2004

Sophie Mahassen
Perrothon Sandrine
Garcia Laura
Hiver 2004
HPLC
HPLC, Séparation des
composés principaux de la
vanille
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Sophie Mahassen
Perrothon Sandrine
Garcia Laura
Hiver 2004
HPLC
1.But:
Le but de ce travail pratique est dans un premier temps de déterminer l'ordre d'élution des
composés principaux de la vanille, puis dans un deuxième temps de déterminer quelques
paramètres de la séparation de la chromatographie, et finalement de doser les composés
de la vanille.
2.Théorie:
D'une façon générale la chromatographie a pour but de séparer des composés présents
dans une même solution en se basant sur le fait que les composés n'ont pas la même
affinité avec la phase stationnaire de la colonne (particules de silice greffées ou non). Le
produit ayant le moins d'affinité avec la colonne sortira en premier alors que celui qui en a
le plus sortira en dernier.
Dans ce TP la méthode de HPLC utilisée est celle de partage. Elles se basent sur les
différences de solubilité des composés dans deux phases liquides non-miscibles (phase
stationnaire, molécules greffées sur des billes de silice, par exemple des molécules
apolaires comme des alcanes, et la phase mobile, l'éluant par exemple de l'eau). Les
composés doivent être solubles dans les deux phases mais avec des solubilités
différentes. Plus un composé sera soluble dans la phase stationnaire plus il restera
longtemps dans la colonne.
Deux types de colonne existent, les colonnes normales et celles inversées. Dans les
colonnes normales, les billes de silice retiennent les composés. La phase stationnaire est
polaire, la silice a pour formule O-Si-O... et à la surface se trouvent des groupes silianols
Si-OH. L'éluant sera donc apolaire et les molécules les plus polaires sortiront en dernier.
Ce type de colonne est le moins utilisé. Dans le cas d'une colonne inversée, les billes de
silice sont greffées avec des particules apolaires tels que des alcanes. L'éluant sera
polaire et les molécules les moins polaires sortiront en dernier.
Dans ce TP nous utiliseront une colonne inverse, et donc un éluant polaire, dans notre cas
il s'agira d'un mélange 50-50 d'eau et d'acétonitrile (l'acétonitrile permet de moduler la
polarité de l'éluant, l'eau étant très polaire, en la mélangeant à de l'acétonitrile, la polarité
de l'éluant sera diminuée). Certains appareils permettent de modifier l'éluant au cours du
temps en diminuant la polarité, ce qui a pour effet d'accélérer la sortie des composés les
plus apolaires, c'est le mode gradient. Dans le cas d'un éluant fixé au départ, on parle de
type isocratique.
Le détecteur à la fin de la colonne permet de détecter les composés. Le détecteur
universel est celui à indice de réfraction, mais il est très peu sensible. Dans ce TP nous
utiliseront un détecteur UV pouvant scanner trois longueurs d'onde. Ce détecteur ne peut
être utilisé qu'avec des molécules ayant une, des liaison(s) π car l'UV engendre des
transitions π π* (dans certains cas d'autres molécules peuvent être détectées).
Après tout ce blabla, quelques petites équations:
Le chromatogramme se présente de la façon suivante:
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Un tout petit pic sort à un temps court (tM temps mort), il s'agit de l'éluant qui sort de la
colonne, et qui est détecté car il engendre une différence de pression. Puis les pics des
différents produits (tn temps de rétention du nième produit) apparaissent.
w
L'aptitude de la colonne à retenir les composés est déterminée par la rétention k', qui
devrait toujours être entre 1 et 5:
k' = (tn – tM) / tM
w
La séparation entre deux pics est donnée de la façon suivante:
α = k'B / k'A = (tB – tM) / (tA – tM)
w
La capacité de séparation de la colonne est donnée par le nombre de plateaux
théoriques:
N = 16 · (tn / W)2
Avec W la largeur du pic à sa base.
w
La qualité du chromatogramme est déterminée en fonction de l'éloignement des deux
pics les plus proches. C'est la résolution:
Rs = [N1/2 / 4] · [(α -1) / α] · [k'b / (1 + k'b)]
La rétention utilisée est celle du temps de rétention le plus long.
Les composés les plus importants de la vanille sont les suivants:
B
A
O
O
OH
Acide vanilique
260 nm
O
OH
O
O
OH
D
C
O
OH
Vanilline
230 nm
OH
4-hydroxybenzaldehyde
280 nm
OH
Acide 4-hydroxybenzoïque
260 nm
L'ordre de polarité (décroissant) est le suivant: D, A, C et B. La fonction éther diminue la
polarité globale de la molécule en générant une partie non polaire en plus dans la
molécule. C'est donc dans cet ordre que sortiront les molécules.
