GenoQuick® Bordetella

GenoQuick Bordetella
®
VER 2.0
Notice d'Utilisation
IFU-313-05
Y
pour usage diagnostique in vitro uniquement
05/2012
GenoQuick® Bordetella VER 2.0
Test de Biologie Moléculaire Rapide pour la Détection et la Différentiation de Bordetella pertussis et
Bordetella parapertussis à partir d’Échantillons de Patients
Veuillez lire attentivement la notice d’utilisation dans sa totalité avant d’utiliser le kit. Respecter strictement la procédure établie pour obtenir des résultats
de tests optimaux.
Domaine d’Utilisation
Le test GenoQuick® Bordetella VER 2.0 est un test qualitatif de diagnostic in vitro pour la détection et la différentiation des souches de Bordetella pertussis
et Bordetella parapertussis directement à partir d'échantillons de patients.
Le test est indiqué comme une aide au diagnostic et destiné à être utilisé dans les établissements médicaux et les laboratoires cliniques.
Résumé et Explication
La coqueluche ou Pertussis est une infection bactérienne infectieuse transmise par aérosols. Les pathogènes responsables de la coqueluche sont des
bacilles Gram-négatifs, à aérobie stricts, immobiles, de l’espèce Bordetella pertussis. Le premier stade de la coqueluche se caractérise par des symptômes
similaires à ceux d’un rhume. Le deuxième stade est caractérisé par l’apparition de quintes de toux spasmodiques. Une infection à B. parapertussis peut
produire un tableau clinique similaire, mais l’infection est généralement moins sévère [1].
En raison du développement atypique de l’infection, les erreurs de diagnostic sont fréquentes chez l’adolescent et l’adulte, ce qui contribue à la
contamination de l’entourage, en particulier les bébés et les jeunes enfants, qui risquent de développer de sérieuses complications [2]. Par conséquent, un
diagnostic rapide et fiable est essentiel afin de démarrer au plus vite une antibiothérapie et interrompre la chaîne de propagation de l’infection.
Principes de la Procédure
Le test GenoQuick® Bordetella est basé sur la technique GenoQuick®. La procédure complète comporte trois phases : (i) Extraction de l’ADN à partir de
prélèvements directs (écouvillons ; le Tampon de Lyse nécessaire est fourni), (ii) une amplification multiplex à l’aide d’amorces biotinylées et (iii) détection
sur la bandelette. Tous les réactifs requis pour l’amplification tels que polymérase et amorces sont inclus dans les Mélanges d’Amplification A et B (AM-A
et AM-B) et sont optimisés pour ce test. Les bandelettes contiennent une matrice imbibée d’or colloïdal et sont recouvertes de sondes spécifiques
complémentaires aux acides nucléiques amplifiés. Après la dénaturation chimique, les amplicons simple brin commencent par absorber l’or colloïdal puis
se lient spécifiquement aux sondes. Des bandes apparaissent alors sur la bandelette. Les signaux obtenus sont facilement et rapidement interprétés à
l’aide d’une matrice fournie avec chaque kit.
Conservation et Élimination des Réactifs
1/2
Composant du Kit 1 de 2
2/2
Composant du Kit 2 de 2
Conserver tous les Composants du Kit 1 à 2-8°C. Conserver tous les Composants du Kit 2 à –20°C et strictement séparés d’ADN contaminant. Ne pas
utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption. Après chaque utilisation, refermer hermétiquement les tubes contenant les bandelettes. La face
interne des tubes est recouverte de dessicant. Eliminer les réactifs inutilisés et les déchets conformément aux règlementations locales, régionales et
nationales.
Précautions de Manipulation des Composants de la Trousse
Les composants du kit ne sont pas considérés comme dangereux. Cependant il faut porter en tout temps une blouse et des gants de protection appropriés
pour les manipuler. Suivre les recommandations (fédérale, nationale, locale) d’hygiène, de sécurité et d’environnement.
Contrôle de Qualité
Afin de contrôler le bon déroulement du test et le bon fonctionnement des composants du kit, chaque bandelette comporte 2 zones de contrôle :
– une zone de Contrôle Conjugué (CC) pour contrôler la fixation du conjugué sur la bandelette
– une zone de Contrôle d’Amplification (AC) afin de vérifier que la réaction d’amplification a été accomplie avec succès
Observer les précautions usuelles pour la préparation de l’amplification. Tous les matériels (tels qu’embouts de pipettes) en contact avec les réactifs
doivent impérativement être exempts de DNases. Ne pas interchanger ou mélanger les réactifs de différents kits, sauf s’ils ont le même numéro de lot.
