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Mémoire DEA_FOFANA S
BURKINA FASO *********** UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE EN SCIENCES DE LA SANTE (UFR / SDS) ******************** TROISIEME CYCLE SPECIALISE ET DOCTORAL Année universitaire : 2010 – 2011 Mémoire n°…… Etude des effets antiradicalaires et anti-lipooxygenases des extraits de Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) MEMOIRE Présenté et soutenu publiquement le 30 juin 2011 Par : FOFANA SOULEYMANE (Docteur en pharmacie) Pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Approfondies en pharmacologie appliquée JURY Directeurs de Mémoire Président Pr. Ag. Elie KABRE Membres Dr. Moussa OUEDRAOGO Pr. Jean-Baptiste NIKIEMA Pr Jacques SIMPORE Co-directeur Dr. Charlemagne GNOULA Dr. Charlemagne GNOULA DEDICACES Nous dédions ce travail : A toutes les familles FOFANA, KAM, PODA, BA, CISSE, KONATE : pour votre soutien moral inconditionnel et inestimable A tous mes frères, sœurs et cousin(e)s : Jules, Mariam, Abdou, Marc, Sali, Yéli, Maimouna, Siéguelbou, Dia, Maurice A tous mes ami(e)s : Las, Noufou, Zida, Sangaré, Aymar, Moumouni (Morè), Yaogo, Osara, Emile, Dimitri, Richard (ORL), Mady (Winner), Kaf, Pata, Valé (valériaquine), Zéinab, Sylvia, Atou, Serge, Maho, Frank Zongo (Frapether), Nicole GUISSOU. A tous les internes des hôpitaux du Burkina Faso A tous ceux qui de près ou de loin ont participé à l’aboutissement de ce travail vii REMERCIEMENTS La réalisation de ce travail n’a été possible que grâce à la disponibilité et à la sincère collaboration de certaines bonnes volontés. A cet effet, nous voudrions exprimer notre profonde gratitude : - Au Directeur de la tutelle des hôpitaux publics et du sous-secteur sanitaire privé. Vous avez supporté mes frais d’inscription au DEA de Pharmacologie Appliquée. - Au Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA), le Professeur Jacques SIMPORE. Vous nous avez offert gracieusement tous les réactifs et le cadre de travail. Merci pour tous les soutiens multiformes. - Au Coordonnateur du 3ème cycle spécialisé et doctoral en pharmacologie et Toxicologie de l’UFR / SDS, le Professeur Innocent Pierre GUISSOU. Vous avez accepté notre inscription à la présente formation doctorante. Cher Maître, merci pour tout. - A tout le personnel du CERBA en particulier M. Désiré, M. Moret, le Père Jean De Dieu. Merci pour votre collaboration. - A tout le personnel de l’IRSS en particulier M. YARO, M. Noufou OUEDRAOGO, Dr Sylvain OUEDRAOGO, Dr Félix KINI, Dr Richard SAWADOGO - A tous les étudiants du CERBA en particulier Jacquéline KOUAME, Saya N’GUESSAN, Florence OUEDRAOGO, Aziz KHINDO, Issa TONDE, Martial CONGO, Sounoungou HETIE, Valery BAZIE. - A Monsieur Moussa OUEDRAOGO. Maître-Assistant en Pharmacologie à l’UFR / SDS Université de Ouagadougou. - A Monsieur COULIBALY Ahmed. Doctorant en Biochimie à l’UFR/SVT (LABIOCA). - A Dr KOANDA Abdoulaye et à Dr. SISSOKO Sonia, pharmaciens-chefs d’unités du service de la Pharmacie Hospitalière du CHU YO. Merci pour votre compréhension et vos soutiens. A notre Maître et Directeur de Mémoire : Le Professeur Jean-Baptiste NIKIEMA Professeur Titulaire de Pharmacognosie à l’UFR / SDS Université de Ouagadougou Honorable Maître, nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faites en acceptant de diriger ce travail. Nous avons le privilège de bénéficier de vos enseignements clairs, précis et pleins de sciences. Nous gardons de vous l’image d’un homme de sciences rigoureux, appliqué et attaché au travail bien fait. Veuillez trouver ici cher Maitre, l’expression de notre plus grand respect A notre Maître et Directeur de Mémoire Le Professeur Jacques Simporé Professeur Titulaire de Génétique et de Biologie moléculaire UFR / SVT Université de Ouagadougou Honorable Maître, c’est un privilège d’avoir mené nos travaux de recherche dans votre Centre de recherche. Tout au long ce travail vous n’avez eu de cesse de nous encourager. Au cours de notre formation théorique au DEA, nous avons bénéficié de vos enseignements clairs et bien élaborés. Nous avons été marqués par vos qualités exceptionnelles de pédagogue. Votre rigueur scientifique et votre humanisme n’ont d’égal que votre générosité et votre modestie. Recevez Cher Maître, l’expression de notre profonde gratitude A notre Maître et Président de jury Le Professeur Agrégé Elie KABRE Maître de Conférence Agrégé en Biochimie à l’UFR / SDS Université de Ouagadougou Honorable Maître, nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faites en acceptant de présider ce jury. Nous avions bénéficié et nous bénéficions toujours de vos enseignements clairs et précis. Nous avions eu la chance de profiter de vos grandes connaissances en biochimie au cours de notre internat des centres hospitaliers universitaires. Nous gardons de vous l’image d’un grand homme de sciences, rigoureux et attaché au travail bien fait.. Vous resterez toujours pour nous un modèle d’homme, une référence. x A notre Maître et Juge Le Docteur Moussa OUEDRAOGO Maître-Assistant de Pharmacologie à l’UFR / SDS Université de Ouagadougou Honorable Maître, nous vous remercions pour avoir accepté de faire partie de ce jury. Vos nombreuses connaissances en pharmacologie nous permettront sans aucun doute d’améliorer ce travail. Vous êtes pour nous plus qu’un enseignant. Nous avions bénéficié non seulement de vos enseignements pendant notre formation de base, au DEA mais aussi et surtout de vos nombreux et précieux conseils. Nous gardons de vous, l’image d’un grand homme de science, très travailleur, rigoureux et appliqué. Votre simplicité, votre générosité et votre sens d’être toujours disponible pour les autres, sont quelques unes de vos nombreuses qualités qui font de vous un des Maîtres les plus respectés de notre UFR. Vous nous aviez beaucoup aidés et nous vous en saurons gré infiniment. A notre Maître et Co-directeur Le Docteur Charlemagne GNOULA. Maître Assistant en Chimie Thérapeutique à l’UFR / SDS Université de Ouagadougou Honorable Maître, vous avez initié et dirigé ce travail et m’avez permis de le mener à terme. Nous avions bénéficié de vos nombreuses connaissances et vos conseils tout au long de ce travail. Vous aviez été et vous resterez toujours pour nous plus qu’un encadreur. Nous avons été marqués par vos qualités humaines et votre sens d’échange. Nous gardons de vous l’image d’un grand homme de science, rigoureux et un infatigable travailleur. Ce travail est le vôtre. Vous resterez toujours pour nous un grand homme de science, une référence. Je vous prie d’accepter l’expression de ma sincère reconnaissance. xi Par délibération, l’UFR/SDS a arrêté que les opinions émises dans les dissertations qui seront présentées doivent être considérées comme propres à leurs auteurs et qu’elle n’entend leur donner aucune approbation ni improbation. xii TABLE DES MATIERES INTRODUCTION – ENONCE DU PROBLEME .................................................................................................. 1 PARTIE I : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ..................................................................................................... 3 I. Les radicaux libres ............................................................................................................................................. 3 I.1. Définition et nature des radicaux libres ............................................................................................................. 3 I.2. La production des radicaux libres ...................................................................................................................... 3 I.3. Rôles physiologiques des radicaux libres .......................................................................................................... 6 I.4. Le stress oxydatif et les processus physiopathologiques ................................................................................... 7 I.4.1. la cytotoxicité des radicaux libres ............................................................................................................... 7 I.4.2. les implications des radicaux libres dans les processus pathologiques ....................................................... 9 I.5. Les systèmes de défense antiradicalaire ........................................................................................................... 10 I.5.1. Les systèmes enzymatiques de défense antiradicalaire ............................................................................. 10 I.5.2. Les systèmes non enzymatiques de défense antiradicalaire ...................................................................... 12 I.6. Quelques méthodes d’évaluation du potentiel antioxydant d’un produit ......................................................... 16 I.6.1. Le test de réduction du radical stable, le DPPH° ...................................................................................... 16 I.6.2. Le test TEAC de réduction du radical-cation ABTS+° ............................................................................. 17 I.6.3. Les Tests de capture des radicaux peroxyles : ORAP et TRAP................................................................ 18 I.6.4. Le test Rancimat........................................................................................................................................ 19 I.6.5. Le test de β-carotène ................................................................................................................................. 19 I.6.6. Le test FRAP ............................................................................................................................................. 20 I.6.7. Les tests d’inhibition de l’oxydation des lipides ....................................................................................... 20 II. Les lipooxygénases ........................................................................................................................................ 22 II.1. Définition ........................................................................................................................................................ 22 II.2. Rôles physiologiques des lipooxygénases ...................................................................................................... 22 II.2.1. La 12-lipooxygenase ................................................................................................................................ 22 II.2.2. La 15-lipoxygenase. ................................................................................................................................. 23 II.2.3. La 5-lipoxygenase .................................................................................................................................... 24 II.3. Les Rôles des lipooxygénases dans les processus pathologiques ................................................................... 24 II.3.1. les lipooxygénases et la production des radicaux libres .......................................................................... 24 II.3.2. les lipooxygénases et les maladies inflammatoires .................................................................................. 24 II.3.3. les lipooxygénases et les cancers humains............................................................................................... 24 II.3.3. les lipooxygénases et l’athérogénèse ....................................................................................................... 25 III. Données bibliographiques sur Erythrina senegalensis DC ............................................................................. 27 III.1. Dénominations locales : ................................................................................................................................ 27 III.2. Classification de la plante d’étude ................................................................................................................. 27 xiii III.3. Habitat ........................................................................................................................................................... 27 III.4. Description botanique de la plante d’étude ................................................................................................... 27 III.5. Données ethnopharmacologiques .................................................................................................................. 28 III.6. Données phytochimiques et pharmacologiques établies .............................................................................. 29 II.6.1. les composés antibactériens, antiviraux et antiparasitaires ...................................................................... 29 III.6.2. les composés cytotoxiques ..................................................................................................................... 30 III.6.3. les composés ayant d’autres activités ..................................................................................................... 30 III.7. Données toxicologiques................................................................................................................................. 30 PARTIE II : NOTRE ETUDE ................................................................................................................................ 32 I. Objectifs de l’étude ........................................................................................................................................... 32 I.1. Objectif général ................................................................................................................................................ 32 I.2. Objectifs spécifiques: ....................................................................................................................................... 32 II. METHODOLOGIE...................................................................................................................................... 33 II.1. Cadre de l’étude ........................................................................................................................................... 33 II.1.1. Le CERBA ............................................................................................................................................... 33 II.1.2. L’IRSS / MEPHATRA-Pharmacie .......................................................................................................... 33 II.2. Matériel de l’étude ....................................................................................................................................... 34 II.2.1. le matériel végétal .................................................................................................................................... 34 II.2.2. le matériel pour l’extraction et la caractérisation phytochimique ............................................................ 34 III.2.3. Matériels pour les études pharmacologiques .......................................................................................... 36 II.3. Méthode d’étude ........................................................................................................................................... 36 II.3.1. La méthode d’extraction .......................................................................................................................... 36 II.3.2. Méthode de détermination du taux d’humidité résiduelle de la drogue et des rendements d’extraction......................................................................................................................................................... 37 II.3.3. La méthode des caractérisations phytochimiques .................................................................................... 38 II.3.4. Le test d’évaluation de l’effet antiradicalaire des extraits ....................................................................... 43 II.3.5. Le test d’évaluation de l’effet anti-lipooxygénase ................................................................................... 44 II.3.6. Expression et analyse des données .......................................................................................................... 45 III. RESULTATS DE L’ETUDE ....................................................................................................................... 46 III.1. Les teneurs en humidité relative (THR) ................................................................................................... 46 III.2. Les rendements d’extractions ................................................................................................................... 46 III.3. La caractérisation des groupements phytochimiques ............................................................................. 47 III.3.1. les réactions colorées en tube ................................................................................................................. 47 III.3.2. La chromatographie sur couche mince (CCM) ...................................................................................... 48 III.4. L’effet antiradicalaire des extraits ............................................................................................................ 56 xiv III.4.1. les effets antiradicalaires des extraits de feuilles .................................................................................... 56 III.4.2. les effets antiradicalaires des extraits d’écorces ..................................................................................... 57 III.4.3. les effets antiradicalaires des extraits de racines entières ....................................................................... 58 III.4.4. Le récapitulatif des effets antiradicalaires des extraits par épuisement successif d’E. senegalensis DC. ................................................................................................................................................ 59 III.5. L’effet inhibiteur de la lipooxygénase des extraits................................................................................... 60 III.5.1. Les tests préliminaires à la concentration de 100 µg/mL de l’extrait ..................................................... 60 III.5.2. Les extraits à effets anti-lipooxygénase non doses-dépendants ............................................................. 61 III.5.3. Les extraits à effets anti-lipooxygénase doses-dépendants ................................................................... 63 III.5.4. Récapitulatif des effets inhibiteurs de la 12-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC. ..................................................................................................................................................................... 64 III.6. Récapitulatif des effets inhibiteurs du DPPH et de la 12-LOX des extraits d’E. senegalensis DC. .................................................................................................................................................... 65 IV. DISCUSSIONS / COMMENTAIRES ........................................................................................................ 66 IV.1. Les teneurs en humidité relative (THR) ........................................................................................................ 66 IV.2. Les rendements d’extractions ....................................................................................................................... 