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abc
article original
Ann Biol Clin 2009 ; 67 (6) : 619-27
Effet protecteur du diclofénac contre le stress oxydatif
induit par la toxicité du paracétamol chez le rat
Protective effect of diclofenac towards the oxidative stress induced
by paracetamol toxicity in rats
W. Aouacheri1
S. Saka1
R. Djafer2
G. Lefranc3
1
Laboratoire de biochimie
et microbiologie appliquée,
Département de biochimie,
<[email protected]>
2
Laboratoire de toxicologie,
Faculté des sciences médicales,
Université Badji Mokhtar Annaba,
Algérie
3
Laboratoire d’immunogénétique
moléculaire humaine,
UPR 1142 CNRS –
Institut de génétique humaine,
Université Montpellier II, France
Résumé. L’association entre le paracétamol (PARA) et le diclofénac (DiCF) a
fait l’objet de notre étude. Soixante rats mâles de genre Albinos wistar ont été
traités par gavage oral (per os) pendant sept jours. Un lot témoin a été traité
par l’eau minérale (0 + 0) mg/kg et un deuxième lot a été traité seulement par
une dose toxique de paracétamol (100 + 0) mg/kg. Les lots restants ont été
traités par une combinaison de différentes doses toxiques de PARA et une
dose thérapeutique de DiCF (15 + 3, 100 + 3, 200 + 3 et 400 + 3) mg/kg.
La concentration des transaminases (ASAT, ALAT), phosphatases alcalines
(PAL), glutathion peroxydase (GPx), glutathion réductase (GR), glutathion
(GSH), glucose, cholestérol, créatinine, bilirubine directe et totale a varié
significativement chez les rats traités par rapport aux témoins. La toxicité du
PARA a été révélée par une augmentation dose dépendante des taux sanguins
de ASAT, ALAT, PAL, GPx, GR, glucose, créatinine, bilirubine (directe et
totale), et une diminution de la concentration du cholestérol sérique et du
GSH tissulaire, en comparant aux témoins. Les résultats de la déplétion du
GSH et l’élévation des enzymes du stress oxydatif (GPx et GR) mettent en
évidence le rôle détoxifiant du système glutathion. L’association (PARA
+ DiCF) a révélé un effet protecteur objectivé par la réduction des concentrations de ASAT, ALAT, PAL, GPx, GR, bilirubine et l’augmentation du taux de
GSH. Au regard de ces résultats, il apparaît que le DiCF possède une action
protectrice vis-à-vis des effets toxiques du PARA.
doi: 10.1684/abc.2009.0376
Mots clés : paracétamol, diclofénac, stress oxydatif, toxicité, glutathion,
glutathion peroxydase
Article reçu le 22 mai 2009,
accepté le 3 septembre 2009
Abstract. Association of paracetamol (PARA) and diclofenac (DiCF) is the
aim of our study. 60 male rats “Albinos wistar” were treated by oral gavage
(per os) during seven days. A control group was treated by mineral water
(0+0) mg/kg and a second group was treated with only a toxic dose of
100 mg/kg of PARA (100+0). Remaining lots were treated with a combination
of different toxic doses of PARA and a therapeutic dose of DiCF (15+3,
100+3, 200+3 and 400+3) mg/kg. Plasma concentration of amiotransferases
(ASAT, ALAT), alkalines phosphatase (ALP), glutathione peroxidase (GPx),
glutathione reductase (GR), glutathione (GSH), glucose, cholesterol, creatinin,
direct and total bilirubin, significantly varied in the treated rats regarding to
the witness’s rats. The toxicity of PARA revealed by a dose dependant blood
increases of ASAT, ALAT, ALP, GPx, GR, glucose, creatinin, bilirubin, and
by decreases of cholesterol concentration and tissue GSH in comparisons to
controls. The depletion of GSH and the increase of the oxidative stress enzy-
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mes (GPx and GR) suggest a detoxification function of the glutathione system. The association (PARA + DiCF) revealed a protective effect, resulting
in the increase of the concentrations of ASAT, ALAT, ALP, GPx, GR, bilirubin and the increase of GSH. Regarding to all these results, it has been suggested that DiCF has a protective action towards the toxic effects of PARA.
Key words: paracetamol, diclofenac, oxidative stress, toxicity, glutathione,
glutathione peroxidase
Chacun a chez soi des médicaments de première urgence ou
destinés à soigner les petits maux de tous les jours. Cependant, le fait de pouvoir s’en remettre à soi-même pour se
soigner banalise l’emploi des médicaments de la pharmacie
familiale et peut faire oublier qu’il y a des précautions à
prendre avec tout médicament, sans exception. L’utilisation
d’un médicament, aussi courant soit-il, n’est jamais anodine,
et comporte toujours des risques potentiels [1].