Un contrôle négatif pour la détection d’une possible contamination contenant du Tampon de Lyse (fourni dans la trousse) et de l’eau au lieu d’ADN doit être
réalisé avec chaque série de tests ; seules les bandes CC et AC devraient se développer sur la bandelette correspondante. Un échantillon de contrôle
positif contenant l’ADN Contrôle (C+) peut également faire partie des échantillons. L’ADN Contrôle contient de l’ADN de B. pertussis.
2
Echantillons
Les écouvillons prélevés sur des patients sont utilisés comme matériel de départ pour l’extraction de l’ADN. Les échantillons appropriés sont les
prélèvements nasopharyngés, nasaux ou pharyngés collectés avec un écouvillon stérile. Jusqu’à la présente version de cette notice d’utilisation, la
performance du test n’a pas été validée avec d’autres types d’échantillons.
Tout matériel à tester issu de la culture doit être dilué afin de prévenir des réactions croisées non spécifiques ou une inhibition causée par un excès de
matériel de départ. Il suffit normalement de diluer une colonie dans 100 μl de Tampon de Lyse, de réaliser l’extraction de l’ADN, puis de diluer au 1:1000.
Si nécessaire, tester différentes dilutions.
Précautions de manipulation des échantillons
Tous les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et être manipulés comme tels (ex. voir [3] ou [4]). Se protéger à l’aide de
vêtements adéquats et de gants. Les échantillons prélevés sur des patients à risques (infectés par des micro-organismes pathogènes incluant l’Hépatite B
et le Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH)) doivent être identifiés et manipulés dans des conditions de sécurité adéquates conformément aux
directives institutionnelles.
Eliminer les embouts de pipettes immédiatement après usage dans un contenant pour déchets à risques biologiques. Après avoir terminé le test, éliminer
tous les consommables dans un contenant pour déchets à risques biologiques.
Extraction de l’ADN
Les écouvillons prélevés sur des patients sont utilisés comme matériel de départ pour l’extraction de l’ADN. L’espace de travail doit être exempt de toute
trace d’ADN contaminant.
Le protocole rapide suivant peut être utilisé pour l’extraction d’ADN à partir d’échantillons cliniques :
1.
2.
3.
4.
Pour chaque échantillon, distribuer 300 μl de Tampon de Lyse (Q-LYS, jaune) dans un microtube 1,5 ml à capuchon vissant.
Laver soigneusement l’écouvillon dans le Tampon de Lyse.
Visser le capuchon et incuber l’échantillon à 95°C pendant 10 minutes dans un bloc chauffant.
Centrifuger à vitesse maximale pendant 5 minutes dans une centrifugeuse de paillasse standard, puis transférer le surnageant (solution d’ADN) dans
un autre microtube.
L’automate GenoXtract combiné au GXT NA Extraction Kit peut être utilisé pour l’extraction automatisée d’ADN d’échantillons de patients (se référer au
chapitre d’information sur les commandes). Pour les instructions concernant la manipulation, consulter les notices d’utilisation de ces kits.
La performance du test GenoQuick® Bordetella a été évaluée à l’aide des méthodes décrites ci-dessus. Jusqu’à la présente version de cette notice
d’utilisation, la performance du test n’a pas été validée avec d’autres méthodes d’extraction d’ADN ou types d’échantillons.
Amplification
Tous les réactifs requis pour l’amplification tels que polymérase et amorces sont inclus dans les Mélanges d’Amplification A et B (AM-A et AM-B) et sont
optimisés pour ce test. Après décongélation, homogénéiser soigneusement AM-A et AM-B. Pipeter AM-A et AM-B dans une pièce exempte d’ADN
contaminant. L’échantillon d’ADN doit être ajouté dans une zone séparée.
