Etude de la staphylococcie en élevage de lapins : persistance

Etude de la staphylococcie en élevage de lapins : persistance clinique au
sein de l’élevage et génotypage des souches isolées
B. LE NORMAND1, U. LIPINSKA2, C. WILDEMAUWE3,
P. FRANÇOIS4,F. AGNOLETTI5, J. LE GUENNEC6
1
2
SCP Fouqué-Gounot-Le Normand-Le Page, Saint Brice en Coglès, 35460, France
Université de Gand, Faculté de Médecine Vétérinaire, Département de pathologie, bactériologie et maladies
aviaires, Gand, Belgique
3
Institut Pasteur, Bruxelles, Belgique
4
Laboratoire de Recherche Génomique, Service des Maladies Infectieuses, Université de Genève, Suisse
5
Institut Zoo-Prophylactique Expérimental de Vénétie, Trévise, Italie
6
Laboratoire LABOFARM, Loudéac, 22600 France
Résumé. 23 souches de Staphylococcus aureus ont été classées suivant leur persistance clinique dans des
élevages pourtant correctement traités. La caractérisation de ces souches a été réalisée par typage agr, profil
MLVA, contenu en toxines et typage phagiques. La bactériologie sur foetus et lapereaux nouveau-nés a révélé
une infection très précoce. Toutes ces données doivent permettre d’améliorer les procédures dans les élevages
contaminés par Staphylococcus aureus.
Abctract. Staphylococcosis in rabbit farms : clinical persistence and characterization of isolates by
genotyping. 23 rabbit Staphylococcus aureus isolates were classified according to their clinical persistence in
the farms despite treatments. Characterization of these strains was carried out by agr typing, MLVA profiling,
toxin-content and phage typing methods. Bacteriology on fetuses and newborn rabbits showed very early
infection. All these data should allow to adopt adapted procedures on S. aureus contaminated farms.
Introduction
La staphylococcie est une maladie majeure dans les
élevages de lapins contaminés car les formes cliniques
sont récurrentes malgré les traitements instaurés et la
staphylococcie y est économiquement lourde. A côté
d’un simple portage détecté par prélèvement cutané
(Hermans et al., 2000), la maladie peut prendre des
formes cliniques variées : abcès sous-cutanés,
mammites, arthrites, péritonites, pyomètres, dermites.
Le pouvoir pathogène des souches de Staphylococcus
aureus peut être abordé selon 2 protocoles analytiques
différents : soit l’étude longue et onéreuse par
manipulations géniques (Que et al., 2001), soit l’étude
des facteurs de virulence dont les conclusions
définitives sont plus difficiles à établir (Ryding et al.,
1997, Switalski et al., 1993, Thomas et al., 1999). Les
aspects cliniques rétrospectifs étant primordiaux pour
déterminer la pathogénicité de la souche en cause,
nous avons procédé à l’analyse plus approfondie des
souches de Staphylococcus aureus d’élevages connus
afin d’améliorer la connaissance de cette maladie.
1. Matériel et méthodes
1.1. Souches bactériennes
23 souches de Staphylococcus aureus (tableau 1) ont
été isolées en élevages de lapins en 2006 et 2007 et
choisies pour leur diversité géographique, leur
diversité d’organes d’isolement et les âges des
animaux ciblés. Nous avons classé les souches de
Staphylococcus aureus sur une base de persistance
clinique : les élevages dans lesquels la staphylococcie
est définie comme priorité sanitaire sur un intervalle
d’au moins 2 ans sont considérés comme contaminés
par une souche de forte pathogénicité.
Tableau 1. Répartition des souches de S. aureus
Numéro
Animal
MLVA
Sa2
lapine
Sa3
lapine
Sa4
lapereau 50 j
Sa5
lapine
Sa6
lapine
Sa7
lapine
Sa8
lapine
Sa9
lapine
Sa10
lapine
Sa11
lapine FR
Sa12
lapine
Sa13
lapine
Sa14
lapine
Sa15
lapereau
Sa16
lapine
Sa17
lapine
Sa18
lapine
Sa19
lapereau 12 j
Sa20
lapine
Sa21
lapine
Sa23
lapereau 25 j
Sa24
lapereau
Sa25
lapine
Localisation
foie
poumons
abcès
abcès mm
poumons
poumons
utérus
utérus
utérus
poumons
utérus
abcès mm
foie
péritoine
poumons
utérus
abcès mm
abcès SC
utérus
utérus
abcès SC
articulation
utérus
Persistance
clinique
oui
non
oui
oui
oui
oui
non
oui
oui
oui
non
non
non
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
2 souches de Staphylococcus xylosus (Sa 1 et Sa 22) ont été
associées lors du génotypage MLVA.
1.2. Analyses effectuées
Les toxines d’importance en médecine humaine ont
été recherchées sur toutes les souches : PVL (Panton
13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans, France
Valentine Leucocidine), TSST (Toxic Shock
Syndrome Toxin), exfoliatines.
Le locus agr (accessory gene regulatory) est impliqué
dans le contrôle de la virulence. Le typage agr
distingue 4 groupes alléliques ; il a été réalisé sur les
23 souches.
