COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0

Transcription

For Use With The High Pure System
RÉSERVÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO.
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
HCV HPS V2
48 Tests P/N : 04861817 190
48 Tests P/N : 03502295 001
USAGE PRÉVU
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure (HPS) est un test
in vitro d’amplification de l’acide nucléique pour le dosage quantitatif de l’ARN du virus de
l’hépatite C (HCV) de génotype 1 à 6 dans le sérum ou le plasma humain, à l’aide du kit d’acide
nucléique viral du système High Pure pour la préparation manuelle des échantillons, et de
l’analyseur COBAS® TaqMan® 48 pour l’amplification et la détection automatisées. Ce test est
destiné à être utilisé conjointement avec la présentation clinique et les autres marqueurs de
laboratoire comme support d’évaluation de la réponse virale à un traitement antiviral mesuré par
les variations des taux d’ARN du HCV dans le sérum ou le plasma. Des données récentes
suggèrent qu’une variation précoce des taux d’ARN du HCV dans le sérum/plasma pourrait
prédire une réponse prolongée au traitement par l’interféron1.
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 ne doit servir ni de test de dépistage du HCV dans le
sang ou les produits sanguins, ni de test diagnostique pour confirmer la présence d’une
infection par le HCV.
RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST
Le virus de l’hépatite C est considéré comme l’agent principal responsable des hépatites non-A
et non-B post-transfusionnelles (90 à 95 % des cas)2-4. Le HCV est un virus à ARN
monocaténaire de sens positif dont le génome comporte environ 10 000 nucléotides encodant
3 000 acides aminés. Virus à diffusion hématogène, le HCV peut être transmis par le sang ou les
produits sanguins. L’adoption courante de mesures de dépistage du HCV dans le sang a
grandement diminué le risque d’hépatite associé aux transfusions. L’incidence d’infections à HCV
est la plus élevée lorsqu’elle est associée à l’injection intraveineuse de drogues et, de façon
moindre, à d’autres expositions percutanées4. La prévalence globale de l’infection à HCV,
déterminée par des tests immunologiques, varie entre 1,0 % en Europe et 5,3 % en Afrique5.
La présence d’anticorps anti-HCV chez des patients infectés par le HCV a été à l’origine du
développement de tests immunologiques spécifiques à ces anticorps. La présence d’anticorps
anti-HCV indique qu’un patient a été exposé à une infection par HCV, mais elle ne peut pas être
considérée comme indicatrice d’une infection active. Par ailleurs, on ne dispose pas de méthode
de détection directe par culture virale.
Le dosage de l’alanine aminotransférase (ALT) est considéré comme un indicateur auxiliaire
d’infection par le HCV mais il ne constitue pas une mesure directe de virémie. Le degré
d’élévation de l’ALT peut ne pas être directement corrélé à l’importance de l’infection par le HCV.
En fait, l’ALT peut être augmentée par de nombreuses causes d’infections hépatiques dont
l’hépatite virale fait partie mais n’est pas la seule. En revanche, la détection et le dosage
quantitatif de l’ARN du HCV par PCR (amplification en chaîne par polymérase) permet de mesurer
la virémie active6-8. La PCR permet de détecter la virémie du HCV avant la séroconversion
immunologique9-10 ainsi que les variations de la charge virale chez les patients porteurs
d’anticorps ayant une infection chronique par HCV et suivant un traitement par interféron1.
La section d’informations sur la révision du document se trouve à la fin du présent document.
05998093001-07FR
1
Doc Rev. 11.0
PRINCIPES DE LA PROCÉDURE
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 comporte trois processus principaux : (1) la préparation
manuelle de l’échantillon pour extraire l’ARN du HCV ; (2) la transcription inverse automatisée de
l’ARN cible pour générer de l’ADN complémentaire (ADNc) ; (3) l’amplification par PCR de l’ADNc
cible à l’aide d’amorces complémentaires spécifiques au HCV et la détection simultanée de
sondes oligonucléotidiques clivées doublement marquées par fluorescence, qui permettent la
quantification du produit amplifié cible du HCV (amplicon).
Le mélange réactionnel contient une paire d’amorces et des sondes spécifiques à la fois de l’ARN du
HCV et de l’ARN du standard de quantification du HCV. La détection de l’ADN amplifié est réalisée à
l’aide d’une sonde oligonucléotidique spécifique aux cibles et d’une sonde oligonucléotidique
doublement marquée spécifique au standard de quantification qui permettent l’identification
indépendante de l’amplicon du HCV et de celui du standard de quantification du HCV.
La mesure de l’ARN du HCV viral est réalisée à l’aide du standard de quantification du HCV. Le
standard de quantification du HCV est un produit de synthèse non infectieux d’ARN encapsidé
qui contient des séquences HCV avec des sites de liaison aux amorces identiques à ceux de
l’ARN du HCV cible et un site unique de liaison aux sondes qui permet de faire la différence entre
l’amplicon du standard de quantification du HCV et l’amplicon cible du HCV. Le standard de
quantification du HCV est incorporé dans chacun des échantillons et des contrôles en nombre de
copies connu et subit les différentes étapes de préparation des échantillons, de transcription
inverse, d’amplification par PCR et de détection avec le HCV cible. L’analyseur COBAS®
TaqMan® 48 calcule le titre d’ARN du HCV dans les échantillons testés en comparant le signal
HCV au signal du standard de qualification du HCV pour chaque échantillon et chaque contrôle.
Le standard de quantification du HCV compense les effets de l’inhibition et des contrôles sur les
processus de préparation et d’amplification pour permettre une quantification précise d’ARN du
HCV dans chaque échantillon.
Choix de la cible
Pour le HCV, la sélection de la séquence cible d’ARN dépend de l’identification de régions situées
dans le génome du HCV qui présentent une conservation maximale de la séquence parmi les
divers génotypes du HCV11,12. On a constaté que la région 5' non traduite du génome du HCV
présente une conservation maximale des séquences d’ARN parmi les génotypes connus du
HCV13. Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 utilise la transcription inverse et des sondes
d’amplification de la PCR définissant une séquence dans la région hautement conservée 5' non
traduite du génome du HCV.
Préparation des échantillons
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 traite les échantillons de plasma prélevé sur EDTA et de
sérum et isole l’ARN du HCV par une préparation manuelle standard de l’échantillon reposant sur
la liaison de l’acide nucléique à des fibres de verre. Les particules du virus du HCV sont lysées
par incubation à une température élevée à l’aide d’un tampon de liaison/lyse chaotrope et
protéatique qui libère des acides nucléiques et protège l’ARN du HCV libéré contre les RNases du
plasma et du sérum. Un nombre connu de molécules d’ARN du standard de quantification du
HCV est introduit dans chaque échantillon avec le réactif de lyse. Ensuite, on ajoute de
l’isopropanol au mélange de lyse, qui est centrifugé dans une colonne contenant un filtre en fibres
de verre. Au cours de la centrifugation, l’ARN du HCV et l’ARN du standard de quantification du
HCV se lient à la surface du filtre en fibres de verre. Les substances non liées, telles que les sels,
les protéines et autres impuretés cellulaires sont retirées par centrifugation. Les acides
nucléiques absorbés sont lavés et élués dans une solution aqueuse. Le matériel jetable permet le
traitement parallèle de 12 échantillons ou de multiples de 12. L’échantillon traité, contenant l’ARN
du HCV et l’ARN du standard de quantification du HCV, est ajouté au mélange d’amplification/de
détection. L’ARN cible du HCV et l’ARN du standard de quantification du HCV sont ensuite
amplifiés et détectés par l’analyseur COBAS® TaqMan® 48 à l’aide des réactifs d’amplification et
de détection fournis dans le kit de test.
05998093001-07FR
2
Doc Rev. 11.0
Transcription inverse et amplification par PCR
Transcription inverse
La transcription inverse et les réactions d’amplification et de détection par PCR sont effectuées
avec l’ADN polymérase de Thermus specie Z05, enzyme recombinante thermostable (Z05). En
présence de manganèse (Mn2+) et dans des conditions tampon appropriées, le Z05 a à la fois
une activité de transcriptase inverse et d’ADN polymérase14,15. Ceci permet à la transcription
inverse, à l’amplification et la détection par PCR de s’effectuer dans le même mélange
réactionnel.
Les échantillons traités sont ajoutés au mélange dans des tubes d’amplification (tubes K) dans
lesquels s’effectuent la transcription inverse et l’amplification par PCR. Le mélange réactif est
chauffé pour permettre à une amorce d’aval de se fixer spécifiquement à l’ARN cible du HCV et à
l’ARN du standard de quantification du HCV. En présence de Mn2+ et d’un excès de
triphosphates de désoxynucléotides (dNTPs) (triphosphates de désoxyadénosine,
désoxyguanosine, désoxycytidine et désoxyuridine), la polymérase Z05 allonge l’amorce
hybridée, produisant ainsi un brin d’ADN (ADNc) complémentaire de l’ARN cible.
Amplification cible
Après la transcription inverse de l’ARN cible du HCV et de l’ARN du standard de quantification du
HCV, le mélange réactionnel est chauffé afin de dénaturer le produit hybride ARN:ADNc et
d’exposer ainsi les séquences cibles aux amorces. Au cours du refroidissement du mélange
réactionnel, les amorces d’amont s’hybrident spécifiquement au brin d’ADNc, Z05 étire l’amorce
et un deuxième brin d’ADN est ainsi synthétisé. Ceci achève le premier cycle de PCR et produit
une copie d’ADN bicaténaire de la séquence cible de l’ARN du HCV et de l’ADN du standard de
quantification du HCV. Le mélange réactionnel est de nouveau chauffé afin de séparer les deux
brins d’ADN bicaténaire ainsi formés et d’exposer les séquences cibles des amorces. Pendant
que le mélange refroidit, les amorces s’hybrident à l’ADN cible. Z05, en présence de Mn2+ et d’un
excès de dNTP, permet l’extension des amorces hybridées le long des modèles cibles, pour
produire une molécule d’ADN bicaténaire appelée « amplicon ». L’analyseur COBAS®
TaqMan® 48 répète automatiquement cette opération pendant un nombre de cycles défini,
chaque cycle doublant effectivement la quantité d’amplicons d’ADN. Le nombre de cycles
nécessaire est préprogrammé dans l’analyseur COBAS® TaqMan® 48. L’amplification n’a lieu
que dans la région du génome du HCV située entre les amorces. Le génome du HCV n’est pas
entièrement amplifié.
Amplification sélective
L’amplification sélective de l’acide nucléique cible à partir de l’échantillon est réalisée grâce au
test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 par l’utilisation de l’enzyme AmpErase (uracil-N-glycosylase)
et du désoxyuridine triphosphate (dUTP). L’enzyme AmpErase reconnaît et catalyse la
destruction des brins d’ADN contenant de la désoxyuridine16, mais pas de l’ADN contenant de la
désoxythymidine. L’ADN naturel ne contient pas de désoxyuridine, mais l’amplicon en contient
toujours du fait de l’utilisation de triphosphate de désoxyuridine en tant que l’un des dNTP du
mélange réactionnel ; ainsi, seuls les amplicons renferment de la désoxyuridine. La présence de
désoxyuridine permet la destruction des amplicons contaminants par l’enzyme AmpErase avant
l’amplification de l’ARN cible. En outre, tout produit non spécifique formé après activation initiale
du mélange réactionnel par manganèse est détruit par l’enzyme AmpErase, améliorant la
sensibilité et la spécificité. L’enzyme AmpErase, qui fait partie du mélange réactionnel, catalyse le
clivage de tout ADN contenant de la désoxyuridine au niveau d’un résidu de désoxyuridine en
ouvrant la chaîne de désoxyribose en position C1. Lorsqu’elle est chauffée au cours de la
première étape du cycle thermique, la chaîne d’ADN de l’amplicon se casse au niveau de la
désoxyuridine, ce qui rend l’ADN non amplifiable. L’enzyme AmpErase est inactive à des
températures supérieures à 55 °C, c’est-à-dire lors des étapes du cycle thermal, et ne détruit
donc pas l’amplicon cible formé au cours de l’amplification.