Préparer pour chaque échantillon :
– 10 μl AM-A
– 35 μl AM-B
– 10 μl de solution d’ADN
Déterminer le nombre d’échantillons à amplifier (nombre d’échantillons à analyser + contrôles). Préparer le nombre de tubes requis. Préparer une
solution mère de mélange réactionnel contenant AM-A et AM-B, et homogénéiser avec soin mais complètement (ne pas vortexer). Il est également
possible de transférer la totalité du contenu d’un tube de mélange réactionnel AM-A dans un tube de mélange réactionnel AM-B. On obtient ainsi du
mélange réactionnel (0,68 ml) pour 12 réactions d’amplification (kit de 12 tests), ou 4x 1,35 ml pour 4x 24 réactions d’amplification (kit de 96 tests).
Aliquoter 45 μl du mélange réactionnel dans les tubes de PCR et ajouter 10 μl d’eau à un aliquot (contrôle négatif). Dans une zone séparée, ajouter 10 μl
d’ADN (ou 5-10 μl C+ pour le contrôle positif) à chaque aliquot (excepté le contrôle négatif). Lorsque l’ADN extrait à l’aide du Tampon de Lyse jaune est
déposé dans le mix, ce dernier vire du rose au rouge. Veuillez noter que le mélange réactionnel doit être préparé fraichement à chaque fois.
Profil d’amplification:
Lorsqu’un thermocycleur de Hain Lifescience est utilisé avec la préinstallation correspondante, sélectionner le protocole « GQAM1 ».
15 min 95°C
1 cycle
10 sec 95°C
2 min 58°C
10 cycles
10 sec 95°C
30 sec 53°C
30 sec 72°C
37 cycles
2 min 10°C
1 cycle
Les produits de l’amplification peuvent être conservés entre +8 et –20°C.
3
Détection
Préparation
Immédiatement avant de débuter la détection, retirer du tube une bandelette pour chaque échantillon testé et l’identifier à l’aide d’un crayon dans la zone
d’identification blanche. La bandelette est pratiquement entièrement recouverte d’un film transparent et peut être manipulée au niveau de la zone
d’identification. Préchauffer un bloc chauffant, uniquement utilisé pour la détection, à 45°C. Pour chaque échantillon, pipeter 110 μl de Tampon de
Migration (RB GQ Bordetella) dans un microtube de 1,5 ml à capuchon vissant, boucher le tube et incuber dans le bloc chauffant à 45°C.
1. Déposer 20 μl d’amplicon dans un microtube de 1,5 ml à capuchon vissant contenant 20 μl de Solution de Dénaturation (Q-DEN, bleu), et
homogénéiser.
2. Déposer 40 μl d’amplicon dénaturé dans un microtube de 1,5 ml à capuchon vissant préchauffé contenant du Tampon de Migration et homogénéiser
par pipetages successifs.
3. Déposer immédiatement la bandelette avec la matrice d’or colloïdal orientée vers le bas (flèches vers le haut) dans le microtube de 1,5 ml à
capuchon vissant et incuber 15 minutes à 45°C dans le bloc chauffant.
Des résultats positifs peuvent apparaître plus tôt ; néanmoins le délai recommandé pour la lecture doit être respecté. Un temps d’incubation rallongé
peut en revanche entraîner un changement d’intensité.
4. Lire les résultats à l’aide de la matrice fournie et les annoter sur la feuille de résultats fournie (voir chapitre Évaluation et Interprétation des
Résultats) Pour éviter les risques de contamination, ne pas sortir la bandelette du tube. Éliminer la bandelette.
La conservation des bandelettes comporte un risque de contamination. De plus, le séchage peut entraîner des variations dans l’intensité du signal. Il est
donc recommandé d’éliminer ou d’archiver numériquement les bandelettes après avoir documenté les résultats.
Eliminer les bandelettes et les tubes contenant le tampon résiduel dans un container contenant une solution d’hypochlorite de sodium 1,5% fraîchement
préparée. Traiter les surfaces de travail avec une solution d’hypochlorite de sodium 1,5% et rincer à l’eau.
Évaluation et Interprétation des Résultats
Une feuille d’évaluation est fournie avec le kit. La matrice fournie avec le kit permet d’identifier chaque zone réactionnelle en alignant la bande CC de la
bandelette et de la matrice. Chaque bandelette comprend 4 zones réactionnelles (voir figure).
Zone
d’identification
Contrôle Conjugué (CC)
Contrôle d’Amplification (AC)
Bordetella pertussis
Bordetella parapertussis
Zone réactionnelle
Matrice d’or
Remarque : Cette bandelette n’est pas représentée dans sa taille originale.