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3.Partie pratique:
3.1.Détermination de l'ordre d'élution et de l'efficacité de la
séparation:
3.1.1.Manipulations:
Trois solutions contenant un seul des composé sont préparées de la façon suivante dans
le mélange 50-50 eau-acétonitrile:
Composé
Masse pesée [g] pour 25
ml
Concentration [g/l]
A
0.0245
0.980
B
0.0248
0.992
C
0.0195
0.780
Une solution contenant les trois composés a été faite comme suit:
Composé A
Composé B
Composé C
Composé D
Masse [g] pour
25 ml
0.0197
0.0214
0.0190
0.0195
Concentration
[g/l]
0.788
0.856
0.760
0.780
Les solutions ont ensuite été injectées dans l'appareil de mesure suivant un rituel
scrupuleux.
3.1.2.Résultats:
Les temps de rétention obtenus pour les composés isolés sont complètement faux, ils
oscillent entre 17.075 et 17.300 minutes. La colonne devait contenir des impuretés.
Nous considéreront que l'ordre d'élution est celui définit plus haut.
Pour l'échantillon contenant les trois composés le chromatogramme était caractérisé par
les paramètres suivants:
Composé Temps de rétention [min] Surface [mV · min]
D
11.317
77.5
A et C
14.142
159.6
B
17.433
81.4
4
W
2.808
2.833
2.092
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La longueur d'onde prise ici est de 230 nm, cette longueur d'onde n'est pas optimale pour
tous les composés, mais permet de tous les voir.
Nous pouvons calculer les paramètres suivants en utilisant les équations ci-dessus:
K'
5.66
7.32
9.25
Alpha
1.29
1.26
N
32.12
35.75
46.19
SR
0.299
0.321
Nous constatons que les valeurs de k' ne sont pas dans la fourchette désirée (entre 1 et
5), mais qu'elles sont toutes au-dessus. La séparation (α) semble bonne, même si elles
pourraient être plus grande, il faut tout de même noter que deux pics ne peuvent pas être
différenciés l'un de l'autre. Le nombre de plateaux semble correct, bien que nous nous
attendions à un chiffre plus élevé. Enfin la résolution est bonne, si on passe le fait que
deux pics ne sont pas du tout séparés.
Pour améliorer le chromatogramme, sachant que les composés A et C ne sont pas
séparés il faudrait surtout diminuer les valeurs de k' qui sont un peu trop élevées, les
composés sont donc trop bien retenus dans la colonne. Dans ce but, il faudrait pouvoir
diminuer les temps de rétention, par exemple en augmentant le débit de la phase mobile,
ou en changeant la polarité de la phase mobile. Une valeur de k' trop grande n'est pas un
signe d'une mauvaise séparation, mais d'une mauvaise utilisation du temps (la séparation
est trop longue), ce qui en entreprise n'est pas rentable. Les valeurs de la séparation α
pourrait être améliorées en faisant varier la phase mobile, sa composition et si besoin est
sa polarité.
Une bonne idée serait de trouvé un paramètre qui puisse séparer les composés A et C.
Dans ce cas le nombre de plateaux pourrait jouer un grand rôle, en effet si ces derniers
étaient plus nombreux il serait peut être possible de séparer A et C. Il faudrait donc que la
colonne soit plus grande, ou carrément changer de colonne.
3.2.Dosage des composés dans une gousse de vanille:
3.2.1.Manipulations:
608.3 µg de vanille sont coupés en petits morceaux et placés dans 25 ml du mélange
50-50 eau-acétonitrile. Le tout est laissé durant une nuit, puis une mesure est effectuée
toutes les heures.
La solution, contenant les quatre composés, utilisée précédemment est diluée 2, 5 et 10
fois. Les concentrations sont donc de:
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Dilution
Concentration
de A [g/l]
Concentration
de B [g/l]
Concentration
de C [g/l]
Concentration
de D [g/l]
2 fois
0.394
0.428
0.380
0.390
5 fois
0.158
0.171
0.152
0.156
10 fois
0.079
0.086
0.076
0.078
3.2.2.Résultats:
Les valeurs ont été prises à la longueur d'onde de 230 nm.
Pour les étalons, les résultats sont les suivants:
Étalon
Composé
D
A et C
B
D
A et C
B
D
A et C
B
Dilution de 2 fois
Dilution de 5 fois
Dilution de 10 fois
Temps de rétention [min] Aire [mV · min]
11.308
76.5
16.533
171.2
17.558
40.4
10.167
59.2
12.775
136.5
15.892
137.5
10.225
15.4
12.842
25.3
15.983
17.7
L'aire du composé B lors de la dilution de 5 fois, semble beaucoup trop importante, elle
sera donc tenu à l'écart pour la droite de régression.
Le graphique est le suivant:
Aire en fonction de la concentration
180
160
140
Aire
120
100
80
60
40
20
0
0
0.1
0.2
0.3
Concentration [g/l]
6
0.4
0.5
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Les droites sont les suivantes:
w
Composé D:
YD = 220.64 · cD
w
Composé B:
YB = 54.06 · cB
w
Composés A et C (les concentrations de A et C ont été additionnées):
YAC = 425.25 · cAC
Les résultats pour la vanille sont les suivants:
Échantillon de vanille Aire du composé D Aire des composés A et C Aire du composé B
1
8.1
10.6
1.2
2
12.1
21.6
13.6
3
7.5
9.3
7.2
Les concentrations trouvées sont:
Échantillon de vanille Concentration de D [g/l] Concentration de A et C [g/l] Concentration de B [g/l]
1
0.037
0.025
0.02
2
0.055
0.051
0.25
3
0.034
0.022
0.13
Il faut noter que les concentrations trouvées pour les composés A et C sont une somme
des deux concentrations réelles des composés.