05998093001-07FR
3
Doc Rev. 11.0
Détection de produits PCR au cours d’un test COBAS® TaqMan®
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 utilise la technologie d’amplification par PCR en temps
réel17,18. L’utilisation de sondes doublement marquées par fluorescence permet une détection en
temps réel de l’accumulation des produits de la PCR par contrôle de la libération du fluorohphore
rapporteur fluorescent pendant la procédure d’amplification. Les sondes sont des sondes
oligonucléotidiques spécifiques du HCV et du standard de quantification du HCV avec un
fluorohphore rapporteur (ou Reporter Dye) et un fluorohphore quencher (ou Quencher Dye). Au cours
du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0, les sondes HCV et du standard de quantification HCV sont
marquées avec des fluorohphores rapporteurs fluorescents différents. Quand les sondes
doublement marquées par fluorescence sont intactes, le fluorohphore rapporteur est supprimé par le
fluorohphore quencher suite aux effets d’un transfert d’énergie de type Förster. Pendant la PCR, la
sonde s’hybride à la séquence cible et est clivée par l’activité nucléase 5'3' de l’ADN polymérase
thermostable Z05. Quand le fluorohphore rapporteur et le fluorohphore quencher sont libérés et
séparés, il n’y a plus de neutralisation (quenching) et l’activité fluorescente du fluorohphore
rapporteur est augmentée. L’amplification de l’ARN du HCV et de l’ARN du standard de
quantification du HCV est mesurée indépendamment à des longueurs d’ondes différentes. Ce
processus est répété pour un nombre déterminé de cycles, chaque cycle augmentant efficacement
l’intensité d’émission des fluorohphores rapporteurs individuels permettant une identification
indépendante de l’ARN du HCV et de l’ARN du standard de quantification du HCV. L’intensité des
signaux est fonction de la quantité de produit d’origine au commencement de la PCR.
Points fondamentaux du dosage par le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 produit des résultats quantitatifs précis sur un domaine
dynamique très grand, puisque le contrôle de l’amplicon est effectué pendant la phase
exponentielle d’amplification. Plus le titre HCV d’un échantillon est élevé, plus tôt la fluorescence
du fluorohphore rapporteur du HCV dépasse le niveau de fluorescence de base (voir la figure 1).
Puisque la quantité d’ARN du standard de quantification du HCV est constante entre tous les
échantillons, la fluorescence du fluorohphore rapporteur de la sonde du standard de
quantification (QS) du HCV doit apparaître au même cycle pour tous les échantillons (voir la
figure 2). Lorsque l’amplification et la détection du standard de quantification sont gênées par
l’inhibition ou par un prélèvement inadéquat de l’échantillon, la fluorescence est retardée,
permettant ainsi d’ajuster en conséquence le titre calculé de l’ARN cible du HCV. L’émission des
signaux de fluorescence spécifiques est considérée comme une valeur seuil critique (Ct). La
valeur seuil critique ou Ct est le numéro du cycle fractionnel où la fluorescence du fluorohphore
rapporteur dépasse un seuil prédéterminé (le niveau de fluorescence assigné) et entame une
phase de croissance exponentielle de ce signal (voir la figure 3). Une valeur Ct plus grande
indique un titre initial d’ARN cible du HCV plus faible. Une augmentation 2 fois plus grande du
titre correspond à une baisse de 1 Ct de l’ARN du HCV, tandis qu’une augmentation 10 fois plus
grande correspond à une baisse de 3,3 Ct.
La figure 1 illustre les courbes de croissance cible pour une série de dilutions de virus effectuées
sur une plage de 5-log10. Au fur et à mesure que la concentration du virus augmente, les courbes
de croissance se déplacent sur des cycles précédents. Par conséquent, la courbe de croissance
la plus à gauche correspond au niveau de titre viral le plus élevé alors que la courbe de
croissance la plus à droite représente le niveau de titre viral le plus faible.
05998093001-07FR
4
Doc Rev. 11.0
Figure 1
45,00
Fluorescence normalisée
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
Titre le plus élevé
10,00
5,00
Titre le plus bas
0,00
0
10
20
30
40
50
60
Numéro de cycle
La figure 2 illustre les courbes de croissance du standard de quantification pour une série de
dilutions virales effectuées sur une plage de 5-log10. Le volume de standard de quantification
ajouté à chaque échantillon est constant pour chaque réaction. La valeur Ct du standard de
quantification est la même quelle que soit la concentration virale.
Figure 2
12,00
Titre le plus bas
10,00
8,00
Valeurs Ct du standard
de quantification du
HCV similaires quel que
soit le titre de HCV
6,00
4,00
Titre le plus élevé
2,00
0,00
0
10
20
30
40
50
60
Numéro de cycle
La figure 3 présente un exemple de normalisation des valeurs de fluorescence à chaque cycle
pour chaque courbe de croissance. Le nombre de cycles fractionnels (valeur Ct) est calculé au
point de rencontre du signal de fluorescence et du niveau de fluorescence théorique.
Figure 3
2,80
2,60
2,40
2,20
2,00
Niveau de
fluorescence assigné
1,80
Valeur Ct = 17,4
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
8
10
12
14
16
18
20
22
Numéro de cycle
05998093001-07FR
5
Doc Rev. 11.0
MESURE DE L’ARN DU HCV
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 détermine la charge virale de l’ARN du HCV en utilisant une
seconde séquence cible (celle du standard de quantification du HCV), qui est ajoutée, à une
concentration connue, à l’échantillon à analyser. Le standard de quantification du HCV est une
construction d’Armored RNA (ARN encapsidé), non infectieuse, contenant des fragments de
séquences du HCV qui présentent des sites de liaison aux amorces identiques à ceux de la
séquence cible du HCV. Le standard de quantification du HCV crée également un produit
d’amplification dont la longueur et la composition en bases sont identiques à l’ARN cible du HCV. Le
site de liaison à la sonde de détection du standard de quantification du HCV a été modifié pour
permettre de distinguer l’amplicon du standard de quantification du HCV de l’amplicon cible du HCV.
Pendant la phase d’hybridation de la PCR dans l’analyseur COBAS® TaqMan® 48, les
échantillons sont éclairés et agités par une lumière filtrée, et des données de fluorescence
d’émission filtrée sont recueillies pour chaque échantillon. Les mesures pour chaque échantillon
sont alors corrigées pour les fluctuations instrumentales. Ces mesures de fluorescence sont
envoyées par l’appareil au logiciel AMPLILINK et stockées dans une base de données. Des
vérifications préalables sont utilisées pour déterminer si les données de l’ARN du HCV et de
l’ARN du standard de quantification du HCV représentent des ensembles valides, et des
messages sont générés lorsque les données se trouvent hors des limites préétablies. Une fois
que les vérifications préalables sont effectuées et que tout est en ordre, les mesures de
fluorescence sont traitées dans le but de générer des valeurs Ct de l’ARN du HCV et de l’ARN du
standard de quantification du HCV. Les constantes de calibration spécifiques des lots fournies
avec le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 servent à calculer la valeur de titre des échantillons et
des contrôles en se basant sur les valeurs Ct de l’ARN du HCV ou de l’ARN du standard de
quantification du HCV. Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 correspond à la deuxième norme
internationale de l’OMS relative aux tests d’amplification nucléique (NAT) de l’ARN du HCV (code
NIBSC 96/798)19 et les mesures de titre sont fournies en unités internationales (UI/mL).
RÉACTIFS
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
Kit d’acide nucléique viral du système High Pure
(P/N : 03502295 001)
48 Tests
LYS
(tampon de lyse/de liaison)
Tris
50 % (p/p) de guanidine HCl
< 1 % d’urée
19 % (p/p) de Triton X-100
2 x 25 mL
CAR
(ARN, lyophilisé)
2 x 2 mg
PK
(protéinase K, lyophilisée)
≥ 64 % (p/p) de protéinase K, lyophilisée
2 x 100 mg
IRB
(tampon éliminateur d’inhibiteur)
Tris
65 % (p/p) de guanidine HCl
1 x 33 mL
WASH
(tampon de lavage)
Tris
NaCl
(ajouter 50 mL d’éthanol et 30 mL d’eau déminéralisée)
ELB
(tampon d’élution)
1 x 20 mL
05998093001-07FR
6
1 x 30 mL
Doc Rev. 11.0
RS
(ensemble de portoirs pour kit d’acide nucléique viral du système High Pure)
Portoir de lyse
Portoir de tubes de filtration avec portoir à déchets
Portoir à élution
Portoir à couvercles
WR
(portoir à déchets du kit d’acide nucléique viral du système High Pure)
HCV HPS V2
(P/N : 04861817 190)
Réactifs de préparation des échantillons et de contrôle
HCV QS
(standard de quantification du HCV COBAS® TaqMan®)
Tampon de phosphate de sodium
EDTA
< 0,005 % d’ARN Poly rA (synthétique)
< 0,001 % d’Armored RNA contenant une insertion de
séquences d’amorce de fixation HCV et un seul site
de fixation de sonde (ARN non infectieux dans du
bactériophage MS2)
Amarante (colorant)
0,1 % de conservateur ProClin® 300
4 x chacun
8 x chacun
48 tests
2 x 1,0 mL
HCV H(+) C, v2.0
[contrôle haut (+) HCV, v2.0]
< 0,001 % d’Armored RNA contenant des séquences de
HCV (ARN non infectieux dans du bactériophage
MS2)
Plasma humain négatif, non réactif aux tests pour les
anticorps HCV, les anticorps HIV-1 et HIV-2,
l’antigène p24 du HIV et l’antigène AgHBs ; l’ARN du
HIV-1, l’ARN du HCV et l’ADN du HBV ne peuvent
pas être détectés par les méthodes de PCR
2 x 1,0 mL
HCV L(+) C, v2.0
[contrôle bas (+) HCV, v2.0]
< 0,001 % d’Armored RNA contenant des séquences de HCV
(ARN non infectieux dans du bactériophage MS2)
2 x 1,0 mL
CTM (–) C
[contrôle négatif COBAS® TaqMan® (plasma humain)]
4 x 1,0 mL
05998093001-07FR
7
Doc Rev. 11.0
Réactifs d’amplification et de détection
HCV MMX
(mélange réactionnel COBAS® TaqMan® HCV)
Tampon TRIS
Hydroxyde de potassium
Acétate de potassium
< 20 % de sulfoxyde de diméthyle
Glycérol
< 0,001 % de dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,001 % d’amorces d’amont et d’aval pour la région
5'-non traduite du HCV
< 0,001 % de sondes oligonucléotidiques marquées par
fluorescence spécifiques du HCV et du standard de
quantification du HCV
< 0,05 % d’ADN polymérase Z05 (microbien)
< 0,1 % d’enzyme (microbienne) AmpErase (uracil-N-glycosylase)
0,09 % d’acide de sodium
CTM Mn2+
(solution de manganèse COBAS® TaqMan®)
< 1,2 % d’acétate de manganèse
Acide acétique glacial
0,09 % d’acide de sodium
2 x 24 tests
2 x 1,4 mL
2 x 24 tests
2 x 1,0 mL
AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS
A. DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO.
B. Ce test ne doit servir ni de test de dépistage du HCV dans le sang ou les produits sanguins,
ni de test diagnostique pour confirmer la présence d’une infection par le HCV.
C. Les valeurs attribuées aux coefficients de calibration sont spécifiques à chaque lot et au test
COBAS® TaqMan® HCV, v2.0, à utiliser avec le système High Pure. Ces méthodes peuvent
ne pas être valides si elles sont utilisées avec d’autres méthodes de préparation des
échantillons.
D. Ce test doit servir pour l’analyse de plasma humain prélevé sur l’anticoagulant EDTA et de
sérum humain.
E. Ne pas pipeter à la bouche.
F. Ne pas manger, boire ou fumer dans les zones de travail du laboratoire. Porter des gants
jetables protecteurs, des blouses de laboratoire et des protections pour les yeux lors de la
manipulation d’échantillons et de kit de réactifs. Bien se laver les mains après la
manipulation des échantillons et des réactifs du kit.
G. Éviter toute contamination des réactifs par des microbes ou des ribonucléases lors du
retrait des aliquotes des bouteilles de réactif.
H. Il est recommandé d’utiliser des pipettes jetables et des embouts stériles sans RNase.
I.
Ne pas mélanger de réactifs provenant de différents lots ou de différents flacons d’un même
lot.
J.
Ne pas mélanger de réactifs provenant de kits différents.
K. Jeter les réactifs non utilisés, les déchets et les échantillons conformément à la
réglementation locale, régionale, fédérale et nationale.
L. Ne pas utiliser une trousse après sa date limite d’utilisation.
M. Les fiches de sécurité (ou SDS pour Safety Data Sheets) sont disponibles sur demande
auprès de votre distributeur local Roche.
05998093001-07FR
8
Doc Rev. 11.0
N.
Les échantillons et les contrôles doivent être manipulés comme s’ils étaient infectieux. Ils
nécessitent les précautions d’usage, telles que celles mentionnées dans Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories20 ainsi que dans le document M29-A321 du
CLSI. Bien nettoyer et désinfecter toutes les surfaces de travail avec une solution
fraîchement préparée contenant 0,5 % d’hypochlorite de sodium dans de l’eau
déminéralisée ou distillée.
Remarque : L’eau de javel domestique liquide et commerciale contient généralement de
l’hypochlorite de sodium à une concentration de 5,25 %. Une dilution de 1/10
d’eau de javel domestique produira une solution d’hypochlorite de sodium
de 0,5 %.
