Valorisation de remèdes traditionnels utilisés dans le traitement de

Transcription

Université de la Nouvelle-Calédonie
Ecole Doctoral : Milieux Insulaires Ultra-Marins
THÈSE
Présentée par
Shilpa KUMAR-ROINÉ
Pour obtenir le titre de
Docteur en Sciences de l‟Université de la Nouvelle-Calédonie
Discipline : Sciences du Vivant
Spécialité : Pharmacologie Cellulaire et Pharmacognosie
VALORISATION DE REMÈDES TRADITIONNELS
UTILISÉS DANS LE TRAITEMENT DE LA
CIGUATERA DANS LE PACIFIQUE
Soutenue publiquement le 09 novembre 2009, à Nouméa, devant le jury composé de :
Ali AL-MOURABIT
DR1, CNRS (France)
Rapporteur
Christian MORETTI
DR2, IRD (Polynésie Française)
Rapporteur
Dominique LAURENT
CR1 IRD (France)
Directeur
Serge PAUILLAC
CR1 Institut Pasteur (France)
Co-Directeur
Hamid AMIR
Professeur, Université de la Nouvelle-Calédonie
Examinateur
Jordi MOLGÓ
DR1, CNRS (France)
Examinateur
Mireille CHINAIN
Chercheur ILM (Polynésie Française)
Examinateur
DOI:10.6098/2009NCAL0024
Ecole Doctoral : Milieux Insulaires Ultra-Marins
THÈSE
Présentée par
Shilpa KUMAR-ROINÉ
Pour obtenir le titre de
Docteur en Sciences de l‟Université de la Nouvelle-Calédonie
Discipline : Sciences du Vivant
Spécialité : Pharmacologie Cellulaire et Pharmacognosie
VALORISATION DE REMÈDES TRADITIONNELS
UTILISÉS DANS LE TRAITEMENT DE LA
CIGUATERA DANS LE PACIFIQUE
Soutenue publiquement le 09 novembre 2009, à Nouméa, devant le jury composé de :
Ali AL-MOURABIT
DR1, CNRS (France)
Rapporteur
Christian MORETTI
DR2, IRD (Polynésie Française)
Rapporteur
Dominique LAURENT
CR1 IRD (France)
Directeur
Serge PAUILLAC
CR1 Institut Pasteur (France)
Co-Directeur
Hamid AMIR
Professeur, Université de la Nouvelle-Calédonie
Examinateur
Jordi MOLGÓ
DR1, CNRS (France)
Examinateur
Mireille CHINAIN
Chercheur ILM (Polynésie Française)
Examinateur
2
REMERCIEMENTS
Mes plus profonds remerciements à mes directeurs de thèse, M. Dominique LAURENT et
M. Serge PAUILLAC, pour m’avoir offert l’opportunité de cette thèse. Merci pour votre
confiance et vos conseils tout au long du projet ainsi que pour votre soutien, tant par vos
idées neuves et vos suggestions de nouvelles approches pour ce projet, que par vos efforts
pour répondre à mes nombreuses demandes d’ordre logistique nécessaires à la réalisation du
projet. Merci aussi pour votre travail de relecture, d’édition et de traduction de ma thèse.
Mes chaleureux remerciements vont aussi aux membres du jury, M. Hamid AMIR, M. Jordi
MOLGÓ et Mme. Mireille CHINAIN pour l’intérêt qu’ils y ont porté. Je souhaiterais
remercier particulièrement M. Christian MORETTI et M. Ali ALMOURABIT pour l’honneur
qu’ils m’ont fait d’avoir été rapporteurs et pour leurs suggestions utiles à cette thèse.
Je voudrais également remercier M. Sylvain PETEK, qui en sa qualité de chef de
laboratoire (UMR152) à Nouméa, a facilité beaucoup de mes démarches administratives.
Merci à Mme. CHINAIN, responsable du Laboratoire des Micro-Algues à l’Institut Louis
Malardé (ILM) pour m’avoir fourni les toxines et pour m’avoir permis d’effectuer un stage
sur les propriétés détoxifiantes des plantes. Je voudrais également exprimer ma gratitude à
Mme. Françoise NEPVEU, directrice de l’unité de recherche (UMR 152), qui a soutenu ma
candidature pour la bourse et facilité mon déplacement en stage de 3 mois à Toulouse.
Je voudrais saisir ici l’opportunité pour remercier M. Fabrice COLIN et Mme. Suzanne
CHANTEAU, respectivement directeur du Centre de Nouméa de l’Institut de Recherche pour
le Développement (IRD) et de l’Institut Pasteur de la Nouvelle-Calédonie (IPNC) pour avoir
rendu possible ma présence dans leurs locaux. Je souhaiterais remercier particulièrement M.
Fabrice COLIN et M. Paul MARTIN, précédent directeur de l’IPNC, pour avoir appuyé ma
demande pour une bourse d’étude.
Je suis particulièrement reconnaissante à Mariko MATSUI, une camarade étudiante,
Taiana DARIUS de l’ILM et Nicolas FABRE de l’UMR 152 à Toulouse pour leur étroite
collaboration sur, respectivement, la biologie moléculaire, la neuropharmacologie et sur
l’analyse structurelle chimique. Les résultats obtenus ont permis l’achèvement de cette thèse.
3
Merci aux techniciens du laboratoire, Alain Videault et Antoine Holué de l’IRD, pour leur
assistance dans la récolte et l’extraction des plantes, ainsi que pour tant d’autres tâches.
Milles mercis à Cyril POULLAIN du CRNS qui m’a fait découvrir et laisser utiliser le
Companion, ce qui a facilité mon travail de chromatographie, et à Karine REYBIER pour
m’avoir pris sous son aile durant mon séjour à Toulouse et pour m’avoir appris, avec
patience, la technique et l’utilisation de la Résonance Paramagnétique Electronique.
Ces remerciements ne seraient pas complets sans une pensée pour notre regretté
collègue M. Martin Pierre Sauviat.
Accomplir cette thèse n’aurait pas été possible sans le soutien financier accordé par
l’IRD via une bourse de soutien de thèse de doctorat et par l’Ambassade de France à Fidji
via une bourse d’étude.
Ces 4 dernières années ont été un voyage, parfois frustrant mais ô combien
enrichissant. Lorsque j’ai suivi mon époux en 2003 pour m’installer en Nouvelle-Calédonie,
l’éloignement de ma famille et de mes amis avaient laissé un grand vide. Réaliser cette thèse
m’a certes apporté beaucoup sur le plan intellectuel mais a aussi comblé ce vide. J’ai appris
tant de nouvelles choses, rencontré et travaillé avec tant de personnes formidables. Oui, ces 4
dernières années furent une véritable expérience humaine. J’aimerais surtout citer AnneSophie KERBRAT, ma collègue, camarade de thèse et amie. Merci d’avoir été là dans les
bons et les mauvais moments. Merci enfin à tous, membres et étudiants de l’IRD et de l’UNC
pour avoir pris le temps de partager une blague ou deux et ainsi me changer les idées.
Je n’oublie pas tous mes amis qui m’ont accompagné et soutenu tout au long de cette
thèse. Merci à vous.
Enfin, mes plus chaleureux remerciements vont à tous les membres de ma famille. A
mes parents qui ont depuis le début soutenu mes études et mes décisions même si parfois elles
leur étaient difficiles. A mes beaux-parents pour leurs constants mots d’encouragement. Et à
mon époux bien-aimé, Damien ROINE, à qui je dois tant. Pour la merveilleuse personne qu’il
est, pour sa patience, son soutien et son amour, je lui dédis cette thèse.
4
Table des matières
LISTE DES ABRÉVIATIONS ET TABLE DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES ABRÉVIATIONS
8
FIGURES
9
TABLEAUX
11
INTRODUCTION GÉNÉRALE
I.
INTRODUCTION SUR LA CIGUATERA
12
Article 1 : Ciguatera fish poisoning and other seafood intoxication syndromes. A revisit
and a review of the existing treatment employed in ciguatera fish poisoning
13
II.
HISTORIQUE : les études de criblage antérieures
51
II.1
II.2
II.3
II.4
51
52
53
54
III.
Test souris
Tests d‟électrophysiologie et de neurophysiologie
Tests sur érythrocytes de grenouilles et humain
Test sur neuroblastomes
OBJECTIFS DE L’ÉTUDE
55
PARTIE 1 : MODULATION DE LA SYNTHÈSE D’OXYDE NITRIQUE (NO•) PAR
LA P-CTX-1B
ÉTUDE DU POTENTIEL INDUCTEUR D’OXYDE NITRIQUE (NO•) DE LA P-CTX-1B
58
I.
CADRE D’ÉTUDE
58
II.
INTRODUCTION SUR L’OXYDE NITRIQUE (NO•) ET L’OXYDE NITRIQUE
SYNTHÉTASE INDUCTIBLE (iNOS)
60
II.1
II.2
BIOLOGIE DU NO•
LA QUANTIFICATION DU NO• ET DE L‟iNOS
II.2.1
II.2.2
III.
Méthodes d‟évaluation de la production du NO•
Méthodes d‟évaluation de l‟expression de l‟iNOS
66
RÉACTION DE GRIESS – TEST BIOCHIMIQUE
RÉACTION DE POLYMÉRISATION EN CHAÎNE
QUANTITATIVE – TEST BIOMOLÉCULAIRE
67
67
MATÉRIEL, MÉTHODES ET RÉSULTATS
Publication 1 : Modulation of inducible nitric oxide synthase gene expression
RAW 264.7 murine macrophages by Pacific ciguatoxins
V.
63
65
LA SÉLECTION ET LE PRINCIPE DES TESTS
III.1
III.2
IV.
61
63
DISCUSSION ET CONCLUSION
69
in
70
78
5
PARTIE 2 : LES ÉTUDES DE CRIBLAGE THÉRAPEUTIQUE
ÉTUDE DE CRIBLAGE THÉRAPEUTIQUE DES PLANTES UTILISÉES POUR TRAITER
LA CIGUATERA
I.
CADRE D’ÉTUDE
80
CHAPITRE 1: ÉVALUATION IN VITRO DU POTENTIEL INHIBITEUR DU NO• DES
PHYTOTHÉRAPIES UTILISÉES CONTRE LA CIGUATERA
81
I.
INTRODUCTION
81
II.
82
Publication 2 : Ability of certain plant extracts traditionally used to treat ciguatera
fish poisoning to inhibit nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages
III.
86
DISCUSSION
95
III.1
III.2
95
96
LES TESTS BIOCHIMIQUES
LES TESTS COMPLÉMENTAIRES
CHAPITRE 2: ÉTUDE IN VITRO DE L’INHIBITION DE LA LIAISON DE LA BRÉVÉTOXINE
TRITIÉE A SON SITE DE HAUTE AFFINITÉ PAR LES PHYTOTHÉRAPIES
UTILISÉES CONTRE LA CIGUATERA
99
I.
INTRODUCTION
II.
PRINCIPE DES ÉTUDES D’INTERACTION LIGAND-RÉCEPTEUR
100
III.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
102
III.1
III.2
III.3
MATÉRIEL
PRÉPARATION DES EXTRAITS DE PLANTES
TEST D‟INTERACTION LIGAND-RÉCEPTEUR
102
102
104
III.3.1
III.3.2
III.3.3
104
105
III.3.4
III.3.5
III.3.6
IV.
II.
80
99
Préparation des synaptosomes
Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford
Évaluation de la qualité des synaptosomes pour le test
d‟interaction ligand-récepteur
Calibration du test d‟interaction ligand-récepteur
Application du test d‟interaction ligand-récepteur aux
extraits de plantes
Analyse de données
RÉSULTATS ET DISCUSSION
CONCLUSION DE LA PARTIE 2
105
106
107
107
107
111
6
PARTIE 3 : LES ÉTUDES DE FRACTIONNEMENT BIOGUIDÉ
FRACTIONNEMENT BIOGUIDÉ AVEC LES TESTS DE GRIESS ET D’INTERACTION LIGANDRÉCEPTEUR DE TROIS PHYTOTHÉRAPIES UTILISÉES DANS LE TRAITEMENT
DE LA CIGUATERA
113
I.
INTRODUCTION
113
Article 2 : Traditional Remedies Employed in the Treatment of Ciguatera Fish Poisoning:
Examples of Use of Three Plants in the Pacific
II.
132
II.1
MATÉRIEL
132
II.2
PARTIE EXPÉRIENCE CHIMIQUE
132
II.2.1
II.2.2
II.2.3
132
133
133
II.3
II.4
III.
115
Extraction
Fractionnement et isolement
Analyse structurale
PARTIE TESTS BIOLOGIQUES
133
II.3.1
II.3.2
II.3.3
134
135
135
Bioguidage avec les tests colorimétriques
Bioguidage avec le test d‟interaction ligand-récepteur
Analyses des données et statistiques
FRACTIONNEMENT BIOGUIDÉ ET ISOLEMENT
136
II.4.1
II.4.2
II.4.3
136
139
143
Euphorbia hirta
Heliotropium foertherianum
Vitex trifolia
DISCUSSION ET CONCLUSION
146
DISCUSSION GÉNÉRALE, CONCLUSION ET PERSPECTIVES
I.
DISCUSSION GÉNÉRALE
149
II.
CONCLUSION
151
III.
PERSPECTIVES
152
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
RÉFÉRENCES
159
7
ANNEXES
ANNEXE 1 : DIFFUSION DE L’INFORMATION SCIENTIFIQUE
165
ANNEXE 2 : RÉSULTATS DE CRIBLAGE (TESTS BIOCHIMIQUES)
172
ANNEXE 3 : PHOTO DES PLANTES SÉLÉCTIONNÉES
180
ANNEXE 4 : RÉSULTATS DE FRACTIONNEMENT BIOGUIDÉ (TESTS BIOCHIMIQUES)
181
ANNEXE 5 : SPECTRES DE RMN ET DE MASSE
190
8
Liste des abréviations
et table des
illustrations
8
Liste des abréviations et table des illustrations
Liste des abréviations
ARNm :
acide ribonucléique messager
BSA :
albumine sérique bovine
Ca2+ :
CCM :
CCE :
CSDP :
CTXs :
ion calcium
chromatographie sur couche épaisse
canaux sodiques dépendants du potentiel
ciguatoxines
DCM :
DMSO :
DPPH :
dichlorométhane
diméthylsulfoxyde
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
ELISA :
EtOAc :
enzyme-linked immunosorbent assay
acétate d‟éthyle
chromatographie sur couche mince
[3H]PbTx-3 : brévétoxine-3 tritriée
IL :
interleukine (IL-1 beta, -6, -10)
L-NAME :
LPS:
Nω-nitro-L-arginine methyl ester
lipopolysaccharide
MeOH :
MTT:
méthanol
3-[4,5-dimethylthiaol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
Na+ :
NED :
NO• :
NOS :
ion sodium
N-naphtyl-éthylènediamine
radical oxyde nitrique
oxyde nitrique synthétase dont l‟iNOS est la forme inductible
P-CTX-1B :
PbTxs :
ciguatoxine -1B du Pacifique
brévétoxines
qPCR :
réaction de polymérisation en chaîne quantitative
RPE :
résonance paramagnétique électronique
TG :
TILR :
TNF-α :
test de Griess
test d‟interaction ligand-récepteur
facteur de nécrose tumorale alpha
Liste des abbreviations et table des illustrations
9
Figures
Figure 1 : Biosynthèse de l‟oxyde nitrique (NO•) par la NOS
61
Figure 2 : Distribution des traitements dans des microplaques à 96 puits pour l‟évaluation in
vitro de l‟inhibition du NO• avec les extraits aqueux de plantes utilisées pour
soigner la ciguatera
84
Figure 3 : Courbes de compétition de la fixation de [3H]-PbTx-3 par différents inhibiteurs,
ciguatoxines et brévétoxines sur les synaptosomes de cerveaux de rats
100
Figure 4 : Structure chimique du gambierol et du brevenal
101
Figure 5 : Procédure de purification des synaptosomes
104
Figure 6 : Courbe de compétition de la P-CTX-3C sur les synaptosomes de cerveaux de rats
106
Figure 7 : Courbes de compétition des extraits aqueux de plantes sur les synaptosomes de
cerveaux de rats
107
Figure 8 : Courbe de compétition d‟un mélange d‟extrait d‟H. foertherianum (feuilles) avec
l‟extrait de G. polynesiensis
108
Schéma 1 : Protocole de fractionnement bioguidé mené sur les extraits aqueux d‟E. hirta (Eh),
d‟H. foertherianum (Hf) et de V. trifolia (Vt)
132
Figure 9 : Structure chimique de la quercitrine (1), de l‟acide rosmarinique (2) et de
l‟agnuside (3)
133
vitro de l‟inhibition du NO• avec les fractions et les molécules pures d‟E. hirta,
d‟H. foertherianum et de V. trifolia
134
vitro de l‟inhibition du NO• avec les sous-fractions d‟E. hirta, d‟H. foertherianum
et de V. trifolia
135
Figure 12 : Effets de la quercitrine (1) sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants
cellulaires et sur la viabilité cellulaire de macrophages RAW 264.7
138
Figure 13 : Courbes de compétition de l‟extrait, des fractions et des sous-fractions
d‟Heliotropium foertherianum (feuilles) sur les synaptosomes de cerveaux de rats
141
Figure 14 : Effets de l‟acide rosmarinique (2) sur l‟accumulation de nitrite dans les
surnageants cellulaires et sur la viabilité cellulaire de macrophages RAW 264.7
142
10
Figure 15 : Courbe de compétition de l‟acide rosmarinique (2) sur les synaptosomes de
cerveaux de rats
143
Figure 16 : Effets de l‟agnuside (3) sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants
cellulaires et sur la viabilité cellulaire de macrophages RAW 264.7
145
11
Tableaux
Tableau 1 : Les espèces de plantes testées, leurs appellations communes en NouvelleCalédonie, les lieux de collecte, les parties de plantes récoltées
83-84
Tableau 2 : Les effets des extraits aqueux de Cerbera manghas, d‟Euphorbia hirta,
d‟Heliotropium foertherianum et de Vitex trifolia sur l‟accumulation de nitrite
comparés à l‟inhibition ou l‟induction de l‟expression de l‟iNOS et de cytokines
(ANRm et/ou protéine)
97
Tableau 3 : Activités inhibitrices des extraits aqueux de plantes utilisées dans le traitement de
la ciguatera vis-à-vis de la fixation de la [3H]-PbTx-3 au site 5 de canaux sodique
dépendants du potentiel de synaptosomes de cerveaux de rats
103
Tableau 4 : Fractionnement bioguidé de l‟extrait aqueux de la plante entière d‟Euphorbia
hirta (Eh) avec le test d‟inhibition du NO• (en comparaison de la cytotoxicité et
de l‟induction du NO•) dans des macrophages RAW 264.7
137
Tableau 5 : Fractionnement bioguidé de l‟extrait aqueux de feuilles d‟Heliotropium
foertherianum (Hf) avec le test d‟inhibition du NO• (en comparaison de la
cytotoxicité et de l‟induction du NO•) et le test d‟inhibition de la liaison de la
[3H]-PbTx-3
140-141
Tableau 6 : Fractionnement bioguidé de l‟extrait aqueux de feuilles de Vitex trifolia (Vt) avec
le test d‟inhibition du NO• (en comparaison de la cytotoxicité et de l‟induction du
NO•) dans des macrophages RAW 264.7
144
12
Introduction générale
12
I.
Introduction sur la ciguatera
Les intoxications alimentaires font depuis toujours partie du quotidien de l‟homme. Parmi
elles, la ciguatera est une forme imprévisible d‟ichtyosarcotoxisme, qui est due à l‟ingestion
de poissons tropicaux et dont les manifestations cliniques se caractérisent généralement par
des troubles sensoriels. Cette maladie est occasionnée par des dinoflagellés benthiques du
genre Gambierdiscus, présents essentiellement dans les zones tropicales et subtropicales
(Chinain et al., 1999 ; 2009a ; Lehane et Lewis, 2000 ; Yasumoto et al., 1977).
Ces algues microscopiques synthétisent au moins deux familles de toxines polyétherées :
les ciguatoxines (CTXs) et les maitotoxines (MTXs) (Bagnis et al., 1980 ; Yasumoto et al.,
1977). Ces neurotoxines sont transmises aux poissons puis à l‟homme par le biais de la chaîne
alimentaire. Cette intoxication est un problème non négligeable de santé publique dans
l‟Océan Pacifique (Laurent et al., 2005).
Hormis la ciguatera, il existe d‟autres intoxications liées aux produits de la mer, les
intoxications paralysante (IPFM), diarrhéique (IDFM), neurotoxique (INFM) et amnésique
(IAFM) dues aux fruits de mer, qui sont assez répandues (van Dolah, 2000 ; Zaccaroni et
Scaravelli, 2008). Récemment, ont été relevés et caractérisés plusieurs syndromes
d‟intoxication inédits provoqués par des dinoflagellés toxiques émergents tels que les
intoxications liées aux azaspiracides et aux palytoxines (Wang, 2008).
Soumis pour publication dans South Pacific Journal of Natural Science, l‟article suivant
présente une vue d‟ensemble du phénomène de la ciguatera (Article 1). Ainsi, les domaines de
l‟étiologie, de la toxicologie, de l‟écotoxicologie, de la pharmacologie, de la pathologie et les
traitements de l‟intoxication, y seront successivement abordés. Parallèlement, ces aspects
seront étendus aux autres intoxications déjà citées (IPFM, IDFM, INFM, et IAFM) et à celles
liées aux tétrodotoxine, azaspiracides et palytoxines.
Article 1
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Pauillac, S., Laurent, D. Ciguatera fish poisoning and other
seafood intoxication syndromes. A revisit and a review of the existing treatment employed in
ciguatera
fish
poisoning.
South
Pacific
Journal
of
Natural
Science,
soumis.
13
Ciguatera fish poisoning and other seafood intoxication
syndromes
A revisit and a review of the existing treatments employed in
ciguatera fish poisoning
Shilpa Kumar-Roinéa,b,c, Mariko Matsuia,b,c, Serge Pauillac,c Dominique Laurenta,*
a
Université de Toulouse ; UPS ; UMR 152 (Laboratoire de Pharmacochimie des Substances Naturelles et
Pharmacophores Redox), 118, rte de Narbonne, F-31062 Toulouse cedex 9, France
b
Institut de Recherche pour le Développement ; UMR-152 ; F-98 848 Noumea, New Caledonia
c
Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie, Laboratoire des Biotoxines, BP61, F-98845 Noumea, New
Caledonia
* Corresponding author: Dr. Dominique LAURENT
Université de Toulouse, Laboratoire de Pharmacochimie des Substances Naturelles et Pharmacophores Redox
(UMR 152), 118, rte de Narbonne, F-31062 Toulouse cedex 9, France. Phone: +33 5 62 25 98 11; Fax: +33 5
62 25 98 02 Email address: [email protected]
ABSTRACT
Ciguatera fish poisoning (CFP) is acquired through consumption of tropical reef fishes,
contaminated with potent neurotoxins, ciguatoxins (CTXs), produced by benthic
dinoflagellate of the Gambierdiscus genus. Both spatially and temporally unpredictable, a
tainted fish is impossible to differentiate from an untainted one by appearance, taste, texture
or odour. Given the predominance of reef fish in the diet of insular countries, the risk of CFP
is ever-present. In the Pacific where the incidence of CFP is the highest, the consequences on
public health and socio-economy can be extremely severe. Multidisciplinary in nature, the
present review revisits the phenomenon of CFP, covering certain of its aspects, notably the
etiology, toxicology, ecotoxicology, pharmacology, pathology and the treatments
administrated. These aspects of CFP have been reviewed in relation to other poisoning
syndromes: tetrodotoxin poisoning and other dinoflagellates- or diatoms-associated
intoxications such as paralytic (PSP), diarrhetic (DSP), neurotoxic (NSP), amnesic (ASP) and
azaspiracid shellfish poisoning (AZP) and palytoxin poisoning.
Based on case reports and bibliographic accounts, a list inventorying the western medicines
prescribed to patients suffering with CFP has been established. Within the last two decades,
several of the herbal remedies have been evaluated for their efficiencies in in vivo and in a
number of in vitro tests, which have also been reviewed herein.
Keywords: Seafood poisoning, marine toxins, ciguatera fish poisoning (CFP), paralytic
shellfish poisoning (PSP), diarrhetic shellfish poisoning (DSP), neurotoxic shellfish poisoning
(NSP), amnesic shellfish poisoning (ASP), azaspiracid shellfish poisoning (AZP), tetrodotoxin
(Fugu) poisoning, palytoxin poisoning, occidental medicine, traditional remedies
1
INTRODUCTION
Mankind has always suffered from foodrelated poisoning. The accounts of one such
intoxication, the ciguatera fish poisoning
(CFP), also known as ciguatera, dates back to
the beginning of the XVI century. Recorded
Article 1: Introduction générale
in his writing, Pedro Martyr D‟Anghera, a
rapporteur working for the Spanish crown on
board the ships of great explorers (Colombus,
Cortez, Magellan and Vasco de Gama)
attributed the cases of poisoning to
14
intoxication by poisonous fish (Bagnis 1981;
Lewis 1986; Martyr d‟Anghera 1555).
This fish-borne toxinological syndrome is
prevalent in the tropical and subtropical areas,
and is acquired by the consumption of marine
fishes which have accumulated naturally
occurring toxins through their diet. The origin
of ciguatera is known to be benthic
dinoflagellates
belonging
to
the
Gambierdiscus genus (Order Peridinales,
Family Heteraulacaceae); the first species to
be described being Gambierdiscus toxicus
Adachi
&
Fukuyo
(1979).
These
dinoflagellates are primarily found in subtropical and tropical areas. (Boydron-Le
Garrec et al. 2005a; de Fouw et al. 2001;
Friedman et al. 2008; Gillespie et al. 1986;
Juranovic and Park, 1991; Laurent 1993;
Laurent et al. 2005; Lehane and Lewis 2000;
Lewis 2001; 2006).
Although, consistently under-appreciated
and under-reported (Begier et al. 2006;
McKee et al. 2001), available evidence
indicates that ciguatera is responsible for
more than 50 000 cases of intoxication
worldwide (Fleming et al., 2006; Van Dolah,
2000a), and thus it represents the single
largest cause of unpreventable fish poisoning
(Isbister and Kiernan 2005; Nicholson and
Lewis 2006).
1.1
SEAFOOD INTOXICATION
Food is essential both for growth and for
the maintenance of life. However, food can
also be responsible for ill-health. Seafoodborne diseases are an emerging subset of
food-borne illness, which have been on the
increase since last few decades (Clemence
and Guerrant 2004; Fleming et al. 1998;
Fleming and Easom 1998). The recent epoch
of international seafood trade expansion,
development of the tourism industry,
increasing anthropogenic stress on the marine
environment, and the growing trend of
utilization of a greater variety of marine
organisms has been marked with increasing
marine seafood-related disease incidences, a
geographic spread of certain seafood
illnesses and the emergence of new marine
toxin diseases observed in human population.
(Bagnis et al. 1970; Fleming et al. 2001;
2006; Hallegraef 1993; 2003; 2006; Knap et
al. 2002; van Dolah 2000a).
An excellent source of high quality
proteins, with low fat and high mineral
content, the consumption of seafood has seen
a steady rise over the recent decades to
become an integral element of human diet
globally (Pigott and Tucker 1990; Soccol and
Oetterer 2003). Over 2.9 billion people
worldwide rely on fish and fishery products
for at least 15% of animal protein (FAO
2009). To meet the growing global demand
for seafood, the world seafood industry has
expanded over last four decades to play a
preeminent role in the economic and social
well-being of several nations (Bell et al.
2009; Pauly 2009). In the island countries,
particularly in the Pacific, seafood is a staple
nutritive and sometimes the only economic
resource (Dalzell 1992; 1994; Dalzell and
Adams 1997). Since the 1970s, the marine
catches in tropical waters of Pacific and the
Indian Oceans have shown a long-term
gradual increase (FAO 2009). Unfortunately,
most cases of seafood poisoning caused by
eating fish have been reported to originate
from waters around tropical islands (Isblister
and Kiernan 2005).
Seafood intoxications are generally
categorized as fish- or shellfish-associated,
based on their primary transvectors, and are
caused due to the presence of biological
(bacterial spoilage related to improper
handling or by contamination with viral or
parasites) or chemical (contamination via
chemical toxins through anthropogenic
activities or via biotoxins issued from microorganisms like diatoms, cyanobacteria and
dinoflagellates) hazards (Fleming et al. 2001;
2006; Huss et al. 2000; Knap et al. 2002).
Though a natural phenomenon, harmful algal
blooms (HABs) seem to have become more
frequent, more intense and more widespread.
Some of the contributing factors attributed to
such observations include a greater scientific
awareness and better surveillance systems. In
addition, local, regional or global favorable
conditions of growth and transportation of
algal cyst via ship ballast water transport or
15
shellfish transplantation are also believed to
contribute to the expansion of seafood
intoxication (Hallegraef 2003; 2006; van
Dolah 2000a).
Marine biotoxins are among the most
potent naturally occurring toxins known to
date (Wang 2008). They are responsible for
extensive fish and shellfish die-offs and have
been implicated in the episodic mortalities of
marine mammals, birds and other animals at
the top of marine food web (Burkholder et al.
1992; Geraci et al. 1989; Jessup et al. 2009;
Landsberg et al. 2009; de la Riva et al. 2009;
Scholin et al. 2000). Worldwide, these toxinproducing marine microorganisms cause
more than 60 000 poisoning events annually
with an associated mortality rate of 1.5%
(van Dolah 2000a). Of these, human diseases
associated with exposure to dinoflagellate
biotoxins occupy the principal position
(Camacho et al. 2007; Knap et al. 2002).
1.2
DINOFLAGELLATEASSOCIATED TOXICOSES
The
dinoflagellates
are
important
components of phytoplankton that provide
vital nutrition support to filter-feeding
bivalve shellfish and to the larvae of
crustaceans and finfish, many of which are
commercially important (Camacho et al.
2007; Hallegraef 2003). Of the 3400-5000
species of extant marine phytoplanktons,
about 300 can proliferate in high numbers
(Barber and Diaz 2003; Hallegraef 2003). A
certain 80-90 of these species are known to
have the capacity of producing phycotoxins
(Camacho et al. 2007; Hallegraef 2003; van
Dolah 2000a). Of these, 70 are
dinoflagellates which make them the largest
group of harmful species that impact humans
(Camacho et al. 2007). Though mass
proliferations of pelagic dinoflagellates are
known to take part in HABs, several benthic
species are also known to produce highly
potent poisons.
The possible presence of natural toxins in
fish and shellfish has been known since
antiquity. However, it has been only in the
past few decades, in view of current world
food priorities, that extensive studies have
been devoted to the toxicology and
pharmacology of marine seafood poisonings.
As a result, four major seafood poisoning
syndromes (Barbier and Diaz, 2003; van
Dolah 2000b; Zaccaroni and Scaravelli,
2008) have been identified from the
dinoflagellate toxins: paralytic shellfish
poisoning
(PSP),
diarrhetic
shellfish
poisoning (DSP), neurotoxic shellfish
poisoning (NSP) and ciguatera fish poisoning
(CFP).
Besides these, there are emerging reports
of several new poisoning syndromes (Wang
2008) resulting from newly appearing
dinoflagellate toxins such as azaspiracid
shellfish poisoning (AZP) and palytoxin
(Table
1-3).
Other
well-described
intoxications include amnesic shellfish
poisoning (ASP) and tetrodotoxin poisoning
from toxins issued from diatoms and from
unknown sources, respectively (Table 1-3).
These various toxic syndromes have
contributed to an increase in global public
concerns on the importance of marine
biotoxicants, especially those associated with
dinoflagellates and have been subject of
many excellent reviews (Bricelj and
Shumway 1998; de Fouw et al. 2001;
Friedman et al. 2008; Katikou 2008; McNabb
2008; Mons et al. 1998; Munday 2008;
Pulido 2008; Ryan et al. 2008; Tubaro et al.
2008; Twiner et al. 2008; Vale 2008; van
Apeldoorn et al. 1999; van Apeldoorn et al.
2001; Watkins et al. 2008).
1.3
FISH -BORNE POISONINGS
Thousands of marine organisms have been
listed as poisonous or venomous, some of
which cause discomfort, illness or even death
in man (Halstead 1959; 2001a; 2001b).
However, in terms of incidence, given its
popularity (Whittle and Gallacher 2000), the
most recurrent forms of marine poisoning
arise from consumption of fish, and
particularly so in tropical and subtropical
insular regions (Barceloux et al. 2008;
Barnett and DiPalma 2004; Huss et al. 2004;
Isblister and Kiernan 2005; Lehane and
Lewis 2000; Pearn 2001). The intoxication,
resulting after one has been in contact or
16
Table 1 Human intoxication syndromes caused by marine biotoxins, toxins implicated, causative agents, vectors and geographical distribution (Backer et al. 2003;
Baden et al. 1995; Chateau-Degat 2003; Hallegraef 2003; Knap et al. 2002; Tosteson et al. 1995)
Disease
Causative Organism(s)
Toxin(s) Implicated
Vectors (Known and Potential)
Geographical
Distribution
Paralytic
shellfish
poisoning (PSP)
Red
tide
dinoflagellate
species:
Alexandrium, Gymnodinium catenatum,
Pyrodinium bahamense, Gonyaulax
Saxitoxins (STXs), gonyautoxins
(GTXs),
N-sulfocarbamoyl analogs
Clams,
mussels,
oysters,
gastropods,
cockles,
fish,
scallops,
whelks,
lobsters,
copepods, crabs
Temperate to tropical
worldwide
1927
Red tide dinoflagellate species:
Dinophysis, Prorocentrum,
Coolia, Protoperidinium oceanicum,
Phalacroma rotundatum
Okadaic
acid
dinophysistoxins
pectenotoxins (PTXs)
Mussels,
scallops,
gastropods
Temperate worldwide
1961
1987
Diarrhetic shellfish
poisoning (DSP)
Amnesic
shellfish
poisoning (ASP)
Neurotoxic shellfish
poisoning (NSP)
Protoceratium
reticulatum,
Lingulodinium polyedrum, Gonyaulax
spinifera
Red tide diatom species:
Pseudo-nitzschia
Red tide dinoflagellates species:
Karenia, Chatonella, Karenia brevis
(formerly Gymnodinium breve and
Ptychodiscus
brevis),
Fibrocapsa
japonica, Heterosigma akashiwo,
Domoic acid
Mussels, anchovies crabs,
Canada,
Ireland
Brevetoxins (PbTxs)
Oysters,
clams,
cockles, whelks, fish
Gulf of Mexico, North
Carolina, Japan, NZ
1844
Ciguatoxins (CTXs), scaritoxin,
maitotoxins (MTXs)?, palytoxin?,
gambierol
>400 coral reef fish, snail,
shrimps, crabs
Subtropical to tropical
worldwide,
Mediterranean Sea
1500s
Japan, China, Mexico
2800 BC
Europe
1995
Europe,
Phillipines,
Brazil,
Japan,
Caribbean,
Indian
Ocean
1987
Epibenthic dinoflagellates species:
Gambierdiscus
Tetrodotoxin (Fugu)
poisoning
Bacteria species:
Vibrio
pelagius,
Alteromonas
tetraodonis, Shewanella alga?
Tetrodotoxin (TTX)
Azaspiracid shellfish
poisoning (AZP)
Red tide-associated dinoflagellates
Protoperidinium crassipes
Azaspiracids (AZAs)
Palytoxin poisoning
Epibenthic dinoflagellates
Ostreopsis sp.
a
Not confirmed
Also isolated from marine soft coral of the genus Palythoa
clams,
yessotoxins (YTXs)
Ciguatera
fish
poisoning (CFP)
?
(OA),
(DTXs),
First Recorded
Incidence
a
Palytoxin (PLX) and ostreocins
mussels,
>40 Pufferfish, porcupine fish,
sun fish, toadfish, trumpet shell,
horseshoe crab, xanthid crabs,
starfish, octopus, marine worms
Mussels,
oysters,
scallops,
clams, crabs
Crabs, sea urchins, mackerel,
triggerfish, sardines, fish
NW,
USA,
17
Table 2 Human intoxication syndromes caused by marine biotoxins, mode of action and chemistry (Backer et al. 2003; Katikou 2008; Knap et al. 2002; Twiner et
al. 2008; van Dolah 2000; Wang 2008)
Toxin
Saxitoxins (STXs)
Congeners
Disease
21
Paralytic shellfish poisoning (PSP)
Gonyautoxins (GTXs)
N-sulfocarbamoyl derivatives
Okadaic acid (OA)
Dinophysistoxins (DTXs)
≥8
Diarrhetic shellfish poisoning (DSP)
Principle Action Target
Chemical Backbone
Nature
Site 1 Na+ channel blocker
Tetrahydropurine
Hydrophilic
Tetrahydropurine
Hydrophilic
Tetrahydropurine
Hydrophilic
Phosphatase inhibitor
Polyether
Hydrophilic
Phosphatase inhibitor
Polyether
Hydrophilic
ND
Polyether
Lipophilic
ND
Polyether
Lipophilic
Pectenotoxins (PTXs)
14
Yessotoxins (YTX)
36
Domoic acid (DA
17
Amnesic shellfish poisoning (ASP)
Glutamate receptor agonist
Tricarboxylic amino acid
Hydrophilic
Brevetoxins (PbTxs)
9
Neurotoxic shellfish poisoning (NSP)
Site 5 Na+ channel activator
Polyether
Lipophilic
+
Site 5 Na channel activator
Ca2+ channel activator
Na+-K+ ATPase inhibitor
Polyether
Polyether
Polyether
Lipophilic
Hydrophilic
Lipophilic and hydrophilic
K+ channel blocker
Polyether
Lipophilic
Densely functionalized cyclohexane
ring with a cyclic guanidine moiety
Polyether
Polyether
Ciguatoxins (CTXs), scaritoxin
Maitotoxins (MTXs)
Palytoxin
>20
3
8?
Gambierol
1
Tetrodotoxin (TTX)
>10
Tetrodotoxin (Fugu) poisoning
Azaspiracids (AZAs)
Palytoxin
>20
8
Azaspiracid shellfish poisoning (AZP)
Palytoxin poisoning
ND
Na+-K+ ATPase inhibitor
?
ND
Assumed but not confirmed
Not determined
Ciguatera fish poisoning (CFP)
Hydrophilic
Lipophilic
Lipophilic and hydrophilic
18
Table 3 Human intoxication syndromes caused by marine biotoxins, symptoms, prevention and treatment (Backer et al. 2003; Baden et al. 1995; Hallegraef 2003;
Huss et al. 2004; Knap et al. 2002; Isbister and Kiernan 2005)
Disease
Prevention
Paralytic
shellfish
poisoning (PSP)
Diarrhetic
shellfish
poisoning
(DSP)
Amnesic
shellfish
poisoning
(ASP)
Neurotoxic
shellfish
poisoning
(NSP)
Ciguatera
poisoning
(CFP)
fish
Tetrodotoxin
(Fugu)
poisoning
Azaspiracid
shellfish
poisoning
(AZP)
Palytoxin
poisoning
No antitoxin, avoid potentially toxic
shellfish especially just after HABs,
detection of toxin and closure of shellfish
beds
beds
Onset
Duration
Acute Symptom
Chronic Symptom
Treatment
0.5-2 h
Days
Primarily neurologic: descending paresthesia,
muscular non-coordination, muscular paralysis,
respiratory failure and death
None observed
Supportive
0.5- 3 h
Days
Entirely gastrointestinal: diarrhea*, nausea,
vomiting, abdominal pain
None observed
Supportive
shellfish, detection of toxin and closure of
shellfish beds
<24 h
Years
Gastrointestinal
coma and death
Amnesia
Supportive
beds
0.5-3 h
Days
Neuromuscular and mild gastrointestinal:
muscular pain, paresthesia, reversal of
temperature sensation*and hypotension*
None observed
Supportive
Years
Gastrointestinal,
neurological
and
cardiovascular: nausea, diarrhea, reversal of
temperature
sensation*,
tachycardia,
bradycardia
Paresthesia
Symptomatic
and
supportive: i.v. rehydration,
antiemetics, antidiarrhoeal,
atropine, anti-depressants,
i.v. D-mannitol
None observed
Supportive: gastric lavage
with sodium bicarbonate,
activated
charcoal,
endotracheal intubation
Difficult, no commercially available
detection methods, no antitoxin available,
either avoid large predacious coral reef
fish or eating the viscera of fish
5-24 h
and neurologic:
amnesia*,
Avoid inherently toxic fish species or have
the fish specially prepared
5-30 min
Days
Acute descending paresthesia* and minor
gastroenteritis that can lead to, muscular
paralysis, cardiac dysfunction, respiratory
paralysis* and death
shellfish, detection of toxin and closure of
shellfish beds
3-18 h
Days
Severe gastroenteritis
None observed
NR
No antitoxin, may be distinguished by an
unusual taste imparted to the fish
NR
NR
Gastrointestinal, neurological, and autonomic:
respiratory distress and death
NR
NR
NR Not reported
* Generally accepted as pathognomonic signs of the intoxication syndrome
19
ingested a poisonous vertebrate fish, is
categorized under ichthyotoxism.