66 IV.3. Les caractérisations phytochimiques ............................................................................................................. 67 IV.4. L’effet antiradicalaire des extraits d’E. senegalensis DC ............................................................................. 69 IV.5. L’effet anti-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC ...................................................................... 72 IV.6. Les effets antiradicalaires et anti-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC .................................... 73 CONCLUSION ......................................................................................................................................................... 75 PERSPECTIVES DE L’ETUDE ............................................................................................................................ 76 RÉFÉRENCES ......................................................................................................................................................... 77 xv Liste des tableaux Page Tableau I Les principales formes réactives de l’oxygène 3 Tableau II les taux moyens d’humidité relative des poudres des drogues végétales 46 Tableau III Le rendement des extractions en fonction des solvants et des drogues. 46 Tableau IV Les groupes phytochimiques mis en évidence dans les extraits d’E. senegalensis DC selon les parties de la plantes 47 Tableau V Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des flavonosides et aglycones flavoniques 49 Tableau VI Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des coumarines et dérivés 51 Tableau VII Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des tanins 52 Tableau VIII Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des saponosides 53 Tableau IX Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des glucosides stéroidiques & triterpéniques, des stérols & triterpènes 55 Tableau X Les effets antiradicalaires doses-dépendants des extraits de feuilles 56 Tableau XI Les effets antiradicalaires doses-dépendants des extraits d’écorces de tronc d’E. senegalensis DC 57 Tableau XII Les effets antiradicalaires doses-dépendants des extraits de racines d’E. senegalensis DC 58 Tableau XIII Le récapitulatif des effets antiradicalaires des extraits par épuisement successif d’E. senegalensis DC. 59 Tableau XIV Les effets inhibiteurs des extraits d’E. senegalensis DC à la dose de 100µg/mL 60 Tableau XV Les effets non doses-dépendants des extraits d’E. senegalensis DC 61 Tableau XVI Les effets inhibiteurs doses-dépendants de la 12-lipooxygénase des extraits de racines d’E. senegalensis DC 61 Tableau XVII Les effets inhibiteurs doses-dépendants de la 12-lipooxygénase des extraits d’écorces de tige d’E. senegalensis DC 62 Tableau XVIII Le récapitulatif des effets inhibiteurs de la 12-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC 62 Tableau XIX Le récapitulatif des meilleurs potentiels antiradicalaire et inhibiteurs de la 12-lipooxygénase 63 xvi Liste des figures Page Figure 1 Les principaux mécanismes de genèse et de cytotoxicité des radicaux libres 4 Figure 2 Le mécanisme d’oxydation de la guanine par le radical hydroxyl 8 Figure 3 La structure chimique de la vitamine E 13 Figure 4 La structure chimique des caroténoïdes 14 Figure 5 La structure chimique de la vitamine C 15 Figure 6 Les structures des différentes classes de polyphénols. 15 Figure 7 La structure chimique de la quercétine 16 Figure 8 La réaction de réduction du radical DPPH° 17 Figure 9 La réduction de l’ABTS par le Trolox 18 Figure 10 Les structures de quelques inhibiteurs connus de la 15-lipoxygénase 26 Figure 11 Les parties d’Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) 28 Figure 12 La révélation des aglycones flavoniques et des flavonosides 48 Figure 13 La révélation des coumarines et des dérivés coumariniques 50 Figure 14 La révélation des tanins 52 Figure 15 La révélation des saponosides 53 Figure 16 La révélation des stérols & triterpènes et leurs glucosides 54 Liste des photos Page Photo 1 Les écorces de tronc d’E. senegalensis DC (Fabaceae) 28 Photo 2 Les jeunes feuilles d’E. senegalensis DC (Fabaceae) 28 Photo 3 La plante entière d’E. senegalensis DC (Fabaceae) 28 Photo 4 Chromatogramme montrant la révélation des aglycones flavoniques 48 Photo 5 Chromatogramme montrant la révélation des flavonosides 48 Photo 6 Chromatogramme montrant la révélation des coumarines 50 Photo 7 Chromatogramme montrant la révélation des dérivés coumariniques 50 Photo 8 Chromatogramme montrant la révélation des tanins 52 xvii Photo 9 Chromatogramme montrant la révélation des saponosides 53 Photo 10 Chromatogramme montrant la révélation des stérols & triterpènes 54 Photo 11 Chromatogramme de révélation des glucosides stéroidiques & triterpéniques 54 Liste des abréviations et sigles % Pourcentage µg Microgramme µL Microlitre µM Micromolaire AAPH 2,2’-azobis-(2-amidinopropane) dihydrochlorure ABTS Acide 2,2’-azino-bis (3-éthylbenzthiazoline-6-sulphonique) EtOAc Extrait à l’acétate d’éthyle ADN Acide désoxyribonucléique AMPc Adénosine monophosphate cyclique AQ Extrait aqueux ATP Adénosine triphosphate BHA Butyl hydroxy anisole BHT Butyl hydroxy toluène CCM Chromatographie sur couche mince CD Cluster of differentiation CERBA Centre de Recherche Biomoléculaire Piétro Annigoni CHU YO Centre Hospitalier Universitaire Yalgado OUEDRAOGO cm Centimètre CMI Concentration minimale inhibitrice CNRST Centre National de Recherche Scientifique et Technologique COX Cyclooxygénase DCM Extrait au dichlorométhane xviii DL Dose létale DMSO Dimethylsulfoxide DPPH 1,1-diphényl 2-picrylhydrazyl EGF Epidermal growth factor EGF-R Epidermal growth factor receptor FRAP Ferric reducing Ability of Plasma FRO Forme réactive de l’oxygène g Gramme Gpx Glutathion peroxydase h Heure H2O2 Peroxyde d’hydrogène HETE Acide Hydroxyéicosatétranoique HPETE Acide Hydroperoxyéicosatétranoique IC50 Inhibitory Concentration 50 (Concentration inhibitrice 50%) IGF Insulin like growth factor ip Intrapéritonéale IRSS Institut de Recherche en Sciences de la Santé Kg Kilogramme Km Kilomètre LDL Lipoproptéine de densité légère LOX Lipooxygénase MeOH Extrait méthanolique MEPHATRA/PH Médecine-Pharmacopée Traditionnelle / Pharmacie min Minute mL Millilitre mm Millimètre NAD Nicotinamide adénosine diphosphate nm Nanomètre xix NO° Oxyde nitrique NOS Oxyde nitrique synthétase O2°- Anion superoxyde OH° Radical hydroxyl ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity PDGF Platelet derivated growth factor PTME Prévention de la Transmission de la mère à l’enfant Rf Référence frontale RL Radicaux libres RX Rayons ionisants SEM Erreur standard sur la moyenne SIDA Syndrome de l’immunodéficience acquise SOD Super oxyde dismutase TEAC Trolox Equivalent antioxydant capacity TGF Tumor growth factor TGFα Transforming growth factor THR Teneur en humidité résiduelle TNF Tumor necrosis factor TRAP Total Radical Trapping Antioxydative Potential Trolox Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique UV Ultra violet VEGF vascular endothelial growth factor VEGF-R vascular endothelial growth factor receptor VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine xx INTRODUCTION – ENONCE DU PROBLEME Les radicaux libres sont des espèces chimiques très réactives capables d’attaquer et de détruire tous les composants des cellules de l’organisme : l’ADN, les protéines, les lipides et les glucides…etc [1]. Ils peuvent s’accumuler dans les cellules et entrainer le stress oxydatif [1]. Le stress oxydatif peut être la cause initiale de nombreuses pathologies comme le cancer, la cataracte, la sclérose latérale amyotrophique, le syndrome de détresse respiratoire aigu et l’œdème pulmonaire [2]. Il peut aussi aggraver ou potentialiser le processus initial d’autres maladies comme les maladies cardiovasculaires, le diabète, la maladie d’Alzheimer, les rhumatismes et le SIDA [2]. Au regard du danger que constituent les radicaux libres, des systèmes de défense antiradicalaire, enzymatiques ou non sont mis en jeu. Ces systèmes ont pour buts d’éliminer les radicaux libres ou d’empêcher leur formation ou encore de réparer les tissus cellulaires endommagés [2]. Les systèmes enzymatiques sont essentiellement endogènes et comprennent la superoxyde dismutase (SOD), la catalase et la glutathion péroxydase (Gpx) [2]. Les systèmes de défense non enzymatiques sont exogènes, apportés par une alimentation saine et complète [3]. Ils comprennent les oligo-éléments (cuivre, zinc, sélénium, magnésium et manganèse), les vitamines (A, C, E), l’acide urique, les composés à groupement thiol et les polyphénols issus des fruits et légumes [2]. Cependant, les systèmes de défense sont parfois vite débordés surtout lorsque les agressions sont multipliées sous l’effet de la fumée de tabac, de la pollution, du soleil, d’un effort physique intense, etc [2]. Aussi, dans des situations d’hyperactivité d’enzymes oxydants telles que les lipooxygénases ou les cyclooxygénases ainsi que dans des cas d’apport alimentaire insuffisant, il apparait un déséquilibre en faveur du stress oxydatif dû aux radicaux libres conduisant à des pathologies [3]. Pour prévenir la survenue de ces pathologies, il est important de renforcer la capacité de l’organisme à contrebalancer le stress oxydatif par des interventions pharmacologiques ou nutritionnelles. A cet effet, des antioxydants synthétiques tels que le butyl hydroxy-anisole (BHA) et le butyl hydroxy-toluène (BHT) ont été proposés mais leur utilisation reste controversée de nos jours à cause de leurs effets tératogènes et mutagènes [4]. De nombreuses études montrent que les antioxydants les mieux tolérés par l’organisme et les plus efficaces proviennent des végétaux [2]. Il s’agit des flavonoides, des tanins, des alcaloides…etc qui peuvent non seulement piéger les radicaux libres mais aussi inhiber certaines enzymes oxydants comme les cyclooxygénases et les lipooxygénases [5]. 1 Les plantes médicinales du Burkina Faso, dont Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) sont très riches en principes phytochimiques bioactifs (flavonoides, tanin, coumarines) [6]. Ce qui témoigne l’utilisation des extraits de Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) par les tradipraticiens de santé dans le traitement de la fatigue, de l’aménorrhée, des fibromes et des maladies vénériennes [6]. Malheureusement, les études sur les propriétés anti-oxydantes des extraits d’Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) sont rares. C’est pourquoi, le but du présent travail est d’étudier les propriétés anti-oxydantes des extraits d’Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) en évaluant leurs effets antiradicalaires et inhibiteurs des lipooxygénases pour un intérêt certain de trouver des composés susceptibles de prévenir ou de guérir le cancer, les maladies cardiovasculaires, le rhumatisme et le diabète. 2 PARTIE I : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES I. Les radicaux libres I.1. Définition et nature des radicaux libres Les radicaux libres (RL) sont des espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possèdent un électron non apparié sur la couche électronique externe [7]. Parmi toutes les espèces radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, on distingue un ensemble restreint de composés radicalaires qui jouent un rôle particulier en physiologie appelés radicaux primaires. Les autres radicaux libres, dits radicaux secondaires, se forment par réaction de ces radicaux primaires sur les composés biochimiques de la cellule. Les radicaux primaires dérivent soit de l'oxygène par des réductions à un électron tels l'anion superoxyde O2•- et le radical hydroxyle OH•, ou soit de l'azote tel le monoxyde d'azote NO• [8]. D'autres espèces dérivées de l'oxygène dites espèces actives de l'oxygène, comme l'oxygène singulet 1O2, le peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou le nitroperoxyde (ONOOH), ne sont pas des radicaux libres, mais sont aussi réactives et peuvent être des précurseurs de radicaux. L'ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs est appelé espèces ou formes réactives de l'oxygène (FRO) (Tableau I). Tableau I : Les principales formes réactives de l’oxygène Radicaux libres Espèces à l'origine de radicaux libres O2°- : radical anion superoxyde 1 OH°: radical hydroxyle H2O2 : peroxyde d'hydrogène HO2° : radical perhydroxyle ROOH : hydroperoxyde O2 : oxygène singulet RO° : radical alkoxyle (carbonyle excité) ROO° : radical peroxyle I.2. La production des radicaux libres Les radicaux libres proviennent de divers mécanismes endogènes comme exogènes (figure 1). a. Les petites molécules cytoplasmiques : Les catécholamines, les flavines, les tétrahydroptérines, les quinones et les molécules à groupement thiol sont des molécules dissoutes dans le cytosol. Par une auto-oxydation, ils participent au cycle d’oxydo-réduction de la cellule. Cette auto-oxydation entraine la production de formes réactives de l’oxygène [3]. 3 Figure 1 : les principaux mécanismes de genèse et de cytotoxicité des radicaux libres Source : d’après Favier A. et al. (2003) [2] b. Les protéines cytoplasmiques : L’activité de certains enzymes cytoplasmiques génèrent des radicaux libres oxygénés. On peut citer la xanthine oxydase, l’aldéhyde déshydrogénase et la méthémoglobine réductase [3]. c. Les enzymes membranaires : Les lipooxygénases et les cyclooxygénases catalysent les réactions de synthèse des leucotriènes, des prostaglandines et des thromboxanes. Cette synthèse s’accompagne de production de formes réactives de l’oxygène destinées à assurer un rétrocontrôle négatif sur la synthèse [3]. La cyclooxygénase participe également à la biotransformation de certains xénobiotiques dont les métabolites sont susceptibles de réagir avec l’oxygène pour produire des formes oxygénées très réactives [3]. L'inflammation est par ailleurs une source importante de radicaux oxygénés produits directement par les cellules phagocytaires activées qui sont le siège d'un phénomène appelé explosion oxydative (« burst oxidatif»). Il consiste en l'activation du complexe de la NADPH oxydase, enzyme capable d'utiliser l'oxygène moléculaire pour produire de grandes quantités d'anions superoxydes au niveau de la membrane cellulaire. Ce mécanisme, lorsqu'il est 4 contrôlé, est capital dans la lutte anti-infectieuse car il permet la phagocytose des bactéries et des corps étrangers. Une autre espèce radicalaire, le monoxyde d'azote, est elle aussi produite par les systèmes enzymatiques que sont les différentes NO synthases (ou NOS), à des fins de médiation par les neurones, les cellules endothéliales ou les macrophages. La production concomitante dans un même lieu de •NO et de superoxyde s'avère très dommageable en donnant naissance au peroxynitrite. d. Les peroxysomes : Ce sont des structures qui ont une grande capacité de former le peroxyde d’hydrogène (H2O2). En effet les peroxysomes concentrent de nombreuses oxydases comme la glycollate oxydase ou D-amino acide oxydase, capables de catalyser la réduction de la molécule de dioxygène sans former de radical libre superoxyde [3]. e. Le système de transport mitochondrial d’électron : La cytochrome c oxydase est le principal support de ce type de transport. Elle catalyse la réduction du dioxygène (O2) en eau (H2O) par acquisition de deux (2) électrons et de deux (2) protons. Le système permet d’éviter la formation excessive de formes oxygénées intermédiaires (radicaux superoxydes). La production peut s'amplifier lorsque la respiration devient plus intense (effort physique, hyperoxie), ou lorsqu’interviennent des désordres inflammatoires (effet du TNF α) ou nutritionnels (carence en ubiquinone), qui augmentent avec l’âge. En plus de la cytochrome c oxydase, on retrouve dans le système de transport mitochondrial d’électron, l’ubiquinone et la NADH déshydrogénase dont l’auto-oxydation produit les radicaux superoxydes [3]. f. Le système de transport microsomial d’électron : Ce système comporte essentiellement les cytochromes P450 et b5 qui catalysent des réactions d’oxydations. Ils génèrent des radicaux libres oxygénés durant l’oxydation des composés tels que les médicaments, les résidus de la fumée de cigarette et l’alcool. La cytochrome réductase qui intervient dans le rétablissement de leur cycle redox produit lui aussi des radicaux libres oxygénés [3]. 5 g. Les métaux toxiques : Le chrome, le cuivre, le vanadium, mais aussi le cuivre et le fer libres (existant lors de surcharges générales ou localisées) génèrent des radicaux hydroxyles, très réactifs, à partir de l'espèce peu réactive H2O2, par une réaction appelée réaction de Fenton [2]. h. Les particules inhalées : L’amiante et la silice sont aussi des sources de radicaux libres, d'une part parce qu'elles exacerbent la phagocytose, d'autre part parce que leur surface est tapissée de sels de fer [2]. i. Les rayonnements Ils sont capables de générer des radicaux libres, soit en scindant la molécule d'eau lorsqu'il s'agit des rayons ionisants X ou γ, soit en activant des molécules photosensibilisantes lorsqu'il s'agit des rayons ultraviolets qui vont par ce mécanisme produire des anions superoxydes et de l'oxygène singulet [2]. I.3. Rôles physiologiques des radicaux libres Tous les radicaux libres de l'oxygène ne sont pas extrêmement réactifs. La réactivité est très variable selon la nature du radical [2]. Ainsi parmi les radicaux formés chez les êtres vivants, l'anion radicalaire superoxyde (O2•-) comme le monoxyde d'azote (•NO) ne sont pas très réactifs, mais constituent des précurseurs d'autres espèces plus réactives [2]. La faible réactivité de ces deux radicaux permet d'ailleurs leur utilisation par l'organisme comme médiateurs régulant des fonctions biologiques telles la vasodilatation capillaire, la prolifération et la différentiation cellulaire, la fécondation de l’ovule, l’induction des gènes antioxydants (SOD-Mn, catalase, ferritine) et des gènes impliqués dans les réponses immunitaires. En revanche, des radicaux comme les radicaux peroxyles (ROO•) ou surtout le radical hydroxyle (HO•) sont extrêmement réactifs, et ce avec la plupart des molécules des tissus vivants. Ces radicaux libres de l'oxygène ou de l'azote, même réactifs, ne sont pas uniquement toxiques ; au contraire, ils sont produits par divers mécanismes physiologiques afin de détruire des bactéries au sein des cellules phagocytaires (macrophages, polynucléaires) ou pour réguler des fonctions cellulaires létales telle la mort cellulaire programmée ou apoptose [2] ou pour assurer un rétrocontrôle négatif sur l’activité de certains enzymes comme la lipooxygénase et la cyclooxygénase [3]. 