Le génotypage par MLVA (Multiple Loci VNTR
Analysis ou Analyse de loci VNTR, VNTR =
Variable Number of Tandem Repeats ou Répétition
en tandem polymorphe) permet de décrire pour les
souches de Staphylococcus aureus un pattern de
facteurs potentiellement
impliqués dans la
pathogénicité, principalement les adhésines. Cette
technique analytique de génotypage donne des
résultats cohérents avec les techniques de référence
(PFGE, MLST et typage spa), tout en étant moins
coûteuse et avec une valeur épidémiologique forte :
les patterns sont conservés entre souches apparentées
(François et al., 2005, , Schouls et al., 2009). La
technique permet donc de déterminer si les souches
sont clonales ou si elles sont génétiquement éloignées.
Les typages agr et MLVA ont été effectuées par P.
François, Laboratoire de Recherche Génomique,
Genève, Suisse. Des souches de référence humaines
communautaires (USA 300) ou hospitalières (USA
700) sont introduites pour comparaison.
Les protéines MSCRAMMs (Microbial Surface
Components
Recognizing
Adhesive
Matrix
Molecules) sont impliquées dans l’adhérence et
l’attachement cellulaire de Staphylococcus aureus.
Les analyses ont été réalisées à l’Institut ZooProphylactique de Vénétie, Trévise, Italie et au
Laboratoire de Recherche Génomique de Genève,
Suisse. Une analyse PCR de détection des gènes bbp,
cna, clfA, clfB, ebpS, eno, bap, icaA, icaD codant pour
les facteurs de virulence a été réalisée sur 7
souches (Tristan et al., Vasudevan et al., 2003).
L’analyse ciblant les gènes FnbA, FnbB a concerné
toutes les souches.
Afin de classer les souches LV (Low Virulence), HV
(High Virulence) ou HV AT (High Virulence
ATypical), une analyse PCR multiplexe ciblant les
gènes bbp, selm et flank a été réalisée sur 22 souches à
l’Université de Gand, Belgique, suivant la méthode
décrite par Vancraeynest et al. (2007). La souche de
référence HV AT a été isolée en Belgique en 1994
(Devriese et al.,1996). Des analyses complémentaires
de sensibilité aux phages ont été réalisées par l’Institut
Pasteur de Bruxelles, Laboratoire de référence de
typage phagique de Belgique, à l’aide d’un ensemble
de bactériophages internationaux utilisés pour
caractériser les souches humaines.
S. aureus est le germe le plus fréquemment rencontré
dans l’utérus des lapines (Le Normand et al., 2007) ;
pour mieux comprendre les modalités de transmission
de la maladie, nous avons prélevé des fœtus sur
lapines gestantes dans des élevages touchés par la
staphylococcie et des lapereaux nouveau-nés dans un
élevage contaminé par une souche HV. Des cultures
bactériennes classiques ont été réalisées sur les foies
des fœtus et des lapereaux en prenant les précautions
d’asepsie habituelles lors des prélèvements.
2. Résultats et discussion
2.1. Gènes de toxines, groupes agr
Parmi les 23 souches étudiées, aucune souche ne porte
de gènes de toxines PVL, TSST ou exfoliatines. Par
comparaison, 10 à 30 % des souches humaines portent
le gène TSST, et les autres toxines sont plutôt
trouvées sur les souches communautaires.
Sur les 23 souches cunicoles, 1 est agr II, 5 sont agr
III, 17 sont agr IV. Les études menées sur d’autres
espèces (Buzzola et al., 2007, Collery et al., 2009,
Gilot et al., 2004) montrent la prédominance des
souches agr I, II, III parmi les souches de
Staphylococcus aureus isolées chez l’homme et les
bovins, avec une très faible proportion de souches agr
IV. Une relation entre le typage agr et l’expression
clinique semble assez nette pour les groupes III et IV
chez l’homme (Jarraud et al., 2002). Chez le lapin,
Vancraeynest et al. (2006) distinguent les groupes
suivants : 12 souches hautement virulentes (HV) sont
agr IV, 2 souches faiblement virulentes (LV) sont
respectivement agr II et III, 1 souche HV atypique est
agr II, Collery et al. (2009) classent 5 souches
cunicoles en agr IV.
2.2. Génotypage MLVA
Le génotypage MLVA a donné un arbre de dispersion
limitée qui permet de distinguer 2 clusters principaux
(dendogramme de la figure 1) : un gros cluster
(cluster G) de 16 souches proches de souches
humaines hospitalières (USA700) qui regroupait
toutes les souches agr IV, un petit cluster (cluster P)
de 5 souches (Sa12, 3, 8, 13, 14) toutes non agr IV, 1
souche (Sa5, agr IV) proche de la souche humaine
communautaire USA300 et 1 souche (Sa24) éloignée
de toutes les précédentes qui était agr II. Les souches
de Staphylococcus xylosus (Sa1, 22) étaient très
éloignées de toutes ces souches.
2.3. MSCRAMMs
Les 7 souches analysées étaient négatives pour le gène
bap et positives pour bbp. Les gènes icaA, icaD, clfA,
clfB, fib, eno étaient présents de façon variable. Ces
résultats confirment les résultats déjà obtenus par
Vancraeynest et al., 2004.