Derived from Greek, the prefix ichthyo
signifies pertaining to fishes, while toxism
denotes poisoning. This denomination
includes various piscine toxicities (Bagnis et
al. 1970; Halstead 2001a; Zaccaroni and
Scaravelli 2008), which are classed
according to the distribution of ichthyotoxins
in the biological compartments of the fish
(Table 4).
Ichtyosarcotoxism, by far the most
common form in terms of incidence,
encompasses different types of intoxications
which have been further delineated either on
the basis of the species of causative fish or of
the clinical picture produced (Table 5). The
clinical manifestations of ichthyosarcotoxism
are routinely characterized by sensory
disturbances. Though lacking precise
definition, due to the diversity in the fish
species and in the nature of toxins
implicated, there appears to be broad
differentiation
between
characteristic
illnesses which appear following ingestion of
diverse species of toxic fish and illnesses
which occur following ingestion of particular
species (SPC 1968).
Thus categorized according to the
taxonomy, the ichthyosarcotoxism groups
include elasmobranch poisoning from
ingestion of sharks, skates and rays, clupeoid
poisoning from ingestion of sardines and
herrings, scombroid poisoning from ingestion
of tuna, mackerel, bonito, skipjack and mahimahi (Table 5), and tetrodotoxin poisoning
from ingestion of puffers and puffer-like fish
(Table 1-3). Ichthyosarcotoxism resulting
from ingestion of diverse species of toxic fish
includes the hallucinatory poisoning (Table
5) and CFP (Table 1-3), and are primarily
diagnosed based on clinical manifestations
(Bagnis et al. 1970; Halstead 2001a; SPC
1968; Zaccaroni and Scaravelli 2008).
2
CIGUATERA
POISONING
FISH
An
unpreventable
form
of
ichthyosarcotoxism, CFP is caused after
consumption of tropical marine fish species
that seem without risk but are tainted with
one or more naturally occurring neurotoxins
from the family of ciguatoxins (CTXs). The
disease, commonly afflicting the regions of
Pacific and Indian Ocean and the Caribbean
Sea, is both spatially and temporally
unpredictable and impossible to detect by
appearance, taste, texture or odor of fish
caught (Friedman et al. 2008; Laurent et al.
2005; Lehane and Lewis, 2000; Lewis 2001;
Lewis 2006; Lewis et al. 2000). More than
400 species of near-shore tropical fishes,
ranging over a broad phylogenetic spectrum,
have been incriminated as potential vectors
of this intoxication (Halstead 1978). Despite
the fact that this marine toxin illness is very
often under-diagnosed and under-reported, it
is nonetheless, the most common nonbacterial intoxication, estimated to between
50 000 to 100 000 cases per year (Begier et
al. 2006; Fleming et al. 2006; McKee et al.
2001)
2.1
TOXINS SOURCE
The term ciguatera was coined in 1866 by
a Cuban doctor Felipe Poey, after the
vernacular name of a marine gastropod,
Turbo (syn. Livona) pica, responsible for
intoxications in Cuba (Poey 1866). Despite
the long history, it was only three decades
ago, that the scientists gained insight into the
etiology of CFP. An exceedingly thorough
examination of the feeding behavior of
ciguatoxic fish in the Pacific by Randall
(1958) led to the theory of food chain
whereby the toxin was presumed to be
produced by an unspecified benthic
microorganism, which is first ingested by
herbivorous fishes and then transferred to
larger carnivores. Supposing the causative
agent might be an alga, a fungus, a protozoan
or a bacterium, Randall (1958), on the basis
of circumstantial evidence, favored an
unidentified benthic cyanobacterium as the
likely precursors of the toxins.
A good part of this theory proved to be
remarkably accurate, although nearly 20
years passed before its validity was proven
by the identification of the source organisms.
20
Table 4 Classification of fish-borne intoxications according to the type and the origin of the
toxic compounds (adapted from Bagnis et al. 1970)
Class
Ichthyohemotoxism
Ichthyohepatotoxism
Ichthyootoxism
Ichthyoalleinotoxism
“hallucinogenic fish poisoning”
Ichthyoacanotoxism
Ichthyocrinotoxism
Ichthyosarcotoxism
Biological Compartment
Injection, absorption or ingestion of
fresh fish blood
Fish liver that probably contains
excessive amounts of vitamin A
Eggs and gonads of mainly
freshwater and a few marine fish
species
Upon ingestion of head or flesh of
certain of reef fishes in the tropical
Pacific and Indian oceans
From injuries sustained from
stings, spines or teeth of venomous
fish poisons that are secreted from
venom apparatus
Venoms are produced by means of
glandular structure, often in the
skin, independent of a true venom
apparatus
Upon ingestion of flesh and other
parts of the fish
Fish Species Implicated
Anguillidae, Congridae,
Muraenidae and Ophichthidae
Scombridae, Serranidae, Sparidae
and Trichodontidae
Barbus, Schizothorax, Tinca and
Stichaeus
ND
ND
Myxinidae, Grammistes, Rypticus
and Ostraciidae
Numerous coral reef-dwelling
fishes
ND Not determined
The
breakthrough occurred
when
Yasumoto et al. (1977a; 1977b) found
considerable toxicity in a sample of algae and
detritus collected from the surface of dead
coral in the Gambier Islands of French
Polynesia during an epidemic of ciguatera in
1976 that correlated with the stomach
contents of fishes. The microalga in question
was a benthic dinoflagellate. Tentatively
identified as Diplopsalis sp. (Yasumoto et al.
1977), it was later placed under a new genus
and named G. toxicus (Adachi and Fuyuko
1979).
Since this first milestone, five other
species in this genera, G. belizeanus (Faust
1995), sp. nov. (Holmes 1998) and G.
australes, G. pacificus, G. polynesiensis
(Chinain et al. 1999; 2009) have been
described. Though, the four former species
have been reported to be toxic in culture
(Chinain et al. 1999; Holmes 1998), their
implication in CFP remains to be
demonstrated. On the other hand, the toxicity
of G. belizeanus is yet to be determined. In
addition, in many ciguatera-endemic regions,
the co-occurrence of other toxic benthic
dinoflagellates belonging to the genera
Ostreopsis, Coolia and Prorocentrum with
the Gambierdiscus spp. has lead to the
presumption of their role as source of toxins
in the ciguatera food-chain (Backer et al.
2003).
The origin of the toxins that cause CFP in
the Caribbean Sea (Lewis et al. 1998; Poli et
al. 1997; Pottier et al. 2002; Vernoux and
Lewis 1997) and Indian Ocean (Hamilton et
al. 2002a; 2002b) has yet to be determined
(Lewis 2001; 2006). Recently, benthic
cyanobacteria have also been suspected in
this phenomenon (Endean et al. 1993;
Laurent et al. 2008; Kerbrat et al. 2009; Hahn
and Capra 1992). In New Caledonia, some
recently reported cases of ciguatoxicosis
have resulted after a meal of giant clams,
which has led the authors to suggest the
name, ciguatera shellfish poisoning (Laurent,
personal communication).
21
Table 5 Classification and general characteristics of different types of ichtyosarcotoxism
apart from ciguatera fish and tetrodotoxin poisonings (adapted from Zaccaroni and Scaravelli
2008; Bagnis et al. 1970)
Name
Species
Clupeotoxism
Herrings, anchovies,
sardines, tarpons,
bonefishes, deep-sea
bonefishes
Hallucinatory Fish Poisoning
Sea chubs, mullets,
goatfish, surmullets
Carchatoxisms
Various sharks species
Scombroidotoxism
Scombridae, tuna,
bonitos, mackerel
Cyclostome Poisoning
Lampreys, hagfish
Gempylotoxic Fish
Gempylidae (castor oil
fish)
Elasmobranch Poisoning
Sharks, skates, rays
Chimaera Poisoning
Ratfishes
?
NR
NK
Clinical Characteristics
Short incubation time digestive
syndrome, pruritus,
tachycardia, vertigos, cyanosis.
Coma and death are not so rare
Short incubation time
Gastrointestinal and
psychological disturbances,
hallucination, vertigos,
behavior alterations, motor
incoordination
Both nervous and digestive
signs
Short incubation time
Rapid evolution, nervous and
digestive signs, regression
within 8-12 h
Nausea, vomiting, dysenteric
diarrhea, tenesmus, abdominal
pain and weakness
Diarrhea
Gastrointestinal, neurological
and cardiovascular symptoms
NR
Toxin
Palitoxin?
Mixed toxins?
Various,
unknown toxins
Mixed toxins
Carchatoxins
Histamine and
biogenic amines
NK
Oil comprised
mainly of oleic
acid
NK
NK
Assumed but not confirmed
Not reported
Not known
2.2
TOXINS IMPLICATED
Ciguatoxins (CTXs) are the neurotoxins
that are predominantly responsible for CFP.
Other toxins isolated from G. toxicus,
Ostreopsis
spp.,
Coolia
spp.
and
Prorocentrum spp., namely the maitotoxins
(MTXs), okadaic acid (OA) and palytoxin
(PTX), have also been implicated in CFP
(Anderson and Lobel 1987; Holmes and
Lewis 1994; Lewis 2001; 2006). Though, the
implication of these different toxins in CFP
could in the least explain the complex
medical symptoms they produce in human
consumers, it still needs to be formally
demonstrated.
The CTXs form a family of chemical
compounds, closely related in structures with
a molecular weight of 941-1141 Da (Lewis
2006). These potent toxins consist of highly
oxygenated long chain alkyl compounds, in
which most of the oxygen atoms occur as
cyclic ether linkage that form 13-14 rings,
which are fused into a mostly rigid, ladderlike structure. (Fig. 1). Heat-resistant, fatsoluble, CTXs are polyheterocyclic toxins
possessing structural framework reminiscent
to that of the brevetoxins (PbTxs) (Fig. 1).
The PbTxs belong to another family of potent
lipid-soluble polyether toxins that are
produced by the red-tide forming marine
dinoflagellate Karenia brevis (formerly
Ptychodiscus brevis then Gymnodinium
22
breve) which is implicated in NSP
intoxications (Table 1-3) (Baden 1989;
Dechraoui et al. 1999; Watkins et al. 2008).
Originally isolated in 1967 in a partially
pure form from specimens of Javanese giant
moray eels Gymnothorax javanicus (Scheuer
et al. 1967), the structural formula of the first
CTX was first elucidated in 1989 on the basis
of 350 µg of poison obtained from 4 tons of
G. javanicus (Legrand et al. 1989; Murata et
al. 1989; Yasumoto 2005). At present, three
classes of CTXs are recognized and the
prefixes P-, C- and I- signifying “Pacific
ocean”, “Caribbean sea” and “Indian ocean”
are denominated to distinguish the CTXs
based on their geographic origin (Lewis et al.
1991; Hamilton et al. 2002a; 2002b; Murata
et al. 1989; 1990; Satake et al. 1993; 1997;
1998; Vernoux and Lewis 1997). This being,
for certain CTXs of the Pacific that were
isolated prior to C-CTXs and I-CTXs, this
prefixion is not used.
Me
P-CTX-1B : R1 = CH2OHCHOH
H
O
A
H
HO Me
H H
O
H
H
O
H
H
O
O
OH
H
H
H
O
H
H
H
H
H
O
M
H
O
O
O
O
H
H
HO
Me
O
E
O
R1
H
H
Me
Me
H
OH
Me
HO Me
P-CTX-3C
H
O
A
H
H H
O
H
H
O
H
O
O
OH
H
O
H
H
H
H
H
H
H
PbTx-3
H O
O
H
O
A
Me
H
H
H
Me
H
H
H
O
O
E
H
M
Me
Me
O
H
O
H
H
H
HO
O
O
O
O
Me
O
E
O
OH
H
H
H
H
O
Me
O H
Me
O
O
Me
H
K
H
Me
O
O
H
Me
OH
Fig. 1. Chemical structure of some polyether marine neurotoxins
(P-CTXs : Pacific ciguatoxins; PbTxs : brevetoxins).
As a consequence, the first CTX to be
purified and structurally elucidated was
called CTX-1 but is now also known as
CTX-1B or P-CTX-1. To date, more than 23
structures of CTX congeners have been
resolved (Dickey 2008; Yasumoto et al.
23
2000; 2005). All origins confounded,
geographical and biological, in 2002, the
analogues of CTXs tallied to 39; more
precisely, 23 P-CTXs, 12 C-CTXs and 4 ICTXs (Boydron-Le Garrec et al. 2005a).
This includes those isolated from fish, both
herbivores and carnivores, and from
dinoflagellates, in wild and cultured. The
CTXs
isolated
from
extracts
of
dinoflagellates are generally grouped under
the name “gambiertoxins” (GTXs).
2.2
ECOTOXICOLOGY
OF
CIGUATOXINS
Ciguatera fish poisoning is a complex
ecotoxicological phenomenon that constitutes
a serious threat to the development of
industry
of
seafood
fisheries
and
international tourism of sub-tropical and
tropical island communities (Bagnis 1992;
Glaziou and Legrand 1994; Laurent et al.
2005; Lewis 1979; Lewis 1992; Lewis and
Ruff 1993; Olsen 1988; Epstein and Rapportt
1996). As Randall (1958) foresaw, the
odyssey of the incriminated toxins from the
G. toxicus cells to the human consumer
involves the food link.
This benthic dinoflagellate will frequently
grow as an epiphyte on macroalgae
colonizing the dead corals or other surfaces.
Consequently, it is not part of the plankton
community and hence takes no part in the
appearance of red-tides. Where toxicity is an
exception in planktonic dinoflagellates, in the
benthic species like Gambierdiscus it is
rather a norm (Anderson and Lobel 1987).
The prevalence of potent toxins among these
dinoflagellates is believed to provide a
competitive advantage over co-occurring
microalgal species.
The CTXs and/or their precursors are
introduced into the marine food web via the
herbivorous fishes grazing on coral or
macroalgae harboring the dinoflagellates G.
toxicus, which in turn once preyed on is
transferred to carnivorous fishes and so on
until they reach the human consumers who
are the final link of the food chain (Bagnis et
al. 1980; Banner 1974; Helfrich and Banner
1963; Juranovic and Park 1991; Lewis 2001;
Lewis and Holmes 1993; Lewis et al. 1994).
As the toxins are passed up the trophic chain,
they tend to concentrate or bio-accumulate
(Gillespie et al. 1986; Johnson and Jong
1983). As the result of this process, the
predators at the end of the food web harbor
the highest concentrations of toxins. Large
carnivorous fishes like, barracuda, snapper,
grouper, jacks and moray eel are particularly
notorious for causing severe CFP, arising
from their capacity to have accumulated high
toxins loads through their diet (Kuberski
1979; Pearn 2001; van Dolah 2000a).
Concurrently it is believed that GTXs and
the less polar CTXs occurring in G. toxicus
are precursors of more polar CTXs found in
fishes after having undergone a series of
oxidation in the liver of vector fishes (Lewis
and Holmes 1993). Indeed, several CTX
congeners been isolated from wild and
cultured G. toxicus (Legrand et al. 1992,
Holmes et al. 1991; Satake et al. 1993; 1997;
1998). However, none of these were
consistent with P-CTX-1B, the toxin
predominantly found in carnivorous fish (red
snapper, shark and moray eels) in the region
of Pacific (Babinchak et al. 1994; Holmes
and Lewis 1994; Lewis 2006). Furthermore,
P-CTX-1B has neither been isolated from
herbivorous fish (Lehane and Lewis 2000;
Lewis 2001; 2006). Instead, these toxin
congeners are less polar forms of P-CTX-1B.
The scaritoxin, later identified as P-CTX-4A,
was first isolated in 1976 from herbivorous
Scarus gibbus, a heavy beak parrotfish
(Chungue et al. 1976; Bagnis 1981).
Subsequent studies confirmed the occurrence
of P-CTX-4A in both cultured and wild G.
toxicus and in S. gibbus that provide the
inevitable support to the theory of the food
chain link (Legrand et al. 1992; Satake et al.
1997).
The resembling chemical structures of
these toxins put in relation to the organisms
from which they were issued indicates that
the toxins found in fish flesh are more
oxygenated and thus are more polar than the
congeners isolated from G. toxicus (Legrand
et al. 1992). It is believed that the fish
metabolites, P-CTX-1B, -2, and -3 (Lewis et
24
al. 1991) are derived from oxidation of the
parent gambiertoxins CTX-4A and CTX-4B
produced by Gambierdiscus spp. from the
Pacific region (Lewis and Holmes 1993;
Murata et al. 1989; 1990; Yasumoto and
Murata 1993). This oxidative conversion
reminds us of the role of the cytochrome
(P450), a family of 60 enzymes involved in
the first step of the detoxification process in
the liver. The lipophilic toxins, like aflatoxin
are detoxified by these enzymes through
oxidative
biochemical
reactions
to
hydrophilic metabolites, which are then
eliminated into urine. Thus the oxidation of
P-CTX-4B to P-CTX-1 could be regarded as
a kind of detoxification process. But what
actually happens is the opposite of
detoxification, as the toxicity of CTXs
increases with the oxidation. The toxicity of
P-CTX-1 is in fact nine-fold superior than
that of CTX-4B (Yasumoto 1993). This
process of toxification is known as biotransformation.
2.3
CLINICAL MANIFESTATIONS
The clinical presentation of CFP (Table 6)
has been addressed in substantial detail by
various authors around the world (Arena et
al. 2004; Bagnis et al. 1979; Cheng and
Chung 2004; de Haro et al. 1997; 2003;
Dickey 2008; Geller et al. 1991; Gillespie et
al. 1986; Friedman et al. 2008; Farstad and
Chow 2001; Goodman et al. 2003; Kipping
et al. 2006; Laurent et al. 2005, Lehane and
Lewis 2000; Katz et al. 1993; Ng and
Gregory 2000; Nicholson and Lewis, 2006;
Ruff and Lewis 1994). Globally more than
175 acute and chronic gastrointestinal,
neurological and/or generalized disturbances,
and to a lesser extent, cardiovascular
symptoms have been described (Wang 2008).
The symptoms of ciguatera vary in different
oceans, attributable to regional (P-, C- and I-)
suite of toxins. In the Pacific Ocean
neurological symptoms predominate, while
in the Caribbean Sea the gastrointestinal
symptoms are dominant features. The toxins
from Indian Ocean give rise to symptoms
that are typical of CFP in the Pacific, in
addition to neuropsychiatric alterations
(Friedman et al. 2008; Lehane and Lewis
2000; Lewis 2001; 2006). However, the
nature, duration, and the severity of
symptoms can also vary after a meal of fish
captured within a restricted location. This is
likely to stem from individual susceptibility,
and from the quantity and type of CTXs
consumed, influenced by the type
(herbivorous, carnivorous) and part (head,
liver, viscera, or flesh) of fish consumed (de
Fouw et al. 2001; Glaziou and Martin 1993;
Lewis 2001; Lewis et al. 2000).
Nevertheless, in its typical form, CFP
announces with an acute but prodromal
gastroenteritis, after which the chronic
neurological symptoms comprising of
neurocutaneous and musculoskeletal features
progressively set in. The cardiovascular
disorders generally also occur in the
prodromal period but are more sustained than
gastrointestinal symptoms. While the acute
illness generally abates within a few days to
a week, the neurological symptoms involving
the peripheral sensory and motor systems can
persevere for months and even years (Table
6) (Butera et al. 2000; Friedman et al. 2008;
Gillespie et al. 1986; Isbister and Kiernan
2005; Lange et al. 1992; Morris et al. 1982a;
1982b; Ting and Brown, 2001; Farstad and
Chow, 2001).The enduring neurological
feature of CFP, that sets it apart from other
seafood
intoxications,
is
commonly
associated with signs of polyneuropathy
(Chateau-Degat et al. 2007; Deroiche et al.
2000; Isbister and Kiernan 2005; Schnorf et
al. 2002; Sozzi et al. 1988). The persistent
neurological pain and dysfunction lasting
months to years associated with chronic CFP
has been reported to yield a symptom
presentation similar to chronic fatigue
syndrome (Pearn 1996; 1997; 2001; Racciatti
et al. 2001). The reversal of temperature
discrimination or cold allodynia, also known
as paradoxical dysesthesia, is considered as
the telltale sign of CFP. However, it is not
always present (Bagnis et al. 1979; Isbister
and Kiernan 2005; Johnson and Jong 1983;
Lewis et al. 1993; Perkins and Morgan,
2004) and is also documented in severe cases
25
Table 6 Symptoms and signs of ciguatera fish poisoning (adapted from Farstad and Chow
2001)
Gastrointestinal (common/early onset from 2 to 12 hours /lasts 1 to 2 days)
Nausea
Vomiting
Diarrhea
Abdominal pain
Hypersalivation
Painful defecation
Cardiovascular (uncommon/early onset/persists up to 1 week)
Hypotension
Bradycardia
Tachycardia
Chest pains
T-wave abnormalities
Pulmonary edema
General/Other (Variable occurrence and onset)
Chills
Perspiration
Fever
Loss of hair and nails
Conjunctivitis
Acne
Skin rash
Malaise
Shortness of breath
Oliguria
Lacrimation
Neck stiffness
Neurologic (common/late onset from 12-72 hours*/prolonged symptoms)
Mental status
Delirium
Coma
Memory/concentration problems
Depression
Giddiness
Multitasking difficulties
Hallucinations
Motor
Ataxia
Respiratory arrest
Ophthalmoplegia
Seizures
Paresis
Diminished reflexes
Weakness
Tonic contractions
26
Coma
Sensory
Paresthesia (lingual, extremities and circumoral)
Dysesthesia (arms, legs and perioral region)
Paradoxical dysesthesias
Asthenia
Headache
Myalgia
Dental pain
Photophobia
Blindness
Vertigo
Arthralgias
Metallic taste
Blurred vision
Pruritus
Dyspareunia
Painful ejaculation
Dysuria
Mydriasis
Strabismus
Desquamation
Polymyositis
*Neurological symptoms can occur early in the disease course, but they classically follow
gastrointestinal and cardiovascular symptoms.
of NSP (Cuypers et al. 2007; Friedman et al.
2008; Knap et al. 2002) (Table 3).
Frequently observed in persons who have
ingested larger predatory fish, the cardiac
signs are indicative of severity of the disease
and can be life-threatening (Chan and Wang
1993; Kodama and Hokama 1989; Lehane
and Lewis 2000). In such cases, default of
proper diagnostic and medical care, death can
occur due to dehydration, cardiovascular
shock, cardiac arrhythmias or respiratory
failure (Bagnis et al. 1979; Bavastrelli et al.
2000; Lehane and Lewis 2000; Wasay et al.
2008). Most fatal cases were reported when
the head, gonads, roe or other internal organs
were consumed (Lehane and Lewis 2000).
Due to its lipid solubility, CTXs tend to
concentrate in these body parts. The fatality
due to CFP is estimated to under 0.1% (Swift
and Swift 1993). Nevertheless, the length of
altered neurosensory (paresthesia in the
extremities, myalgia, arthralgia and pruritus)
and neuropsychiatric (malaise, depression,
generalized
fatigue
and
headaches)
symptoms, which may persist for months or
years (Arena et al. 2004; Barton et al. 1995;
Chan and Kwok 2001; Chateau-Degat et al.
2007; Gillespie et al. 1986; Kodama and
Hokama 1989) make CFP an intensely
distressing, and in certain cases, a long term
debilitating malady. This may also be
alleviated if the treatment is administrated
early enough (Arena et al. 2004; Lange 1994;
Pearn 1995). As no human biomarker exists
to confirm CFP, the diagnosis is entirely
based on the clinical scenario and the
patient‟s recent fish-eating history (Blythe et
al. 1994; Pearn 2001; Ting and Brown, 2001)
which has often led to treatment delay or
omission.
According to certain anecdotal reports,
some
individuals
may
occasionally
experience recurrence of the main
neurological disturbances during periods of
27
overwork, fatigue, stress or with sexual
activities (Bagnis 1993; Lange et al. 1992).
Such recurrence have also been reported
upon consumption of non-ciguateric fish
such as cold-water species and non-fish
product such as chicken, pork, canned beef,
eggs, nuts, caffeine and alcohol (Bagnis
1993; Fleming et al. 1997; Gillespie 1987;
Gillespie et al. 1986; Gollop and Pon 1992;
Lange et al. 1992; Lewis 2000; 2001). The
basis of this recurrent attack is unknown but
is generally presumed to be an immunologic
reaction. The phenomenon of sensitization
has also been observed whereby recurrence
of symptoms typical of CFP is brought on by
the consumption of potentially ciguateric fish
that did not produce symptoms in other
individuals (Gillespie et al. 1986; Narayan
1980; Ruff and Lewis 1994). There is
evidence that second and subsequent attacks
tend to be more severe than first attacks
(Bagnis et al. 1979; Glaziou and Martin
1993). The basis of the sensitization is
believed to be the storage of CTXs in the
adipose tissue of victims. Any activity
involving increased lipid metabolism may
result in CTX re-entering the blood stream
(Barton et al. 1995). Similarly, such storage
could also lead to an accumulation of the
toxins in the host to subclinical levels
explaining the severity of subsequent
intoxications episodes.
2.4
PHARMACOLOGY
AND
TREATMENT
2.5.1 Mode of Action
Pharmacological studies have revealed
that CTXs act on voltage-sensitive sodium
channels (VSSC) present on most excitable
and some non-excitable cells (Al-Sabi et al.
2006; Lewis et al. 2000; Nicholson and
Lewis 2006; Rayner 1972; Wang 2008). Like
PbTxs, CTXs bind directly to site 5 on the αsubunit of VSSC (Dechraoui et al. 1999;
Lombet et al., 1987; Poli et al. 1986), causing
them to open at normal cell resting
membrane potential. One of the wellestablished consequences of this activation is
the influx of sodium ions (Na+), which
induces membrane depolarization (Benoit et
al. 1986; Bidard et al. 1984) and causes
spontaneous firing in a variety of nerve fibers
(Bidard et al. 1984; Benoit and Legrand
1992; 1996; Brock et al. 1995; Hamblin et al.
1995; Hogg et al. 1998; Molgó et al. 1990).
The Na+ influx results in osmotic
deregulation inducing water influx that leads
to edema of Schwann cells (Allsop et a.
1986) and axons (Benoit et al. 1996; Mattei
et al. 1997; 1999).
Activation of VSSC by P-CTX-1B has
also been shown to lead to direct
mobilisation of calcium ions (Ca2+) from
internal stores (Lewis and Endean 1986;
Molgó et al. 1992; 1993a) and to an indirect
activation of the Na+-Ca2+ exchanger
allowing Ca2+ influx against Na+ efflux
(Molgó et al. 1993b; Gaudry-Talarmain et al.
1996). An elevation in cytosolic Ca2+ may
promote neurosecretion believed to underpin
certain CFP symptoms (Mattei et al. 2008;
Nicholson and Lewis 2006). Recent studies
suggest that CTXs may also modulate
voltage-sensitive potassium channels that
most likely contribute to membranes
depolarization caused by CTX-activated
VSSC (Hidalgo et al. 2002; Nicholson and
Lewis 2006; Birinyi-Strachan et al. 2005).
Yet another recent study demonstrated the
action of CTXs on the L-type calcium
channels resulting in the swelling of frog
erythrocytes (Sauviat et al. 2006).
Though CTXs seldom accumulate in fish
at levels that are lethal to humans, explaining
the low mortality, they are extremely potent
in that at nanomolar and picomolar
concentrations they are able to activate the
VSSC in cell membranes (Lewis et al. 2000).
Therefore, as sodium channels are widely
spread in nerve and muscle tissue, the
depolarization of these cells is believed to be
the cause of the array of sensorial
polyneuropathies and myopathy associated
with CFP (Friedmann et al. 2008; Nicholson
and Lewis 2006).
2.5.2. Occidental Medicine
The treatment of CFP in the occidental
medicine remains mainly symptomatic and
supportive. Depending on the clinical
28
symptoms a patient may present; a number of
medications are prescribed (Table 7).
Intravenous (i.v.) D-mannitol infusion is the
most studied and the only therapy for CFP
evaluated by randomized blinded clinical
trials. The therapeutic effect of D-mannitol
was fortuitously discovered in Marshall
Islands when two men who became
unconscious from severe CFP spectacularly
responded within minutes after D-mannitol
was administrated for presumed cerebral
edema. Subsequently, administrated to
further 22 ciguatoxic patients, including one
with circulatory failure, they found
significant relief especially from neurological
and muscular dysfunctions (Palafox et al.
1988). Since then, the utilisation of Dmannitol in treatment of CFP has been
reported in numerous case reports and trial
series from around the world (Blythe et al.
1992; 1994; Eastaugh 1996; Mitchell 2005;
Palafox 1992; Pearn et al. 1989; Schwarz et
al. 2008; Slobbe et al. 2008; Stewart 1991;
Ting and Brown 2001; Williamson 1989).
Currently, accepted as the most effective
method of abating the neurological
symptoms, D-mannitol, nonetheless, has not
been consistently beneficial to all patients.
Despite this treatment, the management of
the chronic neurological symptoms of CFP
continues to be problematic, especially when
D-mannitol has not been administrated in the
acute phase of the disease (Adams 1993;
Butera et al. 2000; de Haro et al. 1997;
2003). None of the case reports or trial series
cited above included a randomized placebocontrolled clinical study, until very recently,
whereby the effects of D-mannitol to normal
saline were compared in a double-blinded
trial (Schnorf et al. 2002). The data obtained
indicated that both treatments were
associated with clinical improvement and to
a similar degree, and that D-mannitol was not
superior to saline. Though some clinicians
are now beginning to question its efficacy, in
the absence of an alternative, the i.v. infusion
of D-mannitol is still considered the
treatment of choice in severe ciguatera
intoxications.
Over the years, a myriad of other
treatments and medicines, mostly responding
to CFP symptoms have been tried (Table 7).
The claims of efficiency are again entirely
based on small, uncontrolled trial series and
case reports. Gastrointestinal symptoms,
usually brief and self-limited, require little
more than intravenous (i.v.) fluid and
electrolyte replacement (Cheng and Chung
2004; Gillespie et al. 1986). In the acute
phase of the intoxication activated charcoal,
believed to bring some benefit through toxin
elimination by absorption, may be
administrated. Likewise, gastric lavage
(Nicholson and Lewis 2006), spontaneous
vomiting and catharsis, thought to enhance
removal of the unabsorbed toxin, are also
encouraged (Farstad and Chow 2001). In the
absence of these symptoms, emetics and
cathartics are administrated (Gillespie et al.
1986). On the other hand, in certain cases,
antiemetic and anti-diarrhea medications may
also be prescribed to contain severe
gastrointestinal manifestations (Cheng and
Chung 2004; de Haro et al. 2003). For the
palliative wellbeing cold showers to relieve
pruritus and bed rest during period of
convalescence are also indicated. Some
clinicians may even advocate a strict diet that
avoids all seafood, fish by-products, nuts, nut
oil and alcohol for at least 6 months after the
intoxication to avoid reappearance of
symptoms, and in some cases, patients are
asked to abstain from sex (Friedman et al.
2008; Lindsay 1997; Ruff and Lewis 1994).
In cases of cardiovascular disorders,
atropine is generally used to alleviate
hypotension and bradycardia but it has no
effect on the neurological or gastrointestinal
disturbances. In severe cases, dopamine or
adrenaline or calcium gluconate may be
required (Baden et al. 1995; Cheng and
Chung 2004; Nicholson and Lewis 2006).
Rarely, critically ill CFP patients may require
endotracheal intubation and mechanical
ventilation for either airway protection if
comatose or in the case of a respiratory
failure. Occasionally, in order to manage the
dysrhythmias, temporary cardiac pacing may
also be inserted (Friedmann et al., 2008;
29
Juranovic and Park 1991; Ruff and Lewis,
1994). Phenytoin, phenobarbitol or thiopental
sodium given i.v. has been recommended for
the treatment of convulsions (Calvert 1991). .
When the activity of anticholinesterase
was held responsible for the toxicity of CTXs
(Li, 1965), oxime like pralidoxime was used
to reactivate acetylcholine but proved
ineffective (Morris et al. 1982a; Russell
1975). This assertion was later rejected
(Rayner et al. 1968; Ogura et al. 1968). On
the other hand, some clinicians have used the
cholinesterase inhibitors such as neostigmine
with a certain success in the severe cases
(Banner et al. 1963; Bagnis 1968).
Other symptomatic treatment includes
analgesics for musculoskeletal symptoms.
Acetaminophen (paracetemol) has been
recommended for relief of headache and
indomethacin has been reported to relieve
myalgias and arthralgias (Calvert 1991;
Pearce et al. 1983). Their use in chronic CFP
is also recommended (Sims 1987). For
generalized pruritus the antihistamines such
as diphenhydramine or cyproheptadine are
usually prescribed (Calvert 1991; Gelb and
Mildran 1979; Pearce et al. 1983). But these
have been reported to be ineffective in the
chronic phase. An i.v. use of the
corticosteroid, methylprednisolone led to an
amelioration of a heightened polymyositis in
a case (Stommel et al., 1993). On the other
hand, the similarities between the symptoms
of avitaminosis B and ciguatera (Boydron-Le
Garrec et al. 2005a) have also led to the i.v.
utilization of vitamin B complex (B1, B6 and
B12) in association to i.v. calcium gluconate
in the treatment of CFP, which reportedly
shortened the duration of symptoms (Ruff
and Lewis 1994; Glaziou and Legrand 1994;
Russell 1975).
Fluoxetine has been used for chronic
fatigue and was reported to be effective in
two patients suffering from CFP-related
chronic fatigue that persisted over nine
months (Berlin et al. 1992; Ruff and Lewis
1994). Occasional diminution of chronic
paresthesia and other neurological symptoms
has been reported with amitriptyline
(Bowman 1984; Davis and Villar 1986;
Calvert et al. 1987; Lange et al. 1992).
However,
prescription
of
these
antidepressants with an addiction potential
warrants caution (Pagliaro and Pagliaro
1993; Peles et al. 2008; Prahlow and
Landrum 2005).
Gabapentin, with a known efficacy in
neuropathic pain, has recently been reported
to
improve ongoing polyneuropathic
symptoms,
chronic
dysesthesias
and
paresthesia, of CFP in two patients (Perez et
al. 2001). However, upon discontinuation of
this medication, the symptoms reappeared
that necessitated a prolonged use. It is not
uncommon for the prescription of gabapentin
to occur in a mental health context (Berigan
2000; Carta et al. 2003). Indeed the chronic
complaints of CFP (depression, fatigue,
algia) can be confounded with psychiatric
causes (Arena et al. 2004; Friedman et al.
2007; 2008).
Moreover, the sudden
discontinuation of gabapentin after long term
use may provoke withdrawal symptoms
(Tran et al. 2005). Given the persistence of
certain symptoms of CFP (Chateau-Degat et
al. 2007a; 2007b), prescriptions of this
substance thus necessitate caution on the part
of clinicians.
Tocainide, an analogue of lidocaine safely
alleviated ciguatoxic symptoms in three adult
males (Lange et al. 1988), while nifedipine
has been noted for the resolution of
headaches in a patient (Calvert et al. 1987).
These drugs, the lidocaines analogs
(tocainide and mexiletine) as well as
amitriptyline and fluoxetine, and nifedipine
and gabapentin appear to alter the Na+ and
Ca2+ channels, respectively, and hence are of
theoretical appeal in CFP (Nicholson et al.
2002; Nicholson and Lewis 2006).
Nevertheless, like pyridoxine, diazepam,
pralidoxime and protamide, the clinical use
of all of these agents in CFP are very limited
and have responded with variable success
(Farstad and Chow 2001, Cheng and Chung
2004; Raikhlin-Eisenkraft and Bentur 2002).
The efficacy of these agents like D-mannitol
in humans as consequence still needs to be
proven. As none of these palliative
30
Table 7 The occidental medicines prescribed in the treatment for CFP based on anamnesis and the clinical signs that a patient may present.
CFP Symptom Treatment
Neurologic
a
Drugs Used
Class
Vitamins B1
Thiamine
Vitamins B6
Pyridoxal
Vitamins B12
Cyanocobalamin
D-mannitol
Polyol
Tiapride
(Tiapridal®)
benzamide
Dexamethasone
(Ciprodex®)
glucocorticoid
Salicyclic acid
Paracetamol
(Acetaminophen)
beta hydroxy acid
b
Prescription/Description
Nutrition supplement - Beriberi characterized by fatigue, depression and loss of appetite that develops to resting
tachycardia, decreased deep tendon reflexes, peripheral neuropathy, mental confusion, memory loss, pain in
limbs, reduced and involuntary movements.
Nutrition supplement - Skin and hair problems, asthma, autism, and cardiac disease related to
hyperhomocysteinemia, depression, migraines, kidney stones, muscle pains, epilepsy, multiple sclerosis, neuritis,
anemia, and influenza.
Nutrition supplement - Pernicious anemia characterized by bone marrow promegaloblastosis, gastrointestinal
symptoms, neurological symptoms. The neurological complex, defined as myelosis funicularis, consists of
impaired perception of deep touch, pressure and vibration, abolishment of sense of touch, very annoying and
persistent paresthesia, ataxia of dorsal cord type, decrease or abolishment of deep muscle-tendon reflexes and
pathological reflexes (Babinski, Rossolimo and others, also severe). Mental disorders, irritability,
focus/concentration problems, depressive state with suicidal tendencies and paraphrenia complex can also occur.
Diuretic, osmotic – Promotion of dieresis in acute renal failure and urinary excretion of toxic materials, reduction
of intracranial pressure and brain mass and of high intraocular pressure.
Antidopamine – relieves intense pain and intero- exteroceptive pains.
Antiinflammatory - rheumatoid arthritis, allergic anaphylactic shock, bacterial meningitis, counteract certain sideeffects of their antitumor treatment, high altitude cerebral edema as well as pulmonary edema and congenital
adrenal hyperplasia.
Antiinflammatory - anti-acne, psoriasis, calluses, corns, keratosis pilaris, and warts.
Widely-used analgesic and antipyretic medication.
Amitriptyline
Tricyclic amine
Serotonin and noradrenaline reuptake inhibitor – migraines, vaginal swelling, treatment of depression, nocturnal
enuresis, ankylosing spondylitis (a chronic, painful, degenerative inflammatory arthritis primarily affecting spine
and sacroiliac joints, causing eventual fusion of the spine) and of certain neuropathic pain, insomnia, anxiety
disorders, rebound headache, chronic cough, chronic pain, postherpetic neuralgia (persistent pain following a
shingles attack), carpal tunnel syndrome, fibromyalgia, vulvodynia, interstitial cystitis, male chronic pelvic pain
syndrome, irritable bowel syndrome, diabetic peripheral neuropathy, neurological pain, and painful paresthesia
related to multiple sclerosis and as prophylaxis for frequent migraines.
Tocainide
(Tonocard®)
Lidocaine
Antiarrhythmic – used to correct irregular heartbeats to a normal rhythm by slowing nerve impulses in the heart.
Antiepileptic – epilepsy, postherpetic neuralgia (neuropathic pain following shingles, other painful neuropathies,
and nerve related pain), migraine, headaches, nystagmus and bipolar disorder. Its therapeutic action on
neuropathic pain is thought to be brought about by its binding to the voltage-dependent calcium channel in the
central nervous system.
Gabapentin
(Neurontin®)
Diphenhydramine
(Bendryl®)
Ethanolaminederivative
Antihistamine - prevents nausea, antitussive, as sleep aid and relieves itching.
31
a
Drugs Used
Class
b
Calcium channel blocker - its main uses are as an antianginal (especially in Prinzmetal's angina) and
Nifedipine
Dihydropyridine
Indomethacin
Cyproheptadine
(Periactin®)
Neostigmine
(Prostigmine®)
Hydroxyzine
Physostigmine
piperazine
Tertiary amine
alkaloid
Fluoxetine
(Prozac®)
Digestive
Lidocaine
Amino-amides
Colchicines
Phenylethylamine group of
alkaloids
Pralidoximes
Oximes
Edrophonium
antihypertensive, although a large number of other uses have recently been found for this agent, such as
Raynaud's phenomenon, premature labour, and painful spasms of the oesophagus in cancer and tetanus patients. It
is also commonly used for the small subset of pulmonary hypertension patients whose symptoms respond to
calcium channel blockers, Nifedipine rapidly lowers blood pressure.
Non-steroidal antiinflammatory drug commonly used to reduce fever, pain, stiffness, and swelling. It works by
inhibiting the production of prostaglandins, molecules known to cause these symptoms. Since indomethacin
inhibits both COX-1 and COX-2, it inhibits the production of prostaglandins in the stomach and intestines which
maintain the mucous lining of the gastrointestinal tract.
Antihistamine and antiserotonergic – treatment of seasonal and year-round allergies like hay fever, relieves
itching and hives, migraine prophylaxis, anorexia nervosa, Equine Cushing‟s-like syndrome, carcinoid, selective
serotonin reuptake inhibitor (SSRI)-induced sexual dysfunction and hyperhydrosis and used in management of
serotonin syndrome. This last condition consists of hyperactive bowel sounds, hypertension, hyperthermia,
overactive reflexes, clonus, hypervigilance, agitation, severe hypertension and tachycardia that may lead to shock.
Reversible cholinesterase inhibitor - improve muscle tone in people with myasthenia gravis, to reverse the effects
of non-depolarizing muscle relaxants after operation, for urinary retention resulting from general anaesthesia,
Ogilvie syndrome (a pseudo-obstruction of colon) and to treat curariform drug toxicity.