6 I.4. Le stress oxydatif et les processus physiopathologiques I.4.1. la cytotoxicité des radicaux libres La production excessive de radicaux libres provoque des lésions directes de molécules biologiques (oxydation de l'ADN, des protéines, des lipides, des glucides), mais aussi des lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des métabolites libérés notamment lors de l'oxydation des lipides [3]. L'organisme peut aussi réagir contre ces composés anormaux par production d'anticorps, qui malheureusement peuvent aussi être des auto-anticorps créant une troisième vague d'attaque chimique [3]. a. L’attaque radicalaire des lipides : Les lipides et principalement leurs acides gras polyinsaturés sont la cible privilégiée de l'attaque par le radical hydroxyle capable d'arracher un hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles liaisons, pour former un radical diène conjugué, oxydé en radical peroxyle [3]. Cette réaction appelée peroxydation lipidique forme une réaction en chaîne car le radical peroxyle formé se transforme en peroxyde au contact d'un autre acide gras qui forme un nouveau radical diène conjugué [9]. Le radical peroxyle, après évolution en un peroxyde cyclique et coupure de la molécule, peut libérer différentes aldéhydes toxiques dont le malonaldialdéhyde ou l'hydroxynonenal. L’attaque des lipides peut concerner les lipoprotéines circulantes ou les phospholipides membranaires. Les conséquences seront différentes : d’abord, l'attaque des lipides circulants aboutit à la formation de LDL (lipoprotéines de densité légère) oxydées qui, captées par des macrophages, formeront le dépôt lipidique de la plaque d'athérome des maladies cardiovasculaires [3]. Ensuite, l'attaque des phospholipides membranaires modifie la fluidité de la membrane et donc le fonctionnement de nombreux récepteurs et transporteurs et la transduction des signaux [3]. b. L’attaque radicalaire des protéines : Les protéines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout celles qui comportent un groupement sulfhydryle (SH) [3]. C’est le cas de nombreuses enzymes cellulaires et protéines de transport qui vont ainsi être oxydées et inactivées. D’autres lésions irréversibles conduisent à la formation d'un intermédiaire radicalaire. Les protéines peuvent alors soit subir des réticulations par formation notamment de ponts bi-tyrosine, soit subir des coupures en cas d'agression forte, soit des modifications de certains acides aminés en cas d'agressions 7 modérées. Les protéines modifiées par oxydation perdent leurs propriétés biologiques (enzyme, anti-enzyme, récepteur...) et deviennent beaucoup plus sensibles à l'action des protéases et notamment du protéasome [2,3]. Les protéines oxydées deviennent aussi très hydrophobes, soit par suppression de groupements amines ionisables, soit par extériorisation de zones hydrophobes centrales. Elles vont alors former des amas anormaux dans ou autour des cellules [2, 3]. Ces amas, associés aux lipides, forment les dépôts de lipofuschines caractéristiques des tissus des sujets âgés. c. L’attaque radicalaire des acides nucléiques : L'ADN est une molécule très sensible à l'attaque par les radicaux de l'oxygène. Cinq classes principales de dommages oxydatifs médiés par OH• peuvent être générées. Ce sont : les bases oxydées, les sites abasiques, des adduits intra-caténaires, des cassures de brins et des pontages ADN-protéines [10]. Les bases qui composent l'ADN, et particulièrement la guanine, sont sensibles à l'oxydation. L'attaque radicalaire peut être directe et entraîner l'oxydation des bases, engendrant un grand nombre de bases modifiées : 8 oxo guanine, 8 nitro guanine, formamidopyrimidine, 8 oxo adénine, formimido uracile, 5 hydroxy cytosine, 5 hydroxy méthyl uracile, thymine diol, oxazolone [2, 3, 10]. Mais le stress oxydant peut aussi attaquer la liaison entre la base et le désoxyribose, créant un site abasique, ou attaquer le sucre lui-même, créant une coupure de chaîne simple brin. Figure 2 : le mécanisme d’oxydation de la guanine par le radical hydroxyl Source : d’après. VALKO, M et al. (2005) [11] Des dommages indirects peuvent résulter de l'attaque des lipides dont la peroxydation génère des aldéhydes mutagènes, formant des adduits sur les bases de l'ADN de type malondialdéhyde β-hydroxyacroléine – guanine (MDA-guanine) ou éthénodérivés [3]. L'attaque radicalaire des protéines de l'ADN entraîne des pontages des protéines ou des adduits sur des bases de type lysinoguanine. On attend par protéines de l’ADN, l’ensemble formé par les histones, les enzymes et facteurs de réplication et de transcription de l’ADN. 8 Les lésions non réparées vont perturber les mécanismes de réplication de l'ADN et entraîner soit des erreurs de lecture et de synthèse par des ADN polymérases translésionelles infidèles [3]. Ceci aboutit soit à une mutation ponctuelle dans le génome, soit à une impossibilité de copie de l'ADN qui aboutira à l’apoptose. Enfin, cette modification de l'ADN induit des mutations par transversions GC (guanine/cytosine) vers TA (thymine/adénine) souvent observées spontanément dans les cellules cancéreuses [3]. Ces sont les premières étapes de la carcinogenèse et ce n'est pas une coïncidence si les agents carcinogènes sont tous des générateurs puissants de radicaux libres (radiations ionisantes et UV, fumée, alcool, fibres d'amiante, métaux carcinogènes, hydrocarbures polycycliques). d. L’attaque radicalaire des glucides : Les espèces réactives de l'oxygène attaquent les mucopolysaccharides et notamment les protéoglycanes du cartilage. Par ailleurs, le glucose peut s'oxyder dans des conditions physiologiques, en présence de traces métalliques, en libérant des cétoaldéhydes, H2O2 et OH•, qui entraîneront la coupure de protéines ou leur glycation par attachement du cétoaldéhyde. Ce phénomène de glycosoxydation est très important chez les diabétiques et contribue à la fragilité de leurs parois vasculaires et de leur rétine [2, 3]. I.4.2. les implications des radicaux libres dans les processus pathologiques a. Stress oxydant et maladie d’Alzheimer La maladie d’Alzheimer est une forme de démence sénile [12]. La neuro-dégénérescence est causée par les dépôts de plaques amyloïdes dues à l’accumulation d’un peptide amyloïde bêta (Aβ) [12]. Ce peptide provient d’une protéine transmembranaire dite APP (amyloïde protein precursor), naturellement présente dans tous les types cellulaires notamment les neurones. Subbarao et al. (1990) [13] ont suggéré un rôle du stress oxydant dans la maladie d’Alzheimer. Smith et al. 1995) [14] ont relevé une augmentation de la peroxydation lipidique et de l’oxydation des protéines. Mecocci et al. 1994 [15] ont montré une altération de l’ADN mitochondrial et Marklund et al. 1985 [16] une augmentation de 50% de l’activité de la Cu/Zn SOD dans le cerveau des patients atteints de maladie d’Alzheimer. b. Stress oxydant et maladie de Parkinson La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative caractérisée par la présence de symptômes et de lésions neuropathologiques spécifiques [17]. Elle se manifeste autour de 9 l’âge de 60 ans [17]. Certaines études ont suggéré une implication du stress oxydant dans la maladie de Parkinson [12]. Les dommages oxydatifs ont été observés après une analyse post mortem du cerveau des individus atteints de la maladie de Parkinson. Une diminution de la quantité du glutathion réduit (GSH) et de l’activité du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale a également été rapportée [18]. Une diminution de GSH suggère l’induction d’un stress oxydant. c. Stress oxydant et cancer De très nombreuses études démontrent la place prépondérante du stress oxydant dans l’initiation et le développement des cancers [2, 3, 10, 12]. Des dérivés d’oxydation de l’ADN signant un stress oxydant sont retrouvés dans le sang et les tissus des malades cancéreux [19]. De nombreux aldéhydes, comme le malondialdéhyde sont retrouvés en quantité importante dans le sang des enfants cancéreux [20]. L’augmentation de la peroxydation lipidique est même observée au stade précancéreux chez des femmes atteintes de dysplasie mammaire ou cervicale [21]. L’activité de l’enzyme Mn-SOD est augmentée dans la muqueuse des malades atteints d’adénocarcinome de l’estomac, sans doute en réaction à la présence excessive des formes réactives de l’oxygène [22]. I.5. Les systèmes de défense antiradicalaire Face au danger que représentent les radicaux libres pour les constituants cellulaires, il existe des systèmes de régulation de leurs niveaux. Le stress oxydatif apparait lorsqu’il existe d’une part un emballement des causes de surproduction des radicaux libres et une défaillance des systèmes de défense antiradicalaire (ou antioxydants) d’autre part. Les systèmes de défense antiradicalaire se répartissent en deux catégories : les systèmes enzymatiques et les systèmes non enzymatiques. I.5.1. Les systèmes enzymatiques de défense antiradicalaire Le système enzymatique vise à détruire les superoxydes et les peroxydes. On distingue les enzymes suivants : a. Les superoxydes dismutases (SOD): Il s’agit d’une famille de métalloenzymes à cuivre ou à zinc ou à manganèse, capables d’éliminer l’anion superoxyde par une réaction de dismutation, formant avec deux superoxydes une molécule d'oxygène et une molécule de peroxyde d'hydrogène [3]. Le mécanisme réactionnel est catalysé par un métal situé au cœur de l’enzyme dont la nature 10 permettra de distinguer les superoxydes dismutases à manganèse (MnSOD) protégeant la mitochondrie, des superoxydes dismutases à cuivre-zinc protégeant le cytosol (cCu-ZnSOD), la face externe de la membrane des cellules endothéliales (ecCu-ZnSOD) ou le plasma sanguin (pCu-ZnSOD) [2, 3]. b. La glutathion péroxydase (Gpx) : Ce sont des enzymes à sélénium qui existent dans le cytosol (cGpx), dans le plasma (pGpx), au niveau de la membrane cellulaire (HPGpx), et l’isoenzyme spécifique des cellules digestives (GIGPx) [2]. Ces enzymes sont sans doute le principal système de protection car elles détruisent non seulement l’H2O2, mais aussi les peroxydes organiques toxiques formés par oxydation des acides gras ou du cholestérol. L'activité de ces enzymes est très dépendante de l'apport nutritionnel en sélénium. Le rôle des SOD et des peroxydases est complémentaire car une bonne protection ne peut être obtenue par les superoxydes dismutases seules. c. La catalase : Enzyme à cofacteur fer, la catalase est capable de détruire le peroxyde d'hydrogène. La catalase est présente dans les hématies et les peroxysomes hépatiques. d. Les enzymes de réparation des dommages oxydatifs sur l’ADN : Ce sont des enzymes localisés dans le noyau cellulaire qui jouent un rôle important dans le maintien de l’intégrité génétique. La DNA polymérase I et la DNA ligase active la réparation de l’ADN rompu. Les endonucléases et les glycosylases empêchent la modification des informations génétiques [2]. Lorsque les dommages de l’ADN sont assez importants pour être réparés, la cellule entière est éliminée. Ce phénomène est initié par la poly (ADP-ribose) synthétase [3]. e. Les autres enzymes Il existe de nombreuses autres enzymes antioxydants comme les peroxyredoxines, l'héme oxygénase, la glutathion transférase, la glutathion réductase et les thioredoxines réductases ou les thioredoxines peroxydases [2]. La plupart de ces enzymes, de même que les enzymes de réparation des dommages oxydants, vont utiliser un donneur d’équivalent réducteur : le NADPH qui constitue avec le glutathion les plaques tournantes de la défense antioxydante. La 11 production d'énergie ne semble pas ici en elle-même capitale car la diminution de l’ATP facilite même la formation du NADPH. Les DT-diaphorase ou l’époxyde hydrolase sont également considérées comme une défense antioxydante [3]. I.5.2. Les systèmes non enzymatiques de défense antiradicalaire a. Les protéines fixant certains métaux : Les formes non liées des métaux de transition sont impliquées dans la genèse du radical hydroxyle à partir des réactions de Fenton qu’ils catalysent [3]. Lorsque ces métaux sont liés aux protéines plasmatiques, ils cessent d’être catalyseurs [2, 3]. La concentration plasmatique du fer libre dépend soit de sa liaison à ces protéines de transport la transferrine ou à la glycoprotéine ou soit de sa liaison à sa protéine de stockage. La céruloplasmine et l’albumine sont les protéines de transport plasmatique du cuivre. Cependant, ces protéines ne sont pas capables de prévenir l’interaction entre ces métaux et les radicaux superoxydes ou le peroxyde d’hydrogène pour générer le radical hydroxyle (le plus agressif) [3]. b. Les petites molécules endogènes : Il existe des composés endogènes synthétisés par les cellules et jouant le même rôle ; le plus important est le glutathion réduit qui protège non seulement contre les radicaux oxygénés, mais aussi contre les peroxydes ou le NO• [3]. D'autres composés endogènes jouent un rôle sans doute important mais encore mal évalué : les thioredoxines, les glutaredoxines, les métallothionéines, l'acide lipoïque ou les polyamines [2]. La bilirubine possédant une propriété de rompre la chaine de la propagation des dommages oxydatifs [2, 3]. c. Les petites molécules exogènes : Certains composés antioxydants comme la vitamine E (tocophérol), la vitamine C (ascorbate), la vitamine Q (ubiquinone), ou les caroténoïdes sont apportés par les aliments. Ils agissent en piégeant les radicaux et en captant l'électron célibataire, les transformant en molécules ou ions stables [23]. La vitamine piégeuse va devenir un radical, puis sera soit détruite, soit régénérée par un autre système. De très nombreux composés alimentaires peuvent aussi avoir le même comportement : les polyphénols, les alcaloïdes et les phytates [24]. 12 La vitamine E ou α-tocophérol Le terme vitamine E correspond à deux grands groupes de molécules : les tocotriénols (avec 3 doubles liaisons en 3, 7, 11) et les tocophérols (α, β, γ et δ). La vitamine E proprement dite fait partie des tocophérols. Figure 3: structure chimique de la vitamine E Les doubles liaisons en 3,7 et 11 sont uniquement caractéristiques des tocotriénols Source : http://fr.wikipedia/wiki/vitamine_E.mht [25] Leur structure lui permet de capter les radicaux libres : o dans les zones lipophiles des membranes cellulaires, grâce à sa chaîne phytyle o dans les zones hydrophiles, à la surface des membranes plasmiques, grâce à son hydroxyle phénolique. L’α-tocophérol réagit avec les radicaux oxygénés lipidiques en empêchant leur propagation [26]. Il est également un puissant inhibiteur de la formation des nitrosamides, en captant l’acide nitreux. Ainsi transformé, celui-ci ne peut plus réagir avec les fonctions amides des molécules pour donner des nitrosamides. Les caroténoïdes : Ils sont très nombreux et représentent la principale source alimentaire de rétinol. En plus de leur activité de provitamine A, les caroténoïdes sont capables d’inactiver l’oxygène singulet et les radicaux libres. a. β-carotène b. rétinol Figure 4: structure chimique des caroténoides Source : http://fr.wikipedia/wiki/vitamine_A .mht [27] 13 L’effet anti-oxydant du β-carotène serait dû à une interaction entre le radical et le système de doubles liaisons conjuguées de la chaîne insaturée du piégeur. Le β-carotène est particulièrement réactif vis-à-vis des lipoperoxydes : le radical peroxyde se fixerait sur un carbone de la chaîne polyinsaturée et serait stabilisé par résonance. L’effet anti-oxydant des caroténoïdes serait dépendant de la pression d’oxygène. Différents systèmes in vitro ont confirmé leur rôle protecteur. La vitamine C : Son action est très controversée quant à son effet protecteur ou activateur face à la toxicité de l’oxygène. Selon le pH, la vitamine C peut prendre une forme réduite ou oxydée. Le passage de l’une à l’autre se fait par l’intermédiaire d’un radical libre, le radical ascorbyle, et en présence de glutathion/glutathion-réductase. Figure 5: structure chimique de la vitamine C Source : http://fr.wikipedia/wiki/vitamine_E.mht [28] La vitamine C forme donc un couple redox avec une forme intermédiaire radicalaire capable de capter l’oxygène singulet et certaines espèces radicalaires. C’est ainsi qu’elle protègerait la peau de la toxicité induite par les rayonnements UV mais, à forte concentration, la vitamine C peut se comporter comme un oxydant générateur de radicaux libres [29]. Les polyphénols : Ils sont ubiquitaires dans les plantes, avec plus de 8000 structures identifiées [30]. Les flavonoïdes, la classe de polyphénols la plus importante, sont des aglycones ou des glycosides avec un cycle benzopyrone. Ils comprennent des flavones, des flavonols, des flavanones, des flavanonols, et des anthocyanines basés sur les structures communes des squelettes de carbones (figure 6). 14 Figure 6 : Structures des différentes classes de polyphénols. Source : d’après PERRET, C (2001) [31] Chaque groupe de flavonoïdes diffère selon le nombre de groupement hydroxyle, méthoxyle, et autres substituants sur les deux cycles benzéniques [29] (figure 6). Figure 7 : structure chimique de la quercétine (flavonoide antioxydant) Source : d’après YAKHLEF G. et al. (2010)[32] Les mécanismes anti-oxydants des polyphénols sont basés sur leur pouvoir donneur d’hydrogène et chélateur d’ions métalliques [30]. Après avoir donné l’atome d’hydrogène, les composés phénoliques stabilisés par résonance, ne participent pas facilement dans les autres réactions radicalaires. Les structures chimiques affectent les activités anti-oxydantes. Les flavonoïdes qui ont des activités anti-oxydantes les plus marquées présentent dans leurs structures chimiques un groupement O-diphénolique, une double liaison 2-3 conjuguée avec la fonction 4-oxo, et des groupements hydroxyles dans les positions 3 et 5. Les activités anti-oxydantes des flavonoïdes sont influencées par l’hydroxylation et la présence d’unité glycosyle [30]. Les flavonoïdes 15 sont de bons capteurs de radicaux hydroxyles et peroxyles. Ils peuvent former des complexes avec les métaux et inhibent l’oxydation lipidique initiée par un métal [33]. I.6. Quelques méthodes d’évaluation du potentiel antioxydant d’un produit La mesure du potentiel antioxydant d’une substance se fait soit par la détermination des produits résultant de son oxydation ou soit par évaluation de son aptitude à piéger les radicaux libres. Les antioxydants peuvent réduire les radicaux libres par transfert d’électron singulet ou par transfert d’atome d’hydrogène. I.6.1. Le test de réduction du radical stable, le DPPH° Le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH°) est un radical stable et coloré, qui est centré sur l’azote. Le maximum de son absorption dans le visible se situe vers 515-520nm dans le méthanol. La réduction du radical par un donneur d’atome H (AH) conduit à la 2,2-diphenyl1-picrylhydrazine incolore (DPPH-H) et au radical (A°) [34]. Figure 8: réaction de réduction du radical DPPH° Source : d’après MOLYNIEUX, P (2004) [34] Le composé à tester est ajouté à une solution méthanolique de DPPH°. Après 30min à l’abri de la lumière, l’absorbance du DPPH est mesurée par spectrophotmétrie UV-visible à 520 nm [34]. Le rapport DPPH° / antioxydant doit être adapté à la stœchiométrie du composé (nombre de radicaux réduits par molécule d’antioxydant) et le DPPH° doit être en excès [34]. Ce test, largement utilisé, est rapide et facile à réaliser ; il permet donc de comparer un grand nombre de composés. De plus, les conditions utilisées (solvants organique, faible température) évitent l’autoxydation des molécules testées. Les résultats peuvent être exprimés : - en pourcentage de réduction de DPPH° (%PR) : % PR = [Abs (antioxydant) / Abs (contrôle)] x 100 16 Abs : absorbance pour une concentration en antioxydant et un temps donné. - en concentration inhibitrice 50% (IC50 ) La concentration en antioxydant nécessaire pour réduire de 50% la concentration initiale en DPPH° (IC50 ) est calculée. On définit une grandeur appelée activité antiradicalaire (AA). AA = IC50 / [DPPH°]initiale I.6.2. Le test TEAC de réduction du radical-cation ABTS+° TEAC : Trolox Equivalent antioxydant capacity Trolox©: Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique ABTS+°: Acide 2,2’-azino-bis (3-éthylbenzthiazoline-6-sulphonique) Dans la méthode TEAC, l’activité antioxydante totale d’une molécule est déduite de sa capacité à inhiber le radical ABTS+°, comparativement à un antioxydant de référence, le Trolox dont la structure moléculaire cyclique (figure 9) est similaire à celle de la vitamine E [35]. Figure 9: Réduction de l’ABTS