En Algérie, l’automédication est une pratique très développée et malgré le danger certain représenté par l’ingestion de médicaments par ce phénomène anarchique, les
intoxications médicamenteuses ne bénéficient toujours
pas d’une grande sensibilisation en direction des citoyens.
De prix de revient bas, le paracétamol (PARA) constitue
l’un des produits les plus vendus au monde [2]. La prise
du paracétamol sans diagnostic ni prescription médicale
est très répandue en Algérie. Il fait partie du quotidien et
il n’y a pas de famille où il n’est pas pris systématiquement aussi bien en cas de douleurs dentaires, de maux de
tête, ou de fièvre, parfois à des doses trop élevées. L’intoxication par le paracétamol est devenue la plus fréquente
des intoxications accidentelles et représente l’une des formes les plus courantes d’intoxication par les produits
pharmaceutiques [3, 4], pouvant conduire à une nécrose
hépatique [5]. Le paracétamol est le métabolite actif de la
phénacétine et l’acétanilide qui sont les plus importants
dérivés de l’aniline dont les propriétés se rapprochent
des salicylates [6]. Il est couramment utilisé comme un
agent analgésique et antipyrétique [7]. Il est sans danger
lorsqu’il est pris à des doses thérapeutiques, mais un surdosage peut entraîner une grave voire mortelle hépatotoxicité [8]. Le paracétamol est un composé lipophile et
passe bien la barrière digestive d’où sa bonne absorption
et donc une bonne disponibilité (environ 90 % sous forme
orale). Le paracétamol a une bonne diffusion tissulaire et
se distribue rapidement dans l’organisme, particulièrement
dans le foie et le rein [9, 10]. Le paracétamol est métabolisé, essentiellement au niveau du foie selon deux voies :
l’une est principale dont 90 % du paracétamol administré
sera dégradé en divers métabolites inactifs par la sulfo620
conjugaison (principal métabolisme chez l’enfant, et
représente 30 % chez l’adulte) et la glucuro-conjugaison
(voie métabolique la plus importante chez l’adulte, car
elle intervient pour 60 %) [11]. L’autre voie est accessoire,
d’importance secondaire, qui intéresse une faible fraction
de la dose ingérée (4 %), métabolisée par des acétylations
et des N-hydroxylations, sous l’influence d’une monooxygénase à cytochrome P450 aboutissant à un dérivé
N-hydroxylé instable à température et pH physiologiques.
Ce dernier subit par déshydratation une transformation en
un métabolite potentiellement toxique : le N-acétyl parabenzo quinone imine (NAPQI), qui est électrophile, très
réactif, et a donc des propriétés de radical libre. Ce métabolite est détoxifié par conjugaison au glutathion réduit
(GSH) sous l’action catalytique d’une glutathion Stransférase (GST). Le NAPQI est transformé alors en acides mercapturiques non toxiques, solubles et facilement
éliminés dans les urines [9, 12, 13]. Le GSH consommé
par le métabolite toxique est normalement régénéré par
une synthèse cellulaire accrue [13]. L’excès en NAPQI
cause un stress oxydatif [14]. D’ailleurs en cas de surdosage massif, la voie accessoire prend de l’importance
parce que la quantité de métabolite toxique produit
dépasse les capacités de neutralisation par le glutathion.
Les réserves hépatiques en glutathion réduit (GSH)
s’épuisent rapidement. Le NAPQI se lie par covalence
aux protéines hépatiques et forme des conjugués 3(cystéine-S-yl)-paracétamol. Ces derniers sont libérés
dans le sang après l’hépatocytolyse [13]. Ceci est l’origine
de la toxicité hépatique exprimée par la nécrose [14-16].
La nécrose cellulaire apparaît lorsque la réserve en glutathion est inférieure à 30 % de la normale [15]. Le glutathion se lie avec le NAPQI dans le foie, sa déplétion augmente le risque de l’hépatotoxicité [13]. Le paracétamol
induit alors une hépatite cytolytique qui correspond biologiquement à une élévation des transaminases et histologiquement à une nécrose hépatique [17].
Largement utilisée en Algérie, l’association paracétamolAINS est très souvent prescrite dans le traitement des
douleurs inflammatoires (douleur de l’arthrose, douleur
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Protection de diclofénac contre la toxicité du paracétamol
dentaire, douleur chirurgicale, lombalgies, etc.). Le paracétamol et les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)
sont des inhibiteurs des cyclo-oxygénases, qui transforment
l’acide arachidonique en prostaglandines et thromboxanes.
