maladie de marek

CHAPITRE 2.3.13.
MALADIE DE MAREK
RÉSUMÉ
La maladie de Marek (MD pour Marek’s Disease) est une maladie causée par un alphaherpèsvirus.
Elle est caractérisée par une affection lymphomateuse et neuropathique chez les volailles
domestiques.
Le diagnostic est réalisé sur la base des signes cliniques et des lésions macroscopiques et
microscopiques. Néanmoins, les poulets peuvent développer une infection latente par le virus de la
MD (MDV) sans avoir montré de signes cliniques. L’infection par le MDV est révélée par l’isolement
viral et/ou la mise en évidence d’antigènes viraux ou d’anticorps.
La prophylaxie contre la MD recourt à la vaccination au moyen de vaccins mono- ou multivalents
de différents types. Les vaccins peuvent être administrés in ovo ou chez le poussin d’un jour.
Chez le poulet, la MD peut apparaître dès l’âge de 3 ou 4 semaines, mais elle est plus couramment
rencontrée entre 12 et 30 semaines. Les symptômes observés sont de la paralysie des pattes et
des ailes, associée à un épaississement des nerfs périphériques. Cependant, l’atteinte des nerfs
passe parfois inaperçue, particulièrement chez les adultes. En fonction de la souche de MDV
infectante, une lymphomatose peut se produire principalement au niveau de l’ovaire, du foie, de la
rate, des reins, du cœur, du proventricule succenturié et de la peau. Alors qu’une uniformité
cellulaire est rencontrée dans les tumeurs associées au virus de la leucose aviaire, plusieurs types
de cellules lymphoïdes constituent les infiltrations nerveuses et les lymphomes associés au MDV.
Des tumeurs ressemblant à celles provoquées par le MDV sont dues au rétrovirus aviaire, le virus
réticulo-endothélial (REV). Le diagnostic différentiel principal de la MD est la leucose lymphoïde.
Des lésions associées au virus de la réticulo-endothéliose peuvent également être confondus avec
ceux de la MD.
Identification de l’agent pathogène : dans les conditions de terrains, la plupart des poulets
s’infectent au cours des premières semaines de vie et deviennent porteurs latents de l’infection à
vie, souvent sans développer de signes cliniques. L’infection est habituellement diagnostiquée par
l’inoculation de cellules blanches du sang (buffy coat) sur des cultures de cellules rénales de poulet
ou sur des fibroblastes embryonnaires de canard, sur lesquelles un effet cytopathogène (ECP)
apparaît en quelques jours. Le MDV est divisé en deux sérotypes principaux : MDV-1 et MDV-2,
auxquels peut être ajouté un troisième représenté par l’herpèsvirus du dindon apparenté au MDV
(HVT pour Herpesvirus of Turkeys). Le sérotype 1 comprend des souches virulentes et le
sérotype 2 des souches naturellement avirulentes. Les antigènes viraux peuvent être détectés dans
les hampes plumifères des oiseaux infectés par un test à la précipitine rayonnante.
Épreuves sérologiques : les anticorps spécifiques du MDV apparaissent 1 à 2 semaines après
l’infection. Ils peuvent être détectés par différentes méthodes : une épreuve d’immunodiffusion en
gélose (IDG) ; une épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) ; ou une épreuve
immuno-enzymatique (ELISA).
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : la
MD peut être prévenue par la vaccination des poulets in ovo ou chez le poussin d’un jour. Les
vaccins utilisés sont du type à virus vivants atténués. Les souches virales les plus utilisées
appartiennent au HVT. Les formulations vaccinales contiennent soit du virus libre (lyophilisé), soit
du virus associé aux cellules (forme humide). Des souches atténuées issues du sérotype 1 du MDV
sont les plus couramment utilisées ; des souches du sérotype 2 peuvent aussi être utilisées
notamment pour les vaccins combinés, bivalents, qui associent le HTV (sérotype 3). Les
formulations vaccinales contenant les sérotypes 1 et 2 ne sont disponibles que sous forme
618
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
associée aux cellules. Il existe également des vaccins trivalents, associant les sérotypes 1, 2 et 3.
Les vaccins bivalents (sérotypes 1 et 3) ou les vaccins trivalents (sérotypes 1, 2 et 3) sont aussi
utilisés. Les vaccins bi- et trivalents ont été mis sur le marché pour lutter contre les souches
hypervirulentes de MDV pour lesquelles la vaccination monovalente était relativement inefficace.
La vaccination réduit fortement la sévérité des signes cliniques associés au MDV, mais n’empêche
pas l’infection persistante. Les virus vaccinaux s’installent par ailleurs à l’état latent chez les
volailles vaccinées et sont excrétés, ce qui se traduit par la présence permanente du MDV.
A. INTRODUCTION
La maladie de Marek (MD) est une maladie de la volaille domestique (poulet) causée par un herpèsvirus
(14, 25, 33). Les oiseaux s’infectent par inhalation de poussières infectées dans les poulaillers et, après un cycle
viral complexe, le virus est excrété au niveau des follicules plumeux des oiseaux infectés (4). La MD peut se
produire dès l’âge de 3 à 4 semaines, mais apparaît le plus souvent vers 12 à 30 semaines. La MD est associée
à plusieurs syndromes différents, parmi lesquels les syndromes lymphoprolifératifs sont les plus fréquents. Dans
la forme classique, la MD se caractérise par une atteinte principalement nerveuse. La mortalité n’excède que
rarement 10 à 15 % et survient au bout de quelques semaines à quelques mois. Dans la forme aiguë, la maladie
aboutit à la formation de lymphomes viscéraux. L’incidence au sein d’un groupe de volailles est alors de 10 à
30 %. Des épisodes impliquant jusqu’à 70 % des animaux peuvent survenir. La mortalité peut se maintenir de
façon enzootique pendant des mois. La forme la plus prévalente actuellement est l’atteinte aiguë avec des
lymphomes viscéraux étendus. Le signe clinique le plus fréquent de la forme chronique est la paralysie partielle
ou complète des pattes et des ailes. Dans la forme aiguë, les oiseaux sont souvent apathiques et il n’est pas rare
d’observer une mortalité sans aucun signe précurseur. Une maladie sans tumeur mais avec un œdème du
cerveau entraînant une paralysie temporaire est de plus en plus associée à une MD due aux souches les plus
virulentes.
