4- Equilibration des IPG entre IEF et SDS PAGE ............................................................................................. 6
5- dépôt des strips IPG sur le gel SDS PAGE et migration ............................................................................... 7
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Préparation des échantillons
1- Extraction des protéines
Solution de précipitation :
TCA
2-mercaptoéthanol
Acétone
10 %
0,07 %
Solution de rinçage :
2-mercaptoéthanol
Acétone
0,07 %
10 g
70 µL
Compléter à 100 mL
70 µL
Compléter à 100 mL
1. Peser des eppendorfs de 2mL
2. Broyer finement le matériel végétal à l’aide d’un mortier dans de l’azote liquide.
3. Mettre environ 200µL de poudre par eppendorf de 2mL. Ajouter environ 1.75mL de la solution de précipitation.
Placer 1 heure à –20°C.
4. Centrifuger 10 min à 10000g ( 10000 rpm ) à –20°C.
5. Eliminer le surnageant et couvrir le culot avec 2 mL de la solution de rinçage éliminant les résidus de TCA. Placer
1 heure minimum à –20°C.
6. Centrifuger 15 min à 10000g ( 10000 rpm ) à –20°C. Eliminer le surnageant.
7. Refaire des rinçages jusqu’à obtention d’un culot blanc.
8. Sécher le culot sous cloche à vide (1h environ) ou 20 à 30 min au speed vacs.
9. Peser l'eppendorf avec la poudre pour déterminer le poids du culot sec.
10. Remettre en suspension le culot de protéines dans un volume déterminé de tampon de solubilisation R2D2 ou
UKS. Le volume de R2D2 ou d’UKS dépend de la nature de l’organe végétal (60 µL/mg de culot sec pour la
feuille de mais et 50 µL/mg de culot sec pour le grain de mais). La resolubilisation se fait en vortexant 1min le
tube contenant la poudre et le tampon de solubilisation.
11. Centrifuger (15 min à 14000g à 20°C) et récupérer le surnageant dans des eppendorfs de 1.5mL.
12. Centrifuger (15 min à 14000g à 20°C) et récupérer le surnageant dans des eppendorfs de 1.5mL.
13. Conserver les extraits à –50°C ou –80°C
Tampon T7mod (UTCSD3P) = R2D2 : solubilisation et réhydratation
5M
3.75g
Urée
Thiourée
2M
1.9g
Chaps
2%
0.25g
SB 3-10
2%
0.25g
DTT
20mM
35mg
Phosphine
5mM
18mg
Pharma 4-6.5
0.5%
62.5µL (SM à 40%)
Pharma 3-10
0.25%
31.25µL (SM à 40%)
H2O bidi
qsp 12.5mL
Tampon de solubilisation UKS
Urée
9,5 M
K2CO3 (2,8 %)
5 mM
SDS (10 %)
1,25 %
DTT
0,5 %
Triton X-100
6%
Ampholines pH 3,5-9,5
2%
H2O bidi
22,8 g
1 mL
5 mL
200 mg
12 mL
2 mL
qsp 40mL
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2- Dosage des protéines avec le kit Pharmacia , “PlusOne 2D Quant Kit ”
1. Préparer la solution ‘working color reagent’ :100 volumes de color reagent A pour 1 volume de color reagent B
2. Préparation de la gamme étalon:
Numéro de tube
Volume de BSA 2mg/mL
quantité de protéine
1
0µL
0µg
2
5µL
10µg
3
10µL
20µg
4
15µL
30µg
5
20µL
40µg
6
25µL
50µg
3. Mettre 10µL d’échantillon solubilisé dans du R2D2 ou de l’UKS dans les tubes eppendorf de 2mL. Ajouter 500µl
de solution précipitante dans chaque tube. Vortexer rapidement. Incuber 2-3min à température ambiante.