Antihistamine and anxiolytic – treatment of itches and irritations, of allergic conditions, such as chronic urticaria,
atopic or contact dermatoses and histamine-mediated pruritus, is an antiemetic for the reduction of nausea, as a
weak analgesic and is also prescribed in general anxiety disorder or in psychoneurosis. A sedative and a mild
tranquiliser, it is used in dentistry and in obstetrics.
Reversible cholinesterase inhibitor - treats myasthenia gravis, glaucoma, improves memory in Alzheimer's
disease and delayed gastric emptying. Also used to treat the central nervous system effects of atropine,
scopolamine and other anticholinergic drug overdoses.
A SSRI antidepressant - treatment of major depression, obsessive-compulsive disorder, bulimia nervosa, anorexia
nervosa, panic disorder and premenstrual dysphoric disorder.
Local anaesthetic and antiarrhythmic – topically used to relieve itching, burning and pain from skin
inflammations, also used in postherpetic neuralgia, injected as a dental anesthetic and in minor surgery. Lidocaine
alters depolarization in neurons, by blocking the fast voltage gated sodium (Na+) channels in the cell membrane.
With sufficient blockade, the membrane of the presynaptic neuron will not depolarize and so fail to transmit an
action potential, leading to its anaesthetic effects
Antimitotic - treatment of rheumatic complaints, muscle spasm, weakness associated with disc disease, gout, also
prescribed for its cathartic and emetic effects.
Anticholinesterase reactivators – used to combat poisoning by organophosphates or other acetylcholinesterase
inhibitors nerve gases.
Reversible acetylcholinesterase inhibitor – used to evaluate muscle response and to diagnose and treat myasthenic
crisis. Also employed to reverse the effects of certain muscle relaxants used during surgery.
32
a
Drugs Used
Class
Atropine
Cardio-vascular
Dopamine
Catecholamines
Calcium
gluconate
Adrenaline
a
Catecholamine
b
Anticholinesterase – antidote for nerve agent and organophosphate insecticides intoxication, treatment of
bradycardia, asystole, pulseless electrical activity in cardiac arrest and hyperhydrosis, used as a cycloplegic and
as a mydriatic, can prevent the death rattle of dying patients. Atropine acts by blocking the effects of excess
concentrations of acetylcholine. Generally, atropine lowers the parasympathetic activity of all muscles and glands
regulated by the parasympathetic nervous system. It is also used as adjunctive therapy in the management of
hypermotility disorders of the lower urinary tract and gastrointestinal system.
Neurotransmitter - can be supplied as a medication that acts on the sympathetic nervous system, producing
effects such as increased heart rate and blood pressure and in the management of Parkinson‟s disease doparesponsive dystonia.
Mineral supplement - a form of calcium most widely used in the treatment of hypocalcemia. Calcium gluconate is
also used as a cardioprotective agent in hyperkalemia. Though it does not have an effect on potassium levels in
the blood, it reduces the excitability of cardiomyocytes thus lowering the likelihood of developing cardiac
arrhythmias.
Hormone and neurotransmitter - boosts the supply of oxygen and glucose to the brain and muscles. It is a drug of
choice to treat cardiac arrest and other cardiac dysrhythmias resulting in diminished or absent cardiac output.
The information on the type of drugs used in the treatment of CFP can be been found in various reviews and articles (Calvert 1991; Farstad and Chow 2001; Glaziou and Legrand 1994; Ruff
and Lewis 1994; Ting and Brown 2001 and the articles cited within).
b
The information on the pharmaceutical drugs and the indication of use can be found on the online databases Medline Plus; Medscape and Merck Manual.
33
treatments are wholly remedial, Pacific
Islanders resort regularly to traditional form
of care (Banner et al. 1963; Bourdy et al.
1992; Laurent et al. 1993).
2.5.3. Traditional Medicine
Over the centuries the primeval people of
the Pacific, where CFP has the highest
occurrence, have elaborated, through trial
and error, a variety of traditional herbal
medicines and remedies. Today the insular
population continues to employ this ancient
pharmacopoeia in the treatment of CFP. In
view of the growing socio-economical
gravity of CFP in insular nations (Bagnis
1992; Dalzell 1992; Laurent et al. 2005) and
the desistance of use of medical care due to
frequent deceptions, poor financial resources
and the geographical isolation of several
Pacific islands, the use of alternative therapy
is extremely popular (Barrau 1950; Bourdeau
1985; Bourdy et al. 1992; Bourret 1981;
Cabalion 1984a; 1984b; 1984c; 1984d;
1984e; Dufva et al. 1976; Haddock 1973;
Laurent et al. 1993; Lobel 1979; Pétard 1986;
Rageau 1973; 1983; Vienne 1981; Weiner
1985). Similarly, the population of other
regions touched by CFP, the Caribbean Sea
and the Indian Ocean, also avails to such
therapies (Kaplan 1999).
In the early 1990‟s, a 10-year long
ethnopharmacological survey carried out on
the various islands of New Caledonia and
Vanuatu resulted in an inventory of at least
90 different plant species used in the
preparation of folk remedy against CFP
(Bourdy et al. 1992; Laurent et al. 1993).
This study provided excellent accounts on
the parts of the plants used and the mode of
preparation and administration of these
phytotherapies. However, despite the effort
on the part of the authors, the information on
the dosage and the duration of each treatment
could not be clearly reported due to the large
variations in the data collected from one
traditional healer to another.
Nonetheless, this survey has provided
precision on the nature of use of these
phytotherapies, that is if the mode of practice
is curative or preventive or both. As means of
prevention when a fish is suspected, certain
plants based on believe to be capable of
neutralizing the causative toxins are
introduced in the culinary preparation or are
consumed together with the fishmeal.
However, the majority of these plants are
used as therapeutics. Indeed, reputed for their
general
purgative,
antidiarrhoeal,
antirheumatic, antipruritic and analgesic
effects, their utilization in the treatment of
CFP is most probably symptomatic rather
than by a specific detoxification process
(Bourdy et al. 1992; Laurent et al. 1993).
This may explain the important number of
plants used in relation to the several
symptoms that are provoked by this
intoxication.
Among the plants administrated as
symptomatic, Heliotropium foertherianum
(formerly Argusia argentea), Cocos nucifera,
Erythrina variegata var. fastigiata, Punica
granatum, Syzygium malaccense, Artocarpus
altilis, Carica papaya, Pandanus tectorius,
Terminalia catappa, Vitex rotundifolia and
Scaevola sericea are much more often used
than others throughout Polynesia and/or
Melanesia (Bourdy et al., 1992; Laurent et
al., 1993). Believed to possess depurative
activities, the use of the plant H.
foertherianum in CFP, particularly popular in
the Western Pacific Basin has been reported
in island nations of French Polynesia, Tonga,
Micronesia and Japan (Banner et al. 1963;
Bagnis 1973; Bourdy et al. 1992, Halstead
1978; Hashimoto et al. 1969; Laurent et al.
1993; Noro et al. 2003). In order to evaluate
the anti-ciguateric potential of these plants,
several scientific experiments were pursued
in various biological models. These are
discussed in detail below.
Following the ethnobotanical survey, the
very first evaluation of the phytotherapies
was undertaken in a mouse bioassay (Amade
and Laurent, 1992). Based on the popularity
of use, facility of identification and collection
and a probable action on the nervous system,
H. foertherianum and twenty of other plants
(C. nucifera, T. catappa, C. papaya, S.
malaccense, A. altilis, Vitex rotundifolia var.
subtrisecta, P. granatum, E. variegata var.
34
fastigiata, Schinus terebenthifolius, P.
tectorius,
Morinda
citrifolia,
Acacia
spirorbis, S. sericea, Ipomoea pes-caprae
and the less popular Davallia solida,
Plectranthus
parviflorus,
Polyscias
scutellaria, Xylocarpus granatum, Ximenia
americana and Euphorbia hirta) were
selected. The extracts from these plants were
prepared according to the traditional method
and their effects were evaluated in mice
intoxicated via intraperitonal (i.p.) injection
with a sublethal dose of a liver extract
obtained from G. javanicus. The toxic extract
provokes a significant corporal weight loss in
mice over 24 to 48 h, after which the growth
curve normalizes, indicating a recovery. A
significant reduction in the weight loss and
amelioration in the recovery time was
observed in mice co-treated with the leave
extracts of H. foertherianum and S.
terebenthifolius, in contrast to i.v. Dmannitol, tocainide and the other plant
extracts tested, (Amade and Laurent, 1992;
Laurent and Amade, 1992). Based on these
results, the therapeutic potential of these two
remedies in the cure of CFP were suggested.
However, this study only allows a semiquantitative evaluation of the activity of the
extracts, in that it provides no information as
to how this beneficial effect is produced. In
addition, though, mouse bioassay has been
standardized and is widely used as a CTX
detection method (Boydron-Le Garrec et al.
2005b; Vernoux, 1994), here as a biological
test it poses certain limits. The authors stated
that they were confronted with two major
inconveniences with this study. First, the
results were not reproducible, varying from
an individual to other, which necessitated the
use of an important number of animals and
second, unlike human subjects, the mice did
not present signs of intoxication after 24-48 h
(Laurent and Amade, 1992). Indeed, based
on pharmacokinetic observations with PbTxs,
rodents are believed to rapidly eliminate
CTXs from their organism (Poli et al. 1990;
Radwan et al. 2005). The relatively shorten
convalescence and the refractoriness of mice
to the effects of CTXs indicate that the end
point of this bioassay may not represent a
classical response in humans (Higerd 1983).
This is further substantiated by the fact that
axonal edema reported on nerve biopsy in
human with ciguatera intoxication is absent
in the mice models (Lewis and Endean,
1983; Lewis et al. 1993). However, axonal
edema due to CTXs has been observed in in
vitro myelinated nerves of frog (Benoit et al.
1996, Mattei et al. 1997; 1999).
Consistent
with
the
neurological
alterations reported in patients suffering from
CFP, the exposure of frog axon to CTXs
results in high frequency action potential
discharges and perturbations in osmotic
balance causing water influx leading to a
marked increase in cellular volume (Benoit et
al. 1996). The fact that this edema was
prevented by tetrodotoxin (TTX), a potent
VSSC inhibitor, underlines the role of the
continuous Na+ influx in the swellings
observed in the nodes of Ranvier and motor
nerve terminals. Inspired from experiments
effectuated with D-mannitol, the positive
effects of the leaves and root extract of H.
foertherianum and D. solida, respectively,
against
the
P-CTX-1B-induced
electrophysiological and morphological
alterations in frog myelinated axons were
confirmed. Like D-mannitol, the spontaneous
and repetitive action potential firing in the
nodal membrane and the edema of node of
Ranvier resolved upon co-treatment with
these two plants. Remarkably, when the
axons were washed, the inhibitory action of
D. solida on the spontaneous repetitive action
potentials as opposed to that of H.
foertherianum proved to be irreversible
(Benoit et al. 2000).
As these neurocellular tests require highly
specialized material and hours of preparation,
which is not compatible with bio-guided
chemical fractionation evaluations, a simpler
test was developed based on the
morphological alteration of frog erythrocytes
induced by the osmotic effect of P-CTX-1B.
In this bioassay, the leave extract of H.
foertherianum was able to suppress the
swelling induced by the toxin, as observed by
the reduction in apparent surface area of the
treated erythrocytes.
35
As opposed to the CTXs-induced edema
in frog axons, TTX was not able to reverse
the CTXs-induced swelling in frog
erythrocytes. In addition, an augmentation in
the volume was observed when Ca2+ was
added to the physiological medium,
indicating an entry of Ca2+ rather than Na+
(Boydron et al. 2001). Further molecular
investigation on this model demonstrated that
the entry of Ca2+ resulted from the activation
of the L-type calcium channel and that the
cascade of events leading to the swelling of
erythrocytes may involve the activation of
the enzyme nitric oxide synthase (Sauviat et
al. 2006).
Eventually this test was further adapted
and the frog erythrocytes were replaced with
human red blood cells, in which similar
results were obtained with H. foertherianum
and TTX (Boydron et al. 2002).
However, as the event of hemolysis of the
red blood cell does not seem to depend on the
activation of VSSC and as the bioassay itself
lacked in sensitivity, another biological test
was elaborated using established nerve cells
derived from a mouse brain cancer. This
murine neuroblastoma (Neuro 2a) cell line is
known to express the VSSC proteins, which
when challenged with veratridine and
ouabain induces cytotoxicity that is further
potentiated by PbTx-3 or P-CTX-1(Manger
et al. 1993; 1994; 1995). Veratridine (site 2
VSSC activator) causes sodium channels in
the cell membrane to open allowing a
potentially lethal influx of sodium ions into
the cells. Ouabain (Na+/K+- pump inhibitor)
inhibits the action of a transporter that pumps
sodium ion back out of the cell and so
maximizes the effect of veratridine. The
PbTx-3 and P-CTX-1, being sodium channel
activators, enhances the effects of veratridine
on sodium ion influx, causing cellular
swelling and subsequent death (Nicholson et
al. 2007). In this way, it was possible to
study the counteractive effects of 31 and 7
plant extracts against the cytotoxicities
induced by ouabain, veratridine and PbTx-3
or P-CTX-1, respectively.
Among the 24 plant extracts that exhibited by
themselves no toxicity in Neuro 2a cells, 22
prevented the cytotoxicity due to one or more
Na+ channel modulators applied. Based on
numerous controls, the anticytotoxicity
activities of certain extracts (S. malaccense,
A. altilis, Stachytarpheta australis, Capsicum
frutescens, X. americana, M. citrifolia,
Dendrolobium umbellatum, P. tectorius, V.
rotundifolia var. subtrisecta and I. pescaprae) against the toxicity of PbTx-3 were
differentiated from those of the potentiating
agents used. Subsequently, the plants E.
hirta, S. sericea, S. malaccense, S. cytherea,
A. altilis and S. australis were also shown to
strongly counteract the cytotoxicity induced
by P-CTX-1 and the two ionic modulators,
ouabain and veratridine (Boydron-Le Garrec
et al. 2005c).
3
DISCUSSION
CONCLUSION
AND
Marine algal toxins impact human health
essentially through seafood consumption and
in the case of NSP also via the respiratory
routes. With the increasing use of marine
organisms for human consumption, human at
the top of the food chain is more likely to
encounter these toxins. Among the six wellcharacterized seafood poisoning syndromes
discussed in this review, CFP is by far the
most common form of intoxication. Had it
not been for this man‟s appetite for fish, the
story of CFP might have remained a secret of
coral reef ecology. As intuitively foreseen by
Jacques Grevin (Grevin 1568), a French
physician and poet, the research on ciguatera
has been painstakingly slow. Though, a
considerable progress has been made in the
last few decades requiring concerted efforts
from scientists from multidisciplinary fields,
this has yet to be translated into the
development of an effective therapy. This
also holds true for the other seafoodassociated syndromes described in this
review.
With the highest incidence in the Pacific
region, CFP is an exceedingly unpleasant
illness that represents a serious socioeconomic problem in these island nations
that depend heavily on fish products for their
livelihood and where the toxins involved are
36
the most potent. Though various medicines
have been and are still used for the treatment
of CFP, the efficacy of these agents remains
uncertain. Thus at present, prevention
appears to be the only solution. Yet in the
absence of a reliable, cost-effective method
of detection of CTXs in fishes, prevention
has also proved to be difficult. In certain
islands, the high incidence of CFP has driven
the population to abstain completely from
consuming fresh fishes from their lagoons
(Fleming et al. 1998). This has also led to
loss in economy due to imposed exportation
embargos. (Laurent et al. 2005). Hence, it is
evident that there was an urgent need to
establish a therapeutic regime.
Given the popular use of traditional
medicine in the Pacific, various studies
reviewed herewith on certain of the plants
used in the treatment of CFP gave evidence
of their efficiencies against the noxious
effects of CTXs in in vitro and in vivo
models.
However,
target-based
and
quantitative pharmacological evaluation of
potentially bioactive molecules in the plants
having the specific effect against the action
of CTXs in the human biological system has
been hampered by the scarcity of CTXs and
inappropriate and impractical bioassays. It is
in this regard, that the bioassay with Neuro
2a cells was adapted in 2004 to evaluate the
therapeutic potential of plants. Originally
develop ten years earlier to detect CTXs,
PbTXs and saxitoxins in fish and microalgal
samples, this biological method at that time
presented an ideal approach to perform high
volume screening for the identification of
potentially active plants and eventually
compounds possessing therapeutic activities
against CFP. Though rapid and replicable,
this semi-automated biological assay for the
purpose of therapeutic evaluation lacks in
specificity and clinical consistency.
Indeed, without ouabain and veratridine
co-treatment, the Neuro-2a cells were
resistant to the effects of CTXs and PbTxs,
exhibiting extremely low to insignificant
cytotoxicities. The co-addition of these
potentiating agents in detection bioassays
though may serve as an indicator for the
presence of VSSC activator toxins in
biological samples, in experiments evaluating
therapeutic activity of plants; however,
addition of these pharmacologically active
agents is not a true reflection of the
conditions of clinical CFP intoxications in
humans. This raises questions on suitability
and specificity of this biological assay for the
tests with plants. Despite the discriminatory
controls, the phenomenon of synergistic
effects is complicated. Thus the extrapolation
of the results obtained from this model to
clinical situations may not be reliable.
Hence though this bioassay has provided
valuable information of therapeutic potential
of the plants, other biological approaches
adapting more closely the pharmacological
action of CTXs are necessary to provide
further scientific-based evidence of the
efficiency of plants with assurance of
specific clinical efficiency in the treatment of
CFP. Furthermore, given the extreme rarity
of CTXs it is also important that these
bioassays are miniaturized and/or permit the
replacement of CTXs with other easily
available functional agents like PbTxs. These
bioassays should also be practicable, rapid
and reproducible, allowing medium to largescale screening and bio-fractionation studies
with relative ease and which will
subsequently allow the isolation of a number
of new bioactive molecules from the plants.
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51
II. Historique : les études de criblage antérieures
Au début des années 1990, l‟ORSTOM (maintenant IRD) a lancé un programme de
recherche sur les remèdes traditionnels utilisés pour traiter les symptômes de la ciguatera
au sein des populations du Pacifique sud. Ce programme a débuté par des enquêtes
ethnobotaniques qui ont duré sur une période de plus de 10 ans dans des tribus et villages
de Nouvelle-Calédonie et du Vanuatu. Elles ont permis de récolter et d‟identifier 94
espèces de plantes entrant dans la préparation de remèdes contre la ciguatera (Bourdy et
al., 1992 ; Laurent et al., 1993).
Cette connaissance acquise, l‟étape suivante a consisté en une sélection des plantes
inventoriées en fonction de leur activité dans des tests biologiques afin de confirmer
scientifiquement leur efficacité.
La nécessité de disposer d‟un test approprié qui pourrait être utilisé dans un criblage
à moyen débit et dans un fractionnement chimique bioguidé s‟est imposée. Au cours des
trois dernières décennies, nous avons assisté à l‟apparition de nombreuses études
expérimentales qui ont permis d‟obtenir un aperçu de plus en plus précis du mode
d‟action des CTXs et de leurs effets sur différents tissus et cellules. Certains de ces
modèles expérimentaux ont été adaptés pour évaluer le potentiel thérapeutique de ces
plantes contre l‟effet des CTXs.
Ces études et quelques uns de leurs avantages et inconvénients sont passées en revue
ci-dessous (voir Article 1 pour les informations de plantes testées et les résultats).
II.1 Test souris
Principe d’étude : La première évaluation thérapeutique a été entreprise au centre IRD de
Nouméa à l‟aide d‟un test souris (Amade et Laurent, 1992). Cet essai est basé sur la
sensibilité des souris qui manifestent des symptômes bien définis après injection de CTXs
ou d‟extraits contenant des CTXs (Kimura et al. 1982 ; Ito et al., 2003). Pour évaluer le
potentiel thérapeutique des remèdes traditionnels, les souris sont co-injectées avec une
gamme de concentration d‟extrait de plantes (traitement) et une dose sublétale de toxines
52
(CTXs pures ou extrait riches en CTXs, tels ceux de foies de murène). L‟activité
thérapeutique chez la souris traitée se manifeste par une récupération pondérale et
physique plus rapide que chez la souris témoin injectée avec l‟extrait toxinique seul.
Avantages & Défauts : Grace à cet essai biologique, nous avons été en mesure d‟identifier
des extraits de plantes comme celui d‟H. foertherianum ou de S. terebenthifolius qui ont
démontré des effets bénéfiques. Toutefois, les deux critères d‟évaluation de cette méthode
n‟offrent qu‟un aperçu qualitatif (période de récupération) ou quantitatif (perte de poids)
mais peu sensible. Etant donné la complexité d‟un organisme vivant, ce test souffre d‟une
faible spécificité et d‟une grande variabilité. Pour ces raisons, nous nous sommes tournés
vers d‟autres tests qui nous offraient plus de spécificité et de précision.
II.2 Tests d’électrophysiologie et de neurophysiologie
Principe d’étude : La liaison des CTXs aux CSDP bloquent ces canaux en position
ouverte et déclenchent l‟afflux d‟ions sodium dans les cellules excitables de divers tissus.
Cela se traduit par l‟induction d‟une dépolarisation membranaire et des décharges de
potentiel d‟action spontanées et répétitives dans les cellules nerveuses. Parallèlement,
l‟accroissement de la concentration intra-axonale en ions sodium perturbe l‟équilibre
osmotique entre les milieux intra et extra-axonaux, ce qui entraîne une entrée d‟eau
responsable de gonflements cellulaires et neuronaux de longue durée (Benoit et al., 1986 ;
1996). Ces deux effets ont été bien décrits chez les axones myélinés de grenouille (Rana
esculenta) avec les techniques de « patch clamp » et de microscopie confocale à balayage
laser (Benoit et al., 1986). Notre collaboration avec le Laboratoire de Neurobiologie
Cellulaire et Moléculaire du CNRS, Gif-sur-Yvette nous a permis d‟utiliser ces deux
modèles et d‟observer les effets d‟extraits d‟H. foertherianum et D. solida contre l‟action
de la P-CTX-1B sur l‟excitabilité membranaire et le volume axonal de ces fibres
nerveuses (Benoit et al., 2000).
Avantages & Défauts : Ces deux méthodes offrent une approche à la fois spécifique et
sensible, permettant une observation directe sur la façon dont le courant électrique et
l‟osmose entraînés par l‟entrée de Na+, sont influencés par les CTXs à des concentrations
nanomolaires. Cependant, cette technique hautement spécialisée, exigeant des opérateurs
qualifiés et des instruments coûteux, ne pouvait pas être développée dans notre
laboratoire à Nouméa. Pour ces raisons, son utilisation dans une sélection à moyen débit
et dans un fractionnement chimique bioguidé n‟a pas été retenue. Cependant, comme ces
53
deux techniques permettent une approche rationnelle de l‟évaluation thérapeutique, elles
devront être reconsidérées pour une utilisation sur les molécules potentiellement actives
isolées à l‟aide d‟autres tests biologiques.
II.3 Tests sur érythrocytes de grenouille et humain
Principe d’étude : S‟appuyant sur les expériences de microscopie confocale à balayage
laser qui nous avaient permis de visualiser en trois dimensions l‟œdème induit par la PCTX-1B dans les axones myélinés de grenouille, les effets apparents de cette toxine sur la
surface des érythrocytes de grenouille ont été observés avec un simple microscope
inversé (Boydron-Le Garrec, 2005). Il a été ainsi montré que l‟application de P-CTX-1B
à des concentrations de l‟ordre du nanomolaire influençait la géométrie (longueur et
largeur) des érythrocytes, en augmentant sensiblement leur surface apparente. Ce test
nous a permis de mettre en évidence l‟activité inhibitrice de ce gonflement par un extrait
d‟H. foertherianum (Boydron et al., 2001a).
Avantages & Défauts : Ce test s‟est avéré simple, peu coûteux et relativement sensible
(Boydron-Le Garrec, 2005). Cependant, les observations microscopiques et la mesure des
dimensions de ces petits disques elliptiques restent qualitatives à semi-quantitatives et
sont assez fastidieuses pour des grands volumes et pour une vérification de routine des
effets thérapeutiques d‟extraits de plantes.
Principe d’étude : Afin de contourner les difficultés rencontrées dans l‟essai
précédemment décrit, certains changements ont été opérés, comme le remplacement des
hématies de grenouille par celles de l‟homme et la quantification du degré d‟hémolyse de
ces cellules par la spectrophotométrie (Boydron-Le Garrec, 2005). En effet, lors de la
lyse des hématies, de l‟hémoglobine est relâchée dans le milieu environnant et cette
libération peut être mesurée à la longueur d‟onde de 540 nm. Ce test, comme le
précédent, a été appliqué à l‟extrait d‟Argusia argentea pour étudier sa capacité à
contrecarrer l‟hémolyse provoquée par la P-CTX-1B (Boydron et al., 2001b).
Avantages & Défauts : Ce test biologique d‟évaluation du potentiel anti-ciguatérique de
plantes avait l‟avantage d‟être réalisé au format microplaques à 96 puits. Cependant, nous
avons rapidement réalisé qu‟il manquait de sensibilité (Boydron-Le Garrec, 2005). Pour
une lecture spectrophotométrique exploitable de l‟action hémolytique, de fortes densités
d‟érythrocytes sont nécessaires à la libération de quantités suffisantes d‟hémoglobine et
cette augmentation de concentrations cellulaires entraîne l‟emploi de plus fortes
54
concentrations en toxine ou de plus longues périodes d‟incubation, ce qui constitue à
l‟évidence des facteurs limitants pour une sélection à grande échelle des plantes. Ce
modèle a donc finalement été abandonné au profit d‟un autre test en microplaques
utilisant des neuroblastomes murins (Neuro-2a).
II.4 Test sur neuroblastomes
Principe d’étude : Le test biologique de cytotoxicité utilisant la lignée cellulaire Neuro-2a
pour une détection spécifique des neurotoxines agissant sur les CSDP dans les extraits
d‟échantillons marins a été développé par Manger et al. (1993). Ce test permet de détecter
les toxines capables d‟amplifier la mortalité des Neuro-2a initialement provoquée par la
ouabaïne et la vératridine. La viabilité des cellules est quantifiée par le test de réduction
du MTT observée à la longueur d‟onde de 490 nm. L‟augmentation de la concentration
en Na+ dans le cytoplasme des Neuro-2a suite à l‟activation des CSDP par des CTXs et
des PbTxs, est accentuée par la vératridine qui agit sur le site 2 des CSDP et par la
ouabaïne qui inhibe la pompe Na+/K+, entraînant ainsi la mortalité cellulaire. Basé sur ce
phénomène biologique, ce test de détection a été légèrement modifié pour mesurer le
potentiel des plantes à contrecarrer la cytotoxicité induite par la P-CTX-1B et/ou la PbTx3 en présence de ouabaïne et de vératridine (Boydron-Le Garrec et al., 2005a).
Avantages & Défauts : Ce test biologique a été une grande avancée pour notre évaluation
pharmacologique des plantes utilisées dans le traitement de la ciguatera car, pour la
première fois, était utilisée une lignée cellulaire immortalisée, nous permettant de nous
affranchir de l‟utilisation d‟animaux vivants. Il est également adapté à un usage en
routine, car 31 extraits de plantes ont pu être testés avec une quantification par
spectrophotométrie relativement aisée (Boydron-Le Garrec et al., 2005a). Autre avantage
non négligeable de cet essai, la substitution de toxines très rares à l‟état pur, les CTXs,
par une toxine commercialisée, la PbTx-3, de structure et de mode d‟action similaires.
Néanmoins, ce dosage biologique admet certaines limites parmi lesquelles la résistance
des Neuro-2a à ces toxines est un facteur majeur. En effet, sans les effets de synergie de
cytotoxicité de la ouabaïne et de la vératridine, ces toxines ne seraient pas capables
d‟induire une toxicité. L‟addition de ces substances n‟est certainement pas représentative
des conditions cliniques d‟une intoxication ciguatérique. En raison des effets synergiques
de la ouabaïne et de la vératridine, une réponse anticytotoxique d‟un extrait de plante ne
reflétera pas nécessairement un effet préventif de la toxicité induite par les CTXs ou les
55
PbTxs. Dans ces conditions, le pronostic d‟efficacité de l‟extrait de plantes dans le
traitement de la ciguatera ne serait donc pas très fiable et sujet à controverse.
III. Objectifs de l’étude
Bien que la ciguatera soit rarement fatale, les victimes dans la zone Pacifique
présentent un état morbide sévère et durable. Les nombreux médicaments prescrits dans
la médecine occidentale n‟offrent qu‟un traitement symptomatique et de soutien et font
preuve d‟une efficacité irrégulière. Le recours à la médecine traditionnelle pour traiter la
ciguatera est une connaissance acquise et transmise aux générations suivantes par les
populations insulaires du Pacifique, plaçant plus de foi par expérience personnelle ou
collective en ce système traditionnel.
Première étape vers des investigations scientifiques, une étude ethnobotanique
exhaustive menée au Vanuatu et en Nouvelle-Calédonie a été réalisée en 1993 par
l‟ORSTOM (ex-IRD). Cette étude a permis d‟identifier près de 94 espèces de plantes
utilisées dans la préparation de remèdes pour traiter les symptômes de la ciguatera
(Bourdy et al., 1992 ; Laurent et al., 1993). Par la suite, plusieurs expérimentations se
sont succédées sur certaines de ces plantes qui ont abouti à mettre en évidence leur
efficacité sur des modèles animaux et cellulaires (article 1). Néanmoins, ces approches
furent non-spécifiques, laborieuses ou nécessitant des techniques et des matériels
spécialisés et coûteux ainsi que l‟usage d‟animaux. Par ailleurs, d‟autres approches ont
été tentées mais manquaient, soit de sensibilité, soit de cohérence clinique (Section II,
Introduction générale).
Dans ces conditions, la sélection rapide, précise et à moindre coût, des plantes et par
la suite leur fractionnement chimique bioguidé, se trouvaient sérieusement limités. C‟est
en considérant ces aspects que nous avons entrepris la présente recherche. Notre objectif
a consisté à mettre en place un ou plusieurs tests appropriés permettant une sélection à
moyenne échelle qui mènerait à terme à l‟isolement des principes actifs des extraits de
plantes les plus intéressants.
56
Deux tests ont ainsi été développés :

Le premier test s‟appuie sur les études antérieures menées sur le mécanisme
moléculaire des CTXs induisant le gonflement des érythrocytes de grenouilles et
l‟hémolyse des érythrocytes humains (Section II, Introduction générale). Elles nous ont
permis d‟avancer l‟hypothèse de l‟implication de médiateurs inflammatoires comme le
radical libre d‟oxyde nitrique (NO•) et les cytokines pro-inflammatoires ainsi que de la
surexpression de l‟enzyme NO synthétase inductible (iNOS) dans l‟empoisonnement
ciguatérique. Le test de Griess (TG) et la Réaction de Polymérisation en Chaîne
quantitative (qPCR) ont été employés pour évaluer, respectivement, les taux de
production de NO• et de surexpression d‟iNOS dans les macrophages murins (RAW
264.7) stimulés par la P-CTX-1B. Ainsi, diverses plantes ont été testées selon ces
méthodes. Pour ces études de criblage, la P-CTX-1B étant extrêmement rare et donc
précieuse, nous l‟avons remplacée par le lipopolysaccharide (LPS). Cette endotoxine
d‟origine bactérienne, bien que différente de la P-CTX-1B en terme de structure, est
reconnue pour ses propriétés inflammatoires.

Le second essai a été adapté du test in vitro d‟interaction ligand-récepteur (TILR)
pour permettre l‟identification des plantes ayant des activités antagonistes vis-à-vis de la
liaison de composés « type-ciguatoxines » sur les canaux sodiques de synaptosomes de
cerveaux de rats. Les CTXs marquées n‟étant pas disponibles, elles ont été remplacées
par la brévétoxine-3 (PbTx-3) tritriée. Cette toxine présente en effet d‟étroites analogies
avec les CTXs quant à sa structure et à son mode d‟action.

Suite à ces criblages, des travaux supplémentaires de phytochimie utilisant les
deux tests ci-dessus ont été menés.
Ce travail de recherche a collectivement conduit à quatre publications dans des
revues internationales à comité de lecture, une soumission de revue et deux en
préparation; certaines d‟entre elles ont été incluses dans cette thèse de façon appropriée.
Ce travail a également mené à une déclaration d‟invention (Annexe 1).
57
La première partie de ce travail a essentiellement été réalisée à l’Institut de
Recherche pour le Développement du Centre de Nouméa et à l’Institut de
Pasteur de Nouvelle-Calédonie en collaboration avec ma collègue Mariko
Matsui.
J’ai eu l’opportunité, au cours de mon doctorat de réaliser un stage de 3
mois au Laboratoire de Pharmacochimie des Substances Naturelles et
Pharmacophores Redox (UMR 152-UPS-IRD dirigé par Mme la Professeur
Françoise Nepveu) à Toulouse, sous la responsabilité du Dr. Karine Reybier,
stage au cours duquel j’ai effectué le test au DPPH pour la recherche d’activités
antioxydantes.
Parallèlement, dans le cadre de la sélection de méthodes pour la
quantification de NO• produit par les cellules RAW 264.7 activées au LPS, j’ai
pu mettre en place un protocole utilisant l’appareil de Résonance
Paramagnétique Électronique. Cette technique ayant pour défaut une grande
consommation de toxine, nous n’avons pas pu poursuivre les études de mesure
de NO• induit dans ces cellules par la P-CTX-1B. Les quelques résultats
préliminaires obtenus ne seront donc pas présentés dans le cadre de cette thèse.
En ce qui concerne la deuxième partie de la thèse, les expériences
d’interaction ligand-récepteur se sont déroulées à l’Institut Louis Malardé de
Tahiti au Laboratoire de Recherche sur les Micro-algues Toxiques (LMT dirigé
par le Dr. Mireille Chinain). Une grande partie de cette étude a été effectuée
par le Dr. Taiana Hèléne Darius à qui j’avais fourni les extraits de plantes et
ensuite les fractions et le produit pur. J’ai néanmoins pu effectuer un stage de 5
jours à l’Institut Louis Malardé ce qui m’a permis de découvrir les bases de ce
test.
Les analyses d’élucidation de structure des produits isolés ont été faites par
le Dr. Nicolas Fabre (UMR 152-UPS-IRD à Toulouse).
48
PARTIE 1
Modulation de la synthèse d’oxyde
nitrique (NO•) par la P-CTX-1B
58
Étude du potentiel inducteur d’oxyde nitrique
(NO•) de la P-CTX-1B
I.
Cadre d’étude
La nécessité de trouver un médicament qui puisse traiter avec succès la ciguatera a
conduit à une analyse scientifique de l‟efficacité des remèdes traditionnels sur des
modèles in vitro et in vivo. Cependant, ces études ont été entravées par les difficultés
inhérentes à l‟acquisition de toxines pures et par l‟absence de tests biologiques pratiques,
rapides, peu coûteux et pharmacologiquement judicieux (Section II, Introduction
générale).
Les CTXs sont connues pour se lier sélectivement sur le site 5 des canaux sodiques
dépendants du potentiel (CSDP) et les maintenir en position ouverte même au potentiel
de repos de la membrane cellulaire. Ce blocage résulte en un influx d‟ions sodium (Na+)
qui entraîne des dérégulations électrophysiologiques et osmotiques dans les neurones
excitables et dans certaines cellules non-excitables (cf. Al-Sabi et al., 2006 ; Lewis et al.,
2000 ; Nicholson et Lewis, 2006 ; Wang, 2008). D‟autres études ont démontré que les
CTXs pouvaient également induire l‟activation sélective de canaux calciques de type L et
le blocage de canaux potassiques dépendants du potentiel (Nicholson et Lewis, 2006 ;
Sauviat et al., 2006).
Cependant, vu la complexité et les aspects multiples du syndrome ciguatérique chez
l‟homme, la dérégulation de canaux ioniques ne peut à elle seule expliquer l‟action des
CTXs (Dechraoui et al., 1999). Ainsi, certains médicaments classés comme modulateurs
de canaux sodiques (tocainide, mexiletine et amitriptyline) ou de canaux calciques
(gabapentine et nifedipine) (Nicholson et al., 2002 ; Nicholson et Lewis, 2006) n‟ont pas
montré une grande efficacité dans le traitement des patients atteints de ciguatera. En effet,
les patients souffrant de cette intoxication manifestent une combinaison complexe de
symptômes variant de manifestations gastrointestinales à neurologiques et avec, pour les
cas sévères, des problèmes cardiovasculaires (Bagnis et al., 1979 ; Gillespie et al., 1986).
Partie 1: Modulation de la synthèse de NO• par la P-CTX-1B
59
Il est rapporté parfois que des symptômes comme le prurit, la paresthésie des
extrémités, les myalgies, les arthralgies, la fatigue généralisée, les malaises, la dépression
ou l‟irritabilité ont duré des semaines voire des mois, ou ont ressurgi des années plus tard
(Friedman et al., 2007 ; 2008 ; Lehane et Lewis, 2000 ; Ruff et Lewis, 1994). Observée
plus particulièrement dans le Pacifique, la chronicité de ces symptômes neuromusculaires
et neuropsychiatriques évoque le syndrome de fatigue chronique (CFS), aussi appelé
encéphalomyélite myalgique (Chateau-Degat et al., 2007 ; Gillespie et al., 1986 ;
Racciatti et al., 2001). Des molécules de structure proche des CTXs ont été détectées dans
des échantillons de sang de certains patients atteints de CFS (Hokama et al., 2003).
De nombreux travaux scientifiques sur le CFS ont montré que ce syndrome était
modulé par la surexpression de facteurs inflammatoires tels que le NO• et des cytokines
circulantes (Buchwald et al., 1997 ; Cannon et al., 1999 ; Gupta et al., 1997 ). Ceci nous a
conduit à avancer l‟hypothèse d‟un lien éventuel entre la ciguatera et le système
inflammatoire. Ce lien est appuyé par l‟observation de deux désordres inflammatoires
chez certains patients souffrant ou ayant souffert de la ciguatera : le syndrome de
Guillain-Barré (une neuropathie inflammatoire aigüe) et la polymyosite (une
inflammation musculaire chronique) (Angibaud et Rambaud, 1998 ; Gatti et al., 2008 ;
Stommel et al., 1991 ; 1993). Par ailleurs, en raison de son caractère distinctif de
symptômes neurologiques de longue durée, la ciguatera est souvent diagnostiquée à tort
comme la sclérose en plaque (Ting et Brown, 2001). Il a d‟ailleurs été montré que
l‟iNOS, une des enzymes responsables de la production de NO•, était surexprimée chez
des patients atteints de cette maladie neurologique auto-immune (Bagasra et al., 1995 ;
Bö et al., 1994).
Une production excessive de cytokines inflammatoires stimule l‟iNOS pour générer
du NO•. Les cytokines sont des médiateurs chimiques qui orientent les réponses
immunitaires et participent aux phénomènes inflammatoires (Oberholzer et al., 2000). Il
est admis qu‟à des taux physiologiques, le NO• joue un rôle majeur dans la régulation de
la pression sanguine et dans le tonus vasculaire. Toutefois, la libération incontrôlée du
NO• par l‟iNOS module l‟hypotension et est impliquée dans les mécanismes qui soustendent la dysfonction cardiovasculaire (Moncada et Higgs, 2006). Cela a été observé
dans des cas sévères de ciguatera (Ruff et Lewis, 1994). En outre, des démangeaisons
persistantes souvent ressenties dans les cas chroniques peuvent être présentées comme
60
une allergie dermatologique (Baden et al., 1995 ; Ruff et Lewis, 1994). Il a en effet été
montré que l‟expression de l‟iNOS augmente significativement durant la pathogénèse de
maladies urticaires chez la souris et l‟homme (Bécherel et al., 1997).
L‟étude du mode d‟action des CTXs sur les érythrocytes humains et de grenouilles a
mis en évidence leur gonflement provoqué par l‟entrée d‟ions calcium (Ca 2+) qui serait à
l‟origine d‟une cascade d‟événements impliquant l‟activation de l‟oxyde nitrique
synthétase (Sauviat et al., 2006). L‟équipe de Ryan et collaborateurs (2007) a également
constaté l‟implication du système inflammatoire chez les souris injectées avec la P-CTX1B. Cette implication pourrait expliquer non seulement la diversité mais aussi la durée
des symptômes observées chez les malades ciguatériques.
Ainsi, sur la base de la nature inflammatoire des symptômes de la ciguatera décrits
dans la littérature et nos résultats antérieurs, nous avons décidé d‟entreprendre la présente
étude afin de démontrer la capacité de la P-CTX-1B à activer l‟iNOS et à générer le NO•
dans les cellules de macrophages murins (RAW 264.7).
II.
Introduction sur l’oxyde nitrique (NO•) et l’oxyde
nitrique synthétase inductible (iNOS)
Bien qu‟étant une des molécules les plus simples de la nature, l‟oxyde nitrique
(monoxyde d‟azote ou radical NO•) est d‟un intérêt tout particulier. Messager secondaire
peu ordinaire, le NO• influence pratiquement toutes les fonctions physiologiques de
l‟organisme, agissant à la fois comme un neurotransmetteur, un autacoïde, un médiateur
constitutif, un médiateur inductible, une molécule cytoprotective ou une molécule
cytotoxique. Toutefois, une altération dans sa production in vivo entraîne une variété de
situations pathologiques (voir les revues de Conner et Grisham, 1995 ; Moncada et Higgs,
1993 ; Singh et Evans, 1997 ; Tuteja et al., 2004).