Dans la forme classique, la lésion caractéristique est l’épaississement d’un ou de plusieurs nerfs. Les plus
fréquemment atteints, et les plus aisément repérés à l’autopsie, sont les plexus brachiaux et sciatiques, le plexus
cœliaque, le nerf vague abdominal et les nerfs intercostaux. Les nerfs atteints ont une épaisseur 2 à 3 fois
supérieure à la normale ; leur apparence normale striée disparaît et leur couleur vire au gris ou au jaune ; ils sont
parfois œdématiés. Des lymphomes peuvent apparaître dans la forme classique de la MD. Ils prennent le plus
souvent l’aspect de petites tumeurs ovariennes molles et grises (parfois aussi dans les poumons, les reins, le
cœur, le foie ou d’autres tissus). L’œil gris, fréquemment observé chez les oiseaux âgés (16 à 18 semaines)
causé par une iridocyclitite, est parfois le seul signe de la forme classique. Cette affection entrave le réflexe
d’accommodation de l’iris en face d’un stimulus lumineux. Cela peut également entraîner une torsion de la pupille.
Dans la forme aiguë, la lésion classique consiste en un lymphome disséminé, diffus atteignant le foie, les
gonades, la rate, les reins, les poumons, le proventricule et le cœur. Des lymphomes peuvent atteindre soit la
peau autour des follicules plumeux, soit les muscles squelettiques. Les oiseaux atteints présentent généralement
des nerfs périphériques épais tels que rencontrés dans la forme classique. Chez les jeunes volailles,
l’hépatomégalie est souvent modérée, alors que les adultes auront une hépatomégalie manifeste dont
l’apparence macroscopique est identique à celle rencontrée dans la leucose lymphoïde. Les lésions nerveuses
sont souvent absentes chez les adultes.
Dans les formes classique et aiguë de la MD, la maladie débute par une prolifération de cellules lymphoïdes qui
progresse dans certains cas et régresse dans d’autres. Les nerfs périphériques peuvent présenter trois types
d’atteintes, soit proliférative, soit inflammatoire, soit légèrement infiltrante. Les lésions sont dénommées
respectivement de types A, B et C. Les lésions du type A consistent en une infiltration par des lymphoblastes
prolifératifs, des lymphocytes grands, moyens et petits et des macrophages. Ces lésions A ont un aspect
néoplasique manifeste. Les lésions de type B sont caractérisées par un œdème interneural, une infiltration
principalement de petits lymphocytes et de cellules sanguines, et une prolifération des cellules de Schwann. Leur
aspect est inflammatoire. Les lésions de type C consistent en une légère infiltration par des petits lymphocytes.
Ces lésions sont observées sur les oiseaux sans lésions macroscopiques ni signes cliniques ; elles pourraient
être une lésion inflammatoire régressive. La démyélinisation se produit fréquemment dans les nerfs atteints par
les lésions A et B et est responsable de la paralysie clinique.
Les lymphomes qui se développent au niveau des viscères et des autres tissus ont une cytologie similaire aux
lésions lympho-prolifératives et de type A nerveuses. Les cellules lymphoïdes sont souvent de plusieurs types à
prédominance de lymphocytes moyens et petits. Il arrive que des grands lymphocytes et des lymphoblastes
soient prédominants dans des formes aiguës des MD chez les adultes.
La population hétérogène des cellules lymphoïdes rencontrées dans les lymphomes de la MD révélée sur des
coupes colorées à l’hématoxyline-éosine ou des frottis colorés par le May-Grünwald Giemsa est un élément
Manuel terrestre de l’OIE 2008
619
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
fondamental pour distinguer la maladie de la leucose lymphoïde dans laquelle l’infiltration lymphomateuse est
composée de lymphoblastes uniformes. Par ailleurs, une autre différence se marque au niveau de la bourse de
Fabricius. En effet, dans la leucose lymphoïde, des tumeurs macroscopiques s’y développent et ces tumeurs ont
une origine intrafolliculaire et sont très proliférantes. Dans la MD, bien que la bourse soit parfois le siège
d’infiltrations lymphoproliférantes, la tumeur est peu apparente, diffuse et se situe entre les follicules. Enfin, les
lésions nerveuses périphériques très communes dans la MD ne se manifestent pas dans la leucose lymphoïde.
Les formes les plus difficiles à différencier dans la MD de la leucose proviennent de cas d’oiseaux adultes
présentant des tumeurs lymphoblastiques avec une hépatomégalie marquée et sans atteinte nerveuse. Si des
autopsies sont réalisées, un diagnostic peut généralement être porté sur la base des lésions macroscopiques et
histopathlogiques. Cependant, d’autres techniques sont décrites. L’expression d’un marqueur biochimique Meq a
été utilisée pour différencier entre les formes tumorales de la MD, les infections latentes de MD et les tumeurs
produites par des rétrovirus (3). Les protocoles exigent du matériel et des réactifs spécifiques, et les laboratoires
qui en sont dépourvus peuvent ne pas pouvoir réaliser ces techniques. D’autres techniques comme la détection
par immunofluorescence des antigènes des lymphocytes T activés présents à la surface des cellules tumorales
de la MD (MATSA pour MD tumour-associated surface antigen) ou des antigènes des cellules B ou d’IgM
présentes à la surface des cellules tumorales, permettent une suspicion mais elles ne sont pas spécifiques des
cellules tumorales de la MD.
Certaines souches du virus de la réticuloendothéliose (RE) induisent des lésions nerveuses et des proliférations
lymphomateuses similaires à ceux de la MD à la fois macro- et microscopiquement. Bien que le virus de la RE
soit rare dans les élevages de poulets, il ne faut pas l’oublier dans les causes potentielles de tumeurs
lymphoïdes. Sa mise en évidence repose sur des examens virologiques et sérologiques de l’élevage. Le virus de
la RE est également responsable de maladies néoplasiques chez la dinde, le canard, la caille et d’autres
espèces. Par ailleurs, la dinde peut être infectée par un autre rétrovirus responsable également d’affections
proliférantes. Même si un élevage de poulet est séropositif pour le virus de la RE, les maladies néoplasiques sont
rares. Le résumé du diagnostic différentiel de la MD, de la leucose lymphoïde et de la RE est repris dans le
tableau 1. La neuropathie périphérique est un syndrome qu’il est facile de confondre avec les lésions nerveuses
dues au virus de MD (MDV). Cette affection n’est pas fréquente mais son incidence pourrait augmenter dans
certains élevages européens (3).