O. ATTENTION : CTM (–) C, HCV L(+)C, v2.0 et HCV H(+)C, v2.0 contiennent du plasma
humain dérivé du sang humain. Le produit d’origine a été soumis à des tests et s’est avéré
ne pas réagir à la présence de l’antigène de surface du virus de l’hépatite B (AgHBs), des
anticorps anti-HCV, des anticorps anti-HIV-1 et HIV-2, et de l’antigène p24 du HIV. Les tests
PCR sur le plasma humain négatif indiquaient une absence de détection d’ARN du HIV-1,
d’ARN du HCV et d’ADN du HBV. Cependant, aucune technique de test ne peut garantir
avec une certitude absolue que des produits dérivés du sang humain sont exempts de
risque de transmission d’agents infectieux. Tout produit d’origine humaine doit donc être
considéré comme potentiellement infectieux. CTM (–) C, HCV L(+)C, v2.0 et HCV H(+)C,
v2.0 doivent être manipulés comme s’ils étaient infectieux, en respectant les consignes de
sécurité de laboratoire, telles que celles décrites dans Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories20 et dans le document M29-A321 du CLSI. Bien nettoyer et
désinfecter toutes les surfaces de travail avec une solution fraîchement préparée contenant
0,5 % d’hypochlorite de sodium dans de l’eau déminéralisée ou distillée.
P. HCV MMX et CTM Mn2+ contiennent de l’acide de sodium. L’acide de sodium peut réagir
en présence de tuyauterie en plomb et en cuivre pour former des acides métalliques
hautement explosifs. Lors de l’élimination de solutions contenant de l’acide de sodium dans
des lavabos de laboratoire, rincer les conduites avec une quantité abondante d’eau pour
éviter l’accumulation d’acide.
Q. Portez des gants de protection jetables, une blouse de laboratoire et des lunettes de
protection lors de la manipulation des réactifs. Éviter tout contact de ces produits avec la
peau, les yeux ou les membranes muqueuses. En cas de contact, rincer immédiatement
avec de l’eau en abondance. Si aucune action n’est entreprise, des brûlures pourront
apparaître. Si un réactif est répandu hors du flacon, diluer avec de l’eau avant d’essuyer.
CONDITIONS DE MANIPULATION ET DE STOCKAGE
Réactifs de préparation des échantillons
A.
B.
C.
D.
E.
Stocker les réactifs d’acide nucléique viral du système High Pure entre 15 et 25 °C à
leur livraison.
Stocker le tampon d’élution (ELB) et le tampon de lyse/de liaison (LYS) entre 15 et 25 °C.
Une fois ouverts, stocker ELB et LYS entre 15 et 25 °C. Les ELB et LYS ouverts doivent être
utilisés dans les 28 jours ou avant la date d’expiration, selon celle qui survient en premier.
Après avoir ajouté le tampon d'élution (ELB) pour reconstituer l'ARN porteur (CAR) et la
protéinase K (PK), conserver l'ARN porteur reconstitué non utilisé et la protéinase K
reconstituée non utilisée entre –15 et –25 °C. Une fois reconstitués, l’ARN porteur et la
protéinase K doivent être utilisés dans les 28 jours ou avant la date d’expiration, selon celle
qui survient en premier.
Après ajout d’éthanol au tampon éliminateur d'inhibiteur (IRB) et ajout d’éthanol et d’eau au
tampon de lavage (WASH), conserver le tampon éliminateur d’inhibiteur et le tampon de
lavage entre 15 et 25 °C. Ces solutions actives restent stables pendant 28 jours ou jusqu’à la
date d’expiration, selon celle qui survient en premier.
La solution de lyse/de liaison active [tampon de lyse/de liaison avec ARN porteur, protéinase K
et HCV QS] doit être utilisée immédiatement après la préparation. Éliminer tout excédent.
05998093001-07FR
9
Doc Rev. 11.0
A.
B.
C.
D.
E.
Ne pas congeler les réactifs et les contrôles.
Conserver HCV MMX, CTM (–) C, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0, HCV QS et CTM Mn2+
entre 2 et 8 ºC. Non ouverts, ces réactifs sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée.
Une fois ouverts pour extraire un aliquote pour un lot de 12 échantillons, conserver les HCV
MMX, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0, HCV QS et CTM Mn2+ restant entre 2 et 8 ºC. Une
fois ouverts, HCV MMX, HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0, HCV QS et CTM Mn2+ restent
stables entre 2 et 8 °C pendant 28 jours ou jusqu’à la date d’expiration, selon celle qui survient
en premier. Une fois ouverte, toute portion non utilisée de CTM (–) C doit être éliminée.
Le mélange réactionnel actif (préparé par l’ajout de CTM Mn2+ au HCV MMX) doit être
stocké entre 2 et 8 ºC à l’abri de la lumière. Les échantillons et contrôles préparés doivent
être ajoutés moins d’1 heure après la préparation du mélange réactionnel actif.
Les échantillons et contrôles restent stables jusqu’à 3 heures entre 20 et 30 °C, jusqu’à
24 heures entre 2 et 8 °C ou jusqu’à 1 semaine s’ils sont congelés à –20 °C.
L’amplification doit commencer dans les 2 heures suivant l’ajout des échantillons et des
contrôles traités au mélange réactionnel actif.
PRODUITS FOURNIS
Réactifs de préparation des échantillons
A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
Kit d’acide nucléique viral du système High Pure
(P/N : 03502295 001)
LYS
(tampon de lyse/de liaison)
CAR
(ARN porteur)
PK
(protéinase K)
IRB
(tampon éliminateur d’inhibiteur)
WASH
(tampon de lavage)
ELB
(tampon d’élution)
RS
(ensemble de portoirs du kit d’acide nucléique viral du système High Pure)
WR
(portoir à déchets du kit d’acide nucléique viral du système High Pure)
B.
(P/N : 04861817 190)
HCV HPS V2
HCV QS
(standard de quantification du HCV COBAS® TaqMan®)
HCV H(+) C, v2.0
[contrôle haut (+) HCV, v2.0]
HCV L(+) C, v2.0
[contrôle bas (+) HCV, v2.0]
CTM (–) C
[contrôle négatif COBAS® TaqMan® (plasma humain)]
HCV MMX
(mélange réactionnel HCV COBAS® TaqMan®)
CTM Mn2+
(solution de manganèse COBAS® TaqMan®)
05998093001-07FR
10
Doc Rev. 11.0
MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
Instruments et logiciel
• Analyseur COBAS® TaqMan® 48
• Logiciel AMPLILINK version 3.3 ou 3.4
• Unité de contrôle du logiciel AMPLILINK
• Manuels de l'appareil et du logiciel :
-
Manuel de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 à utiliser avec le logiciel AMPLILINK versions 3.3 et 3.4
Manuel d’application du logiciel AMPLILINK version 3.3 à utiliser avec l'appareil
COBAS® AmpliPrep, l’analyseur COBAS® TaqMan®, l’analyseur COBAS® TaqMan®
48 et l'analyseur COBAS® AMPLICOR® et l’instrument cobas p 630
ou
- Manuel d'application du logiciel AMPLILINK version 3.4
• Fichier de définition de test (FDT). Reportez-vous à la carte d'informations sur les produits
incluse dans le kit pour obtenir le nom et la version actuelle du FDT.
• Décapsuleur de tubes K (P/N : 03516539001)
• Dispositif de pose de bouchon pour plaques K (P/N : 03339904001)
•
•
•
•
Portoir K de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 (P/N : 28150397001)
Portoir de plaque K (P/N : 03341488001)
Dispositif de maintien de portoir K (P/N : 03287696001)
Transporteur de portoir K (P/N : 03517519001)
Articles jetables
• Coffret de 12 x 96 tubes K (P/N : 03137082001)
• Coffret de 24 plaques K (P/N : 03343146001)
Centrifugeuse
• Centrifugeuse de paillasse Sigma 4-15C ou centrifugeuse de plaque de microtitrage
équivalente, capable d’atteindre une force centrifuge de 4600 x g
• Rotor amovible de centrifugeuse Sigma P/N : 11118 (comprend 2 godets P/N : 13218 et
2 porte-plaques P/N : 17978) ou équivalent
AUTRE MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Isopropanol (> 99 %) – atteint ou dépasse les spécifications ACS
Éthanol (96–100 %) – atteint ou dépasse les spécifications ACS
Eau déminéralisée
Pipetteurs ajustables* : (d’une capacité de 250 µL et 1000 µL) avec embouts de protection
contre les aérosols ou à déplacement positif, exempts de RNase
Dispositif d’aide au pipetage : Drummond (P/N : 4-000-100) ou équivalent
Bain-marie à 50 °C (± 2 °C)
Bloc à chaleur sèche à 70 °C (± 2 °C)
Pipettes sérologiques jetables et stériles : 5, 10 et 25 mL
Tubes coniques de polypropylène stérile ; 15 mL et 50 mL : Corning (P/N : 430052 et P/N :
430290) ou équivalent
Tubes microfuges stériles de 2,0 mL : Sarstedt (P/N : 72.693.005) ou équivalent
Mélangeur Vortex
Portoirs de tubes
Gants jetables, sans poudre
Thermomètres calibrés pour bain-marie et bloc à chaleur sèche
05998093001-07FR
11
Doc Rev. 11.0
*
La précision des pipetteurs ne doit pas différer de plus de 3 % du volume déclaré. Utiliser
des embouts à filtre de protection contre les aérosols ou à déplacement positif et exempts
de RNase chaque fois que cela est spécifié afin d’éviter toute contamination croisée entre
les échantillons et les amplicons.
PRÉLÈVEMENT, TRANSPORT ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS
Remarque : Manipuler tous les échantillons comme s’ils pouvaient tous potentiellement
transmettre des agents infectieux.
A.
Prélèvement des échantillons
Le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 est à utiliser uniquement avec des échantillons de sérum
ou de plasma. Le prélèvement sanguin doit se faire dans des tubes de séparation de sérum
BD SST ou dans des tubes stériles contenant de l’EDTA (bouchon de couleur lavande) comme
anticoagulant.
Conserver le sang entier entre 2 et 25 °C pendant un maximum de 6 heures. Observer les
instructions du fabricant pour séparer le sérum ou le plasma du sang total dans les 6 heures
suivant le prélèvement. Transférer le sérum ou le plasma dans un tube stérile en polypropylène.
Les figures 4 et 5 montrent les données de ces études de prélèvement d’échantillons. Les études
ont été effectuées avec le test COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR, version 2.0 (v2.0).
Figure 4
Stabilité du HCV dans le sang total ; tubes SST (sérum)
< 1 heure 2–8C
Taux moyen d’ARN du HCV :
Log10 ARN du HCV (UI/mL)
6 heures 2–8C
24 heures 2–8C
48 heures 2–8C
72 heures 2–8C
< 1 heure 20–25C
6 heures 20–25C
24 heures 20–25C
48 heures 20–25C
72 heures 20–25C
Numéro de l’échantillon
Figure 5
Stabilité du HCV dans le sang total ; tubes EDTA (plasma EDTA)
< 1 heure 2–8C
6 heures 2–8C
24 heures 2–8C
48 heures 2–8C
72 heures 2–8C
< 1 heure 20–25C
6 heures 20–25C
24 heures 20–25C
48 heures 20–25C
72 heures 20–25C
05998093001-07FR
12
Doc Rev. 11.0
B.
Transport des échantillons
Le transport des échantillons de sang total, de sérum ou de plasma doit s’effectuer conformément
aux règlements pour le transport d’agents pathogènes en vigueur aux niveaux local, fédéral et
national22. Le sang total doit être transporté entre 2 et 25 °C et traité dans les 6 heures suivant
son prélèvement. Le plasma ou le sérum peuvent être transportés entre 2 et 8 °C ou congelé entre
–20 °C et –80 °C.
C.
Conservation des échantillons
Les échantillons de sérum et de plasma peuvent être conservés soit entre 2 et 8 °C jusqu’à
3 jours, soit congelés à –70 °C, voire à une température inférieure. Il est recommandé de
conserver les échantillons sous forme de parties aliquotes de 800–900 µL dans des tubes en
polypropylène de 2,0 mL, stériles et à bouchon fileté (tels que les Sarstedt P/N : 72.694.006). Les
figures 6 et 7 montrent les données de ces études de conservation d’échantillons. Les études ont
été effectuées avec le test COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR, v2.0.
Figure 6
Stabilité du HCV dans le sérum
< 1 heure 2–8C
72 heures 2–8C
120 heures 2–8C
168 heures 2–8C
240 heures 2–8C
< 1 heure 20–25C
72 heures 20–25C
120 heures 20–25C
168 heures 20–25C
240 heures 20–25C
Figure 7
Stabilité du HCV dans le plasma prélevé sur EDTA
< 1 heure 2–8C
72 heures 2–8C
120 heures 2–8C
168 heures 2–8C
240 heures 2–8C
< 1 heure 20–25C
72 heures 20–25C
120 heures 20–25C
168 heures 20–25C
240 heures 20–25C
Les échantillons de sérum et de plasma peuvent être congelés et décongelés jusqu’à trois fois
sans entraîner une perte d’ARN du HCV. Le tableau 1 montre les données de ces études de
congélation-décongélation effectuées avec le test COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR, v2.0.