61
II.1 Biologie du NO•
Le NO• endogène est synthétisé dans de nombreux type de cellules à partir de Larginine et d‟oxygène moléculaire (O2) sous le contrôle enzymatique d‟une famille
d‟enzymes appelées collectivement NO synthétases (NOSs). Il existe trois isoformes
distinctes de NOS qui sont les produits de gènes différents : la NOS neuronale (nNOS –
dite aussi de type I), la NOS inductible (iNOS – dite aussi de type II), et la NOS
endothéliale (eNOS – dite aussi de type III)1. En règle générale, comme les isoformes
eNOS et nNOS sont constitutionnellement exprimées, elles sont aussi collectivement
dénommées NOS constitutives (cNOS). Quant à l‟iNOS, elle n‟est normalement pas
présente mais peut apparaître en quelques heures sous l‟influence de stimuli très variés
parmi lesquels de nombreux produits bactériens comme le LPS, ou plusieurs cytokines
pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α),
l‟interleukine-1 beta (IL-1β) et l‟interféron gamma (IFN-γ), ou encore les radicaux libres
de l‟oxygène (Alderton et al., 2001 ; Feihl et Liaudet, 2002 ; Förstermann et al., 1998 ;
Michel, 1999 ; Xie et Nathan, 1994).
Les trois isoformes2 partagent un schéma catalytique global (Fig. 1) dans lequel ces
enzymes dimériques convertissent, par oxydation, l‟acide aminé L-arginine en Lcitrulline, tout en générant du NO•. Cependant, les activités enzymatiques des trois
isoformes diffèrent dans leur dépendance au Ca2+. Conséquence de cette régulation3, les
cNOSs ne produisent du NO• à vitesse maximale que de manière intermittente en réponse
à des signaux calciques et sont donc associées à une production de NO• à des taux
physiologiquement bas de l‟ordre du nano-molaire. Cette propriété de la nNOS et de
l‟eNOS
est
adaptée
à
leur
rôle
dans
les
phénomènes
de
signalisation.
1
Ces enzymes sont désignées sous deux appellations : l‟appellation classique nNOS, iNOS et eNOS qui
reflète leur caractérisations initiales respectivement dans le tissu neuronal, les macrophages (ou autres
cellules immunitaires) et dans les cellules endothéliales, et l‟appellation officielle NOS1, NOS2 et NOS3
qui reflète plutôt l‟ordre de l‟isolement et la caractérisation des clones du génome humain.
2
La NOS est un très gros complexe dont l‟activité dépend d‟un certain nombre de cofacteurs tels que la
tétrahydrobioptérine (BH4), des flavines adénine dinucléotide (FAD) et mononucléotide (FMN), l‟hème et
la calmoduline, et des co-substrats, comme l‟O2 et le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
(NADPH).
3
L‟activité des eNOS et nNOS est régulée par la liaison du Ca2+ à la calmoduline, et ainsi ces cNOS
requièrent des concentrations élevées de Ca2+ cytosolique. En revanche, du fait de sa très forte liaison à la
calmoduline, l‟activité de la iNOS, est indépendante du Ca2+.
53
Figure 1: Biosynthèse d‟oxyde nitrique (NO•) par la NOS d‟après Torreilles (2001).
Le NO• endogène est synthétisé à partir de L-arginine dans une réaction catalysée par les
oxyde nitrique synthétases (NOSs). Les électrons sont fournis par le NADPH au domaine
réductase (partie C-terminale) de l'enzyme. La liaison de la calmoduline chargée en Ca 2+
permet le transport de ces électrons jusqu'au groupement hème situé dans le domaine
oxygénase (partie N-terminale) des isoformes eNOS et nNOS. Celui-ci active alors 1‟O2.
Il en résulte l'oxydation successive de la L-arginine en N-hydroxy-L-arginine, puis en Lcitrulline avec libération de NO•. Les cofacteurs BH4, FMN et FAD sont aussi requis.
62
Au contraire, pour autant que les substrats, O2 et L-arginine, soient présents en
quantité suffisante, l‟expression de l‟iNOS entraîne toujours une production de NO• à
haut débit, de l‟ordre du micro-molaire, et sur des périodes plus soutenues (Alderton et
al., 2001 ; Bogdan, 2001 ; Feihl et Liaudet, 2002 ; Xie et Nathan, 1994).
Le rôle du NO• dans les milieux biologiques est dicté par sa chimie. Le NO• est une
petite molécule lipophile et de nature gazeuse qui, pour cette raison, traverse facilement
les membranes cellulaires pour y activer ses cibles moléculaires. En vertu d‟un électron
non apparié, le NO• répond à la définition d‟un radical libre, mais n‟est pas pour autant
très réactif en lui-même. Il possède néanmoins un large éventail d‟effets biologiques,
physiologiques et pathologiques, basés sur l‟une ou l‟autre des trois groupes distincts de
réactions : avec les métaux de transition (Fe2+, Fe3+, Cu+, Cu2+, etc.), avec l‟O2, ou avec
-
les autres radicaux libres comme l‟ion superoxyde (O2• ). L‟interaction préférentielle avec
telle ou telle molécule dépend de la concentration de NO libérée localement (Feihl et
Liaudet, 2002 ; Grisham et al., 1999 ; Wink et Mitchell, 1998).
Etant donné que le NO• produit par ces trois isoformes est associé à des processus
physiologiques particuliers4, des défauts dans leur expression, conduisant à un excès ou à
déficit dans la production du NO•, peuvent entraîner le développement de nombreuses
pathologies5 dans le cadre d‟un même évènement physiologique (voir les revues Billiar,
1995 ; Grisham et al., 1999 ; Kröncke et al., 1998 ; Lowenstein et al., 1994 ; Mayer et
Hemmens, 1997 ; Moncada et Higgs, 1993 ; Moshage, 1997 ; Nathan, 1992 ; Singh et
Evans, 1997 ; Wink et Mitchell, 1998 ; Wink et al., 2001).
4
Principalement impliquées dans les processus biochimiques et physiologiques de l‟homéostasie, eNOS et
nNOS jouent un rôle dans la régulation de la transduction du signal, le péristaltisme, la relaxation des
muscles lisses et la neurotransmission. Les autres effets vitaux des cNOSs incluent l‟inhibition de
l‟agrégation plaquettaire, la modulation de la pression artérielle et la potentialisation de la mémoire à long
terme. Quant au NO• produit par l‟iNOS dans les cellules de macrophage activées, il agit comme agent
cytotoxique dans la défense immunitaire contre les microorganismes et les cellules tumorales.
5
Cependant, une altération dans l‟expression correcte des cNOSs peut conduire à plusieurs conditions
pathophysiologiques telles que l‟hypertension, l‟athérosclérose, les maladies coronaires, les attaques
cardiaques, l‟hypertension pulmonaire, l‟impuissance, les complications vasculaires dans le diabète sucré,
les ulcères gastro-intestinaux, l‟asthme et autres désordres systémiques ou du CNS. En outre, suite à
l‟activation de l‟iNOS, les hauts niveaux de NO• produits engendrent un certain nombre de maladies
inflammatoires chroniques comme le diabète juvénile, l‟arthrite, l‟hépatite, les maladies inflammatoires de
l‟intestin, les chocs septiques et hémorragiques, et certains désordres auto-immuns comme la sclérose
multiple ou sclérose en plaque (SEP). L‟expression chronique du NO• est aussi associée à divers
carcinomes.
63
Pour conclure ce survol biologique, le NO• se caractérise par une intrication d'effets
potentiellement favorables et dangereux pour l'hôte. Par conséquent, une intervention sur
sa production pourrait se révéler propice à des fins thérapeutiques. Pour notre présente
étude, nous nous sommes intéressés particulièrement à la voie de transduction du signal
impliquant l‟enzyme iNOS.
II.2 La quantification du NO• et de l’iNOS
Il est maintenant admis que l‟augmentation de la production de NO• suivant
l‟induction de l‟iNOS est impliquée dans la pathogénèse de l‟inflammation (Korhonen et
al., 2005 ; Kröncke et al., 1998 ; Nussler et Billiar, 1993). Cette voie de transduction peut
être régulée à de multiples niveaux6. Ainsi chaque séquence d‟événement, de l‟activation
du gène de l‟iNOS à l‟expression de la protéine iNOS jusqu‟à la production du NO•, peut
être identifiée comme une cible thérapeutique potentielle (Aktan, 2004). De nos jours,
nous disposons de nombreux outils moléculaires, biochimiques et pharmacologiques pour
pouvoir doser ces différentes cibles. Grâce à ces techniques et à la cascade d‟évènements
de la voie du iNOS/NO•, plusieurs cibles peuvent être exploitées, donnant ainsi de
multiples possibilités de criblage de nos plantes médicinales utilisées dans le traitement
de la ciguatera.
II.2.1
Méthodes d’évaluation de la production du NO•
Les propriétés chimiques et physiques du NO•, sa réactivité, sa rapidité de diffusion,
sa courte demi-vie de 6 à 50 secondes et le fait que les concentrations de ce radical
varient du pico- à la micromole dans les milieux biologiques, compliquent sa
quantification (Archer, 1993 ; Hetrick et Schoenfisch, 2009). Malgré ces difficultés,
plusieurs méthodes directes et indirectes de détermination du NO• et de ses produits ou
métabolites ont émergé.
Les tests de détection directe du NO• incluent la détection par chimioluminescence,
la fluorimétrie, la spectrophotométrie, la résonance paramagnétique électronique (RPE) et
la détection électrochimique.
6
L‟expression de l‟iNOS est essentiellement régulée au niveau transcriptionnel (cytokines, facteurs de
transcription, etc.) mais également au niveau post-transcriptionnel, translationnel et post-translationnel.
64
Les méthodes indirectes comprennent la détermination de la L-arginine, la L–
citrulline ou de métabolites biologiques stables du NO• comme les nitrites, les nitrates,
les S-nitrosothiols, la 3-nitrotyrosine par la spectrophotométrie, la fluorimétrie, la
chromatographie, la spectroscopie de masse, l‟électrophorèse ou la radiométrie (voir les
revues d‟Archer, 1993 ; Nagano, 1999 ; Tarpey et al., 2004 ; Yao et al., 2004 pour toutes
ces techniques).
Chacune de ces méthodes présente des avantages et des inconvénients. La
chimioluminescence est la méthode de détection directe du NO• la plus sensible et la plus
spécifique mais le détecteur est coûteux et nécessite une importante maintenance, ce qui
le rend inaccessible à de nombreux laboratoires (Archer et al., 1995 ; Ridnour et al.,
2000). En outre, si cette méthode est très utile pour les applications liées au gaz exhalé,
elle n‟est pas efficace dans la détection du NO dans les liquides biologiques (Yao et al.,
2004), en particulier dans les échantillons contenant de l‟albumine ou du sang qui ont
tendance à former de la mousse durant les tests (Archer, 1993).
La détection par microcapteurs électrochimiques permet la détection en temps réel et
semble une technique prometteuse pour les mesures in vivo. Cependant, cette technique
n'a pas trouvé une large application en raison d‟un encrassement naturel et d'une
information uniquement spatiale, influencée par le placement de l'électrode (Brunet et al.,
2000 ; Zhang, 2004).
L‟utilisation de sondes fluorescentes permet un monitoring temporel et spatial in vivo
et in situ à des limites de détection très basses (Gomes et al., 2006). Cette technique
souffre toutefois d‟interférences avec les fluides biologiques et d‟une faible stabilité des
sondes (Yao et al., 2004). De plus, pour beaucoup de laboratoires, un investissement dans
la fluorimétrie reste relativement onéreux.
La RPE permet une quantification directe du NO• dans des modèles in vitro et in
vivo. Cette technique admet néanmoins une limite de détection relativement élévée (1
µM) et son lourd appareillage ne lui permet pas d‟être utilisée en routine (Archer, 1993 ;
Yao et al., 2004).
65
La détection indirecte par chromatographie associée à la spectrométrie de masse a
également fourni un moyen sensible de mesure de la concentration du NO• dans des
solutions, mais ces méthodes requièrent des instruments coûteux et très spécialisés,
nécessitant un personnel hautement qualifié ainsi que des frais de maintenance élevés
(Ridnour et al., 2000).
Pour les mesures par spectrophotométrie, les taux de NO• sont évalués soit
directement en quantifiant la formation de méthémoglobine à la suite de l‟oxydation
induite par le NO• de l‟oxyhémoglobine, soit indirectement par l‟analyse de la
concentration en nitrites en utilisant le test de Griess. La détection du NO• par
spectrophotométrie via l‟oxydation des oxyhémoglobines est limitée car ce composé est
assez instable, non disponible dans le commerce et doit donc être préparé avant chaque
test (Nims et al., 1995 ; Ridnour et al., 2000). Considérant la capacité oxydante de NO•,
d‟autres
réactifs
comme
le
ferricyanure
ou
l‟ABTS
[(2,2‟-azion-bis-
(3-
ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)] peuvent également être utilisés à la place des
oxyhémoglobines. L‟oxydation par le NO• induit un changement dans la couleur
quantifiable par spectrophotométrie. Bien que relativement simple et facile à mettre en
place, ces essais ne sont pas spécifiques car d‟autres espèces réductrices produites
pendant l'activité normale des cellules pourraient intervenir dans l‟oxydation de ces
produits (Yao et al., 2004).
Quant au test de Griess, il n‟est pas sujet à de telles interférences (Yao et al., 2004).
Ce test est rapide et facile à mener pour une estimation indirecte du NO• via la mesure
-
des nitrites (NO2 ). Bien qu‟elle ne soit pas aussi sensible (de l‟ordre de la micromole)
que la chimioluminescence et que des particules colorées ou en suspension dans les
échantillons peuvent interférer dans les lectures spectrophotométriques, cette technique
représente la solution la plus simple pour quantifier les émissions du NO•, même pour les
laboratoires ne disposant que d‟un équipement de base (Archer et al., 1995 ; Miranda et
al., 2001).
II.2.2
Méthodes d’évaluation de l’expression de l’iNOS
La voie de transduction du signal conduisant à la production du NO• via l‟activation
de l‟iNOS consiste en une longue chaîne d‟événements qui implique la transcription de
66
l‟acide désoxyribonucléique (ADN) en acide ribonucléique messager (ARNm), suivie par
sa traduction en un produit protéique actif (Aktan, 2004). Les récents progrès dans les
techniques moléculaires et immunochimiques ont ouvert la voie à de nombreuses
méthodes d‟analyse qui permettent de quantifier, en parallèle du NO•, les taux d‟ARNm
et de protéine iNOS.
Le Western Blot ou immunoblot est la méthode utilisée pour détecter une protéine
dans un échantillon donné d‟homogénat de tissu ou d‟extrait via des anticorps
spécifiques. Bien que spécifique pour détecter une protéine particulière, les limites du
Western blot sont nombreuses. La procédure nécessite du temps et un travail laborieux,
souffre d‟un manque de précision quantitative, et son interprétation reste largement
subjective (analyse quantitative ou seulement semi-quantitative). Sa haute sensibilité et
spécificité dépendent de la standardisation de la technique et requièrent une grande
qualification des manipulateurs ainsi qu‟une bonne organisation du laboratoire. D‟autres
techniques utilisant également des anticorps peuvent servir à la détection des protéines
dans les tissus (immunohistochimie) et les cellules (immunocytochimie) : elles sont de
plus en plus utilisées dans la détection de l‟iNOS (cf. Chandler et Colitz, 2006 ; Crabbé et
Laga, 1999).
Basée sur la réaction de polymérisation en chaîne, la qPCR est une technique
d‟amplification permettant de multiplier les copies d‟une séquence spécifique d‟acides
nucléiques, et est un puissant outil pour mesurer l‟expression différentielle des gènes au
niveau des ARNm. Du fait de sa très grande sensibilité, la qPCR est une méthode de
choix pour déterminer quantitativement ou semi-quantitativement l‟expression relative de
gènes qui sont exprimés à un niveau très bas dans un test à haut débit (cf. Bustin, 2000 ;
Chandler et Colitz, 2006). Bien que très rapide, ce test reste relativement cher, nécessitant
des réactifs et un matériel sophistiqués.
III. La sélection et le principe des tests
Compte tenu de la panoplie de techniques décrites ci-dessus, un certain nombre de
ces méthodes peut être appliqué à notre présente étude pour confirmer si la P-CTX-1B, la
CTX la plus toxique et majoritaire dans le Pacifique, induit la production de NO• et si ce
67
haut niveau de production résulte bien de l‟activation enzymatique de l‟iNOS. La
sélection des méthodes fut fondée sur ce qui semblait le plus approprié à notre étude et en
même temps a été arbitrée en fonction des possibilités du laboratoire en termes de
matériel, d'équipements et d'expertise. La disponibilité en P-CTX-1B pure étant un
facteur extrêmement limitant, l‟évaluation du NO•, en plus d'être robuste et précise,
devait donc être miniaturisée.
En conséquence, le test de quantification indirecte du NO• par le TG, en utilisant le
spectrophotomètre pour microplaques, a été retenu. Ensuite, la technique de qPCR a été
utilisée afin de confirmer que la production du NO• résultait bien de l'activation
enzymatique de l‟iNOS. Une brève introduction aux principes de cette technique est
décrite ci-dessous.
III.1 Test de Griess – Test biochimique
Cette méthode repose sur la réaction des deux composés, sulfanilamide et N-naphtyléthylènediamine (NED), avec des ions nitrites en milieu acidifié. 7 Le NO• produit par les
cellules est spontanément converti en nitrite et relargué dans les surnageants cellulaires.
La réaction des nitrites au réactif de Griess conduit à la formation d‟un complexe coloré
de rose à pourpre. En absence de nitrite, le réactif reste incolore. La formation de
chromophore dont l‟intensité dépend de la concentration en nitrite dans les échantillons
est ensuite mesurée par spectrophotométrie à la longue d‟onde de 540 nm (Ivanov, 2004 ;
Miranda et al., 2001).
III.2 Réaction de Polymérisation en Chaîne quantitative – Test
biomoléculaire
La technique PCR est fondée sur l‟amplification des séquences d‟ADN, permettant
d‟identifier leur présence. La qPCR étend l‟utilité de la PCR grâce à la quantification de
cette amplification par l‟incorporation d‟un agent intercalant fluorescent mesurée au
cours de la phase exponentielle du processus.
7
Il s‟agit d‟une réaction de diazotation en deux étapes : les nitrites forment un sel de diazonium avec la
sulphanilamide qui est ensuite couplé avec la N-(1-naphthyl)ethylène-diamine ce qui génère un colorant
azoïque qui absorbe à 540 nm.
68
La PCR repose sur deux principes. Elle est basée premièrement sur la capacité de
l‟ADN polymérase à synthétiser les brins complémentaires d‟une molécule d‟ADN à
partir d‟une molécule d‟ADN matrice, donnant ainsi naissance à une molécule d‟ADNc
double-brin. Pour initier le processus sur chaque brin, un petit segment d‟acide nucléique
de séquence complémentaire à celle du brin à amplifier doit s‟y associer afin de servir
d‟amorce. Le deuxième principe de la PCR repose sur le contrôle de la température qui
est ainsi associée aux différentes étapes de dénaturation, hybridation et élongation de
cette technique. En effet, la PCR consiste en une succession cyclique de ces trois étapes.
La première étape d‟une PCR classique consiste en la séparation par la chaleur des
deux brins d‟ADN par rupture des liaisons hydrogènes, et la deuxième en l‟hybridation
des amorces complémentaires à ces brins d‟ADN. Cette association est finalement suivie
de leur élongation par l‟enzyme polymérase, aboutissant ainsi à la synthèse d‟un ADNc
double brin. Ainsi chaque cycle, correspond au doublement du nombre de copies de
l‟information génétique (Ameziane et al., 2005 ; Tse et Capeau, 2003).
L‟amplification du matériel génétique à partir de l‟ARNm nécessite une étape
supplémentaire en début de cycle. La transcriptase inverse est une enzyme qui transcrit
l‟information génétique de l‟ARNm en ADNc. Cette propriété est très utile car
l‟utilisation de l‟ADNc simple brin produit par la reverse transcriptase permet d‟effectuer
par la suite une PCR classique.
Ainsi, en ajoutant des séquences d‟amorce spécifique, par exemple celle de l‟iNOS,
nous pouvons sélectionner l‟amplification des molécules d‟ADNc correspondantes aux
molécules d‟‟ARNm cibles de départ. L‟intensité de la fluorescence, qui augmente
proportionnellement à chaque molécule d‟ADN amplifiée, est mesurée en fin
d‟élongation de chaque cycle de la qPCR. Ce test permet donc de mesurer la cinétique
d‟accumulation d‟une séquence d‟information génétique ciblée par la fluorescence dans
un délai très bref, avec en plus l‟avantage de ne nécessiter aucun traitement post-PCR,
permettant une diminution considérable du risque de contamination du produit de PCR.
69
IV. Matériel, méthodes et résultats
Pour ces expérimentations, deux lignées cellulaires furent
utilisées :
les
neuroblastomes Neuro-2a (utilisées préalablement pour évaluer la cytotoxicité induite par
les CTXs) et les macrophages RAW 264.7 (utilisés généralement pour analyser
l‟expression de l‟iNOS). Ces cellules cultivées en masse en flacons de culture de 75 cm 2,
ont été incubées dans le même milieu, mais en microplaques à 24 et 96 puits pour les
expériences. Leur réponse à l‟addition de P-CTX-1B fut analysée comparativement à
celle du LPS, endotoxine bactérienne facilement disponible et reconnue pour son pouvoir
inducteur de l‟iNOS et sa capacité à produire des concentrations significatives de NO•.
Pour le TG, les valeurs de densité optique ont été enregistrées à 540 nm à l‟aide d‟un
spectrophotomètre pour microplaque à 96 puits. Quant à la réaction de qPCR, la
fluorescence a été mesurée à 522 nm dans un spectrofluorimètre à 32 tubes capillaires
portés sur un caroussel (LightCycler 2.0, Roche Applied Science, Auckland, New
Zealand).
Ce travail a fait l‟objet d‟une publication dans le journal Nitric Oxide (Publication 1).
Les matériels et les méthodologies utilisés ainsi que les résultats obtenus y sont décrits.
Publication 1
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Chinain, M., Laurent, D., Pauillac, S., 2008. Modulation of
inducible nitric oxide synthase gene expression in RAW 264.7 murine macrophages by
Pacific ciguatoxin. Nitric Oxide, 19, 21-28.
70
Publication 1: Modulation de la synthèse de NO• par la P-CTX-1B
71
72
73
74
75
76
77
78
V. Discussion et conclusion
Les données obtenues à partir des études in vitro menées avec le TG et la qPCR
confirment notre hypothèse de l‟induction de la production de NO• par la P-CTX-1B
dans les macrophages murins RAW 264.7 via la surexpression de l‟enzyme iNOS. En
effet, nos expériences ont démontré que la P-CTX-1B tout comme le LPS induisent une
production de nitrite de façon dose-dépendante. Il doit être souligné que cette
surproduction du NO• n‟a été observée qu‟avec les RAW 264.7 et non pas avec les
cellules Neuro-2a.
Cette différence montre que la lignée cellulaire Neuro-2a utilisée pour étudier la
cytotoxicité induite par les CTXs n‟est pas adaptée à la présente recherche. L‟étude
bibliographique confirme que les Neuro-2a ne sont que peu utilisées pour de telles
expériences, à l‟inverse des RAW 264.7 qui sont largement mises à contribution pour
étudier la voie iNOS/NO•. Pour cette raison, nos expérimentations ultérieures sur le
criblage de plantes exerçant une activité inhibitrice sur la surproduction de NO• ont été
menées sur cette lignée macrophagique.
Nous avons également évalué l‟effet du Nω-nitro-L-arginine methyl ester (LNAME), un inhibiteur non spécifique de NOS, sur la production de nitrite induite par la
P-CTX-1B dans le surnageant de cellules de RAW 264.7. Tandis que les cellules
stimulées par le LPS ou la P-CTX-1B produisent de fortes quantités de nitrite
(caractéristiques de la surexpression de l‟iNOS), le co-traitement par le L-NAME a
provoqué une forte inhibition de la production du NO•, révélée par une nette diminution
du taux de nitrite. Ces expériences ont confirmé que la production de NO• par la P-CTX1B était bien due à la modulation de l‟expression de l‟enzyme iNOS. Ainsi, pour
confirmer ces résultats chimiques, nous avons étudié la modulation de l‟expression de
l‟ARNm iNOS par la P-CTX-1B dans ces cellules. Les résultats de ces études par la
qPCR sont en bon agrément avec ceux obtenus avec le TG.
Finalement, cette modulation de l‟iNOS par la P-CTX-1B nous a conduit à étudier le
rôle probable des cytokines dans la ciguatera. Pour cela, nous avons utilisé le même
modèle cellulaire avec la comparaison LPS/P-CTX-1B. Ainsi le profil de l‟ARNm des
79
cytokines pro- et anti-inflammatoires induites par la P-CTX-1B fut évalué par qPCR
(Matsui et al., 2009a)8.
Bien que le rôle de cette surproduction de NO• via la surexpression de l‟enzyme
iNOS dans la ciguatera n‟ait pas été confirmé chez l‟homme, la nécessité d‟enrichir
l‟arsenal thérapeutique pour traiter cette intoxication, combinée à l‟implication probable
des mécanismes inflammatoires dans la pathologie, nous a conduit à analyser le potentiel
anti-inflammatoire des plantes utilisées dans les remèdes traditionnels. Au vue de notre
expérience, le TG offre le mode d‟évaluation le mieux adapté (coût, rapidité, et fiabilité)
à la mesure de l‟activité inhibitrice du NO•9 des plantes sélectionnées.
8
Ces travaux font l‟objet de la thèse de doctorat Mariko MATSUI, intitulée «Rôle des cytokines dans la
ciguatera : application à l'isolement et à l'étude du potentiel thérapeutique des principes actifs de remèdes
traditionnels ».
9
Ce terme « activité inhibitrice du NO » est relativement général et prend en compte à la fois une
inhibition de la production du radical et son élimination par piégeage ce qui se traduit par la baisse de sa
concentration.
57
PARTIE 2
Les études de criblage thérapeutique
80
Etude de criblage thérapeutique des plantes
utilisées pour traiter la ciguatera
I.
Cadre de l’étude
Le second objectif de cette thèse était d‟évaluer l‟efficacité des plantes utilisées dans
la médecine traditionnelle par les populations du Pacifique pour soigner la ciguatera
(Laurent et al., 2005).
Ainsi, deux approches expérimentales mimant les mécanismes pathogéniques des
CTXs, l‟induction du NO• et la liaison de ces toxines au site 5 des canaux sodiques furent
exploitées. Les tests basés sur la réaction de Griess et l‟interaction ligand-récepteur sont
les deux modèles in vitro correspondants qui ont été modifiés pour étudier,
respectivement, le potentiel thérapeutique de vingt-huit et vingt-quatre extraits de plantes.
Ces études ont permis de sélectionner trois extraits aqueux de plantes, Euphorbia
hirta, Vitex trifolia et Heliotropium foertherianum, qui furent soumis à un fractionnement
chimique bioguidé conduisant à l‟isolement et à la purification de trois molécules actives.
Les chapitres suivants décrivent séparément les expérimentations qui permirent
d‟évaluer l‟activité anti-inflammatoire et détoxifiante des plantes.
Partie 2: Études de criblage
81
Chapitre 1 : Evaluation du potentiel inhibiteur du
NO•
des
phytothérapies
utilisées
contre
la
ciguatera
I.
Introduction
Alors que la mesure du NO• est essentielle pour tirer des conclusions mécanistiques
sur la genèse et le déroulement de plusieurs évènements physiologiques ou
physiopathologiques, elle est également un complément nécessaire à l‟élaboration de
stratégies thérapeutiques. Etant donné sa forte implication dans les neuropathologies,
parmi d‟autres pathologies inflammatoires, la régulation de l‟iNOS fait maintenant l‟objet
d‟une grande attention.
Prenant en compte les symptômes de type inflammatoire observés dans la ciguatera,
nous avons démontré que le traitement de macrophages murins (RAW 264.7) avec la PCTX-1B provoquait une surexpression de l‟enzyme iNOS. Cette dernière conduit à une
surproduction du radical libre NO•, mise en évidence par un fort accroissement des
nitrites mesuré dans le surnageant cellulaire par le TG (Publication 1).
Nos études subséquentes montrèrent que la P-CTX-1B augmentait l‟expression de
certaines cytokines comme les interleukines (IL)-1β, IL-6, IL-10, et le facteur de nécrose
tumorale (TNF)-α dans ces cellules (Matsui et al., 2009a).
L‟implication du système inflammatoire dans la ciguatera a aussi été étudiée par Ryan et
collaborateurs (2007), qui via des puces à ADN, caractérisèrent la réponse génomique et
protéomique à une dose sublétale de P-CTX-1B dans le sang de souris injectées en i.p. Ils
conclurent que les profils d‟expression des gènes étaient comparables à la réponse
immunitaire de cellules T helper de type 2 (Th2) chez des modèles asthmatiques. Les
cellules Th sont impliquées dans l‟activation, la différentiation et la prolifération d‟autres
cellules immunes (macrophages, cellules B ou cellules tueuses naturelles) et leur
activation par un antigène entraîne la libération de cytokines (Meert et al., 2003). Les
cellules Th2 sont essentielles pour l‟immunité humorale ce qui pourrait expliquer le
Partie 2: Évaluation du potential inhibiteur du NO• des plantes
82
phénomène d‟hypersensitivité observé chez certains patients ciguatériques, bien que la
présence d‟IgE sériques spécifiques de CTXs n‟a jamais été démontrée.
Suite à ces récentes avancées, la nécessité d‟évaluer les plantes pour leur potentiel
anti-inflammatoire, devint évidente. Le TG est une méthode simple, peu onéreuse, rapide
et reproductible. Il permet aussi un criblage aisé des phytothérapies à moyenne échelle.
Ainsi, pour notre étude de l‟activité anti-inflammatoire des remèdes, nous avons choisi
d‟évaluer la capacité des extraits de plantes à réduire les taux de NO• produit par des
macrophages activés au moyen du TG.
II.
Matériel, méthodes et résultats
S‟appuyant sur les résultats de précédentes études in vitro reportés par Boydron-Le
Garrec et al. (2005a), 28 extraits aqueux préparés à partir de 25 plantes furent
sélectionnés (Tableau 1). Etant donné la rareté de la P-CTX-1B, le modèle cellulaire
inflammatoire a été établi par addition de LPS dans les milieux de cultures des
macrophages RAW 264.7.
Les extraits redissous dans l‟eau distillée ont été co-incubés à 4 concentrations
différentes (2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL) en présence de 10 µg/mL de LPS avec des
cellules RAW 264.7 cultivées en microplaques à 96 puits (Fig. 2). Après 24 h, l‟effet de
ces extraits de plantes sur l‟inhibition du NO• fut détecté via le TG et qualifié à l‟aide
d‟un spectrophotomètre pour microplaque équipé d‟un filtre à 540 nm.
Pour vérifier si la réduction de taux de nitrite n‟était pas due à la mortalité des
cellules, la cytotoxicité de ces 28 extraits (aux quatre concentrations étudiées) fut
parallèlement analysée (Fig. 2) via le test au MTT (3-[4,5-dimethylthiaol-2-yl]-2,5diphenyl tetrazolium bromide). Ce test colorimétrique quantitatif s‟appuie sur la capacité
sélective des cellules vivantes à réduire le sel de bromure de tetrazolium de couleur jaune
en des cristaux de formazan de couleur bleue. Les densités optiques ont été ensuite
mesurées à l‟aide d‟un spectrophotomètre pour microplaque équipe d‟un filtre à 490 nm.
83
Tableau 1 : Les espèces de plantes testées, leurs appellations communes en Nouvelle-Calédonie, les lieux de collecte, les parties de plantes récoltées et la
manière dont elles ont ensuite été extraites dans de l‟eau distillée, les poids de matières humides et de matières sèches.
Espèces de Plantes (Famille)
Artocarpus altilis (Parkinson)
Fosberg (Moraceae)
Synonymes
Artocarpus communis J.R. Forst. & G. Forst.
Artocarpus incisus L.f. (ou A. incisa L.)
Sitodium altile Parkinson
Noms Communs
Lieu de
Collection
Parties récoltées &
extraction*
Matière humide
(g)
Matière sèche
(g)
Arbre à pain
Yahoué
Macération de bourgeons
de feuilles et de latex
83,3
1,1
Capsicum frutescens L.
(Solanaceae)
Piments (ou piment
du Chili)
Naïna, La Foa
Macération de fruits
57,0
1,3
Carica papaya L. (Caricaceae)
Papayer
Fun Beach, Anse
Vata, Noumea
8,4
0,3
Faux manguier
CPS, Anse Vata,
Noumea
Décoction de fleurs d‟un
pied mâle
Homogénéisation du latex
libéré de pétiole de feuilles
dans l‟eau à 40°C
0,5
0,03
Cocotier
Fun Beach, Anse
Vata, Noumea
Décoction de racines
300,0
6,5
Naïna, La Foa
Décoction de rhizomes
50,0
2,6
Naïna, La Foa
Décoction de feuilles
55,0
2,8
Infusion de feuilles
90,0
4,4
70,0
3,0
Cerbera manghas L.
(Apocynaceae)
Cerbera odollam Gaertner ?
Cerbera lactaria Ham. ?
Cocos nucifera L. (Palmae)
Davallia solida (J.R Forst. & G.
Forst.) Swartz (Davalliaceae)
Dendrolobium umbellatum (L.)
Benth. (Papilionaceae)
Hedysarum umbellatum L.
Desmodium umbellatum (L.) DC.
Desmodium australe DC.
Meibomia umbellata (L.) Kuntze.
Dodonaea viscosa (L.) Jacq.
(Sapindaceae)
Duboisia myoporoides R. Br.
(Solabaceae)
Erythrina variegata var.
fastigiata Panch & Guillaumin
(Papilionaceae)
Euphorbia hirta L.
(Euphorbiaceae)
Diane & Hilger (Boraginaceae)
Ipomoea pes-caprae (L.) R.
Brown (Convolvulaceae)
Mise à eau,
Nouville, Noumea
Mise à eau,
Nouville, Noumea
Chamaesyce hirta (L.) Millsp.
Euphorbia capitata (Lam.)
Euphorbia pilulifera (Jaquin)
Euphorbia pilulifera L. var. hirta (L.) Thell.
Argusia argentea (L.f.) Heine
Messerschmidia argentea (L.f.) Johnston
Tournefortia argentea L.f.
Tournefortia arborea Blanco
Ipomoea pes-caprae subsp. brasiliensis (L.)
Van Ooststr.
Peuplier canaque
IRD, Anse Vata,
Noumea
Macération d‟écorce
300,0
5,2
Herbe à dysenterie
IRD, Anse Vata,
Noumea
Décoction de la plante
entière
43,7
2,5
80,0
2,4
Faux tabac
Propriété de
Rouvray, Anse
Vata, Noumea
jaunie
20,0
0,5
48,0
0,8
Liseron de mer
Fun Beach, Anse
Vata, Noumea
Décoction d‟écorce
84
Tableau 1 Les espèces de plantes testées, leurs appellations communes en Nouvelle-Calédonie, les lieux de collecte, les parties de plantes récoltées et la
manière dont elles ont ensuite été extraites dans de l‟eau distillée, les poids de matières humides et de matières sèches.
Espèces de Plantes (Famille)
Synonymes
Morinda citrifolia L. (Rubiaceae)
Pandanus tectorius Parkinson
(Pandanaceae)
Punica granatum L. (Punicaceae)
Rhizophora x selala (Salv.) Toml.
(Rhizophoraceae)
Saccharum officinarum L.
(Gramineae)
Scaevola sericea Vahl
(Goodeniaceae)
Macération de fruits
Grenadier
Lieu de
Collection
Rocher à la Voile
Anse Vata
IRD, Anse Vata,
Noumea
Naïna, La Foa
Matière humide
(g)
Matière sèche
(g)
123,2
8,6
266,0
1,2
837,5
42,0
Palétuvier rouge
Magenta, Ouémo
Décoction d‟écorce
50,0
10,0
Canne à sucre
Naïna, La Foa
Macération de tiges
1000,0
8,1
Mise à eau,
Nouville, Noumea
150,0
4,5
Faux poivrier
IRD, Anse Vata,
Noumea
90,0
37,0
Station de RFO,
Nouméa
360,0
13,9
Pomme cythère
80,0
9,9
Macération de racines
31,9
1,1
130,0
0,9
400,0
0,6
Mise à eau,
Nouville, Noumea
58,0
6,9
Ilot Corbeille,
Mara, La Foa
Macération d‟écorce de
racines
586,0
1,2
Noms Communs
Fromager
Pandanus veitchii Mast. & T. Moore
Pandanus
Scaevola taccada (Gaertn.) Roxb.
Lobelia taccada Gaertn.
Scaevola frutescens K. Krause
Scaevola koenigii Vahl
Schinus terebenthifolius Raddi
(Anacardiaceae)
Spondias cytherea Sonnerat
(Anacardiaceae)
Spondias dulcis Soland ex Parkinson
Stachytarpheta australis
Moldenke (Verbanaceae)
Stachytarpheta dichotoma (Ruiz & Pavón)
Vahl
Herbe bleue
Mise à eau, Cote
Blanche, Nouméa
Syzygium malaccense (L.) Merr.
& Perry (Myrtaceae)
Eugenia malaccensis L. not Lour.
Jambosa malaccensis (L.) DC.
Pomme canaque
SICAR, MotorPool, Noumea
Vitex trifolia L. (Labiateae)
Ximenia americana L.
(Olacaceae)
Vitex trifolia var. trifolia L.
V. lagundi Ridley
V. repens Blanco
Vitex rotundifolia L.f. ?
V. trifolia var. simplicifolia L.?
Vitex negundo L.?
Vitex ovate Thunb.?
Ximenia elliptica J.R. Forst
Ximenia inermis L.
Prunier canaque
* Toutes les extractions ont été faites en utilisant de l‟eau distillée comme décrites par Laurent et al. (1993).
? Plantes parfois reportées comme étant de la même espèce et parfois distinctes
Parties récoltées &
extraction*
aériennes
Décoction de fruits
85
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
vitro de l‟inhibition du NO• avec les extraits aqueux de plantes utilisées pour soigner la
ciguatera. Parallèlement, les potentiels cytotoxiques et d‟induction spontanée du NO• sont
évalués. Les contrôles négatifs présentent les plus fortes proportions (% v/v) de l‟eau distillée
utilisée (n = N × 2 ; N = 6).
Puits avec eau distillée
Macrophages RAW 264.7 à la densité de 5 × 104 cellules/puits incubés avec 10 µg/mL
de LPS et des concentrations croissantes d‟extraits de plantes (0, 2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL)
Macrophages RAW 264.7 à la densité de 5 × 104 cellules/puits incubés uniquement
avec des concentrations croissantes d‟extraits de plantes (0, 2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL)
85
Les valeurs de densité optique mesurées au spectrophotomètre sont souvent sujettes à des
interférences dues aux pigments et/ou particules non solubles contenus dans les extraits de
plantes. Afin d‟éliminer ou de minimiser ces influences indésirables, des contrôles négatifs
furent menés. Les cellules RAW 264.7 furent ainsi traitées uniquement avec les extraits de
plantes aux quatre concentrations (Fig. 2). De cette façon, nous avons pu également observer
si ces extraits de plantes pouvaient par eux même induire spontanément une production du
NO• et/ou une prolifération cellulaire.
En complément, nous avons entrepris l‟étude du potentiel antioxydant de ces 27 extraits
de plantes. Leur évaluation fut menée via leur potentiel de piégeage du radical DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl). En présence d‟un antioxydant, la coloration pourpre sombre du
DPPH s‟affaiblit avec le temps. Cette expérience fut effectuée en utilisant des cuves jetables
et un spectrophotomètre UV/Vis (à 530 nm).
Ce travail a fait l‟objet d‟une publication dans Journal of Ethnopharmacology
(Publication 2). Le matériel, la méthode et les résultats obtenus y sont décrits.
Publication 2
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Reybier, K., Darius, H.T., Chinain, M., Pauillac, S., Laurent,
D., 2009. Ability of certain plant extracts traditionally used to treat ciguatera fish poisoning to
inhibit nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages. Journal of Ethnopharmacology,
123, 369-377.
86
Publication 2: Évaluation du potential inhibiteur du NO• des plantes
87
88
89
90
91
92
93
94
95
III. Discussion
III.1 Les tests biochimiques
Après 24 h d‟incubation, les résultats des deux tests, TG et au MTT, sont analysés. Aucun
effet d‟interférence ne fut observé dans les témoins négatifs lors du test au MTT pour les 28
extraits de plantes, ce qui ne fut pas le cas avec le TG. En effet, de nombreux surnageants
contenant des extraits de plantes à la concentration de 2500 µg/mL furent saturés par la
couleur des pigments des plantes. Par conséquent, les données obtenues à ces concentrations
de plantes ne furent pas prises en considération. Cependant, aucun de ces 28 extraits de
plantes ne provoqua une inhibition du NO• aux deux plus faibles concentrations de 2,5 et 25
µg/mL. En revanche, des données intéressantes furent obtenues avec les traitements à la
concentration de 250 µg/mL. Les données obtenues à cette concentration furent donc
analysées (voir l‟annexe 2 pour l‟intégralité des données).