par le Trolox Source : d’après MARC, F et al. (2004) [35] 17 L’obtention du radical cation résulte du contact de l’ABTS avec une enzyme de peroxydation (peroxydase metmyoglobine [36] ou horseradish peroxydase) [37] en présence de H2O2 ou d’un antioxydant (dioxyde de manganèse [38, 39] ou persulfate de potassium [40]). Le radical ABTS+°, en contact avec un donneur de H° conduit à ABTS+ décoloré. La décoloration de la solution est mesurée à 734nm [41]. D’autres auteurs utilisent l’acide 2,2-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) ou ABTS-° à la place de son sel d’ammonium et analysent l’inhibition du radical ABTS-°, produit par un initiateur de radicaux thermolabiles, l’ABAP (2,2’-azobis-(2- amidinopropane)HCl) [42]. La cinétique de réaction de l’antioxydant étudié doit être examinée préalablement pour déterminer la fin de réaction. La capacité antioxydante en équivalent Trolox (TEAC) correspond à la concentration (mmol/L ou mg/L) de Trolox ayant la même activité qu’une même concentration unitaire de substance à tester. I.6.3. Les Tests de capture des radicaux peroxyles : ORAC et TRAP Dans des modèles d’oxydation comme la peroxydation lipidique, la génération de radicaux libres à taux constant est idéale. Le 2,2’-azobis-(2-amidinopropane) dihydrochlorure (AAPH) est un générateur hydrophile de radicaux libres, tandis que le 2,2’-azobis-(2,4méthylvaleronitrile) (AMVN) est lipophile [43]. Ils ont l’avantage de se décomposer à vitesse constante en fonction de la température appliquée. Dans l’air, les radicaux R° se combinent très rapidement avec O2 pour former les radicaux peroxyles ROO°. L’AMVN n’étant plus disponible commercialement, seul l’AAPH est utilisé dans les différents tests de capture des radicaux peroxyles. a. Le test ORAC ORAC : Oxygen Radical Absorbance Capacity La particularité du test ORAC est de mesurer séparément à partir d’une même solution biologique la capacité antioxydante des composés hydrophiles et lipophiles qui la composent. Les deux types d’antioxydants de l’échantillon aqueux sont séparés par une extraction à l’hexane. Puis les antioxydants hydrophiles et lipophiles sont analysés en utilisant le même générateur de radicaux peroxyles l’AAPH à 37°C. Les composés sont évalués pour leur capacité à empêcher l’oxydation de la fluorescéine par les radicaux peroxyles pendant 30min 18 [43]. La fluorescence de la solution est lue toutes les minutes et permet d’obtenir une cinétique de dégradation de la fluorescéine en fonction du temps qui sera stoppée (temps de latence) ou juste ralentie par les antioxydants présents. Ce test est applicable aux solutions biologiques comme le plasma sanguin et aux extraits de fruits et légumes b. Le test TRAP TRAP : Total Radical Trapping Antioxydative Potential Dans le test TRAP, l’AAPH est solubilisé en milieu aqueux avec l’antioxydant et un indicateur qui devient luminescent lorsqu’il est oxydé à 37°C, comme le luminal, la Rphycoérytrine et la dichlorofluorescéine [44]. Les radicaux peroxyles issus de l’APPH oxydent l’indicateur donnant des radicaux qui émettent de la fluorescence. La capacité des antioxydants à empêcher l’oxydation de l’indicateur est comparée à celle du Trolox donnant une valeur TRAP. Ce test est souvent utilisé pour déterminer la capacité antioxydante du plasma et du sérum sanguin. I.6.4. Le test Rancimat Le test consiste à mesurer la dégradation d’un corps gras face à une auto-oxydation accélérée, dans un appareil automatisé qui chauffe les solutions à 100°C environ avec un rapport d’air constant (20 L/h). Cet appareil détecte les composés volatiles libérés qui indiquent indirectement le degré d’oxydation du corps gras. Un temps de latence (d’induction ou d’inhibition) pendant lequel le corps gras n’est pas altéré est évalué. Les corps gras typiquement testés sont les huiles végétales (olive ou tournesol) voire les graisses animales. I.6.5. Le test de β-carotène Cette technique de spectrophotométrie dans l’ultraviolet a initialement été développée par Marco [45] puis légèrement modifiée par Miller [46]. Elle consiste à mesurer, à 470 nm, la décoloration du β-carotène résultant de son oxydation par les produits de décomposition de l’acide linoléique. L’addition d’antioxydants purs ou sous forme d’extraits végétaux induits un retard de la cinétique de décoloration du β-carotène. Le β-carotène est un indicateur d’oxydation. Une émulsion est préparée contenant du βcarotène et de l’acide linoléique puis elle est solubilisée dans une émulsion aqueuse de Tween-40. L’antioxydant (solubilisé dans le méthanol) est ajouté et la solution est portée à 50°C pendant 120min. Le β-carotène est un antioxydant lipophile qui protège les acides gras de l’oxydation. Or l’ajout d’un second antioxydant va permettre sa préservation ; c’est cette 19 protection qui sera mesurée. Ainsi l’absorbance du β-carotène est mesurée à 470nm avec et sans antioxydant. Une activité antioxydante (AA) est calculée pour chaque antioxydant à une concentration donnée : AA = (A antiox 120 – A témoin 120) / (A antiox 0 – A témoin 120) Avec respectivement A antiox 0 et A antiox 120, les absorbances de la solution en présence d’antioxydant à 0 et 120 minutes et A témoin 120, l’absorbance de la solution sans antioxydant à 120 minutes. I.6.6. Le test FRAP FRAP : Ferric reducing Ability of Plasma Le pouvoir antioxydant d’une solution comme le plasma est déterminé grâce au test FRAP. A faible pH et à 37°C, le complexe tripyridyltriazine ferreux (TPTZ-Fe 3+) est ajouté à l’échantillon. Les antioxydants présents réduisent le complexe en sa forme Fe 2+ et son absorbance est lue à 593nm toutes les 15s durant la période de mesure [47]. Ce test est rapide et donne des résultats reproductibles pour des solutions biologiques ainsi que pour les solutions pures d’antioxydants où la réaction est indépendante de la concentration car la réponse est linéaire. I.6.7. Les tests d’inhibition de l’oxydation des lipides a. test d’inhibition de la peroxydation des phospholipides Principe Le test consiste à évaluer l’inhibition de la peroxydation des phospholipides induite par le fer (Fe 2+ ) libre. En effet, les phospholipides sont susceptibles de subir une peroxydation en présence du fer ferreux libre (FeSO4). Les dérivés oxydés ainsi formés, réagissent à chaud avec l’acide thiobarbiturique pour donner des produits colorés qui absorbent à 532nm. En présence d’un inhibiteur (extrait ou vitamine C), la densité optique diminue. Mode opératoire Selon la méthode décrite par Mathisen et al. (2002) [48], les phospholipides (PL) à utiliser, proviennent de la cervelle de porc. La solution de PL est préparée à raison de 20 25mg/mL dans un mélange de chloroforme / méthanol (2 :1). L’ajout du sulfate de fer (FeSO4) dans la solution de PL déclenche la peroxydation à 37°C. Cuve 1 (Blanc) : 50µL de la solution de PL (25mg/mL) + 500µL d’eau distillée + 200µL de DMSO Cuve 2 (Echantillon sans inhibiteur) : 50µL de la solution de PL (25mg/mL) + 500µL d’une solution (10mM) de sulfate de fer (FeSO4) + 200µL de DMSO. Cuve 3 (Echantillon avec inhibiteur) : 50µL de la solution de PL (25mg/mL) + 500µL d’une solution (10mM) de sulfate de fer (FeSO4) + 200µL d’une solution de l’inhibiteur (extrait ou vitamine C) dans du DMSO. Conditions de travail : Toutes les trois cuves sont incubées pendant 30min et la réaction est arrêtée par l’ajout de 4mL de l’acide trichloroacétique à 10%. On ajoute 500µL d’une solution d’acide thiobarbiturique (1%) puis le tout porté dans un bain-marie bouillant pendant 15min. Après refroidissement et centrifugation (5min), l’absorbance du surnageant est mesurée à 532nm L’activité antiradicalaire (AA) est déterminée selon la formule suivante : AA = 100 x (Abs532 contrôle - Abs 532 échantillon) / Abs 532 contrôle - Abs 532 Blanc) Abs532 contrôle : absorbance du contrôle négatif à 532nm Abs532 échantillon : absorbance en présence de l’antioxydant (extrait ou vitamine C) à 532nm c. test d’inhibition de la lipooxygénase Principe Le test d’inhibition de la lipooxygénase a été réalisé selon la méthode spectrophotométrique décrite par Lyckander & Malterud en 1992 [49]. La lipooxygénase est une enzyme capable d’oxyder l’acide linoléique en hydropéroxydiènes conjugués qui absorbe à 234 nm. En présence d’un composé inhibiteur, il y a une diminution de la vitesse d’apparition d’hydropéroxydiènes conjugués. La comparaison de la vitesse (Vx) en présence d’un composé avec la vitesse initiale (Vi) de l’enzyme permet d’évaluer l’effet inhibiteur du composé. 21 Mode opératoire A 400µL d’une solution de lipooxygénase type I-B dans du tampon borate de sodium (pH9), sont ajoutés 100µL de la solution contenant l’extrait à tester (concentrations variant de 0.125mg/mL à 2.5mg/mL dans du tampon borate pH9). Le mélange réactionnel est incubé pendant 10 minutes à la température de 25°C. L’addition de 500 µL d’une solution d’acide linoléique (utilisé comme substrat) initie la réaction. Lire la vitesse enzymatique à 234 nm pendant 1 h 30 min contre un blanc (400µL de tampon + 100µL d’extrait + 500µL d’acide linoléique) Le pourcentage d’inhibition est calculé selon la formule suivante : INHIBITION (%) = [(Vi - Vx) / Vi] x100 Vi : activité de l’enzyme sans le composé à tester ; Vx : activité de l’enzyme en présence du composé à tester. II. Les lipooxygénases II.1. Définition Les lipooxygénases sont une famille d’enzymes retrouvées dans de nombreux tissus végétaux et animaux. Elles possèdent un fer non-héminique qui leur sert de site catalytique des réactions stéréo et régiospécifiques de dioxygénation des acides gras polyinsaturés qui possèdent un motif 1,4-pentadiène [50]. Chaque enzyme réalisera la dioxygénation sur un atome de carbone donné : 5 ou 8 ou 12 ou 15. La position du carbone sur lequel a lieu l’oxygénation permettra de distinguer les différents isoformes de lipoxygénases : 5-, 8-, 12-, et 15-lipooxygénases [51]. II.2. Rôles physiologiques des lipooxygénases II.2.1. La 12-lipooxygenase La 12-lipooxygénase (12-LOX) a été la première à être découverte dans les tissus humains, les plaquettes d’abord et les leucocytes plus tard. Comme tous les autres types de lipooxygénases, elle catalyse l’oxydation de l’acide arachidonique en un métabolite primaire, l’acide 12-hydro-peroxyéicosatétraénoique (12-HPETE) qui par réduction, conduit à la formation de l’acide 12-Hydroxyécosatétraénoique (12-HETE) dans la plupart des cellules [52]. Il peut également subir un réarrangement intramoléculaire pour donner d’autres 22 métabolites actifs : les acides 8- et 10-hydroxy-11,12-epoxyeicosatrieneoique appelés hépoxilines. Le rôle de la 12-LOX et de ses produits dérivés reste bien incertain dans le fonctionnement cellulaire [52]. De nombreuses études montrent que le 12-HETE ou le 12-HPETE joue le rôle de médiateur cellulaire [52]. Le 12-HETE induit la sécrétion des granules des neutrophiles, augmente la libération des IgE par les cellules mastocytaires [52]. Il a des propriétés chimiotactiques, favorise l’adhésion des cellules tumorales à la matrice subendothéliale [53] et stimule la migration des cellules du muscle lisse aortique [54]. Le 12-HPETE joue également le rôle de second messager suite à l’interaction entre le neuropeptide et ses récepteurs postsynaptiques [55]. II.2.2. La 15-lipoxygenase. La 15-lipooxygénase (15-LOX) est présente dans les leucocytes et les réticulocytes [56]. Les produits dérivés sont de façon majoritaire le 15-HPETE (ou le 15-HETE) et le 12HPETE (ou le12-HPETE) dans une moindre mesure [57]. Les autres métabolites intermédiaires sont pour certains, des analogues aux leucotriènes de type A4 (LTA4) [52]. Au cours du processus, une action supplémentaire de la 5-lipooxygénase (oxygénation et réduction) sur les 15-HPETE ou 15-HETE conduit à la synthèse des lipoxines A et B. La lipoxine A est massivement produite par les macrophages alvéolaires en cas d’exposition aux infections virales [52]. La voie de la 15-LOX est primordiale dans le métabolisme de l’acide arachidonique au sein des tissus pulmonaires [52]. Les 15-HPETE et/ou 15-HETE modifient un grand nombre de fonctions de l’immunité cellulaire, agissent comme des agents mitogènes et interviennent dans la modulation d’autres enzymes oxygénases [52]. Certains métabolites du 15-HPETE sont impliqués dans l’hypersensibilité neuronale et dans l’inhibition de l’action des lymphocytes NK. Ils sont des activateurs des polynucléaires neutrophiles et des protéines kinases C. La 12-LOX et la 15-LOX peuvent autant que leurs produits dérivés oxyder les acides gras estérifiés aux phospholipides membranaires. Cela perturbe la composition et les fonctions des membranes cellulaires [51]. Par exemple, la forte présence des dérivés oxygénés de l’acide linoléique et de l’acide arachidonique sous forme estérifiée dans la membrane mitochondriale des réticulocytes, la déstabilise et la prédispose à l’action des protéases lors de la maturation érythrocytaire [58]. 23 II.2.3. La 5-lipoxygenase La 5-lipooxygénase (5-LOX) conduit à la synthèse des leucotriènes et est stimulée par le calcium, l’ATP et d’autres nucléotides. Son activité est par contre inhibée par les peroxydes [59]. La 5-LOX oxyde l’acide arachidonique en 5-HPETE qui est le précurseur des leucotriènes (LT) : le LTA4 va donner LTB4 et LTC4 respectivement par hydrolyse enzymatique du LTA4 et par action du glutathion [52]. Le cytochrome P450 intervient pour métaboliser le LTB4 en 20-hydroxy-LTB4 et 20-carboxy-LTB4 dans les neutrophiles [60]. Les leucotriènes sont des médiateurs majeurs de l’inflammation, avec des effets prééminents sur l’appareil bronchopulmonaire [61]. Les LTB4 se fixent sur des récepteurs spécifiques des neutrophiles pour favoriser le chimiotactisme [52]. Les leucotriènes C4, D4 et E4 entrainent la contraction des voies respiratoires, des vaisseaux et du muscle lisse intestinal [62]. II.3. Les Rôles des lipooxygénases dans les processus pathologiques II.3.1. les lipooxygénases et la production des radicaux libres L’activation des lipooxygénases conduit à la formation des radicaux libres oxygénés via l’activation d’autres dioxygénases et des hydroperoxydases. Les radicaux oxygénés sont les causes initiales ou les facteurs favorisants de nombreuses maladies. Tout d’abord, les formes réactives de l’oxygène jouent un rôle majeur dans la carcinogénèse. Elles induisent des dommages oxydatifs de l’ADN qui vont modifier la transcription ou l’activation des oncogènes [63]. Dans les poumons, les lipooxygénases sont responsables de la bioactivation de certaines substances pro-carcinogènes dont les formes oxygénées sont éminemment carcinogènes (benzinidine et O-dianisidine) [64]. Ensuite, les lipooxygénases sont responsables de l’oxydation des LDL qui vont se déposer dans les cellules phagocytaires et former des cellules spumeuses à l’origine de la formation de plaques d’athéromes [65]. II.3.2. les lipooxygénases et les maladies inflammatoires Les métabolites dérivés de l’action des lipooxygénases sont impliqués dans divers processus de pathologies inflammatoires : l’asthme, l’arthrite rhumatoide, la rhinite allergique, les glomérulonéphrites et les psoriasis [66]. Ces pathologies sont essentiellement liées à l’action des leucotriènes issus du métabolisme de la 5-lipooxygénase [67]. II.3.3. les lipooxygénases et les cancers humains Les métabolites actifs (HPETE et HETE) de la voie des lipooxygénases sont également associés à de nombreux cancers humains [68]. Ils modulent la synthèse de l’ADN ou la 24 signalisation intracellulaire médiée par certains seconds messagers : tyrosine kinase [69], l’AMPc [70] et la protéine kinase C [71]. A l’origine de ces signalisations intracellulaires, on trouve l’action de nombreux facteurs de croissance, EGF, TGF, TNF, PDGF et l’IGF qui sont eux-mêmes activés par la voie des lipooxygénases [72-74]. C’est pourquoi le blocage des lipooxygénases pourrait réduire la prolifération cellulaire. En effet, il a été montré l’implication de la 15-lipooxygénase-1 dans le développement des cancers du sein, de la prostate, des cancers colorectaux où elle est fortement surexprimée [75]. Kelavkar et al (2001) [76] ont pu produire in vitro une inhibition (dose-dépendante) de la prolifération des cellules du cancer de la prostate (modèle PC-3) en inhibant la 15lipooxygénase-1 par un inhibiteur spécifique, le PD146176 (figure 10). L’inhibition de la formation du 5-HETE et du 15-HETE inhibe la néoangiogénèse dans les cellules cancéreuses de la prostate, entraine leur mort par apoptose [77, 78], réduit leur invasivité et leur mobilité [78]. Figure 10: Structures de quelques inhibiteurs connus de la 15-lipoxygénase Source : d’après BENSEGUENI, A et al. (2007) [79] II.3.3. les lipooxygénases et l’athérogénèse L’athérosclérose ou athérome, est une pathologie multifactorielle qui consiste à l’épaississement progressif de la paroi des artères de gros et moyens calibres (l'aorte abdominale, l'aorte thoracique descendante, les artères coronaires, les artères des membres inférieurs, les artères cervicales carotide, sous-clavière et vertébrale) [80]. Trois types de complications peuvent survenir [80] : 25 Une ulcération de la plaque correspondant à l'érosion du tissu endothélial au niveau de la plaque, ce qui entraîne la création d’un thrombus. Une rupture ou fissure de la plaque qui peut être à l’origine de multiples sténoses en aval de la plaque par émission d'embols cruoriques qui bouchent de petites artères. Une hémorragie intra-plaque au niveau du centre lipidique pouvant entraîner une augmentation brutale du volume de celle-ci et peut aboutir à l’occlusion complète de l’artère. L’athérosclérose est la deuxième cause de mortalité dans le monde derrière les maladies infectieuses. Il s’agit de la principale cause de mortalité dans les pays industrialisés, devant les cancers. La formation de la plaque d’athérome se fait en plusieurs étapes qui peuvent prendre plusieurs années: la formation de la strie lipidique, la formation de la plaque athéromateuse simple (comprenant le centre lipidique et la chape fibreuse) qui va évoluer vers le dernier stade dit « compliqué » [80]. La strie lipidique est composée de cellules spumeuses qui s’accumulent dans l’intima des artères. Les cellules spumeuses sont des macrophages ou des cellules musculaires lisses gorgées de lipides, en particulier d’esters de cholestérol. Ces cellules sont formées par l’intermédiaire des LDL oxydées (LDLox) qui les chargent en lipides par la voie des récepteurs scavenger [80]. Il existe de nombreux cholestérols oxydés (ou oxycholestérols ou oxystérols) qui résultent tous de l’oxydation du cholestérol. Les oxystérols proviennent soit de l’alimentation ou soit du cholestérol oxydé dans l’organisme. Cette oxydation du cholestérol dans l’organisme peut résulter de l’action des lipooxygénases ou myéloperoxydases ou de celle de substances oxydantes comme les ions métalliques (Cu 2+ et Fe 2+ ) ou encore les espèces réactives de l’oxygène [81-83]. Les oxystérols les plus fréquemment retrouvés au niveau des lésions athéromateuses et dans le plasma sont : le 7-cétocholestérol, le 27-hydroxycholestérol, le 7bhydroxycholestérol, le 25-hydroxycholestérol, le 5a,6a-époxycholestérol, le 5 b,6 bépoxycholestérolet le 7a-hydroxycholestérol [84-86]. 