Module 2 - EU-RL GMFF
Transcription
Module 2 - EU-RL GMFF
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours M. Querci WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L’EUROPE ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 2 Table des matières Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours COMMENT DETECTER LES OGM 3 AVANTAGES INHERENTS ET LIMITATIONS DES APPROCHES BASEES SUR L’ADN ET SUR LES PROTEINES 4 REMARQUES GENERALES ET PRESENTATION DU MANUEL 7 REFERENCES Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés 11 Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 3 Comment détecter les OGM Comme indiqué précédemment, les végétaux transgéniques se caractérisent par l’insertion d’un nouveau gène (ou d’un nouvel groupe de gènes) dans leur génome. Les nouveaux gènes sont ensuite transcrits et la nouvelle protéine est exprimée. Ceci donne au végétal une nouvelle caractéristique telle que la résistance à certains insectes ou la tolérance aux herbicides. La base de tout type de technologie de détection d’OGM consiste à exploiter la différence entre la variété non modifiée et la plante transgénique. Ceci peut se faire en détectant le nouvel ADN transgénique qui a été introduit ou la nouvelle protéine exprimée ou, si la protéine joue le rôle d’enzyme, en procédant à une analyse chimique pour détecter le produit de la réaction enzymatique. Deux approches scientifiques sont généralement utilisées aujourd’hui pour détecter la modification génétique dans des cultures telles que le soja, le blé, le coton et d’autres. L’une d’elles, ELISA (essai d’immunoabsorption enzymatique), implique la recherche de la présence de protéines spécifiques en exploitant la spécificité de liaison entre l’antigène exprimé et l’anticorps cible ; l’autre, la PCR (réaction de polymérisation en chaîne), repose sur la détection de nouvelles séquences d’ADN insérées dans le génome de plantes cultivées. Ces méthodes révèlent l’absence ou la présence d’OGM dans l’échantillon, mais peuvent aussi fournir une indication sur la quantité (pourcentage) présente dans un échantillon testé. La première méthode validée au niveau de l’UE était une technique de contrôle basée sur la PCR qui permettait de détecter la plupart des OGM actuellement approuvés pour la commercialisation (Lipp et al., 1999). Mise au point par Pietsch et al. (1997), cette méthode repose sur la détection des séquences de contrôle qui accompagnent le gène nouvellement introduit, en l’occurrence le promoteur 35S et le terminateur nos. La validation a été coordonnée par l’Unité Produits Alimentaires et Biens de Consommation de l’IPSC du Centre Commun de Recherche, et exécutée en collaboration avec l’Institut des Matériaux et des Mesures de Référence (IRMM) du CCR, qui était responsable de la production de matériaux de référence certifiés. Comme indiqué ci-dessus, des efforts de recherche ont été également dirigés vers le développement de méthodes reposant sur les protéines. Une méthode très spécifique à l’examen du soja Roundup Ready® basée sur le test ELISA a été validée (Lipp et al., 2000), tandis que d’autres ont été mises au point (http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm). Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 4 Avantages inhérents et limitations des approches basées sur l’ADN et sur les protéines L’approche basée sur l’ADN L’utilisation des méthodes analytiques basées sur la technologie PCR pour détecter des séquences d’ADN associées aux OGM est de plus en plus courante. La PCR permet d’amplifier sélectivement des fragments spécifiques d’ADN qui se trouve en faible quantité dans un mélange complexe d’autres séquences d’ADN. Dans la PCR, les petits éléments d’ADN complémentaires sont appelés des amorces et s’utilisent en paires. Ces amorces sont conçues pour s’hybrider sur des sites de reconnaissance de séquence complémentaires situés sur le brin opposé du gène d’intérêt. Par le biais d’une série de cycles thermiques différentiels répétitifs, un enzyme de polymérase d’ADN aide à répliquer et à amplifier la séquence de manière exponentielle entre la paire d’amorces. Ces gènes amplifiés sont enfin soumis à une électrophorèse sur gel standard de manière à pouvoir en détecter la présence en