Les AINS agissent sur les cyclo-oxygénases systémiques
(COX-1 et COX-2) périphériques, et le paracétamol agit
principalement sur la cyclo-oxygénase au niveau du système nerveux central ; l’inhibition sélective de la COX2 a été notamment évoquée [18]. La COX-1 (enzyme
constitutive) est exprimée dans la plupart des tissus et responsable des effets indésirables, les plus importants sont
l’inhibition de l’adhésivité plaquettaire, les ulcères gastriques et la diminution de la perfusion rénale. La COX2 (enzyme inductible) est spécifique de l’inflammation et
de la fièvre, elle est localisée dans les nerfs périphériques et
la moelle épinière [19-21].
Les AINS, en provoquant l’inhibition non sélective des
deux COX, entraînent une baisse des quantités des prostaglandines et des thromboxanes produites et donc une
diminution de l’inflammation (action anti-inflammatoire),
diminution de la fièvre (action antipyrétique), diminution
de l’agrégation des plaquettes (action anti-agrégeant plaquettaire) et diminution de la protection de l’estomac
(action ulcérogène) [22].
L’exemple de l’AINS choisi pour notre étude d’association est le diclofénac (DiCF). Le choix d’un antalgique
pour la prise en charge des douleurs aiguës nécessite de
prendre en compte plusieurs critères : efficacité, effets
indésirables, profil pharmacocinétique et coût [18].
Le DiCF est faiblement dosé et utilisé comme antalgique
[23]. C’est un AINS de courte demie vie, il est choisi en
association avec le paracétamol de façon à ce que la molécule exerce une action de durée comparable à celle du
paracétamol [18]. En plus, les travaux de Munsterhielm
et al. [24] ont prouvé l’action synergique entre le paracétamol et le diclofénac.
Le DiCF est doué de propriétés anti-inflammatoire, antipyrétique et antalgique. Le métabolisme du DiCF s’effectue en partie par glucuro-conjugaison de la molécule
inchangée entraînant la formation de différents métabolites qui sont éliminés. Environ 60 % de la dose sont éliminés dans les urines sous la forme de métabolites et moins
de 1 % sont excrétés sous forme inchangée. Le reste est
éliminé sous forme de métabolites par la bile avec les
fèces [25].
Les médicaments, comme tout xénobiotique, produisent
après leur métabolisme des métabolites actifs qui sont normalement neutralisés et éliminés par l’organisme sous
forme soluble facile à éliminer dans les urines et la bile.
Le problème de l’intoxication médicamenteuse se pose
après l’ingestion de doses en dessus de la dose thérapeutique. Face à ce danger, la cellule vivante peut se défendre
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grâce à plusieurs systèmes de détoxification intracellulaires dont le plus important est celui de glutathion. Le GSH
agit comme un agent nucléophilique ou comme un antioxydant contre les composés électrophiliques ou oxydatifs, résultant des sources endogènes ou exogènes [26].
Ce rôle de glutathion lui est attribué grâce au groupement
thiol (-SH) de la cystéine qui entre dans sa composition.
Le glutathion est alors un tripeptide formé de la succession de trois acides aminés donnant le γ-L-glutamyl-Lcystéinyl-glycine. Il constitue le majeur composé thiol
non protéique intracellulaire [27].
Le système enzymatique de glutathion est en réalité un
cycle d’oxydoréduction qui fait intervenir deux enzymes
essentielles qui maintiennent un rapport normal GSH/
GSSG (100/1) : la glutathion réductase (GR) (EC :
25.1.6.4.2) qui transforme le glutathion oxydé (GSSG)
en sa forme réduite (GSH). Sies et al. [28] ont indiqué
que cette enzyme est responsable de la régénération de
plus de 97 % du glutathion réduit total à partir du glutathion oxydé. La glutathion peroxydase (GPx) (EC :
27.1.11.1.9) est la seule séléno-enzyme dans les cellules
des mammifères, sa molécule contient quatre atomes de
sélénium dans le centre actif sous forme de sélénocystéine. Elle catalyse les réactions de réduction des peroxydes organiques et inorganiques en utilisant le GSH
comme donneur de protons, ce qui provoque l’oxydation
de glutathion réduit (GSH) en glutathion oxydé (GSSG) et
la production d’alcool primaire non toxique. Ce système
enzymatique contient également la glutathion Stransférase (GST) qui catalyse la réaction de conjugaison
entre le GSH et les substances étrangères (xénobiotiques,
carcinogènes, composés électrophiles, etc.) afin de former
des métabolites glutathion-conjugués [29].
En clinique, le but de l’association paracétamol-diclofénac
est d’améliorer l’efficacité et/ou de réduire les effets
secondaires [18]. L’objectif de notre étude a été orienté
vers l’évaluation de la balance bénéfices-risques de cette
association à travers le dosage des enzymes du système
enzymatique de glutathion (enzymes antioxydantes) ainsi
que d’autres paramètres biochimiques.