26 III. Données bibliographiques sur Erythrina senegalensis DC III.1. Dénominations locales : Nom vulgaire français : Arbre à corail, érythrine du Sénégal Noms vernaculaires : Mooré : Kulin-tiiga Bambara : Béru, ntenbileni Peulh : Mototay Nom scientifique (botanique) : Erythrina senegalensis DC III.2. Classification de la plante d’étude La plante Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) fait partie de : Embranchement : Spermaphytes Sous embranchement : Angiospermes Classe : Dicotylédones Ordre : Leguminosales Famille : Leguminoseae Sous famille : Fabaceae (Papilionaceae) Genre : Erythrina Espèce : senegalensis III.3. Habitat Le genre Erythrina de la famille des Leguminosae comprend plus de 110 espèces d’arbustes et d’herbacées très répandues dans les régions tropicales et intertropicales [87]. En Afrique occidentale, il est disséminé dans les savanes boisées ou arbustives, en zone soudanienne ou soudano-guinéenne [88]. Il est également répandu en Afrique centrale (Cameroun, Tchad, Centre-Afrique) [88]. III.4. Description botanique de la plante d’étude Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) un arbuste épineux (Photo 3) de 6 à 7 m de hauteur, à cime irrégulière avec une écorce épaisse (Photo 1), claire liégeuse et crevassée [6]. Les feuilles (photo 2) sont trilobées alternes avec des pétioles épineux légèrement cannelés par-dessus. Les courtes épines sont dispersées sur les rameaux [6]. 27 1 2 Photo 1: écorce de tronc; Photo 2 : jeunes feuilles 3 Photo 3 : plante entière Figure 11: Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) Les fleurs en longs racèmes terminaux s’épanouissent avant ou au début de la feuillaison. La corolle est longue, écarlate, vive, soudée et à peine ouverte [6]. Les fruits sont en gousse monoliforme (portant un long acumen) à parois minces fortement incurvées ou enroulées Les graines ovoïdes sont visibles de l’extérieur, rouges vif, lisses et brillantes [89]. La pollinisation se fait par les oiseaux et la multiplication par boutures et graines. III.5. Données ethnopharmacologiques Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) est une plante ornementale et l’une des plus vieilles plantes médicinales largement utilisées par les populations de l’Afrique de l’Ouest [90]. Toutes les parties de la plantes : les écorces, les racines, les feuilles, les fleurs et les graines sont utilisées dans le traitement de nombreuses maladies par les tradipraticiens de santé en Afrique. Cependant les modes d’utilisation diffèrent d’une contrée à une autre. 28 Au Burkina Faso [6], les extraits d’écorces et de racines sont employés dans le traitement de la douleur, de l’hématurie, du rhumatisme, de la jaunisse, du paludisme, et de la dysenterie. Les mêmes extraits sont recommandés en cas de menace d’avortement, en cas de stérilité féminine, en cas d’aménorrhée et en cas de vomissement. Les extraits de racines sont utilisés en cas d’asthénie. Les extraits de Feuilles et de fleurs sont indiqués dans le traitement des affections buccales (gingivites, stomatites), dans les vomissements de sang, dans les hémorroïdes, et dans le traitement des dermatoses. On les emploie enfin comme astringent, antiseptique et cicatrisant. Le bois est utilisé comme frotte-dent et aphrodisiaque. Au Mali [91], les extraits d’Erythrina senegalensis font partie des recettes traditionnelles utilisées contre le paludisme et l’ictère (écorces et feuilles), contre les douleurs abdominales (écorces en décoction), contre les aménorrhées (racines), et contre les dermatoses. Au Nigéria [92], le macéré aqueux d’écorces de tronc est utilisé dans le traitement de l’ictère et de nombreuses maladies vénériennes. Le décocté d’écorces est indiqué dans le traitement des infections bronchiques, de la toux et des inflammations. La poudre d’écorce et de feuille est prise avec de la soupe pour traiter la stérilité féminine et les fibromes. III.6. Données phytochimiques et pharmacologiques établies Dans la littérature, de nombreux composés chimiques isolés des extraits d’Erythrina senegalensis ont montré diverses activités biologiques. Il s’agit d’alcaloïdes, de ptérocarpans, de flavonoïdes, de stéroïdes et de triterpènes. II.6.1. les composés antibactériens, antiviraux et antiparasitaires La 2,3 dihydroauriculatine isolée d’Erythrina senegalensis par l’équipe de Taylor [93] a montré une activité modérée sur Streptococcus mutans, prophyromonas gingivalis et actinomyces actinomycetemcomitans [94]. L’Erybraedine A est une isoflavonoïde issue de nombreuses espèces d’Erythrina dont E. senegalensis. C’est un composé bactériostatique puissant sur les souches d’entérocoques résistants à la vancomycine et même sur les souches de S. aureus multirésistantes [95]. La 6,8-Diprenylgenisteine. Lee et al (1999) [96] ont isolé des écorces de tige cette isoflavonoïde qui s’est révélée active à moins de 200µg/mL sur 36 souches différentes de S. aureus, 29 souches de Shigella spp et 27 souches différentes de Salmonellae spp. Des souches de Pseudomonas spp et de Kliebsiella spp ont également montré une sensibilté modérée à ce composé. 29 La senegalenseine (ou Lonchocarpol A). Le composé a été isolé des écorces de tiges par Fomum et al. (1987) [97] et a opposé une activité inhibitrice au VIH avec une IC50 de 2,7µg/Ml [98]. La senegalenseine a aussi présenté une puissante activité (CMI de 0,78 – 1.56µg/mL) contre le S. aureus méthi-R et contre l’Enterococcus faecium résistant à la vancomycine [99]. L’Alpinumisoflavone. Il a été isolé des extraits méthanoliques d’écorces de tige [96]. Le composé mis en contact 2 à 24 heures sur la peau d’une souris prévient l’infection à Schistosoma mansoni. Il a immobilisé les miracidia et les cercaires S .mansoni. Il a inhibé les œufs produits et éliminé tous les S.mansoni adultes à une concentration de 50µg/mL après 24heures d’exposition. III.6.2. les composés cytotoxiques L’Alpinumisoflavone est connu comme possédant une puissante activité cytotoxique contre les cancers solides de l’homme (cellules KB). L’Erysenegalenséine E, un autre composé isolé des écorces de tige d’Erythrina senegalensis par l’équipe de Wandji (1994) [100] a présenté un certain degré de cytotoxicité [101]. L’Erythrisenegalone et la senegalenséine, deux prenylflavones tous isolés des écorces de tige d’E. senegalensis [97] ont montré des activités antiproliférative globale sur le modèle expérimental des virus Epstein-Barr (virus reconnu jouant un rôle majeur dans la phase de promotion de la cancérogénèse). L’Alpinumisoflavone et le derrone : ont montré un effet antiprolifératif modéré à l’égard des cellules U937 (leucémie humaine) [102]. III.6.3. les composés ayant d’autres activités Han et al. (2005) [103] ont montré que l’Alpinumisoflavone inhibe de façon dose-dépendante l’activité de la monoamine oxydase cérébrale chez la souris. L’Erysodine, un alcaloïde isolé des extraits méthanoliques des graines d’Erythrina senegalensis [104] s’est révélé un inhibiteur potentiel des récepteurs nicotiniques neuronaux. Erytrinasinate, un ester isolé des extraits hexaniques d’écorces de tige d’E. senegalensis [97] a montré une faible activité de piégeage de la péroxynitrite [105]. III.7. Données toxicologiques Les données toxicologiques retrouvées dans la littérature concernaient les extraits chloroformiques des écorces de tige d’Erythrina senegalensis DC. Il s’agissait de données de toxicités aigue et chroniques étudiées in vivo et in vitro. 30 La dose létale 50% (DL50) en intrapéritonéale (i.p) a été estimée à 526mg/kg (212–744 mg/kg) avec un toxidrome comportant une augmentation de la fréquence respiratoire, une perte d’appétit et une dyspnée [106]. Les études de toxicité chronique ont révélé des altérations de marqueurs biochimiques d’hépatotoxicité (hépatomégalie) et de cardiotoxicté (cardiomodulaton). Aux doses réitérées de dose de 1.0 g d’extrait/kg, l’auteur a observé une chute du nombre et du volume moyen des globules rouges [106]. 31 PARTIE II : NOTRE ETUDE I. Objectifs de l’étude I.1. Objectif général Etudier les effets antiradicalaires et anti-lipooxygénase des extraits de feuilles, de racines et d’écorces de tronc d’Erythrina senegalensis (Fabaceae) DC. I.2. Objectifs spécifiques: Préparer les extraits par un épuisement successif des feuilles, des racines et d’écorces de tronc à l’aide de solvants de polarité croissante Caractériser les groupes phytochimiques présents dans les extraits Evaluer in vitro les effets antiradicalaires des extraits Evaluer in vitro les effets anti-lipooxygénases des extraits. 32 II. METHODOLOGIE II.1. Cadre de l’étude II.1.1. Le CERBA Nous avons mené les extractions et les tests pharmacologiques (antiradicalaire et anti- lipooxygénase) au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA). Le CERBA est dirigé par le Professeur Jacques SIMPORE, professeur titulaire de Génétique et de Biologie Moléculaire à l’Université de Ouagadougou. Le centre a pour objectif la formation et la promotion de jeunes chercheurs. Les axes de recherche du CERBA sont : La recherche fondamentale et les sciences du génome. La recherche clinique. La mise en valeur de la médecine traditionnelle et identification des composés naturels actifs des sur les cellules cancéreuses (PC-3, MCF-7, U373, A549 et LoVo), sur les bactéries, sur les fongi, sur les plasmodies et sur les helminthes. II.1.2. L’IRSS / MEPHATRA-Pharmacie La caractérisation (réactions colorées et CCM) des groupes chimiques contenus dans les extraits a été réalisée à l’Institut de Recherche en Sciences de la Santé (IRSS) à Ouagadougou. L’IRSS est une structure spécialisée du Centre National de la Recherche Scientifique et Technologique (CNRST) qui est chargé de coordonner les programmes nationaux de recherche en matière de santé au Burkina Faso. L’I.R.S.S comprend deux Départements de recherche dont le Département Médecine – Pharmacopée Traditionnelles et Pharmacie (MEPHATRA/PH) chargé de développer la recherche en matière de médecine et de pharmacopée traditionnelles et en pharmacie. Le Département MEPHATRA/PH dirigé par le Professeur Innocent Pierre GUISSOU, professeur titulaire de pharmacologie et toxicologie, a pour missions entre autres de : mener des recherches sur la Médecine et la Pharmacopée Traditionnelle ; valoriser les données de la pharmacopée traditionnelle en vue de développer des phytomédicaments valoriser et diffuser les résultats de la recherche. Nos travaux ont été réalisés dans le Laboratoire de Chimie. 33 II.2. Matériel de l’étude II.2.1. le matériel végétal Les feuilles, les écorces de tronc et les racines entières d’Erythrina senegalensis Dc (Fabaceae) ont constitué les drogues végétales de l’étude. Les drogues végétales ont été récoltées en juin 2009 à Kougpaka, un village (de Saponé) situé à 50km de Ouagadougou (Burkina Faso) après localisation GPS de la plante (30P0641573 UTM132 7922). Un spécimen, après authentification par un expert botaniste (Dr. GANABA Souleymane, Centre National de la Recherche Scientifique et Technologiques) a été enregistré sous le n°8709 au niveau de l’Herbier National du Burkina (HNBU). Dès lors, les drogues végétales récoltées ont été séchées à l’air libre et à l’abri du soleil pendant dix (10) jours. Elles ont ensuite été réduites en une poudre grossière à l’aide d’un mortier et d’un pilon. II.2.2. le matériel pour l’extraction et la caractérisation phytochimique Tous les matériels, solvants et réactifs ont été obtenus auprès de Sigma, Allemagne. a. Matériels de laboratoire - la verrerie de laboratoire - un percolateur - un évaporateur rotatif ROTAVAPOR BUCHI® RE 11 couplé à une pompe à vide. - une hotte à flux laminaire avec lampe ultra-violet LN 120 nüve - un spectrophotomètre UV-Visible de marque Biotek - un bain marie de marque Nüve - des cuvettes en quartz et en plastique - des tubes en polypropylène à fond conique de 15mL et 50mL Falcon - des micropipettes automatiques de marque Eppendorf - des rabs, des tips - une balance analytique Sartorius (sensibilité 1/10.000g ; portée max 220g) - des chromatoplaques (support : verre ; adsorbant : gel de silice 60F 254) - une lampe ultra - violet (254 et 366nm 34 b. Solvants d’extraction - Ether de pétrole - Dichlorométhane - Chloroforme - Acétate d’éthyle - Méthanol - Eau c. Solvants et réactifs de caractérisation c.1. Systèmes de solvants d’analyse pour la CCM - Système S1 : éthyle acétate/acide formique/acide acétique glacial / eau : (100 : 11 : 11 : 26 v/v) - Système S2 : n-hexane/ Toluène/ acétate d’éthyle: (3 : 1 : 1 v/v) - Système S3 : n-butanol/eau/acide acétique glacial : (2 : 1 : 1 v/v) - Système S4 : acétate d’éthyle/ Méthanol/ eau : (10 : 5: 9 v/v) c. 2. Réactifs de caractérisation - solution d’anhydride acétique - réactif de Meyer (cf. Annexe) - réactif de Dragendorff (cf. Annexe) - solution d’acide sulfurique (H2SO4) concentrée - réactif de Shibatat (cf. Annexe) - ammoniaque 20% et 10% - acide sulfurique (H2SO4) concentré - acide chlorhydrique (HCl) concentré et 2% - solution de chlorure ferrique à 1% et 2% - tournure de magnésium - Anisaldéhyde sulfurique (cf. Annexe) - éthanol 50% 35 III.2.3. Matériels pour les études pharmacologiques Tous les matériels, solvants et réactifs ont été obtenus auprès de Sigma, Allemagne. a. Solvants et réactifs du test anti-oxydant - 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) - Quercetine - Méthanol - DMSO b. Réactifs du test anti-lipooxygénase - Tampon Borate : 0,2 M, pH 9,0 - Solution de substrat: l'acide linoléique (250µM) - Solution d'Enzyme : la lipoxygénase (EC 1.13.11.12) de type I-B (extraite du soja) (200 U/mL) dans du Tampon borate. II.3. Méthode d’étude II.3.1. La méthode d’extraction L’extraction des principes phytochimiques s’est faite par épuisement successif dans un percolateur. C’est une méthode qui consiste à extraire les substances chimiques d’une drogue par des solvants de polarité croissante. Trois cents grammes (300g) de poudre végétale ont été initialement dégraissés (étape permettant d’éliminer les matières grasses et les substances lipophiles) avec de l'éther de pétrole, séchée et épuisée successivement avec du dichlorométhane, de l'acétate d’éthyle, du méthanol et de l'eau. Les poudres végétales étaient préalablement mouillées avec le solvant puis laissées en contact pendant deux (2) heures en vase clos afin d’obtenir une répartition complète du liquide au sein de la poudre de drogue. Les poudres de drogues végétales humectées ont été ensuite tassées uniformément dans un percolateur de 2000 mL et percolé successivement par addition de dichlorométhane, de l’acétate d’éthyle, du méthanol et de l’eau. L’épuisement des drogues par un solvant se faisait jusqu'à limpidité du percolât. 36 II.3.2. Méthode de détermination du taux d’humidité résiduelle de la drogue et des rendements d’extraction a. Détermination du taux d’humidité résiduelle (THR) Une prise d’essai d’un (1) gramme (Po) d’extrait est placée à l’étuve pendant 1 heure 30 minutes à 110°C. Cette prise d’essai est refroidie dans un dessiccateur pendant 15 minutes et on la pèse à nouveau (P). THR = [(Po – P) / Po] x 100 b. Détermination des rendements des extractions Extraction au percolateur par le dichlorométhane. La poudre végétale dégraissée, séchée a été pesée (M). Après un épuisement complet (limpidité du percolât) de la dite poudre, l’extrait sec obtenu au rotavapor a été également pesé (m). Extraction au percolateur par l’acétate d’éthyle. Le marc résiduel de l’extraction au dichlorométhane séché et pesé (M) a été repris et épuisé complètement par un volume suffisant d’acétate d’éthyle au percolateur. L’extrait sec obtenu au rotavapor a été également pesé (m). Extraction au percolateur par le méthanol Le marc résiduel de l’extraction à l’acétate d’éthyle séché et pesé (M) a été repris et épuisé complètement par un volume suffisant méthanol au percolateur. L’extrait sec obtenu au rotavapor a été également pesé (m). Extraction au percolateur par l’eau distillée Le marc résiduel de l’extraction au méthanol séché et pesé (M) a été repris et épuisé complètement par un volume suffisant d’eau distillée au percolateur. L’extrait sec obtenu au rotavapor a été également pesé (m). Le rendement de l’extraction r(%) est donné par la formule : r = [m / M] x 100 37 II.3.3. La méthode des caractérisations phytochimiques a. Les réactions en tubes Les méthodes décrites par Ciulei et al. en 1982 [107] ont été utilisées. Ce sont des méthodes qualitatives permettant de caractériser les groupes chimiques présents dans la plante. Ces méthodes comportaient les tests de caractérisation chimique suivants : - le test de Shibata pour l’identification des flavonoïdes ; - la réaction de Borntragër pour l’identification des anthracénosides ; - le test de liebermann-Burchard pour l’identification des aglycones triterpéniques et stéroïdiques ; - le test de Dragendorff et de Mayer pour l’identification des alcaloïdes; - la réaction de Carr et Price pour l’identification des caroténoïdes ; - la réaction de Keedee pour l’identification des hétérosides cardiotoniques ; - les réactions d’identification des coumarines, des glucides, des anthocyanosides, des saponosides et des polyphénols (tanins). a1. Caractérisation des composés apolaires Caractérisation des caroténoïdes La réaction de Carr-Price a été utilisée : 2 mL de l’extrait au dichlorométhane (CH2Cl2) concentré ont été évaporés à sec dans une capsule en porcelaine et 2 à 3 gouttes d’une solution saturée de trichlorure d’antimoine dans du chloroforme (SbCl3) ont été ajoutées au résidu. La réaction est positive lorsque les pigments virent du bleu au rouge. Caractérisation des aglycones triterpéniques et stéroïdiques La réaction de Liebermann-Burchard a été utilisée : 5 mL de l’extrait au CH2Cl2 concentré ont été évaporés à sec dans un tube à hémolyse placé dans un bain-marie chaud. Le résidu a été dissout dans 0,25 mL d’anhydride acétique et 0,25 mL de CH2Cl2. La solution a été transférée dans un tube à essai et 1 mL d’acide sulfurique (H2SO4) concentré a été ajouté au sommet du liquide. La réaction est positive lorsqu’un anneau rouge brun ou violet brun se forme séparant les deux liquides. Le liquide supérieur devient bleu verdâtre ou violet en cas de présence de stérols et de triterpènes. 38 Caractérisation des alcaloïdes bases Les tests de Dragendorff et de Mayer ont été utilisés : 4 mL de l’extrait au CH2Cl2 concentré ont été évaporés à sec dans un tube à hémolyse. Le résidu a été dissous dans 2 mL d’acide chlorhydrique (HCl) 2%. La solution a été filtrée sur coton et le filtrat est utilisé pour faire réagir les réactifs de Dragendorff et de Mayer. - Le développement d’un précipité rouge orangé en présence du réactif de Dragendorff justifie la présence de composés aminés dans l’extrait. - L’apparition d’un précipité jaune blanchâtre ou d’une opalescence en présence du réactif de Mayer témoigne de la présence des alcaloïdes bases dans l’extrait. Caractérisation des aglycones flavoniques La réaction de Shibata ou Test à la cyanidine a été utilisée : 5 mL de l’extrait au CH2Cl2 concentré ont été évaporés à sec dans un tube à essai et le résidu a été dissous dans 2 mL d’éthanol 50%. La solution obtenue a été légèrement chauffée dans un bain-marie chaud. Des fragments de tournure de magnésium ont été ajoutés à la solution et 3-4 gouttes d’acide chlorhydrique (HCl) concentré y sont ajoutées. La solution est laissée barbotée dans le bainmarie. L’apparition d’une coloration rouge (flavonols) ou orange (flavanones) indique la présence d’aglycones flavoniques. Caractérisation des émodols La réaction de Bornsträger a été utilisée : 1 mL d’ammoniaque 25% a été ajouté à 1 mL d’extrait au dichlorométhane concentré. La solution a été agitée et laisser reposer 5 minutes. L’apparition d’une coloration rouge témoigne de la présence des émodols. Caractérisation des coumarines 2 mL de l’extrait au CH2Cl2 concentré ont été évaporés à sec et le résidu a été dissous dans 2 mL d’eau distillée chaude. Après refroidissement, 0,5 mL d’ammoniaque 10% ont été ajoutés suivi d’une observation sous la lampe ULTRAVIOLET (λ = 254 nm et λ = 366 nm). L’apparition d’une fluorescence intense bleu verdâtre ou violette indique la présence des coumarines. a. 2. Caractérisation des composés moyennement polaires Caractérisation des glycosides stéroïdiques La réaction de Liebermann-Burchard a été réalisée à partir de l’hydrolysat d’extrait de partie de la plante. 