05998093001-07FR
13
Doc Rev. 11.0
Tableau 1
Log10 Différences entre les concentrations du HCV depuis le cycle 0 pour le sérum et
le plasma EDTA congelés et décongelés pendant 5 cycles
Stabilité
Échantillon No Cycle 0
1
0,00
2
0,00
Sérum
3
0,00
4
0,00
5
0,00
Sérum moyen
0,00
11
0,00
12
0,00
Plasma
13
0,00
EDTA
14
0,00
15
0,00
Plasma EDTA moyen
0,00
Matrice
Cycle de congélation/décongélation
Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle 4
–0,052
0,238
0,179
–0,670
0,293
0,228
–0,206
–0,338
–0,270
–0,023
–0,430
0,008
0,071
–0,516
–0,295
–0,564
0,342
–0,031
–0,344
–0,436
0,077
–0,021
–0,239
–0,400
–0,006
0,043
–0,143
–0,159
–0,329
–0,375
–0,234
–0,642
–0,056
–0,248
–0,371
–0,395
0,186
–0,066
–0,034
–0,241
–0,120
–0,111
–0,055
0,250
–0,065
–0,151
–0,167
-–0,237
Cycle 5
–0,277
0,175
–0,229
–0,670
–0,277
–0,246
–0,140
–0,265
–0,142
–0,084
–0,217
–0,170
MODE D’EMPLOI
Remarque : pour obtenir des instructions d'utilisation détaillées, sur l'impression des
résultats, l'interprétation des messages, commentaires et messages d'erreur,
consulter : (1) le manuel de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48 à utiliser avec le
logiciel AMPLILINK versions 3.3 et 3.4 ; (2) le manuel d'application du logiciel
AMPLILINK version 3.3 à utiliser avec l'appareil COBAS® AmpliPrep,
l'analyseur COBAS® TaqMan®, l'analyseur COBAS® TaqMan® 48, l'analyseur
COBAS® AMPLICOR® et l'instrument cobas p 630 ou (3) le manuel
d'application du logiciel AMPLILINK version 3.4.
Remarque : Tous les réactifs d’amplification et de détection doivent se trouver à
température ambiante avant l’usage. Retirer les éléments de l’emplacement
de conservation à une température comprise entre 2 et 8 °C au moins
30 minutes avant l’utilisation.
Remarque : Les échantillons de sérum et de plasma doivent être stabilisés à température
ambiante pendant 15 à 30 minutes avant traitement.
Remarque : Utiliser des pipetteurs munis de filtre de protection contre les aérosols ou de
lames de déplacement positif, aux endroits spécifiés. agir avec un soin
extrême pour éviter toute contamination.
Taille du run :
Chaque kit contient des réactifs en quantité suffisante pour quatre runs analytiques de 12 tests,
qui peuvent être réalisés séparément ou simultanément. Il est nécessaire d’inclure une réplique
des CTM (–) C, HCV L(+)C, v2.0 et du HCV H(+)C, v2.0 dans chaque cycle analytique
comprenant jusqu’à 24 échantillons et contrôles (voir la section « Contrôle de qualité »). Les
réactifs d’amplification et de détection sont conditionnés en flacons à double usage de 24 tests.
Pour une utilisation optimale des réactifs, les échantillons et contrôles devraient être traités en
lots multiples de 12.
Préparation des échantillons et des contrôles
Remarque : Si l’on utilise des échantillons de sérum ou de plasma congelés, les mettre à
température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés,
puis les mélanger au vortex pendant 5 à 10 secondes avant de les utiliser.
Remarque : Laisser les réactifs atteindre la température ambiante avant de continuer.
Préchauffer le ou les blocs de chauffage à 70 °C (± 2 °C) et les plonger dans un
bain-marie à 50 °C (± 2 °C) avant de commencer les réactions de purification.
05998093001-07FR
14
Doc Rev. 11.0
A. Préparation des réactifs
Remarque : Ne préparer la solution active de lyse/de liaison qu’après avoir stabilisé tous
les échantillons et contrôles à température ambiante pendant 15 à
30 minutes.
1.
Préparer le tampon éliminateur d’inhibiteur en pipetant 20 mL d’éthanol à 96–100 % dans
ce tampon (IRB). Mélanger en retournant 5 à 10 fois. Cette quantité de tampon reconstitué
suffit à effectuer 48 tests.
2.
Préparer le tampon de lavage en pipetant 50 mL d’éthanol à 96–100 % et 30 mL d’eau
déminéralisée dans ce tampon (WASH). Mélanger en retournant 5 à 10 fois. Cette quantité
de tampon de lavage reconstitué suffit à effectuer 48 tests.
3.
Préchauffer le tampon d’élution (ELB) à 70 °C (± 2 °C) dans un tube microfuge de 2,0 mL à
bouchon vissé. Plusieurs tubes peuvent être utilisés. Le volume d’élution pour chaque
échantillon est de 75 µL. Préchauffer le volume indiqué dans le tableau ci-dessous en
fonction du nombre de tests.
Réactif
Tampon d’élution (mL)
4.
6.
7.
Nombre de répliques
24
4,0
Pipeter le volume d’isopropanol indiqué dans le tableau ci-dessous dans un tube stérile et
propre, en fonction du nombre de tests.
Réactif
Isopropanol (mL)
5.
12
2,0
12
5,0
24
10,0
Pipeter 0,5 mL du tampon d’élution (ELB) dans l’ARN porteur (CAR). Remettre le bouchon
en place, retourner le flacon et mélanger au vortex jusqu’à dissolution complète de l’ARN
porteur. L’ARN porteur reconstitué suffit à effectuer 24 tests. La quantité non utilisée
d’ARN porteur peut être conservée entre –15 et –25 °C pendant 28 jours ou jusqu’à la date
d’expiration, selon celle qui survient en premier.
Pipeter 5,0 mL du tampon d’élution (ELB) dans la protéinase K (PK). Remettre le bouchon
en place, retourner le flacon et mélanger au vortex jusqu’à dissolution complète de la
protéinase K. La protéinase K reconstituée suffit à effectuer 24 tests. La quantité non
utilisée de protéinase K peut être conservée entre –15 et –25 °C pendant 28 jours ou
jusqu’à la date d’expiration, selon celle qui survient en premier.
Préparer la solution active de lyse/de liaison en pipetant les volumes indiqués dans le
tableau suivant en fonction du nombre d’échantillons et de contrôles à traiter :
Réactifs
Tampon de lyse/de liaison (mL)
ARN porteur (µL)
HCV QS (µL)
Protéinase K (mL)
12
7,0
140
56
1,4
24
14,0
280
112
2,8
Remarque : Le volume HCV QS (standard de quantification du HCV) est spécifique au test
COBAS® TaqMan® HCV, v2.0.
Remarque : Si l’on utilise de l’ARN porteur ou de la protéinase K congelés, les faire
décongeler à température ambiante et retourner les flacons plusieurs fois
avant usage.
• Ajouter le volume indiqué de tampon de lyse/de liaison dans un tube de 50 mL propre
et stérile.
• Ajouter le volume indiqué d’ARN porteur reconstitué dans le tube contenant le tampon de
lyse/de liaison.
05998093001-07FR
15
Doc Rev. 11.0
• Mélanger le HCV QS pendant 3 à 5 secondes et ajouter le volume indiqué de HCV QS au
tube contenant le tampon de lyse/de liaison et l’ARN porteur reconstitué.
• Fermer le flacon et mélanger en le retournant 10 à 15 fois. Ne PAS mélanger au vortex :
cela entraînerait l’apparition de bulles dans la solution.
• Ajouter le volume indiqué de protéinase K reconstituée dans le tube contenant le tampon
de lyse/de liaison.
• Fermer le flacon et mélanger en le retournant 10 à 15 fois. Ne PAS mélanger au vortex :
cela entraînerait l’apparition de bulles dans la solution. Commencer à pipeter la solution
active de lyse/de liaison immédiatement après l’ajout et le mélange de la protéinase K au
tampon de lyse/de liaison.
La quantité non utilisée de tampon de lyse/de liaison (LYS) peut être conservée entre 15 et
25 °C pendant 28 jours ou jusqu’à la date d’expiration, selon celle qui survient en premier.
Toute solution active de lyse/de liaison doit être éliminée.
B. Préparation des échantillons et des contrôles
Remarque : des pipetteurs ajustables dotés d'embouts avec filtre de protection contre les
aérosols sont recommandés pour cette procédure.
Remarque : une pipette à répétition à embout stérile de taille appropriée peut être utilisée
dans les étapes 1, 14, 16, 19 et 22. Néanmoins, il est nécessaire de veiller avec
le plus grand soin à éviter les éclaboussures de réactifs et une contamination
croisée.
Remarque : tout au long de la procédure, éviter toute éclaboussure de solution active de
lyse/liaison, d'échantillon, de contrôle et d'isopropanol au niveau de la zone
de fermeture entre le puits et le couvercle sur le bord de chaque puits.
Remarque : utilisez des gants bien ajustés. Remplacer fréquemment les gants, en
particulier après la manipulation de contrôles positifs et après l'ouverture de
tubes pleins du portoir de lyse. Ne jamais toucher à la partie interne des
couvercles (par exemple lors de l'ouverture ou de la fermeture).
Remarque : lors de la manipulation de contrôles de kit et d'échantillons cliniques,
commencer par charger le contrôle négatif avant de traiter les contrôles
positifs du kit.
1.
Pipeter 625 µL de solution active de lyse/liaison dans chaque puits du portoir de lyse
(I, transparent). Refermer soigneusement les couvercles. Ne pas enclencher pas le
mécanisme de fermeture.
2.
Ouvrir un puits à la fois, pipeter précautionneusement 500 µL d'échantillon ou de contrôle
dans le puits approprié. Après avoir ajouté chaque échantillon ou contrôle, refermer le
couvercle depuis la charnière en appliquant une légère pression vers le bas. Maintenir la
légère pression sur le centre du couvercle et enclencher les mécanismes de fermeture afin
de fermer hermétiquement le puits.
3.
Une fois tous les échantillons et contrôles ajoutés, mélangez au vortex le portoir de lyse
rempli pendant environ 10 secondes. Éviter tout mélange trop vigoureux au vortex.
Examiner tous les puits pour vous assurer que le mélange au vortex est satisfaisant.
4.
Placez soigneusement les portoirs de lyse dans un bain-marie préchauffé à 50 °C (± 2 °C)
et évitez toute éclaboussure. Incuber le portoir de lyse pendant 10 minutes. Pendant
l'incubation, le portoir de lyse doit être immergé dans l'eau du bain mais ne doit pas flotter.
Veiller à ce que la surface supérieure du portoir de lyse entre les puits reste sèche pendant
l'incubation. Essuyer soigneusement les parties inférieure et supérieure du portoir de lyse
une fois celui-ci retiré de l'eau du bain.
5.
Centrifuger le portoir de lyse à 4 600 x g pendant 10 à 20 secondes dans la centrifugeuse
de plaque de microtitrage. Il se peut que la centrifugeuse n'atteigne pas la vitesse définie.
Vérifier qu'il n'y a pas de fuite en contrôlant le niveau de liquide de chaque puits. En cas de
détection de fuite, interrompre la procédure.
6.
Ouvrir un puits à la fois en appliquant une légère pression sur la charnière de fermeture de
manière à libérer le mécanisme de fermeture et soulever le couvercle, puis transvaser
250 µL d'isopropanol dans chaque puits. Après chaque ajout, refermer le couvercle depuis
la charnière en appliquant une légère pression vers le bas. Maintenir la légère pression sur
05998093001-07FR
16
Doc Rev. 11.0
le centre du couvercle et enclencher les mécanismes de fermeture afin de fermer
hermétiquement le puits.
Remarque : le volume d'isopropanol est spécifique au test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0.
7.
Vérifier que tous les portoirs sont hermétiquement fermés. Mélanger les échantillons en
retournant le portoir trois fois puis en mélangeant le portoir au vortex pendant environ
10 secondes. Éviter tout mélange trop vigoureux au vortex. Examiner tous les puits pour
vous assurer que le mélange au vortex est satisfaisant.
8.
Centrifuger le portoir de lyse à 4 600 x g pendant 10 à 20 secondes dans la centrifugeuse
de plaque de microtitrage. Il se peut que la centrifugeuse n'atteigne pas la vitesse définie.
Vérifier qu'il n'y a pas de fuite en contrôlant le niveau de liquide de chaque puits. En cas de
détection de fuite, interrompre la procédure.
9.
manière à libérer le mécanisme de fermeture et soulever le couvercle, puis transférer 750 µL
de mélange d'échantillon ou de contrôle dans les puits correspondants du portoir de tubes
de filtration (II, jaune) doté d'un portoir à déchets (blanc). Après avoir ajouté chaque mélange
d'échantillon ou de contrôle, refermer le couvercle depuis la charnière en appliquant une
légère pression vers le bas. Maintenir la légère pression sur le centre du couvercle et
enclencher les mécanismes de fermeture afin de fermer hermétiquement le puits.
