CCP-Ab ELISA - IBL international

Fiche technique
CCP-Ab ELISA
Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif des anticorps IgG
contre peptide citrulliné cyclique (CCP) dans le serum et plasma humains.
.
RE75791
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
[email protected]
www.IBL-International.com
CCP-Ab ELISA (RE75791)
1.
FRANÇAIS
BUT DU TEST
Le test immuno-enzymatique est pour le dosage quantitatif des anticorps IgG contre peptide citrulliné
cyclique (CCP) dans le serum et plasma humains.
2.
SOMMAIRE ET INTRODUCTION
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le plus souvent diagnostiquée par la mesure de facteurs rhumatoïdes
(FR). Le facteur rhumatoïde est un anticorps anti-IgG dirigé contre le fragment Fc. Il apparaît
principalement comme anticorps IgM, mais également comme IgA ou IgG.
Les facteurs rhumatoïdes sont présents dans les sérums de 80 % des patients souffrant de polyarthrite
rhumatoïde. Leur présence n'est cependant pas spécifique à la PR, puisqu'ils se retrouvent également
chez des personnes en bonne santé. L'incidence de cette maladie est fonction de l'âge : chez les
personnes jeunes, elle se situe entre 1 et 4 %, tandis que chez les personnes plus âgées elle peut
atteindre 25 %.
Comparés aux facteurs rhumatoïdes seuls, les anticorps anti-CCP présentent l'avantage d'une sensibilité et
d'une spécificité supérieures dans le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde. Les anti-CCP sont souvent
présents à des stades très précoces de la maladie. Cette présence a par ailleurs une haute valeur
prédictive pour le développement de celle-ci.
3.
PRINCIPE DU TEST
Dans une première étape, les CCP AAb provenant de l'échantillon dilué (ainsi que des calibrateurs et du
contrôle) se lient aux peptides cycliques citrullinés dont la plaque de microtitrage est revêtue. Après une
incubation de 60 minutes à température ambiante, les composants non liés sont éliminés par lavage.
À l'étape suivante, les anticorps liés réagissent avec le complexe anti-IgG humain peroxydase de raifort
(HRP) ajouté. L'excès de conjugué est éliminé après 30 minutes à température ambiante par un second
lavage.
Le complexe HRP transforme le substrat TMB incolore ajouté en un produit bleu. La réaction enzymatique
est arrêtée par l'ajout d'une solution acide après 15 minutes à température ambiante. La couleur vire du
bleu au jaune. L'absorbance du produit obtenu est mesurée à 450/620 nm dans les 30 minutes. La DO
obtenue est directement proportionnelle à la quantité d'anticorps liés.
4.
PRECAUTIONS D’EMPLOI
1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l’usage professionnel.
2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version
valide de la fiche technique incluse dans le kit. S’assurer que tout a été bien compris.
3. Dans le cas de dommages importants de l’emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur
sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N’utilisez pas les composants
abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte.
4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas
utiliser de réactifs périmés.
5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de
laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire.
6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le
MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce
produit sont disponibles sur le site Internet IBL ou sur demande particulière à IBL.
7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord
avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque.
8. Eviter tout contact avec la solution d’arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées.
9. Tous les réactifs doivent être conservés à 2-8°C dans leur emballage d’origine jusqu’à leur utilisation
10. Quelques réactifs contiennent de l’azide de sodium (NaN3) comme conservateur. En cas de contact
cutané ou avec les yeux, rincer immédiatement avec de l’eau. NaN3 peut réagir avec le plomb et le
cuivre pour former des azides métalliques explosifs. Pour l’élimination des réactifs, rincer avec une
grande quantité d’eau pour éviter la formation de ces azides.
11. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs
à HIV I/II, HbsAg et HCV. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants
et utilisés en tant que tel.
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5.
STOCKAGE ET STABILITE
Avant de sortir la microplaque de son emballage scellé, laissez-la arriver à la température ambiante
pendant au moins 30 minutes. Les puits non utilisés doivent être conservés au froid et protégés contre
l'humidité dans leur emballage d'origine. Soigneusement refermée, elle peut être utilisée pendant
8 semaines.