4. Ajouter 500µL de solution co-précipitante. Vortexer rapidement ou mélanger par inversion.
5. Centrifuger les tubes à 10000g pendant 5min (orienter les tubes)
6. Enlever délicatement les tubes, il y a un culot minuscule. Eliminer le surnageant
7. Centrifuger rapidement et aspirer délicatement le surnageant restant à la pipette. Il ne doit rester que le culot.
8. Ajouter 100µL de solution ‘copper’ et 400µL d ‘eau bidi. Vortexer rapidement pour resuspendre le culot.
9. Ajouter 1mL de ‘working color reagent solution’ préparée préalablement. Mélanger par inversion.
10. Incuber 15-20min à température ambiante.
11. Lecture à 480nm en utilisant l’eau comme référence.
12. ( La lecture doit se faire dans les 40min qui suivent l’étape 9)
Première dimension : IEF
1- Préparation des échantillons pour l’IEF
1. Centrifuger les échantillons repris dans R2D2 ou UKS pendant 10 minutes à 15000rpm
2. Dans un eppendorf propre, préparer le mélange échantillon/tampon de migration. Si l’échantillon est repris dans
du R2D2, le tampon de migration est aussi du R2D2. Si l’échantillon est repris dans de l’UKS, le tampon de
migration est selon le volume d’échantillon à déposer, du Tpr50 ou du Tpr140. Le dépôt étant de 450µL on
prépare 495µL soit 10% supplémentaire.
Ö Quantité de protéine à déposer : voir plus bas
3. Centrifuger les eppendorfs contenant les échantillons et le tampon de migration (facultatif)
Tampon de réhydratation : Tpr 50, calculé pour un dépôt de 50µL d’UKS –valable de 20 à 90µLUrée
7M
42,042 g
Thiourée
2M
15,224 g
Chaps
1,4 %
1,4 g
Pharma 3-10
0,3 %
300 µL
Phosphine (TCEP HCl )
5 mM
144 mg
DTT
16 mM
0,247 g
H2O bidi
qsp 100 mL
Tampon de réhydratation : Tpr 140, calculé pour un dépôt de 140µL d’UKS
Urée
7M
42,042 g
Thiourée
2M
15,224 g
Chaps
0,5 %
0,5 g
Pharma 3-10
Phosphine (TCEP HCl )
5 mM
144 mg
DTT
10 mM
140 mg
H2O bidi
qsp 100 mL
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Quantité de protéine à déposer (informatif)
Maïs feuille
50 µg
Maïs coléoptile
150 µg ?
Maïs grain 4 DAP
30 µg
Maïs grain 21 DAP
35 µg
Maïs grain 30 DAP
55 µg
Maïs grain 40 DAP
80 µg
arabidopsis
500 µg
Coloration à l’argent
Coloration à l’argent
Coloration à l’argent
Coloration à l’argent
Coloration à l’argent
Coloration à l’argent
Colo bleu colloïdal bien chargé
2- Dépôt des échantillons sur IPG
1. Dans les plateaux préalablement nettoyés et totalement séchés, déposer 450 µL du mélange échantillon/tampon.
Le dépôt se fait tout le long du plateau d’une électrode à l’autre.
2. Déposer ensuite les strips délicatement sur le plateau pour éviter les éclaboussures, acrylamide contre
l ‘échantillon et la pointe du coté de la borne positive.
3. Déposer 4µL de bleu.
4. Recouvrir les strips avec de l’huile minérale (2mL environ).
3- Migration IEF
La migration s’effectue à 20°C à ampérage limitant de 50µA :
- Etape 1 : réhydratation active des strips à 50V/ h pendant 13 heures
- Etape 2 : 200 V/ h pendant 30 minutes
- Etape 3 : 500 V/ h pendant 30 minutes
- Etape 4 : 1000 V/ h pendant 1 heure
- Etape 5 : 10000 V/ h jusqu'à 84000V
Après migration, les strips sont égouttés sur papier absorbant coté gel bond sur papier, puis stockés à-20°C
Deuxième dimension : SDS-PAGE
Le SDS se fixe aux polypeptides leur conférant une forte charge négative constante quelque soit la protéine. Le
principe de la séparation est fondé sur le ralentissement des polypeptides par la maille de la matrice de polyacrylamide :
les polypeptides les plus gros, au PM plus élevé, migreront moins rapidement donc moins loin dans le gel.