Matériel et méthodes
Animaux
Soixante rats mâles (Albinos wistar) ont été fournis par
l’Institut Pasteur d’Alger, âgés de 10 semaines, avec un
poids moyen de (250 ± 10 g). Les rats ont été exposés à
une photo-période journalière de 12 heures et une température ambiante de (21 ± 3 °C). Ils ont été nourris par un
régime alimentaire standard, l’eau étant quotidiennement
renouvelée. Après la période d’accoutumance, les ani-
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maux ont été répartis au hasard en six groupes de 10 rats
chacun. Le traitement des rats par (PARA + DiCF) mg/kg
a été réalisé par gavage oral (per os) pendant sept jours.
Le lot témoin a été traité par l’eau minérale (0 + 0) mg/kg,
le deuxième lot a été traité seulement par une dose toxique
de 100 mg/kg de paracétamol (100 + 0) mg/kg. Les lots
restants ont été traités par la combinaison des deux médicaments. Le DiCF a été utilisé par une seule dose thérapeutique (3 mg/kg), cependant le PARA a été donné par
différentes doses (15, 100, 200 et 400) mg/kg. Les solutions de traitement ont été préparées par le mélange de
(PARA + DiCF) selon les doses étudiées (15 + 3, 100
+ 3, 200 + 3 et 400 + 3) mg/kg. Soixante-douze heures
après l’arrêt du traitement, des prélèvements sanguins
ont été réalisés pour le dosage sanguin des paramètres
biochimiques et des enzymes de glutathion. Puis les rats
ont été décapités. Le foie, les reins, les intestins et la rate
sont isolés, lavés avec 0,1 M de tampon phosphate (pH
7,4), pesés et stockés pour servir au dosage du glutathion
tissulaire.
Méthodes
Le dosage du glucose a été réalisé par un glucose-mètre
(Accu-Check Aviva fourni par Roche Diagnostics).
Les paramètres biochimiques : cholestérol, créatinine,
ASAT (aspartate aminotransférase), ALAT (alanine aminotransférase), phosphatases alcalines (PAL), bilirubine
directe (D) et totale (T) ont été dosés sur analyseur
Roche Diagnostics. La GPx et la GR ont été dosées
selon la méthodologie de Randox laboratoires. Le glutathion réduit a été déterminé par spectrophotométrie selon
la méthode de Weckbeker et Cory [30]. Le dosage des
protéines a été effectué par la méthode de Bradford [31].
Analyse statistique
Les résultats ont été représentés sous forme de moyennes
plus ou moins l’écart type (M ± SD). La comparaison
entre les différents groupes est effectuée par un test t de
Student grâce au logiciel Minitab (version 13.31).
Résultats
L’étude statistique de la variation des poids des organes
par rapport à 100 g du poids corporel a montré qu’il n’y a
pas de différence significative des rapports hépatocorporel, réno-corporel, cardio-corporel et splénocorporel des rats traités comparant aux témoins
(tableau 1). Les résultats illustrés dans le tableau 2 et
qui concernent le dosage des paramètres biochimiques
Tableau 1. Variations des rapports organo-corporels chez les rats témoins (0 + 0) et traités avec des doses associées PARA + DiCF
(100 + 0 ; 15 + 3 ; 100 + 3 ; 200 + 3 ; 400 + 3) mg/kg après 7 jours de traitement (chaque valeur représente la moyenne ± SD de 10
rats).
Rapports (%)
Doses (PARA + DiCF) mg/kg
Hépato-corporel
Réno-corporel
Cardio-corporel
Spléno-corporel
Témoin (0 + 0)
3,80 ± 0,45
0,645 ± 0,08
0,302 ± 0,03
0,41 ± 0,06
(100 + 0)
3,67 ± 0,26
0,654 ± 0,04
0,305 ± 0,02
0,37 ± 0,06
(15 + 3)
3,82 ± 0,48
0,696 ± 0,08
0,320 ± 0,05
0,44 ± 0,07
(100 + 3)
3,94 ± 0,25
0,672 ± 0,03
0,330 ± 0,04
0,38 ± 0,09
(200 + 3)
3,67 ± 0,19
0,674 ± 0,06
0,301 ± 0,04
0,43 ± 0,12
(400 + 3)
3,76 ± 0,35
0,680 ± 0,08
0,311 ± 0,04
0,37 ± 0,03
Tableau 2. Concentrations des paramètres biochimiques chez les rats témoins (0 + 0) et traités avec des doses associées PARA
+ DiCF (100 + 0 ; 15 + 3 ; 100 + 3 ; 200 + 3 ; 400 + 3) mg/kg après 7 jours de traitement (chaque valeur représente la moyenne ± SD de
10 rats).