Après son ouverture, la solution anti-IgG humain - HRP reste stable jusqu'à 8 semaines à une température
de 2-8 °C. Évitez d'exposer la solution de substrat à la lumière. La date de péremption de chaque
composant figure sur son étiquette respective ; celle de la trousse complète se trouve sur l'étiquette de la
boîte. Après réception, tous les composants de la trousse CCP-Ab ELISA doivent être conservés à une
température de 2-8 °C, de préférence dans la boîte d'origine.
6.
COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS
Sérum, Plasma
Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l’intégrité chimique
d’un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu’à son analyse. Ne pas utiliser d’échantillons fortement
hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d’apparence turbide doivent être centrifugés avant
analyse pour éliminer toute particule gênante.
Conservation:
2-8 °C
-20 °C (aliquots) À conserver à l’abri de la chaleur ou de la lumière directe.
Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés.
Stabilité:
< 3 jours
> 3 jours
7.
MATERIEL FOURNI
Les réactifs fournis dans ce kit suffisent pour 96 dosages. Ceci correspond à l’analyse en double de
42 échantillons inconnus, des étalons et sérums de contrôle.
Quantité
Symbole
1 x 12 x 8
MTP
1 x 15 mL
ENZCONJ
5 x 1 mL
CAL
1 x 1 mL
CONTROL+
1 x 1 mL
CONTROL-
1 x 100 mL
SAMPLEDIL
1 x 100 mL
WASHBUF CONC
1 x 15 mL
TMB SUBS
1 x 15 mL
TMB STOP
Composant
Microplaque
Barrettes sécables. Coatée avec de la peptides synthétiques avec résidus
citrullinés.
Conjugué Enzymatique Prêt à l’emploi
Contient: IgG anti humain (mouton) Complexe anti-IgG humain (mouton)
peroxydase de raifort (HRP).
Etalon 1-5 Prêt à l’emploi
Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le
certificat CQ.
Contrôle Positif
Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le
certificat CQ.
Contrôle Négatif
Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes des flacons ou sur le
certificat CQ.
Diluant pour Echantillons
Prêt à l'emploi.
Tampon de Lavage, Concentré (10x)
Suffisamment pour 1000 mL.
Solution Substrat TMB
Prêt à l’emploi. Contient: 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine.
Solution d’Arrêt TMB
Prêt à l’emploi, incolore. 0.25 M H2SO4.
Le kit CCP-Ab ELISA est artificiellement calibré, pour cette raison les concentrations des anticorps antiCCP sont exprimées en U/mL. Ces unités corrèlent avec un facteur constant de 1:12 avec le standard de
référence WHO W1066 pour l’arthrite rhumatoïde.
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MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI
Pipettes précision 5 - 1000 µL
Multi-channel pipette avec jetable pipette tips
Bouteille pour lavage système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque
Lecteur de microplaque capable de lire l’absorbance à 450 nm et 620 ou 690 nm
Cylindres gradués
Eau bidistillée ou désionisée
Papier absorbant ou serviette
Tubes (2 mL) pour la dilution des échantillons
Feuille
9.
NOTES POUR LA PROCEDURE
1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les
résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d’incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N’utiliser que des pipettes et appareils
calibrés.
2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S’assurer que
les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les
réactifs et échantillons à température ambiante (18-25°C) et mélanger doucement en tournant chaque
flacon de réactif liquide et d’échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse.
3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette
en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours
refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs.
4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d’éventuelles erreurs de
pipetage.
5. Le temps d’incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et
aux mêmes intervalles. Il est recommandé d’utiliser une micropipette à 8-canaux pour pipeter les
solutions dans tous les puits.
6. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés donneront des résultats erronés. Il est
recommandé d’utiliser une pipette à multicanaux ou un système de lavage automatique. Ne pas laisser
sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage et l’aspiration.
Rincer et remplir les réactifs avec soin. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient bien égouttés
du tampon de lavage, et que les puits ne contiennent aucun résidu.
7. L’humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n’ait atteint la
température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet
refermé avec le dessiccateur.
10.