10.
Une fois tous les échantillons et contrôles ajoutés, centrifuger à 4600 x g l'ensemble du
portoir de tubes de filtration pendant 2 minutes dans la centrifugeuse de plaque de
microtitrage. Vérifier qu'il n'y a pas de fuite en contrôlant le niveau de liquide de chaque
puits. En cas de détection de fuite, interrompre la procédure.
11.
manière à libérer le mécanisme de fermeture et soulever le couvercle, puis transférer le
mélange restant d'échantillon ou de contrôle dans les puits correspondants du portoir de
tubes de filtration. Après avoir ajouté chaque mélange d'échantillon ou de contrôle, refermer le
couvercle du puits depuis la charnière en appliquant une légère pression vers le bas. Maintenir
la légère pression sur le centre du couvercle et enclencher le mécanisme de fermeture afin de
fermer hermétiquement le couvercle. Éliminer le portoir de lyse de manière appropriée.
12.
Centrifuger le portoir de tubes de filtration à 4 600 x g pendant 2 minutes dans la
centrifugeuse de plaque de microtitrage. Vérifier qu'il n'y a pas de fuite en contrôlant le
niveau de liquide de chaque puits. En cas de détection de fuite, interrompre la procédure.
13.
Retirer le portoir de tubes de filtration du portoir à déchets en appuyant sur les deux
fermoirs situés sur le bord supérieur du portoir de tubes de filtration. Éliminer le portoir à
déchets. Le remplacer par un nouveau portoir à déchets et enclencher le portoir de tubes
de filtration dans le portoir à déchets.
14.
Ouvrir tous les couvercles du portoir de tubes de filtration et pipeter 400 µL de tampon
éliminateur d'inhibiteur (IRB) le long des parois de chaque puits. Ne pas toucher les
parois du puits. Après avoir ajouté le tampon éliminateur d'inhibiteur à tous les puits,
refermer le couvercle depuis la charnière en appliquant une légère pression vers le bas.
Maintenir la légère pression sur le centre du couvercle et enclencher le mécanisme de
fermeture afin de fermer hermétiquement les couvercles.
15.
16.
Ouvrir tous les couvercles du portoir de tubes de filtration et pipeter 700 µL de tampon de
lavage (WASH) le long des parois de chaque puits. Ne pas toucher les parois du puits.
Après avoir ajouté le tampon de lavage à tous les puits, refermer le couvercle depuis la
charnière en appliquant une légère pression vers le bas. Maintenir la légère pression sur le
centre du couvercle et enclencher le mécanisme de fermeture afin de fermer
hermétiquement les couvercles.
17.
05998093001-07FR
17
Doc Rev. 11.0
18.
fermoirs situés sur le bord supérieur du portoir de tubes de filtration. Éliminer le portoir à
déchets. Le remplacer par un nouveau portoir à déchets et enclencher le portoir de tubes
de filtration dans le portoir à déchets.
19.
Ouvrir tous les couvercles du portoir de tubes de filtration et pipeter 700 µL de tampon de
lavage le long des parois de chaque puits. Ne pas toucher les parois du puits. Après
avoir ajouté le tampon de lavage à tous les puits, refermer le couvercle depuis la charnière
en appliquant une légère pression vers le bas. Maintenir la légère pression sur le centre du
couvercle et enclencher le mécanisme de fermeture afin de fermer hermétiquement les
couvercles.
20.
21.
fermoirs situés sur le bord supérieur du portoir de tubes de filtration. Placer le portoir de
tubes de filtration dans le portoir à élution (IIIA, bleu) et enclencher le portoir de tubes de
filtration dans le portoir à élution. Éliminer le portoir à déchets de manière appropriée.
22.
Ouvrir tous les couvercles du portoir de tubes de filtration et pipeter 75 µL du tampon
d'élution préchauffé (ELB) au centre de chaque filtre sans toucher le filtre.
Remarque : ne pas ajouter le tampon d'élution en le déversant le long des parois du puits.
Après avoir ajouté le tampon d'élution à tous les puits, refermer le couvercle depuis la
charnière en appliquant une légère pression vers le bas. Maintenir la légère pression sur le
centre du couvercle et enclencher les mécanismes de fermeture afin de fermer
hermétiquement les puits.
23.
Incuber le portoir à élution à la température ambiante pendant 3 minutes minimum après
avoir ajouté le tampon d'élution au dernier puits; refermer le couvercle depuis la charnière
en appliquant une légère pression vers le bas ; maintenir la légère pression sur le centre du
couvercle et enclencher le mécanisme de fermeture afin de fermer le puits de manière
étanche.
24.
25.
Retirer le portoir de tubes de filtration du portoir à élution en appuyant sur les deux
fermoirs situés sur le bord supérieur du portoir de tubes de filtration. Éliminer le portoir de
tubes de filtration de manière appropriée.
26.
Disposer le portoir à couvercles (IIIB, bleu) dans le portoir à élution (IIIA, bleu). Appuyer
fermement et enclencher les fermoirs sur le portoir à élution. Refermer le couvercle depuis
la charnière en appliquant une légère pression vers le bas. Maintenir la légère pression sur
le centre du couvercle et enclencher le mécanisme de fermeture afin de fermer
hermétiquement tous les couvercles.
27.
Les échantillons et contrôles traités sont directement utilisés pour la PCR. Utiliser 50 µL
des échantillons et contrôles traités pour l'amplification. Ajouter les échantillons et
contrôles traités au mélange réactionnel actif dans les 3 heures suivant la fin de la
préparation des échantillons et des contrôles. Si les échantillons et contrôles traités ne
peuvent pas être utilisés dans les 3 heures suivant la préparation, ils peuvent être stockés
à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant 24 heures maximum dans le portoir à
élution couvert, ou congelés à -20 °C pendant 1 semaine maximum dans des tubes stériles
en polypropylène de 2,0 mL à bouchon fileté (tels que Sarstedt P/N : 72.694.006). Amplifier
les échantillons et contrôles traités dans les 2 heures suivant l'ajout des échantillons et des
contrôles au mélange réactionnel actif.
Transcription inverse, amplification et détection
Remarque : les portoirs K/portoirs de plaque K et les dispositifs de maintien de portoir K/
de portoir de plaque K doivent être nettoyés à l'aide d'un chiffon non
pelucheux humidifié à l'aide d'une solution d'isopropanol à 70 %.
05998093001-07FR
18
Doc Rev. 11.0
C.
Préparation des réactifs
Remarque : le mélange réactionnel COBAS® TaqMan® HCV (HCV MMX), le mélange
réactionnel actif (MMX actif) et le mélange réactionnel actif + échantillons et
contrôles traités sont sensibles à la lumière. Conserver ces réactifs à l'abri de
la lumière.
Remarque : le mélange réactionnel COBAS® TaqMan® HCV (HCV MMX) et la solution de
manganèse COBAS® TaqMan® (CTM Mn2+) doivent être portés à
température ambiante pendant 30 minutes minimum avant de préparer le
mélange réactionnel actif.
Remarque : préparer le mélange réactionnel actif au terme de la préparation des
échantillons et des contrôles.
Remarque : le mélange réactionnel actif doit être utilisé dans un délai d'1 heure suivant la
préparation.
Remarque : une fois que les échantillons et les contrôles traités ont été ajoutés au
mélange réactionnel actif, l'amplification doit commencer dans les 2 heures.
Porter un flacon de HCV MMX et un flacon de CTM Mn2+ à température ambiante
pendant 30 minutes minimum.
2.
Placer un portoir K ou un portoir de plaque K dans un dispositif de maintien de portoir K/de
portoir de plaque K.
3.
Placer de nouveaux tubes K ou une nouvelle plaque K dans le portoir K/portoir de plaque K
sans toucher les parois des tubes K.
Remarque : en cas de run de moins de 24 tubes, les emplacements 1, 2, 5, 20, 23 et 24
doivent être occupés afin d'équilibrer le portoir K dans le thermocycleur.
Aucun équilibrage du thermocycleur n'est nécessaire lorsqu'une plaque K est
utilisée.
4.
Le cas échéant, déboucher les tubes K à l'aide du décapsuleur de tubes K. Placer les
bouchons dans le dispositif de maintien de tubes K.
5.
Préparer le MMX actif comme suit :
1.
Pour 24 tests, ajouter170 µL de CTM Mn2+ dans un flacon de HCV MMX. Fermer le flacon
et mélanger vigoureusement en le retournant 10 fois. Ne pas agiter le mélange réactionnel
actif au vortex. Conserver le mélange réactionnel actif à l'abri de la lumière et l'utiliser dans
un délai d'1 heure.
Pour 12 tests, retirer 669 µL de HCV MMX et les placer dans un tube de 2 mL. Ajouter
81 µL de CTM Mn2+ au tube de 2 mL contenant le HCV MMX, boucher le tube et
mélanger bien en retournant 10 fois. Conserver le mélange réactionnel actif à l'abri de la
lumière et l'utiliser dans un délai d'1 heure. Conserver le HCV MMX et le CTM Mn2+ non
utilisés dans leurs flacons d'origine à une température comprise entre 2 et 8 °C. Une fois
ouverts, le HCV MMX et le CTM Mn2+ restent stables pendant 28 jours à une température
comprise entre 2 et 8 °C ou jusqu'à leur date de péremption, selon le cas le plus proche
dans le temps.
Remarque : le volume de CTM Mn2+ est spécifique au test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0.
6.
Pipeter 50 µL du mélange réactionnel actif dans chaque tube K ou dans chaque puits de la
plaque K.
Remarque : Si les échantillons et les contrôles traités ont été conservés congelés avant
l'amplification, les ramener à température ambiante et bien les mélanger
avant de passer à l'étape 7.
7.
À l'aide d'une micropipette dotée d'un embout avec filtre de protection contre les aérosols
ou à déplacement positif, ajouter 50 µL de chaque échantillon ou contrôle traité dans le
tube K ou les puits de la plaque K appropriés contenant le mélange réactionnel actif.
Mélanger délicatement chaque échantillon ou contrôle en déplaçant la micropipette trois
fois de haut en bas, tout en évitant la formation de bulles.
05998093001-07FR
19
Doc Rev. 11.0
8.
Répéter l'étape 7 pour tous les échantillons et contrôles traités jusqu'à ce qu'ils aient tous
été transférés dans les tubes K ou les puits de plaque K. Utiliser un nouvel embout pour
chaque échantillon et contrôle. Inspecter chaque tube à la recherche de bulles ; les
éliminer le cas échéant. Refermer les tubes K/la plaque K à l'aide d'un décapsuleur de tube
K/dispositif de pose de bouchon pour plaques K. Vérifier que les volumes adéquats ont été
ajoutés.
9.
L'amplification doit commencer dans les 2 heures suivant l'ajout des échantillons et
contrôles traités aux tubes K ou à la plaque K contenant le mélange réactionnel actif.
D.
1.
Chargement et fonctionnement de l'analyseur COBAS® TaqMan® 48
Allumer l'ordinateur de la station de travail et ouvrir une session sur le système
d'exploitation Microsoft Windows en saisissant l’ID utilisateur et le mot de passe
appropriés.
2.
Démarrer l'analyseur COBAS® TaqMan® 48. S'assurer que l'appareil démarre bien et est
prêt à l'emploi. Si l'un des thermocycleurs contient encore des portoirs K ou des portoirs
de plaque K issus d'une ou de plusieurs analyses précédentes, les enlever à l'aide du
transporteur de portoir K.
3.
Lancer le logiciel AMPLILINK sur l'ordinateur. Ouvrir la session en saisissant l'identifiant
utilisateur et le mot de passe appropriés.
4.
Pour créer des commandes de portoir K ou de portoir de plaque K pour les échantillons à
analyser, cliquer sur l'icône Orders. Sélectionner l'onglet Sample, cliquer sur le bouton
New et entrer le numéro de commande d'un échantillon à l'aide du pavé numérique ou
d'un lecteur de code-barres. Sélectionner le fichier de définition de test correspondant au
test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0. Répéter cette étape pour chaque échantillon. Cliquer
sur le bouton Save.
Remarque : en cas de run de moins de 24 tubes, les emplacements 1, 2, 5, 20, 23 et 24
doivent être occupés afin d'équilibrer le portoir K dans le thermocycleur.
Aucun équilibrage du thermocycleur n'est nécessaire lorsqu'une plaque K est
utilisée.
5.
Entrer les informations relatives au contrôle de qualité en sélectionnant l'onglet Quality
Control dans la fenêtre Orders. Cliquer sur le bouton New et entrer les données de la
carte des valeurs de contrôle du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 fournie avec le kit à
l'aide du clavier ou du lecteur de code-barres. Entrer le numéro de lot du test COBAS®
TaqMan® HCV, v2.0 la date de péremption, les plages des contrôles bas (+) et haut (+),
ainsi que les coefficients de calibration spécifiques au lot dans les espaces prévus. Cliquer
sur « OK ».
