1 Usage prévu 2 Description de la méthode employée 3

CAND v.3
1 Usage prévu
5 Stabilité et stockage
RealCycler CAND est un kit de réactifs qui permet la détection
qualitative par PCR en temps réel de l'ADN de Candida sp. en
échantillons cliniques, en utilisant l’appareil SmartCycler® (Cepheid®).
Tous les composants du kit RealCycler CAND doivent être stockés à
-20 °C. Le kit est stable à -20 °C jusqu'à la date limite d' utilisation
qui est inclus dans l'étiquette extérieure.
Le système inclut un contrôle interne d'amplification pour prévenir les
faux négatifs dus à l'inhibition de la réaction.
6 Matériel et équipement additionnel requis
et non-fourni
2 Description de la méthode employée
- Appareil de PCR en temps réel SmartCycler® (Cepheid®).
- Micro centrifugeuse pour tubes SmartCycler®.
- Support de tubes SmartCycler®.
- Système de purification d'ADN.
- Gants jetables.
- Pipettes calibrées.
- Pointes de pipettes à filtre.
- Congélateur (-20 °C).
La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est basée sur
l'amplification d'une région spécifique de l'ADN/ARN en utilisant des
amorces complémentaires de la séquence cible. La PCR en temps
réel utilise des marqueurs fluorescents qui émettent une
fluorescence dans le cas de l'amplification. Le cycle de la PCR dans
lequel apparaît une fluorescence importante est proportionnelle à la
quantité d'ADN/ARN présent dans l'échantillon. Cette valeur est
appelée Cycle Treshold (Ct) ou Cycle Quantification (Cq).
7 Avertissement et précautions
L'amplification de Candida sp. se détecte dans le canal
correspondant an fluorophore FAM et celle du contrôle interne dans
le canal correspondant an fluorophore Alx532.
- Tous les composants du kit doivent être maintenus à faible
température pendant qu'ils sont utilisés.
- Après avoir ajouté l'ADN, mettez en marche immédiatement le
programme d'amplification.
- Les tubes contenant le mélange de réaction ne doivent pas être
exposés trop longtemps à la lumière.
- Décongeler et recongeler plusieurs fois les réactifs peut diminuer la
sensibilité du kit.
- Utiliser des gants jetables.
- Utiliser des pipettes calibrées et des pointes de pipettes à filtre.
- Les essais doivent être menés par du personnel qualifié et
respectant les bons protocoles de laboratoire.
- Il est recommandé de réaliser un contrôle positif et un contrôle
négatif à chaque fois qu'une analyse est réalisée.
- Il est recommandé de réchauffer les tubes pendant 5 minutes à
température ambiante avant de les ouvrir. Dans le cas contraire, le
bouchon pourrait se casser.
- N'utiliser pas le kit après la date limite d'utilisation.
- Usage pour le diagnostic in vitro.
- Cepheid® et SmartCycler® son des marques déposées de Cepheid
Corporation.
- QIAamp est une marque déposée de QIAGEN Group.
- Maxwell® est une marque déposée de Promega Corporation.
- NucliSENS® easyMAG® est une marque déposée de bioMérieux.
3 Spécifications techniques
Sensibilité
Candida sp.: 100 copies/µL.
La sensibilité analytique a été déterminée par la méthode de dilution
limite. La sensibilité a été obtenue lors d'essais répétitifs avec une
reproductibilité supérieure à 95%.
Spécificité
Candida sp.: Internal Transcribed Spacer Regions.
La validation de la spécificité a été réalisée par des essais
expérimentaux et l'analyse BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
4 Composition
RealCycler CAND inclut le mélange de réaction AmpliMix dans des
tubes d'amplification et un Contrôle Positif ADN C. albicans.
8 Echantillons cliniques
Tous les réactifs sont prêts à être utilisés sans avoir à ajouter ou
reconstituer aucun composant.
Composant
Nombre
Volume
AmpliMix
24
18,5 µL
Contrôle Positif
1
60 µL
- Récolter les échantillons dans des tubes stériles.
- Stocker-les et transporter-les congelés à -20 °C jusqu'à utilisation.
9 Procédure
a) Purification des acides nucléiques
L'ADN doit être purifié à partir d'échantillons cliniques utilisant une
procédure appropriée. Il existe sur le marché de nombreux systèmes
de purification d'acides nucléiques. Veuillez réaliser la procédure de
purification en suivant les instructions recommandés par le fabricant
et a partir du volume d’echantillon recommandé.
1
2
Ce kit a été validé en utilisant les systèmes de purification suivant:
e) Example de résultat
● Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification Kit (référence AS1140).
Promega Corporation.
● QIAamp DNA Blood Mini Kit (références 51104, 51106). QIAGEN.
Ce kit peut être utilisé en combinaison avec les systèmes de
purification suivants:
● BioRobot EZ1.QIAGEN.
● QIAcube. QIAGEN.
● NucliSENS® easyMAG®. bioMérieux.
b) Protocole
Programme le protocole d'amplification “CAND” selon les
spécifications suivantes:
Graphique 1 (Chaîne FAM: Candida sp.): Résultat obtenu en
amplifiant un contrôle négatif et un contrôle positif. Contrôle négatif
(A7 en bleu): absence de signal. Contrôle positif (A8 en gris): on
observe un signal avec Ct=29,64.
c) Préparation de la réaction
- Décongeler les tubes AmpliMix nécessaires pour l'amplification des
échantillons et le Contrôle positif.
- Ajouter 9 µL de l'ADN de chaque échantillon ou contrôle à chaque
tube.
- Centrifuger les tubes pour que la réaction aille dans la zone optique
du tube. Vérifier qu'il ne se forme pas de bulles dans la-dite zone.
- Mettre les tubes dans l’appareil.
- Create run > Dye set > FATA25.
- Add/Remove Sites: assigner le protocole “CAND” aux positions
correspondantes aux échantillons et aux contrôles.
- Start Run: mettre en marche le programme d'amplification.
Graphique 2 (Chaîne Alx532: contrôle interne): Résultat obtenu en
amplifiant un contrôle négatif et un contrôle positif. Contrôle négatif
(A7 en bleu): on observe un signal avec Ct=32,41. Contrôle positif
(A8 en gris): on observe un signal avec Ct=32,44.
d) Interprétation des résultats
Afin de valider les résultats, les valeurs Ct obtenues lors du contrôle
positif et des contrôles internes doivent être dans les rangs
spécificités dans l'étiquette interne du kit.
Interpréter le résultat obtenu sur chaque échantillon par rapport à la
combinaison des signaux indiqué dans le tableau suivant:
FAM
Std/Res
Canaux
Alx532
Std/Res
Alx532
Ct
POS
Indifférent
Indifférent
POSITIF
Candida sp.
NEG
POS
Ct dans
les limites
NE SE DÉTECTE
PAS
NEG
POS
Ct hors
des limites
INVALIDE
NEG
NEG
0,00
INVALIDE
10 Contrôle de qualité
Chaque lot du kit RealCycler CAND a été testé selon les
spécifications de la PCR en temps réel en utilisant l’appareil
SmartCycler® (Cepheid®).
Interprétation
Date de publication: Juillet, 2013.
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