Il n’existe pas de risques avérés pour l’homme dus au MDV ou aux herpèsvirus apparentés de la dinde.
Tableau 1 : Caractéristiques clés permettant le diagnostic différentiel entre la maladie de Marek,
la leucose lymphoïde et la réticuloendothéliose
Caractéristique
Age
Maladie de Marek
Leucose lymphoïde
Réticuloendothéliose*
Tout âge, habituellement vers
6 semaines ou plus
Paralysie fréquente
Pas en dessous de
16 semaines
Non spécifiques
Pas en dessous de
16 semaines
Non spécifiques
Souvent plus de 5 % dans les élevages
non vaccinés
Rare dans les élevages vaccinés
Rarement plus de 5 %
Rare
Atteinte nerveuse
Fréquente
Absente
Rare
Atteinte de la bourse de
Fabricius
Tumeurs au niveau de la peau,
des muscles, et du
proventricule, œil gris
Hypertrophie diffuse ou atrophie
Tumeurs nodulaires
Tumeurs nodulaires
Parfois
Normalement
absentes
Absentes
Atteinte nerveuse
Oui
Non
Rare
Tumeur du foie
Souvent périvasculaire
Focale ou diffuse
Focale
Atteinte de la rate
Diffuse
Souvent focale
Focale ou diffus
Bourse de Fabricius
Tumeur interfolliculaire et /ou atrophie
des follicules
Oui
Tumeurs
intrafolliculaires
Non
Tumeurs intrafolliculaires
Non
Oui
Non
Non
Signes
Incidence
Lésions macroscopiques
Lésions microscopiques
Système nerveux central
Prolifération lymphoïde au
niveau de la peau et des
follicules plumeux
620
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
Cytologie des tumeurs
Catégorie des cellules
néoplasiques
*
Cellules lymphoïdes pléiomorphes
comprenant des lymphoblastes, des
lymphocytes de toute taille et des
cellules réticulées. Rarement des
lymphoblastes seuls
Cellules T
Lymphoblastes
Lymphoblastes
Cellules B
Cellules B
Le virus de la réticuloendothéliose peut causer plusieurs syndromes différents. Le lymphome bursal apparaît le plus
souvent lorsque les animaux sont en plein air et est décrit ici.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
L’infection par le MDV peut être révélée par l’isolement viral réalisé sur des tissus de poulets infectés. Il convient
de garder présent à l’esprit la nature ubiquiste du MDV et le diagnostic devra être basé sur l’association de
l’isolement du virus ou de la détection du génome par PCR ainsi que sur les symptômes cliniques. Les tissus les
plus utilisés sont les cellules de la fraction leucocytaire (buffy coat) d’échantillons de sang hépariné ou des
suspensions de cellules extraites de lymphomes ou de cellules de rate. Quand ces échantillons sont prélevés sur
le terrain, il est conseillé de les transporter sous froid. Le MDV étant un virus très fortement associé aux cellules,
il est essentiel que les suspensions contiennent des cellules viables. Ces suspensions sont inoculées sur des
cultures en monocouches de cellules rénales de poulet ou de fibroblastes embryonnaires de canard (les
fibroblastes embryonnaires de poulet sont moins sensibles pour l’isolement viral primaire). Cependant, les
sérotypes 2 et 3 du MDV (voir Section C.1.a) sont plus facilement isolés à partir de fibroblastes de poulet que de
cellules rénales de poulet. L’inoculation est réalisée en double dans les conditions suivantes : 0,2 ml d’une
6
7
suspension cellulaire contenant 10 à 10 cellules sont inoculés à des monocouches cellulaires contenues dans
des puits de plaques de culture (diamètre de 60 mm). Des témoins positif et négatif sont incubés dans les mêmes
conditions à 38,5 °C et en atmosphère humide sous 5 % de CO2. Il est possible de réaliser les isolements en
bouteilles de culture fermées. Le milieu doit être remplacé à intervalle de 2 jours. Des effets cytopathogènes
(ECP) confinés à des zones délimitées appelées plages virales se manifestent après 3 à 5 jours. Ces plages
peuvent être dénombrées au bout de 7 à 10 jours.
Un autre tissu est plus rarement utilisé pour l’isolement viral : la hampe plumifère à partir de laquelle des virions
libres du MDV peuvent être isolés. Des embouts de plumes de 5 mm de long ou de minces biopsies cutanées
contenant le follicule plumeux sont suspendus dans un tampon d’extraction SPGA/EDTA (sucrose, phosphate,
glutamate et albumine/acide éthylène diamine tétra-acétique) pour permettre l’extraction et la titration des virions
(9). La composition du tampon est la suivante : 0,218 M de saccharose (7,462 g) ; 0,0038 M de phosphate
monopotassique (0,052 g) ; 0,0072 M de phosphate dipotassique (0,125 g), 0,0049 M de L-glutamate de sodium
(0,083 g) ; 1 % de poudre d’albumine bovine (1,0 g), 0,2 % d’EDTA (0,2g) dans 100 ml d’eau distillée. Le tampon
est stérilisé par filtration et son pH doit être de 6,5.
La suspension est soumise aux ultra-sons et filtrée sur un filtre 0,45 µm avant d’être inoculée sur des
monocouches de cellules rénales de poulet fraîchement passées de 24 h. Après une période d’adsorption de
40 min, le milieu de culture est ajouté et les cultures sont incubées pendant 7 à 10 jours.
Ces méthodes permettent l’isolement des sérotypes 1 et 2 du MDV. Il est possible d’isoler le sérotype 3 du MDV
(HVT) qui peut être isolé à la suite d’une vaccination. Un observateur expérimenté est capable de faire la
distinction entre les plages virales induites par les différents sérotypes viraux en se basant sur la cinétique
d’apparition, la rapidité d’évolution et la morphologie des plages virales. Les plages HVT apparaissent plus
précocement et sont plus grandes que les plages du sérotype 1. Le sérotype 2 induit l’apparition encore plus
tardive de plages plus petites que celles du sérotype 1.
