Histologie Générale, Techniques d`imagerie cellulaire

ASEP ¤ Prérentrée
2008-2009
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
Histologie Générale, Techniques d’imagerie
cellulaire
Par Célian BERTIN
A.
La cellule
Elle est l’unité fondamentale de la vie. C’est la plus petite quantité de matière vivante capable de subsister à l’état
autonome et de se reproduire.
La cellule associée à la matrice extracellulaire forme les tissus fondamentaux :
1. Les épithéliums de revêtement et glandulaires
2. Les tissus conjonctifs et squelettiques
3. Les cellules sanguines et les tissus hématopoïétiques (tissus responsables de la production des éléments
cellulaires du sang)
4. Le tissu musculaire
5. Le tissu nerveux
Les tissus forment des organes, appareils et systèmes :
1. Système circulatoire
2. Système immunitaire
3. Appareil respiratoire
4. Appareil digestif
5. Système endocrinien
6. Appareil urinaire
7. Appareil tégumentaire
8. Appareil de reproduction
9. Système nerveux
10. Les organes des sens
B.
-
La taille de la cellule
Taille des cellules (¢) = 5 à 20µm donc non visible à l’œil nu, d’où la nécessité du recours à
des techniques d’imagerie cellulaire :
Microscopie (observation)
Cytométrie (mesures)
C.
-
Pouvoir séparateur/Echelles biologiques
Pouvoir séparateur = distance la plus petite entre deux points vus séparément
Œil = 0,2mm
200µm > ¢ (la ¢ n’est donc pas visible à l’ œil nue)
Microscopie Optique (MO) =0,2µm
 Vision des cellules
Microscopie Electronique (ME) =0,2nm
 Vision des organites
200nm > organites
> molécule
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D.
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
Grandes étapes de l’imagerie cellulaire
1.
-
Microscopie optique (photonique) : source lumineuse = faisceau de photons
Microscopie électronique : source lumineuse = faisceau d’électrons
2.
-
Description morphologique des biostructures
Caractérisation et localisation des constituants biochimiques in situ
Histochimie
o Réaction chimique sur préparation histologique
Histoenzymologie
Réaction enzymatique sur préparation histologique, met en évidence une activité
enzymatique
3.
-
-
Immunohistologie
o Avec des anticorps pour reconnaître des protéines (qui se comportent alors comme des
antigènes)
Hybridation in situ
o Avec des sondes nucléiques pour explorer l’ADN et l’ARN
Autoradiographie
o Avec des précurseurs des macromolécules marquées avec des isotopes radioactifs
4.
-
Analyse moléculaire in situ
Approche quantitative
Techniques de cytométrie
o Réalisation de « mesures » à un échelon cellulaire
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I.
Histologie Générale ¤ Techniques d’imagerie cellulaire
Différentes types d’échantillon
A.
Cellules vivantes
2 possibilités : la cellule peut être en survie (ex vivo) / en culture (in vitro)
(NB : ex vivo il n’y a pas de multiplication cellulaire possible, de ce fait la préparation a une durée de vie limitée, tandis
qu’in vitro la durée est quasi illimitée, une multiplication se réalisant).
La réalisation de la préparation se fait entre lames et lamelles ou boîtes de Pétri ou flacons de culture. On ajoute un
milieu de culture (sérum physiologique pour le plus simple jusqu’à des milieux de synthèse très élaborés)
On peut placer les cultures longues dans une étuve à 37°C avec du CO2 (pour tamponner les produits du métabolisme
cellulaire) afin de se rapprocher des conditions de l’organisme. Une saturation en H2O est également possible pour que
la culture ne se dessèche pas.
Pour l’observation de cellules vivantes on utilise un microscope inversé à contraste de phases, ou un cytomètre.
L’adjonction de colorants vitaux (bleu trypan, sondes fluorescentes) peut aussi être réalisée pour mettre une
caractéristique cellulaire particulière en exergue.
B.
C.
-
D.
-
E.
-
Frottis/Etalement/Cytocentrifugation
Pour les liquides (biologiques, pathologiques, d’exploration)
Pour les produits de grattage ou de brassage
L’observation est réalisée sur lame
Empreintes/Appositions
Pour les échantillons solides (organes, tumeurs…)
o Tranche de section appuyée sur la lame, les cellules de la tranche restent donc fixées sur la lame.
Préparation à plat
Pour les organes très fins (après microdissection)
Sur lame (par exemple pour de la peau)
Coupes
Le plus fréquent car les organes sont trop épais pour observation directe au microscope. Cette technique
nécessite de réaliser des coupes fines (après fixation et inclusion)
Sur lame (MO) ou grille (ME)
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II.
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Descriptions morphologiques
A.
Microscopie optique
1.