6.
Attribuer un numéro de portoir K/plaque K au run en cliquant sur l'onglet K-Carrier de la
fenêtre Orders. Dans la fenêtre K-Carrier, cliquer sur New. Dans la cellule à droite de
K-Carrier ID, entrer le numéro du portoir K ou de la plaque K du code-barres se trouvant
sur le portoir K ou la plaque K à l'aide d'un lecteur de code-barres ou du pavé numérique.
En cas d'utilisation d'une plaque K, cocher la case K-Tray sous le champ K-Carrier ID.
Sélectionner le fichier de définition de test correspondant au test COBAS® TaqMan® HCV,
v2.0 depuis le panneau de test dans la partie inférieure de la fenêtre. Reportez-vous à la
carte d'informations sur les produits incluse dans le kit pour obtenir le nom et la version
du FDT.
Remarque : les résultats d'un run précédent disposant du même ID de portoir K doivent
être acceptés.
7.
Dans la liste de travail (Worklist), sélectionner la première ligne de la colonne Type (T).
Mettre ce champ en surbrillance pour accéder au menu déroulant puis sélectionner le type
de contrôle requis. Double-cliquer ensuite sur le champ comportant l'identifiant de
l'échantillon sur la même ligne. La fenêtre LookUp Control s'affiche, présentant tous les
contrôles disponibles. Lorsque le contrôle est sélectionné, les valeurs de calibration et de
contrôles correspondantes sont affichées dans le panneau d'information inférieur droit.
Répéter cette procédure pour tous les contrôles nécessaires.
05998093001-07FR
20
Doc Rev. 11.0
8.
Pour entrer des échantillons dans la liste de travail Worklist, double-cliquer sur la première
position (ligne) d'entrée d'échantillon. La fenêtre Lookup Sample s'affiche alors,
présentant les commandes d'échantillons assignées. Utiliser les touches MAJ + Flèche
pour sélectionner plusieurs numéros de commande. Vérifier que le fichier de définition de
test correspondant au test COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 a été attribué à toutes les
commandes. Reportez-vous à la carte d'informations sur les produits incluse dans le kit
pour obtenir le nom et la version du FDT.
9.
Cliquer sur Save pour enregistrer l'attribution de commande de portoir K/portoir de
plaque K.
Remarque :en cas de run de moins de 24 tubes, les emplacements 1, 2, 5, 20, 23 et 24
doivent être occupés afin d'équilibrer le portoir K dans le thermocycleur. Aucun
équilibrage du thermocycleur n'est nécessaire lorsqu'une plaque K est utilisée.
E.
1.
Transcription inverse, amplification et détection
Cliquer sur l'icône Systems dans l'onglet System. Cliquer ensuite sur Open pour ouvrir le
thermocycleur. Lorsque le couvercle du thermocycleur est totalement ouvert et que la
mention « Ready to Load » s'affiche dans la fenêtre Systems, soulever et maintenir ouvert
le couvercle du thermocycleur. À l'aide du transporteur de portoir K, transférer le portoir K/
portoir de plaque K contenant les tubes K/plaques K bouchés avec le mélange réactionnel
actif et les échantillons et contrôles dans le thermocycleur. Fermer le couvercle du
thermocycleur.
2.
Cliquer sur Start dans la fenêtre Systems sous l’icône TC pour fermer le couvercle du
thermocycleur et lancer le run.
3.
L’analyseur COBAS® TaqMan® 48 exécute automatiquement la transcription inverse,
l’amplification et la détection.
RÉSULTATS
Calcul des résultats
L’analyseur COBAS® TaqMan® 48 détermine automatiquement le titre d’ARN du HCV de
l’échantillon ou du contrôle. Le titre d’ARN du HCV est exprimé en unités internationales (UI)/mL,
conformément à la deuxième norme internationale relative aux tests d’amplification nucléique
(NAT) pour l’ARN du HCV (code NIBSC 96/798)19.
L’analyseur COBAS® TaqMan® 48 :
• détermine le cycle seuil (Ct) de l’ARN du HCV et de l’ARN du standard de quantification
du HCV.
• détermine le titre d’ARN du HCV d’après les valeurs Ct de l’ARN du HCV et de l’ARN du
standard de quantification du HCV, et d’après les coefficients de calibration spécifiques
au lot.
• vérifie que les titres en UI/mL calculés pour HCV L(+)C, v2.0 et HCV H(+)C, v2.0 se situent
dans les plages assignées.
Validation du run – AMPLILINK versions 3.3 et 3.4
Consulter la fenêtre des résultats AMPLILINK ou l'impression pour vérifier les messages et
les commentaires afin de s'assurer de la validité du run.
Le run est valide si aucun message ne s’affiche pour les contrôles COBAS® TaqMan® HCV.
Le run n'est pas valide si l'un des messages suivants s’affiche pour les contrôles COBAS®
TaqMan® HCV :
05998093001-07FR
21
Doc Rev. 11.0
Contrôle négatif :
Message
NC_INVALID
Résultat
Invalid
Interprétation
Un résultat invalide ou un
résultat « valide » qui n'était
pas négatif pour la cible
du HCV
Résultat
Invalid
Interprétation
Résultat invalide ou
contrôle hors limites
Résultat
Invalid
Interprétation
Résultat invalide ou
contrôle hors limites
Contrôle faiblement positif HCV :
Message
LPCINVALID
Contrôle fortement positif HCV :
Message
HPCINVALID
Si le run est non valide, le répéter entièrement, y compris la préparation des échantillons et des
contrôles, la transcription inverse, l'amplification et la détection.
Interprétation des résultats :
Si le run est valide, vérifier les messages ou commentaires accompagnant chaque échantillon sur
les résultats imprimés. Interpréter les résultats comme suit :
Un run valide peut comprendre des résultats d’échantillons valides et non valides en fonction de
la présence de messages et/ou commentaires accompagnant les échantillons individuels.
Les résultats des échantillons s’interprètent comme suit :
Résultats de titre
Target Not Detected
< 2.50E+01 IU/mL
2.50E+01 IU/mL et
 3.91E+08 IU/mL
 3.91E+08 IU/mL
Interprétation
La valeur Ct du HCV dépasse la limite du test ou aucune
valeur Ct n’a été obtenue pour le HCV. Enregistrer les
résultats comme suit : « ARN du HCV non détecté ».
Les UI/mL calculées se situent sous la limite de
quantification pour l'analyse. Enregistrer les résultats
comme suit : « ARN du HCV détecté, moins de 25 UI/mL
d’ARN du HCV ».
Les résultats calculés supérieurs ou égaux à 25 UI/mL et
inférieurs ou égaux à 3,91E+08 UI/mL se situent dans le
domaine linéaire du test.
Les UI/mL calculées dépassent le domaine linéaire du test.
Enregistrer les résultats comme suit : « supérieur à
3,91E+08 UI/mL d’ARN du HCV ». Pour obtenir des
résultats quantitatifs, l’échantillon d’origine doit être dilué
avec du plasma ou du sérum humain HCV négatif, selon la
nature de l’échantillon d’origine, et le test doit être répété.
Multiplier le résultat enregistré par le coefficient de dilution.
Remarque : Les échantillons au-dessus de la plage du dosage qui produisent un résultat
non valide accompagné du message « QS_INVALID » ne devraient pas être
rapportés comme étant > 3,91E+08 UI/mL. L'échantillon d'origine doit être
dilué avec du plasma ou du sérum humain HCV négatif, selon la matrice de
l'échantillon d'origine, et le test doit être répété. Multiplier le résultat
enregistré par le coefficient de dilution.
05998093001-07FR
22
Doc Rev. 11.0
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Un contrôle négatif CTM (–), un contrôle positif HCV L(+)C et un contrôle positif HCV H(+)C, v2.0
doit être incluse dans chaque run comportant jusqu'à 24 échantillons et contrôles. Comme c'est
le cas avec toute nouvelle procédure de laboratoire, il est recommandé aux opérateurs novices
d'utiliser des contrôles de laboratoire supplémentaires pour chaque test jusqu'à ce qu'ils se
sentent totalement capables d'effectuer le test correctement. Il n'y a aucune obligation concernant
la position des contrôles positifs sur le portoir K ou la plaque K. Vérifier que les résultats imprimés
ne contiennent ni message ni commentaire afin de s'assurer de la validité du run.
Contrôle négatif
Le CTM (–) C doit donner un résultat « Target Not Detected », c’est-à-dire que la valeur Ct de l’ARN
du HCV a dépassé la limite du test ou aucune valeur Ct n’a été obtenue pour l’ARN du HCV, mais
une valeur Ct valide a été obtenue pour l’ARN du standard de quantification du HCV. Si le CTM (–) C
ne satisfait pas à ces critères, tout le run est non valide. Répéter tout le processus (préparation des
échantillons et des contrôles, amplification et détection). Si le CTM (–) C est continuellement non
valide, contacter le bureau local de Roche pour obtenir une assistance technique.
Contrôles positifs
Les plages assignées pour HCV L(+)C, v2.0 et HCV H(+)C, v2.0 sont indiquées sur la carte des
valeurs de contrôles du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0, fournie dans le kit. Ces plages de
valeur sont entrées dans l'unité de contrôle du logiciel AMPLILINK.
Les titres d’ARN du HCV (en UI/mL) de HCV L(+)C, v2.0 et de HCV H(+)C, v2.0 doivent se situer
dans la plage indiquée sur la carte des valeurs de contrôle du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0,
fournie dans le kit. Le run entier est non valide si l’un des contrôles positifs ou les deux ne
répondent pas à ces critères. Répéter tout le processus (préparation des échantillons et des
contrôles, amplification et détection). Si le titre d’ARN du HCV de l’un des contrôles positifs ou
des deux se situe constamment en dehors de la plage assignée, contacter le bureau local de
Roche pour obtenir une assistance technique.
PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES
Comme pour toute procédure d’analyse, une bonne technique de laboratoire est essentielle pour
le bon déroulement de ce test. En raison de la haute sensibilité analytique de ce test, des
précautions extrêmes doivent être prises pour préserver la pureté du kit de réactifs ou des
mélanges d’amplification. Tous ces réactifs doivent être étroitement surveillés pour en préserver
la pureté. Mettre de côté tout réactif pouvant être suspect.
05998093001-07FR
23
Doc Rev. 11.0
LIMITATIONS DU TEST
1.
Les valeurs attribuées aux coefficients de calibration sont spécifiques à chaque lot et au
test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0, à utiliser avec le système High Pure. Ces méthodes
peuvent ne pas être valides si elles sont utilisées avec d’autres méthodes de préparation
des échantillons.
2.
L’emploi de ce test a été approuvé avec du sérum ou du plasma humain prélevé sur
anticoagulant EDTA. L’utiliser sur d’autres types d’échantillons peut entraîner des résultats
incorrects, faux positifs ou faux négatifs.
3.
Bien qu'il s'agisse d'un cas rare, des mutations au niveau des régions hautement
conservées du génome viral couvertes par les amorces et/ou la sonde du test risquent
d'entraîner une sous-estimation de la quantification du virus ou l'échec de la détection
du virus.
4.
La quantification de l'ARN du HCV dépend du nombre de particules virales présentes dans
l'échantillon et peut être affectée par les méthodes de collecte d'échantillons, les facteurs
relatifs aux patients (par exemple, l’âge, la présence de symptômes) et/ou le stade de
l’infection.
5.
La fiabilité des résultats dépend des procédures utilisées pour prélever, transporter,
conserver et traiter les échantillons.
6.
La présence de l’enzyme AmpErase dans le mélange réactionnel COBAS® TaqMan® HCV
réduit le risque de contamination des amplicons. Cependant, une contamination par des
contrôles ou par des échantillons cliniques HCV positifs ne peut être évitée que par de
bonnes pratiques de laboratoire et un respect scrupuleux des consignes fournies dans
cette notice d’utilisation.
7.
Seules des personnes formées à la technique de la PCR doivent utiliser ce produit.
8.
Ce produit ne peut être utilisé qu’avec l’analyseur COBAS® TaqMan® 48.
9.
En raison des différences inhérentes à chaque technologie, il est recommandé aux
utilisateurs, avant de passer d'une technologie à l'autre, de mener des études de
corrélation de méthodes au sein de leur laboratoire afin de quantifier les différences entre
les diverses technologies.
05998093001-07FR
24
Doc Rev. 11.0
SUBSTANCES INTERFÉRENTES
Il a été prouvé qu’un taux élevé d’albumine (jusqu’à 7 000 mg/dL), de biliburine totale (jusqu’à
24,1 mg/dL), d’hémoglobine (jusqu’à 540 mg/dL) et de triglycérides (jusqu’à 1,432 mg/dL) ainsi
que des échantillons cliniques de patients atteints de lupus érythémateux disséminé (jusqu’à
780 UI/mL d’anticorps anti-ADN natif) et de polyarthrite rhumatoïde (jusqu’à 660 UI/mL de
facteurs rhumatoïdes) dans du plasma prélévé sur EDTA et du sérum n’interfèrent pas avec le
dosage de l’ARN du HCV par ce test.