39 Caractérisation des alcaloïdes sels 10 mL de la phase aqueuse de l’hydrolysat ont été basifiés par de l’ammoniaque 25% (8≤pH≤9) et extraits par 2×5 mL de CH2Cl2. La phase organique a été évaporée à sec et 1 mL de HCl 2% a été ajouté au résidu. Les tests de Dragendorff et de Mayer ont été appliqués à la solution acide résiduelle. Caractérisation des flavonosides La réaction de Shibatat a été appliquée en utilisant l’hydrolysat de l’extrait méthanolique de chaque partie de la plante. Caractérisation des aglycones anthracéniques La réaction de Bornsträger a été réalisée avec l’hydrolysat des différents extraits. L’apparition d’une coloration rouge signe la présence de dérivés d’anthraquinones libres ou oxydés. Caractérisation des dérivés coumariniques La phase hydrolysée a servi à l’identification des dérivés coumariniques après observation aux UV (λ = 254 nm et λ = 366 nm). Caractérisation des anthocyanosides La phase aqueuse de l’hydrolysat a été utilisée : 1-2 grains de pastilles de soude ont été ajoutés à 1 mL d’extrait et l’apparition d’une coloration bleue indique la présence des anthocyanes dans l’extrait. Caractérisation des hétérosides cardiotoniques La réaction de Keddee a été utilisée : 1 mL de l’hydrolysat a été évaporé à sec et dissous dans 1 mL de méthanol 50%. 1 mL d’acide 3,5-dinitrobenzoïque 1% dans l’éthanol et 2 mL d’hydroxyde de potassium 1N ont été ajoutés à la solution. L’apparition d’une coloration rouge violette furtive après chauffage indique la présence de glycosides cardénoliques et de lactones penta atomiques non saturés. a.3. Caractérisation des composés polaires Caractérisation des glucides (oses et polyoses) 2 mL d’extrait aqueux ont été évaporés à sec dans une capsule en porcelaine et 2-3 gouttes de H2SO4 concentré ont été additionnées au résidu. Après 5 minutes de repos, 3-4 gouttes d’une solution d’α-naphtol 1% ont été ajoutées. L’apparition d’une coloration rouge indique la présence de glucides. Caractérisation des saponosides 2 mL d’extrait aqueux ont été dilués au demi avec de l’eau distillée (1/1 v/v) dans un tube à essais (16 cm ou 160 mm de hauteur) et agitées pendant 15 minutes. 40 L’apparition d’une colonne de mousse d’au moins 1 cm de haut persistant pendant au moins 15 minutes indique la présence de saponosides. Caractérisation des polyphénols (tanins) 1 mL d’extrait aqueux est dilué dans 1 mL d’eau distillée et additionné de 3 gouttes d’une solution diluée de trichlorure de fer (FeCl3 1%). - l’apparition d’une coloration bleu foncée indique la présence de tanins galliques ; - la présence de tanins catéchiques est indiquée par l’apparition d’une coloration vert foncé ; - l’apparition d’une coloration hybride indique la présence de tanins galliques et catéchiques. Caractérisation des composés réducteurs La réaction à la liqueur de Fehling a été utilisée : 1 mL d’extrait aqueux a été dilué dans 1 mL d’eau distillée et porté à ébullition pendant 30 minutes en présence de 1 mL de liqueur de Fehling (I+II). La présence de composés réducteurs est matérialisée par la formation d’un précipité rouge brique. b. L’analyse par la chromatographie sur couche mince (CMM) b.1. Principe Le principe de la CCM consiste en une séparation des substances chimiques en fonction de leur affinité par rapport à deux phases : une phase stationnaire solide (verre, silicagel…) et une phase mobile liquide (éluant) constituée par un système de solvant. Le support utilisé est en verre. b .2. Chromatographie sur couche mince (CCM) Des capillaires de 10 μL ont été utilisés pour le dépôt des différents extraits soumis à la migration chromatographique. Sur une même plaque chromatographique, sont déposés les trois extraits correspondant aux trois drogues végétales : écorce (Ec), racines (R) et feuilles (Fe). Des dépôts en bande ont été réalisés et la distance entre deux dépôts était de 1 cm. Les plaques ont été séchées à l’air ambiant et placées dans des cuves de migration contenant préalablement des solvants appropriés. La distance de parcours de l’éluant a été de 8 cm à partir du point de dépôt. Après la migration, les plaques ont été retirées, séchées et révélé avec un réactif spécifique pour l’identification des groupes chimiques. 41 b.3. Les révélation des groupes chimiques Détection des tanins. L’éluant était le système de solvant S3 : n-butanol/eau/acide acétique glacial : (2 : 1 : 1 v/v). Les plaques ont été pulvérisées avec une solution de chlorure ferrique à 2% (FeCl3 2%) dans du méthanol 80% et séchées à l’air. L’apparition de tâches de coloration bleu foncé révèle la présence de tanins hydrolysables (galliques). Les tanins condensés (catéchiques) donnent une coloration verdâtre Détection des saponosides. Le solvant de migration était le système de solvant S4 : acétate d’éthyle/ Méthanol/ eau : (10 : 5: 9 v/v). La pulvérisation avec de l’anisaldéhyde sulfurique a permis la révélation. L’apparition de taches brunes ou violettes après chauffages des plaques à 110°C pendant 10min, sur une plaque chauffante indique la présence de saponosides. Détection des glucosides et des aglycones stéroïdiques et triterpéniques L’éluant pour la détection des glucosides stéroïdiques et triterpéniques était le système S1 : éthyle acétate/acide formique/acide acétique glacial/eau : (100 : 11 : 11 : 26 v/v). L’éluant pour la détection des aglycones stéroïdiques et triterpéniques était le système de solvant S2 : n-hexane/ Toluène/ acétate d’éthyle: (3 : 1 : 1 v/v). La pulvérisation avec de l’anisaldéhyde sulfurique a permis la révélation par l’apparition de spots bruns (phytostérols) ou violets (triterpènes). Détections des flavonoïdes et des aglycones flavoniques. L’éluant pour la détection des flavonoides était le système S1 : éthyle acétate/acide formique/acide acétique glacial/eau : (100 : 11 : 11 : 26 v/v). L’éluant pour la détection des aglycones flavoniques était le système de solvant S2 : n-hexane/ Toluène/ acétate d’éthyle: (3 : 1 : 1 v/v). La révélation a été faite à la lumière UV à 365 nm après exposition des plaques aux vapeurs d’une solution éthanolique de diphenylborinate et d’ethyle glycol. Les flavonoïdes ou aglycones correspondants apparaissent jaunes ou jaune orangé. Détection des coumarines et dérivés coumariniques. Le système de solvant utilisé pour l’élution des dérivés coumariniques était le système S1 : éthyle acétate/acide formique/acide acétique glacial/eau : (100 : 11 : 11 : 26 v/v). Les coumarines ont été éluées par le système de solvant S2 : n-hexane/ Toluène/ acétate d’éthyle: (3 : 1 : 1 v/v). 42 La révélation a été faite à la lumière UV à 366 nm, après pulvérisation des plaques par une vapeur d’une solution de NaOH à 5% dans de l’éthanol 95°. A cette longueur d’onde les coumarines et leurs dérivés, sous forme de spots émettent une fluorescence bleue. II.3.4. Le test d’évaluation de l’effet antiradicalaire des extraits La capacité des extraits à donner un proton à un radical stable, le DPPH (1-1-diphenyl2-picryl-hydrazyl) a été évaluée comme décrit par Kim et al. en 2003 [108] avec quelques modification. Dans ce test, les antioxydants contenus dans les extraits de la plante réduisent le DPPH (couleur violette) en un composé jaune. La mesure de la diminution de l’absorbance du DPPH à 520nm rend compte de l’effet antioxydant des extraits. Pour ce faire, une série de 10 doses (24 ; 20 ; 6 ; 3 ; 2 ; 0,3 ; 0.2 ; 0.03 ; 0.02 et 0.002 mg/mL) ont été préparées à partir de solutions d’échantillon à 40mg/mL dans du DMSO. Les concentrations finales de dans le milieu réactionnel sont les 1/20 de ces concentrations. A 950 μL de la solution méthanolique de DPPH (101 µM), ont été ajoutés 50 µL de la dose du composé (extraits ou quercétine) à tester. Le mélange a été incubé à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à 37°C. L’absorbance a été mesurée à 520 nm contre un blanc (950 μL de méthanol + 50 µL de la dose d’extrait à tester). La décoloration par rapport au contrôle négatif (950 µL solution de DPPH + 50 µL de DMSO) est mesurée à 520 nm. La quercétine (950 µL solution de DPPH + 50 µL de quercétine dans du DMSO) nous a servi de contrôle positif Les conditions expérimentales ont été réalisées en triplicata avec les dix concentrations. L’effet anti radicalaire est estimé selon l’équation ci-dessous: Effet anti radicalaire (%) = [(Abs520 contrôle–Abs520 échantillon) / Abs520 contrôle] x 100 - Abs520 contrôle : absorbance du contrôle négatif à 520 nm - Abs520 échantillon : absorbance du test (extrait ou quercétine) à 520 nm. 43 II.3.5. Le test d’évaluation de l’effet anti-lipooxygénase a. Préparation des réactifs A : Tampon Borate : 0,2 M, pH 9,0 Dissoudre 19,05 g de Sodium tetraborate (Na2B4O7, 10 H2O) [(0,2 M) : FW 381,37] dans 250 mL d’eau distillée afin d’obtenir une solution (S1) de concentration 76,2 g/L. Dissoudre 4,34 g d’Acide borique (H3BO3: 0,2 M, PM = 61,83) dans 350 mL d’eau distillée afin d’obtenir une concentration S2 = 12,4 g/L Le tampon borate 0.2 M, est obtenu en ajoutant S2 à S1 jusqu’à obtention du pH 9.0, le volume est ensuite complété à 1 L. B: Solution de substrat (250 µM) D'abord l'acide linoléique (substrat) a été pré oxydé afin de favoriser l'activité de l'enzyme, ainsi il été laissé à l'air libre pendant toute une nuit à la température du laboratoire, il a ensuite été conservé au congélateur. 10 µL d'acide linoléique, 30 µL d'éthanol et 120 mL de tampon borate ont été mélangés pour obtenir 250 µM d’acide linoléique. La solution est utilisée dans un intervalle de 24 h. C: Solution d'Enzyme La solution d’enzyme est obtenue par préparation de la lipoxygénase (EC 1.13.11.12) de type I-B (extraite du soja) (200 U/mL) dans du Tampon borate. D: Inhibiteurs Les inhibiteurs sont les solutions d'extraits dissout dans le tampon borate contenant 1% de DMSO à différentes concentrations (0.25 ; 0.50 ; 1 ; 1.5 ; 2 et 2,5 mg/ml). Les concentrations finales de dans le milieu réactionnel sont les 1/10 de ces concentrations. b. Principe Le test d’inhibition de la lipooxygénase a été réalisé selon la méthode spectrophotométrique décrite par Lyckander & Malterud en 1992 [49]. La lipooxygénase est une enzyme capable d’oxyder l’acide linoléique en hydropéroxydiènes conjugués qui absorbe à 234 nm. En présence d’un composé inhibiteur, il y a une diminution de la vitesse d’apparition d’hydropéroxydiènes conjugués. La comparaison de la vitesse (Vx) en présence d’un composé avec la vitesse initiale (Vi) de l’enzyme permet d’évaluer l’effet inhibiteur du composé. 44 c. Mode opératoire A 400 µL d’une solution de lipooxygénase type I-B dans du tampon borate de sodium (pH9), ont été ajoutés 100 µL de la solution contenant l’extrait à tester (concentrations variant de 0.125 mg/mL à 2.5 mg/mL dans du tampon borate pH9). Le mélange réactionnel a été incubé pendant 10 min à la température de 25°C. L’addition de 500 µL d’une solution d’acide linoléique (utilisé comme substrat) initiait la réaction. Lire la vitesse enzymatique à 234 nm pendant 1 h 30 min contre un blanc (400 µL de tampon + 100 µL d’extrait + 500 µL d’acide linoléique) Toutes les conditions expérimentales ont été répétées trois fois. Le pourcentage d’inhibition a été calculé selon la formule suivante : INHIBITION (%) = [(Vi - Vx) / Vi] x100 Vi : activité de l’enzyme sans le composé à testé ; Vx : activité de l’enzyme en présence du composé à tester. II.3.6. Expression et analyse des données Toutes les expériences ont été effectuées en quadruplicata (n = 4). Les données obtenues ont été présentées sous la forme de moyenne ± SEM. Les valeurs des concentrations inhibitrices 50% (IC50) ont été déterminées à partir des courbes doses / effets obtenues à l’aide du logiciel PRISM version 5.0. 45 III. RESULTATS DE L’ETUDE III.1. Les teneurs en humidité relative (THR) Les taux moyens d’humidité relative des poudres déterminés en trois essais ont été consignés dans le tableau II. Les teneurs étaient différentes selon les parties de la plante. La poudre de racine présentait la plus faible teneur moyenne. Tableau II : les taux moyens d’humidité relative des poudres des drogues végétales (n=3) Poudres de drogues végétales Taux d’humidité résiduel (%) Ecorces de tronc Racines Feuilles 5.54 ± 0.05 3.09 ± 0.23 5.14 ± 0.02 III.2. Les rendements d’extractions L’épuisement successif par percolation des drogues a permis d’obtenir des masses d’extraits dont les rapports sur les prises d’essais sont présentés dans le tableau III. Tableau III : le rendement des extractions en fonction des solvants et des drogues. Solvants d’extraction Rendements d’extraction (%) Ecorces de tronc Racines Feuilles Dichlorométhane 4.24 1.16 1.96 Acétate d’éthyle 1.56 0.30 1.25 Méthanol 2.20 2.21 6.50 Eau 9.7 10.16 12.30 46 III.3. La caractérisation des groupements phytochimiques III.3.1. les réactions colorées en tube Les résultats positifs des réactions en tube sont présentés dans le tableau IV. Globalement, les écorces et les racines étaient plus riches que les feuilles en composés phytochimiques détectables par la méthode employée. Les saponosides, les composés stéroïdiques et triterpéniques, les coumarines et leurs dérivés ont été détectés dans toutes les parties de la plante. Par contre les flavonoïdes et les tannins ont été plus retrouvés dans les racines et les écorces de tronc. Tableau IV : Les groupes phytochimiques mis en évidence dans les extraits d’E. senegalensis DC selon les parties de la plantes Solvants d’extraction Résultats obtenus Groupes chimiques Dichlorométhane Acétate d’éthyle Méthanol Ecorces de tronc Racines Feuilles Stérols & triterpènes + (rouge brun) ++ (rouge brun) Non décelé Aglycones flavoniques ++ (rouge orange) ++ (rouge orange) + (rouge orange) Coumarines ++ (fluorescence verte) ++ (fluorescence verte) ++ (fluorescence verte) Flavonosides ++ (orange) + (orange) Non décelé Tanins ++ (vert) Non décelé Non décelé Flavonosides ++ (jaune orange) ++ (jaune orange) Non décelé Tanins ++ (vert) + (vert) ++ (vert) Saponosides ++ (Hmousse > 1.5cm) ++ (Hmousse > 1.5cm) ++ (Hmousse > 1.5cm) Dérivés coumariniques ++ (fluorescence verte) + (fluorescence verte) ++ (fluorescence verte) ++ (anneau rouge brun) ++ (anneau rouge brun) ++ (anneau rouge brun) Flavonosides + + Non décelé Tanins Non détecté Non décelé Non décelé Saponosides ++ ++ ++ Glucoside stéroidiques & triterpèniques Eau + : abondant ; ++ : très abondant 47 III.3.2. La chromatographie sur couche mince (CCM) a. Détection des flavonoïdes Sur les chromatogrammes (photos 4 et 5), les aglycones flavoniques et leurs hétérosides apparaissent sous forme de spots jaune-orange et les acides phénoliques en spots bleus. Le nombre de spots majeurs et leurs références frontales ont été consignés dans le tableau V. Flavonosides Aglycone flavonique 4 Ec R F 5 Ec R F Figure 12 : La révélation des aglycones flavoniques et des flavonosides Légende : Ec : extrait de l’écorce de tronc ; R : extrait de racines ; F : extrait de feuiles Développements des chromatogrammes Chromatogramme des aglycones flavonique (photo 4) - Eluant : S2 : n-hexane/ Toluène/ acétate d’éthyle: (3 : 1 : 1 v/v) - Révélation : la lumière UV à 366 nm après exposition des plaques aux vapeurs d’une solution ethanolique de diphenylborate et d‘éthyle glycérol Chromatogramme des flavonosides (photo 5) - Eluant : S1 : éthyle acétate/acide formique/acide acétique glacial / eau : (100 : 11 : 11 : 26 v/v) - Révélation : la lumière UV à 366 nm après exposition des plaques aux vapeurs d’une solution ethanolique de diphenylborate et d‘éthyle glycérol 48 Tableau V : Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des flavonosides et aglycones flovoniques Drogues végétales Groupes chimiques Ecorces de tronc (Ec) Racines (R) Feuilles (F) Rf couleur Rf couleur Rf couleur 0.013 Jaune-orange 0.013 Jaune-orange 0.013 Jaune-orange 0.067 Jaune-orange 0.069 Bleue Flavonosides 0.13 Bleue 0.16 Bleue (λ = 366 nm) 0.24 Jaune-orange 0.27 Bleue 0.41 Jaune-orange 0.30 Jaune-orange 0.53 Jaune-orange 0.52 Bleue 0.19 Jaune-orange 0.09 Bleue 0.33 Jaune-orange 0.27 Jaune-orange 0.23 Bleue 0.41 Jaune-orange 0.33 Jaune-orange 0.33 Bleue 0.55 Jaune-orange 0.47 Jaune-orange 0.4 Bleue 0.48 Jaune-orange 0.52 Bleue 0.57 Jaune-orange Aglycone flavonique Bleue La photo 4 et le tableau V montrent que les extraits d’écorces et de feuilles étaient riches en aglycones flavoniques (couleur jaune-orange) et les extraits de racines en acide phénoliques (couleur bleue). Un même type d’aglycone semblait se retrouver dans les extraits de feuilles et d’écorces (Rf identique : 0.33). La photo 5 et le tableau V montrent que les flavonosides étaient plus abondants (4 spots de couleur jaune-orange) dans les extraits d’écorces que les autres extraits. Les extraits de racines contenaient plus, les acides phénoliques (couleur bleue). Un flavonoside (Rf : 0.013) était présent dans toutes les drogues. 49 b. Détection des coumarines et leurs dérivés Les coumarines et leurs dérivés apparaissent sous formes de spots fluorescents bleus verdâtres. Le nombre de spots majeurs et leurs références frontales ont été consignés dans le tableau VI Coumarines Dérivés coumariniques 7 6 Ec Ec R R F F Figure 13: La révélation des coumarines et dérivés coumariniques Développement des chromatogrammes Chromatogramme des coumarines (photo 6) - Eluant : S2 : n-hexane/ Toluène/ acétate d’éthyle: (3 : 1 : 1 v/v) - Révélation : la lumière UV à 366 nm après exposition des plaques aux vapeurs d’une solution de NaOH à 5% dans de l’éthanol 95° Chromatogramme des dérivés coumariniques (photo 7) - Eluant : S1 : éthyle acétate/acide formique/acide acétique glacial / eau : (100 : 11 : 11 : 26 v/v) - Révélation : la lumière UV à 366 nm après exposition des plaques aux vapeurs d’une solution de NaOH à 5% dans de l’éthanol 95° 50 Tableau VI : Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des coumarines et leurs dérivés. Drogues végétales Groupes chimiques Ecorces de tronc (Ec) Rf couleur 0.17 Racines (R) Rf couleur 0.17 Feuilles (F) Rf couleur 0.43 0.27 Fluorescence 0.27 Fluorescence 0.59 Fluorescence Coumarines 0.32 bleu verdâtre 0.32 bleu verdâtre bleu verdâtre (λ = 366 nm) 0.41 0.47 0.47 0.57 Non décelé 0.67 0.11 0.11 Coumariniques 0.17 Fluorescence 0.17 Fluorescence (λ = 366 nm) 0.27 bleu verdâtre 0.27 bleu verdâtre - 0.44 Les extraits de racines et d’écorce présentaient quatre (4) spots majeurs de mêmes Rf (0.11, 0.27, 0.32 et 0.47). Les Rf des spots obtenus avec le dépôt d’extraits de feuilles différaient des Rf des spots observés avec les autres drogues végétales. La photo 7 et le tableau VI montrent que les dérivés coumariniques ont été révélés par quatre (4) spots majeurs de fluorescence bleu-verdâtre sur la ligne de migration des extraits d’écorce contre trois (3) spots sur celle des extraits de racines. Les trois (3) spots de racines avaient leurs Rf (0.11, 0.27 et 0.44) identiques avec trois des quatre spots observés avec les écorces. Au niveau du trajet des extraits de feuilles nous avons observé des trainées avec des contours imprécis. Ce qui ne nous a pas permis de déterminer avec certitude les références frontales 51 c. Détection des tanins Sur le chromatogramme (photo 8) les tanins apparaissent sous formes de spots bleus noirâtres. Le nombre de spots majeurs et leurs références frontales sont dans le tableau VII. Tanins 8 Ec R F Figure 14: La révélation des tanins Développements des chromatogrammes Chromatogramme des tanins (photo 8) - Eluant : S3 : n-butanol/eau/acide acétique glacial : (2 : 1 : 1 v/v) - Révélation : pulvérisation des plaques avec une solution à 2% de FeCl3 dans du methanolique 80% Tableau VII : Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots des tanins révélés Drogues végétales Groupes chimiques Ecorces de tronc (Ec) Rf Tanins couleur Racines (R) Rf couleur Feuilles (F) Rf couleur 0.03 Verte 0.11 Verte 0.91 Verte 0.36 Verte 0.35 Verte 0.32 Verte 0.88 Bleu-noir 0.88 Bleu-noir Le chromatogramme ci-dessus (photo 8) et le tableau VII montrent que les tanins catéchiques (spots verts) sont les plus dominants dans toutes les drogues avec des références frontales différentes. Les tanins galliques (spots bleu-noir) retrouvés dans l’écorce de tronc et les racines ont les mêmes références frontales (Rf), 0.88. 