Contrôle Conjugué (CC)
Une ligne doit se développer dans cette zone, attestant de l’efficacité du conjugué et de la migration.
Contrôle d’Amplification (AC)
Lorsque le test a été correctement réalisé, un amplicon de contrôle se fixe dans la zone Contrôle d’Amplification. Le développement d’un signal à ce niveau
exclut toute erreur durant les phases de pré-amplification et d’amplification, ainsi que la présence d’inhibiteurs.
Lors de résultats positifs, le Contrôle d’Amplification peut présenter un signal faible ou même disparaître complètement, dû à un phénomène de
compétition au cours de l’amplification ou à la présence d’inhibiteurs en quantité limitée. Néanmoins, il n’est pas nécessaire de répéter l’étape
d’amplification.
Lorsque seules les bandes CC et AC se développent, on considère qu’il s’agit d’un résultat négatif valide. Lors de résultats négatifs, le Contrôle
d’Amplification doit présenter un signal d’intensité équivalente au Contrôle d’Amplification de la bandelette du contrôle négatif. Une bande AC faible ou
inexistante en cas de tests négatifs indique une erreur au niveau de l’amplification, ou la présence d’inhibiteurs, ou bien encore une inhibition due à une
surcharge du système (voir chapitre Causes d’Erreurs). Dans ce cas, le test n’est pas validé et les échantillons doivent être re-testés.
Bordetella pertussis
Cette zone de réaction signale la présence d’une souche de Bordetella pertussis (voir également chapitre Limitations).
En cas de signal très faible, l’échantillon incriminé doit être testé à nouveau.
Bordetella parapertussis
Cette zone de réaction signale la présence d’une souche de Bordetella parapertussis (voir également chapitre Limitations).
En cas de signal très faible, l’échantillon incriminé doit être testé à nouveau.
4
La figure ci-dessous indique les profils possibles :
positif
négatif
non valide
Remarque : Les intensités des bandes dans les images ci-dessus ne préfigurent en aucun cas des intensités de référence à obtenir, mais sont
représentées uniquement pour refléter la variété des intensités pouvant être obtenues.
Limitations
Respecter scrupuleusement les protocoles et procédures établis afin d’éliminer tout risque de contamination et d’obtenir des résultats optimaux.
Ce test identifie Bordetella pertussis et B. parapertussis par les éléments IS IS481 et IS1001. Les espèces bactériennes B. bronchiseptica et B. holmesii,
rarement présentes dans les échantillons cliniques, peuvent également comporter ces éléments, et dans ce cas, donneront également des signaux positifs.
Comme toute méthode de détection d’ADN, ce test détecte l’ADN à partir de bactéries viables et non-viables. Par conséquent, le test GenoQuick®
Bordetella ne peut être utilisé pour effectuer le suivi d’une thérapie antimicrobienne.
Le test GenoQuick® Bordetella fournit des résultats qualitatifs. L’intensité des bandes Bordetella n’informe en aucun cas sur la charge bactérienne de
l’échantillon de départ. Afin d’éviter une perte de sensibilité, les prélèvements ne doivent pas être lavés dans plus de 300 μl de Tampon de Lyse.
Le test fonctionne dans les limites de la région du génome choisie pour les amorces et les sondes.
Comme dans tout système de détection basé sur l’hybridation, il existe la possibilité que des variations situées dans la séquence d’ADN génomique cible à
partir de laquelle les amorces et les sondes ont été choisies et pour lesquelles le test n’a pas été conçu, entraînent un résultat erroné. En raison de
l’extrême variabilité des génomes bactériens, il est possible que certains sous-types puissent ne pas être détectés. Le test reflète l’état actuel des
connaissances de la société Hain Lifescience.
L’utilisation de ce kit est réservée à un personnel qualifié déjà formé et rodé aux techniques de biologie moléculaire.
Les performances du test ont été évaluées à partir d’écouvillons nasopharyngés à l’aide des méthodes d’extraction d’ADN décrites au chapitre Extraction
d’ADN. Jusqu’à la présente version de cette notice d’utilisation, la performance du test n’a pas été validée avec d’autres méthodes d’extraction ou types
d’échantillons.