Préparation standard des échantillons
= préparation d’un fragment d’organe pour examen au MO
Différentes étapes : (fixation, inclusion, coupe, coloration, montage)
a)
Fixation
-
Indispensable pour préserver les structures biologiques
A réaliser le plus rapidement possible après exérèse
De petits blocs d’organes sont immergés dans un grand volume de liquide fixateur
-
Fixateurs
o Acide acétique – méthanol
o Paraformaldéhyde
o Liquide de BOUIN (formol + acide picrique)
b)
-
Pour durcir le prélèvement afin d’en permettre la coupe
Après déshydratation, dans des bains d’alcool de degré de croissant puis de toluène (qui est le solvant de
la paraffine)
Dans la paraffine fondue (chauffage à 56°) qui se mélange au toluène et envahit tout l’échantillon (parfois
utilisation de résines plastiques ou congélation)
c)
-
Inclusion
Coupe
Coupes fines (2 à 10 µm)
Avec un microtome (à avance mécanique, couteau en acier)
Déposer et coller sur des lames de verre
(Coupes en congélation avec un cryostat, permettant la préservation des protéines et des lipides)
d)
-
Coloration
Pour augmenter les contrastes et faire apparaitre différents composants
Après déparaffinage (par la chaleur (56°C) et par des bains de toluène)
Et réhydratation (par bains d’alcool de degré décroissant puis eau distillée)
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-
Colorations les plus utilisées
o
o
o
o
Hématéine - Eosine (HE) :
 H= colore le noyau en violet
 E=cytoplasme en rose
HE – Safran (HES) :
 S=fibres de collagène en jaune
Trichrome de Masson : qui est l’association de :
 Hématoxyline  noyau en brun
 Fuschine acide  cytoplasme en rouge
 Vert lumière  collagène en vert
May Grunwald Giemsa (MGG) :

utilisé pour colorer les cellules sanguines
e)
-
Montage
Après coloration puis déshydratation (bains d’alcool de degré croissant puis de toluène)
Coupe montée entre lame et lamelle
Avec un milieu de montage (résine synthétique) dont l’indice de réfraction est voisin de celui du verre.
2.
Le MO
Etude et observation des préparations et production + traitement d’images
a)
-
-
Le microscope « standard »
Partie mécanique avec :
o La potence
o Le tube optique
o La platine
Source de lumière (photonique)
Partie optique avec :
Le condensateur (focalise le faisceau de photons sur
l’échantillon)
L’objectif (focalise sur l’oculaire)
L’oculaire (focalise sur la rétine)
b)
Capteur d’image (appareil photo/caméra digitale)
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c)
-
Le microscope à contraste de phase
met en évidence les différences d’indices de réfraction des coupes en révélant les différences de phase de
la lumière.
permet l’étude des cellules vivantes et préparations non colorées
d)
Le microscope à fluorescence
Fluorochromes : substances qui, lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde donnée ( )
(longueur d’onde d’excitation), émettent à une longueur d’onde supérieure ( d’émission).
-
B.
Source lumineuse avec sélection de la d’excitation
Filtre pour sélectionner les d’émission
Le Microscope Electronique
1.
Préparation des échantillons pour la ME à transmission (MET)
(Fixation, inclusion, coupe, coloration=contraste)
a)
-
Fixation : glutaraldéhyde dans du tampon de cacodylate ou de phosphate
Post-fixation à l’acide osmique= tétroxyde d’osmium = OsO4
b)
-
Inclusion
Après déshydratation par des bains d’alcool de degré croissant puis oxyde de propylène
Puis dans des résidus synthétiques (Epon ou Araldite)
c)
-
Fixation
Coupe
Coupe ultrafine (50 à 80nm)
Avec un ultra-microtome (avance thermique, couteau en verre ou en diamant)
Déposées sur des grilles de cuivre
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d)
-
Contraste
Acétate d’uranyle pour augmenter le contraste du noyau, nucléole et ribosome
Citrate de plomb pour toutes les membranes de la cellule
2.
Préparation des échantillons pour la ME à balayage (MEB)
(Fixation, déshydratation, métallisation)
a)
-
Fixation : glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate ou de phosphate
Pas de post-fixation
b)
-
Déshydratation
Par des bains d’alcools de degrés croissants puis de CO2 liquide
Et par passage au point critique du CO2 (c'est à dire où le CO2 passe directement de l’état liquide a
gazeux, pour une température de 32°C et à une pression de 73 atm). On parle alors de dessiccation par
lyophilisation.
c)
-
Fixation
Métallisation
De toutes les surfaces de l’échantillon par dépôt d’une fine couche (10 nm) d’or palladium afin de
réfléchir les électrons
NB : nouvelle génération de MEB à pression variable, donnant la possibilité de travailler sur ¢ ou
microorganismes non métallisés ou vivants en culture.