Parmi les 28 extraits de plantes testés, 16 furent capables de réduire significativement les
taux de nitrite dans les surnageants cellulaires. De ces 16 extraits aqueux, ceux à partir de la
plante entière d‟ Euphorbia hirta, de feuilles et d‟écorce de Syzygium malaccense, de feuilles
de Schinus terebenthifolius et de Vitex trifolia, de fruits de Punica granatum, du latex de
Cerbera manghas, de racines de Ximenia americana et de racines aériennes de Pandanus
tectorius montrèrent une plus ou moins forte activité inhibitrice du NO• sans manifester de
cytotoxicité ni d‟effets inducteurs dans les 24 heures.
Nous avons constaté que les extraits aqueux provenant d‟écorce d‟Heliotropium
foertherianum (anciennement nommé Argusia argentea), d‟Erythrina variegata var.
fastigiata, de Rhizophora x selala, et de Spondias cytherea, de racines d‟Ipomoea pes-caprae
et de Stachytarpheta australis, de feuilles de Dodonaea viscosa, de tiges de Saccharum
officinarum et de bourgeons de feuilles et de latex d‟Artocarpus altilis étaient capables
d‟induire une surproduction spontanée du NO• avec l‟apparition d‟une coloration rose dans
les surnageants après addition du réactif de Griess.
Le test au MTT a révélé que les extraits de fruits de Capsicum frutescens et des feuilles
de Scaevola sericea présentaient une toxicité sur les cellules RAW 264.7. Quant à l‟extrait de
96
racine de S. australis, il a provoqué une légère mais significative augmentation de la viabilité
cellulaire.
En ce qui concerne le criblage avec le test au DPPH, à l‟exception de l‟extrait de S.
officinarum et de X. americana, tous les extraits de plantes ont manifesté des activités
antioxydantes significatives. Les extraits d‟E. hirta, de S. malaccense (feuille et écorce), de S.
terebenthifolius, et de P. granatum montrèrent une IC50 inférieure à 20 µg/mL dans leur
capacité à piéger le radical DPPH.
III.2 Les tests complémentaires
Suite au criblage décrit ci-dessus, notre équipe a entrepris des études complémentaires au
niveau moléculaire pour confirmer le caractère anti-inflammatoire de certains de ces extraits,
notamment ceux d‟E. hirta, de V. trifolia, de C. manghas et de feuilles de H. foertherianum.
Les effets de ces quatre extraits sur la modulation de l‟expression de l‟iNOS et de différentes
cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α et IL-10) induites par le LPS dans les cellules RAW 264.7
furent étudiés par les techniques de qPCR et d‟ELISA (Matsui et al., 2009b ; 2009c). Bien
que les méthodes et les résultats obtenus ne fassent pas dans leurs détails l‟objet de cette
thèse10, leur interaction générale avec le présent projet de recherche est néanmoins discutée
ci-dessous. Les résultats de ces expériences sont notamment détaillés et comparés à ceux
obtenus avec le TG dans le Tableau 2.
A l‟aide de ces tests biologiques, nous avons montré que les extraits d‟E. hirta et de V.
trifolia étaient capables d‟agir sur l‟activité inflammatoire du LPS en modulant fortement la
surexpression des ARNm de l‟iNOS et des cytokines. De même, pour ces deux extraits, une
forte diminution du niveau d‟expression protéique de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et
TNF-α) a également été observée. Il est important de noter que ces résultats reflètent ceux
obtenus avec le TG. Par ailleurs, l‟extrait de feuilles d‟H. foertherianum ne présente qu‟un
léger potentiel anti-inflammatoire dans le test qPCR, confirmant également les résultats
obtenus avec le TG.
10
Ces travaux sont développés dans la thèse de doctorat de Mariko MATSUI.
97
Tableau 2 : Les effets des extraits aqueux de Cerbera manghas, d‟Euphorbia hirta, d‟Heliotropium foertherianum et de Vitex trifolia sur l‟accumulation de
nitrite dans les surnageants de cellules RAW 264.7 stimulées avec du LPS, comparés à l‟inhibition ou l‟induction de l‟expression de l‟ARNm et/ou protéine de
l‟iNOS, de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6 et TNF-α) et d‟une cytokine anti-inflammatoire (IL-10).
Plantes (extraction)
Euphorbia hirta L.
(Décoction de la plante
entière)
Cerbera manghas L.
(Homogénéisation du latex
libéré de pétiole de feuilles
dans l‟eau à 40°C)
Vitex trifolia L.
(Décoction de feuilles)
% Activité
inhibitrice sur
l’accumulation de
nitrite (TG)a
44,9
+++
Activité inhibitrice sur
l’expression d’ARNm de
l’iNOS (qPCR)b
Inhibition à 2, 4, 8, 12 et
24 h
NS, NS, ++, ++, +++
Activité inhibitrice sur
l’expression d’ARNm des
cytokines (qPCR)b
Inhibition à 2, 4, 8 à 12 h
(IL-1β)
NS, +, +++, ++
16,6
+++
Inhibition
NS
NS (IL-1β)
13,9
+++
Inhibition à 2, 4, 8 et 12 h
NS, +, +, +
Inhibition à 2, 4, 8, 12 et 24
h (IL-1β)
+, +++, +++, ++, ++
Inhibition à 2, 4, 8 et 12 h
(IL-6)
+, ++, +++, ++
Diane & Hilger
(Décoction de feuilles jaunies)
3,3
NS
Inhibition à 8, 12 et 24 h
NS, NS, +
Inhibition entre 12 et 24 h
(IL-1β)
+, +
Effet sur le taux d’expression
protéique des cytokines
(ELISA)c
Inhibition à 12 et 24 h (IL-6)
NS, ++
Inhibition à 12 et 24 h (TNF-α)
++, ++
ND
Inhibition à 12 et 24 h (IL-6)
+, +
Activité
antioxydante (test
au DPPH) avec
IC50 (µg/mL) d
10,0
Niveau de
régulation de
l’inhibition de la
voie de iNOS/
NO•
Transcriptionnel
687,7
Transductionnel
ou
piégeur de NO•
64,5
Transcriptionnel
Inhibition entre 12 et 24 h
(TNF-α)
+, NS
Induction à 12 et 24 h (IL-10)
-, ND
29,0
a
Effet des extraits aqueux de plantes, C. manghas, E. hirta, H. foertherianum et V. trifolia à 250 µg/mL sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants des cellules RAW 264.7 co-traitées
avec du LPS (10 µg/mL) à 24 h. Les inhibitions exprimées en pourcentage sont pondérées par rapport aux témoins positifs (cellules traitées au LPS uniquement) (Publication 2).
b
Cinétique de l‟effet des extraits aqueux de plantes, E. hirta et H. foertherianum à 250 et V. trifolia à 2500 µg/mL sur la surexpression de l‟ARNm de l‟iNOS et des cytokines proinflammatoires (IL-1β et IL-6) induite dans les cellules RAW 264.7 stimulées avec du LPS (0,5 µg/mL) de 0 à 24 h (Matsui et al., 2009b ; 2009c).
c
Effet des extraits aqueux de plants, E. hirta à 250 et V. trifolia à 2500 µg/mL à 12 et 24 h sur la modulation du taux d‟expression protéique des cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α)
et d‟une cytokine anti-inflammatoire (IL-10) induite dans les cellules RAW 264.7 stimulée au LPS (0,5 µg/mL) (Matsui et al., 2009b ; 2009c).
d
Effet antioxydant des extraits aqueux de plantes, C. manghas, E. hirta, H. foertherianum et V. trifolia (0, 2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL) sur le radical DPPH après 30 mins exprimé en valeur
d‟IC50 valeurs (Publication 2).
Abréviations : ND : indéterminé ; NS : non significatif (P > 0,05) ; (+), (+ +) et (+ + +) : diminution significative (0,01 < P < 0,05, 0,001 < P < 0,01 et P < 0,001) ; (−), (−−) et (−−−) :
augmentation significative (0,01 < P < 0,05, 0,001 < P < 0,01 et P < 0,001).
98
A contrario, l‟extrait de C. manghas qui était modérément actif au cours du TG (montrant
une inhibition à peine plus forte que celle le V. trifolia) n‟a pas provoqué d‟inhibition de la
surexpression des gènes de l‟iNOS, ni des différentes cytokines. Ceci indique que l‟aptitude
pharmacologique de cet extrait à réduire la production du NO• se situerait plutôt dans sa
capacité à inhiber l‟expression de la protéine iNOS. Mais il est aussi possible, étant donné sa
complexité matricielle chimique, que l‟activité inhibitrice du NO• observée par le TG dans cet
extrait et ceux d‟E. hirta et V. trifolia, puisse aussi être partiellement attribuée à leur forte
activité antioxydante révélée par le test au DPPH. Cependant, l‟extrait de feuilles d‟H.
foertherianum manifeste une activité équivalente de piégeage du radical DPPH que les
extraits de V. trifolia et d‟E. hirta, bien qu‟à l‟inverse de ceux-ci, il ne présente qu‟une légère
activitié avec le TG.
En nous appuyant sur les activités pharmacologiques observées dans ces présentes études
(TG, qPCR et ELISA) ainsi que sur celles du passé (tests d‟électrophysiologie, de
neurophysiologie, de physiologie cellulaire, et de neurotoxicité), nous avons sélectionné trois
extraits de plantes : l‟extrait de la plante entière d‟E. hirta et de feuilles d‟H. foertherianum et
de V. trifolia, pour un fractionnement chimique bioguidé avec le TG.
Bien que l‟extrait d‟H. foertherianum n‟ait pas démontré d‟activités antiinflammatoires probantes, nous l‟avons néanmoins sélectionné pour les études chimiques
bioguidées ultérieures en raison de ses diverses propriétés thérapeutiques démontrées dans
plusieurs des études effectuées précédemment dans le cadre de recherche thérapeutique sur la
ciguatera. Une autre raison de ce choix est que, après la séparation chimique, il sera
éventuellement possible d‟observer des activités du fait de la plus grande concentration de la
ou des molécules actives dans les fractions. Cette question sera abordée dans la partie 3.
99
Chapitre 2 : Etude in vitro de l’inhibition de la liaison
de brévétoxine tritiée à son site de haute affinité par les
phytothérapies utilisées contre la ciguatera
I.
Introduction
Eléments critiques pour la génération et la propagation des signaux électriques dans la
plupart des cellules excitables, les canaux sodiques dépendants du potentiel (CSDP) sont des
cibles pour un grand nombre de composés tels que les anesthésiques locaux, les insecticides
ou les diverses neurotoxines comme les ciguatoxines (CTXs) ou les brévétoxines (PbTxs). La
liaison de ces toxines affecte la fonction du canal sodique en provoquant 4 effets distincts : un
déplacement du potentiel d‟activation vers des valeurs plus négatives, une prolongation du
temps moyen d‟ouverture, l‟inhibition de l‟inactivation et la visualisation de multiples états de
sous-conductance (Ojeda et al., 2008).
Les CTXs se lient quasi-irréversiblement au site 5 des CSDP (Ulbricht, 2005). Cette
liaison rentre en jeu dans la manifestation de symptômes neurologiques centraux et
périphériques observés dans la ciguatera. Le caractère irréversible ou très faiblement
réversible de la liaison des CTXs à leur cible peut expliquer les longues périodes nécessaires à
un rétablissement clinique chez les patients souffrant de ciguatera, les rechutes des années
plus tard observées chez certains malades ainsi que la sévérité croissante des symptômes lors
d‟intoxications répétées (Dickey, 2008 ; Lehane et Lewis, 2000).
Le test d‟interaction ligand-récepteur (TILR) associé à la synthèse d‟une brévétoxine
radiomarquée au tritium via la réduction du PbTx-2 (aldéhyde) en [3H]-PbTx-3 (alcool
primaire) par le [3H] borohydrure de sodium fut une étape décisive dans la recherche
pharmacologique des neurotoxines, PbTxs et CTXs. Ce test a en effet permis d‟identifer le
site 5 comme étant la cible primaire des PbTxs sur la sous-unité α du CSDP (Catterall et
Gainer, 1985; Ramsdell, 2008). Ceci a été suivi par plusieurs expériences de déplacement
homologue pour déterminer les affinités (Ki) relatives aux différents analogues des PbTxs
(Poli et al., 1986).
Partie 2: Évaluation du potential inhibiteur de la fixation de [3H]-PbTx-3 des plantes
100
Par la suite, sur la base des expériences de déplacement hétérologue 11, les CTXs furent
également classées comme neurotoxines du site 5 (Dechraoui et al., 1999). Les CTXs et
PbTxs sont ainsi deux familles de toxines liposolubles et polyéthérées, ayant des structures
chimiques similaires et partageant la même cible moléculaire. Elles furent donc longuement
étudiées pour leur capacité à entrer en compétition avec la [ 3H]-PbTx-3 (voir Fig. 3 pour les
valeurs de Ki).
II.
Principe des études d’interaction ligand-récepteur
Outil neuropharmacologique relativement simple mais puissant, le TILR est aujourd‟hui
utilisé en association avec le test souris et le test de cytotoxicité sur les cellules Neuro-2a pour
détecter la présence de CTXs ou d‟autres toxines de « type-ciguatoxines » dans des
échantillons biologiques tels que des extraits de Gambierdiscus (sauvages ou de culture) ou
de poissons (Boydron-Le Garrec et al., 2005b ; Guzmán-Perez et Park, 2000). Le principe de
ces expériences consiste à mettre les récepteurs, et par conséquent les préparations
membranaires riches en canaux sodiques, en présence d‟un ligand, la [ 3H]-PbTx-3, et de doser
la quantité de complexe ligand-récepteur formé en présence ou en absence de molécules
inhibitrices, telles que les PbTxs, CTXs, ou bien d‟autres composés, par la mesure de la
radioactivité par scintillation liquide. L‟inhibition sélective de la fixation de la [3H]-PbTx-3
au site 5 est observée par la diminution dose-dépendante de la radioactivité (Fig. 3).
Les CTXs radiomarquées n‟étant pas disponibles, la [ 3H]-PbTx-3 est utilisée pour évaluer
l‟activité inhibitrice des CTXs. Ces expériences de déplacement hétérologue ont également
été utilisées pour étudier le comportement des polyéthers isolés comme les yessotoxines, le
gambierol, l‟acide gambierique A et le brevenal. Le gambierol et le brevenal déplacent la
[3H]-PbTx-3 du site 5 des synaptosomes avec une valeur de Ki respective de 1.4-4.8 µM et de
685 nM (Bourdelais et al., 2004 ; LePage et al., 2007 ; Inoue et al., 2003). Ces activités
inhibitrices des CTXs, du gambierol et du brevenal sont purement de nature compétitive, de
telle
sorte
qu‟ils
empêchent
l‟accès
des
[3H]-PbTx-3
11
au
site
5
des
CSDP.
Les déplacements hétérologues à l‟inverse de déplacement homologues consistent en une inhibition de la
liaison de la [3H]-PbTx-3 au récepteur par une molécule autre que les PbTxs.
102
Ki (nM)
Effet relatif (% du témoin)
100
90
PbTX-1
2.0
80
PbTx-3
2.24
70
P-CTX-1B
0.041
P-CTX-3C
0.49
60
50
40
30
20
10
0
10-13
10-12
10-11
10-10
10-9
10-8
10-7
10-6
Concentration des toxines (g/mL)
Figure 3 : Courbes de compétition de la fixation de [ 3H]-PbTx-3 par différents inhibiteurs,
ciguatoxines (déplacement hétérologue) et brévétoxines (déplacement homologue), sur les
synaptosomes de cerveaux de rats et leurs valeurs de Ki d‟après Dechraoui-Bottein, 1999.
101
Composés respectivement de 8 et 5 cycles condensés, le gambierol et le brevenal (Fig. 4),
- bien que capables de se fixer au site 5 - ne semblent pas provoquer de réponses
neurotoxiques comme le font les CTXs et les PbTxs (Bourdelais et al., 2004 ; LePage et al.,
2007) et se révèlent être de bon antagonistes de ces deux familles de toxines. Aussi, ces deux
composés et leurs analogues peuvent servir de pistes intéressantes dans le développement de
thérapies visant à prévenir ou soigner les intoxications neurologiques dues aux PbTxs ou aux
CTXs.
Lors de l‟étude pharmacologique in vitro menée par Boydron-Le Garrec et al. (2005a), 21
des 23 remèdes traditionnels non toxiques testés montrèrent une action préventive contre la
cytotoxicité induite par la PbTx-3 et la P-CTX-1B sur les cellules Neuro-2a. Dans cet essai,
l‟application simultanée de la ouabaïne et de la vératridine, deux agents qui potentialisent les
effets des CTXs et des PbTxs sur les canaux sodiques, est nécessaire. En effet, en absence de
ces agents, ni lesPbTxs, ni les CTXs n‟ont d‟effet d‟abaissement de la viabilité cellulaire. Par
conséquent, nous sommes en présence de réponses cytotoxiques induites dans ces cellules par
l‟action spécifique de ces neurotoxines sur les canaux sodium (Dickey, 2008).
Le TILR devrait pouvoir nous permettre de spécifier si la réponse inhibitrice de la
cytotoxicité observée avec ces extraits de plantes est due à leur action sur ces canaux. Aussi,
dans cette optique, nous avons recherché si un de nos extraits de plantes inhibait la liaison de
la [3H]-PbTx-3 au site 5 des CSDP. Ce projet est très novateur car, à notre connaissance,
aucun extrait de plantes n‟avait été testé avec ce modèle bien que cette technique ait été
employée dans de nombreux autres programmes de pharmacochimie pour identifier des
composés leaders qui agiraient sur des récepteurs vitaux dans les fonctions neuronales,
immunologiques, gastrointestinales ou cardiovasculaires (Caballero-George et al., 2001 ;
Vlietinck et Apers, 2001).
100
Gambierol
Brevenal
Figure 3: Structures chimiques de gambierol et brevenal
Figure 4 : Structure chimique du gambierol et du brevenal
102
III. Matériel et méthodes
Dans le cadre d‟un programme de recherche sur la gestion de risque de ciguatera dans les
lagons de Polynésie Française, le Laboratoire de recherche sur les Micro-alguesToxiques de
l‟Institut Louis Malardé à Tahiti emploie plusieurs voies de détection de CTXs dont le TILR.
Ce dernier, suffisamment précis et sensible, a abouti à la mise au point d‟une méthode de
dosage en routine des CTXs. Pour la présente étude, nous avons procédé à une légère
modification dans le protocole en remplaçant les extraits d‟algues ou de poissons
potentiellement ciguatoxiques par des extraits de plantes en concentrations croissantes.
III.1 Matériel
Sauf spécifications, tous les réactifs et milieux utilisés dans les expérimentations
suivantes proviennent de chez Sigma-Aldrich (Lyon, France).
III.2 Préparation des extraits de plantes
En s‟appuyant sur les résultats des études précédentes in vitro reportées par Boydron-Le
Garrec et al. (2005a), 24 extraits aqueux préparés à partir de 21 plantes furent sélectionnés
(Tableau 3). Récoltés dans les régions côtières de Nouvelle-Calédonie, la détermination
taxonomique des échantillons botaniques fut confirmée par comparaison avec des échantillons
référencés déposés à l‟herbier de l‟IRD. Les parties étudiées (feuilles, racines, écorce, ou
autres) des différentes plantes ont été recueillies et extraites par ébullition, infusion ou
macération dans de l‟eau distillée (voir Tableau 3). Les extraits aqueux ont été filtrés et le
filtrat lyophilisé. Les extraits secs ont été pesés et redissous dans l‟eau pour les tests. En cas
d‟apparition de suspensions lourdes, la solution a été décantée et seul le surnageant a été
utilisé.
103
Tableau 3 : Activités inhibitrices des extraits aqueux de plantes utilisées dans le traitement de la ciguatera vis-à-vis de la fixation de la [3H]-PbTx-3 au site 5 de
canaux sodiques dépendants du potentiel de synaptosomes de cerveaux de rats.
Nom des plantes
Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg
Carica papaya L.
Cocos nucifera L.
Davallia solida (J.R Forster & G. Forster) Swartz
Dendrolobium umbellatum (L.) Benth.
Duboisia myoporoides R. Br.
Euphorbia hirta L.
Heliotropium foertherianum Diane & Hilger
Ipomoea pes-caprae (L.) R. Brown
Morinda citrifolia L.
Pandanus tectorius Parkinson
Punica granatum L.
Rhizophora x selala (Salv.) Toml.
Schinus terebenthifolius Raddi
Stachytarpheta australis Moldenke
Syzygium malaccense (L.) Merr. & Perry
Syzygium malaccense (L.) Merr. & Perry
Vitex trifolia L.
Parties de plante
Feuilles bourgeons,
latex secrété
Fruits
Fleurs mâles
Jeunes racines
Racines
Feuilles
Jeunes Feuilles
Plante entière
Ecorce
Feuilles jaunes
Racines
Fruits
Racines aériennes
Fruits
Ecorce
Feuilles
Feuilles
Ecorce
Feuilles
Racines
Ecorce
Feuilles
Feuilles
Racines
Extraction
Solution
stock
(mg/mL)
Concentrations
testées (µg/mL)
IC50
(mg/ml)
Coéfficient
de Hill
Anti-cytotoxicitéb
PbTx-3
P-CTX-1B
36,0
Macération 24 h
100
120 - 40 000
2,4
+
-0,4
55,0
Macération 30 min
Décoction 30 min
Décoction 30 min
Décoction 3 min
Décoction 15 min
Infusion 20 min
Décoction 10 min
Décoction 30 min
Décoction 20 min
Décoction 20 min
Macération 30 min
Décoction 30 min
Décoction 10 min
Décoction 30 min
Décoction 15 min
Infusion 30 min
Macération agitation 1 h
Décoction 10 min
Macération 10 min
Macération 30 min
Infusion 20 min
Décoction 30 min
Macération froide 30 min
100
100
100
100
100
50
100
100
50
100
100
100
100
100
100
100
100
50
50
100
100
50
100
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
60 – 20000
120 - 40000
120 - 40000
60 – 20000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
120 - 40000
60 – 20000
60 – 20000
120 - 40000
120 - 40000
60 – 20000
120 - 40000
9,8
23,7
≥ 40
0,2
13,2
1,8
3,3
24,8
3,6 a
21,3
3,5
3,5 a
0,6
≥ 40
3,8
≥ 40
≥ 40
3,3
1,8
6,2
≥ 40
4,8a
7,4
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
++
+
+
+
+
+
++
+
-0,6
-1,3
ND
-0,4
-0,2
-0,6
-0,4
-0,5
-0,7
-0,3
-3,1
-0,7
-0,4
ND
-0,4
ND
ND
-1,2
-0,5
-0,3
ND
-1,0
-1,3
40,7
44,1
-16,1
-16,1
33,8
30,7
74,8
33,5
26,0
18,9
38,4
33,7
49,8
69,8
52,0
28,3
61,6
34,4
50,3
13,8
48,7
28,9
40,6
101,9
61,0
44,0
28,9
a
Pour ces 3 extraits uniquement n = 8 (n=N × 4 ; N = 2).
Augmentation de la viabilité cellulaire des Neuro-2a co-traitées avec les extraits de plantes (5 g/L), l‟ouabaine (417 µM), la vératridine (41,7 µM) et la PbTx-3 (12 nM) [OVB] ou la P-CTX1B (5 pM) [OVC] exprimée en pourcentage de cellules exposées à OVB ou à OVC (Boydron-Le Garrec et al., 2005a).
Les extraits présentant une toxicité sur les cellules Neuro-2a sont surlignés en grisé comme précédemment reporté par Boydron-Le Garrec et al. (2005a).
b
Abréviations : ND : non défini ; (-) : valeur d‟IC50 ≥ 20 mg/mL pour les extraits testés à 50 mg/mL ou ≥ 40 mg/mL pour les extraits testés à 100 mg/mL ; (+) : valeur d‟IC50 < 20 mg/mL pour
les extraits testés à 50 mg/mL ou < 40 mg/mL pour les extraits testés à 100 mg/mL ; (++) : extraits ayant la valeur d‟IC50 < 20 mg/mL mais également la courbe d‟une allure de sigmoïde.
104
III.3 Test d’interaction ligand-récepteur
III.3.1
Préparation des synaptosomes
Les synaptosomes ont été préparés suivant le protocole décrit par Dechraoui-Bottein
(1999). Cette méthode consiste à débarasser l‟homogénat des tissus cérébraux, débris
cellulaires, mitochondries, myéline et microsomes par trois centrifugations successives sur
solution de sucrose (Fig. 5).
Des rats adultes (250 g) sont tués par inhalation de CO2, leurs hémisphères cérébraux sont
prélevés et congelés à l‟azote liquide, pour être stockés à -80 °C avant d‟être utilisés pour la
préparation des synaptosomes. Toutes les étapes de purification sont réalisées à 4 °C avec des
récipents préalablement refroidis.
Une trentaine d‟hémisphères cérébraux est pesée (45 g), décongelée puis homogénéisée
dans un tampon phosphate contenant du sucrose (0,32 M) à l‟aide d‟un appareil de Potter (50
mL, tige en téflon, tube en verre de 15 mL et de 2 cm de diamètre, espace mortier-piston 0,5
mm). Les broyats obtenus sont centrifugés à 4 °C pendant 10 min à 2000 × g (centrifugeuse
Hettich). Le surnageant est déposé sur une solution de sucrose à 1,2 M (7 mL/4 mL) pour être
centrifugé 50 min à 220000 × g à 4 °C dans des tubes en polycarbonate. Les interfaces sont
délicatement prélevées, mélangées et homogénéisées dans un tampon sucrose à 0,32 M (2
mL/5 mL). Des fractions de 7 mL sont réparties sur 4 mL de tampon sucrose 0,8 M pour être
centrifugées dans les mêmes conditions (Fig. 5). Les culots sont repris dans un volume
minimum de tampon d‟incubation sans BSA (Hepes/Tris 50 mM pH 7,4 contenant 130 mM
de chlorure de choline, 5 mM de glucose, 5,4 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO4 et de
l‟émulphore à 0,01%) puis sont homogénéisés à l‟aide d‟un petit appareil de Potter de 2 mL
(tige et tube en verre).
Les synaptosomes sont finalement aliquotés puis stockés à -80 °C pour une durée
maximum de 6 mois.
106
Homogénat de cerveaux de rats en sucrose
0.32M
Centrifugé à 2000 x g pendant 10 min
Culot
Surnageant
Noyaux et débris cellulaires
Déposé sur sucrose 1,2M
S1
Centrifugé 50 min à 220000 x g
C1
Culot
Interphase
Mitochondries
Déposé sur sucrose 0,8M
C2
Surnageant
Microsomes, ribosomes
Centrifugé 50 min à 220000 x g
S2
grpm
Culot
Synaptosomes
C3
Surnageant
Fragments de myéline
S3
Figure 5 : Procédure de purification des synaptosomes (les fractions non grisées ne sont pas
conservées).
105
III.3.2
Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford
Le dosage des protéines totales de la préparation membranaire obtenue est effectué en
suivant la méthode de Bradford en se basant sur une gamme étalon de BSA (0,5 g/L). La
gamme étalon (courbe linéaire log-log) est obtenue à partir d‟aliquotes contenant entre 1,25 et
20 µg/mL de BSA diluée dans une solution de NaCl à 0,15 M. Les synaptosomes sont dilués
au 1/10ème dans le tampon d‟incubation sans BSA et une gamme de 8 dilutions est préparée de
la façon suivante : 2, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30 et 40 µL dilué à chaque fois dans 1 mL de NaCl à
0,15 M.
Ensuite, la solution de Bradford est rajoutée à chacun des tubes (1 mL) et les tubes sont
agités au vortex. Un tube « blanc » est préparé avec 1mL de NaCl (0,15 M) + 1 mL de réactif
de Bradford. La densité optique (DO) de chaque tube de BSA est mesurée en duplicate (2 × 1
mL) à 595 nm puis celle des tubes du lot de synaptosomes est mesurée de la même façon. Les
quantités de protéines contenues dans les échantillons sont déduites de la courbe standard
décrite par l‟équation log DO= f(log [BSA]).
En général, la quantité de protéines finales utilisées dans le TILR est comprise entre 60 et
120 µg/mL.
III.3.3
Évaluation de la qualité des synaptosomes pour le test
d’interaction ligand-récepteur
Le TILR est réalisé en tube, suivant le protocole de Darius et al. (2007). Le lot de [3H]PbTx-3 utilisé a été préparé sur commande par la société GE Healthcare (Luxembourg) selon
la réaction chimique précédemment citée. Le radioligand présente une radioactivité spécifique
de 14 Ci/mmol (18,5 MBq/mmol) et une pureté radiochimique déterminée par HPLC proche
de 99%.
La solution stock de [3H]-PbTx-3 (250 µCi dans 2,5 mL d‟éthanol) est conservée à -80 °C
et les dilutions sont effectuées juste avant utilisation. Les expériences de fixation spécifique
sur les synaptosomes de cerveaux de rats sont classiquement effectuées dans un tampon
d‟incubation HEPES/Tris 50 mM (pH 7,4) contenant 130 mM de choline chloride, 5 mM de
106
glucose, 5,4 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO4, de l‟émulphore à 0,01%, et de la BSA à 1
mg/mL, dans un volume final de 500 µL.
Des volumes croissants de synaptosomes (60-120 µg de protéines totales) sont mis à
incuber en présence de [3H]-PbTx-3 (1 nM) ce qui permettra d‟obtenir la fixation totale (FT)
pour chacun des volumes testés. Après 1 h d‟incubation, la réaction est arrêtée par addition de
tampon de lavage froid. Le lavage se fait avec un tampon HEPES/Tris 5 mM (pH 7,4)
contenant 163 mM de chlorure de choline, 1,8 mM de CaCl2 et 0,8 mM de MgSO4. Les
complexes [3H]-PbTx-3-synaptosomes formés sont isolés du milieu réactionnel par filtration
rapide (Brown, 1986) sur filtre GF/C (Whatman). Chaque filtre est déposé dans une fiole de
comptage contenant 2 mL de liquide scintillant (Perkin Elmer Betaplate). La radioactivité
recueillie sur ces filtres est comptée pendant 4 min dans un compteur à scintillation liquide
(Perkin Elmer Microbeta Trilux 1450, Waltham, MA, USA).
La fixation non spécifique (NS) est déterminée par des incubations en parallèle, faites en
présence d‟un excès de ligand froid (PbTx-3 à 0,67 mM). La fixation spécifique (FS) de
chaque volume de synaptosomes est donc déterminée par la formule suivante : FS = FT – NS.
Le volume de synaptosomes efficace aura une FS comprise entre 8 et 10% de la valeur de
la radioactivité totale. Un fois ce volume déterminé, il sera fixe pour toutes les expériences du
TILR appliqué aux extraits de plantes.
III.3.4
Calibration du test d’interaction ligand-récepteur
Selon les conditions optimales définies précédemment, le TILR a été calibré avec la PCTX-3C obtenue à partir d‟une culture clonale de Gambierdiscus polynesiensis (Chinain et
al., 1999). La P-CTX-3C est utilisée comme standard interne pour la calibration des
échantillons et son IC50 a été définie à 0,62 ± 0.16 ng/mL (r2 = 0.9796, coefficient de Hill = 0.84, Ki = 0.49 nM) (Fig. 6 ; Darius et al., 2007 ; Chinain et al., 2009a).
Des contrôles “Qualité” sont réalisés lors de chaque TILR à partir d‟un extrait toxique de
G. polynesiensis ayant une concentration connue de 3.1 pg d‟équivalent P-CTX-3C en
duplicate (Darius et al., 2007 ; Chinain et al., 2009a ; 2009b).
105
100
90
80
70
P-CTX-3C
60
50
40
30
20
10
0
10-13
10-12
10-11
10-10
10-9
10-8
10-7
10-6
Concentration de P-CTX-3C (g/mL)
Figure 6 : Courbe de compétition de la P-CTX-3C sur les synaptosomes de cerveaux de rat.
Des concentrations croissantes de P-CTX-3C ont été incubées en présence de brévétoxine
tritiée ([3H]-PbTx-3, 0.89 nM). La fixation spécifique de la [3H]-PbTx-3 a été mesurée suivant
le protocole décrit dans « Matériels et Méthodes ».
107
III.3.5
Application du test d’interaction ligand-récepteur aux extraits de
plantes
Pour chaque extrait de plante (solution stock à 50 mg/mL, dissous dans l‟eau distillée),
des doses de 1000 et 10000 µg/mL ont été testées en duplicate. En fonction des réponses,
chacun des 24 extraits a été testé lors de 1 à 4 expérimentations avec 8 dilutions en duplicate :
soit à partir d‟une solution à 50 mg/mL (60, 200, 600, 1200, 2000, 6000, 12000 et 20000
µg/mL) ; soit à partir d‟une solution à 100 mg/mL (120, 400, 1200, 2400, 4000, 12000, 24000
et 40000 µg/mL)
III.3.6
Analyse de données
Les résultats de comptage sont analysés au moyen des logiciels Multicalc software 2.6
(Wallac, Perkin Elmer France) et Graphpad Prism 4.0 (Software Inc., San Diego, CA, USA)
afin d‟obtenir une courbe de compétition. L‟IC50, qui est la concentration d‟extrait capable
d‟inhiber la fixation de [3H]-PbTx-3 à 50%, est exprimée en mg/mL (Tableau 3).
Les extraits de plante dans le Tableau 3 classés « - » ont une valeur d‟IC50 ≥ 20 mg/mL
lorsqu‟ils sont testés à 50 mg/mL ou ≥ 40 mg/mL lorsqu‟ils sont testés à 100 mg/mL. Les
extraits ayant une valeur inférieure sont classés « + ». Et ceux dont la courbe aura une allure
de sigmoïde sont classés « ++ ».
IV. Résultats et discussion
Parmi les 24 extraits aqueux testés, ceux de cinq plantes n‟ont montré aucune activité
d‟inhibition de la fixation de la [3H]-PbTx-3 avec une IC50 ≥ 40 mg/ml d‟extrait (Tableau 3).
Pour ce qui concerne les autres plantes, même si une valeur d‟IC 50 a pu être générée par
Graphpad pour la majorité d‟entre elles, elles présentent des droites au lieu de sigmoïdes (Fig.
7A). Seuls trois extraits, H. foertherianum (feuilles), P. tectorius (racines aériennes) et V.
trifolia (feuilles) présentent des courbes de type sigmoïdale et peuvent être considérés comme
réellement actifs sur le site 5 du canal sodique (Fig. 7B).
108
100
A
Scaevola sericea
Punica granatum
Dendrolobium umbellatum
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10-1
100
100
101
Concentration des extraits (mg/mL)
B
90
102
Pandanus tectorius
Vitex trifolia
(feuilles)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10-2
10-1
100
101
102
Concentration des extraits (mg/mL)
Figure 7 : Courbes de compétition des extraits aqueux de plantes sur les synaptosomes de
cerveaux de rats. Ces extraits de plante étaient utilisés soit à partir d‟une concentration de 100
mg/mL (7A) soit de 50 mg/mL (7B). Des dilutions croissantes d‟extraits ont été incubées en
présence de brévétoxine tritiée ([3H]-PbTx-3 ; 1 nM).
108
Ces trois plantes sont susceptibles de contenir soit des molécules qui se fixeraient sur les
CSDP (donc inhibition par compétition), soit des molécules qui pourraient réagir avec les
PbTxs (et probablement les CTXs) en changeant leur configuration.
Afin de conclure pour l‟une ou l‟autre de ces deux hypothèses, l‟extrait de feuilles d‟H.
foertherianum (à concentration variable) a été préalablement mis en présence d‟un extrait de
5000 cellules de G. polynesiensis de la culture identifié comme très toxique (Chinain et al.,
2009a). Puis, le TILR a été appliqué comme défini précédemment. Les résultats sont
présentés sur la Fig. 8.
L‟extrait de H. foertherianum (feuilles) mélangé à l‟extrait de G. polynesiensis
« déplace » la courbe vers la gauche (Fig. 8A) par rapport a celle de l‟extrait de G.
polynesiensis seul (Fig. 8B). Cet extrait est donc bien susceptible de contenir des molécules
qui entrent en compétition par interaction avec les CSDP.
Bien que cette expérience nous ait permis de démontrer que l‟activité inhibitrice observée
avec l‟extrait d‟H. foertherianum était de nature compétitive, elle ne nous a pas permit
d‟estimer si cette activité d‟extrait était due une compétition directe (action spécifique sur le
site 5) ou à un effet allostérique. Ce type de travail nécessiterait dans un premier temps
l‟isolement du principe actif et sa conversion en ligand radiomarqué avant de mener des
expériences de déplacements hétérologues avec plusieurs neurotoxines spécifiques du site 5 et
des autres sites récepteurs (1, 2, 3, 4 et 6) du CSDP (Catterall, 1986).
Néanmoins, les résultats obtenus ici avec l‟extrait de feuilles d‟H. foertherianum sont très
intéressants dans la mesure où cet extrait avait auparavant démontré des effets inhibiteurs
dans l‟axone myéliné de grenouille contre les décharges spontanées et répétitives de potentiel
d‟action et contre le gonflement dûs à l‟activation des canaux sodium par la P-CTX-1B
(Benoit et al., 2000). Bien que les expériences présentes n‟aient pas été faites avec une CTX
radiomarquée (en raison de son indisponsiblité), notre étude permet d‟avancer l‟hypothèse
qu‟une plante telle que l‟H. foertherianum pourrait contenir des molécules qui empêcheraient
la liaison des CTXs au CSDP, expliquant ainsi ses effets bénéfiques sur les
dysfonctionnements électrophysiologiques et neurophysiologiques dans l‟axone de grenouille.
109
Effet Relatif (% du témoin)
110
A
100
90
Mélange H. foertherianum
(feuilles) et
G. polynesiensis
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10-2
10-1
100
101
102
Concentration d’extrait (mg/mL)
110
B
100
90
G. polynesiensis
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
101
102
103
Concentration d’extrait de G. polynesiensis (cell/mL)
104
Figure 8 : Courbe de compétition d‟un mélange d‟extrait d‟H. foertherianum (feuilles) avec
l‟extrait de G. polynesiensis (8A) et d‟un extrait provenant seul d‟une culture in vitro du
dinoflagellé Gambierdiscus polynesiensis (8B) sur les synaptosomes de cerveaux de rats. Des
dilutions croissantes d‟extrait (dinoflagellé ou plante) ont été incubées en présence de
brévétoxine tritiée ([3H]-PbTx-3, 1 nM).
109
Au contraire, l‟extrait aqueux de rhizomes de Davallia solida, bien qu‟étant capable de
contrecarrer cette action induite par la P-CTX-1B sur les axones de grenouille (Benoit et al.,
2000) n‟a pas démontré d‟activité inhibitrice significative dans le TILR (Tableau 3). De
même, nous n‟avons pas observé de corrélation entre les résultats obtenus avec le TILR et
ceux obtenus avec le test d‟inhibition de la cytotoxicité sur les cellules Neuro-2a (Tableau 3).
Ainsi, l‟extrait de la plante entière d‟E. hirta, qui a fortement contrarié la cytotoxicité induite
par PbTx-3 et P-CTX-1B, fut inactif dans le TILR alors que les extraits de feuilles de V.
trifolia et H. foertherianum, qui furent seulement modérément actifs sur les Neuro-2a,
montrèrent la plus forte activité inhibitrice sur la fixation de [ 3H]-PbTx-3.
Ceci étant, nous ne devons pas exclure la possibilité d‟une teneur élevée en sel dans ces
extraits puisque la majorité des plantes a été récoltée en zone côtière. Les préparations se
faisant par extraction à l‟eau, leur taux en sucre est aussi important. Ces teneurs élevées en
sels et sucres peuvent intervenir sur le déséquilibre osmotique provoqué par les neurotoxines,
ce qui peut expliquer, en partie, de telles divergences dans les données. Ces remarques sont
également valables pour les activités électrophysiologiques et neurophysiologiques
mentionnées ci-dessus. De même, étant donné la complexité chimique de ces extraits naturels,
il est difficile de juger si le potentiel d‟inhibition de la cytotoxicité observée avec ces plantes
est dû entièrement à une interaction directe avec les CSDP ou à d‟autres événements.
Même si l‟utilisation de ce test nous permet d‟identifier un extrait contenant un ou
plusieurs composé(s) possédant des affinités pour le site 5, leur innocuité devrait être
soigneusement examinée. Pour cela, en plus de la séparation et de la purification chimique des
principes actifs, des tests fonctionnels sur animal entier, organes isolés, tissus ou cellules,
évaluant la toxicité, la neurotoxicité et les divers flux ioniques, seront nécessaires.
