Dynamique d`évolution du promoteur des cassettes des intégrons

 Sujet de thèse : Dynamique d’évolution du promoteur des cassettes des intégrons de multirésistance. Equipe : UMR Inserm 1092, Anti-­‐infectieux : Supports moléculaires des résistances et innovations thérapeutiques Co-­‐Directeurs de thèse : Sophie RAHERISON; [email protected]; 05 55 43 59 74 Marie-­‐Cécile PLOY; marie-­‐[email protected]; 05 55 05 67 27/ 05 55 43 59 74 Introduction Ce sujet de thèse s’inscrit dans l’un des axes de recherche de l’UMR S-­‐1092 Inserm qui vise à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu par les bactéries pour acquérir des gènes de résistance aux antibiotiques, en utilisant le modèle des intégrons. Les intégrons de résistance sont des plateformes génétiques capables d'acquérir, d’échanger et d’exprimer des cassettes de gènes codant principalement pour des résistances aux antibiotiques. La plateforme intégron est constituée de 3 éléments: (i) un gène int1 transcrit à partir de son promoteur Pint et codant l’intégrase IntI1, une recombinase spécifique de site, (ii) un site de recombinaison attI1 et (iii) un promoteur commun (Pc) localisé dans le gène int1 et permettant l’expression des cassettes comme un opéron, les cassettes les plus proches de Pc étant les plus exprimées. 13 variants de Pc ont été décrits à ce jour. Les gènes de résistance sont donc exprimés par le promoteur Pc et mobilisés grâce à une intégrase assurant leur rapprochement du Pc afin d’être mieux exprimées. Ces 2 fonctions dépendent l’une de l’autre car le polymorphisme du promoteur Pc influe directement sur l’efficacité de l’intégrase. Les études épidémiologiques montrent que les variants de Pc les plus fréquents associent une faible expression des gènes de résistance à une intégrase très efficace favorisant ainsi le réarrangement des cassettes. Les variants forts de Pc sont moins fréquents et sont associés à une intégrase de faible efficacité. L’expression de l’intégrase est régulée par la protéine LexA du système SOS qui est un répresseur transcriptionnel du promoteur Pint à l’état basal. Les antibiotiques causant des dommages à l’ADN, en induisant l’autoprotéolyse de LexA, aboutissent à l’augmentation de l’expression de l’intégrase. De nombreux antibiotiques sont capables d’induire la réponse SOS et d’induire ainsi l’expression de l’intégrase. Par ailleurs, le système SOS induit aussi le fonctionnement d’ADN polymérases ayant un taux élevé d’erreurs, favorisant ainsi l’adaptation mutationnelle. Ce sujet vise à étudier la dynamique d’évolution génomique concernant les 2 fonctions essentielles, intégration et expression des gènes de résistance, et à évaluer l’influence du stress antibiotique sur cette évolution. 1 Matériel et méthodes •
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Le projet consiste à suivre l’évolution d’un intégron synthétique en culture continue par une approche chémostat permettant une croissance bactérienne continue et contrôlée. La mise au point du système chémostat sera réalisée au préalable par un stagiaire en Master 2 (2012-­‐2013) en déterminant les paramètres de croissance des souches dans les différents environnements avec et sans pression antibiotique et les conditions de stabilité de croissance dans le système. L’intégron synthétique a déjà été construit au laboratoire et utilisé au cours de précédents travaux. Il est constitué d’un réseau de cassettes codant des résistances à 4 familles antibiotiques. Cet intégron synthétique existe en différentes versions avec les 4 principaux variants de Pc de force différente. Les expériences d’évolution seront ensuite menées sur des réplicats, pour des variants forts et des variants faibles de Pc et sur un nombre n de génération. L’évolution du variant initial de Pc vers une (des) autre (s) forme (s) de variant sera suivie par le séquençage du Pc de clones bactériens isolés à partir de prélèvements au cours du temps et à partir de la suspension bactérienne finale et avec ou sans pression antibiotique. L’analyse par séquençage haut débit sera aussi envisagée car il permettra d’obtenir rapidement des résultats qualitatif et quantitatif. L’étude phénotypique des variants sera effectuée. D’une part, le fitness des variants sera étudié au cours d’expériences de compétition, le fitness des variants « évolués » sera comparé à celui du variant initial afin de déterminer les variants ayant un avantage phénotypique. La résistance aux antibiotiques sera également corrélée aux différentes formes de Pc. En parallèle, la dynamique d’évolution du Pc sera comparée à la dynamique générale du taux de mutation. Celle-­‐ci sera évaluée par le suivi d’apparition de mutations dans les gènes codant les régulateurs globaux et aboutissant à des génotypes hypermutateurs connus. Résultats attendus •
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Les données expérimentales seront confrontées à l’hypothèse du modèle de co-­‐évolution des variants de Pc et de l’intégrase IntI1. Le polymorphisme des variants de Pc, la présence de nouveaux variants, transitoires ou non décrits, l’émergence de génotypes hypermutateurs permettraient de mieux comprendre l’évolution génétique du Pc. En parallèle les expériences de compétitions entre variants permettront d’identifier les variants ayant un avantage phénotypique. Enfin ce projet permettra d’évaluer la (les) dynamique (s) mutationnelle (s) du Pc au cours du temps, in vitro sans pression de sélection et sous l’influence de différentes pressions de sélection antibiotique et donc de mieux comprendre les mécanismes d’acquisition de résistance par les intégrons. Ce projet permettra de définir si certaines pressions de sélection antibiotiques sont associées vers l’évolution d’un promoteur fort, ce qui aura des implications en termes de santé publique. En effet, pourront être envisagées des recommandations concernant l’utilisation ou pas de certains antibiotiques. 2