3.
Les ME
a)
-
Le MET
Source de rayonnement = filament qui génère des électrons
Lentilles = solénoïdes générant un champ électrique pour focaliser les électrons
Recueil des électrons traversant la préparation
Fonctionne sous vide pour éviter toute déviation des électrons
Résolution supérieure car la des électrons est inférieure à celle des photons
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b)
-
Film photo ou caméra digitale
c)
-
III.
La capture d’images
Le MEB
Cf. MET mais recueil des électrons des électrons réfléchis par la surface de l’échantillon.
Etudes in situ des constituants biochimiques
A.
Histochimie
= déceler et localiser à l’échelon cellulaire et tissulaire, sur des préparations histologiques les substances organiques
et minérales, en particulier les constituants biochimiques (lipides, glucides et protéines) à partir de réactions
chimiques mettant en évidence des fonctions ou des groupements
Exemples :
1) Glucide et réaction à l’acide périodique de Schiff (PAS)
1er tps : oxydation des groupements glycol par le PAS  formation d’aldéhydes
2ème tps : révélation des aldéhydes par le réactif de Schiff (fuschine basique acidifiée par HCl +
bisulfite de soude anhydre) donnant une coloration rouge pourpre
2) ADN et réaction de Feulgen et Rossenbeck (permet la localisation et la quantification d’ADN dans une
cellule)
1er tps : hydrolyse de l’ADN  mise en évidence de la fonction aldéhyde du désoxyribose
2ème tps : révélation des aldéhydes par le réactif de Schiff  rouge pourpre
B.
Histoenzymologie
= déceler et localiser des activités enzymatiques (et non les enzymes elles-mêmes) en mettant en évidence le produit
de leur action sur un substrat spécialement fourni, donc surtout appliqué a des cellules vivantes
1er tps : incubation en présence du substrat
2ème tps : révélation du produit de la réaction enzymatique sur le substrat
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Exemples :
1) Activité des estérases (étude de la variabilité cellulaire)
o la calcéine AM, substrat non fluorescent, traversant les membranes cellulaires
o dans le cytoplasme des cellules vivantes, elle est estérifiée en calcéine
o la calcéine est fluorescente et ne traverse pas les membranes cellulaires
o Si la cellule présente une fluorescence elle est donc vivante !
2) Activité des peroxydases (marquage des polynucléaires éosinophiles et détection d’anticorps)
o La peroxydase en présence d’H2O2 (eau oxygénée) oxyde le diaminobenzidine (DAB)
o Ceci génère un précipité brun noir
IV.
Analyse moléculaire in situ
(Pour l’étude des protéines et des acides nucléiques)
A. Immunohistologie
(Pour les protéines)
= utilisation d’un anticorps (Ac), (anticorps monoclonal (AcM) essentiellement), pour détecter et localiser très
spécifiquement une protéine, contre laquelle il est dirigé et qui se comporte alors comme un antigène (Ag)
Protéines détectées = protéines de structure, hormones, enzymes, neurotransmetteurs, récepteurs… (Toutes les
protéines sont étudiables dès lors qu’on lui fabrique un Ac)
(Pour la méthode d’obtention des AcM attendre d’avoir le cours)
Le complexe Ag-Ac est révélé par :
-
Soit un fluorochrome (technique d’immunofluorescence)
Soit une enzyme (technique immunoenzymatique)
Soit de l’or colloïdal pour la ME
Soit de façon directe
Soit de façon indirecte
Parfois après amplification
a)
Par un fluorochrome
Le fluorochrome est couplé directement ou indirectement à l’Ac.
Exemples de fluorochromes utilisés en immunofluorescence :
Fluorochromes
Fluorescéine (FITC)
Phycoérythrine
d’excitation
488nm
488nm
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d’émission
520nm
580nm
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b)
Par une enzyme
L’enzyme est couplé à l’Ac.
Exemples d’enzymes utilisées pour la révélation immunoenzymatiques :
-
Peroxydase révélée par le DAB
Phosphatase alcaline révélée par le nitrobleu de tétrazodium
c)
Par de l’or colloïdal
L’or colloïdal est couplé à l’Ac par l’intermédiaire d’une protéine A.
d)
De façon directe
e)
De façon indirecte
Marquage indirect avec :
-
Un 2ème Ac anti-1er Ac
De l’avidine qui se lie à de la biotine attachée au 1er Ac
Un 2ème Ac anti-digoxigénine qui se lie à la digoxigénine attaché au 1er Ac
Amplification, afin d’obtenir un signal de plus forte intensité (schémas)
B. Hybridation in situ
On utilise des sondes nucléiques « marquées » pour détecter et localiser dans les cellules et tissus une séquence
particulière d’ADN ou d’ARN qui est complémentaire de celle de la sonde. Cette technique permet l’étude des gènes
et de leur expression.