PREPARATIONS PREALABLES AU TEST
10.1. Préparation de Composants lyophilisés ou concentrées
Diluer / dissoudre
Composant
Diluant Relation
50 mL
WASHBUF CONC
avec
450 mL
Eau
bidist.
1+ 9
Remarques
Rechauffer à
37°C pour
dissoudre les
cristaux.
Stockage
2-8 °C
Stabilité
jusqu'à
30 jours
Laisser le coffret revenir à température ambiante (18-25°C). Bien homogénéiser les échantillons les
échantillons sériques en les agitant doucement Dilution des Echantillons.
10.2. Dilution des Echantillons
Echantillon
Sérum ou
plasma
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À être dilué
En général
avec
Relation
Remarques
SAMPLEDIL
1+100
Par ex. 5 µL échantillon + 500 µL SAMPLEDIL
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FRANÇAIS
PROCEDURE DU TEST
Pipeter 100 µL de chaque Etalon, Contrôle et échantillon dilué dans les puits respectifs de la
microplaque.
Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 60 min à TA (18-25 °C).
Egoutter l’excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. Laver la plaque
3 x avec 300 µL de Tampon de Lavage dilué et laisser agir pour 5 secondes.
Pipeter 100 µL de Conjugué Enzymatique dans chaque puits.
Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 30 min à TA (18-25 °C).
Egoutter l’excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. Laver la plaque
3 x avec 300 µL de Tampon de Lavage dilué et laisser agir pour 5 secondes.
Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l’ajout des solutions substrat et d’arrêt. Pipeter
ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d’air.
Pipeter 100 µL de Solution Substrat TMB dans chaque puits.
Incuber 15 min à TA (18-25 °C) dans le noir.
Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µL de Solution d’Arrêt TMB dans chaque puits. Agiter la
plaque rapidement.
Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm entre 620 ou 690 nm dans les 30 min
suivant l’ajout de la Solution d’Arrêt.
12.
CONTROLE QUALITE
13.
CALCUL DES RESULTATS
Les résultats du test ne sont valides que si l’essai a été réalisé en suivant les instructions. De plus,
l’utilisateur doit strictement suivre les règles de bonne pratique de laboratoire (GLP, Good Laboratory
Practice) ou autres lois/standards applicables. Tous les contrôles du kit doivent être trouvés dans les
gammes acceptables indiquées dans les étiquettes. Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non
valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle
supplémentaire.
En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des
réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d’incubation et méthodes de
lavage.
Evaluation quantitatif
La courbe standard est établie en marquant les valeurs de DO moyennes des calibrateurs 1 - 5 sur l'axe des
ordonnées, y, et leurs concentrations CCP-Ab respectives sur l'axe des abscisses, x (échelle logarithmique).
Les concentrations CCP-Ab des contrôles et des échantillons dilués inconnus sont lues directement en
U/mL à partir des valeurs DO450 mesurées.
Il n'est plus nécessaire de corriger la dilution.
CCP-Ab ELISA peut également être utilisé dans le cadre d'analyses assistées par ordinateur, avec un
logiciel capable d'ajuster la fonction de lissage spline. Nous conseillons de procéder à un ajustement à 4
paramètres.
3,000
Courbe Etalon Typique
2,500
U/mL
1
20
40
400
2000
103
2,000
450/620 nm OD
(Exemple. Ne pas utiliser pour vos calculs!)
Etalon
DO (a)
DO (b) DO (moyenne)
1
0.037
0.043
0.040
2
0.304
0.285
0.295
3
0.514
0.551
0.533
4
1.771
1.589
1.680
5
2.631
2.284
2.458
Patient
1.024
1.019
1.022
1,500
1,000
0,500
Echantillon 1
0,000
1
10
100
1000
10000
U/ml
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Les échantillons montrant une DO supérieure au standard 5 doivent être davantage dilués avec du diluant
pour échantillon. La concentration en anticorps anti-CCP doit être multipliée avec le facteur de dilution.
14.
INTERPRETATION DES RESULTATS
CCP-Ab ELISA
Gamme
Interprétation
< 30 U/mL
négatif
≥ 30 U/mL
positif
Les résultats ne peuvent pas être l’unique raison de
conséquences thérapeutiques. Ils doivent être corrélés à
d’autres observations cliniques et tests diagnostics.