1- Préparation de la solution SDS PAGE
1. A l’aide des éprouvettes spécifiques préparer le mélange : acrylamide, PDA, Tris et SDS et compléter avec de
l’eau bidi
2. Préparer ue solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10% dans H2O bidi et la garder à 4°C
acrylamide (solution
commerciale 40%)
PDA
Tris HCl pH 8.8
(solution stock 2M)
SDS
(solution stock 10%)
H2O bidi
[] finale
11%
12 gels
440 mL
12 gels
495 mL
20 gels et 2.5L
688 mL
20 gels et 2.7L
743 mL
0.5M
4.7 g
400 mL
5.3 g
450 mL
7.34 g
625 mL
7.93 g
675 mL
24 mL
27 mL
37.5 mL
40.5 mL
qsp 1.6 L
qsp 1.8 L
qsp 2.5 L
qsp 2.7 L
0.15M
3. Filtrer dans une fiole à vide de 3L puis dégazer sous vide pendant 1h.
4. Nettoyer le filtre plusieurs fois à l’eau monodistillée, puis finir à l’eau bidistillée.
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2- Préparation des plaques et coulage des gels SDS PAGE
1. vérifier qu’il ne reste pas d’acrylamide polymérisé à l’intérieur de la plaque.
2. nettoyer l’intérieur à l’acétone ou à l’alcool et les laisser sécher posées sur une feuille de papier, charnière en
haut, légèrement ouverte.
3. Préparer des espaceurs de 1mm d’épaisseur, les rincer à l’eau bidi. espaceur du haut : 1 cm de large et sans
accros. Plus fin pour les cotés.
4. Sur une feuille de papier tracer 2 traits écartés de 1 cm. Positionner le haut de la plaque ouverte sur le trait le
plus haut. Aligner le bas de l’espaceur du haut sur le trait le plus bas. Poser les espaceurs de cotés de façon à ce
qu’ils encadrent l’espaceur du haut. Sous chacun des espaceurs de coté, glisser un petit bout de papier calque
où est notée la date de l’électrophorèse et le numéro de la plaque. Les plaques « montées » sont déposées dans
la cuve de coulage charnière au fond de la cuve et espaceur du haut de la plaque à l’arrière de la cuve. Elles sont
légèrement serrées à l’aide de plexiglas. Entre le plexiglas et les plaques, on rajoute un coin en plastique avec
poignée pour faire un appel d’air au moment du démoulage. La cuve, au moment du coulage est surélevée
(environ 5cm) du coté opposé aux espaceurs à l’aide de petits bouchons pour fioles à vide.
5. Juste avant le coulage des gels, ajouter dans la fiole le Temed puis le persulfate 10% sous agitation modérée
mais efficace.
Temed
APS 10% préparé le
jour même
12 gels
0.66 mL
4mL
12 gels
0.74 mL
4.5 mL
20 gels et 2.5L
1 mL
6 mL
20 gels et 2.7L
1.35 mL
8.1mL
6. Verser rapidement mais doucement la solution dans l’entonnoir et ouvrir le système en faisant remonter la bulle
d’air.
7. Pendant le coulage tapoter la cuve à l’aide du couteau en bois pour faire remonter les bulles d’air.
8. A la fin du coulage retirer les bouchons de surélévation de la cuve, couvrir la cuve avec du plexiglas, arrêter la
hotte et laisser polymériser pendant au moins 1h / 1h30.
9. Nettoyer l’entonnoir avec 2L H2O bidi.
10. Démouler les plaques en évitant de les ouvrir. Faire des appels d’air avant de retirer les plexiglas avec une tige à
bareau aimanté. Les nettoyer à l’eau monodistillée pour enlever l’acrylamide en trop.