Paramètres
Doses (PARA + DiCF) mg/kg
Glucose (g/L)
Cholestérol (g/L)
Créatinine (mg/L)
Bilirubine D (mg/L)
Bilirubine T (mg/L)
ALAT (UI/L)
ASAT (UI/L)
PAL (UI/L)
Témoin (0 + 0)
1,56 ± 0,14
0,820 ± 0,07
4,14 ± 0,51
0,63 ± 0,24
1,29 ± 0,26
59,7 ± 14,8
153,2 ± 26,9
172,2 ± 37,0
(100 + 0)
1,722 ± 0,16*
0,779 ± 0,15
4,50 ± 0,76
1,12 ± 0,47*
1,65 ± 0,42*
71,5 ± 11,3*
245,2 ± 73,0*
212,4 ± 45,3*
(15 + 3)
1,56 ± 0,29
0,749 ± 0,08
4,36 ± 0,62
0,83 ± 0,21
1,49 ± 0,42
60,1 ± 18,3
163,2 ± 37,1
173,8 ± 43,6
(100 + 3)
1,69 ± 0,23
0,740 ± 0,09
4,52 ± 0,63
1,06 ± 0,46*
1,60 ± 0,44
65,3 ± 13,3
166,9 ± 20,0
193,7 ± 32,0
(200 + 3)
1,77 ± 0,14*
0,726 ± 0,04*
4,79 ± 0,71*
1,31 ± 0,70**
1,83 ± 0,52**
115,5 ± 14,3***
313,5 ± 75,6***
234,9 ± 43,3**
(400 + 3)
1,95 ± 0,34**
0,703 ± 0,07*
4,95 ± 0,53**
1,37 ± 0,33***
1,96 ± 0,59***
140,1 ± 26,6***
425 ± 10,7***
244,0 ± 59,4**
* (P < 0,05) ; ** (P < 0,01) ; *** (P < 0,001) : différence significative par rapport aux témoins.
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Protection de diclofénac contre la toxicité du paracétamol
affirment l’existence d’une grande perturbation métabolique. Le traitement des rats par la dose thérapeutique de
paracétamol associée au diclofénac (15 + 3) mg/kg a
maintenu à des concentrations physiologiques tous les
marqueurs en comparaison au lot témoin. Le traitement
par la dose toxique du paracétamol (100 + 0) mg/kg a
entraîné une augmentation significative des concentrations
sériques de glucose, bilirubine D, bilirubine T, ASAT,
ALAT, et PAL, par rapport aux témoins. L’association
du diclofénac avec le paracétamol a montré une stabilité
relative de ces paramètres analysés mais seulement au
niveau du lot (100 + 3) mg/kg tout en comparant avec
les rats non traités. Avec ou sans l’association au DiCF,
la dose toxique du PARA (100 mg/kg) n’a pas influencé les
concentrations du cholestérol et de la créatinine qui n’ont
pas significativement changé comparativement au témoin.
Par contre, cette association a provoqué un changement très
significatif des concentrations de tous les marqueurs dosés
au niveau des lots (200 + 3 et 400 + 3) mg/kg. Les résultats
de la figure 1 montrent une diminution des concentrations
de glutathion dans les quatre organes après le traitement par
les doses toxiques du paracétamol. Le GSH tissulaire des
rats traités par la dose (15 + 3) mg/kg a été maintenu dans
les normes du lot témoin. Le traitement par la dose toxique
du paracétamol (100 + 0) mg/kg a donné une diminution
très significative du GSH dans tous les organes en comparant aux témoins. L’addition du diclofénac à la dose
100 mg/kg du paracétamol a diminué l’effet toxique, mais
l’a aggravé au niveau des deux doses 200 et 400 mg/kg par
rapport au lot témoin. Le dosage des enzymes d’oxydoréduction du système de glutathion (GPx et GR) a fourni
les résultats des figures 2 et 3 qui révèlent l’absence de
différences significatives entre le lot (15 + 3) mg/kg et le
lot témoin. D’autre part, le groupe de rats qui a bénéficié de
Foie
la dose (100 + 0) mg/kg a présenté une élévation statistiquement significative de l’activité des deux enzymes. Cette
augmentation a été plus faible lors de l’association des
deux médicaments à la dose (100 + 3) mg/kg. Malgré
cela, les doses très toxiques du paracétamol associées à
cet AINS (200 + 3 et 400 + 3) mg/kg ont conduit à des
augmentations très hautement significatives de GPx et GR
comparativement au groupe contrôle.