C‟est en gardant ceci à l‟esprit que nous avons choisi de rechercher le principe actif
contenu dans l‟extrait de feuilles d‟H. foertherianum en relation avec le TILR. En effet, cet
extrait a été étudié par le passé pour ces activités dans les différents tests biologiques, allant
des modèles électrophysiologiques, neurophysiologiques, osmotiques et neurotoxiques in
vitro aux tests souris in vivo (Amade et Laurent, 1992 ; Benoit et al., 2000 ; Boydron et al.,
2001a ; 2001b ; Boydron-Le Garrec et al., 2005a). Ces études ont mis en évidence la
remarquable efficacité de cet extrait dans tous ces tests. Pour cette raison et malgré le
caractère très onéreux de l‟utilisation de composés radioactifs, nous avons décidé de pratiquer
110
un fractionnement chimique bioguidé de l‟extrait de feuilles d‟H. foertherianum avec le
TILR. Cette question sera abordée dans la partie suivante.
111
II.
Conclusion de la Partie 2
En raison de l‟absence de tests biologiques spécifiques et pratiques permettant des
enquêtes de routine, l‟étude des effets bénéfiques des plantes médicinales utilisées dans le
traitement de la ciguatera dans le Pacifique a été retardée. Lors de nos études, nous avons
utilisé une combinaison de divers tests biologiques in vitro afin de détecter des vertus
thérapeutiques de ces plantes vis-à-vis des effets négatifs des CTXs.
En nous appuyant sur notre découverte de la capacité de la P-CTX-1B à induire l‟iNOS,
nos premières études se sont portées sur la sélection d‟extraits inhibiteurs du NO• via le TG. Il
en est ressorti qu‟un certain nombre d‟extraits de plantes présentait un potentiel d‟inhibition
de l‟accumulation de nitrite dans le surnageant cellulaire de macrophages murins (RAW
264.7) stimulés par du LPS. Ces données ont été comparées à celles obtenues simultanément
pour ce qui concerne la cytotoxicité et l‟induction spontanée de NO• avec le test au MTT et le
TG. Etant donné la complexité chimique des échantillons, ces deux derniers tests apportent
des informations complémentaires et parfois discriminatoires sur la valeur réelle du potentiel
d‟un extrait. Ainsi, sur la base de ces trois tests, les extraits de la plante entière d‟ E. hirta, de
feuilles et d‟écorce de S. malaccense, de feuilles de S. terebenthifolius et de V. trifolia, de
fruits de P. granatum, du latex de C. manghas, de racines de X. americana et de racines
aériennes de P. tectorius ont été identifiés comme des inhibiteurs effectifs du NO• sans
manifester d‟effets cytotoxiques ou inducteur de ce radical. De même, ces extraits ont été
évalués pour leur potentiel antioxydant en mesurant leur capacité à piéger le radical DPPH.
A la suite de ces études, quatre extraits de plantes, E. hirta, C. manghas, V. trifolia et H.
foertherianum, ont été sélectionnés et leurs effets sur la modulation de l‟expression de l‟iNOS
et de différentes cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α et IL-10) induite par le LPS, ont été étudiés
par les techniques de qPCR et d‟ELISA. L‟activité anti-inflammatoire des extraits d‟E. hirta
et de V. trifolia, déjà observée avec le TG, a ainsi été confirmée (Matsui et al., 2009b ;
2009c).
Dans notre seconde étude, pour la première fois a été évaluée (à l‟aide du TILR) la
capacité des extraits de plantes à inhiber la fixation de la [3H]-PbTx-3 sur le site 5 des CSDP.
Les résultats de cette étude pilote ont montré que les extraits de racines aériennes de P.
112
tectorius et de feuilles d‟H. foertherianum et de V. trifolia trifolia manifestent une inhibition
de la fixation de ligand radioactif sur son récepteur spécifique sur les synaptosomes de rats de
façon dose-dépendante.
Par la suite, un examen minutieux de l‟extrait d‟H. foertherianum nous a démontré qu‟il
contenait des molécules qui avaient une affinité pour le CSDP. Cet extrait pourrait inhiber par
compétition la fixation de la [3H]-PbTx-3 au CSDP en se liant soit au site 5 soit à d‟autres
sites et par conséquent empêcherait (directement ou indirectement par effet allostérique)
l‟accès du ligand radiomarqué au site 5.
Pour caractériser la nature chimique des molécules hydrosolubles des extraits actifs lors
de ces deux études, nous avons entrepris un fractionnement chimique pour isoler et purifier
certains des principes actifs de ces plantes. En nous appuyant conjointement sur les activités
pharmacologiques révélées au cours de nos travaux (TG, qPCR, ELISA et TILR) et les
résultats obtenus par le passé (électrophysiologie, neurophysiologie, physiologie cellulaire,
neurotoxicité), trois extraits de plantes ont été sélectionnés pour des études chimiques
complémentaires. Ce sont les extraits de la plante entière d‟E. hirta, ceux de feuilles d‟H.
foertherianum et de V. trifolia (voir photos en Annexe 3). Ces fractionnements chimiques
bioguidés avec le TG et le TILR sont décrits dans la partie suivante.
110
PARTIE 3
Les études de fractionnement bioguidé
113
Fractionnement bioguidé avec les tests de Griess
et
d’interaction
ligand-récepteur
de
trois
phytothérapies utilisées dans le traitement de la
ciguatera
I.
Introduction
Après les études de criblage, la sélection de plantes pour l‟extraction et l‟isolement des
principes actifs fut une étape d‟application dans notre projet d‟étude.
Les résultats décrits dans le chapitre 1 de la partie 2 nous ont permis de sélectionner les
extraits aqueux de plante entière d‟E. hirta et de feuilles de V. trifolia. Dans des macrophages
RAW 264.7 activés par du LPS, ces derniers ont manifesté un fort à moyen potentiel à, d‟une
part, réduire l‟accumulation de nitrite dans le surnageant cellulaire (Publication 2), et à,
d‟autre part, moduler la surexpression de l‟ARNm d‟iNOS et de cytokines et à moduler les
profils protéiques de cytokines (Matsui et al., 2009b ; 2009c).
Le TILR décrit dans le chapitre 2 de la partie 2, nous a permis de sélectionner l‟extrait
aqueux de feuilles d‟H. foertherianum qui a montré une activité d‟inhibition de la liaison de la
[3H]-PbTx-3 au site 5 des CSDP de synaptosomes de cerveaux de rats.
Bien que l‟extrait brut de feuilles d‟H. foertherianum se soit révélé inactif ou faiblement
actif dans le TG (Publication 2) et lors des qPCR (Matsui et al., 2009b ; 2009c), nous avons
choisi d‟évaluer les fractions, sous-fractions ou le produit isolé de cet extrait par le TG, car
leur bioactivité pourrait bien être renforcée du fait de leur plus forte concentration en
molécules potentiellement actives.
En attente d‟être soumis pour publication dans Toxicon, l‟article 2 présente en revue les
divers tests entrepris et les activités obtenues de ces trois plantes dans le cadre de nos études
présentes et passées.
Partie 3 : Études de fractionnement bioguidé
114
Article 2
Kumar-Roiné, S., Darius H. T., Matsui, M., Molgó, J., Chinain, M., Pauillac, S., Laurent, D.
Traditional Remedies Employed in the Treatment of Ciguatera Fish Poisoning: Examples of
Use of Three Plants in the Pacific. Toxicon, soumis.
Partie 3 : Études de fractionnement bioguidé
115
Traditional Remedies Employed in the Treatment of Ciguatera
Fish Poisoning: Examples of Use of Three Plants in the Pacific
Shilpa Kumar-Roinéa,b,c, H. Taiana Dariusd, Mariko Matsuia,b,c, Jordi Molgóe,
Mireille Chinaind, Serge Pauillacc, Dominique Laurenta
a
Université de Toulouse ; UPS ; UMR 152 (Laboratoire de Pharmacochimie des Substances
Naturelles et Pharmacophores Redox), 118, rte de Narbonne, F-31062 Toulouse cedex 9, France
b
Institut de Recherche pour le Développement ; UMR-152 ; F-98848 Noumea, New Caledonia
c
Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie, Laboratoire des Biotoxines, BP61, F-98845 Noumea, New
Caledonia
d
Institut Louis Malardé, Laboratoire des Microalgues Toxiques, BP30, F-98713 Papeete, Tahiti,
French Polynesia
e
Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Neurobiologies Alfred Fessard,
Laboratoire de Neurobiologie Cellulaire et Moléculaire, F-91198 Gif-sur-Yvette, France
Abstract
Ciguatera Fish Poisoning (CFP) is an illness caused by eating tropical coral fishes
contaminated with ciguatoxins (CTXs). The clinical management of patients with CFP is
generally supportive and symptomatic in nature as no antidote exists. Of the myriad of drugs
prescribed, certain have been claimed efficient in small, uncontrolled studies. However, the
outcomes of treatments with these medicines are often contradictory. In New Caledonia, the
traditional remedies, prepared from different part of plants, are commonly employed in the
treatment of CFP. Of the 90 plant species catalogued, by far, the most popular herbal remedy
is a concoction prepared from the leaves of Heliotropium foertherianum Diane & Hilger
(Boraginaceae). A number of pharmacological studies, involving an in vivo (mouse bioassay)
and various in vitro (electrophysiology, neurophysiology, cellular physiology, neurotoxicity,
and anti-inflammatory) experimental approaches have been performed to evaluate the
efficiency of this phytotherapy. In this review, we have provided a bibliographic account,
compiling the information reported on certain of the western medicines used in CFP and on
the pharmacological activities of H. foertherianum. Concurrently, the therapeutic effects of
Euphorbia hirta L. (Euphorbiaceae) and Vitex L. sp., (Labiatae), two other leading plants in
the CFP research are also discussed.
Keywords: ciguatera fish poisoning; western medicine; folk remedy; Heliotropium
foertherianum; Euphorbia hirta; Vitex trifolia; Vitex rotundifolia; Vitex rotundifolia var.
subtrisecta; pharmacological activities

Corresponding author. Tel.: +33 5 62 25 98 11; fax: +33 5 62 25 98 02
E-mail : [email protected] (D. Laurent)
Article 2 : Sélection des plantes pour les études de fractionnement bioguidé
116
1.
Introduction
Among the existing seafood-borne
poisonings, Ciguatera Fish Poisoning (CFP)
is one of the most common forms of
ichtyosarcotoxism in the Pacific, Indian and
Caribbean regions (Freidman et al., 2008;
Laurent et al., 2005; Lehane and Lewis,
2000; Lewis et al., 2000; 2006). Though,
generally endemic to tropical and subtropical islands and coastal regions, CFP
cases are now more and more reported in
inland areas (Hammond, 1992) and in
temperate countries due to international
seafood exportation (Moulignier et al., 1995;
Ng and Gregory, 2000; Sadovy, 1997),
tourism (Bavastrelli et al., 2000; de Haro et
al., 2003; Johnson and Jong, 1983) and
global warming incidences (Hales et al.,
1999; Raikhin-Eisenkraft and Bentur, 2002).
Though, largely under-reported (Barbier and
Diaz, 2003), today the frequency of CFP is,
nonetheless, estimated to between 50 000 to
100 000 cases per year (Flemming et al.
2006). While the mortality due to CFP is low
(typically <0.5%), this malady manifests
itself by a variable combination of
gastrointestinal,
neurological
and
cardiovascular symptoms, differing from
person to person in intensity and duration
(Farstad and Chow, 2001; Lehane and Lewis
2000; Pearn, 1994). This leads to an elevated
morbidity and has important socio-economic
impacts on island population (Glazious and
Legrand, 1994; Laurent et al., 2005; Lewis,
1992; Olsen, 1988).
The
marine
neurotoxins
named
ciguatoxins (CTXs) are predominantly
responsible for CFP. Produced by certain
strains of benthic dinoflagellates of the genus
Gambierdiscus (Bagnis et al., 1980), CTXs
are transferred up the marine food chain from
the microalgae to herbivorous and then to
carnivorous coral fishes. At the same time,
these toxins undergo an oxidation process
concomitant with an increase in toxicity up
the chain (Lewis and Holmes, 1993; Lewis et
al., 1994).
All CTXs possess a ladder-shaped
polyether backbone (Nicholson and Lewis,
2006; Yasumoto & Murata 1993) that bind
with high affinity to receptor site 5 of
voltage-sensitive sodium channels (VSSC)
(Bidard et al., 1984; Lombet et al., 1987).
Recently, they have also been shown to act
on the L-type calcium channel by an
activation of the Nitric Oxide Synthase
(NOS) pathway (Sauviat et al., 2006).
Subsequently, the Pacific CTX-1B (P-CTX1B) was shown to up-regulate the mRNA
expression of inducible NOS (iNOS) that
leads to overproduction of nitric oxide (NO)
in murine macrophages RAW 264.7 cells
(Kumar-Roiné et al., 2008). Significant
increase in the mRNA expression of
proinflammatory cytokines; tumor necrosis
factor-alpha (TNF-), the interleukin (IL)-1
and -6, and an anti-inflammatory cytokine,
IL-10 were also observed (Matsui et al., this
issue). An important physiological mediator
(Tuteja et al., 2004), NO may become a
noxious radical when released in large
amounts. Indeed, in these conditions, it is
actively oxidised by reactive oxygen species
(ROS) such as superoxide (O2•–) to produce
peroxynitrite (ONOO–). This extremely
cytotoxic anion, in turn, avidly modifies and
functionally impairs proteins, lipids and
DNA, and depletes tissue antioxidant stores
(Singh and Evans, 1997).
The clinical presentation of CFP has
been addressed in substantial detail by
various authors throughout the global (Arena
et al. 2004; Bagnis et al., 1979; Cheng and
Chung 2004; de Haro et al. 1997; 2003;
Dickey 2008; Geller et al. 1991; Gillespie et
al. 1986; Friedman et al. 2008; Farstad and
Chow 2001; Goodman et al. 2003; Kipping
et al. 2006; Laurent et al. 2005, Lehane and
Lewis 2000; Katz et al. 1993; Ng and
Gregory 2000; Nicholson and Lewis, 2006;
Ruff and Lewis 1994). The typical clinical
features of CFP include acute gastroenteritis
(nausea, vomiting, diarrhoea and abdominal
pain) within 6-12 h of contaminated fish
ingestion. This is followed within 12-72 h by
dramatic
neurocutaneous
symptoms
comprising circumoral and limb paresthesia,
Dysaesthesia and pathognomonic paradoxical
apparent temperature sensation reversal.
117
During this stage, musculoskeletal features
such as myalgia, arthralgia, cramps and
weakness as well as pruritus, sweating and
dental pain may be present. In severe cases,
cardiovascular disorders have been signalled.
Although the acute illness resolves after a
mean of 8 days, neurological symptoms can
last for months and even years (Ting and
Brown, 2001; Lewis, 2006). The chronic
effects of CFP, that include fatigue, loss of
energy, myalgias and headaches, have been
recorded in 3 to 20% of the cases (Barnett
and DiPalma, 2004).
2.
Occidental Treatment
At present, no specific therapy for CFP
has been identified. Treatment has been and
is still primarily symptomatic and supportive.
The palliative care consists of inducing
spontaneous vomiting and diarrhea, which
are thought to enhance elimination of the
toxin. Activated charcoal if administrated
early enough is believed to bring some
benefit through toxin decontamination. The
gastrointestinal symptoms are usually brief
and self-limited, requiring little more than
adequate fluid intake in order to prevent
dehydration. However, in severe cases of
dehydration, intravenous (i.v.) or oral fluid
and electrolyte replacement therapy may be
required. Bed rest and cold shower in cases
of pruritus are advised. In critical cases
involving comatose that requires airway
protection or in cases of respiratory failure,
assistance via endotracheal intubation and
mechanical ventilation may be administrated.
For
cardiovascular
disorders
like
bradycardia, i.v. atropine is generally used. In
cases of shock, mechanical circulatory
support including positive inotropic agents
like dopamine, adrenaline or calcium
gluconate may be required (Baden et al.,
1995; Cheng and Chung, 2004; Gillespie et
al., 1986; Ruff and Lewis, 1994).
Occasionally, in order to manage the
dysrhythmias, temporary cardiac pacing may
also be inserted (Friedman et al., 2008; Ruff
and Lewis, 1994).
A number of occidental medications,
mostly responding to the symptoms of CFP,
are also currently prescribed, however,
without significant or consistent success
(Ruff and Lewis, 1994; Farstad and Chow,
2001; Friedman et al., 2008). Antiemetic and
anti-diarrheic medications are sometimes
prescribed for severe gastrointestinal
disorders. Pruritus usually responds to
antihistamine therapy, but severe pruritus is
difficult to treat. Symptomatic treatment also
includes analgesics for musculoskeletal
symptoms. The relief of neurologic
symptoms has been reported with
amitriptyline, a tricyclic antidepressant, with
variable success (Bowman, 1984; Davis and
Villar, 1986; Calvert et al., 1987; Lange et al.
1992). Gabapentin, with a known efficacy in
neuropathic pain, has recently been reported
to
improve ongoing polyneuropathic
symptoms of CFP in two patients (Perez et
al., 2001). Paracetamol and nifedipine are
prescribed for headaches, and fluoxetine has
been used for chronic fatigue (Calvert et al.,
1987; Berlin et al., 1992; Friedman et al.,
2008). Tocainide was reported to provide
potential benefit to three patients (Lange et
al., 1988).
Other reports have also made claims of
efficiency
of
tocainide,
lignocaine,
mexiletine,
calcium
gluconate,
corticosteroids, and vitamin B12 (Farstad and
Chow, 2001; Cheng and Chung, 2004).
However, all of these claims are entirely
based on small, uncontrolled trial series and
case reports. Owing to the relative
infrequency and irregularity of CFP
occurrence, small numbers, variability in
time of treatment and variability in the
symptomatic profile of study participants,
and the potential inter and intra differences
between Pacific, Indian Ocean and Caribbean
toxins, investigation of specific treatments
has remained unexplored. This is further
exacerbated by the lack of resources for
conducting such studies in regions where
CFP is endemic and by the absence of a
clinical analytic test providing diagnostic
precision. This void of information presents
118
difficulties on the part of treating physicians
to make adequate therapy recommendations.
Intravenous D-mannitol, an acyclic
sugar, is the most studied therapy for CFP
and is considered treatment of choice (Blythe
et al., 1992; Blythe et al., 1994; Eastaugh,
1996; Mitchell, 2005; Palafox, 1992; Pearn et
al., 1989; Schwarz et al., 2008; Slobbe et a.,
2008; Stewart, 1991; Williamson, 1989).
Generally, if administrated within 48-72 h
after toxic fish ingestion, D-mannitol was
reported to alleviate acute and chronic
neurologic and muscular dysfunction, but not
the gastrointestinal symptoms (Blythe et al.,
1994; Palafox et al., 1988). The basis by
which this simple polyol confers its
neuroprotectant effect is unclear, though,
being an osmotic agent it is thought to be
mediated by the osmotic reduction of
neuronal edema (Birinyi-Strachan et al.,
2005; Pearn, 2001). D-mannitol is also the
only therapy that has been evaluated by
randomized blinded clinical trials (Schnorf et
al., 2002). This recent study compared the
effects of D-mannitol to normal saline and
found no difference in relieving symptoms at
24 h. Thus even if the use of D-mannitol has
often been reported utile in CFP, its efficacy
still remains controversial, leading to general
scepticism and reluctance amongst clinicians
(Palafox et al., 1992; Schnorf et al., 2002).
3.
Traditional Remedies
In the Pacific, numerous traditional
herbal remedies are preferentially employed
to treat CFP (Barrau, 1950; Bourdeau, 1985;
Bourdy et al., 1992; Bourret, 1981; Cabalion,
1984a; 1984b; 1984c; 1984d; 1984e; Dufva
et al., 1973; Haddock, 1973; Laurent et al.
1993; Lobel, 1979; Pétard, 1986; Rageau,
1973; 1983; Vienne, 1981; Weiner, 1985).
An ethnopharmacological survey carried out
in New Caledonia and in Vanuatu,
inventoried the use of at least 90 plant
species as folk remedy in CFP (Bourdy et al.,
1992; Laurent et al., 1993). These traditional
remedies are usually water-based and are
concocted in different manners (ebullition,
infusion or maceration) from different parts
(leaves, barks, roots or latex) of the plants.
The application of these herbal preparations
can either be internal as oral administration,
external in the form of a bath to help calm
the sensation of pruritus or both (Bourdy et
al., 1992; Laurent et al., 1993). In New
Caledonia, a wide number of the population
when suffering from CFP prefers, rather than
consulting a physician, to seek advice from
traditional healers or to resort to self-made
herbal preparations. Among these, the use of
is highly preferred in a number of Pacific
islands. Other plants like Euphorbia hirta L.
and species of Vitex L. are also employed in
the treatment of CFP (Bourdy et al., 1992;
Laurent et al., 1993).
An anterior survey carried out in New
Caledonia revealed that 40% of the persons
interrogated used H. foertherianum in the
case of CFP intoxication (Laurent et al.,
1992). It is thus not surprising that the H.
foertherianum tree has been baptised to
„arbre à gratte‟ (Bourret, 1981; Laurent et al.,
1993), which literally means the „scratching
tree‟ after the local colloquial appellation of
CFP as „gratte‟ in New Caledonia due to the
phenomenon of pruritus. Its utilisation in
CFP has also been reported in other parts of
the Pacific region (Bagnis, 1973; Halstead,
1978), namely in Vanuatu, French Polynesia,
Tonga (Bourdy et al., 1992; Pétard, 1986),
Micronesia (Noro et al., 2003), and in the
Ryukyu Islands in Japan (Hashimoto et al.,
1969). The remedy prepared from H.
foertherianum includes essentially either an
infusion or a decoction of a large senescent
leave, and the concoction is either
administrated via oral intake or used in the
form of a bath (Bourdy et al., 1992; Bourret,
1981; Laurent et al., 1993; Pétard, 1986).
Similarly, other parts of this plant, like the
roots and bark are also used (Bourdy et al.,
1992; Bourret, 1981; Cabalion, 1984b;
Laurent et al., 1993; Pétard, 1986; Rageau,
1983).
Widespread in Polynesia, Micronesia
and Melanesia and also present throughout
the Indian Ocean, H. foertherianum is a
119
common coastal plant of the Boraginaceae
family. Derived from the fact that these
plants turn their light green, pubescent leaves
to the sun, it is generally known as the „tree
heliotrope‟ in many of these regions (Manner
and Elevitch, 2006). Originally published as
Tournefortia argentea L.f., it was transferred
to Argusia argentea (L.f.) Heine, and
remained under that name until it was
recently restored to Tournefortia before
being transferred, based on molecular
studies, into Heliotropium under a new name
in 2003 (Hilger and Diane, 2003). It is also
known under the scientific names
Messerschmidia argentea (L.f.) Johnston, T.
arborea Blanco, T. sarmentosa sensu
Christian non Lam. and T. sericea Cham.
(Manner and Elevitch, 2006). Indigenous to
most islands of the Pacific, this strand plant
is also valued for its other medicinal
properties. This includes the application of an
infusion of the leaves to infected cuts and
stings from certain poisonous fish in Tonga,
while in Fiji the roots are used to treat
rheumatism. In Nauru, the meristem and
inner bark of the root are pounded to prepare
medicine for curing rashes in children,
diarrhea, and fish poisoning (Manner and
Elevitch, 2006).
The other herbal preparation includes a
decoction of the whole plant of E. hirta
(Bourdy et al., 1992; Laurent et al., 1993;
Rageau, 1973; 1983). Used in the treatment
of CFP in New Caledonia and Vanuatu
(Bourdy et al. 1992; Rageau, 1973; 1983), E.
hirta, generally regarded as weed, is a
widespread species distributed throughout
the tropical and sub-tropical regions
(Steinman, 2003). Belonging to the family of
Euphorbiaceae, it is also known as E.
pilulifera L. or Chamaesyce hirta (L.) Millsp.
(Johnson et al., 1999). Characterised by an
irritant milky sap, the plant exhibits
interesting pharmacological activities and is
much used in traditional medicines in all
tropical countries of Africa, Asia, America
and Australia as well as in the South Pacific
(Lanhers et al., 1990). In former British
colonies and in America during the 18th and
19th century this herb played a major role in
the treatment of asthma, which earned it the
name “asthma plant” (Blair, T. S., 1917;
British Pharmaceutical Codex, 1911; Felter,
1922; Crellin and Philpott, 1997).
Dysenteral® is an improved traditional
medicine that consists of lyophilised
decoction of aerial part of E. hirta that is sold
in Mali in form of tea sachets and is
employed against acute enteritis and
dysentery (Elujoba et al., 2005; Maiga et al.,
2005). In New Caledonia due to its frequent
use in the treatment of latter disease, it is
popularly named as „herbe à dysenterie‟
(Rageau, 1973; Bourdy et al. 1992; Laurent
et al., 1993).
Various species of Vitex have also been
reported in the use of CFP in New Caledonia
and Vanuatu and as well as in the islands of
Ryukyu (Bourdy et al., 1992; Bourret, 1981;
Halstead, 1978; Laurent et al., 1993; Rageau,
1973; Vienne, 1981). A decoction or
maceration of the leaves of V. rotundifolia
var. subtrisecta (Kuntze) Moldenk or Vitex
rotundifolia L.f. Moldenk is either taken
orally or used when bathing. The roots of
these two plants are also used (Bourdy et al.,
1992; Cabalion, 1984e; Laurent et al., 1993).
Other Vitex species reported in the use of
treatment of CFP are Vitex negundo L.
(Rageau, 1973), and Vitex trifolia L. or Vitex
trifoliata L. (Bourret, 1981; Halstead, 1978;
Vienne, 1981). The genus Vitex in the past
had been widely included in the family
Verbenaceae and has recently been
transferred to the family Lamiaceae or
Labiatae (Abbas Azimi et al., 2006; Cantino,
1992a; 1992b; Cantino et al., 1992; Wagstaff
et al. 1998). However, the infrageneric
taxonomy of Vitex species is still not clearly
established and there is still much confusion
in the identification of these plants (DjiétoLordon et al., 2005).
V. trifolia is a large aromatic shrub with
three-foliolate leaves found along coastlines
of East Africa extending across to as far east
as French Polynesia. This plant is also known
as V. lagundi Ridley, V. repens Blanco
(Wiart, 2006), and is often confounded with
V. rotundifolia L.f (Laurent et al. 1993). V.
rotundifolia or Vitex ovate Thunb., as the
120
name indicates, is round, single-leaved.
Though, now taxonomically distinguished
from V. trifolia, certain continue to think of it
as a simplicifolia variety of V. trifolia (Hu et
al., 2007). Similarly, certain authors consider
that V. trifolia and Vitex negundo L. are the
same species and group them under the name
V. rotundifolia (Laurent et al., 1993).
Considered a panacea, various parts of
the V. trifolia, commonly denominated as
„three-leaves chaste tree,‟ and other species
of Vitex are extensively employed in several
traditional systems of medicine, over the
globe, for a wide variety of illnesses ranging
from minor complaints like headache,
coughing and colds to asthma, tuberculosis,
diabetes and inflammation (Hernández et al.
1999; Hossain et al., 2001; Kannathasan et
al., 2007; Wiart, 2006). Vitex agnus-castus
L., a species related to V. trifolia that is
common to the countries of the
Mediterranean basin have been used in
ancient times as an aphrodisiac, hence the
name „chaste tree.‟ The berries from this
shrub were later to be used as a food spice in
monasteries where it was called „monk‟s
pepper‟ (Ross, 2001). This medicinal plant
has also been since long time used in
conditions pertaining to deregulations of the
female genital system (Daniele et al., 2005;
Artz, 2007). In the Pacific, an infusion of the
leaves of V. trifolia is used in the bath water
of women who given birth as it is believed to
help remove any remaining blood from the
uterus (WHO, 1998). Today, a number of
products of chaste berry, categorized as a
nutraceutical, are widely commercialized and
are indicated for treatment of gynecological
disorders in many countries including Europe
(Artz, 2007; Dugoua et al 2008).
4.
Pharmacological Evaluations
A number of pharmacological studies,
involving an in vivo (mouse bioassay) and
various
in
vitro
(electrophysiology,
neurophysiology,
cellular
physiology,
neurotoxicity,
and
anti-inflammatory)
experimental
approaches
have
been
performed to evaluate the efficiency of
various plants used as traditional remedies
against CFP (Table 1). The whole plant
extract of Euphorbia hirta and the leave
extracts of H. foertherianum and V.
rotundifolia var. subtrisecta, were evaluated
for effects on weight loss and recovery
periods in mice injected intraperitonally (i.p.)
with sublethal dose of CTXs-containing
moray eel liver extract. Of these three
phytotherapies, only the mice co-treated with
the extract of H. foertherianum seemed to
have resisted the corporal loss induced by the
toxins. As for the extract of E. hirta, it
proved to be toxic in this bioassay (Table 1)
(Amade and Laurent, 1992).
The leave extract of H. foertherianum
was later shown to have identical effects as
that of mannitol on isolated frog myelinated
axons treated with P-CTX-1B. By modifying
the function of VSSC, CTXs increase the
intracellular Na+ ion concentration, which
triggers an influx of water, resulting in the
swelling of the node of Ranvier of
myelinated axons (Benoit et al., 2000).
Another effect of CTXs is that they induce
high-frequency, spontaneous and repetitive
action potential discharges in these excitable
membranes (Benoit et al., 1996). Upon cotreatment with the H. foertherianum extract
an inhibition of both the electrophysiological
and osmotic effects of P-CTX-1B on isolated
frog myelinated axons were observed (Benoit
et al., 2000). This extract has also been
reported to counteract P-CTX-1B-induced
swelling in frog and human blood cells
(Table 1) (Boydron et al., 2001; 2002).
Further investigations, using murine
neuroblastoma (Neuro-2a) cells, potentialised
with VSSC agents, ouabain and veratridine,
showed that all of the three above mentioned
extracts (whole plant extract of Euphorbia
hirta, leaves extracts of H. foertherianum and
V. rotundifolia var. subtrisecta), in addition
to the bark extracts of H. foertherianum,
exerted a protective effect against the
cytotoxic action of brevetoxin-3 (PbTx-3)
(Boydron-Le Garrec et al., 2005).
121
Table 1 Phytotherapies used in the treatment of CFP and evaluation of pharmacological activity in different experimental models
Plant Name
Family
Acacia spirorbis Labill.
Artocarpus altilis
(Parkinson) Fosberg
Carica papaya L.
Cerbera manghas L.
Mimosaceae
Moraceae
Cocos nucifera L.
Part
Extraction
Maceration 24 h
Palmae
Leave bud,
latex secreted
Fruit
Male flowers
Latex from
petiole
Young roots
Davallia solida (J.R
Forster & G. Forster)
Swartz
Dendrolobium
umbellatum (L.) Benth.
Dodonaea viscosa (L.)
Jacq.
Duboisia myoporoides
R. Br.
Erythrina variegata
var. fastigiata Panch &
Guillaumin
Euphorbia hirta L
Heliotropium
foertherianum Diane &
Hilger
Heliotropium
foertherianum Diane &
Hilger
Ipomoea pes-caprae
(L.) R. Brown
Davalliaceae
Roots
Decoction 3 min
Papilionaceae
Leaves
Sapindaceae
Morinda citrifolia L.
Pandanus tectorius
Parkinson
Plectranthus
parviflorus Willd.
Solanaceae
Caricaceae
Apocynaceae
Maceration 30 min
Decoction 30 min
Dissolve in water
(40°C)
Decoction 30 min
Experimental Pharmacological Evaluations/Activity
MB EP
NP
CP
AC
ANF
PbTx-3 P-CTX-1B Cytokines
NO iNOS
2
2
1
1
2,4
1
1
1
1,3
2
1
2,3
2
2,3
2
Decoction 15 min
1
2
Leaves
Infusion 20 min
2,3
1,4
Solanaceae
Young leaves
Infusion 20 min
1
2
Papilionaceae
Bark
Maceration 3 h
2
2
2,4
Euphorbiaceae
Boraginaceae
Whole plant
Bark
Decoction 10 min
Decoction 30 min
3
2
1
1
Boraginaceae
Yellowed
leaves
Decoction 20 min
1
Convolvulaceae
Roots
Decoction 20 min
Rubiaceae
Panadanaceae
Fruit
Aerial roots
Lamiaceae
Stems
2
IL-1β
2
2
1
1,4
1
1
1
2
1
1
2
1
1,4
Maceration 30 min
Decoction 30 min
3
2
1
1
2
1
Decoction 10 min
2
3
3
1
1
1
1
1
1
IL-6
IL-10
TNF-α
2
1
1
122
Table 1 Phytotherapies used in the treatment of CFP and evaluation of pharmacological activity in different experimental models
Plant Name
Family
Part
Extraction
Experimental Pharmacological Evaluations/Activity
MB EP
NP
CP
AC
ANF
PbTx-3 P-CTX-1B Cytokines
NO iNOS
2
IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α
Polyscias scutellaria
Araliaceae
Leaves
Decocotion
(Burman F.) Fosberg
Punica granatum L.
Punicaceae
Fruit
Decoction 10 min
2
1
1
Rhizophora x selala
Rhizophoraceae Bark
Decoction 30 min
1,3
1,4
(Salv.) Toml.
Saccharum officinarum Gramineae
Stem
Maceration 24 h
2
2,4
L.
Goodeniaceae
Leaves
Decoction 15 min
2
1
1
1,3
Schinus
Anacardiaceae
Leaves
Infusion 30 min
1
1,3
1
terebenthifolius Raddi
Spondias cytherea
Anacardiaceae
Bark
Maceration 1 h
1
1
1,4
Sonnerat
Spondias cytherea
Anacardiaceae
Leaves
Decoction 10 min
1
2
Sonnerat
Stachytarpheta
Verbenaceae
Roots
Maceration 10 min
1
1
2,3
australis Moldenke
,4
Syzygium malaccense
Myrtaceae
Bark
Decoction 10 min
1
1
(L.) Merr. & Perry
Syzygium malaccense
Myrtaceae
Bark
Maceration 30 min
2,3
1
(L.) Merr. & Perry
Syzygium malaccense
Myrtaceae
Leaves
Infusion 20 min
3
1
1
(L.) Merr. & Perry
Terminalia catappa
Combretaceae
Bark
Decoction
2
Vitex rotundifolia var.
Labiateae
Leaves
2
1
subtrisecta (Kuntze)
Moldenk
Vitex trifolia L.
Labiateae
Leaves
Decoction 30 min
1
1
1
1
1
1
Olacaceae
Roots
Maceration 30 min
3
1
1
Xylocarpus granatum
Meliaceae
Bark
Decoction
2
Koenig
Abbreviation: (MB): mouse bioassay (Amade and Laurent, 1992, Laurent et al., 1993); (EP): electrophysiological assay on the myelinated frog axons (Benoit et al., 2000); (NP):
neurophysiological assay on the node of Ranvier of the myelinated frog axons (Benoit et al., 2000); (CP): cellular physiology on frog and human erythrocytes (Boydron-Le Garrec et al., 2001,
2002); (AC): anticytotoxicity bioassay on PbTx-3- and P-CTX-1B-stimulated Neuro 2a cells (Boydron-Le Garrec et al., 2005); (ANF): antiinflammatory evaluation on LPS-stimulated RAW
264.7 cells (Kumar-Roiné et al.,2009; Matsui et al 2009a; 2009b); (1): active; (2): inactive; (3): toxic; (4) induces spontaneous NO production.
123
Brevetoxins (PbTxs) are another class of
marine toxins that resemble CTXs in
structure and activity. Both of these
neurotoxins bind to site 5 of VSSC, which
depolarises the excitable membranes towards
more negative potentials and, as a
consequence, inhibits its normal inactivation
(Dechraoui et al., 1999). The resulting
prolonged stimulation accompanied by an
abnormal influx of Na+ is responsible for the
cytotoxic activity of these neurotoxins in
Neuro-2a cells (Manger et al., 1995). In this
in vitro bioassay none of the four extracts by
themselves exhibited any cytotoxicity. The
extract of E. hirta was found to exert the
strongest effect against the neurotoxicity
induced by both PbTx-3 and P-CTX-1B
(Table 1). Furthermore, the extract of E. hirta
was shown to have mild but significant
proliferative activity, increasing the viability
cells compared to non-treated cells
(Boydron-Le Garrec et al., 2005).
Recently, in the light of the
inflammatory nature of P-CTX-1B, we have
investigated the effect of these crude extracts
on the production of NO in murine
macrophage (RAW 264.7) cells stimulated
with
the
bacterial
endotoxin,
lipopolysaccharide (LPS) that is well known
to induce the production of proinflammatory
mediators like NO via iNOS over-expression
and various cytokines. None of the four
extracts (whole plant extract of Euphorbia
hirta, bark extract of H. foertherianum,
leaves extracts of H. foertherianum and
V.trifolia) tested showed any cytotoxicity on
the RAW 264.7 cells. Once again, the extract
of E. hirta exhibited the highest activity,
strongly inhibiting the production of NO. An
inhibitory activity was also observed with the
leave extract of V. trifolia. Though, the bark
extract of H. foertherianum proved to be
quite active, the leaves were not. On the
other hand, the bark extract of this plant was
also shown to induce NO production, thus
exhibiting dual and opposite effects (Table 1)
(Kumar-Roiné et al., 2009).
Following the above preliminary
experiments, the anti-inflammatory potential
of the leave extracts of H. foertherianum and
V. trifolia and the whole plant extract of E.
hirta was also evaluated by monitoring the
expression profiles of iNOS and of the proinflammatory (IL-1β, IL-6 and TNF-α) and
anti-inflammatory (IL-10) cytokines. E. hirta
was reported to significantly decrease the
LPS-dependent induction of IL-1β and iNOS
mRNA in time-dependant manner and a
significant attenuation in the expression
levels of IL-6 mRNA and protein was also
observed with this plant. In addition, the
plant also decreased the LPS-dependant
overproduction of TNF-α in the cellular
supernatants (Matsui et al., 2009a). The
extract of V. trifolia also exhibited inhibitory
properties, reducing significantly the
expression levels of IL-1β, IL-6 and iNOS
mRNA and only slightly affecting the TNF-α
mRNA. Moreover, this plant seemed to
induce the LPS-dependant IL-10 antiinflammatory cytokine. These results were
in accord with the expression levels of IL-6,
TNF-α and IL-10 protein quantified (Matsui
et al 2009b). On the other hand, though the
extract of H. foertherianum was able to
reduce the induction of IL-1β mRNA, only a
very slight reduction in the iNOS production
was observed (Matsui et al., 2009a), which
reflects the results obtained when the NO
inhibitory capacity of this extract was studied
(Table 1).
5.
Discussion and Conclusion
An exceedingly unpleasant illness in
man, CFP represents a serious health and
socioeconomic problem, particularly in
island nations of the South Pacific that
depend heavily on fish products for their
livelihood, and where the incidence of CFP is
high. Unfortunately, there is as yet no
medical treatment for CFP beyond the
measures designed to relieve some of the
early symptoms. Hence, based on anamnesis,
a patient can often be prescribed several
drugs in relation to the number of symptoms
the patient may present. In cases where the
symptoms persist, medication may be
prescribed over weeks to months, all of
124
which render the medical care quite costly.
This is exacerbated by the fact that none of
these palliative treatments are wholly
remedial. In many Pacific Islands Countries
and Territories (PICTs), the low familial
incomes, lack of a social health care system,
and even the absence of medical facilities in
isolated areas make such occidental health
care both unaffordable and inaccessible to
common people.
Traditional medicine, on the other hand,
an important practice in the Oceanian culture,
is commonly employed in the South Pacific
in the treatment of CFP, of which the herbal
preparation with the leaves of H.
foertherianum is highly preferred and widely
used. Compared to the extracts of Vitex
trifolia and E. hirta, the leave extract of H.
foertherianum exhibited only a mild antiinflammatory potential. The inflammatory
mediators,
NO induced
via
iNOS
overexpression
and
cytokines,
are
responsible for various pathophysiological
conditions in human (Šimko, 2007). Though
it is not possible as yet to conclude if this
pathway is a result of a direct action of CTXs
or not, the modulation of these factors by PCTX-1B could explain the complex
multifaceted clinical nature of CFP observed
in the region of Pacific, that sole the
activation of VSSC is unlikely to account for
(Dechraoui et al., 1999; Kumar-Roiné et al.,
2008). Hence, the attenuation of induction of
these mediators as observed with the extracts
of V. trifolia and E. hirta could provide
symptomatic relieve in CFP.
On the other hand, various other studies
have reflected the remarkable efficacy of the
leave extract of H. foertherianum in
impeding electrophysiological and osmotic
effects of CTXs. However, it is not yet
known how this plant is able to counteract
these noxious effects of CTXs. Brevenal, a
patented compound isolated from culture of
Karenia brevis, has been recently reported to
act as a molecular antagonist of PbTx-3,
inhibiting the binding of the toxin to VSSC
(Bourdelais et al., 2004). This has solicited
huge interest for its therapeutic development
against the neurotoxic effects of PbTxs
(Abraham et al., 2005; Baden et al., 2005;
Abraham and Baden, 2006; LePage et al.,
2007; Sayer et al., 2008). Due to the
structural and functional similarity of PbTxs
to CTXs (Baden, 1989; Gawley et al., 1992;
Jeglitsch et al., 1998; Dechraoui et al., 1999),
it has been suggested that brevenal could
have the same inhibitory activity on CTXs
(Freidman et al., 2008; Mattei et al., 2008).