Elle se réalise en 3 temps :
1. Dénaturation de l’ADN et de la sonde
2. Hybridation
3. Lecture
Les marqueurs utilisés peuvent être :
-
Sondes : qui si elles incorporent des isotopes radioactifs sont appelées sondes « chaudes ». Dites
« froides » si non radioactives.
Sondes identiques à celles utilisées en immunohistologie : fluorochromes, biotine, digoxigénine,
enzymes
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C. Autoradiographie
Utilisation de précurseurs de macromolécules marquées avec des isotopes radioactifs afin de repérer les sites de
synthèse et étudier le cheminement de composés biologiques.
Se fait en 4 temps :
1.
2.
3.
4.
V.
Incorporation in vivo ou in vitro du précurseur
Confection des préparations
Autoradiographie (application d’une émulsion photosensible durant plusieurs semaines sur la préparation)
Développement et lecture du film au microscope
Approches quantitatives : les techniques de cytométrie
A.
Définitions
Les techniques de cytométrie permettent des analyses quantitatives à l’échelon cellulaire ou subcellulaire. Elles ont
3 dénominateurs communs :
-
Recours à la fluorescence
Les mesures sont réalisées par des capteurs qui sont des photomultiplicateurs
Les histogrammes et images sont reconstitués par ordinateur
Il y a différents niveaux d’investigation
B.
Cytométrie en flux : analyse quantitative et tri pour 103 cellules en suspensions
Cytométrie en image : analyse quantitative, tri et microchirurgie à l’échelon cellulaire, pour seulement
quelques dizaines de cellules par minutes, ces dernières devant être adhérentes a un support.
Microscopie confocale : analyse morphologique 3D pour 1 à 10 cellules par minutes
Nature des échantillons
En cytométrie en flux les cellules doivent être en suspension. On peut donc utiliser des liquides biologiques
(physiologiques, pathologiques, d’exploration) ou de tissus solides après dissociation à des fins de mono dispersion.
Pour la cytométrie en image et confocale les échantillons sont de même nature qu’en MO.
C.
-
Marquage
Fluorochromes : il en existe 2 types les marqueurs et les sondes
o Marqueur : simple indicateur de présence
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-
o Sondes : peuvent indiquer les propriétés de leur environnement
GFP : protéine fluorescente dont la séquence de codage est couplée par génie génétique au gène de la
protéine à étudier, ce qui lui fournira une queue fluorescente.
La contrainte principale est que la λ d’excitation soit compatible avec la source lumineuse et la λ d’émission
compatible avec le banc optique du cytomètre.
(Il vous sera fourni en cours un tableau de 4 groupes de fluorochromes qui, l’an dernier, n’était pas à apprendre, je
ne vous le fourni donc pas, à vous de voir ce qui sera dit en cours.)
D.
Cytométrie en flux
Méthode de cytologie analytique et préparative, rapide car traite 10 3¢/s et précise. Permet donc l’analyse
individuelle d’un grand nombre de cellules.
L’analyse est fondée sur des principes : fluidique, optique, électrique, et informatique.
Elle permet des analyses qualitatives mais surtout quantitatives, ainsi qu’un tric cellulaire par séparation physique à
partir des propriétés biologiques de la cellule (taille, morphologie, récepteurs, ADN,…)
Impératifs : les cellules doivent être en suspension mono dispersées et marquées avec des fluorochromes
Application : immunophénotypage (plus de détails dans le cours), analyse du contenu en ADN, prolifération cellulaire
(L’explication (laborieuse) de la méthode de tri cellulaire vous sera (peut-être) donnée en cours, je ne m’avance pas
à vous la fournir n’étant pas certain de son utilitée, vous avez déjà de quoi vous occuper avec la partie
« intéressante » du cours)
E.
Cytométrie en image
Méthode de cytologie analytique et préparative pour quelques dizaines de cellules, mêmes vivantes en culture.
Fondée sur des principes : optique, mécanique, électrique, informatique
Elle permet des analyses quantitatives e fluorescence, une quantification itérative de fluorescence, et utilise le laser
comme outil
Impératifs : ¢ adhérentes au support, et marquées avec des fluorochromes
Application : par exemple sur des cellules vivantes on peut-mettre en évidence des communications intercellulaires,
et par exemple l’effet de médicaments sur celles-ci.
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F.
Microscopies confocale
Méthode de cytologie et d’histologies analytique 3D à l’échelon tissulaire cellulaire ou subcellulaire
Fondée sur des principes : optique, mécanique, électrique, informatique
Permet : coupes optiques, reconstructions 3D
Impératifs : marquer les cellules avec des fluorochromes
Application : localisation et collocalisation tissulaire ou cellulaire
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