Il est recommandé que chaque laboratoire établisse ses propres gammes de valeurs de référence
normales et pathologiques pour les taux d'anticorps anti-CCP des sérums, en suivant la procédure
habituelle pour d'autres paramètres de diagnostic. Pour cette raison, les valeurs de référence ci-dessus ne
sont données qu'à titre indicatif.
15.
LIMITES DE LA PROCEDURE
Le test CCP-Ab ELISA devrait être négatif dans le cas de personnes en bonne santé. Toutefois, les autoanticorps CCP peuvent également être présents chez des personnes apparemment en bonne santé.
16.
PERFORMANCE
Linéarité
Sur la base de la nature hétérogène de la population d'auto-anticorps et au vu de la spécificité et de
l'affinité qui caractérisent les auto-anticorps dans leur reconnaissance des épitopes, les valeurs théoriques
attendues par dilution avec du sérum humain ne contenant pas d'anti-CCP correspondent le plus souvent
aux concentrations mesurées.
Spécificité et sensibilité
Les résultats disponibles font apparaître une sensibilité clinique de 79 % à une spécificité de 97 % pour le
diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde.
Limites de détection
La sensibilité analytique (limite inférieure de détection, 0 + 3 DS) a été établie à 1,2 U/mL.
La sensibilité fonctionnelle a été mesurée au niveau de 20 % du CV inter-analyses à env. 2 U/mL.
Intra- et inter-essai variation
Intra-Essai
Inter-Essai
Concentration
moyenne
CV (%)
(U/mL)
Echantillons no.
Concentration
moyenne
(U/mL)
CV (%)
Echantillons no.
1
29
7
6
2.5
8
2
39
3
7
91
6
3
147
7
8
209
8
4
572
5
9
1140
11
5
870
6
10
1737
9
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FRANÇAIS
ESSAI SCHEMA
Avant de commencer le test, ramener tous les composants requis à température ambiante (18 25°C). Bien homogénéiser les réactifs en les agitant doucement. Diluer tous les échantillons 1+100 (v+v)
avec du diluant pour échantillons.
Etape
Activité
Matériel
1
Pipeter
Echantillons
2
Incuber
Plaque
3
18.
Contrôle
Patient échantillons
dilués 1, 2 etc.
100 µL
100 µL
100 µL
1 heure à AT (18-25 °C)
Aspirer ou décanter
egoutter prudent sur du papier absorbant
Pipeter
Tampon de
Lavage
4
Pipeter
Conjugué
Enzymatique
5
Incuber
Plaque
6
CAL
3 x 300 µL
5 seconds
chaque
3 x 300 µL
5 seconds
chaque
3 x 300 µL
5 seconds
chaque
100 µL
100 µL
100 µL
30 min à TA (18-25 °C)
Aspirer ou décanter
egoutter prudent sur du papier absorbant
Pipeter
Tampon de
Lavage
7
Pipeter
Substrat
8
Incuber
Plaque
9
Pipeter et agiter
Solution d’Arrêt
10
Mesurer DO
3 x 300 µL
5 seconds
chaque
3 x 300 µL
5 seconds
chaque
3 x 300 µL
5 seconds
chaque
100 µL
100 µL
100 µL
15 min à TA (18-25 °C) dans le noir
100 µL
100 µL
100 µL
à 450 nm entre 620 nm (ou 690 nm) dans les 30 min
LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT
1. Zendman A. J. W. et al. Use and significance of anti-CCP autoantibodies in rheumatoid arthritis. Rheumatology
2006;45:20–25 (2005)
2. Smith JB et al. Rheumatoid arthritis - a molecular understanding. Ann Intern Med 136: 908-922 (2002).
3. Schellekens GA et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic
citrullinated peptide. Arthritis Rheum 43: 155-163 (2000).
4. Schellekens GA et al. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by
rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 101: 273-281 (1998).
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany
IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
Tel.:
E-MAIL:
WEB:
+ 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11
[email protected]
http://www.IBL-International.com
+1 (416) 645 -1703 Fax: -1704
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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20