52 d. Détection des saponosides Les saponosides ont été décelés dans toutes les drogues végétales étudiées (Feuille, écorce de tronc et racines) par l’apparition de spots rouges-bruns ou violets sur le chromatogramme (photo 9). Saponosides 9 Ec R F Figure 15 : La révélation de saponosides Développements des chromatogrammes Chromatogramme des saponosides (photo 9) - Eluant : S4 : acétate d’éthyle/ Méthanol/ eau : (10 : 5: 9 v/v) - Révélation : pulvérisation avec une solution d’anisaldéhyde sulfurique puis chauffage à 110°C, 10 min Tableau VIII : Les références frontales (Rf) et les couleurs des spots des saponosides Drogues végétales Groupes chimiques Ecorces de tronc (Ec) Rf Saponosides couleur Racines (R) Rf couleur Feuilles (F) Rf couleur 0.013 Violette 0.013 Violette 0.013 Violette 0.067 Rouge brun 0.067 Rouge brun 0.067 Rouge brun 0.16 Rouge brun 0.16 Rouge brun 0.27 Violette 0.23 Rouge brun 0.27 Violette 0.39 Violette 0.29 Rouge brun 0.43 Violette 0.57 Violette 53 e. Détection des stérols et triterpènes et leurs dérivés glucosides Sur les chromatogrammes (photos10 et 11), les glucosides stéroidiques et les stérols ont été détectés par des spots bleus (et rouges-bruns) tandis que les triterpènes et les glucosides triterpéniques apparaissaient sous forme de spots violets. Le nombre de spots majeurs et leurs références frontales sont dans le tableau IX. Stérols & Triterpène Glucosides Stéroid&Triterp 11 10 Ec R F Ec R F Figure 16 : La révélation des stérols & triterpènes et de leurs glucosides. Développement des chromatogrammes Chromatogramme des glucosides stéroidiques et triterpènes (Photo 10) - Eluant : S1 : éthyle acétate/acide formique/acide acétique glacial / eau : (100 : 11 : 11 : 26 v/v) - Révélation : pulvérisation avec une solution d’anisaldéhyde sulfurique Chromatogramme des stérols et triterpènes (photo 11) - Eluant : S2 : n-hexane/ Toluène/ acétate d’éthyle: (3 : 1 : 1 v/v) - Révélation : pulvérisation avec une solution d’anisaldéhyde sulfurique 54 Tableau IX : les références frontales (Rf) et les couleurs des spots après révélation des glucosides stéroidiques & triterpéniques, des stérols & triterpènes. Groupes chimiques Drogues végétales Ecorce de tronc (Ec) Rf couleur Racine (R) Rf couleur Feuille (F) Rf couleur Glucosides stéroidiques 0.09 Bleue 0.11 Bleue 0.11 Bleue et triterpéniques 0.24 Bleue 0.23 Bleue 0.40 Bleue 0.29 Bleue 0.40 Bleue 0.87 bleue 0.38 Violette 0.53 Violette 0.43 Bleue 0.88 bleue 0.84 Violette 0.2 Rouge brun 0.27 Rouge brun 0.27 Rouge brun 0.33 Rouge brun 0.33 Rouge brun 0.40 Violette 0.40 Violette 0.47 Rouge brun 0.59 Violette 0.60 Violette 0.65 Rouge brun 0.65 Rouge brun 0.89 Violette 0.88 violette Stérols & triterpène - Non décelé Le tableau IX montre que les glucosides stéroidiques (spots bleus) et triterpéniques (spots violets) étaient présentés dans toutes les drogues végétales étudiées. Les extraits de racines et de feuilles présentaient deux (2) spots bleus identiques (Rf : 0.11 et 0.40). Tous les spots observés sur le trajet de l’extrait des écorces présentaient des Rf différentes d’avec celles des autres extraits de la plante. Les stérols et les triterpènes ont été plus abondamment (7 spots) retrouvés dans les écorces de tronc et les racines que dans les feuilles (trainées sans contour précis). 55 III.4. L’effet antiradicalaire des extraits III.4.1. les effets antiradicalaires des extraits de feuilles L’extrait au dichlorométhane a été le plus actif des extraits de feuilles d’E. senegalensis DC. (tableau X) Les extraits aqueux n’étaient pas solubles dans les conditions de travail et n’ont alors pas fait l’objet d’évaluation d’effets antiradicalaires. Tableau X : Effets antiradicalaires doses-dépendants des extraits de feuilles (n=4) Concentrations des extraits (µg/mL) Effets antiradicalaires (% d’inhibition) DCM EtOAc MeOH 1200 92,67 ± 3,1 89,1 ± 1,54 90,0 ± 0,7 1000 83,46 ± 5,7 60,4 ± 15,53 49,4 ± 3,8 300 21,78 ± 1,6 23,8 ± 9,5 7,9 ± 2,5 100 9,41 ± 2,4 6,6 ± 4,9 0,07 ± 7,1 30 1,43 ± 0,47 2,4 ± 0,4 2,37± 5,56 10 0,52 ± 0,4 -21,7 ± 22,2 9,82 ± 3,06 3.0 -2,7 ± 2,1 0,23 ± 0,6 18,0 ± 1,2 1.0 -5,2 ± 7,4 0,38 ± 0,4 15,8 ± 3,4 IC50 (µg/mL) 148,5 ± 6,3 469,3 ± 1,1 306,4 ± 1,01 56 III.4.2. les effets antiradicalaires des extraits d’écorces Les différents extraits ont présenté des effets inhibiteurs dose-dépendants sur le DPPH. L’extrait au dichlorométhane (DCM) a été le plus actif (IC50 : 57,6 ± 0.68). Les moindres effets inhibiteurs du DPPH ont été observés avec l’extrait aqueux de feuilles (IC50 :700.1 ±12,3). Le tableau XI rend compte des effets des extraits d’écorces sur le DPPH. Tableau XI : Effets antiradicalaires doses-dépendants des extraits d’écorces de tronc d’E. senegalensis DC (n=4). Concentrations des extraits (µg/mL) Effets antiradicalaire (% d’inhibition) DCM EtOAc MeOH AQ 1200 97,3 ± 0,86 96,5 ± 1,6 94,8 ± 1.35 67,2 ± 3,8 1000 94,7 ± 1,02 96,1 ± 1,49 90,4 ± 0.62 62,3 ± 6,12 300 66,8 ± 0,71 75,8 ± 2,14 59,6 ± 0.59 54,1 ± 12,42 100 47,3 ± 0,52 47,4 ± 2,32 20,7 ± 2.94 18,6 ± 1,12 30 26,1 ± 1,29 21,3 ± 3,5 9,7 ± 1.3 2,5 ± 2,17 10 24,8 ± 3,21 2,0 ± 0,69 6,2 ± 0.61 0,7 ± 1,2 3.0 21,2 ± 1,27 0,53 ± 0,01 2,9 ± 1.21 -1,1 ± 0,04 1.0 17,07 ± 2,57 -11,2 ± 0,28 -0,11 ± 1.2 -3,9 ± 0,51 IC50 (µg/mL) 57,6 ± 0,68 114 ± 12,6 263 ± 1,8 700.1 ±12,3 DCM: dichlorométhane ; EtOAc: acetate d’éthyle ; MeOH: méthanol ; AQ : aqueux 57 III.4.3. les effets antiradicalaires des extraits de racines entières Les différents extraits ont présenté des effets inhibiteurs dose-dépendants sur le DPPH. Les extraits au dichlorométhane (DCM) et à l’acétate d’éthyle (AC. ETH) ont été les plus actifs avec respectivement des concentrations inhibitrices 50% atteignant 51,8 ± 0.06 et 72,7 ± 0.13. Aux doses élevées les extraits aqueux devenaient insolubles. Le tableau XII rend compte des effets des extraits d’écorces sur le DPPH. Tableau XII : Effets antiradicalaires doses-dépendants des extraits de racines d’E. senegalensis DC (n=4) Concentrations des extraits (µg/mL) Effets antiradicalaire (% d’inhibition) DCM EtOAc MeOH AQ 1200 96.2±0.12 94.2 ± 0.02 95.1 ± 0.95 insoluble 1000 93.8±1.04 91.1 ± 0.79 89.8 ± 0.34 insoluble 300. 88.5±0.18 89.6 ± 0.12 33.2 ± 1.14 61,2 ± 0,17 100 62.0±2.01 59.0 ± 0.07 28.4 ± 1.10 62,3 ± 6,12 30 32.5±0.4 19.2 ± 0.51 6.9 ± 1.02 51,1 ± 2,52 10 15.8±2.1 13.6 ± 0.23 5.8 ± 2.13 9,6 ± 0,89 3.0 9.2±0.05 8.3 ± 1.2 4.7 ± 0.47 2,5 ± 2,17 1.0 -0.9 ± 0.16 8.1 ± 1.02 4.2 ± 1.06 0,7 ± 1,2 0.3 -8.7 ± 0.41 0.34 ± 0.05 3.8 ± 1.08 -1,1 ± 0,04 0.1 -15.1 ± 0.31 -2.46 ± 1.05 3.6 ± 0.25 -3,9 ± 0,51 IC50 (µg/mL) 51.8 ± 0.06 72.7 ± 0.13 321 ± 4.21 987.1 ±12,3 DCM: dichlorométhane ; EtOAc: acetate d’éthyle ; MeOH: méthanol ; AQ : aqueux 58 III.4.4. Le récapitulatif des effets antiradicalaires des extraits par épuisement successif d’E. senegalensis DC. Le tableau XIII montre que les différents extraits d’E. senegalensis DC présentent des effets réducteurs du DPPH qui varient significativement d’un extrait à un autre et d’une drogue végétale à une autre. Les extraits au dichlorométhane de racines (IC50: 51.8 ± 0.06) et d’écorces de tige (IC50: 57,6 ± 0,68), ainsi que les extraits à l’acétate d’éthyle de racines (IC50: 72.7 ± 0.13) ont présenté les meilleurs effets antiradicalaires. Tableau XIII : Récapitulatif des effets antiradicalaires des extraits par épuisement successif d’E. senegalensis DC. Solvants d’extraction Les concentrations inhibitrices 50% (IC50 ± SEM) Ecorces Racines Feuilles Dichlorométhane 57,6 ± 0,68 51,8 ± 0,06 148,5 ± 6,3 Acétate d’éthyle 114 ± 12,6 72.7 ± 0.13 469,3 ± 1,1 Méthanol 263 ± 1,8 321 ± 4,21 306,4 ± 1,01 700.1 ±12,3 987.1 ±12,3 indéterminé Eau 59 III.5. L’effet inhibiteur de la lipooxygénase des extraits Afin de déceler les extraits qui pourraient présenter des potentiels inhibiteurs intéressants, nous avions d’abord testé 100 µg/mL de chaque extrait (tableau XIV). Nous avions ensuite recherché une relation dose-effet des extraits dont le pourcentage d’inhibition avait été supérieur à 40% (tableau XIV). Certains extraits ont présenté des effets anti-lipooxygénase doses-dépendants (tableaux XVI et XVII) et d’autres sans relation avec l’augmentation des doses des extraits (tableau XV) III.5.1. Les tests préliminaires à la concentration de 100 µg/mL de l’extrait Tableau XIV : les effets inhibiteurs des extraits d’E. senegalensis DC à la dose de 100 µg/mL Extraits Pourcentage d’inhibition (% d’inhibition) à 100 µg/mL FEUILLES DCM (46.62 ± 0.15) % EtOAc (26.97 ± 1.1) % MeOH (25.55 ± 4.1) % Eau (9.09±1.3) % ECORCES DE TRONC DCM (69.89 ± 0.3) % EtOAc (67.41 ± 1.2) % MeOH (66.40 ± 0.5) % Eau (17.79 ± 0.1) % RACINES DCM (73.03 ± 0.2) % EtOAc (75.29 ± 0.1) % MeOH (34.78 ± 0.1) % Eau (13.01 ± 3.3) % 60 III.5.2. Les extraits à effets anti-lipooxygénase non doses-dépendants A des doses variées, les extraits ne présentaient pas d’effets significativement différents (tableau XV). Le meilleur potentiel inhibiteur de la lipooxygénase a été observé avec l’extrait méthanolique des écorces de tronc (MeOH-Ec). Tableau XV : Les effets non dose-dépendant des extraits d’E. senegalensis DC (n=4) Extraits Pourcentage d’inhibition (% d’inhibition) à 100 µg/mL à 250 µg/mL DCM-F (44.11 ± 2.3) % (42.99 ±1.3) % MeOH-Ec (64.09 ± 1.3) % (61.61 ± 3.3) % MeOH-R (32.12 ± 1.6) % (27.98 ± 6.7) % DCM-F : extrait dichlorométhanique de feuilles ; MeOH-Ec : extraits méthanoliques des écorces de tronc ; MeOH-R : extrait méthanolique de racine. 61 62 III.5.3. Les extraits à effets anti-lipooxygénase doses-dépendants a. Les effets inhibiteurs doses-dépendants de la 12-lipooxygénase des extraits de racines d’E. senegalensis DC. Les extraits au dichlorométhane et à l’acétate d’éthyle des racines d’E. senegalensis DC ont montré une inhibition dose-dépendante de la 12-lipooxygénase (tableau XVI). L’extrait à l’acétate d’éthyle a été le plus actif (IC50: 74,17±2,31). Tableau XVI : Les effets inhibiteurs de la 12-lipooxygénase des extraits de racines d’E. senegalensis DC (n=4) Concentrations des extraits (µg/mL) Effets anti-lipooxygénase (% d’inhibition) DCM EtOAc 250 63.0 ± 1.03 58.9 ± 0.71 100 46.34 ± 1.01 44,6 ± 1.41 25 23.0 ± 0.12 6,2 ± 1.61 10 12.5 ± 0.48 4,7 ± 2.12 2,5 10.13 ± 1.57 1,16 ± 2.30 1.0 0.10 ± 0.09 0,08 ± 1.60 IC50 220.3 ± 1.30 72,14 ± 2.31 63 b. Les effets inhibiteurs doses-dépendants de la 12-lipooxygénase des extraits d’écorces de tige d’E. senegalensis DC. L’extrait à l’acétate d’éthyle, aux doses de 49.54 ±1.12 a été capable de réduire de 50% l’activité enzymatique de la 12-lipooxygénase (tableau XVII). Tableau XVII : Effets inhibiteurs doses-dépendants de la 12-lipooxygénase des extraits d’écorces de tige d’E. senegalensis DC (n=4) Concentrations des extraits (µg/mL) Effets anti-lipooxygénase (% d’inhibition) DCM EtOAc 250 59±2.3 61±0.21 100 38.5±1.1 54±0.34 25 18.0±0.12 10±1.47 10 5.9±0.58 7.5±2.20 2.5 3.13±1.01 1.12±0.07 1.0 0.16±0.01 0.02±0.03 IC50 214.6±3.8 49.54±1.12 III.5.4. Récapitulatif des effets inhibiteurs de la 12-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC. Tableau XVIII : récapitulatif des effets inhibiteurs de la 12-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC Extraits Effets anti-lipooxygénase (IC50±SEM) Ecorces de tronc Racines entières DCM 214.6±3.8 220.3 ± 1.30 EtOAc 49.54±1.12 72,14 ± 2.31 64 III.6. Récapitulatif des effets inhibiteurs du DPPH et de la 12-LOX des extraits d’E. senegalensis DC. Les meilleurs potentiels antiradicalaires et inhibiteurs de la 12-lipooxygénase ont été observés avec les extraits au dichlorométhane (DCM) et les extraits à l’acétate d’éthyle (EtOAc). Les extraits au DCM ont présenté d’excellents effets antiradicalaires (DPPH) tandis que les extraits à l’acétate d’éthyle présentaient les meilleurs effets inhibiteurs de la 12lipooxygénase du soja. Nous avons observé que l’extrait à l’acétate d’éthyle d’écorce de tronc qui présentait le meilleur effet inhibiteur de la lipooxygénase avait un effet antiradicalaire modéré (IC50LOX : 49,54 ± 1,12 versus IC50-DPPH : 114 ± 12,6). Par contre, l’extrait à l’acétate d’éthyle de la racine était aussi bien antiradicalaire qu’inhibiteur de la 12-lipooxygénase de soja (IC50-LOX : 72,14 ± 2,31 versus IC50-DPPH : 72.7 ± 0.13). Tableau XIX: Le récapitulatif des meilleurs potentiels antiradicalaire et inhibiteurs de la 12-lipooxygénase Extraits d’E. Effets inhibiteurs (IC50±SEM) senegalensis Ecorces de tronc Racines entières 12-LOX DPPH 12-LOX DPPH DCM 214,6 ± 3,8 57,6 ± 0,68 220,3 ± 1,30 51.8 ± 0.06 EtOAc 49,54 ± 1,12 114 ± 12,6 72,14 ± 2,31 72.7 ± 0.13 65 IV. DISCUSSIONS / COMMENTAIRES Nos résultats mettent en évidence les effets antiradicalaires et inhibiteurs de la 12lipooxygénase. Ces effets sont liés aux composés phytochimiques contenus dans les extraits de feuilles, d’écorces de tronc et de racines entières d’E. senegalensis DC IV.1. Les teneurs en humidité relative (THR) Le calcul des teneurs en humidité relative des poudres (tableau II) a donné pour les écorces de tronc 5.54 ± 0.05, les feuilles 5.14 ± 0.02 et les poudres de racines 3.09 ± 0.23. La teneur en humidité relative est une donnée de la conservation des poudres de plante. En effet, l’humidité peut favoriser la détérioration de la qualité microbiologique de la poudre. L’humidité pourrait également offrir des conditions aux enzymes d’hydrolyse de poursuivre des réactions avec pour conséquence la variation des métabolites secondaires (composés phytochimiques) au cours du temps de conservation. Un THR de 5% constitue la norme selon la pharmacopée européenne. A cet effet, nos poudres à l’étude présentaient de bonnes propriétés de conservation. IV.2. Les rendements d’extractions L’épuisement successif par percolation des drogues a permis d’obtenir des masses d’extraits variables selon les solvants utilisés et selon les parties de la plante (tableau III). L’eau, le dichlorométhane et le méthanol ont donné de meilleurs rendements d’extraction. Cependant les extraits au dichlorométhane, au méthanol et à l’acétate d’éthyle (le plus faible des rendements d’extraction) ont été les plus utiles au vu des effets obtenus avec ces extraits. L’épuisement des écorces par le dichlorométhane et le méthanol a donné respectivement 4,24% et 2,2% comme rendements d’extraction. Nos valeurs étaient nettement supérieures à celles trouvées par Togola et al., (2008) [91] qui avait utilisé le soxhlet. L’auteur trouvait 1,2% pour le méthanol et 3,9% pour le dichlorométhane. Par contre pour les extraits méthanoliques de racine, nous avions trouvé des rendements comparables : 2,21% (notre étude) et 2,31% (Togola et al., 2008) [91]. Ces différences pourraient s’expliquer par le fait que l’extraction au soxhlet donnerait un rendement moindre que la percolation qui nous a servi de méthode d’extraction dans notre étude. 66 IV.3. Les caractérisations phytochimiques Les résultats des analyses obtenus par les réactions de caractérisation (en tube) et la chromatographie sur couche mince (CCM) des extraits au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au méthanol et à l’eau ont montré que les poudres des écorces de tige, de racines entières et de feuilles d’E. senegalensis DC contiennent une grande variété de groupes chimiques. Globalement, les écorces et les racines étaient plus riches que les feuilles en groupes phytochimiques détectables par la méthode employée. Les saponosides, les composés stéroidiques et triterpéniques, les coumarines et leurs dérivés ont été détectés dans toutes les parties de la plante. Au contraire les flavonoïdes et les tanins ont été plus retrouvés dans les racines et les écorces de tronc. Nos résultats sont en accord avec ceux de nombreux auteurs : Wanji J et al. (1994) [100] et Taylor et al (1986) [93] ont isolé de nombreux phényl isoflavones et de nombreux composés triterpéniques respectivement des extraits methanoliques et hexaniques d’écorces de tronc. De plus, Nacoulma, O et al. (1996) [6] a indiqué la présence de coumarines, de flavonoides, de saponosides stéroidiques et de stéroides dans les feuilles, dans les racines et dans les écorces d’E. senegalensis DC. Enfin, Saidu. K et al (2000) [109] ont caractérisé les flavonoides, les tanins et les saponoside dans le macéré aqueux des écorces de tronc. Notre étude n’a guère mis en évidence la présence d’alcaloïdes dans les parties étudiées de la plante. Ces résultats contrastent ceux de Nacoulma, O et al (1996) [6] et de Saidu. K et al (2000) [109]. En effet, Nacoulma, O et al (1996) [6] ont indiqué la présence d’alcaloïdes dans les écorces, les racines, les feuilles et les fleurs et Saidu. K et al (2000) [109], dans le macéré aqueux des écores de tronc et de racines (étude de Saidu K). Nos observations corroborent par contre celles de Wanji J et al (1994) [100] qui n’a isolé les alcaloides (érysodine) que dans les graines d’E. senegalensis DC. Les différences pourraient s’expliquer d’une part par le matériel végétal utilisé : en effet, les écorces de tige, les racines et les feuilles ont constitué notre matériel d’étude et non les graines comme indiqué dans l’étude de Wanji et al. ou les fleurs comme mentionné dans l’étude de Nacoulma et al. D’autre part, notre méthode d’extraction (épuisement successif avec 4 solvants de polarité croissante) a probablement contribué à répartir la faible proportion de ces alcaloïdes dans les différents solvants si bien que dilués, ils ont été indétectables. 67 De plus, nos matériels végétaux ne provenaient pas de la même zone géographique. En effet la variation dans la composition phytochimique des extraits pourrait être une réponse des plantes aux facteurs tels que les conditions climatiques [110], l’environnement géologique des sites de récoltes [111], la période de récolte (maturation), l’équipement enzymatique responsable des voies métaboliques de biosynthèse [112] et la régulation de l’expression des gènes [113]. L’examen de la migration chromatographique des extraits a confirmé et précisé la présence des différents groupes phytochimiques caractérisés par les réactions colorées. Les résultats de la CCM indiquaient une prédominance des tanins catéchiques sur les tanins galliques dans toutes les drogues. La révélation des coumarines (tableau VI et photo 7) suggérait que les feuilles ne contenaient pas les mêmes types de coumarines (Rf différentes) que les autres drogues (écorces et racines). Certains types de coumarines étaient communs aux extraits de racines et d’écorces (Rf identiques). Les flavonosides initialement non décelés dans les feuilles par les réactions colorées en tube, ont été mis en évidence par la CCM. Cela pourrait s’expliquer par la sensibilité différentielle des deux méthodes. La CCM pourrait être plus sensible que les tests colorés. En effet, les résultats des tests colorés sont souvent tributaires de la capacité de l’opérateur à discerner les couleurs. Les couleurs sont elles-mêmes souvent la résultante réactionnelle de plusieurs groupes chimiques présents dans le tube qui ont réagi simultanément au même réactif test et donnant donc une couleur difficilement discernable par l’opérateur. Les flavonoïdes étaient plus abondants dans les extraits d’écorces de tronc que les autres drogues végétales (photo 6 et le tableau V). Certains flavonosides semblaient être communs aux écorces et aux feuilles (les Rf étant égales). Les extraits de racines contenaient plus les acides phénoliques. Les flavonosides révélés n’avaient aucune communauté avec ceux retrouvés dans les deux autres drogues. Les glycosides triterpéniques et stéroidiques ainsi que les stérols ont été caractérisés dans toutes les drogues végétales. Les glycosides de l’écorce semblaient présenter des différences avec ceux retrouvés dans les autres drogues. 