Il a été démontré que les substances médicamenteuses suivantes, testées à une concentration
représentant 3 fois leur valeur Cmax respective (concentration plasmatique maximale) dans le
plasma EDTA et le sérum n’interfèrent pas avec le dosage de l’ARN du HCV par ce test.
Inhibiteur nucléotidique de la Inhibiteurs nucléosidiques de la
transcriptase inverse du HIV transcriptase inverse et de
l’ADN-polymérase
Lamivudine
Tenofovir disoproxil fumarate
Zidovudine
Zalcitabine
Inhibiteur de fusion du HIV
Stavudine
Ribavirine
Enfuvirtide
Sulfate d’abacavir
Didanosine
Inhibiteurs
Modulateurs de l’immunité
non-nucléosidique de la
transcriptase inverse du HIV
Névirapine
Peg interféron alfa-2a
Éfavirenz
Interféron alpha-2b
Interféron alpha-2a
Inhibiteur de protéase
du HIV
Sulfate d’indinavir
Ritonavir
Mésylate de nelfinavir
Saquinavir
Amprénavir
Lopinavir/Ritonavir
Antidépresseurs
Paroxétine HCl
Fluoxétine HCl
Sertraline HCl
ÉVALUATION DES PERFORMANCES NON CLINIQUES
A. Limite de détection
La limite de détection du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0, à utiliser avec le système High Pure
a été déterminée par une analyse de dilutions en série du deuxième standard du HCV (lot
GTR015) et d’un échantillon clinique du génotype 4 du HCV dans du plasma humain HCV négatif
prélevé sur EDTA et dans du sérum humain HCV négatif. Le deuxième standard de HCV (lot
GTR015) a été préparé à l’aide d’un échantillon clinique de HCV de génotype 1a calibré selon la
deuxième norme internationale de l’OMS relative aux tests d’amplification nucléique (NAT) pour
l’ARN du HCV (Code NIBSC 96/798)19 obtenue auprès du NIBSC. La concentration de HCV de
génotype 4 dans les échantillons a été déterminée par le test COBAS® AMPLICOR® HCV
MONITOR, v2.0. Au moins 8 séries de dilution indépendantes ont été analysées pour chaque
matrice, pour chacune des trois combinaisons de lots du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 et
du kit d’acide nucléique viral du système High Pure. Un nombre minimum de 48 répliques par
concentration a été analysé avec chaque combinaison de lots du kit, sur un total d’au moins
148 répliques par concentration dans chaque matrice (plasma prélevé sur EDTA et sérum).
Les résultats de cette étude indiqués dans les tableaux 2 et 3 démontrent que la concentration
d’ARN du HCV de génotype 1 pouvant être détectée par le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0,
avec un taux de positivité de 95 % lors d’une analyse Probit est de 9,3 UI/mL (IC 95 % 6,1, 24,2)
dans du plasma prélevé sur EDTA et de 8,8 UI/mL (IC 95 % 7,5, 11,1) dans du sérum. Les
résultats de chacune des trois combinaisons de lots sont indiqués dans les tableaux 2 et 3.
05998093001-07FR
25
Doc Rev. 11.0
Tableau 2
Limite de détection pour le génotype 1 du HCV du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0, à
utiliser avec le système High Pure dans du plasma prélevé sur EDTA
G10020
Lot du kit COBAS® TaqMan®
Lot du kit High Pure
17310600
34 UI/mL
100 %
23 UI/mL
100 %
17 UI/mL
100 %
11 UI/mL
88,2 %
5,6 UI/mL
92,2 %
2,8 UI/mL
74,0 %
Taux de positivité de 95 %
10,0 UI/mL
par analyse Probit
Intervalle de confiance (IC)
(5,0–2107,0)
de 95 %
G11233
G11225
Les 3 lots combinés
12317800
100 %
100%
100 %
94,0 %
86,3 %
76,5 %
9,0 UI/mL
17390400
100 %
100 %
100 %
94,1 %
88,2 %
71,0 %
8,8 UI/mL
100,0 %
100,0 %
100,0 %
92,1 %
88,9 %
74,8 %
9,3 UI/mL
(6,7–14,6)
(6,6–14,0)
(6,1–24,2)
Tableau 3
utiliser avec le système High Pure dans du sérum
G10020
Lot du kit COBAS® TaqMan®
Lot du kit High Pure
17310600
34 UI/mL
100 %
23 UI/mL
100 %
17 UI/mL
98,0 %
11 UI/mL
94,1 %
5,6 UI/mL
82,4 %
2,8 UI/mL
62,7 %
10,8 UI/mL
par analyse Probit
Intervalle de confiance (IC)
(8,3–16,3)
de 95 %
G11233
G11225
Les 3 lots combinés
12317800
100 %
100 %
100 %
100 %
92,2 %
68,6 %
6,0 UI/mL
17390400
100 %
97,9 %
97,9 %
97,9 %
89,6 %
79,2 %
9,0 UI/mL
100,0 %
99,3 %
98,7 %
97,3 %
88,0 %
70,0 %
8,8 UI/mL
(4,8–9,6)
(6,3–16,0)
(7,5–11,1)
Les résultats du génotype 4 du HCV, indiqués au tableau 4, démontrent que la concentration
d’ARN du HCV de génotype 4 pouvant être détectée par le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0,
avec un taux de positivité de 95 % lors d’une analyse Probit est de 16,1 UI/mL (IC 95 % 12,2;
25,1) dans du plasma prélevé sur EDTA et de 25,4 UI/mL (IC 95 % 21,5; 31,2) dans du sérum.
05998093001-07FR
26
Doc Rev. 11.0
Tableau 4
utiliser avec le système High Pure dans du plasma prélevé sur EDTA et du sérum
Matrice de l’échantillon
Concentration
30 UI/mL
20 UI/mL
15 UI/mL
10 UI/mL
5 UI/mL
2,5 UI/mL
par analyse Probit
Intervalle de confiance (IC) de 95 %
Plasma EDTA
Sérum
Les 3 lots combinés Les 3 lots combinés
100,0 %
96,6 %
95,3 %
90,6 %
96,7 %
88,7 %
86,2 %
79,7 %
60,0 %
47,3 %
41,2 %
29,5 %
16,1 UI/mL
25,4 UI/mL
(12,2–25,1)
(21,5–31,2)
B. Précision
La précision des composantes suivantes : lot à lot, opérateur à opérateur, inter-dosage, intradosage, ainsi que la précision totale ont été évaluées selon les panels HCV dérivés d’un
échantillon clinique de génotype 1 dans du plasma prélevé sur EDTA et de sérum. Les tableaux 5
et 6 indiquent le coefficient de variation (CV) en % de chaque composant de l’analyse de variation
et le CV en % du génotype 1 du HCV.
Tableau 5
Précision du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 dans du plasma prélevé sur EDTA
pour le génotype 1 du HCV
Composante de
variance
4,44E+06
Lot à lot
4,8 %
Appareil à appareil
0,0 %
Opérateur à opérateur 18,4 %
Inter-dosage
18,6 %
Intra-dosage
18,8 %
CV total en %
32,6 %
n
48
Concentration de génotype 1 du HCV (UI/mL)
4,44E+05 4,44E+04 4,44E+03 4,44E+02 4,44E+01
0,0 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
15,4 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
1,3 %
17,7 %
18,7 %
16,8 %
14,8 %
12,7 %
20,7 %
17,1 %
12,7 %
23,0 %
9,8 %
17,6 %
20,0 %
24,4 %
17,2 %
28,0 %
32,5 %
32,3 %
32,2 %
32,3 %
35,8 %
48
48
48
48
48
Tableau 6
Précision du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 dans du sérum pour le génotype 1 du HCV
Composante
de variance
Lot à lot
Appareil à
appareil
Opérateur à
opérateur
Inter-dosage
Intra-dosage
CV total en %
n
1,17E+06
2,7 %
0,0 %
Concentration de génotype 1 du HCV (UI/mL)
1,31E+05 1,31E+04 1,31E+03 1,31E+02 6,56E+01
0,0 %
12,3 %
13,9 %
11,1 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
0,0 %
3,28E+01
10,4 %
0,0 %
12,0 %
12,8 %
0,0 %
0,0 %
6,6 %
0,0 %
9,7 %
16,5 %
15,2 %
25,6 %
72
17,5 %
13,9 %
25,8 %
72
16,2 %
18,9 %
27,7 %
72
16,5 %
12,9 %
25,1 %
72
16,9 %
24,3 %
32,3 %
72
32,9 %
36,5 %
49,1 %
72
31,2 %
46,1 %
57,5 %
72
05998093001-07FR
27
Doc Rev. 11.0
Des études sur la précision du génotype 4 du HCV ont également été menées à l’aide des panels
de HCV provenant d’un échantillon clinique de génotype 4 dans du plasma prélevé sur EDTA et
du sérum, les titres de HCV se situant entre 5,87E+01 UI/mL et 1,17E+04 UI/mL. Le CV total en %
pour le génotype 4 du HCV se situait entre 33,3 et 35,1 %.
C. Domaine linéaire
Deux panels de linéarité composés de 15 segments d’ARN du HCV encapsidé dans du plasma
prélevé sur EDTA ou du sérum ont été analysés à l’aide de trois combinaison de lots du test
COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 et des kits d’acide nucléique viral du système High Pure. Les
15 membres du panel ont couvert une plage de 7,83E+00 UI/mL d’ARN de HCV à 7,83E+08 UI/mL
d’ARN de HCV, en fonction du matériel d’origine dont le titre a été déterminé conformément à la
deuxième norme relative au HCV (lot GTR015). Ils ont été préparés à l’aide d’un échantillon
clinique de HCV de génotype 1a, calibré selon la deuxième norme internationale de l’OMS relative
aux tests d’amplification nucléique (NAT) pour l’ARN du HCV (code NIBSC 96/798)19. Douze
répliques par niveau pour chacune des trois combinaisons de lots ont été analysées sur un total de
36 répliques par niveau.
L’analyse de linéarité a fourni des réponses linéaires allant de 2,35E+01 UI/mL d’ARN de HCV à
3,91E+08 UI/mL d’ARN de HCV, conformément à la directive CLSI EP6-A avec un critère
d’acceptation de ± 0,2 log10. Comme le montrent les figures 8 et 9 utilisant les panels d’ARN du
HCV encapsidé, le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure a
fourni des résultats précis situés dans 0,3 log10 des valeurs nominales, dans le domaine linéaire
allant de 2,5E+01 UI/mL d’ARN du HCV à 3,91E+08 UI/mL d’ARN du HCV dans du plasma
prélevé sur EDTA et dans du sérum.
Charge virale observée (UI/mL)
Figure 8
Domaine linéaire du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0
à utiliser avec le système High Pure dans du plasma prélevé sur EDTA
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
y = 0,9945x - 0,0404
2,0
2
R = 0,9979
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
Charge virale nominale (UI/mL)
Charge virale observée (UI/mL)
Figure 9
Domaine linéaire du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0
à utiliser avec le système High Pure dans du sérum
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
y = 1,0001x - 0,0579
2,0
2
R = 0,9969
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
Charge virale nominale (UI/mL)
05998093001-07FR
28
Doc Rev. 11.0
D.
Inclusivité des génotypes
Quantification, échantillons cliniques
Soixante échantillons cliniques HCV positifs représentant des génotypes (1, 2a, 2, 3, 4, 5 et 6)
dans diverses matrices, y compris dans du plasma prélevé sur EDTA et du sérum ont été
analysés trois fois à l’aide du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High
Pure (HCVHPSV2) et le test COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR, v2.0 (CAHCM).
Des échantillons supplémentaires de génotype du HCV ont été préparés en diluant vingt-quatre
des soixante échantillons ci-dessus dans du plasma HCV négatif prélevé sur EDTA et vingt-deux
des soixante échantillons dans du sérum HCV négatif.
La différence moyenne dans les mesures de la charge virale avec le test HCVHPSV2 et le test
CAHCM pour chaque génotype était de  0,23 log pour tous les échantillons cliniques testés
comme indiqué au tableau 7.
Tableau 7
Différence moyenne dans la mesure de la charge virale
entre les tests HCVHPSV2 et CAHCM pour chaque génotype de HCV
Génotype du HCV
1
2a
2
3
4
5
6
HCVHPSV2 – CAHCM
–0,12
–0,21
–0,04
0,23
–0,07
–0,03
–0,15
n
25
7
14
22
16
9
13
Tous les génotypes
du HCV
–0,03
106
Quantification, panel NIBSC
Le panel de génotypes du HCV procuré auprès de l’organisme NIBSC (code 02/202) a été évalué
à l’aide du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0, à utiliser avec le système High Pure. Comme
indiqué au tableau 8, les 6 échantillons de génotype du HCV du panel NIBSC ont donné des
valeurs se situant dans 0,25 log de la valeur nominale.