Discussion
Le paracétamol et les AINS sont des analgésiques fréquemment prescrits en association. Le rationnel de la
combinaison de ces deux types d’agents a fait l’objet de
plusieurs études expérimentales chez l’animal et chez
l’homme. Les études sur l’animal, chez des volontaires
sains et des patients arthrosiques suggèrent un bénéfice à
associer ces deux types de médicament [18]. Au regard
des résultats trouvés, nous n’avons pas signalé de variation significative des rapports poids organe/poids corporel
malgré les doses toxiques du paracétamol. La croissance
physiologique des rats n’a pas été influencée par l’association des deux médicaments. La ration alimentaire n’a
donc pas changé et les rats ont gardé un appétit normal ce
qui a conservé leurs poids. L’association du diclofénac au
paracétamol a exprimé un effet protecteur significatif en
diminuant la toxicité du paracétamol. Les rats traités par
les doses thérapeutiques des deux médicaments n’ont pas
donné de résultats significativement différents de ceux des
témoins. Par contre, ceux traités par les doses toxiques de
paracétamol ont montré un changement significatif des
concentrations des marqueurs biochimiques. Une hyper-
Intestins
Reins
Rate
[GSH] (nM/mg Prt)
60
50
*
***
40
***
**
30
*
***
20
***
***
***
***
***
***
***
***
(200 + 3)
(400 + 3)
10
mg/kg
0
(0 + 0)
(100 + 0)
(15 + 3)
(100 + 3)
Figure 1. Taux de glutathion (nM/mg protide) chez les rats témoins (0 + 0) et traités avec des doses associées PARA + DiCF (100 + 0 ;
15 + 3 ; 100 + 3 ; 200 + 3 ; 400 + 3) mg/kg après 7 jours de traitement (chaque valeur représente la moyenne ± SD de 10 rats).
* (P < 0,05) ; ** (P < 0,01) ; *** (P < 0,001) : différence significative par rapport aux témoins.
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glycémie a été observée et qui est probablement due à un
dysfonctionnement du métabolisme glucidique sous l’effet
du métabolite toxique (NAPQI). Ce dernier étant électrophile, possède des propriétés de radical libre [13], ce qui
génère un stress oxydatif lorsque la vitesse de génération
des radicaux libres dépasse la capacité cellulaire de leur
suppression [32]. En effet, le stress oxydatif est responsable d’une multitude de dysfonctions métaboliques
comme la résistance à l’insuline [33], qui inhibe la pénétration du glucose dans les cellules [34]. En plus en cas
350
Activité GPx (Ul/L)
300
***
250
**
***
200
*
150
100
50
mg/kg
3)
+
3)
(4
00
(1
00
(2
00
+
+
3)
3)
+
(1
5
(0
(1
00
+
+
0)
0)
0
Figure 2. Activité enzymatique de la glutathion peroxydase GPx
(UI/L) chez les rats témoins (0 + 0) et traités avec des doses
associées PARA + DiCF (100 + 0 ; 15 + 3 ; 100 + 3 ; 200 + 3 ;
400 + 3) mg/kg après 7 jours de traitement (chaque valeur
représente la moyenne ± SD de 10 rats). * (P < 0,05) ;
** (P < 0,01) ; *** (P < 0,001) : différence significative par rapport
aux témoins.
25
***
Activité GR (Ul/L)
**
20
***
*
15
10
5
mg/kg
3)
00
+
3)
(4
00
(2
00
+
3)
+
3)
(1
(1
5
+
+
00
(1
(0
+
0)
0)
0
Figure 3. Activité enzymatique de la glutathion réductase GR (U/
L) chez les rats témoins (0 + 0) et traités avec des doses associées PARA + DiCF (100 + 0 ; 15 + 3 ; 100 + 3 ; 200 + 3 ; 400 + 3)
mg/kg après 7 jours de traitement (chaque valeur représente
la moyenne ± SD de 10 rats). * (P < 0,05) ; ** (P < 0,01) ;
*** (P < 0,001) : différence significative par rapport aux témoins.
624
d’agressions, le métabolisme hépatique des protéines est
modifié vers la production des systèmes de défense et la
néoglucogenèse [35]. Les transaminases et les phosphatases alcalines sont des biomarqueurs de la fonction hépatique [36] et leur augmentation sérique est liée à l’effet
hépatotoxique du paracétamol administré par des doses
toxiques. Le NAPQI non conjugué s’accumule lorsque
la capacité de détoxification des hépatocytes est dépassée.
Ceci favorise la fixation du métabolite toxique par liaison
covalente irréversible aux enzymes et amino-acides des
protéines vitales de la cellule, et induit alors une cytolyse
des cellules hépatiques [13, 14, 37]. Ces dernières déversent leur contenu dans la circulation sanguine [13, 38].
Par ailleurs, l’élévation du taux de la bilirubine plasmatique par les doses toxiques du paracétamol peut être attribuée au stress oxydatif induit par le NAPQI. Ce phénomène provoque l’oxydation de l’hémoglobine en
méthémoglobine qui peut être dégradé en bilirubine, son
métabolite final. Ce résultat est en accord avec les travaux
de Udosen et al. [39].
Les résultats des paramètres mesurant le stress oxydatif
(GSH, GR, GPx) reflètent le rôle important de détoxification assuré par le système enzymatique de glutathion.