3- Préparation de la cuve SDS PAGE
1. Au moment de la préparation du tampon de cuve mettre le réfrigérant en route (14°C)
Tampon de cuve :
Tris
25 mM
66.6 g
Glycine
0,2 M
330 g
SDS
0,1 M
22 g
Eau monostillée
qsp 5 L puis 22L
Faire le mélange ci dessus dans un bécher de 5L. Remplir la cuve, SANS les séparateurs
jusqu’au trait de 17 L, verser le contenu du bécher dans la cuve et compléter, si besoin est,
jusqu’à 22L . Bien homogénéiser le tout avec la baguette avant de rajouter les séparateurs.
4- Equilibration des IPG entre IEF et SDS PAGE
Cette étape peut-être réalisée avant la congélation ou avant le dépôt en deuxième dimension.
1. Déposer les strips (coté acrylamide sur le dessus) dans les portoirs prévus a cet effet.
2. Déposer 5mL par strip du mélange tampon d’équilibration + dithiotréitol (100mg/10mL). Laisser 15 minutes sous
agitation
3. Enlever la totalité du tampon puis déposer 5 mL par strips de tampon d’équilibration + iodoacétamide (250 mg /
10mL). Laisser 15 minutes sous agitation
4. Vider et rincer avec du tampon de cuve
5. Enlever le tampon puis égoutter les strips sur un papier absorbant coté gel bond sur papier.
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Tampon d’équilibration des strips :
Concentration finale
50mM
6M
30% (v/v)
2% (w/v)
Tris-Cl, pH 8.8, 2M
Urée (FW 60.06)
Glycérol (87% v/v)
SDS (FW 288.38)
H2O bidi
Conserver à –20°C en aliquot de 40 mL. Avant utilisation ajouter :
1. DTT : 100 mg pour 10 mL
2. IAA : 250 mg pour 10 mL
quantité
5.025mL
72.07g
69mL
4g
qsp 200 mL
5- dépôt des strips IPG sur le gel SDS PAGE et migration
1. Après avoir enlever les "espaceurs du haut", remplir l'espace libéré avec de l’eau bidistillée. Enlever l’eau
bidistillée. Sécher avec un bout de papier et rajouter l'agarose low melting chaud. Déposer les strips dans
l’agarose sans introduire de bulles d’air entre le strip et le gel SDS PAGE.
Solution d’agarose :
Agarose low melting
En préparer 50 à 100 mL
1% dans le tampon de cuve de 2ème
dimension
2. La migration est conduite pour 12 gels en même temps ; il est possible de faire migrer en parallèle les 2 cuves de
12 gels mais attention pour une coloration à l’argent il n’est pas souhaitable de dépasser 20 gels.
3. Installer les plaques dans la cuve. Elles sont maintenues en place grâce aux séparateurs. Pour que les plaques
de verres se mettent plus facilement en place, on peut les tremper préalablement dans le tampon de cuve. La
charnière du gel se place au fond de la cuve, le strip se retrouvant positionné verticalement du coté de la cathode
(-- ; borne noire). Attention au branchement électrique : ne pas l’inverser sous peine de détériorer les électrodes.
Siil y à moins de 12 gels par cuve, placer des plaques de verres vides pour augmenter la hauteur du tampon de
cuve (les buses permettant la circulation du tampon doivent être immergées mais le tampon ne doit pas recouvrir
le haut des plaques).
4. Ajouter du bleu de bromophénol du coté de la borne négative ( cathode) de la cuve de migration.
5. Commencer donc la migration par 1h à 20 volts puis le reste de la nuit à 120 V et 0.4 A pour 12 gels (soit 30 mA/
gel). En cas d’un nombre de gels inférieur il faut diminuer l’ampérage.
Attention : ne pas oublier de vérifier que le réfrigérant est en route ainsi que la circulation du tampon de cuve.
6. A la fin de la migration, sortir les plaques de la cuve, les ouvrir sans casser le gel. Découper le haut du gel pour
enlever le strip et l’agarose et le bas du gel sous le front de migration de manière à avoir des contours nets.
7. Mettre le gel dans le bac en plastique contenant le bain de fixation spécifique de la coloration à réaliser. (500 mL
par gel avec 5 gels maximum par bac sauf indication contraire).
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