L’application de concentrations trop élevées d’ADN peut provoquer une surcharge du système d’analyse. Tout matériel à tester issu de la culture doit être
dilué afin de prévenir des réactions croisées non spécifiques ou une inhibition causée par un excès de matériel de départ.
Les résultats obtenus avec ce test doivent être interprétés en tenant compte de toute autre donnée de laboratoire ou clinique à la disposition du médecin
responsable.
Causes d’Erreurs
Résultats faibles ou absence de signal (incluant la zone de Contrôle Conjugué)
– Volume de Tampon de Migration insuffisant ou en excès déposé.
– Excès d’amplicons ajouté au Tampon de Migration.
– Bandelette insuffisamment plongée dans le Tampon de Migration.
Recommencer la détection.
Résultats faibles ou absence de signal, excepté dans la zone de Contrôle Conjugué
– La solution de dénaturation (Q-DEN) n’a pas été ajoutée.
– Quantité insuffisante d’amplicons ajoutée au Tampon de Migration.
– La bandelette n’a pas été placée immédiatement dans le tube après l’ajout de l’amplicon dénaturé au Tampon de Migration.
– La détection n’a pas été effectuée à 45°C.
Recommencer la détection.
– La qualité de l’ADN extrait n’a pas permis une amplification correcte. Recommencer l’extraction.
– Concentration d’ADN utilisée pour l’amplification trop élevée, due par exemple à un ADN extrait à partir de bactéries cultivées et insuffisamment dilué
(voir chapitre Echantillons). Diluer la solution d’ADN et recommencer l’amplification.
5
Résultat inattendu
– Contamination de l’ADN extrait avec de l’ADN précédemment extrait ou amplifié.
– Contamination des réactifs d’amplification. Dans ce cas, un échantillon de contrôle négatif développe des bandes additionnelles en plus de CC et AC.
Recommencer l’amplification en utilisant des réactifs fraichement préparés.
– Contamination du Tampon de Lyse. Dans ce cas, le Tampon de Lyse utilisé comme contrôle négatif développe des bandes supplémentaires en plus de
CC et AC. Demander un nouvel échantillon et recommencer l’extraction en utilisant du Tampon de Lyse frais.
– Contamination des tubes adjacents par éclaboussures durant le dépôt des amplicons. Recommencer la détection.
– Non-respect des procédures de prélèvement, conservation, transport ou préparation des échantillons. Demander de nouveaux échantillons et répéter
le test.
– L’échantillon du patient contenant une espèce bactérienne que ce test ne peut différencier de B. pertussis et B. parapertussis, un résultat positif est
obtenu (voir le chapitre Limitations).
Matériel Requis mais Non Fourni
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Blocs chauffants (précision : +/–1°C) (un dans la zone d’extraction d’ADN et l’autre dans la zone de détection)
Centrifugeuse de paillasse
Chronomètre
Eau (niveau de pureté pour Biologie Moléculaire)
Embouts de pipettes stériles avec filtre
Gants à usage unique
Microtubes 1,5 ml à capuchon vissant
Microtubes pour thermocycleur ; exempts de contamination par DNase et RNase
Pipettes réglables pour 10, 20, 200 et 1000 μl
Solution d’hypochlorite de sodium (Eau de Javel ménagère exempte de colorant et sans parfum)
Thermocycleur (taux de chauffage : 3°C/sec, taux de refroidissement : 2°C/sec, précision : +/–0,2°C)
Composition du Kit
réf
tests
313
12
31396
96
12
2x 48
6 ml
2x 20 ml
0,3 ml
2x 1,2 ml
2 ml
16 ml
Composant du Kit 1 sur 2 (conserver à 2-8°C)
Bandelette sensibilisées avec des sondes spécifiques (DS GQ Bordetella)
Tampon de Lyse (Q-LYS GQ Bordetella) prêt à l’emploi
contient détergent anionique <1,5%, colorant
Solution de Dénaturation (Q-DEN) prêt à l’emploi
contient du NaOH (<1%), colorant
Tampon de Migration (RB GQ Bordetella) prêt à l’emploi
contient du tampon, NaCl <1%, détergent anionique <1%
Feuille d’évaluation
1
4
1 de chaque
1 de chaque
Mélange d’Amplification A (AM-A GQ Bordetella)