L’identification des plages virales peut être réalisée grâce à des anticorps spécifiques de poulets couplés à des
molécules fluorescentes. Des anticorps monoclonaux (AcM) peuvent être utilisés pour faire la distinction
sérotypique (17).
•
Amplification en chaîne par polymérase
Les génomes des trois sérotypes du MDV ont été séquencés (2, 18). Des réactions d’amplification en
chaîne par polymérase (PCR) ont été développées pour le diagnostic du MDV et une RT-PCR en temps réel
a été décrite (1, 5, 16). En outre, la différenciation entre les souches oncogènes et non-oncogènes du
sérotype 1 du MDV et la distinction des souches vaccinales du MDV appartenant aux sérotypes 2 et 3 (6, 7,
15, 27, 34) ont aussi été décrites. La PCR peut également être utilisée pour quantifier la charge virale dans
les tissus (5, 7, 8, 24) ou pour différencier le MDV du HVT sur les échantillons de sang ou de plumes (5, 13).
Manuel terrestre de l’OIE 2008
621
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
2.
Épreuves sérologiques
La présence d’anticorps spécifiques du MDV chez des poulets non-vaccinés âgés de 4 semaines est révélatrice
d’une infection par le MDV. Avant cette limite d’âge, les anticorps peuvent être la trace d’anticorps maternels
transmis par le jaune d’œuf.
Pour les différentes épreuves décrites ci-après, les virus, antigènes et sérum peuvent être obtenus auprès des
Laboratoires de référence de l’OIE spécialisés dans la MD (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel
terrestre). Cependant, des réactifs internationaux de référence n’ont pas encore été produits.
a)
Immunodiffusion en gélose
Bien qu’elle ne soit pas prescrite pour les échanges internationaux, l’épreuve d’immunodiffusion en gélose
(IDG) est la plus utilisée pour la détection des anticorps envers le MDV. L’épreuve est réalisée sur des
lames porte-objet recouvertes d’une solution saline tamponnée par du phosphate à 1 % d’agarose et 8 % de
chlorure de sodium. Les puits adjacents sont remplis alternativement avec des sérums et de l’antigène viral.
Une incubation de 24 h en atmosphère humide donne le temps à la diffusion de se produire. Les sérums
positifs exhibent une réaction similaire à celle des témoins positifs. L’antigène utilisé peut être de trois
types : soit il provient de culture de cellules infectées, soit il est extrait de hampes plumifères, soit il est
obtenu à partir de biopsies cutanées contenant les follicules plumeux de poulets infectés. L’antigène en
culture de cellules est obtenu par multiplication du MDV sur des cellules rénales de poulet ou sur des
fibroblastes embryonnaires de poulets. Les cellules sont détachées et suspendues dans le milieu lorsque
l’ECP a atteint sa confluence à une concentration proche de 1 × 107 cellules/ml. Il faut que le milieu de
resuspension soit dépourvu de tryptose phosphate (ce dernier pourrait produire des lignes non spécifiques
de précipitine). La suspension cellulaire doit subir trois cycles de congélation-décongélation pour pouvoir
être utilisée comme antigène.
!
Protocole
i)
Préparer une solution saline contenant 1 % de Difco Bactoagar (8 % de NaCl).
ii)
Déposer cette solution d’agarose sur une lame porte objet ou dans une boîte de Petri sur une
épaisseur de 2 à 3 mm.
iii)
Découper des puits dans l’agarose solidifié en utilisant un pochoir (1 puits central et 6 puits
périphériques à égale distance du puits central). Le diamètre des puits doit être de 5,3 mm. Les
puits doivent être séparés d’environ 2,4 mm. Des modèles pré-découpés sont disponibles dans le
commerce.
iv)
Déposer l’antigène dans le puits central et le sérum témoin dans trois puits périphériques en
alternance. Les sérums à tester sont déposés dans les trois puits périphériques restants de sorte
qu’une ligne de précipitation continue puisse se former entre un sérum à tester positif et le sérum
témoin.
v)
Incuber les lames pendant 24 h à 37 °C dans une étuve humide. Les résultats sont visualisés sous
une lampe dans une chambre noire.
Si des hampes plumifères sont utilisées pour détecter la présence du MDV, le protocole doit être adapté
comme suit. Les lames sont préparées avec une solution saline (8 % NaCl) à 0,7 % d’agar avec un sérum
anti-MDV inclus dans cette solution. Les hampes provenant d’oiseaux suspects de MD sont insérées
verticalement dans l’agarose et l’épreuve est réalisée comme décrite plus haut. L’apparition de zones
radiales de précipitation autour des hampes révèle la présence de l’antigène dans les hampes testées.
b)
Autres épreuves
Il est possible de recourir à d’autres techniques pour détecter les anticorps anti-MDV comme par exemple
l’immunofluorescence directe ou indirecte. Dans ces épreuves, le sérum testé va montrer ou non sa
capacité à mettre en évidence des plages du MDV en culture de cellules (28, 29). Ces épreuves sont plus
sensibles que l’IDG. Elles sont de plus spécifiques des sérotypes de MDV. Un test de séroneutralisation
virale peut également être utilisé. Il repose sur la capacité d’un sérum à neutraliser ou non la formation de
plages par des virions libres du MDV. Ce test convient davantage à des fins de recherche qu’à un but
diagnostic. Des tests immuno-enzymatiques (ELISA) permettant la détection des anticorps anti-MDV ont été
mis au point (10, 25, 35). L’antigène utilisé pour sensibiliser les puits des plaques de 96 puits est préparé à
partir de cultures de cellules infectées par le MDV.