Sur 23 analyses ciblant le gène FnbB, 7 sont
positives : les 5 souches du petit cluster et les souches
Sa5 et Sa24.
13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans, France
Figure 1. Dendogramme du typage MLVA sur 23 souches de Staphylococcus aureus isolées de lapins.
2.4. PCR multiplexe bbp, selm et flank
Les résultats sont présentés dans le tableau 2 qui
intègre également l’analyse MLVA . Si quelques
souches apparaissent atypiques, la majorité des
souches de Staphylococcus aureus sont clonales ; la
caractérisation en souche HV ou LV par PCR
multiplexe apparaît fiable par rapport à la clinique et à
l’analyse MLVA.
Les 2 souches HV AT (Sa5 et Sa24) ont fait l’objet
d’analyses complémentaires et présentent les mêmes
types phage (29/54/95/+ et 29±/54±/95/+) ; elles sont
sensibles au phage 29 comme la souche de référence
HV AT, mais ont des profils PFGE et spa différents :
Sa5 est PFGE A et spa t656 (11-12-12-21-17-34-2434-22-25), Sa24 est PFGE sporadique (pas de code) et
spa t4461 (14-44-12-17-23-18-261-17-17-17-23-24).
La souche Sa12 issue d’un élevage où 100 % des
lapines mortes présentaient des pyomètres causés par
S. aureus (aucun autre signe clinique, isolements par
plusieurs laboratoires), a subi les mêmes analyses : les
profils PFGE Y3d et spa t2968 (07-23-21-17-34-3434-34-34-33-34) confirment le statut LV de cette
souche qui s’est avérée résistante à tous les phages
testés.
2.5. Bactériologie
Les cultures réalisées sur les foies de fœtus dans
plusieurs élevages atteints de staphylococcie se sont
révélées positives. Dans un élevage contaminé par une
souche HV (souche Sa4), les foies de lapereaux
nouveau-nés s’avèrent également positifs pour
Staphylococcus aureus. Ces résultats démontrent une
transmission très précoce du germe ; ils incitent à
mettre en place des moyens de lutte englobant
obligatoirement une gestion du renouvellement des
animaux dans l’élevage.
Tableau 2. Caractérisation des souches de
Staphylococcus aureus selon leur persistance clinique,
le type agr, la virulence déterminée par PCR
multiplexe et l’analyse MLVA
Numéro
MLVA
Sa2
Sa3
Sa4
Sa5
Sa6
Sa7
Sa8
Sa9
Sa10
Sa11
Sa12
Sa13
Sa14
Sa15
Sa16
Sa17
Sa18
Sa19
Sa20
Sa21
Sa23
Sa24
Sa25
Persistance
clinique
Type
agr
Type
HV/LV
Cluster
MLVA
oui
non
oui
oui
oui
oui
non
oui
oui
oui
non
non
non
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
oui
IV
III
IV
IV
IV
IV
III
IV
IV
IV
III
III
III
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
II
IV
HV
LV
HV
HV AT
HV
HV
LV
HV
HV
HV
LV
LV
LV
(NT)
HV
HV
HV
HV
HV
HV
HV
HV AT
HV
G
P
G
13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans, France
G
G
P
G
G
G
P
P
P
G
G
G
G
G
G
G
G
G
Conclusion
L’approche clinique des élevages sur le long terme
permet de définir a posteriori des souches de
Staphylococcus aureus à fort pouvoir pathogène ; ces
souches ont un profil analytique par génotypage agr,
MLVA ou PCR multiplexe bbp, selm, flank qui
semble correspondre à la détermination clinique.
L’isolement de Staphylococcus aureus sur des foies
fœtaux et des foies de lapereaux nouveau-nés suggère
une notion de transmission extrêmement précoce du
germe, ce qui pourrait remettre en cause l’abord
traditionnel de la maladie en élevage.
Dans les élevages contaminés par Staphylococcus
aureus, il est indispensable de pouvoir connaître,
avant de devoir gérer une extension trop importante
de la maladie, le statut des souches isolées afin
d’adopter des protocoles de soins zootechniques et
thérapeutiques adaptés. En complément d’une étude
clinique solide, la PCR multiplexe est intéressante et
d’un coût raisonnable. Cette approche analytique
correspond à une démarche sanitaire cohérente et
évite une médicalisation excessive ; une approche
raisonnée du renouvellement des animaux
est
nécessaire, avec mise en place d’un audit des mesures
techniques logiques répondant aux facteurs de risques
de la contamination des animaux nouvellement
introduits.
La détection des porteurs sains de Staphylococcus
aureus à fort pouvoir pathogène selon les méthodes de
prélèvements récemment décrites par Hermans et al.
en 2000 ou Agnoletti et al. en 2008, peut dans ce
cadre constituer un élément sanitaire d’assainissement
ou de contrôle des reproducteurs très intéressant.
Remerciements
Nous remercions toute l’équipe de LABOFARM qui a
manipulé (sans s’impatienter) les souches ces trois
dernières années.
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