contient du tampon, amorces spécifiques, nucléotides, Taq polymérase
0,15 ml
4x 0,3 ml
Mélange d’Amplification B (AM-B GQ Bordetella)
contient du tampon, sels, colorant
0,53 ml
4x 1,05 ml
ADN Contrôle (C+ GQ Bordetella) prêt à l’emploi
contient de l’ADN bactérien de contrôle, colorant
0,1 ml
0,1 ml
Notice d'utilisation, matrice
Composant du Kit 2 sur 2 (conserver à –20°C)
6
Commandes
Hain Lifescience
réf
GenoQuick® Bordetella VER 2.0 (kit pour l’analyse de 12 échantillons)
313
®
GenoQuick Bordetella VER 2.0 (kit pour l’analyse de 96 échantillons)
31396
GXT NA Extraction Kit
(kit d’extraction automatisée d’ADN pour 96 échantillons à l’aide de GenoXtract)
GenoXtract (automate d’extraction d’ADN - jusqu’à 12 échantillons)
12.08.02
8.31.01
Copan, Brescia, Italie
réf
190C Écouvillon avec milieu amies gélosé, sans charbon,
stérile, capuchon bleu, tige métallique torsadée souple
190C
108C Écouvillon simple avec milieu amies gélosé, sans charbon,
stérile, capuchon bleu, tige plastique
108C
110C Écouvillon avec milieu amies gélosé, sans charbon,
stérile, capuchon orange, tige aluminium
110C
114C Écouvillon simple avec milieu amies gélosé, avec charbon,
stérile, capuchon noir, tige plastique
114C
155C Écouvillon simple sans milieu, stérile, capuchon blanc, tige plastique
155C
168C Écouvillon sans milieu, stérile, capuchon bleu, tige d’aluminium souple
168C
7
Performance Characteristics
Diagnostic performance
Diagnostic performance of the GenoQuick® Bordetella VER 2.0 test was determined in a study with 138 clinical specimens (nasopharyngeal, nasal, and
throat swabs). The swabs were collected with different swab systems, e.g. Copan 190C, 108C, 110C, 114C, 155C, and 168C (Copan; see chapter Ordering
Information). Method of comparison was an in-house test validated by the conducting laboratory for the detection of Bordetellae using the LightCycler
(Roche, Basel, Switzerland).
Manual DNA extraction was performed using the quick method described in chapter DNA Extraction (all 138 specimens). Automated DNA extraction was
additionally carried out with 78 of the 138 specimens using the GXT NA Extraction Kit.
After DNA extraction with the quick method, four invalid results were obtained with the GenoQuick® Bordetella VER 2.0 for samples not collected with the
swab systems mentioned above; these results were disregarded for calculating diagnostic performance characteristics. There were no invalid results after
extraction with the GXT NA Extraction Kit.
Table 1: GenoQuick® Bordetella VER 2.0 in comparison to the in-house test after DNA extraction with the quick method
®
GenoQuick
Bordetella
VER 2.0
PER
PARA
PER+PARA
negative
invalid
total
PER
16
0
0
0
0
16
PARA
0
1
0
0
0
1
In-House Test
PER+PARA
0
0
2
0
0
2
negative
0
0
0
115
4
119
invalid
0
0
0
0
0
0
total
16
1
2
115
4
138
diagnostic sensitivity: 100%
diagnostic specificity: 100%
positive predictive value: 100%
negative predictive value: 100%
PER: Bordetella pertussis; PARA: Bordetella parapertussis
Table 2: GenoQuick® Bordetella VER 2.0 in comparison to the in-house test after DNA extraction with the GXT NA Extraction Kit
®
GenoQuick
Bordetella
VER 2.0
PER
PARA
PER+PARA
negative
invalid
total
PER
16
0
0
0
0
16
PARA
0
1
0
0
0
1
In-House Test
PER+PARA
0
0
2
0
0
2
negativ
0
0
0
59
0
59
invalid
0
0
0
0
0
0
total
16
1
2
59
0
78
diagnostic sensitivity: 100%
diagnostic specificity: 100%
positive predictive value: 100%
negative predictive value: 100%
PER: Bordetella pertussis; PARA: Bordetella parapertussis
Analytical performance
Analytical specificity
The specificity of the GenoQuick® Bordetella is ensured by the accurate design of specific primers and probes which considers, among others, homology
comparisons of all sequences published in gene databases, and by stringent reaction conditions.