Given their lipophilic nature and high affinity
to site 5 of VSSC, CTXs have been reported
to bind quasi-irreversibly to excitable cells
like neurons. By blocking these receptor
proteins in open position, CTXs provoke
electrophysiological
dysfunctions
and
osmotic imbalance (Benoit et al., 1996;
Benoit et al., 2000; Ghiaroni et al., 2005).
Indeed, such neurocellular effects could be
prevented if a molecular antagonist competes
with CTXs for their binding site on the nerve
membranes and subsequently renders the
receptors unavailable.
An effective antidote against CFP would
be a substance that would displace the
already bounded CTX molecules from the
VSSC of the neurones. This may initiate the
process of detoxification and eventual purge
of CTXs from the biological system.
Furthermore, this antagonist, on its own,
should not affect the normal propagation of
the electrical signal in neurones. The process
of synthesising and safely delivering
brevenal as drug for human patients will
require extensive trials. As CFP is essentially
considered a tropical disease, mostly limited
to financial resource-poor settings, the forprofit pharmaceutical industries may not
invest in the development of a new chemical
entity for such condition. To this end, it
would be highly interesting to screen certain
plants; in particular H. foertherianum that has
since long provided a primary source of
health care to man against CFP, in order to
observe such detoxifying ability. Remedies
from these plants could also be suggested in
the form of improved traditional medicine as
already done in other countries with the
plants E. hirta and V. agnus-castus.
Undoubtedly, further scientific investigations
are necessary. Nonetheless, with the
125
advances made in the recent years on the
study of pharmacology of selected
phytotherapies, we have never been closer to
proffering a much awaited effective therapy
against CFP.
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132
II.
Matériel, méthodes et résultats
Les sections II.2 et III.3 décrivent les expérimentations chimiques et biologiques menées
pour chacune des trois plantes E. hirta, H. foertherianum et V. trifolia. Ces plantes ont été
respectivement désignées par les codes Eh, Hf et Vt, suivis par les chiffres ou lettres de
l‟alphabet de façon ascendante en regard des différentes étapes de fractionnement.
Pour chacune de ces plantes, les étapes de fractionnement et les résultats obtenus sont
présentés séparément dans la section II.4 de cette partie.
II.1 Matériel
Sauf spécifications, tous les réactifs et milieux utilisés dans les expérimentations
suivantes proviennent de chez Sigma-Aldrich (Lyon, France).
II.2 Partie chimique
Les méthodes d‟extractions et de séparations chimiques et chromatographiques utilisées
pour chacune des trois plantes sont illustrées dans le Schéma 1.
II.2.1
Extraction
Les extractions ayant été essentiellement menées sur de petites biomasses pour les
expérimentations de criblage de plantes (Tableau 1), de plus amples récoltes et extractions (>
800 g) des trois plantes sélectionnées ont été nécessaires. Ces procédures sont détaillées dans
la section II.4.
Partie 3: Études de fractionnement bioguidé
133
Plantes
(Eh, Hf, Vt, etc)
Ébullition dans de l’eau distillée
Lyophilisation
Extrait aqueux brut
(Eh1, Hf1, Vt1, etc)
Partition liquide-liquide (x3)
Séchage sous vide
Tests biologiques
Eau
n-Butanol
Fractions
Fractions
(Eh3, Hf3, Vt3)
(Eh2, Hf2, Vt2)
Séparations chromatographiques sur colonne (Silice)
Séchage sous vide
Tests biologiques
Colonne ouverte
Colonne ouverte
Sous-fractions actives
Sous-fractions actives
(Hf2a-, Vt2a-))
(Eh2a-)
Fraction Eh2 resoumise à flash chromatographie
Comparaison en CCM avec la fraction active Eh2a-,
Séchage sous vide
Chromatographie sur plaques préparatives
Tests biologiques
Identification
Tests biologiques
Identifcation
Composés
(2, 3)
Composés
(1)
Schéma 1 : Protocole de fractionnement bioguidé mené sur les extraits aqueux d‟E. hirta
(Eh), d‟H. foertherianum (Hf) et de V. trifolia (Vt). La sélection des fractions et sous-fractions
pour le travail complémentaire, découlant des évaluations biologiques, est représentée par la
succession de flèches en gras. Les composés 1 d‟E. hirta, 2 d‟H. foertherianum et 3 de V.
trifolia ont été identifiés puis analysés pour leurs activités biologiques.
133
II.2.2
Fractionnement et isolement
Les trois extraits (Eh1, Hf1 et Vt1) ont été soumis à une partition liquide-liquide entre du
n-butanol et de l‟eau distillée (3 fois). En fonction des évaluations biologiques, les fractions
actives, n-butanolique pour les trois, furent ensuite soumises à des purifications ultérieures par
chomatographie sur colonne (silice) qui donnèrent plusieurs sous-fractions. Ces sous-fractions
ont été à leur tour évaluées pour leurs activités biologiques. Ces purifications successives ont
conduit à l‟identification de trois composés (1-3 ; Fig. 9), un pour chaque extrait (Schéma 1).
Ces trois produits se sont avérés commercialement disponibles et la confirmation de leur
activité a été recherchée sur des produits du commerce.
De plus amples détails sur les paramètres de ces expérimentations sont décrits séparément
pour chacune des trois plantes dans la section II.4.
II.2.3
Analyse structurale
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du 1H (400 MHz) et du
13
C
(100 MHz) ont été obtenus (dans du D2O) sur un spectromètre Bruker ARX 400 (Bruker
BioSpin, Courtaboeuf, France). Les spectres de masse (MS ; modes négatif et positif) furent
réalisés sur un spectromètre Perkin-Elmer API Sciex 365 triple quadripole (Perkin-Elmer,
Concord, ON, Canada) équipé d‟une source d‟ionisation électrospray (ESI).
II.3 Partie tests biologiques
A chaque étape de la purification, des extraits bruts aux molécules isolées en passant par
chaque fraction et sous-fraction, l‟activité inhibitrice du NO• induit par le LPS dans les RAW
264.7 (pour Eh, Hf et Vt) et/ou l‟activité inhibitrice de la liaison de la [ 3H]-PbTx-3 au CSDP
(pour Hf) ont été évaluées (Schéma 1).
Il est à noter qu‟à l‟exception des solvants utilisés pour dissoudre les fractions, sousfractions et produits isolés, et des concentrations testées par la suite, aucune autre
modification n‟a été apportée à ces deux essais biologiques par rapport à ce qui a été décrit
dans les études de criblage des extraits dans les chapitres 1 et 2 de la partie 2.
134
OH
OH
HO
O
OH
HO
O
OH
O
O
OHO
OH
OH
O
O
O
HO
1 : quercitrine
Quercitrin
(M 448)
OH OH
OH
Quercitrin (M 448)
OH OH
OH
HO
O
O
COOH
HO
O
O
O
OH
O
O
O
O
OH
2 : acide rosmarinique
HO
OH
OH
OH
OH
HO
Afzelin (M 432)
OH
OH
O
HO
HO Afzelin (M 432)
H
HO
H
O
O
O
O
H
HO
O
H
HO
O
OH
O
O
OH
OH
O
O (M 466)
Agnuside
3 : agnuside
Agnuside
(M 466)
OH
HO
OH
OH
HO
Figure 9 : Structure chimique de la quercitrine (1), de l‟acide rosmarinique (2) et de
l‟agnuside (3).
134
II.3.1
Bioguidage avec les tests colorimétriques
Les activités inhibitrices du NO• ont été évaluées dans les cellules RAW 264.7 (5 × 104
cellules/puits) activées par 10 µg/mL de LPS par le TG. Parallèlement, les potentiels
cytotoxique et inducteur du NO• des différentes fractions ont été évalués.
Les échantillons ont été redissous dans le DMSO, le MeOH ou l‟eau distillée suivant leur
polarité. Avant de débuter les essais biologiques sur les fractions, des tests ont été effectués
sur des concentrations croissantes de DMSO et de MeOH dans les macrophages RAW 264.7
non activés et activés par le LPS pour observer les effets de ces solvants sur la viabilité
cellulaire et sur les taux de production de nitrite via le TG et le test au MTT, respectivement.
Nous avons observé que le DMSO et le MeOH, au dessus de la concentration minimale
de 2 et 3 % v/v, induisait une cytotoxicité significative de respectivement 10,6 ± 1,1 et 16,4
± 9,3% dans les cellules RAW 264.7. Ainsi, des précautions ont été prises pour ne pas
dépasser cette limite dans le volume final déposé. En outre, pour chaque fraction, sousfraction ou produit pur testé, des contrôles négatifs appropriés ont été appliqués dans chaque
microplaque avec la concentration (%v/v) finale en solvant la plus forte.
Alors que l‟eau distillée et le MeOH ont été utilisés pour redissoudre les extraits et les
fractions, le DMSO et le MeOH ont servi pour la dissolution des sous-fractions et des
molécules pures. A l‟exception des extraits bruts, pour chacun de ces échantillons, les
solutions stocks furent préparées à la concentration de 50 mg/mL et ultrasoniquées pour
favoriser la dissolution. Pour ce qui concerne les extraits bruts, elles furent préparées à 250
mg/mL.
Ces solutions furent ensuite diluées dans le milieu d‟incubation (DMEM) aux
concentrations appropriées pour le test. Ces mélanges ont finalement été répartis dans des
microplaques à 96 puits aux concentrations de 2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL pour les extraits
(Fig. 2), de 50, 100, 500 et 1000 µg/mL pour les fractions (Fig. 10), de 10, 50, 100 et 250
µg/mL pour les sous-fractions (Fig. 11) et de 10, 50, 100 et 500 ou 10, 50, 100 et 250 µg/mL
pour les produits purs (Fig. 10).
136
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
vitro de l‟inhibition du NO• avec les fractions et les molécules pures d‟E. hirta, d‟H.
foertherianum et de V. trifolia. Parallèlement, la capacité à induire spontanément du NO• et la
cytotoxicité des extraits sont évaluées. Les contrôles négatifs présentent les plus fortes
proportions (% v/v) de solvants (MeOH ou eau distillée) utilisées (n =N × 2 ; N = 6).
Puits avec eau stérile
Macrophages RAW 264.7 à la densité de 5 × 104 cellules/puits incubés avec 10 µg/mL
de LPS et des concentrations croissantes de différentes fractions (0, 50, 100, 500 et 1000
µg/mL) ou des molécules pures (0, 10, 50, 100, et 500 ou 0, 10, 50, 100 et 250 µg/mL).
Macrophages RAW 264.7 à la densité de 5 × 104 cellules/puits incubés uniquement
avec les concentrations croissantes de différentes fractions (0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL) ou
des molécules pures (0, 10, 50, 100 et 500 ou 0, 10, 50, 100 et 250 µg/mL).
138
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
vitro de l‟inhibition du NO• avec les sous-fractions d‟E. hirta, d‟H. foertherianum et de V.
trifolia. Parallèlement, la capacité à induire spontanément du NO• et la cytotoxicité des
extraits sont évaluées. Pour ces tests biologiques, deux échantillons différents sont analysés
par microplaque. Les contrôles négatifs présentent les plus fortes proportions (% v/v) de
solvants (DMSO ou MeOH) utilisées (n = N × 2 ; N = 3).
Puits avec eau stérile
Macrophages RAW 264.7 à la densité de 5 × 104 cellules/puits incubés avec 10
µg/mL de LPS et des concentrations croissantes de deux différentes sous-fractions (0, 10, 50,
100 et 500 µg/mL).
Macrophages RAW 264.7 à la densité de 5 × 104 cellules/puits incubés
uniquement avec les concentrations croissantes des deux différentes sous-fractions (0, 10, 50,
100 et 500 µg/mL).
135
II.3.2
Bioguidage avec le test d’interaction ligand-récepteur
L‟activité d‟inhibition de la liaison de la [ 3H]-PbTx-3, a été interprétée par le TILR en
utilisant les synaptosomes de cerveaux de rats comme décrit dans le chapitre 2 de la partie 2.
Pour ces tests, l‟extrait et les fractions sont dissous dans l‟eau et préparés en solution
stock de 50 ou 167 mg/mL. Les sous-fractions et les produits purs sont redissous dans le
DMSO et le MeOH pour fournir des solutions stock à 5 ou 20 mg/mL.Ces solutions sont
ensuite diluées dans le tampon d‟incubation aux concentrations appropriées pour le test. Ces
concentrations sont décrites par la suite.
II.3.3
Analyses des données et statistiques
En ce qui concerne l‟analyse des données des premiers tests biologiques, les pourcentages
de réduction de l‟accumulation de nitrite induite par le LPS, d‟induction spontanée du NO• et
de viabilité cellulaire furent calculés comme précédemment décrit dans le chapitre 1 de la
partie 2.
Les résultats de ces expérimentations ont été exprimés sous forme de moyenne de chaque
expérience menée en duplicate (n = N × 2) où N = 6 pour les fractions et les composés purs
(Fig. 10) et N = 3 pour les sous-fractions (Fig. 11).
Les données liées à l‟inhibition ou à l‟induction du NO• ont été statistiquement évaluées
par le test t de student. Les différences furent considérées comme significatives à P ≤ 0.05.
L‟évaluation statistique de la cytotoxicité a été faite par analyse de variance (ANOVA à deux
facteurs) suivi par le test de Bonferroni en utilisant le logiciel Prism 4.0. Les valeurs de P ≤
0.05 furent considérées comme significatives.
Pour le TILR, 8 ou 4 concentrations en duplicate ont été testées sur 1 à 4
expérimentations selon les échantillons. La réponse est obtenue à partir de l‟IC 50 exprimée en
mg/mL d‟extrait. Un extrait est considéré comme actif lorsque la courbe est de type sigmoïde.
L‟établissement de la courbe, la valeur de coefficient de Hill et les calculs d‟IC 50 ont été
obtenus avec le logiciel Prism 4.0.
136
II.4 Fractionnement bioguidé et isolement
Pour chacune des trois plantes (Eh, Hf et Vt), les expérimentations chimiques et
biologiques qui ont conduites (Schéma 1) à l‟isolement de trois molécules (Fig. 9) sont
présentées ci-dessous.
II.4.1
Euphorbia hirta
Les poids des fractions et les données des activités biologiques obtenus pendant l‟étude
de bioguidage par le TG pour la plante entière d‟E. hirta (Eh) sont présentés dans le Tableau
4.
Les échantillons de plantes entières d‟E. hirta (Eh ; 839,5 g) ont été récoltés sur la bande
côtière de l‟Anse Vata, Nouméa, et extraits par ébullition dans 8 L d‟eau distillée pendant 30
min. La solution aqueuse a été filtrée et lyophilisée pour donner 32,6 g de résidu sec (Eh1).
Testé dans nos criblages sur RAW 264.7 (Fig. 2), l‟extrait Eh1 à 250 µg/mL fut très actif
démontrant une forte capacité à réduire l‟accumulation de nitrite (44,9 ± 6,7%) sans
provoquer ni de cytotoxicité ni d‟induction spontanée de production de NO• (Publication 2).
Par la suite, l‟extrait Eh1 (30 g) a été redissous dans 1 L d‟eau distillée et partitionné
entre 300 mL de n-butanol (Eh2 ; 10,4 g) et de l‟eau distillée (Eh3 ; 19,2 g). Ces deux
fractions furent soumises au TG (Fig.10). Les deux fractions se révélèrent capables d‟inhiber
l‟accumulation de nitrite (réduction de 17,8 ± 7,5% à la plus faible concentration de 50 µg/mL
pour Eh2) sans manifester de cytotoxicité. Cependant, les deux fractions, et plus
particulièrement Eh2, induirent fortement la production de NO• ou provoquèrent des
interférences.
Aussi, la fraction butanolique (Eh2 ; 450 mg) a été sujette à une séparation sur colonne de
chromatographie préparée manuellement (L : 24,5 cm, D : 2,06 cm) avec du gel de silice 60
(Merck, 30,0 g, 230-400 µm mesh size) avec le gradient d‟élution suivant : CH2Cl2-EtOAcMeOH (100:0:0 → 50:50:0 → 0:100:0 → 0:99:1 → 0:98:2 → 0:90:10 → 0:80:20 →
0:60:40→ 0:40:60 → 0:20:80 → 0:0:100).
137
Tableau 4 : Fractionnement bioguidé de l‟extrait aqueux de la plante entière d‟Euphorbia hirta (Eh) avec le test d‟inhibition du NO• (en comparaison de la
cytotoxicité et de l‟induction du NO•) dans des macrophages RAW 264.7 activés ou non par du LPS. Les masses obtenues et les concentrations testées sont
également spécifiées dans ce tableau (voir données des bioactivités sous forme graphique en Annexe 4).
Echantillons
Poids (mg)
Eh1
32600
Eh2
10400
Eh3
19200
Eh2a-1
3,4
Eh2a-2
6,1
Eh2a-3
3,2
Concentrations
testées (µg/mL)
2,5
25
250
2500
50
100
500
1000
50
100
500
1000
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
Bioactivités
Inhibition du
NO•a
-3,0
NS
4,5
NS
44,9
+++
58,8
+++
17,8
+
37,0
+++
52,0
+++
27,4
++
-0,4
NS
3,2
NS
46,2
+++
69,5
+++
-3,1
NS
-6,4
NS
-19,8 NS
27,4
NS
2,4
NS
51,1
+++
59,3
+++
60,0
+++
4,1
NS
71,1
+++
78,2
+++
37,2
++
Induction
du NO•b
NS
NS
NS
NS
--------NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
--NS
NS
NS
---
Viabilité
Cellulairec
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
-NS
+++
+++
+++
NS
++
++
+++
Echantillons
Poids (mg)
Eh2a-4
11,8
Eh2a-5
42,9
Eh2a-6
36,5
Eh2a-7
63,8
Eh2a-8
63,4
Eh2a-9
376,9
Concentrations
testées (µg/mL)
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
Bioactivités
Inhibition
du NO•a
-1,6 NS
26,6 ++
25,5 ++
96.5 +++
-8,3 NS
9,0
NS
2,8
NS
54,1 +++
-3,2 NS
8,5
NS
7,9
NS
60,1 +++
-7,1 NS
-1,5 NS
-4,8 NS
36,6 +++
-1,0 NS
14,0 NS
11,9 NS
54,9 +++
12,9 NS
16,1 NS
5,3
NS
17,9 NS
Induction
du NO•b
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
--NS
NS
NS
--NS
NS
NS
--NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Viabilité
Cellulairec
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
L‟extrait, les fractions, ou sous-fractions qui furent actifs et retenus pour un fractionnement ultérieur sont surlignés en grisé.
a
% de la capacité d‟inhibition du NO• d‟extrait, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 traités avec 10 µg/mL de LPS après 24 h et exprimés sous forme de
moyennes (n = 6 ou 12).
b
% de la capacité d‟induction du NO• d‟extrait, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 après 24 h (n = 6 ou 12).
c
% d‟effet sur la viabilité cellulaire d‟extrait, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 traités avec 10 µg/mL de LPS après 24 h (n = 6 ou 12).
Abréviations : NS : pas de changement significatif (P > 0,05) ; (+), (+ +) et (+ + +) : diminution significative (0,01 < P < 0,05, 0,001 < P < 0,01 et P < 0,001) ; (-), (--) et (---) : augmentation
significative (0,01 < P < 0,05, 0,001 < P < 0,01 et P < 0,001).
138
Sur la base de leurs profils chimiques sur la chromatographie sur couche mince (CCM),
les différentes élutions furent combinées en sous-fractions désignées d‟Eh2a-1 à Eh2a-9. Ces
9 sous-fractions furent ensuite soumises aux tests biologiques (Fig. 11), pour conduire à
l‟identification de la fraction fortement active, Eh2a-4, sans cytotoxicité ni induction
spontanée de NO•.
Suite à l‟identification de la sous-fraction active (Eh2a-4), la séparation à l‟échelle
préparative de la fraction Eh2 (2.1 g) a été menée sur l‟appareil de flash chromatographie
automatisé CombiFlash Companion® (Teledyne Isco, Nebraska, USA) en utilisant une
colonne pré-remplie de 40 g (Teledyne Isco, Nebraska, USA). Un gradient d‟élution de
polarité croissante avec CH2Cl2-EtOAc-MeOH (100:0:0 → 0:100:0 → 0:95:5 → 0:90:10 →
0:80:20 → 0:50:50 → 0:0:100) a été programmé. Ainsi les élutions furent, sur la base de leur
CCM, combinées en sous-fractions d‟Eh2b-1 à Eh2b-10. Les profils chimiques de ces 10
sous-fractions ont été comparés à celui d‟Eh2a-4 par des CCM combinées. Les molécules
potentiellement actives d‟Eh2a-4 furent observées dans les sous-fractions Eh2b-5 à Eh2b-7.
Ces trois sous-fractions réunies (Eh2b-5-7 ; 200 mg) furent soumises à une
chromatographie préparative sur couche épaisse (CCE) de gel de silice 60 (Merck, 2 mm).
Chargées à la concentration de 25-30 mg/plaque, ces CCE ont été éluées dans le système de
solvant CH2Cl2-EtOAc 10:90. Révélés à la lampe UV (254 et 366 nm), le composé 1 (29,7
mg) a été désorbé.
Cette molécule a ensuite été identifiée comme étant la quercitrine d‟après les spectres de
fragmentation de MS (annexe 5), qui ont été comparés à ceux du produit commercial. La
quercitrine
(1 ;
3-[(6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)oxy]-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-
dihydroxy-4H-benzopyran-4-one) est un composé polyphénolique, de masse moléculaire
448.4 et de formule chimique C21H20O11 (Fig. 9).
Par la suite, la quercitrine obtenue commercialement a été évaluée pour son potentiel
inhibiteur dans le TG (Fig. 10) à différentes concentrations (0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL). La
quercitrine possède une légère activité inhibitrice (14,3 ± 2,4%) à 500 µg/mL sur
l‟accumulation de nitrite dans les surnageants de cellules RAW 264.7 activées au LPS (Fig.
12).
139
120
Réponse Relative (%)
100
***
80
60
40
20
0
0
10
50
100
Concentration de la quercitrine (µg/mL)
500
Figure 12 : Effets de la quercitrine (1) sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants
cellulaires et sur la viabilité cellulaire de macrophages RAW 264.7 (5 × 104cellules/puits)
stimulés ou non avec du LPS.
Abréviations : (+), (+ +) et (+ + +): diminution significative (0,01 < P < 0,05, 0,001 < P <
0,01 et P < 0,001).
% de la capacité d‟inhibition du NO• de la quercitrine à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL
dans des macrophage RAW 264.7 après 24 h de traitement avec 10 µg/mL de LPS.
Pourcentages d‟activité calculés par rapport à la production de NO• observée avec le LPS (n =
12).
% d‟effet sur la viabilité des cellules RAW 264.7 traitées avec 10 µg/mL de LPS et de
la quercitrine à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL après 24 h. Pourcentages d‟activité calculés par
rapport à la viabilité cellulaire observée avec le LPS (n = 12).
% de la capacité d‟induction du NO• de la quercitrine à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL
dans des macrophages RAW 264.7 après 24 h. Pourcentages d‟activité calculés par rapport à
la production de NO• observée avec le LPS à 10 µg/mL (n = 12).
139
II.4.2
Les poids des fractions et les données des activités biologiques obtenus pendant les
études de bioguidage par le TG et le TILR pour les feuilles d‟H. foertherianum (Hf) sont
présentés dans le Tableau 5.
L‟extrait d‟H. foertherianum (Hf) a été préparé à partir de 2,1 kg de feuilles sénescentes
récoltées près de la zone côtière de l‟Anse Vata, Nouméa. Après ébullition pendant 30 min
dans 9 L d‟eau distillée, la solution fut filtrée et lyophilisée pour donner 51,9 g de résidu sec
(Hf1). Testé pour sa capacité à inhiber le NO•, l‟extrait Hf1 dans cette étude de criblage (Fig.
2) n‟a pas manifesté d‟activité (Publication 2).
Cependant, cet extrait a été capable d‟inhiber la liaison de la [3H]-PbTx-3 aux
synaptosomes de cerveaux de rats dans le TILR avec une IC50 de 4,25 ± 1,58 mg/mL (Fig.
13A).
En conséquence, l‟extrait Hf1 (36,8 g) a été redissous dans 1 L d‟eau distillée et
partitionné entre 300 mL de n-butanol (Hf2 ; 2,7 g) et de l‟eau distillée (Hf3 ; 30,5 g). Ces
deux fractions furent analysées avec le TILR, aux concentrations de 50 mg/mL pour Hf2 et
167 mg/mL pour Hf3 suivi de 8 dilutions (60, 200, 600, 1200, 2000, 6000, 12000 et 20000
µg/mL, et 200, 667, 2000, 4000, 6667, 20000, 40000 et 66668 µg/mL, respectivement) testées
en duplicate (n = N × 2 ; N = 2). Alors que la fraction aqueuse Hf3 n‟a pas montré d‟activité,
la fraction n-butanolique Hf2 manifesta une activité inhibitrice (IC50 = 3,64 ± 0,36 mg/mL)
légèrement plus forte que le remède traditionnel Hf (Fig. 13A).
Les fractions Hf2 et Hf3 furent aussi soumises au test de l‟inhibition du NO• (Fig.10). La
fraction Hf3 a montré une action modérée mais significative à 1000 µg/mL (29,4 ± 11,4%),
alors que la fraction Hf2 manifesta une activité nettement plus forte de 41,3 ± 4,2% à la
concentration de 100 µg/mL. Cette dernière fraction provoqua spontanément une induction du
NO• ou des interférences à 1000 µg/mL, ainsi qu‟un accroissement significatif de la viabilité
cellulaire de 9,1 ± 1,7% à la concentration de 500 µg/mL.
Etant donné que la fraction butanolique (Hf2) manifesta des activités dans les deux tests,
500 mg de cette fraction ont fait l‟objet d‟une séparation analytique sur colonne de
140
Tableau 5 : Fractionnement bioguidé de l‟extrait aqueux de feuilles d‟Heliotropium foertherianum (Hf) avec le test d‟inhibition de NO• (en comparison de la
cytotoxicité et de l‟induction du NO•) dans des macrophages RAW 264.7 activés ou non par du LPS et avec le test d‟interaction ligand-récepteur pratiqué sur
les synaptosomes de cerveaux de rats co-incubés avec la [3H]-PbTx-3. Les masses obtenues et les concentrations testées sont également spécifiées dans ce
tableau (voir données de tests biochimiques sous forme graphique en Annexe 4).
Echantillons
Hf1
Poids
(mg)
Concentrations
testées (µg/mL)
Inhibition du
NO•a
Induction
du NO•b
2,5
25
250
2500
-4,5
-5,8
3,3
68,6
NS
NS
NS
+++
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
50
100
500
1000
50
100
500
1000
10
50
100
500
10
50
100
500
16,7
41,3
68,3
58,6
3,3
6,4
12,4
29,4
0,7
1,4
19,1
42,5
-0,7
3,8
12,1
92,8
NS
+++
+++
+++
NS
NS
NS
++
NS
NS
NS
+++
NS
NS
NS
+++
NS
NS
NS
--NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
--NS
NS
NS
NS
NS
NS
-NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
+++
NS
NS
NS
NS
105,9
10
50
100
500
4,5
6,3
6,4
49,4
NS
NS
NS
+++
NS
NS
NS
NS
93,4
10
50
100
500
-8,2
-18,5
-7,4
55.9
NS
NS
NS
+++
NS
NS
NS
NS
51900
Hf2
2700
Hf3
30500
Hf2a-1
10,3
Hf2a-2
14,3
Hf2a-3
Hf2a-4
Bioactivités dans les tests d’interaction ligand-récepteur
Bioactivités dans les tests biochimiques
Viabilité
Cellulairec
Solution stock
(mg/mL)
Concentrations
testées (µg/mL)
IC50 (mg/mL)
Coefficient de Hill
50
300 - 20000
4,3 ± 1,6
++
-0,9
50
60 - 10000
3,6 ± 0,4
++
-1,0
167
200 - 66000
ND
-
-0,1
5
6 – 2000
ND
-
ND
5
6 – 2000
ND
-
ND
NS
NS
NS
-
5
6 – 2000
ND
-
ND
NS
NS
NS
NS
5
6 – 2000
1,1
++
-1,2
141
Tableau 5 : Fractionnement bioguidé de l‟extrait aqueux de feuilles d‟Heliotropium foertherianum (Hf) avec le test d‟inhibition de NO• (en comparison de la
cytotoxicité et de l‟induction spontanée du NO•) dans des macrophages RAW 264.7 activés ou non par du LPS et avec le test d‟interaction ligand-récepteur
pratiqué sur les synaptosomes de cerveaux de rats co-incubés avec la [3H]-PbTx-3. Les masses obtenues et les concentrations testées sont également spécifiées
dans ce tableau (voir données de tests biochimiques sous forme graphique en Annexe 4).
Echantillons
Poids
(mg)
-5
12,9
Hf2a-6
258,4
Bioactivités dans les tests d’interaction ligand-récepteur
Bioactivités dans les tests biochimiques
Concentrations
testées (µg/mL)
10
50
100
500 Hf2a
10
50
100
500
Inhibition du
NO•
-4,7
NS
2,3
NS
8,3
NS
59,3
+++
-9,8
NS
-5,3
NS
0
NS
38,6
+++
Induction
du NO•b
NS
NS
NS
NS
NS
NS
-
Viabilité
Cellulairec
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
-
Solution stock
(mg/mL)
Concentrations
testées (µg/mL)
IC50 (mg/mL)
Coéfficient de Hill
5
6 – 2000
ND
-
ND
5
6 – 2000
0,3
++
-1,8
L‟extraits, les fractions, ou sous-fractions qui furent actifs et retenus pour un fractionnement ultérieur sont surlignés en grisé.
Tests biochimiques
a
% de la capacité d‟inhibition du NO• d‟extraits, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 traités avec 10 µg/ml de LPS après 24 h et exprimés sous forme de
b
% de la capacité d‟induction du NO• d‟extraits, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 après 24 h (n = 6 ou 12).
c
% d‟effet sur la viabilité cellulaire d‟extrait, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 traités avec 10 µg/ml de LPS après 24 h (n = 6 ou 12).
Test d‟interaction ligand-récepteur
Abréviations : ND : non défini ; (-) : valeur d‟IC50 ≥ 20 µg/mL pour l‟extrait et les fractions ou ≥ 2 mg/ml pour les sous fractions ; (+) : valeur d‟IC50 < 20 µg/mL pour l‟extrait et les fractions
ou < 2 mg/ml pour les sous fractions ; (++) : échantillons ayant la valeur d‟IC50 < 20 µg/mL (extrait ou fractions) ou < 2 mg/ml (sous fractions) mais également la courbe d‟une allure de
sigmoïde.
142
100
Hf1
Hf2
Hf3
A
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10-2
10-1
100
101
102
Concentration d’extrait ou des fractions (mg/mL)
B
100
Effet relative (% du témoin)
90
80
Hf2a-1
70
50
Hf2a-2
Hf2a-3
Hf2a-4
Hf2a-5
40
Hf2a-6
60
30
20
10
0
10-2
10-1
100
101
Concentration des sous-fractions (mg/mL)
Figure 13 : Courbes de compétition de l‟extrait, des fractions et des sous-fractions
d‟Heliotropium foertherianum (feuilles) sur les synaptosomes de cerveaux de rats. L‟extrait
Hf1 et les fractions butanolique Hf2 et aqueuse Hf3 sont représentés sur la Figure 13A et les
sous-fractions Hf2a-1 à 6 sur le Figure 13B. Des dilutions croissantes d‟échantillons ont été
incubées en présence de brévétoxine tritiée ([ 3H]-PbTx-3, 1 nM).
142
chromatographie (L : 29,0 cm, D : 1,51 cm ) sur gel de silice 60 (Merck, 36,1 g, 230-400 µm
mesh size) avec comme système éluant : CH2Cl2-MeOH (100:0:0 → 0:99:1 → 0:98:2 →
0:95:5 → 0:90:10 → 0:80:20 → 0:60:40 → 0:40:60 → 0:20:80 → 0:0:100). Les sousfractions obtenues ont été combinées au vu de leur profil en CCM pour donner les sousfractions Hf2a-1 à Hf2a-6.
Ces 6 sous-fractions ont été analysées avec le TILR à partir d‟une concentration de 5
mg/mL avec 4 dilutions (20, 120, 600 et 2000 µg/mL) testées en duplicate (n = N × 1 ; N = 2).
Les résultats obtenus sont reportés dans le Tableau 5 et la Figure 13B. Les sous-fractions
Hf2a-4 et 6 montrent une activité dans ce test. Également soumises au TG (Fig. 11), toutes les
sous-fractions ont démontré à 500 µg/mL une capacité à réduire l‟accumulation de nitrite,
dont la sous-fraction Hf2a-1 provoquant en plus une forte cytotoxicité de 98,4 ± 3,8%.
A l‟examen des CCM des 6 sous-fractions, on observe que Hf2a-4, Hf2a-5 et Hf2a-6
partagent un profil chimique similaire avec une pureté relative pour la sous-fraction Hf2a-5.
Aussi, l‟analyse structurale de cette sous-fraction a été effectuée par RMN du proton et du
carbone ainsi que par la spectroscopie de masse (Annexe 5).
Le composé a été identifié comme étant l‟acide rosmarinique (2 ; ~ 12 mg) par
comparaison des données de spectre de masse et de RMN avec celles d‟un échantillon
standard et
celles de
la
littérature. L‟acide rosmarinique
(acide (R)-a-[[3-(3,4-
dihydroxyphenyl)-1-oxo-2E-propenyl]oxy]-3,4-dihydroxy-benzenepropanoique)
est
un
composé polyphénolique, de masse moléculaire 360,3 et de formule chimique C 18H16O8 (Fig.
9).
Un échantillon commercial de l‟acide rosmarinique a ensuite été évalué pour son
potentiel inhibiteur dans le TG (Fig. 10) et le TILR. L‟acide rosmarinique testé en
concentrations croissantes (0, 10, 50, 100 et 250 µg/mL) a démontré une forte activité sur la
réduction de l‟accumulation de nitrite (14,6 ± 7,7% à 100 µg/mL et 65,2 ± 7,5% à 250
µg/mL) dans les surnageants de cellules RAW 264.7 induite par le LPS (Fig. 14). L‟acide
rosmarinique testé à 20 mg/mL avec les 8 dilutions (24, 80, 240, 480, 800, 2400, 4800 et 8000
µg/mL) a démontré une activité inhibitrice de la liaison de la [ 3H]-PbTx-3 aux synaptosomes
146
*
120
100
*
80
60
***
40
*
20
0
0
10
50
100
250
Concentration d'acide rosmarinique (µg/mL)
Figure 14 : Effets de l‟acide rosmarinique (2) sur l‟accumulation de nitrite dans les
surnageants cellulaires et sur la viabilité cellulaire de macrophages RAW 264.7 (5 ×
104cellules/puits) stimulés ou non au LPS.
Abréviations : (+), (+ +) et (+ + +): augmentation ou diminution significative (0,01 < P <
0,05, 0,001 < P < 0,01 et P < 0,001).
% de la capacité d‟inhibition du NO• de l‟acide rosmarinique à 0, 10, 50, 100 et 250
µg/mL dans des macrophages RAW 264.7 après 24 h de traitement au 10 µg/mL de LPS.
Pourcentages d‟activité calculés par rapport à la production de NO• observée avec le LPS (n =
12).
% d‟effet sur la viabilité des cellules RAW 264.7 traitées avec 10 µg/mL de LPS et de
l‟acide rosmarinique à 0, 10, 50, 100 et 250 µg/mL après 24 h. Pourcentages d‟activité
calculés par rapport à la viabilité cellulaire observée avec le LPS (n = 12).
% de la capacité d‟induction du NO• de l‟acide rosmarinique à 0, 10, 50, 100 et 250
µg/mL dans des macrophages RAW 264.7 après 24 h. Pourcentages d‟activité calculés par
rapport à la production de NO• observée avec le LPS à 10 µg/mL (n = 12).
143
avec une valeur d‟IC50 évaluée à 0,88 mg/L et un coefficient de Hill -1,35 (Fig. 15). La valeur
de Ki de l‟acide rosmarinique a ensuite été calculée à 1,43 mM.
Afin d‟estimer précisément le rendement de ce composé, nous avons reproduit la séparation
de la fraction Hf2 (2,1 g) sur l‟appareil de flash chromatographie automatisé CombiFlash
Companion® en utilisant une colonne pré-remplie de 40 g. Le gradient d‟élution à été
programmé pour un accroissement de polarité avec les solvants CH 2Cl2-EtOAc-MeOH
(100:0:0 → 30:70:0 → 5:95:0 → 0:100:0 →0:90:5 → 0:90:10 → 0:80:20 → 0:50:50 →
0:0:100). Au vu des profils sur CCM, les élutions ont été combinées en sous-fractions et
désignées comme Hf2b-1 à Hf2b-17.
Les profils chimiques de ces 17 sous-fractions ont été comparés avec celui de la fraction
Hf2a-5 qui contenait majoritairement l‟acide rosmarinique (2). En conséquence, les sousfractions Hf2b-7, Hf2b-8, Hf2b-9 et Hf2b-10 identifiées comme contenant l‟acide
rosmarinique furent regroupées (Hf2b-7-10 ; 210 mg) pour une nouvelle flash
chromatographie automatisée sur une colonne pré-remplie de 12 g. L‟appareil a été
programmé pour une détection UV à 329 nm (λmax de l‟acide rosmarinique) et avec un
gradient d‟élution EtOAc-MeOH (100:0→ 98:2 → 95:5 → 90:10 → 90:20 → 0:100).
Finalement, 97 mg d‟acide rosmarinique furent isolés et le rendement de ce produit a été
estimé à 0,34% de l‟extrait sec de feuille d‟H. foertherianum (Hf1).
II.4.3
Vitex trifolia
Les poids des fractions et les données des activités biologiques obtenues pendant l‟étude
de bioguidage par le TG pour les feuilles de V. trifolia (Vt) sont présentés dans le Tableau 6.
L‟extrait de V. trifolia (Vt ; 962 g) a été préparé à partir de feuilles collectées en bord de
plage à Nouville, Nouméa. Après 30 min d‟ébullition dans 7,5 L d‟eau distillée, la solution fut
filtrée et lyophilisée pour donner 47,7 g de poudre sèche (Vt1). Testé pour ses qualités
d‟inhibition du NO• (Fig. 2), Vt1 avait manifesté une légère mais significative activité de 13,8
± 9,0% à 250 µg/mL. Comme l‟extrait brut d‟E. hirta, Vt1 n‟a pas provoqué de cytotoxicité ni
d‟induction spontanée du NO• (Publication 2).
144
100
Acide rosmarinique
Effet relatiF (% du témoin)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10-2
10-1
100
Concentration d’acide rosmarinique (mg/mL)
101
Figure 15 : Courbe de compétition de l‟acide rosmarinique (2) sur les synaptosomes de
cerveaux de rats. Des dilutions croissantes de ce composé ont été incubées en présence de
brévétoxine tritiée ([3H]-PbTx-3, 1 nM).
144
Tableau 6 : Fractionnement bioguidé de l‟extrait aqueux de feuilles de Vitex trifolia (Vt) avec le test d‟inhibition du NO• (en comparaison de la cytotoxicité et
de l‟induction du NO•) dans des macrophages RAW 264.7 activés ou non par du LPS. Les masses obtenues et les concentrations testées sont également
spécifiées dans ce tableau (voir données de bioactivité sous forme graphique en Annexe 4).
Echantillons
Poids
(mg)
Vt1
47700
Vt2
13400
Vt3
22200
Vt2a-1
4,3
Vt2a-2
6,7
Vt2a-3
18,4
Concentrations
testées (µg/mL)
2,5
25
250
2500
50
100
500
1000
50
100
500
1000
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
Inhibition du
NO•a
-2,1
NS
-0,5
NS
13,8
+++
67,0
+++
5,3
NS
4,9
NS
41,1
+++
80,2
+++
-8,4
NS
-6,4
NS
1,3
NS
8,3
NS
1,9
NS
14,3
NS
9,3
NS
69,2
+++
82
NS
46,2
+++
48,9
+++
60,3
+++
2,0
NS
44,2
+++
48,2
+++
87,6
+++
Bioactivités
Induction
du NO•b
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
--NS
NS
NS
NS
Viabilité
Cellulairec
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
+++
NS
--+++
NS
NS
NS
+++
Echantillons
Poids
(mg)
Vt2a-4
123,2
Vt2a-5
1604
Vt2a-6
175,2
Vt2a-7
393,3
Vt2a-8
879,6
Concentrations
testées (µg/mL)
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
10
50
100
500
Inhibition du
NO•a
1,2
NS
18,8
NS
11,6
NS
94,0
+++
-2,7
NS
-0,8
NS
-7,6
NS
11,6
NS
-2,0
NS
1,0
NS
-8,7
NS
24,2
+
-2,7
NS
9,2
NS
16,9
NS
69,7
+++
-0,3
NS
1,4
NS
6,8
NS
29,8
+
Bioactivités
Induction
du NO•b
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Viabilité
Cellulairec
NS
NS
NS
+++
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
L‟extrait, les fractions, ou sous-fractions qui furent actifs et retenus pour un fractionnement ultérieur sont surlignés en grisé.
a
% de la capacité d‟inhibition du NO• de l‟extrait, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 traités avec 10 µg/ml de LPS après 24 h et exprimés sous forme de
b
% de la capacité d‟induction du NO• de l‟extrait, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 après 24 h (n = 6 ou 12).
c
% d‟effet sur la viabilité cellulaire de l‟extrait, des fractions ou sous-fractions dans des macrophages RAW 264.7 traités avec 10 µg/ml de LPS après 24 h (n = 6 ou 12).