Ce rôle est confirmé par une étude in vitro sur des hépatocytes de souris traitées par une dose toxique de paracétamol, en utilisant deux inhibiteurs spécifiques de GPx et
GR. La toxicité a augmenté en présence des inhibiteurs
avec l’apparition de lésions membranaires en réponse au
stress oxydatif [40]. Les données indiquent que ce système enzymatique contribue à la protection de la toxicité
de paracétamol et que la formation des radicaux libres est
responsable de ses effets toxiques. L’administration de
doses toxiques de paracétamol a entraîné une déplétion
significative du taux de GSH au niveau du foie, des
reins, des intestins et de la rate. Cette diminution est expliquée par la participation de ces organes à l’élimination des
différents métabolites toxiques résultant de la dégradation
du xénobiotique tels que les peroxydes lipidiques et les
électrophiles responsables des dommages tissulaires [4143]. De plus, le glutathion a une forte capacité de donneur
d’électrons, c’est le principal antioxydant dans les cellules
en se liant par son groupe SH aux métabolites toxiques
[44]. Le glutathion reste alors un élément essentiel dans
la détoxication des substances toxiques. Lors d’une intoxication aiguë, la diminution du glutathion hépatique est
expliquée par l’afflux massif de paracétamol qui sature la
sulfoconjugaison. Par augmentation de son substrat, la
voie de détoxication par conjugaison au glutathion prend
de l’importance et va conduire à une formation accrue du
NAPQI toxique. La conjugaison au glutathion inactive
normalement ce métabolite réactif, mais une baisse de
ses réserves en dessous du seuil critique de 20 à 30 %
de la normale entraîne une augmentation du toxique
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Clin,
vol. 67, no 6, novembre-décembre 2009
Protection de diclofénac contre la toxicité du paracétamol
libre, la cellule devient de ce fait en état de stress oxydatif
[2]. Plusieurs travaux ont trouvé des résultats semblables
après traitement de rats par des doses toxiques de paracétamol [45-47]. En ce qui concerne les enzymes clés du
système de défense de glutathion, l’activité enzymatique
de GPx et GR a significativement augmenté après le traitement des rats par les doses toxiques de paracétamol.
Le résultat de l’élévation de l’activité de GR est similaire
à celui des travaux de Guzy et al. [14], qui ont traité des
rats par 500 mg/kg de paracétamol. Kozer et al. [37] ont
suggéré que cette activité élevée peut avoir un effet protecteur contre la toxicité du paracétamol. Nos résultats
montrent que l’accumulation accrue du NAPQI a causé
une forte déplétion du GSH, ce qui n’a pas permis d’augmenter son niveau malgré la grande activité signalée de
GR. Cette enzyme est connue par sa capacité à régénérer
le GSH afin de maintenir le rapport (GSH/GSSG) normal.
L’augmentation de GPx est peut-être liée au stress oxydatif induit par NAPQI. Les radicaux libres ainsi formés
donnent naissance aux hydroperoxydes toxiques. La principale fonction de ces enzymes antioxydantes est la protection des cellules contre les différents hydroperoxydes
résultant d’espèces oxygéniques réactives (ROS) [48].
L’augmentation de l’activité des enzymes antioxydantes
stimule la capacité cellulaire à capter les radicaux libres,
ce qui limite les dommages causés par les ROS. Toutefois,
les travaux de Chattopathyay et al. [49] ont trouvé une
diminution de la GPx hépatique chez des rats traités par
2 g/kg de paracétamol. Nous pensons que ce résultat peut
être dû à l’inhibition de l’enzyme par excès de substrat.
La présente étude a évalué l’effet protecteur du diclofénac
contre la toxicité induite par le paracétamol. L’association
du diclofénac a considérablement réduit l’intensité de la
toxicité qui a été reflétée par le changement des valeurs du
glucose, bilirubine D, bilirubine T, ASAT, ALAT et PAL,
chez les animaux traités seulement avec la dose
100 mg/kg de paracétamol, par rapport aux témoins.
Ceci est une indication de la stabilisation de la membrane
plasmique, peut-être due à la réduction de la liaison covalente des métabolites toxiques suite à l’effet du diclofénac.
Ce dernier a peut-être diminué la vitesse de l’absorption
du paracétamol, et augmenté l’excrétion urinaire des dérivés conjugués PARA-GSH. Les travaux de Speck et al.
[50] ont signalé que l’activité d’ALAT sérique ainsi que
l’étendue de la nécrose hépatocellulaire ont significativement diminué chez les rats traités par une dose toxique de
paracétamol (375 mg/kg) associée au prednisolone qui est
un anti-inflammatoire stéroïdien.