68 Tous ces résultats suggéraient que notre étude a pu mettre en évidence dans les extraits des polyphenols (tanins, coumarines et flavonoides), des saponosides, et des triterpénes et stéroidiques (libre ou combinés). IV.4. L’effet antiradicalaire des extraits d’E. senegalensis DC Les effets antiradicalaires des extraits de feuilles, d’écorces de tronc et de racines ont été évalués par leur capacité à donner un atome d’hydrogène au radical de 1,1-diphenyl-2picryl-hydrazyl (DPPH). En effet le DPPH est un radical stable (oxydant) qui se caractérise par sa capacité à se réduire par captation d’un atome d’hydrogène à partir des composés contenus dans les extraits. Les extraits de feuilles ont montré de faibles effets antiradicalaires sur le DPPH. Dans la littérature [91, 104, 114], les feuilles sont rarement utilisées comme matériel végétal. Dans l’étude de Togola et al., (2008) [91], une étude ethnopharmacologique de l’usage traditionnel de la plante, les tradipraticiens du Mali utilisaient rarement les feuilles seules dans la prise en charge des maladies. Les feuilles étaient régulièrement associées à d’autres parties de la plante (écorces, racines). De plus nous avons caractérisé dans les feuilles, des saponosides (extrait aqueux, méthanolique et à l’acétate d’éthyle), des dérivés coumariniques et les tanins (extraits méthanoliques). Bien que certains composés soient des polyphénols (tanins et coumariniques), mais il existerait une grande diversité dans l’activité antiradicalaire de ces composés [115]. Selon Naoulma et al [6], les coumarines seraient anticoagulantes, antispasmolytiques, antipyrétique ; les saponosides seraient hémolysants et les tanins hémostatiques, astringents et faiblement piégeurs de radicaux libres. Les extraits méthanoliques de racines et d’écorces de tronc ont par contre produit des effets antiradicalaires doses-dépendants. Ces extraits d’écorces de tronc et de racine aux doses respectives de 263µg/mL et de 321µg/mL ont piégé 50% des radicaux libres de DPPH. Ces résultats suggérent que l’extrait méthanolique d’écorce de tronc est plus actif que l’extrait méthanolique de racines. En effet, plus la concentration inhibitrice 50% (IC50) d’un extrait est petite, plus l’extrait est actif. De même, l’extrait de racines à l’acétate d’éthyle (IC50 : (72 ± 0.13) µg/mL) a été plus actif que l’extrait d’écorce de tronc à l’acétate d’éthyle (IC50 : (114 ± 12.6) µg/mL). L’examen des IC50 montre que les extraits à l’acétate d’éthyle présentent un potentiel antiradicalaire plus puissant que les extraits au méthanol malgré que les derniers 69 contenaient beaucoup plus de composés polyphenoliques (tableau IV). Ce résultat confirme les données de la littérature selon lesquelles il n’existerait pas de relation entre l’effet antiradicalaire et la composition quantitative en polyphénols totaux [116]. L’aptitude à piéger les radicaux libres ainsi que l’activité antiradicalaire des polyphénols dépendraient de l’arrangement des groupements fonctionnels par rapport à la structure du noyau. De plus, selon des auteurs tels que Cao et al (1997) [117] ainsi que Shekher & Pannala (2001) [118], le nombre et la configuration des groupes hydroxyl donneurs d’hydrogène constitueraient les principales influences du potentiel antiradicalaire des composés polyphénoliques. Les extraits au dichlorométhane de feuilles, d’écorces et de racines ont montré un effet antiradicalaire dose-dépendant avec des IC50 respectives de 148,5 ± 6,3µg/mL, de 57.6 ± 0.68 µg/mL et de 51.8±0.06 µg/mL. Ces résultats suggèrent que les extraits dichlorométhaniques d’écorce et de racines étaient ceux qui présentaient les meilleurs potentiels antiradicalaires. Ces résultats corroborent ceux trouvés par Soro et al (2005) [114]. Cet auteur a trouvé (par autobiographie au DPPH) un effet antiradicalaire plus marqué avec les extraits au dichlorométhane de racines et d’écorces de tronc. Nos meilleurs résultats (72 ± 0.13µg/mL, 57.6±0.68 µg/mL et 51.8±0.06 µg/mL) comparés à l’effet de la quercétine (IC50 : 2.25 ± 0.001 µg/mL) pris comme référence dans notre étude, restaient cependant faibles. Néanmoins, nous pourrions dire que nos extraits possèdent un potentiel antiradicalaire non négligeable. En effet, nos extraits étaient des extraits totaux, non purifiés alors que la quercétine est un composé purifié. Les extraits qui ont présenté de meilleurs potentiels antiradicalaires étaient les extraits au dichlorométhane (57.6±0.68 µg/mL et 51.8±0.06 µg/mL) et à l’acétate d’éthyle (72 ± 0.13µg/mL). Cela pourrait s’expliquer par le fait que ces extraits contenaient de nombreux polyphénols (flavonoides, coumarines, tanins). Il pourrait également s’agir de l’effet des flavonoides liposolubles [6] ou leurs aglycones dans les extraits au dichlorométhane. En effet, dans de nombreuses études [6, 119, 120, 121], les auteurs liaient l’effet antiradicalaire des extraits de plantes aux polyphénols. L’activité antiradicalaire des polyphénols serait due à leur propriété oxydoréductrice qui jouerait un rôle important dans l’adsorption, la capture, la neutralisation des radicaux libres ou dans la décomposition des péroxydes [120]. 70 Les espèces chimiques oxydatives (radicaux libres) sont des formes hautement réactives qui sont capables de réagir avec n’importe quelle structure cellulaire (glucides, protéines et lipides). La présence en excès de ces espèces chimiques dans les cellules de l’organisme définit le stress oxydatif. Les dommages oxydatifs des lipides (peroxydation lipidique) perturberont le fonctionnement des membranes, provoqueront des dépôts de lipides oxydés dans les vaisseaux (formation de plaques d’athéromes) ou dans les tissus âgés et généreront des dérivés carcinogènes. L'oxydation des protéines déréglera les signaux cellulaires de prolifération ou de défense, inhibera des enzymes et générera des dépôts responsables d'amyloïdose et de fibrose [121]. Les principales et les plus redoutables cibles des formes oxydatives sont les acides nucléiques (ARN, ADN). Les attaques radicalaires de l'ADN seront sources de rupture et de mort cellulaire, mais surtout de mutations carcinogènes [121]. La rupture du brin conduit à l’activation et à l’augmentation de la glycosylation du matériel chromosomique avec modification de l’expression du gène attaqué [122]. Lorsqu’il s’agit d’oncogènes, ou d’anti-oncogènes, ou de gènes réparateurs d’ADN ou tout autre gène impliqué dans la cancérogénèse, il apparait un néoplasme. Ainsi, le stress oxydant sera la principale cause initiale du cancer, de la cataracte, de la sclérose latérale amyotrophique. Le stress oxydant peut aussi être un des facteurs potentialisant l'apparition de maladies plurifactorielles tels que le diabète, la maladie d'Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardio-vasculaires [2, 121]. De ce qui précède, nos extraits potentiellement antiradicalaires pourraient être intéressants dans la prévention ou dans la réduction de la pathogénie de toutes ces maladies. En effet, de nombreuses études ont montré que les composés anti-oxydants inhibent de nombreux cancers [119, 123-126]. La réduction du risque de cancer de prostate est associée à la prise régulière de légumes de couleur jaune très riches en caroténoides et de tomates qui sont riches en carotenoides lycopène [127]. La consommation des légumes du genre Allium (oignons, ails) riche en composés antioxydants organosulfurés et du sélénium [128] réduirait le risque de cancers de la prostate et des cancers gastrointestinaux [129, 130]. Les polyphénols contenus dans le thé vert réduiraient significativement le risque de survenue des cancers du sein et de l’ovaire chez les sujets asiatiques [131, 132]. Certains flavonoides telles que la quercétine, la curcumine, le resveratrol et des cathéchines inhibent la carcinogénèse sur des modèles cellulaires et animaux [123, 133, 134]. 71 IV.5. L’effet anti-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC Les extraits au dichlorométhane de racine (220,3 ± 1.30µg/mL) et d’écorces de tronc (214 ± 3,8 µg/mL) ainsi que les extraits à l’acétate d’éthyle des racines (74,14 ± 2,31 µg/mL) et d’écorces de tronc (49,54 ± 1,2 µg/mL) d’E. senegalensis DC ont montré une inhibition dose-dépendante de la 12-lipooxygénase I-B. Par contre, les extraits méthanoliques de feuilles, de racines et d’écorces de tronc ont présenté des effets inhibiteurs non dose-dépendants sur la lipoxygénase. Ces résultats suggèrent que nos extraits contiennent des composés capables d’inhiber et qualitativement et quantitativement la 12-lipooxygénase. Les extraits à l’acétate d’éthyle ont présenté des potentiels inhibiteurs largement supérieurs à ceux d’extraits au dichlorométhane. L’extrait à l’acétate d’éthyle des écorces de tronc a présenté le meilleur potentiel inhibiteur de la 12-lipooxygénase I-B avec une IC50 de 49,54 ± 1,2 µg/mL Togola et al (2009) [135] ont trouvé des tendances inversées aux nôtres. L’auteur a trouvé la majorité des effets anti-lipooxygénase dans l’extrait dichlorométhanique de racines (14 ± 1 µg/mL) qui d’ailleurs étaient mieux que les nôtres (74,14 ± 2,31 µg/mL et 49,54 ± 1,2 µg/mL). Les effets de nos extraits restent également faibles par rapports à ceux trouvés par le même auteur avec un composé purifié, la quercétine (IC50 : 30 ± 2 µM). Néanmoins, nos extraits à l’acétate d’éthyle présentaient de très bons effets antilipooxygénase bien que toujours à l’état d’extraits totaux. Les caractérisations phytochimiques (réaction colorée et CCM) des extraits à l’acétate d’éthyle ont signalé la présence en abondance de flavonosides et de tanins dans les écorces de tronc et la présence peu abondante de flavonoside dans les racines. Ainsi, il serait possible que la présence dans les écorces de flavonosides et de tanins, de façon contributive soit responsable de la forte activité inhibitrice de la lipooxygénase (synergie d’action). Ces résultats sont en accord avec les données d’autres auteurs qui ont mis en évidence les effets inhibiteurs des polyphénols (tanins, flavonoides) sur la lipooxygénase. En effet, Schewe et al (2001) [136] ont rapporté que les procyanidines et la (-) épicatéchine (isolées des noix de cacao) induisent une inhibition dose-dépendante de la 15-lipooxygénase-1 de 72 lapin. Shubert et al (1999) [137] ont montré que les flavonoides extraits des huiles de racines de Punica granatum inhibent à 81% la lipooxygénase de soja. Les lipooxygénases sont une famille d’enzymes possédant un domaine à fer nonhéminique qui leur sert de site catalytique des réactions stéréo et régiospécifiques de dioxygénation des acides gras polyinsaturés qui possèdent un motif 1,4-pentadiène [50]. Les produits dérivés, les HPETE, les HETE, les leucotriènes et les lipoxines sont impliqués dans de nombreux processus pathologiques : cancer, maladies cardiovasculaires, asthme, rhumatisme. Ainsi, une inhibition de ces enzymes pourrait contribuer à réduire la survenue de ces maladies. Dans notre étude, nous avons utilisé comme modèle, la 12-lipooxygénase de soja (12-lipooxygénase I-B) dont la séquence d’acides aminés présente une similitude de 25% avec celui de la 15-lipooxygénase-1 [138] impliquée dans la croissance des cellules de cancer de prostate et des cellules de cancer colorectal [76]. En effet, Kelavkar, U et al. (2001) [76] ont démontré que la 15-lipooxygénase-1 était surexprimée dans les cellules cancéreuses colorectales et de la prostate. Kimita H et al (1999) [139] ainsi que Nie et al (2001) [78] ont montré que l’inhibition de la 15-lipooxygenase induit la mort de ces cellules cancéreuses par apoptose. De plus, des inhibiteurs de la 15-lipooxygénase ont été proposés dans le traitement de certains cancers (brevet US2005070588) [136]. Ainsi, nous fournissons là des données intéressantes pour la recherche de principes chimiques contre les cancers de la prostate, du côlon et contre les pathologies inflammatoires chroniques, les maladies cardiovasculaires. IV.6. Les effets antiradicalaires et anti-lipooxygénase des extraits d’E. senegalensis DC L’extrait à l’acétate d’éthyle d’écorce de tronc qui présentait le meilleur effet inhibiteur était non antiradicalaire (IC50-LOX : 49,54 ± 1,12 versus IC50-DPPH : 114 ± 12,6). Ces résultats suggèrent qu’il pourrait ne pas exister une relation entre l’action antiradicalaire et l’action inhibitrice de la lipooxygénase. Ces mêmes observations ont été faites par Wangensteen et al (2004) [140], par Gundersen et al (2003) [141] et par Bråthe et al (2002) [142]. Ces auteurs ont indiqué qu’il n’y a pas de corrélation entre les deux activités. Noguchi et al (2002) [143] ont montré que ce manque de 73 corrélation pourrait suggérer que les composés inhibiteurs de la lipooxygénase agiraient en se fixant directement sur l’enzyme. L’extrait à l’acétate d’éthyle de la racine était aussi antiradicalaire qu’inhibiteur de la 12-lipooxygénase de soja (IC50-LOX : 72,14 ± 2,31 versus IC50-DPPH : 72.7 ± 0.13). Ces résultats suggèrent que l’inhibition de la lipooxygénase aurait nécessité une donation d’atome d’hydrogène. En effet, au cours de la réaction de peroxydation par la lipooxygénase, l’acide gras polyinsaturé doit perdre un atome d’hydrogène puis se réarranger avant de fixer le radical dioxygène [144]. La donation de proton consisterait à compenser cette perte d’hydrogène et de bloquer alors l’étape de dioxygénation. Toutefois ces deux résultats suggèrent que les extraits à l’acétate d’éthyle de racines et d’écorces de tronc contiennent des composés phytochimiques différents. Cela a été mis en évidence dans les caractérisations chimiques qui signalaient la présence de flavonoïdes dans l’écorce de tronc et des acides phénoliques dans les racines. 74 Conclusion Notre étude portait sur Erythrina senegalensis DC (Fabaceae), une plante médicinale du Burkina Faso. Les feuilles, les racines et les écorces de tronc de la plante concentraient de nombreux groupes phytochimiques : les flavonoides, les tanins, les coumarines, les saponosides et les stérols et triterpènes. Le test antiradicalaire (au DPPH) et le test d’inhibition de la lipooxygénase nous ont permis d’évaluer le potentiel antioxydant des extraits au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au méthanol et à l’eau. Les extraits au dichlorométhane et l’acétate d’éthyle ont montré les meilleurs effets pharmacologiques recherchés. Les extraits au dichlorométhane ont présenté de puissants effets antiradicalaires mais sont restés faiblement inhibiteurs de la 12-lipooxygénase. Par contre, les extraits à l’acétate d’éthyle possédaient les deux types d’effets avec une prédominance de l’effet inhibiteur de la 12-lipooxygénase de soja. Nous montrons par cette étude, que les différents extraits étudiés d’E. senegalensis DC (Fabaceae) possèdent un potentiel antioxydant intéressant. Par la même occasion, nous fournissons des données intéressantes pour la recherche des principes chimiques purifiés ou pour le développement de phytomédicaments pour la prévention des maladies cancéreuses ou des maladies cardiovasculaires ou des maladies inflammatoires chroniques. 75 Perspectives de l’étude Cette étude, au regard des résultats, mérite d’être poursuivie. Nous avons en perspectives d’orienter les travaux vers la recherche de principes chimiques anticancéreux. Pour cela, il sera nécessaire de : Fractionner les extraits les plus actifs puis les tester à nouveau Rechercher des effets antiprolifératifs des extraits sur des lignées de cellules cancéreuses de types : PC-3 (cancer de la prostate), LoVo (cancer colorectal) et A549 (cancer des poumons non à petites cellules) Identifier et isoler le(s) principe(s) chimique(s) à l’origine d’effet antiprolifératif Elucider le mécanisme d’action moléculaire anticancéreuse du (ou des) principe(s) chimique(s) actif(s) Effectuer des pharmacomodulations afin de déterminer les pharmacophores et les éventuels supports de toxicité Déterminer les toxicités des principes chimiques d’intérêt Rechercher in vivo les effets anticancéreux des principes chimiques intéressants 76 RÉFÉRENCES [1]. POLI, G; LEONARDUZZI G; BIASI F; CHIARPOTTO, E. (2004). Oxidative stress and cell signaling. Curr. Med. Chem. 11: 1163–1182. [2]. FAVIER A. (2003). Le stress oxydant. 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Réactif de Meyer 13,55 g de chlorure de mercure II et 49,8 g d’iodure de potassium sont dissous dans 20 mL d’eau distillée. Le volume du mélange est porté à 1L avec de l’eau distillée. 4. Réactif de Shibatat Acide chlorhydrique + Quelques (2-3) grains de tournure de magnesium. 5. Anisaldéhyde sulfurique Mélanger dans 85mL d’éthanol absolu 0,5mL d’anisaldéhyde et 5mL d’acide sulfurique concentré. II. 1. EVALUATION DE L'EFFET ANTIRADICALAIRE DES EXTRAITS D’E. senegalensis DC Mode opératoire du test antiradicalaire au DPPH. L’effet antiradicalaire des extraits a été déterminé par la méthode spectrophotométrique développée par KIM et al. (2003). Tableau de préparation des cuves pour la lecture de l’absorbance Contenu des cuves Cuve du Blanc Cuve du contrôle Cuve du test - 950 950 Extrait (µL) 50 - 50 Méthanol (µL) 950 - - - 50 - 1000 1000 1000 Solution DPPH (µL) DMSO (µL) Total volume (µL) xxi La lecture de la DO des cuves se fait au spectrophotomètre à 520nn. Les doses testées seront calculées en tenant compte du facteur de dilution égal à 1/20 %INHIBITION = [(DOctrl - DOextrait) / DOctrl] x 100 Les IC50 sont déterminées graphiquement par le logiciel PRISM version 5.0 2. Courbes doses-effets antiradicalaires de quelques extraits d’E. senegalensis DC. Inhibition (%) 100 Racine CH2Cl2 Racine MeOH Ecorce CH2Cl2 Ecorce Acet Ethyl 75 50 25 0 -25 -2 -1 0 1 2 3 4 log[conc] (µg) Effets antiradicalaires doses-dépendants des extraits d’E. senegalensis DC 1. EVALUATION DE L'EFFET ANTILIPOOXYGENASE DES EXTRAITS D’E. senegalensis Mode opératoire du test d’inhibition de la 12-Lipoxygénase. L’activité inhibitrice des extraits sur la lipoxygénase a été déterminée par la méthode spectrophotométrique développée par MALTERUD et al. (1992). Tableau de préparation des cuves pour la mesure de la cinétique enzymatique de la 12-lipooxygénase Mélange dans la cuve Contrôle Inhibition (activité de l’enzyme sans inhibiteur) (activité de l’enzyme + l’inhibiteur) Blanc (µl) Tampon borate 400 Tampon-DMSO (10%) 100 Enzyme Test (µl) Blanc (µl) Test (µl) 400 100 400 Extrait 400 100 100 Incuber pendant 2 minutes à température ambiante Substrat 500 500 500 500 Lecture de la cinétique à 234 nm pendant 2 minutes xxii Le pourcentage de l'inhibition a été calculé suivant la formule: %INHIBITION = 100 x [(Vctrl – Vextrait)/Vctrl] Où Vctrl est l'activité de l'enzyme sans inhibiteur (extrait) et Vextrait l’activité de l’enzyme en présence de l’échantillon. Les IC50 sont déterminées graphiquement par le logiciel PRISM version 5.0 xxiii