Tableau 8
Différence entre la charge virale observée et la charge virale attendue
du panel NIBSC pour les génotypes 1 à 6 du HCV
Génotype
du HCV
1
2
3
4
5
6
05998093001-07FR
Charge virale en UI/mL
Attendu
Observé
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
2,76
3,15
3,01
2,78
3,00
3,15
29
Observé –
Attendu
–0,24
0,15
0,01
–0,22
0,00
0,15
Doc Rev. 11.0
Détection des génotypes de HCV
La détection de tous les génotypes de HCV a été déterminée par l’analyse de dilutions en série du
deuxième standard de HCV (lot 0002, génotype 1a) et des échantillons cliniques de HCV
disponibles représentant les génotypes (2a, 2b, 3, 4, 5 et 6) dans du plasma humain prélevé sur
EDTA et du sérum HCV négatifs. Le test COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR, v2.0 a permis de
déterminer les concentrations des matériels d’origine pour les dilutions en série des génotypes
2a, 2b, 3, 4, 5 et 6 du HCV. Pour chacun des deux lots différents des kits de test COBAS®
TaqMan® HCV, v2.0, au moins 3 séries de dilution indépendantes ont été analysées pour chaque
matrice et génotype. Un nombre minimum de 12 répliques par concentration a été testé à l’aide
de chaque lot de kit de test COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0, pour un nombre total de
24 répliques par concentration.
Les résultats indiqués au tableau 9 montrent que les génotypes 1 à 6 du HCV dans du plasma
prélevé sur EDTA et du sérum ont été détectés à des niveaux aussi bas que 6,3 UI/mL à 19,4 UI/mL.
Tableau 9
Détection des génotypes 1 à 6 du HCV dans du plasma prélevé sur EDTA et du sérum
Génotype
du HCV
1
2a
2b
3
4
5
6
Détection à 95 % par
analyse PROBIT
(UI/mL)
Plasma EDTA
Sérum
16,7
11,3
11,8
19,4
9,6
11,0
6,3
11,1
14,9
13,5
14,3
13,4
7,0
10,7
Niveau le plus bas actuellement
observé avec un taux de
positivité d’au moins 95 %
Plasma EDTA
Sérum
20
20
20
20
20
10
10
10
20
20
10
20
10
10
E. Spécificité clinique
La spécificité clinique du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure
(HCVHPSV2) a été déterminée par l’analyse de 50 échantillons de plasma séronégatif au HCV
prélevé sur EDTA et de 50 échantillons de sérum séronégatif au HCV à l’aide de chacun des
2 différents lots de kit de test COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0. Les 200 résultats de test étaient
négatifs à l’ARN du HCV. Selon ces résultats, la spécificité clinique du test HCVHPSV2 est de 100 %.
F. Spécificité analytique
La spécificité analytique a été évaluée en ajoutant des micro-organismes dans du plasma prélevé
sur EDTA et du sérum HCV négatifs. Douze membres de Flaviviridae non liés à HCV et vingt-deux
micro-organismes supplémentaires ont été testés pour vérifier une réactivité croisée potentielle, à
l’aide du test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure. Aucun des
micro-organismes d’ADN ou d’ARN testés non liés à HCV ne s’est avéré positif pour la recherche
d’ARN du HCV. Le tableau 10 fournit une liste des micro-organismes testés.
05998093001-07FR
30
Doc Rev. 11.0
Tableau 10
Échantillons pour la spécificité analytique
Micro-organismes testés pour la spécificité analytique dans du plasma sur EDTA et du sérum
Virus du Nil Occidental
Virus de l’hépatite G
Génotypes A et B du virus
de l’hépatite B
Virus de l’encéphalite de St Louis
Staphylococcus aureus
et epidermis
Papillomavirus humain 11, 18, 6B
Types 1, 2, 3, 4 du virus de la
dengue
Virus d’Epstein Barr
Varicella Zosta
Virus de la fièvre jaune
Propionibacterium acnes
Candida albicans
Virus Zika
Adénovirus humain de type 3
HTLV I/ II
Virus Banzi
Cytomégalovirus Davis et
Cytomégalovirus Towne
Influenza B
Virus Ilheus
Virus de l’herpès simplex de
type 1, MacIntyre; type 2,G
Mycobacterium avium
Virus de l’encéphalite
de Murray Valley
Virus de l’hépatite A
HIV
05998093001-07FR
31
Doc Rev. 11.0
Comparaisons des performances entre le test COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR,
v2.0 et le test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV
Quarante-sept échantillons cliniques de plasma HCV positif prélevé sur EDTA et quarante-sept
échantillons cliniques de sérum HCV positif ont été analysés à l’aide du test COBAS® TaqMan®
HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure (HCVHPSV2) et du test COBAS® AMPLICOR®
HCV MONITOR, v2.0 (CAHCM). Cinquante échantillons cliniques de plasma HCV positif prélevé
sur EDTA et cinquante échantillons cliniques de sérum HCV positif ont été analysés à l’aide du
test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure (HCVHPSV2) et du test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV (CAPCTM). Les résultats du titre d’ARN du HCV
obtenus à l’aide des tests HCVHPSV2, CAHCM et CAPCTM pour tous les échantillons, groupés
par génotype, sont indiqués à la figure 10 pour la comparaison entre les tests CAHCM et
HCVHPSV2, et à la figure 11 pour la comparaison entre les tests CAPCTM et HCVHPSV2.
G.
Charge virale obtenue avec le test HCVHPSV2
(UI/mL de HCV)
Figure 10
Corrélation entre le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure
(HCVHPSV2) et le test COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR, v2.0 (CAHCM)
8,0
y = 0,9911 x - 0,0515
2
R = 0,9666
7,0
6,0
Gt 1, n=32
5,0
Gt 2, n=18
Gt 3, n=11
4,0
Gt 4, n=7
Gt 5, n=6
3,0
Gt 6, n=10
Gt unk, n=10
2,0
1,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
Charge virale obtenue avec le test CAHCM (UI/mL de HCV)
Charge virale obtenue avec le test HCVHPSV2
(UI/mL de HCV)
Figure 11
Corrélation entre le test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 à utiliser avec le système High Pure
(HCVHPSV2) et le test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV (CAPCTM)
05998093001-07FR
8,0
y = 0,9881 x - 0,0254
2
R = 0,9565
7,0
6,0
Gt 1, n=32
5,0
Gt 2, n=20
Gt 3, n=11
4,0
Gt 4, n=11
Gt 5, n=6
3,0
Gt 6, n=10
Gt unk, n=10
2,0
1,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
Charge virale obtenue avec le test CAPCTM (UI/mL de HCV)
32
Doc Rev. 11.0
RÉFÉRENCES
1.
Orito, E., Mizokami, M., Suzuki, K. et al. 1995. Loss of serum HCV RNA at week 4 of
interferon-a therapy is associated with more favorable long-term response in patients with
chronic Hepatitis C. Journal of Medical Virology 46:109-115.
2.
Choo, Q.-L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W. and Houghton, M. 1989.
Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis viral
genome. Science 244:359-362.
3.
Alter, H. 1991. Descartes before the horse: I clone, therefore I am: The Hepatitis C virus in
current perspective. Annals of Internal Medicine 115:644-649.
4.
Lauer, G.M. and Walker, B.D. 2001. Hepatitis C Virus Infection. New England Journal of
Medicine 345:41-52.
5.
World Health Organization, Weekly Epidemiological Record, 1999. 74:421-428.
6.
Kessler, H.H., Santner, B.I., Umlauft, F. et al. 1996. Quantitation and genotyping of Hepatitis C
virus RNA in sera of hemodialysis and AIDS patients. Clinical Diagnostic Virology 5:73-78.
7.
Orito, E., Mizokami, M., Nakano, T. et al. 1994. Serum hepatitis C virus RNA level as a
predictor of subsequent response to interferon-a therapy in Japanese patients with chronic
Hepatitis C. Journal of Medical Virology 44:410-414.
8.
Reichard, O., Yun, Z.B., Sonnerborg, A. et al. 1993. Hepatitis C viral titers in serum prior to,
during, and after oral treatment with ribavirin for chronic Hepatitis C. Journal of Medical
Virology 41:99-102.
9.
Puoti, M., Zonaro, A., Ravagil, A. et al. 1992. Hepatitis C virus RNA and antibody response
in the clinical course of acute Hepatitis C virus infection. Hepatology 16:877-881.
10.
Young, K., Resnick, R., and Myers, T. 1993. Detection of Hepatitis C virus RNA by a
combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Journal of Clinical
Microbiology 31:882-886.
11.
Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A. et al. 1993. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. Journal of General Virology 74:1093-1102.
12.
Machida, A., Ohnuma, H., Tsuda, F. et al. 1992. Two distinct subtypes of hepatitis C virus
defined by antibodies directed to the putative core protein. Hepatology 16:886-891.
13.
Bukh, J., Purcell, R. H., and Miller, R.H. 1992. Sequence analysis of the 5' noncoding region of
hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA 89:4942-4946.
14.
Meng Q, Wong C, Rangachari A, Tamatsukuri S, Sasaki M, Fiss E, Cheng L, Ramankutty T,
Clarke D, Yawata H, Sakakura Y, Hirose T, Impraim C. 2001. Automated multiplex assay
system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA, hepatitis C virus RNA, and
human immunodeficiency virus type 1 RNA. J Clin Microbiol 8:2937-45.
15.
Smith, E.S., Li, A.K., Wang, A.M., Gelfand, D.H., Myers, T.M. 2003. Amplification of RNA:
High-Temperature
Reverse
Transcription
and
DNA
Amplification
with
a
Magnesium-Activated Thermostable DNA Polymerase. In PCR Primer: A Laboratory
Manual, 2nd Edition, Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S., Eds. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 211-219.
16.
Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to
control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
17.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification
and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.
18.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR.
Genome Research 6:986-994.
19.
Saldanha, J., Heath, A., Aberham, C., Albrech, J., Gentili, G., Gessner, M. and Pisani, G.
2005. World Health Organization collaborative study to establish a replacement WHO
international standard for hepatitis C virus RNA nucleic acid amplification technology
assays. Vox Sanguinis 88:202-204.
20.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
21.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From
Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document
M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
22.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
05998093001-07FR
33
Doc Rev. 11.0
Informations sur la révision du document
Doc Rev. 9.0
08/2014
Doc Rev. 10.0
04/2015
Doc Rev. 11.0
07/2015
05998093001-07FR
Les phrases R et S connues ont été ajoutées sous les symboles de
danger.
Mise à jour de la page de description des symboles harmonisés à
la fin de la notice.
Mise à jour de la section « Marques commerciales et brevets »
pour les références des ressources en ligne uniquement.
Veuillez contacter votre représentant local Roche si vous avez des
questions.
Suppression des symboles, messages et codes d'avertissement
de la section RÉACTIFS.
Ajout du symbole GTIN et de la description à la page des symboles
harmonisée.
questions.
Mise à jour des versions, des manuels, de la terminologie et du
système d'exploitation d'AMPLILINK.
questions.
34
Doc Rev. 11.0
Kit d’acide nucléique viral du système High Pure fabriqué pour :
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Test COBAS® TaqMan® HCV, v2.0 fabriqué en Suisse :
"
Distributed by
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877-273-3433)
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Marques commerciales et brevets
Voir http://www.roche-diagnostics.us/patents
©2015 Roche Molecular Systems, Inc.
07/2015
Doc Rev. 11.0
05998093001-07FR
05998093001-07
35
Doc Rev. 11.0
Les symboles suivants sont utilisés dans toute la documentation accompagnant les
produits de diagnostic par PCR de Roche.
Logiciel auxiliaire
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Mandataire dans la
Communauté européenne
Limite inférieure de la plage assignée
Fiche technique à codes-barres
Fabricant
Code du lot
Conserver dans un endroit sombre
Risques biologiques
Suffisant pour <n> tests
Référence du catalogue
Limites de température
SW
Consulter les instructions d'utilisation
Fichier de définition de tests
TDF
Contenu du kit
Limite supérieure de la plage assignée
Distribué par
Utiliser jusque
Pour évaluation de performance
IVD uniquement
Code article international
Ce produit répond aux exigences de la Directive Européenne 98/79/CE
concernant les dispositifs médicaux de diagnostic in vitro.
Assistance technique pour les clients aux États-Unis 1-800-526-1247
05998093001-07FR
36
Doc Rev. 11.0

COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0

Transcription

Documents pareils

Prix des analyses fréquemment demandées

adopter un

Test cobas® HCV

Signal HCV ver 2.0

Lire la communication - ANGH Association Hépato

Hépatite C - American Liver Foundation

RÉSUMÉ Environ 4 000 000 de personnes auraient une hépatite C

Dépistage et prévention chez les 767.4 Ko