Les cellules ont un certain nombre de mécanismes pour se
protéger des effets toxiques du ROS. La SOD dismute le
superoxyde (O°2) en le transformant en H2O2 rapidement
convertis en eau par la catalase et la GPx. En outre, une
grande réserve de glutathion est présente dans les hépatoCopyright © 20162009
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cytes et les globules rouges afin de détoxifier les xénobiotiques et les radicaux libres [5]. À cause de la peroxydation des lipides accrue chez les rats traités par le
paracétamol seulement, la diminution du taux de glutathion est très significative au niveau de tous les organes.
La combinaison avec le diclofénac a réduit la déplétion du
GSH au niveau du lot traité par 100 mg/kg de paracétamol. Ce résultat montre l’effet du diclofénac sur la régénération du glutathion et donc probablement son pouvoir
à stimuler la GR. Cela confirme les travaux de Van Bree
et al. [45] qui ont administré à des rats une dose toxique
de paracétamol associée à un AINS (acide acétylsalicylique). Cette association a provoqué une diminution de
l’épuisement du GSH. Par ailleurs, Rocha et al. [51] ont
traité les rats par une combinaison de paracétamol
(1 200 mg/kg) et ebselen. Ce dernier a également diminué
sensiblement la peroxydation des lipides et donc la
conservation du contenu cellulaire en GSH. Ceci est probablement dû à son action semblable à celle de GPx qui
contribue à la réduction des radicaux libres formés après
l’intoxication au paracétamol. Le même résultat a été
prouvé par la combinaison paracétamol et lobenzarit [52].
Les enzymes du stress oxydatif interviennent par des réactions en chaîne afin d’empêcher les lésions cellulaires
résultantes de l’attaque des radicaux libres et des hydroperoxydes. Dans notre étude, le niveau de l’augmentation
de l’activité enzymatique de GR et GPx a diminué après
la combinaison avec le diclofénac. Cela est un signe de la
réduction de la toxicité du paracétamol, qui est vraisemblablement expliquée par la capacité du diclofénac à
empêcher l’accumulation des métabolites toxiques du
paracétamol. Cependant les résultats de l’association du
diclofénac avec les doses très toxiques du paracétamol
(200, 400) mg/kg ont dévoilé l’existence d’une grave toxicité. Cette dernière est reflétée par des variations significatives des concentrations de tous les paramètres étudiés
par rapport au témoin. La diminution significative du cholestérol peut être due à l’hépatotoxicité causée par le
PARA. Ghanem et al. [53] ont affirmé que les doses toxiques du PARA induisent une élévation de l’excrétion
biliaire. Le cholestérol est le constituant essentiel de la
bile, donc ceci peut expliquer la chute du taux du cholestérol. Comme la créatinine est éliminée exclusivement par
les reins, son augmentation significative est probablement
due à l’altération de la fonction rénale. Une surdose de
PARA provoque une insuffisance rénale aiguë [54].
Le diclofénac n’a pas donc d’effet protecteur au niveau
des doses (200, 400) mg/kg du PARA. À ce stade, les
dommages cellulaires provenant de l’accumulation du
NAPQI sont irréversibles, d’ailleurs Hans-Peter et al.
[22] ont déconseillé l’indication du diclofénac en cas
d’insuffisance hépatique sévère.
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625
article original
Conclusion
10. Forrest JA, Clements JA, Prescott LF. Clinical pharmacokinetics of
paracetamol. Clin Pharmacokinet 1982 ; 7 : 93-107.
Les résultats de cette étude démontrent l’effet protecteur
du diclofénac contre le stress oxydatif généré par l’accumulation du métabolite toxique du paracétamol chez les
rats. La toxicité a été évaluée par la perturbation du métabolisme biochimique et la déplétion du système enzymatique de détoxification du glutathion. La combinaison
(PARA + DiCF) a fait alléger le niveau de la toxicité en
augmentant le rendement du GSH par sa régénération et
donc le fonctionnement normal de GPx et GR. Ceci a
augmenté la capacité de la cellule à capter les radicaux
libres, ce qui a diminué leurs liaisons covalentes aux protéines membranaires. La cytolyse cellulaire a été donc
probablement affaiblie ce qui a induit la baisse des
concentrations des marqueurs biochimiques. Nos résultats
établissent une action protectrice du diclofénac qui peut
être associée à une diminution du stress oxydatif. Il semble
qu’il y a un bénéfice à combiner ces deux médicaments ce
qui rend leur association favorable.
Il serait judicieux de compléter cette recherche par une
étude approfondie s’intéressant aux mécanismes de
défense radicalaire par le dosage d’autres marqueurs du
stress oxydatif (rapport GSH/GSSG, SOD, catalase, vitamine C, etc.). Il serait également souhaitable de pouvoir
doser les composés conjugués du NAPQI et les protéines
cellulaires afin de bien cerner la toxicité causée par le
paracétamol.
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