622
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Le contrôle de la MD est assuré essentiellement par l’utilisation à grande échelle de vaccins à virus vivants
atténués (21). Les produits biologiques commercialisés pour le contrôle du MDV sont des virus libres ou associés
aux cellules du MDV ou du HVT. Des formulations nouvelles non commercialisées actuellement ont été mises au
point. Il s’agit de vaccins recombinés produits par génie génétique (23). Les vaccins de la MD sont soit injectés in
ovo aux jours 17 ou 18 de l’incubation (26), soit injecté par voie sous-cutanée au moment de l’éclosion. Les
exigences pour la fabrication des vaccins sont reprises ci-dessous. Elles peuvent également être
consultées au Chapitre 1.1.8., « Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire », ou à partir de
documentations publiées pour la fabrication des vaccins à usage vétérinaire (11, 12, 19, 20, 22, 30). Les
protocoles sont décrits dans la monographie 589 de la pharmacopée britannique et dans le volume 19, partie 113
du code fédéral des États-Unis d’Amérique (31). Les lignes de conduites émises par le Manuel terrestre sont
générales. Elles doivent être mises en œuvre par les recommandations nationales ou régionales en vigueur.
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
Les virus du groupe MDV sont classés en trois sérotypes (MDV-1, -2 et -3) sur la base de relations
antigéniques.
Sérotype 1 : il inclut toutes les souches pathogènes du virus ; elles sont classées en hypervirulentes (par
ex. 648A), très virulentes (par ex. Md/5, Md/11, Ala-8, RB-1B), virulentes (par ex. HPRS-16, JM GA),
moyennement virulentes (par ex. HPRS-B14, Conn A) et finalement faiblement virulentes (par ex. CU-2,
CVI-988). Ces souches peuvent être atténuées par passages successifs en culture de cellules, au cours
desquels elles perdent leur pouvoir pathogène mais conservent leur caractère immunogène, de manière à
pouvoir être utilisées comme souches vaccinales. Deux souches atténuées par ce procédé et qui ont été
mises sur le marché sont HPRS-16 et CVI-988 (Rispens). Des souches atténuées de souches
hypervirulentes ont été utilisées dans des protocoles vaccinaux destinés à mettre au point des vaccins
contre la forme aiguë de la maladie. Aux États-Unis d’Amérique, la souche vaccinale Md11/75C/R2/23 est
une de ces souches (32) ayant reçu une autorisation de mise sur le marché. Les vaccins du sérotype 1 sont
préparés sous la forme associée aux cellules (humide), et doivent par conséquent être conservés dans de
l’azote liquide.
Sérotype 2 : il inclut les souches naturellement avirulentes du MDV (par ex. SB-1, HPRS-24, 301 B/1,
HN-1). Plusieurs d’entre-elles ont démontré qu’elles conféraient une protection contre les souches virulentes
du sérotype 1. Les souches SB-1et 301 B/1 ont été commercialisées et sont utilisées, souvent sous la forme
de vaccins bivalents associant le HVT, pour protéger les poulets contre les souches hypervirulentes. Les
vaccins du sérotype 2 sont préparés uniquement sous la forme humide, et doivent par conséquent être
conservés dans de l’azote liquide.
Sérotype 3 : il contient les souches naturellement avirulentes du HVT (par ex. FC126 et PB1). Ces souches
sont fréquemment utilisées comme vaccins monovalents ou en combinaison avec des souches des
sérotypes -1 et/ou -2. Les vaccins bi- ou trivalent sont utilisés pour la protection envers les souches
hypervirulentes. Le HVT peut être préparé sous la forme de virions libres lyophilisables. Il peut cependant
être préparé sous la forme associée aux cellules.
b)
Méthode de culture
Les cellules utilisées pour la préparation des vaccins commercialisés sont des cultures de cellules de
première explantation de fibroblastes d’embryons de poulets (CEF pour Chicken Embryo Fibroblasts)
obtenus à partir d’élevages exempts d’organismes pathogènes spécifiques (EOPS) ou de canards (DEF
pour Duck Embryo Fibroblasts). Les CEF obtenus à partir d’élevages EOPS sont préférées aux DEF en
raison de la meilleure connaissance des pathogènes touchant ces cellules et des méthodes pour les
détecter.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
Les méthodes permettant de tester l’indemnité de maladie des élevages EOPS sont publiées (20, 30). Les
élevages de poulets EOPS doivent être indemnes des adénovirus aviaires, incluant le virus 76 (syndrome
de la chute de ponte), du virus de l’encéphalomyélite aviaire, du virus de la leucose aviaire (sous-groupes A,
B et J), du virus de la néphrite aviaire, des rétrovirus aviaires, des rotavirus aviaires, du virus de l’anémie du
poulet, du virus de la peste aviaire, du virus de la bronchite aviaire, du virus de la bursite infectieuse, du
virus de la laryngotrachéite infectieuse, des influenza virus de type A, du MDV, des Mycoplasma
Manuel terrestre de l’OIE 2008
623
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
gallisepticum et M. synoviae, du virus de la maladie de Newcastle, du virus de la réticuloendothéliose, de
Salmonella spp., et du virus de la trachéite du dindon.
Les élevages de canards EOPS doivent être indemnes des adénovirus aviaires, du réovirus aviaire, de
Chlamydia, du virus de l’entérite du canard, des virus des hépatites I et II du canard, des influenza virus de
type A, du virus de la maladie de Newcastle, de Pasteurella anatipestifer (maintenant Riemerella), du virus
de la réticuloendothéliose, et d’infections à Salmonella spp.
En cas d’émergence d’une nouvelle maladie, l’exigence d’indemnité envers cette nouvelle infection sera de
mise.
L’innocuité des souches de références vaccinales sera démontrée par l’inoculation de 10 fois la dose
recommandée à des poulets de 1 jour pour toute souche susceptible de causer la MD. Les poulets inoculés
seront autopsiés à l’âge de 120 jours pour s’assurer de l’absence de développement de lésions
macroscopiques et de lésions microscopiques étendues typiques de la MD. Il faut noter que certaines
souches du MDV et du HVT peuvent provoquer des lésions nerveuses mineures et transitoires.