La courbe de la concentration en fonction du temps est la suivante:
Concentration en fonction du temps d'extraction
0.275
0.250
Concentration [g/l]
0.225
0.200
0.175
0.150
0.125
0.100
0.075
0.050
0.025
0.000
24
24.25
24.5
24.75
25
25.25
Temps d'exctraction
7
25.5
25.75
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En bleu la concentration de vanilline (B) en vert les composés A et C et en rouge le
composé D.
Ce graphique n'est pas très intéressant car il ne montre pas vraiment ce à quoi nous
pourrions nous attendre, c'est à dire une faible augmentation de la concentration avec
celle du temps d'extraction. Par contre il montre clairement que la deuxième mesure
donne des valeurs beaucoup plus importantes que les autres, il doit donc y avoir eu un
problème avec le chromatogramme.
3.2.2.1.Questions pratiques:
Généralement une gousse de vanille contient environ 2 % de vanilline (B). La
concentration trouvée ici en pourcentage est de 0.58 %, ce qui est nettement inférieur à la
valeur théorique. Cette concentration ne doit pas signifier grand chose, car la gousse a
juste été coupée en morceau et placée dans l'éluant, toute la vanilline ne s'en est pas
extraite. Il aurait fallu, pour avoir des concentrations plus significatives, broyer la gousse
avant de la placer dans l'éluant, afin que les composés puissent mieux s'en extraire.
Dans le cas ou la limite de détection de l'UV/Visible n'aurait pas été suffisante, un
détecteur à fluorescence aurait pu être utilisé. Vu que ce détecteur ne compare pas deux
intensités lumineuses (lumière incidente et lumière transmise) mais une seul l'intensité
émise (l'autre étant égal à 0), la limite de détection est très bonne. Un autre détecteur à
absorbance pourrait être utilisé, IR par exemple, et aurait peut être une meilleure limite de
détection. Sinon dans les techniques plus pointues il existe des détecteurs très performant
du type électrochimique, valable si les composés sont oxydables ou réductible (ce qui est
le cas ici).
Une bonne chose avant d'analyser les composés par HPLC, est d'avoir une idée sur la
nature du composé, savoir s'il est chargé, s'il est polaire, si les molécules ont des tailles
différentes, afin de choisir de mode d'HPLC le plus efficace (Échange d'ions pour les
molécules chargée, Adsorption et Échange si les molécules sont polaires et Exclusion de
taille si les composés ont des tailles différentes). Du type de chromatographie choisie
dépendra ensuite de la colonne utilisée.
3.2.2.2.Questions théoriques:
L'appareil HPLC se présente comme suit:
w
La pompe: Elle module la pression qui va être injectée dans la colonne, donc c'est par
elle que l'on peut régler le débit de la phase mobile.
w
L'injecteur: Cette partie sert, comme sont nom l'indique, à injecter l'échantillon à
analyser. L'injecteur contient une boucle avec un volume exact. Lors de l'injection, la
boucle est remplie, l'excès est déversé dans un récipient, puis le contenu de la boucle
est injecté dans la colonne.
w
La colonne: C'est le coeur de la séparation, là où les composés se séparent.
w
Le détecteur: C'est l'endroit où les molécules sont détectées.
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L'intérêt de mesurer au maximum d'absorption (ce qui n'a pas été fait dans notre cas) est
dans un premier temps que si les composés sont en très faible quantité, et si l'absorption
n'est pas prise à son maximum il y a un risque de ne pas voir un pic car la concentration
est basse et que la molécule absorbe peu à cette longueur d'onde, le pic peut donc être
comparable au bruit de fond. Dans un deuxième temps, plus le pic est grand (intensité est
grande), plus les paramètres qui le caractérisent sont fiables.
Les molécules apparaissent sous forme de pics Gaussiens car par toutes les molécules
vont à la même vitesse dans la colonne, certaines sont plus retenues car elle rencontrent
plus de particules sur leurs chemins, alors que d'autres en rencontrent moins et sortent
donc plus vites. Le nombre de rencontre avec des particules pouvant interagir avec les
composés, est proportionnel au chemin parcouru. En effet une molécule traversant la
colonne tout droit rencontrera moins de particules avec qui interagir qu'une molécule ayant
fait des « détours ». Le chemin parcouru, étant le fruit du hasard, il est donc normale de
tomber sur une fonction statistique, une Gaussienne.
4.Conclusion:
Nous avons pu, durant ce TP nous familiariser avec la technique d'HPLC, et ses alléats.
Nous avons pu par cette méthode, qui est à la base une méthode de séparation, doser
des composés avec plus ou moins de réussite vu les résultats obtenus. Ce TP nous a
permis de mieux comprendre le fonctionnement de la technique grâce à des questions
posées sur des améliorations possibles, de paramètres des séparations.
Bref ce TP fut une grande réussite!
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