The analytical specificity was determined with the following 16 strains: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Enterobacter
aerogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus
mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes.
Bordetella pertussis and B. parapertussis are identified by this test through the IS elements IS481 and IS1001. B. bronchiseptica and B. holmesii potentially
also carry one of these elements and, in this case, cannot be distinguished. The B. bronchiseptica strain (DSM 13414) tested showed a negative result
because it contains none of both.
The B. pertussis and B. parapertussis strains were correctly identified, all other samples were negative. Hence, an analytical specificity of 100% was
achieved.
Analytical sensitivity
For determination of analytical sensitivity, three parallel culture dilutions of one B. pertussis and one B. parapertussis strain were processed with the quick
method for DNA extraction (see chapter DNA Extraction) and analyzed with the GenoQuick® Bordetella VER 2.0. A limit of detection of 10 CFU/reaction was
determined.
Reproducibility
Intra-assay precision
In order to determine the intra-assay precision, two B. pertussis isolates, two B. parapertussis isolates, one negative isolate, and one negative control (water
instead of DNA added to the aliquoted master mix) were set up in four parallels and tested under identical conditions. All parallel samples showed identical
correct results; hence, an intra-assay precision of 100% was achieved.
Inter-assay precision
In order to determine the inter-assay precision, two B. pertussis isolates, two B. parapertussis isolates, one negative isolate, and one negative control (water
instead of DNA added to the aliquoted master mix) were tested at three different points of time. All parallel samples showed identical correct results;
hence, an inter-assay precision of 100% was achieved.
Interfering substances
There are substances that may inhibit PCR reactions. Known inhibitors are, for example, phenol, chloroform, sodium perchlorate, and ethanol. Applying the
recommended DNA extraction method will generate DNA solutions that do not contain any of the mentioned substances in relevant concentrations.
Stability
Stability is determined according to DIN EN 13640.
Shelf life of the GenoQuick® Bordetella test kit when stored as recommended: see box label.
8
References
1. Mattoo S, Cherry JD. Molecular pathogenesis, epidemiology, and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetella pertussis and other
Bordetella subspecies. Clin Microbiol Rev 2005; 18: 326-382.
2. Riffelmann M, Littmann M, Hülße C, Hellenbrand W, Wirsing von König CH. Pertussis: Not only a disease of childhood. Dtsch Arztebl Int 2008; 105: 623628.
3. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 5th edition. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and
Prevention, Atlanta, USA 2009.
4. Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue. Approved guideline.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards), USA, Document M29 (please refer to the
latest version).
Important Changes in IFU-313-05
Chapter
DNA Extraction
several
(especially Amplification)
Detection
several
(especially Evaluation and
Interpretation of Results)
Change
generally revised and restructured:
− former chapter “Methodology“ extended and split in new chapters “Intended Use“ and “Principles of the Procedure“
− former chapter “Storage and Precautions” extended and split in new chapters “Storage and Disposal of Kit
Constituents”, “Precautions for Handling Kit Constituents”, and “Specimen Requirements”
− new chapters: “Summary and Explanation”, “Ordering Information”, “Performance Characteristics”, “References”,
“Important Changes”
The DNA extraction from patient specimens may be automated using the GenoXtract instrument in combination with the
GXT NA Extraction Kit.
In order to obtain a fully reactive master mix, now only two pipetting steps have to be performed combining the two
Amplification Mixes A and B (AM-A and AM-B). They come as Kit Component 2 and must be stored at –20°C. AM-A already
includes Taq polymerase and buffer; hence, the enzyme has not to be purchased and added separately any more.
Furthermore, the amplification profile has been changed.
For detection, the so-called Denaturation Solution (Q-DEN) is added. Detection is carried out in a 1.5 ml screw cap tube at
45°C. In order to avoid contaminations, it is crucial to use separate thermal blocks for detection and DNA extraction.
The GenoQuick® Bordetella VER 2.0 now permits the differentiation of Bordetella pertussis and B. parapertussis strains.
Therefore the dipsticks are coated with an additional probe. The supplied template serves as an aid for evaluation.
9
313-05-03
Y
Hain Lifescience GmbH
Hardwiesenstraße 1, 72147 Nehren, Germany
www.hain-lifescience.de, +49 (0) 74 73- 94 51- 0