L’absence de réversion vers la virulence sera démontrée par la réalisation de six passages successifs de la
souche vaccinale sur des poulets de 1 jour EOPS de la MD. La dose initiale administrée sera un inoculum
10 fois supérieur à celui utilisé en routine. Le passage est réalisé par transfert de sang infecté hépariné à
intervalle régulier de 5 à 7 jours. Les sangs transférés sont testés pour vérifier qu'ils contiennent du virus
e
infectieux. Les oiseaux qui se sont vus administrés le 5 passage sont maintenus jusqu’à 120 jours. Ils sont
examinés et autopsiés pour vérifier l’absence de lésions imputables au MDV. Cependant, certaines souches
comme Rispens peuvent provoquer le développement de lésions mineures. Il est capital de constater
qu’aucune modification de virulence n’a eu lieu pendant le passage du virus. Ce test est difficile à mettre en
œuvre parce que (1) la résistance génétique des poulets a une influence importante sur la virulence
apparente du virus, (2) le type d’inoculum influence également le résultat. Ces tests d’innocuité en
laboratoire seront complétés par des essais de terrain à grande échelle.
Les souches de référence doivent être indemnes des agents énoncés plus haut pour les élevages EOPS.
Par ailleurs, aucune trace de contaminants ou de réactifs de laboratoire ne doit être détectée. Toute souche
vaccinale obtenue à partir de dindes doit en plus être indemne du virus de la maladie lymphoproliférative et
du virus de l’entérite hémorragique.
Il faut déterminer l’efficacité à conférer une protection envers la MD de toute souche vaccinale, et de ses
passages successifs utilisés pour la production vaccinale (généralement cinq passages au maximum sont
autorisés). Les tests de protection normalisés ont été publiés. Ils comprennent la vaccination de poulets
EOPS d’un jour, sensibles à la MD et la réalisation d’épreuves virulentes au moyen de souches virulentes
de MD 8 jours plus tard. Les souches utilisées doivent produire la MD avec une incidence minimale de
70 % chez les poulets non vaccinés. Deux types de test sont décrits. Dans le premier, un indice de
protection est calculé suite à l’administration d’une dose unique de 1 000 unités formant plages (UFP) du
vaccin. Les incidences de MD faisant suite à l‘épreuve virulente sont calculées dans les groupe vacciné et
témoin. L’indice de protection doit être supérieur à 80 %. Cela signifie que les animaux vaccinés montrent
une réduction d’au moins 80 % d’incidence de MD macroscopique par rapport aux contrôles non vaccinés.
Un second test est décrit, il s’agit du test de la dose qui confère 50 % de protection (DP50). Ce test consiste
à inoculer une série de cinq dilutions de facteur 4 du virus vaccinal. Suite à l’épreuve virulente réalisée 8
jours après la vaccination, il faut repérer les deux dilutions qui confèrent d’une part plus et d’autre part moins
de 50 % de protection de la MD. Il est alors possible de calculer la valeur de la DP50. Ce test doit inclure une
souche vaccinale de référence à titre de comparaison. La DP50 peut avoir une valeur inférieure à 4 UFP. Il
est possible également d’obtenir des valeurs supérieures. Les facteurs qui affectent le résultat sont les
variables souche vaccinale, nature du virus vaccinal (associé au non aux cellules), présence ou absence
d’anticorps maternels chez les poulets soumis aux tests. Sur la base des tests de DP50, il est recommandé
de fournir une dose vaccinale de terrain qui dépasse de deux valeurs le résultat obtenu, soit 1 000 UFP ou
100 DP50.
Pour garantir l’efficacité et la persistance de l’immunité, des essais de terrain à grande échelle au moyen de
souches vaccinales nouvelles doivent être réalisés avec des souches de MD actuelles en réalisant les
essais sur différents élevages, en présence et en absence d’anticorps maternels. Des résultats
expérimentaux suggèrent que l’immunité vaccinale une fois acquise perdure tout au long de la vie.
2.
Méthode de fabrication
Les cultures de cellules sont réalisées dans des bouteilles à fond plat ou dans des flacons roulants en fonction du
type d’incubation, stationnaire ou rotatif. Les milieux les plus utilisés sont le milieu essentiel minimum d’Eagle
624
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
(MEM) ou le milieu 199. Ils sont tamponnés par du bicarbonate de sodium et additionné de 5 % de sérum de
veau. L’incubation est réalisée à 38-39 °C pendant 48 h.
Pour la fabrication des vaccins associés aux cellules, les cultures sont infectées avec une souche de MDV ou de
HTV produite en stock, sous la forme associée aux cellules, généralement passée 2 fois par rapport à la souche
de référence. Au terme d’une incubation de 48 h, les cellules sont récoltées par un traitement au moyen d’une
solution de trypsine/EDTA qui permet le détachement des cellules. Après une brève incubation à 38 °C, le
détachement cellulaire est complet. Les cellules récupérées sont centrifugées à faible vitesse et resuspendues
ensuite dans un milieu de congélation. Ce milieu est constitué du milieu de culture additionné de 7,5 à 15 % de
diméthylsulfoxyde (DMSO). Les cellules sont alors refroidies à 4 °C et conditionnées dans les fioles vaccinales,
généralement des ampoules en verre, scellées à la flamme et congelées dans l’azote liquide.
Pour les souches de HTV, des vaccins sont disponibles sous la forme de virions libres lyophilisés. Pour leur
fabrication, les cultures infectées par le HVT sont incubées pendant 72 h. Les cellules sont alors détachées
comme décrit plus haut. Les cellules récoltées sont suspendues dans un petit volume de milieu de culture,
centrifugée et resuspendues dans une solution tampon à 8 % de saccharose, mais dépourvue de protéine afin
d’éviter la formation de mousse. La suspension cellulaire est soumise aux ultra-sons pour libérer les virions.
Après avoir ôté les débris cellulaires, la solution virale est diluée dans un tampon adéquat (par ex. du SPGA). Les
fioles vaccinales sont remplies et le virus est lyophilisé.
La dilution finale pour la préparation des vaccins des deux types est réalisée sur la base de l’expérience acquise
lors des préparations précédentes. Il n’est pas possible de procéder au titrage d’une production avant son
conditionnement. Le titrage a posteriori est réalisé sur chaque lot. L’information peut être indiquée alors sur le lot.
3.
Contrôles en cours de fabrication
De manière à obtenir des résultats optimaux pour la préparation des vaccins associés aux cellules, il est essentiel
d’avoir une vitesse de congélation lente (1 à 5 °C par min) et au contraire une vitesse de décongélation rapide. Le
titre infectieux des cellules infectées ou des virions lyophilisés, par conséquent la dose virale par ampoule, est
déterminée après remplissage des fioles.