145
L‟extrait Vt1 (36,3 g) a ensuite été redissous dans 1 L d‟eau distillée et partitionné entre
300 mL de n-butanol (Vt2 ; 13,4 g) et de l‟eau distillée (Vt3 ; 22,2 g). Les résultats du test
pratiqué sur ces deux fractions (Fig. 10) ont révélé que les composés actifs étaient présents
seulement dans la fraction Vt2 qui montra une forte activité inhibitrice du NO• (41,1 ± 6,2% à
500 µg/mL).
Par la suite, la fraction n-butanolique (Vt2 ; 2,1 g) fut sujette à une séparation
préliminaire par colonne de chromatographie (L : 32,5 cm, D : 3,74 cm) sur gel de silice 60
(Merck, 200,7 g, 230-400 µm mesh size) avec comme gradient d‟élution : C6H6-CH2Cl2EtOAc-MeOH (100:0:0:0 → 50:50:0:0 → 0:100:0:0 → 0:50:50:0 → 0:80:20:0 → 0:0:100:0
→ 0:0:99:1 → 0:0:95:5 → 0:0:90:10 → 0:0:80:20 → 0:0:60:40 → 0:0:40:60 → 0:0:20:80 →
0:0:0:100). Les élutions obtenues ont été combinées selon leur profil chimique sur CCM pour
donner les sous-fractions Vt2a-1 à Vt2a-8. Ces sous-fractions ont ensuite été testées (Fig. 11).
Les plus fortes activités inhibitrices du NO• ont été observées avec les sous-fractions
Vt2a-2 et Vt2a-3 à 50 µg/mL et une activité plus faible a été enregistrée dans les sousfractions Vt2a-6 et Vt2a-7 mais à une concentration de 500 µg/mL. Vt2a-2 et Vt2a-3 ont
également manifesté une forte cytotoxicité à 500 µg/mL. Par ailleurs, la dernière sous-fraction
a entraîné une induction spontanée du NO• ou des interférences à la concentration de 500
µg/mL.
A l‟examen des CCM des 8 sous-fractions de Vt2, on observe que Vt2a-6 et Vt2a-7
admettent un profil chimique similaire et semblent relativement pures. Ainsi, ces sousfractions ont été soumises à l‟analyse structurale par spectroscopie de masse (Annexe 5).
Le composé majoritaire a été identifié comme étant l‟agnuside (3 ; > 500 mg) par
comparaison des données de spectre de masse avec celles d‟un échantillon standard et celles
de la littérature. L‟agnuside (3 ; 1S,4aS,5R,7aR)-1-(beta-D-glucopyranosyloxy)-1,4a,5,7atetrahydro-5-hydroxycyclopenta[c]pyran-7-yl]methyl ester)
est
un
composé
glycoside
iridoïde, de masse moléculaire 466,4 et de formule chimique C22H26O11 (Fig. 9).
L‟agnuside commercial a finalement été évalué pour son potentiel inhibiteur dans le TG
(Fig. 16). Dans notre bioéassai, l‟agnuside testé à 10, 50, 100 et 500 µg/mL n‟a pas démontré
146
120
100
80
60
40
20
0
0
10
50
100
Concentration d'agnuside (µg/mL)
500
Figure 16 : Effets de l‟agnuside (3) sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants
stimulées ou non avec du LPS.
% de la capacité d‟inhibition du NO• de l‟agnuside à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL dans
des macrophages RAW 264.7 après 24 h de traitement au 10 mg/mL de LPS. Pourcentages
d‟activité calculés par rapport à la production de NO• observée avec le LPS (n = 12).
% d‟effet sur la viabilité des cellules RAW 264.7 traitées avec 10 µg/ml de LPS et de
l‟agnuside à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL après 24 h. Pourcentages d‟activité calculés par
rapport à la viabilité cellulaire observée avec le LPS (n = 12).
% de la capacité d‟induction du NO• de l‟agnuside à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL dans
des macrophages RAW 264.7 après 24 h. Pourcentages d‟activité calculés par rapport à la
production de NO• observée avec le LPS à 10 µg/mL (n = 12).
146
d‟activité inhibitrice sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants de cellules RAW 264.7
activées au LPS.
III. Discussion et conclusion
En
utilisant
différentes
techniques
de
séparation
(partition
liquide-liquide,
chromatographies sur colonne, sur couche mince, sur plaque épaisse, et flash
chromatographie) ainsi que deux tests biologiques de bioguidage (test de Griess et
d‟interaction ligand-récepteur), nous avons pu isoler les molécules 1-3 à partir des extraits
aqueux de la plante entière d‟E. hirta et de feuilles d‟H. foertherianum et de V. trifolia.
Il convient de noter que nous n‟avons pas identifé toutes les molécules présentes dans les
sous-fractions actives sélectionnées. Par conséquent, la bioactivité mesurée avec les composés
purs 1-3 peut ne pas correspondre avec celle des sous-fractions.
Il faut également souligner que l‟extrait brut de feuilles d‟H. foertherianum (Hf1) qui
n‟avait pas démontré d‟activité inhibitrice du NO•, après simple séparation liquide-liquide a
conduit à une remarquable activité dans la fraction butanolique (Hf2). Cela met en évidence
les effets de la concentration lors du processus de séparation selon laquelle la proportion des
principes potentiellement actifs a été largement amplifiée par rapport à celle de l‟extrait brut.
De même, l‟activité inductrice du NO• a été amplifiée lorsque l‟extrait brut d‟E. hirta (Eh1) a
été fractionné pour donner Eh2. D‟autres séparations menées sur la fraction Eh2 ont conduit à
l‟apparition de cytotoxicité dans certaines sous-fractions, activité qui n‟avait pas été observée
dans la fraction de départ ni dans l‟extrait brut. Similairement, certaines sous-fractions de
l‟extrait de feuilles de V. trifolia montrèrent une forte cytotoxicité non observée
préalablement.
Les trois produits, la quercitrine (1), l‟acide rosmarinique (2) et l‟agnuside (3), sont déjà
bien définis et sont même commercialement disponibles. La quercitrine est une forme
hétéroside de quercetine, un flavonoïde alimentaire majeur et reconnue comme un excellent
antioxydant (Materska, 2008). La quercitrine est présente dans plusieurs préparations de
remèdes utilisées traditionellement dans le traitement des dysfonctionnements gastrointestinaux, dont la préparation connue sous le nom de Dysentral® fait à partir des parties
147
aériennes d‟E. hirta au Mali (Gálvez et al., 1993 ; Maiga et al., 2005). Plusieurs études
scientifiques ont mis en évidence son activité antioxydante, antidiarrhéique et son action
bénéfique sur les pathologies inflammatoires intestinales (Camuesco et al., 2004 ; 2006 ;
Gálvez et al., 1993 ; 1995 ; Sanchez de Medina et al., 1996 ; Wagner et al., 2006). La
quercitrine présente dans l‟extrait aqueux d‟E. hirta pourrait donc jouer un rôle prépondérant
dans l‟amélioration des symptômes gastro-intestinaux durant la phase aigüe de la ciguatera.
L‟agnuside a été isolé de plusieurs espèces de Vitex (Sharma et al., 2009 ; Kuruüzüm-Uz
et al., 2003 ; Suksamrarn et al., 2002). C‟est également un constituant majeur de la
préparation médicinale à base de ces plantes utilisée dans le traitement de la fertilité ou pour
soigner diverses pathologies de l‟appareil reproductif chez la femme (Barceloux, 2008). Les
propriétés anti-inflammatoires de ce composé ont été étudiées (Suksamrarn et al., 2002).
L‟acide rosmarinique est un flavonoïde présent en grande quantité dans les plantes de la
famille des Lamiacées, ou Labiatées (plus de 3% du poids sec) et a aussi été reporté dans de
nombreuses plantes de la famille des Borraginacées (Petersen, 1999). Parmi ses principaux
effets biologiques, on recense son caractère antioxydant et ses propriétés bactéricide,
fongicide et anti-inflammatoire, agissant sur le système cardiovasculaire, lui conférant un
rôle préventif à l‟égard des maladies dégénératives (Sroka et al., 2005 ; Qiao et al., 2005 ;
Kim et al., 2005 ; Psotova et al., 2005 ; Makino et al., 2000 ; Zelić et al., 2005 ; Iuvone et al.,
2006 ; Petersen, 1999 ; Petersen et Simmonds, 2003 ; Zou et al., 1993). L‟acide
rosmarinique fait partie du régime alimentaire de l‟homme et est également utilisé
aujourd‟hui en cosmétique en tant qu'antioxydant et apaisant pour la peau (Eggensperger et
al., 1998). Plusieurs brevets à vocation sanitaire dans le domaine de l‟allergie, du cancer et
de l‟inflammation ont été déposés.12
De nos trois composés, c‟est l‟acide rosmarinique qui a démontré la plus forte activité
de réduction de l‟accumulation de nitrite. Il a également été actif dans notre étude
neuropharmacologique avec le TILR et pour lequel nous avons déposé un brevet (N°
0903781) en août 2009 (Annexe 1). Bien que cette inhibition ne soit pas très forte (Ki 1000
fois supérieure à celle du brevenal), cette bioactivité de l‟acide rosmarinique mérite d‟être
12
Les références de ces brevets sont WO/2005/074959, WO/2005/072723, WO/2002/094301 et US4329361 et
sont extraits des sites de l‟WIPO (http://www.wipo.int) et free patent online (http://www.freepatentsonline.com)
148
étudiée davantage pour les raisons qui seront discutées dans la section suivante réservée aux
perspectives de notre étude.
156
Discussion générale,
conclusion et
perspectives
149
I. Discussion générale
Touchant essentiellement les pays insulaires tropicaux, la ciguatera est du fait de sa forte
incidence dans le Pacifique d‟un intérêt particulier pour les pays et territoires insulaires du
Pacifique (PICTs). En effet, dans la mesure où les produits de la mer provenant des lagons
constituent la source principale voire parfois la seule source de protéines et de revenus pour
ces petites nations insulaires, l‟intoxication par la ciguatera est difficilement évitable.
Bien que la ciguatera soit rarement fatale, les victimes dans la zone pacifique peuvent
présenter un état morbide sévère et durable pouvant évoluer vers la chronicité. La ciguatera a
ainsi un impact socio-économique non négligeable pour les PICTs.
Or, jusqu‟à présent la médecine occidentale ne propose aucun traitement efficace. Parmi
la myriade de médicaments prescrits, tous sont symptomatiques et de soutien et avec une
efficacité irrégulière.
La possibilité d‟avoir recours à la médecine traditionnelle pour traiter la ciguatera est une
connaissance acquise et transmise depuis des générations dans les populations insulaires du
Pacifique. Elles y ont recours fréquemment, plaçant plus de foi, par expérience personnelle ou
collective dans le système traditionnel que le système occidental. En effet, de nombreuses
anecdotes et témoignages sont venus et viennent encore à notre attention, attestant de l‟effet
bénéfique de l‟utilisation de tels remèdes.
Dans notre quête thérapeutique, après les diverses études réalisées (Section II,
Introduction générale), l‟étape suivante était d‟adopter un test biologique nous permettant de
passer du niveau cellulaire au niveau moléculaire. Une telle approche pouvait nous apporter
une meilleure compréhension du mécanisme par lequel une plante est capable de contrecarrer
l‟action nocive des CTXs.
Pour cela, nous avons choisi de développer deux approches biologiques basées sur deux
modes d‟action différents des CTXs. Le premier mécanisme concerne la liaison des CTXs sur
le site 5 des CSDP, dont le rôle est bien défini dans la pathogénèse de la ciguatera. Le
Discussion générale, conclusion et perspectives
150
deuxième s‟appuie sur la récente découverte de la réponse inflammatoire aux CTXs, bien que
le rôle du système immunitaire dans la ciguatera reste encore à préciser.
Lors de l‟étude mécanistique de l‟augmentation du volume des érythrocytes de
grenouille, notre groupe de recherche a souligné, pour la première fois, une action possible de
la P-CTX-1B sur la voie NO•/NOS. Notamment, il a été montré que le gonflement induit par
la P-CTX-1B était prévenu et inhibé par le Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), un
inhibiteur de la NOS (Boydron-Le Garrec, 2005 ; Sauviat et al., 2006).
Durant nos études bibliographiques sur la ciguatera, notre attention a été attirée par le fait
que certains auteurs évoquaient les un lien possible entre les mécanismes pathogéniques des
CTXs et le système immunologique (Bagnis and Kaeuffer, 1974; Kaeuffer et al., 1976; Ruff
et Lewis, 1994). Des études de cas plus récentes ont également mis en évidence des troubles
inflammatoires auto-immuns aigus et chroniques comme le syndrome de Guillain-Barré et les
polymyosites (Angibaud et Rambaud, 1998 ; Gatti et al., 2008 ; Oehler et al., 2009 ; Stommel
et al., 1991 ; 1993).
Dernièrement, un petit nombre d‟études expérimentales ont commencé à confirmer ces
observations. Par exemple, Ryan et collaborateurs (2007) ont montré la modulation de
l‟expression de facteurs immunologiques chez la souris exposée à la P-CTX-1B. De leurs
côtés, les équipes de Tsumoto (2008) et d‟Ui (2008) ont mis en évidence les propriétés
antigéniques des CTXs en décrivant le mécanisme par lequel les antigènes CTX-3C sont
spécifiquement reconnus par des anticorps anti-CTX isolés de souris.
Ainsi, en se basant sur les études antérieures et en gardant à l‟esprit la nature
symptomatique complexe de l‟empoisonnement ciguatérique qui révèlerait une composante
inflammatoire aigüe et chronique, nous avons émis l‟hypothèse du rôle initiateur de
médiateurs inflammatoires (tels l‟iNOS, le NO• et les cytokines pro-inflammatoires) dans la
physiopathologie de la ciguatera.
Nous nous sommes attachés dans un premier temps à mettre en évidence la surproduction
du NO• via l‟activation de l‟enzyme iNOS par la P-CTX-1B. Dans un deuxième temps, nous
avons adapté cette technique pour mettre au point un test de sélection des plantes et pousuivre
leur étude pharmacochimique jusqu‟à l‟isolement des molécules potentiellement bioactives.
151
Notre deuxième hypothèse de travail fut l‟apport possible du test d‟interaction ligandrécepteur et de son adaptation à notre problématique. Etant donné que les CTXs sont connues
pour activer principalement les CSDP, il est très probable que le déplacement des CTXs ou
l‟inhibition de la liaison des CTXs aux CSDP dûs à des agents thérapeutiques agissant sur
cette cible, puissent, au moins en théorie, aider dans le traitement ou la prévention de la
ciguatera.
Ces deux tests biologiques se complètent car ils représentent l‟aspect polymorphe de la
ciguatera qui peut être dû à deux mécanismes pathogéniques distincts, l‟un d‟ordre
pharmacologique et l‟autre très probablement d‟ordre immunologique (Bagnis et al., 2006).
II.
Conclusion
Dans un premier temps, nous avons démontré, in vitro, la modulation de l‟expression de
l‟iNOS et de la production de NO• par la P-CTX-1B dans les macrophages murins RAW
264.7 par le test de Griess et la qPCR (Partie 1).
Ces deux méthodologies ont été ensuite utilisées pour un criblage des plantes.
Pour chaque extrait de plante, l‟évaluation de l‟inhibition du NO• (mesurée par le TG) sur
macrophages RAW 264.7 activés au LPS, a été couplée à une mesure de sa capacité propre à
induire le NO• (test en absence de LPS) et de son potentiel cytotoxique (test au MTT, en
présence de LPS). L‟activité antioxydante de ces extraits par le test au DPPH a également été
évaluée. Ceci nous a conduit à confirmer les activités anti-inflammatoires des extraits de
plantes entières d‟E. hirta, de feuilles et d‟écorce de S. malaccense, de feuilles de S.
terebenthifolius et de V. trifolia, de fruit de P. granatum, de latex de C. manghas, de racines
de X. americana et de racines aériennes de P. tectorius (Partie 2, Chapitre 1).
Le test d‟interaction ligand-récepteur nous a permis d‟observer l‟activité inhibitrice des
extraits de racines aériennes de P. tectorius et de feuilles d‟H. foertherianum et de V. trifolia,
vis-à-vis de la fixation de [3H]-PbTx-3 à son récepteur spécifique sur les synaptosomes de
cerveaux de rats de façon dose-dépendante. Pour l‟extrait d‟H. foertherianum, nous avons pu
152
observer que cette activité inhibitrice provenait de l‟affinité de cet extrait pour le site de
liaison du ligand empêchant ainsi l‟accès de [ 3H]-PbTx-3 au site (Partie 2, Chapitre 2).
Pour démontrer l‟applicabilité de ces deux tests, quelques travaux de phytochimie ont
ensuite été menés sur l‟extrait de plantes entières d‟E. hirta, et les extraits de feuilles d‟H.
foertherianum et V. trifolia. Ceci a conduit à l‟isolement et à l‟identification de 3 molécules,
la quercitrine, l‟acide rosmarinique et l‟agnuside, à partir respectivement d‟E. hirta, d‟H.
foertherianum et de V. trifolia. Suite à cela, nous avons testé ces produits commercialisés et
l‟acide rosmarinique a démontré des propriétés intéressantes dans nos deux tests (Partie 3).
Ces travaux ont collectivement conduit à 4 publications (dont 2 en premier auteur) dans
des revues internationales à comité de lecture. Une revue a été soumise et deux autres sont en
préparation. Un brevet a été également déposé sur la bioactivité de l‟acide rosmarinique
(Annexe 1).
III. Perspectives
Nous avons démontré que l‟acide rosmarinique inhibait la fixation de la [ 3H]-PbTx-3 au
site 5 des CSDP. Ainsi, cette molécule peut servir de composé modèle pour le développement
de thérapies pour prévenir ou soigner l‟intoxication liée à l‟exposition aux marées rouges dues
aux efflorescences de dinoflagellé, K.brevis, et impliquant les PbTxs.
Néanmoins, gardant en mémoire que les PbTxs et les CTXs agissent sur les CSDP à
travers le même mécanisme et le même site, il est possible que l‟acide rosmarinique (ou un
autre produit similaire) puisse être aussi utilisé dans le traitement de la ciguatera.
L‟acide rosmarinique a l‟avantage d‟être déjà utilisé en cosmétique et dans des
ingrédients alimentaires. Aucune allégation ni contre-indication n‟a été répertoriée (voir
Fiche Ingrédient de Nutrialpha, 2007)13. L‟acide rosmarinique ne présente qu‟une faible
toxicité avec une DL50 de 561 mg/kg en i.v. chez la souris. Ce composé est reconnu pour un
bon nombre d‟activités fortes intéressantes et suscite beaucoup d‟enthousiasme. Plusieurs
13
Fiche Ingrédient : Acide Rosmarinique de NutriAlpha (www.nutrialpha.com), mise à jour le 10 octobre 2007
153
études se sont portées sur les possibilités de production industrielle par des approches
biotechnologiques (Park et al., 2008 ; Petersen, 1999).
Son extraction à partir d‟H. foertherianum ou d‟autres herbes culinaires de la famille des
Lamiaceae dont le romarin, est également envisageable et sans doute à faible prix, ce qui est
un avantage non négligeable pour la région du Pacifique. Cependant, des études plus
poussées sont nécessaires pour confirmer l‟activité détoxifiante de ce produit contre les
CTXs et son innocuité pour un usage humain.
Aussi, pour valoriser l‟acide rosmarinique en vue d‟un traitement de la ciguatera,
certaines expériences sont envisagées dans le futur proche, telles que :

des essais in vivo sur souris pour étudier son innocuité et ses effets bénéfiques sur
l‟action néfaste des CTXs,

des essais électrophysiologiques et neurophysiologiques pour étudier ses effets contre
les dysfonctions électriques et osmotiques engendrées par les CTXs,

des tests sur neuroblastomes pour étudier son effet contre la cytotoxicité induite par
les CTXs et

des études de relation structure-activité de ce composé avec le test d‟interaction
ligand-récepteur en vue d‟améliorer la faible valeur de Ki (1,43 mM), reflet de son faible
degré d‟affinité vis à vis des CSDP.
157
Références
Bibliographiques
14
14
Hors articles (les références des articles figurent au sein de ceux-ci).
154
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Référence
168
Annexes
165
ANNEXE 1 : DIFFUSION DE L’INFORMATION SCIENTIFIQUE
ARTICLES (REVUES À COMITÉ DE LECTURE)
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Pauillac, S., Laurent, D. Ciguatera fish poisoning and other
seafood intoxication syndromes. A revisit and a review of the existing treatment employed
in ciguatera fish poisoning. South Pacific Journal of Natural Science, soumis.
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Chinain, M., Laurent, D., Pauillac, S., 2008. Modulation of
inducible nitric oxide synthase gene expression in RAW 264.7 murine macrophages by
Pacific ciguatoxin. Nitric Oxide, 19, 21-28.
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Reybier, K., Darius, H.T., Chinain, M., Pauillac, S., Laurent,
D., 2009. Ability of certain plant extracts traditionally used to treat ciguatera fish poisoning
to
inhibit
nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages.
Journal of
Ethnopharmacology, 123, 369-377.
Kumar-Roiné, S., Darius H. T., Matsui, M., Molgó, J., Chinain, M., Pauillac, S., Laurent, D.
Traditional Remedies Employed in the Treatment of Ciguatera Fish Poisoning: Examples
of Use of Three Plants in the Pacific. Toxicon, en préparation.
Matsui, M., Kumar-Roiné, S., Darius, H. T., Chinain, M., Laurent, D., Pauillac, S., 2009.
Characterisation of the anti-inflammatory potential of Vitex trifolia L. (Labiatae), a
multipurpose plant of the Pacific traditional medicine. Journal of Ethnopharmacology,
doi:10.1016/j.jep.2009.09.020.
Matsui, M., Kumar-Roiné, S., Darius, H.T., Chinain, M., Laurent, D., Pauillac, S., 2009.
Pacific ciguatoxin 1B-induced modulation of inflammatory mediators in a murine
macrophage cell line. Toxicon, doi:10.1016/j.toxicon.2009.05.039.
Matsui, M., Kumar-Roiné, S., Laurent, D., Pauillac, S. Ciguatera therapy : the relevance of in
vitro models for natural products based drug discovery. Toxicology In Vitro, en
preparation.
Annexe 1
166
COMMUNICATIONS, POSTERS, AUTRES (COLLOQUES, CONGRÈS,
DOCTORIALES)
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Reybier-Vuattoux, K., Darius, H.T., Chinain, M., Pauillac, S.,
Laurent, D., 2008. Assessment of therapeutic efficacy of medicinal plants used against
Ciguatera Fish Poisoning through inhibition of nitric oxide production. Ciguatera and
Associated Biotoxins Workshop, 27-31, October, 2008, Noumea, New Caledonia
Kumar-Roiné S., Pauillac S., Laurent D., 2006. Studies on the efficacy of the traditional
remedies in the treatment of ciguatera through the inhibition of inducible nitric oxide
synthase (iNOS). 4ème Colloque International sur les Plantes Aromatiques et
Médicinales des Régions d’Outre-Mer, 10-13 juillet 2006, Tahiti, Polynésie Française.
Pauillac S., Vernel-Pauillac F., Kumar-Roiné S., Sauviat M.P., Benoit E., Chinain M.,
2006. First evidence of the implication of nitric oxide in a mouse model for Ciguatera
Fish Poisoning. 12th International Conference on Harmful Algae, 4-8 septembre 2006,
Copenhagen, Danemark.
Kumar-Roiné, S., 2008. Etude de l‟efficacité thérapeutique des plantes médicinales
utilisées dans le traitement de la Ciguatéra. Doctoriales de Nouvelle-Calédonie, 7 et 8
octobre, 2008, Nouville.
Kumar-Roiné, S., Matsui, M., Reybier-Vuattoux, K., Darius, H.T., Chinain, M., Pauillac, S.,
Laurent, D., 2008. Therapeutic efficacy of plants traditionally used to treat Ciguatera Fish
Poisoning via nitric oxide inhibition. 5ème CIPAM, Colloque International sur les Plantes
Amoratiques et Médicinales des regions d’outre-mer, 3 au 6 novembre, 2008, Nouméa,
Nouvelle-Calédonie (Poster)
Matsui, M., Kumar-Roiné, S., Chinain, M., Laurent, D., Pauillac, S., 2009. Evaluation of the
anti-inflammatory potential of plants extracts traditionally used for the treatment of
ciguatera fish poisoning in the South Pacific. Actes des Doctoriales conjointes UPF/UNC,
02 au 06 mars, Tahiti, no pagination.
Annexe 1
167
Annexe 1
168
Annexe 1
169
Annexe 1
170
Annexe 1
171
Annexe 1
172
ANNEXE
2:
RÉSULTATS
DE
CRIBLAGE
(TESTS
BIOCHIMIQUES)
Annexe 2: Effets des extraits de plantes sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants de
cellules et sur la viabilité cellulaire des macrophages RAW 264.7 (5 × 104cellules/puits)
Abréviations : (+), (++) et (+++): augmentation ou diminution significative (0.01 < P < 0,05,
0,001 < P < 0,01 et P < 0,001).
% de la capacité d‟inhibition du NO• des extraits à 0, 2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL dans
des macrophages RAW 264.7 après 24 h de traitement avec 10 µg/ml de LPS. Pourcentages
d‟activité calculés par rapport à la production de NO• observée avec le LPS (n = 12).
% d‟effet sur la viabilité des cellules RAW 264.7 traitées avec 10 µg/ml de LPS et des
extraits à 0, 2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL après 24 h.. Pourcentages d‟activité calculés par
rapport à la viabilité cellulaire observée avec traitement au LPS (n = 12).
% de la capacité d‟induction du NO• des extraits à 0, 2,5, 25, 250 et 2500 µg/mL dans
des macrophages RAW 264.7 après 24 h. Pourcentages d‟activité calculés par rapport à la
production de NO• observée avec le LPS à 10 µg/mL (n = 12).
Annexe 2
173
140
Artocarpus altilis (feuilles bourgeons et latex)
140
*
120
***
100
***
80
60
***
40
***
120
*
20
100
60
40
***
20
2,5
25
250
Concentration (µg/mL)
0
2500
Carica papaya (fleurs mâles)
120
2,5
25
250
2500
Cerbera manghas (latex de pétiole de feuilles)
100
***
80
60
40
100
***
***
0
0
***
80
***
60
40
20
20
0
0
0
Annexe 2
***
80
0
120
Capsicum frutescens (fruits)
2,5
25
250
2500
0
2,5
25
250
2500
174
120
Cocos nucifera (racines)
100
***
80
60
***
40
***
100
60
40
20
0
0
0
2,5
25
250
***
80
20
120
Davallia solida (rhizomes)
120
0
2500
2,5
25
250
2500
Dendrolobium umbellatum (feuilles)
120
Dodonaea viscosa (feuilles)
*
100
80
60
***
***
40
100
80
60
20
0
0
Annexe 2
2,5
25
250
2500
***
40
20
0
***
***
***
***
0
2,5
25
250
2500
175
120
Duboisia myoporoides (feuilles)
100
100
80
60
***
40
*
20
80
***
***
40
20
2,5
25
250
0
2500
Euphorbia hirta (plante entière)
*
120
2,5
25
250
2500
Heliotropium foertherianum (écorce)
100
80
***
60
***
***
40
100
***
60
0
0
0
25
250
2500
***
***
40
0
2,5
***
60
20
0
***
80
20
Annexe 2
***
***
0
120
Erythrina variegata var. fastigiata (écorce)
120
***
0
2,5
25
250
2500
176
120
Heliotropium foertherianum (feuilles jaunies)
120
Ipomoea pes-caprae (racines)
***
100
80
60
***
40
***
Réponse Rlative (%)
100
60
***
40
20
20
0
0
0
2,5
25
250
2500
0
2,5
Morinda citrifolia (fruits)
120
100
***
80
60
40
20
*
2500
***
80
60
***
40
20
0
0
0
Annexe 2
25
250
Pandanus tectorius (racines aériennes)
100
**
120
***
***
80
2,5
25
250
2500
0
2,5
25
250
2500
177
120
Punica granatum (fruits)
120
***
100
100
Rhizophora x selala (écorce)
***
80
60
40
***
20
80
***
***
***
60
40
20
*
**
0
0
0
25
250
Saccharum officinarum (tiges)
120
100
0
2500
***
80
***
60
***
40
0
Annexe 2
2500
Scaevola sericea (feuilles)
***
***
***
40
0
25
250
2500
60
20
2,5
25
250
80
20
0
2,5
100
120
2,5
***
0
2,5
25
250
***
2500
178
120
Schinus terebenthifolius (feuilles)
120
***
Spondias cytherea (écorce)
*
***
100
***
80
60
***
***
40
100
60
0
25
250
2500
120
60
40
***
80
*
60
***
0
2500
**
40
0
25
250
2500
***
20
2,5
25
250
80
20
0
2,5
Stachytarpheta australis (racines)
100
100
Annexe 2
***
0
Spondias cytherea (feuilles)
***
40
0
2,5
***
***
20
120
80
20
0
***
0
2,5
25
250
2500
179
120
***
Syzygium malaccense (écorce)
120
***
***
60
40
80
60
**
20
0
0
2,5
25
250
0
2500
120
Vitex trifolia (feuilles)
100
80
60
***
***
***
***
***
***
0
2500
2500
40
0
25
250
Ximenia americana (écorce de racines)
60
20
2,5
25
250
80
20
0
2,5
100
**
40
***
40
20
0
80
***
Annexe 2
**
100
100
120
Syzygium malaccense (feuilles)
0
2,5
25
250
2500
180
ANNEXE 3 : PHOTOS DES PLANTES SÉLÉCTIONNÉES
Euphorbia hirta L.
(Euphorbiaceae)
Diane & Hilger
(Boraginaceae)
Vitex trifolia L. (Labiateae)
Annexe 3
181
ANNEXE 4 : RÉSULTATS DE FRACTIONNEMENT BIOGUIDÉ
(TESTS BIOCHIMIQUES)
Effets des fractions et des sous fractions d‟Euphorbia hirta (Eh), d‟Heliotropium
foertherianum (Hf) et de Vitex trifolia (Vt) sur l‟accumulation de nitrite dans les surnageants
Abréviations : (+), (++) et (+++): augmentation ou diminution significative (0,01 < P < 0,05,
0,001 < P < 0,01 et P < 0,001).
% de la capacité d‟inhibition du NO• des fractions à 0, 50, 100, 500 et 1000 µg/mL ou
des sous fractions à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL dans des macrophages RAW 264.7 après 24
h de traitement avec 10 µg/mL de LPS. Pourcentages d‟activité calculés par rapport à la
production de NO• observée avec le LPS (n = 12).
% d‟effet sur la viabilité des cellules RAW 264.7 traitées avec 10 µg/mL de LPS et
des fractions à 0, 50, 100, 500 et 1000 µg/mL ou des sous fractions à 0, 10, 50, 100 et 500
µg/mL après 24 h. Pourcentages d‟activité calculés par rapport à la viabilité cellulaire
observée avec traitement au LPS (n = 12)..
% de la capacité d‟induction du NO• des fractions à 0, 50, 100, 500 et 1000 µg/mL ou
des sous fractions à 0, 10, 50, 100 et 500 µg/mL dans des macrophages RAW 264.7 après 24
h. Pourcentages d‟activité calculés par rapport à la production de NO• observée avec le LPS à
10 µg/mL (n = 12).
Annexe 4
182
Eh2
100
*
100
*
***
**
80
***
60
***
***
***
40
***
80
***
60
20
0
0
50
100
500
***
40
20
0
Eh3
120
120
1000
0
50
140
Eh2a-1
120
**
100
80
60
40
***
80
***
60
***
***
40
20
20
0
0
***
***
***
0
Annexe 4
1000
Eh2a-2
100
120
100
500
*
10
50
100
500
0
10
50
100
500
183
120
Eh2a-3
120
100
100
***
**
**
80
**
60
40
***
***
20
60
40
***
10
50
100
500
0
Eh2a-5
120
10
50
100
500
Eh2a-6
100
80
60
***
***
40
100
**
0
0
80
60
***
40
***
20
20
0
0
0
Annexe 4
**
80
20
***
0
120
Eh2a-4
10
50
100
500
0
10
50
100
500
184
140
Eh2a-7
120
100
120
Eh2a-8
100
80
***
60
40
80
***
60
40
***
20
20
0
0
0
140
10
50
100
0
500
120
Eh2a-9
100
80
60
40
Hf2
500
**
80
***
60
20
0
0
0
10
50
100
500
***
***
***
40
20
Annexe 4
50
100
100
120
10
0
50
100
500
1000
185
120
Hf3
120
*
100
**
80
60
40
100
Hf2a-1
80
***
60
***
40
20
20
***
0
0
0
120
50
100
500
0
1000
Hf2a-2
120
80
60
40
20
***
500
Hf2a-3
*
80
***
60
40
20
0
0
0
Annexe 4
50
100
100
Résponse Relative (%)
100
10
10
50
100
500
0
10
50
100
500
186
Hf2a-5
120
120
100
100
Hf2a-4
80
60
***
40
60
20
0
0
120
10
50
100
120
Hf2a-6
*
60
***
*
80
***
0
Annexe 4
***
40
0
500
500
60
20
50
100
50
100
Vt2
80
20
10
10
100
100
0
*
0
500
40
***
40
20
0
80
0
50
100
500
1000
187
120
120
Vt3
60
*
40
80
*
80
***
40
20
0
0
50
100
500
Vt2a-2
*
0
1000
120
**
**
***
60
20
0
100
10
50
100
80
***
60
***
***
40
***
20
Vt2a-3
80
***
***
60
40
***
20
***
0
***
0
0
Annexe 4
500
100
*
100
100
120
Vt2a-1
10
50
100
500
0
10
50
100
500
188
120
120
Vt2a-4
100
80
***
60
40
20
100
60
40
0
0
10
50
100
0
500
120
Vt2a-6
*
80
60
40
50
100
500
Vt2a-7
80
60
20
0
0
0
10
50
100
500
***
40
20
Annexe 4
10
100
100
80
20
***
0
120
Vt2a-5
0
10
50
100
500
189
120
Vt2a-8
100
*
80
60
40
20
0
0
Annexe 4
10
50
100
500
190
ANNEXE 5 : SPECTRES DE RMN ET DE MASSE
Spectres MS, MS/MS et MS de la quercitrine (1)
NL: 2.66E7
Eh-2b-20-2#110-125 RT:
1.59-1.75 AV: 7 F: - c ESI Full
ms [ 75.00-2000.00]
431.20
100
80
60
386.85
20
0
100
304.91
101.48 141.11
550.82
468.93
40
632.83
536.90
372.81
611.07
490.79
222.85
NL: 7.15E6
Eh-2b-20-2#13-49 RT:
0.27-0.57 AV: 37 F: - c ESI
Full ms2 [email protected] [
115.00-450.00]
285.23
80
60
40
20
124.92 151.07
0
100
227.36 255.37
257.22
327.16 357.14
431.33
NL: 9.09E5
Eh-2b-20-2#75-98 RT:
0.84-1.08 AV: 24 F: - c ESI
Full ms3 [email protected]
[email protected] [
75.00-450.00]
80
60
229.27
40
267.29
213.25
20
285.35
163.21
135.00
0
100
150
200
250
300
350
m/z
400
450
500
550
600
650
MS et MS/MS de l‟acide rosmarinique (2)
359.12
100
NL: 5.31E7
Heliotropium#159-183
RT: 1.98-2.35 AV: 25
F: - c ESI Full ms [
95.00-1000.00]
80
60
40
161.24
20
197.14
135.31
0
100
201.22
97.94
463.24
381.12
256.36 295.28 313.14 335.25
417.08
493.15
161.20
NL: 7.39E6
Heliotropium#195-221
RT: 2.51-2.72 AV: 27
F: - c ESI Full ms2
[email protected] [
95.00-370.00]
80
60
40
197.05
20
223.05
133.27
0
100
Annexe 5
150
200
249.11
284.98 315.15
250
300
m/z
359.29
350
400
450
500
191
Spectre 13C de l‟acide rosmarinique (2)
Spectre 1H général de l‟acide rosmarinique (2)
Annexe 5
192
Spectre 1H zone des H aliphatiques de l‟acide rosmarinique (2)
Spectre 1H zone des aromatiques de l‟acide rosmarinique (2)
Annexe 5
193
MS et MS/MS de l‟agnuside (3)
501.06
100
80
NL: 1.00E7
Vt-2a-47#2-11 RT:
0.04-0.30 AV: 10 F: c ESI Full ms [
135.00-2000.00]
465.32
60
40
20
0
100
137.20
179.16
225.24
285.31
339.55
373.22
543.29
447.35
578.84
639.08
701.34
285.14
NL: 1.03E7
Vt-2a-47#93-126 RT:
1.44-1.63 AV: 22 F: c ESI Full ms2
[email protected] [
125.00-520.00]
80
60
40
303.10
20
241.26
259.12
137.17
215.17
0
150
200
250
327.01
300
375.40
350
447.08
400
450
500
550
m/z
L‟ion à m/z 501 correspond à un adduit Cl sur l‟agnuside.
Annexe 5
600
650
700
Thèse de Doctorat 2009
KUMAR-ROINÉ Shilpa
Valorisation de remèdes traditionnels utilisés dans le traitement de la ciguatera dans le Pacifique
Résumé :
La ciguatera est une intoxication liée à l‟ingestion de poissons de récif corallien devenus toxiques par
l‟accumulation d‟une ou plusieurs neurotoxines d‟origine dinflagellaire. Cet ichytosarcotoxisme représente
une des formes parmi les plus fréquentes d‟intoxication dans les régions tropicales et subtropicales et se
manifeste par une cohorte de symptômes complexes chez l‟homme. Malgré les nombreuses connaissances
acquises ces dernières dizaines d‟années, la ciguatera, par ses aspects et conséquences multiples, reste à
l‟origine des fortes préoccupations environnementales, socio-économiques, sanitaires et nutritionnelles des
populations insulaires du Pacifique. En effet, bien que la mortalité due à la ciguatera reste faible, la
persistance et la résurgence de certains symptômes comme le prurit et l‟évolution possible de la maladie vers
une forme de fatigue chronique entraîne une importante morbidité chez les patients atteints. L‟agent causal
de la ciguatera, identifié comme étant une micro-algue du genre Gambierdiscus, produit les toxines
incriminées, les ciguatoxines (CTXs) qui agissent principalement par fixation directe au site 5 du canal
sodium voltage dépendant. Cependant, ce mode d‟action n‟explique pas tous les symptômes de la ciguatera,
plus particulièrement les signes d‟ordre inflammatoire.
La première partie de cette étude a ainsi consisté à mettre en évidence, l‟action de la CTX-1B du
Pacifique (P-CTX-1B) sur la surproduction d‟oxyde nitrique (NO) via la modulation de son enzyme de
synthèse, la NO synthétase inductible (iNOS), impliquant ainsi pour la première fois ce mécanisme
pathogénique inflammatoire dans la ciguatera.
La deuxième partie concerne les travaux de l‟évaluation de potentiel thérapeutique d‟une trentaine
d‟extraits de plantes. En effet, la médecine occidentale reste peu efficace et symptomatique pour traiter
durablement les patients souffrant de ciguatera. En Nouvelle-Calédonie où elle est dénommée « gratte », la
ciguatera y est communément traitée par divers remèdes à base de plantes. Cette riche pharmacopée
traditionnelle propose alors une alternative intéressante. La nécessité d‟enrichir l‟arsenal thérapeutique dans
le traitement de la ciguatera nous a conduit à caractériser, d‟une part, le potentiel anti-inflammatoire et
d‟autre part, le potentiel détoxifiant des extraits de plantes traditionnellement employées dans le Pacifique.
Ainsi deux tests, test de Griess et test d‟interaction ligand-récepteur, pratiqués sur cellules de macrophage de
souris et les synaptosomes de cerveaux de rat ont été adaptés aux conditions matérielles du laboratoire et
exploités pour les études de l‟évaluation thérapeutique de plantes. Huit plantes ont été ainsi identifiées
comme ayant des propriétés intéressantes.
La troisième partie décrit la sélection de trois de ces plantes et les études phytochimiques menées. Ces
travaux ont conduit à l‟identification de trois molécules : la quercitrine, l‟acide rosmarinique et l‟agnuside à
partir respectivement des plantes Euphorbia hirta L., Heliotropium foertherianum Diane & Hilger et Vitex
trifolia L. Cette thèse a abouti au dépôt d‟un brevet sur l‟activité détoxifiante de l‟acide rosmarinique.
Mots clés :
Ciguatera, Ciguatoxine, Médecine traditionnelle, Plantes, Macrophage, Synaptosome, Oxyde nitrique,
Oxyde nitrique synthétase inductible, Test, Lipopolysaccharide, Brévétoxine tritiée

Valorisation de remèdes traditionnels utilisés dans le traitement de

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