4.
Contrôles des lots
a)
Identité
Afin de vérifier que le produit conditionné présente une spécificité identique à la souche de référence
utilisée, des tests d’immunofluorescence indirecte (IFI) avec un sérum monospécifique doivent être réalisés.
Des anticorps monoclonaux sont le plus souvent utilisés.
b)
Innocuité et stérilité
Il est nécessaire de procéder à plusieurs tests qui démontrent la sécurité du vaccin et du produit fini. Les
cellules sur lesquelles sont produits les vaccins doivent provenir d’élevages EOPS, surtout indemnes
d’agents pathogènes transmis par voie verticale. Toutes les substances d’origine animale (sérum, trypsine,
et albumine sérique bovine) utilisées pendant le processus de fabrication doivent aussi être exemptes
d’agents infectieux.
Les lots de vaccins produits doivent être testés pour toute contamination par les levures, bactéries,
mycoplasmes et virus énoncés pour les élevages EOPS. La pureté du produit doit également être
démontrée. Les tests adéquats à chaque étapes du processus de fabrication doivent être réalisés tels que
recommandés par les organismes officiels (20, 22, 30) et dans le Chapitre 1.1.9., « Contrôle de la stérilité ou
de l’absence de contamination des matériels biologiques ».
Dix doses de vaccins ou une quantité équivalente de dilutions de deux doses vaccinales doivent être
inoculées à des groupes séparés de 10 poulets EOPS d’un jour. Aucun effet indésirable ne peut apparaître
dans les 21 jours qui suivent l’administration.
c)
Activité
La norme pour la dose de chaque type de vaccin est 1 000 UFP par poulet ou par œuf. Des titrages viraux
sont réalisés sur les lots de vaccins conditionnés afin de garantir la dose pour chaque oiseau vacciné.
d)
Durée de l’immunité
Les tests de durée d’immunité ne doivent être réalisés que sur les souches de référence. L’immunité
conférée par ce vaccin devrait perdurer à vie.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
625
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
e)
Stabilité
Des tests de stabilité sont réalisés sur six lots représentatifs de chaque vaccin pour démontrer le maintien
du titre infectieux dans les vaccins conditionnés. Les tests doivent être réalisés dans les conditions de
stockage habituelles du vaccin. Les produits lyophilisés doivent avoir une durée de conservation de 12 mois
s’ils sont conservés entre 2 et 8 °C. Le fabricant peut doubler le contenu viral du vaccin pour compenser les
pertes occasionnées par un stockage de longue durée. Un liquide de dilution est fourni par les fabricants
pour les deux formes vaccinales (liquide et lyophilisée). La stabilité du vaccin resuspendu doit avoir été
testée pendant une période de 2 h.
f)
Agents de conservation
Aucun agent de conservation n’est ajouté dans les vaccins ou les diluants.
g)
Précautions d'emploi et mise en garde
Des précautions particulières doivent être mises en œuvre pour la manipulation des vaccins associés aux
cellules lorsqu’ils sont retirés de l’azote liquide afin d’éviter toute blessure liée aux explosions fortuites qui se
produisent à la décongélation. Il est recommandé de porter des lunettes de protection. Les vaccins
reconstitués doivent être maintenus au froid pendant leur utilisation. Les formes associées aux cellules
doivent être agitées pour maintenir les suspensions cellulaires homogènes.
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Voir section C.4.b.
b)
Activité
Voir section C.4.c.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.
ABDUL-CAREEM M.F., HUNTER B.D., NAGY E., READ L.R., SANEI B., SPENCER J.L. & SHARIF S. (2006).
Development of a real-time PCR assay using SYBR Green chemistry for monitoring Marek's disease virus
genome load in feather tips. J. Virol. Methods, 133 (1), 34–40.
2.
AFONSO C.L., TUMLIN E.R., LU Z., ZSAK L., ROCK D.L. & KUTISH G.F. (2001). The genome of turkey herpesvirus.
J. Virol., 75, 971–978.
3.
BACON L.D., WITTER R.L. & SILVA R.F. (2001). Characterization and experimental reproduction of peripheral
neuropathy in white leghorn chickens. Avian Pathol., 30, 487–499.
4.
BAIGENT S.J. & DAVISON F. (2004). Marek’s disease virus: biology and life cycle. In: Marek’s disease: An
Evolving Problem, Davison F. & Nair V., eds. Elsevier Academic Press, London, UK, 62–77.
5.
BAIGENT S.J., PETHERBRIDGE L.J., HOWES K., SMITH L.P., CURRIE R.J.W. & NAIR V. (2005). Absolute
quantitation of Marek’s disease virus genome copy number in chicken feather and lymphocyte samples
using real-time PCR. J. Virol. Methods, 123, 53–64.
6.
BECKER Y., ASHER Y., TABOR E., DAVIDSON I., MALKINSON M. & WEISMAN Y. (1992). Polymerase chain reaction
for differentiation between pathogenic and non-pathogenic serotype 1 Marek’s disease virus (MDV) and
vaccine viruses of MDV-serotypes 2 and 3. J. Virol. Methods, 40, 307–322.
7.
BUMSTEAD N., SILLIBOURNE J., RENNIE M., ROSS N. & DAVISON F. (1997). Quantification of Marek’s disease
virus in chicken lymphocytes using the polymerase chain reaction with fluorescence detection. J Virol.
Methods, 65, 75–81.
8.
BURGESS S.C. & DAVISON T.F. (1999). A quantitative duplex PCR technique for measuring amounts of cellassociated Marek’s disease virus: differences in two populations of lymphoma cells. J. Virol. Methods, 82,
27–37.
9.
CALNEK B.W., HITCHNER S.B. & ADLDINGER H.K. (1970). Lyophilization of cell-free Marek’s disease
herpesvirus and a herpesvirus from turkeys. Appl. Microbiol., 20, 723–726.
10. CHENG Y.-Q., LEE L.F., SMITH E.J. & WITTER R.L. (1984). An enzyme-linked immunosorbent assay for the
detection of antibodies to Marek’s disease virus. Avian Dis., 28, 900–911.
626
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
11. COUNCIL OF EUROPE (1997). Marek’s Disease Vaccines (Live). In: European Pharmacopoeia, Third Edition.
Editions of the Council of Europe, Strasbourg, France, 1814–1818. ISBN 92-871-2990-8.
12. COUNCIL OF EUROPE (1997). Vaccines for Veterinary Use. Chapter 5.2.2. Chicken flocks free from specified
pathogens for the production and quality control of vaccines. In: European Pharmacopoeia, Third Edition.
Editions of the Council of Europe, Strasbourg, France, 301–304. ISBN 92-871-2990-8.
13. DAVIDSON I. & BORENSHTAIN R. (2002). The feather tips of commercial chickens are a favourable source of
DNA for the amplification of MDV and ALV-J. Avian Pathol., 31, 237–240.
14. DAVISON F. & NAIR V., EDS. (2004). Marek’s disease: An Evolving Problem. Elsevier Press, Amsterdam, the
Netherlands and Boston, USA.
15. HANDBERG K.J., NIELSON O.L. & JORGENSEN P.H. (2001). Use of serotype 1 & serotype 3 specific polymerase
chain reaction for the detection of Marek’s disease virus in chickens. Avian Pathol., 30, 243–249.
16. ISLAM A., HARRISON B., CHEETHAM B.F., MAHONY T.J., YOUNG P.L. & WALKDEN-BROWN S.W. (2004). Differential
amplification and quantitation of Marek’s disease viruses using real-time polymerase chain reaction. J. Virol.
Methods, 119 (2), 103–113.
17. LEE L.F., LIU X. & WITTER R.L. (1983). Monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of
Marek’s disease virus in chickens. J. Immunol., 130, 1003–1006.
18. LEE L.F., WU P., SUI D., REN D., KAMIL J., KUNG H.J. & WITTER R.L. (2000). The complete unique long
sequence and the overall genomic organization of the GA strain of Marek’s disease virus. Proceedings of
the National Academy of Sciences, USA, 97, 6091–6096.
19. MERIEUX C., HULSE E.C., GAUDRY D., ALLAN W.H., REGAMEY R.H., EDS (1974). International Symposium on
Requirements for Poultry Virus Vaccines. Proceedings of the 42nd Symposium, International Association of
Biological Standardization, Lyon, France, August 1973. Dev. Biol. Stand., 25, 423.
20. MINISTRY OF AGRICULTURE, FISHERIES AND FOOD (1990). Guidelines for the Production and Control of Avian
Virus Vaccine. MAL 74. HMSO, London, UK.
21. NAIR V. (2004). Successful control of Marek’s disease by vaccination. In: Control of Infectious Animal
Diseases by Vaccination, Schudel A. & Lombard M., eds. Dev. Biol. (Karger, Basel, Switzerland), 119, 147–
154.
22. OFFICE OF FEDERAL REGULATIONS (1989). Animals and Animal Products. Code of Federal Regulations, Vol. 9.
National Archives of the United States, USA.
23. REDDY S.K., SHARMA J.M., AHMAD J., REDDY D.N., MCMILLEN J.K., COOK S.M., WILD M.A. & SCHWARTZ R.D.
(1996). Protective efficacy of a recombinant herpesvirus of turkeys as an in ovo vaccine against Newcastle
and Marek’s diseases in specific-pathogen-free chickens. Vaccine, 14, 469–477.
24. REDDY S.M., WITTER R.L. & GIMENO I.M. (2000). Development of a quantitative-competitive polymerase chain
reaction assay for serotype 1 Marek’s disease virus. Avian Dis., 44, 770–775.
25. SHARMA J.M. (1998). Marek’s disease. In: A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian
Pathogens, 4th Edition. Swayne D.E. et al., eds. American Association of Avian Pathologists, 116–124.
26. SHARMA J.M. (1999). Introduction to poultry vaccines and immunity. Adv. Vet. Med., 41, 481–494.
27. SILVA R.F. (1992). Differentiation of pathogenic and non-pathogenic serotype 1 Marek’s disease viruses
(MDVs) by the polymerase chain reaction amplification of the tandem direct repeats within the MDV
genome. Avian Dis., 36, 521–528.
28. SILVA R.F., CALVERT J.G. & LEE L.F. (1997). A simple immunoperoxidase plaque assay to detect and
quantitate Marek’s disease virus plaques. Avian Dis., 41, 528–534.
29. SPENCER J.L. & CALNEK B.W. (1970). Marek’s disease: application of immunofluorescence for detection of
antigen and antibody. Am. J. Vet. Res., 31, 345–358.
30. THORNTON D.H. (1985). Quality control and standardisation of vaccines. In: Marek’s Disease, Payne L.N. ed.
Martinus Nijhoff, Boston, USA, 267–291.
31. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (USDA) (1995). Code Of Federal Regulations, Title 9, Parts 1–
199. US Government Printing Office, Washington D.C., USA.
32. WITTER R.L. (2001). Protective efficacy of Marek’s disease vaccines. In: Marek’s disease, Hirai K., ed.
Springer-Verlag, Berlin, Germany, 58–90.
Manuel terrestre de l’OIE 2008
627
Chapitre 2.3.13. — Maladie de Marek
33. WITTER R.L. & SCHAT K.A. (2003). Marek’s disease. In: Diseases of Poultry, Eleventh Edition, Saif Y.M. et al.,
eds. Iowa State University Press, Ames Iowa, USA, 407–465.
34. ZHU G.-S., OJIMA T., HIRONAKA T., IHARA T., MIZUKOSHI N., KATO A., UEDA S. & HIRAI K. (1992). Differentiation of
oncogenic and non-oncogenic strains of Marek’s disease virus type 1 by using polymerase chain reaction
DNA amplification. Avian Dis., 36, 637–645.
35. ZELNIK V., HARLIN O., FEHLER F., KASPERS B., GOEBEL T. W., NAIR V. & OSTERRIEDER N. (2004). an enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for detection of marek’s disease virus-specific antibodies and its
application in an experimental vaccine trial. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health, 51, 61–67.
*
* *
NB : Il existe plusieurs Laboratoires de référence de l’OIE pour la maladie de Marek (se reporter à la liste de la
partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int).
628
Manuel terrestre de l’OIE 2008