se basant sur la détermination de leur taille. Diverses méthodes basées sur la PCR ont été élaborées dans le but de détecter et de quantifier les OGM dans des espèces cultivées pour l’alimentation humaine et animale. La détermination de l’identité génétique permet, en outre, la ségrégation et la traçabilité (préservation de l’identité) sur toute la chaîne d’approvisionnement des cultures GM. Afin de pouvoir détecter les OGM, il est essentiel de connaître le type de modification génétique, notamment la constitution moléculaire du gène introduit et les éléments régulateurs connexes (promoteurs et terminateurs). Une quantité minimale du matériau d’échantillon contenant un ADN intact comportant le gène cible s’impose pour pouvoir procéder à l’analyse. La PCR est une technique de laboratoire qui nécessite un personnel formé et un équipement spécialisé. Les caractéristiques principales du diagnostic PCR sont, entre autres, les suivantes : - Il peut être extrêmement sensible, capable de détecter une ou plusieurs répliques d’un gène ou d’une séquence cible d’intérêt dans le matériel génétique complet d’un organisme (ou génome). Cette sensibilité élevée a pour résultat que des taux de contamination accidentelle très faibles peuvent produire de faux positifs. En conséquence, il est très important de veiller à prévenir toute contamination croisée. Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 5 - Par rapport aux essais immunologiques (synthèse de l’amorce par rapport à la production d’anticorps), il requiert un temps de développement par réactif relativement limité. - La plupart des réactifs nécessaires sont disponibles dans le commerce et peuvent être aisément obtenus auprès d’un grand nombre de fournisseurs. Une licence est toutefois parfois réclamée afin de pouvoir utiliser certains de ces réactifs dans des applications diagnostiques commerciales. - L’analyse de l’échantillon prend environ un jour. - La PCR peut établir une distinction entre divers types de modification génétique (également appelés « événements de transformation ») si elle est correctement développée. Les méthodes diagnostiques permettant d’identifier des événements de transformation spécifiques requièrent un temps de développement et des efforts de validation supplémentaires. L’approche basée sur les protéines La méthode de test basée sur les protéines utilise des anticorps spécifiques à la protéine d’intérêt. Le test ELISA détecte ou mesure la quantité de protéine d’intérêt présente dans un échantillon, lequel peut en contenir diverses autres. Le test ELISA utilise un anticorps unique pour établir la liaison avec la protéine spécifique, un second anticorps pour amplifier la détection (facultatif) et un anticorps conjugué à un enzyme dont le produit génère une réaction colorée facile à visualiser et à quantifier en la comparant à une courbe standard de la protéine d’intérêt. Pour être correct, l’essai doit être exécuté par un personnel dûment formé sur un équipement spécialisé. Les caractéristiques principales du test ELISA sont les suivantes : - Une moins grande sensibilité que la PCR et donc un moins grand risque de « faux positifs » induits par de faibles niveaux de contamination. - Des coûts en amont élevés pour le développement des essais et la génération des anticorps et des protéines de référence. - Un coût peu élevé par échantillon à partir du moment où les réactifs sont développés. - Il ne peut établir de différence entre des modèles et des modes d’expression différents entre divers événements transgéniques exprimant des caractéristiques protéiniques similaires. - Les méthodes basées sur les protéines ont un temps de production important pour le développement des réactifs et la mise au point de la méthode. Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 6 - Les essais basés sur les protéines constituent une méthode de test efficace et pratique lorsqu’une protéine détectable est produite. Certains produits issus de modification génétique ne s’expriment cependant qu’au cours de certains stades de développement ou dans certaines parties du végétal et il est, dès lors, improbable qu’un test ELISA permette une détection aisée de ces OGM. La transformation industrielle dénature, par ailleurs, facilement les protéines, ce qui peut poser problème lors de l’utilisation de la méthode ELISA pour analyser des fractions d’aliments transformés. Compte tenu de tous ces éléments, il est clair que le test ELISA et la PCR devraient être considérés comme complémentaires plutôt que comme des méthodes s’excluant l’une l’autre. Tableau 1 : synthèse comparative des méthodes ELISA et PCR Méthode Durée Facilité d’utilisation ELISA Élément testé Protéine 2 à 8 heures PCR ADN 1 à 3 jours Moyenne ; nécessite une familiarité avec les pratiques de laboratoire ; les tests sont spécifiques et varient en fonction de la culture et de la variété. Difficile ; nécessite un équipement et une formation spécialisés. Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Résultats Confirment la modification génétique spécifique et permettent de quantifier. Très sensibles avec un risque de faux positifs ; confirment la présence d’ADN GM et permettent de quantifier. Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 7 Remarques générales et présentation du manuel La méthode de validation est capitale tant pour les laboratoires que pour les autorités de contrôle. Dans l’idéal, le contrôle de la performance de chaque méthode devrait être confirmée par un nombre limité de laboratoires spécialisés afin d’obtenir des résultats reproductibles, sensibles et spécifiques. Le Centre Commun de Recherche de la Commission Européenne a été le premier à valider l’utilisation des méthodes ELISA et PCR pour tester les matières premières composées de soja Roundup Ready® et d’une méthode PCR pour le maïs Maximizer (Bt-176) et à valider une méthode PCR pour le soja Roundup Ready® et le maïs Maximizer (Bt176) dans des fractions d’aliments transformés (Lipp et al., 1999, 2000 et 2001). Depuis lors, plusieurs autres méthodes d’analyse qualitative et quantitative ont été développées et validées. Afin d'obtenir des informations actualisées sur les méthodes validées en vue de la détection et la quantification d’OGM, veuillez consulter le site : http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm. La préparation d’un échantillon est essentielle pour la détection et la quantification tant avec la méthode basée sur l’ADN qu’avec celle reposant sur la protéine. Il est important de connaître les limitations de chaque procédure en fonction de la réponse souhaitée (ex. : qualitative ou quantitative). Tant la taille de l’échantillon que les procédures d’échantillonnage influencent considérablement les conclusions à tirer de chacune de ces méthodes de test. Une exigence fondamentale pour chacune des méthodes de détection est la disponibilité de matériaux de référence certifiés. Produits par l’IRMM du CCR (Trapmann et al., 2002 et 2001), les échantillons utilisés durant la formation sont des matériaux de référence certifiés. Les caractéristiques et les certificats correspondants sont présentés dans le module 3. Un autre élément critique, sur lequel nous ne nous attarderons pas durant ce cours, mais qu’il est important de mentionner, est l’homogénéisation de l’échantillon. La Figure 1 résume les différentes étapes suivies durant le cours. L’extraction d’ADN optimisée est fondamentale pour garantir la présence et la qualité de l’ADN extrait et amplifiable par le biais de la PCR. Cet aspect est particulièrement important, car la majorité des denrées alimentaires présentes sur le marché et fabriquées à partir de soja ou de maïs ont subi une importante transformation. Il est notoire que l’ADN peut se dégrader considérablement durant la transformation alimentaire, en particulier sous l’influence d’un traitement thermique effectué en présence d’eau. Plus l’aliment est transformé, plus la quantité de fragments d’ADN Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 8 suffisamment longs et renfermant, à l’état intact, la cible dont on a besoin pour détecter des OGM dans l’aliment transformé, risque d’être limitée. Une méthode d’extraction d’ADN adéquate et correcte devrait, en outre, veiller à supprimer les substances inhibitrices présentes dans l’échantillon. Ce point sera abordé dans le module 4. Plusieurs méthodes d’extraction de l’ADN ont été élaborées et diverses entreprises commerciales ont mis au point des kits spécialisés, prêts à l’emploi. La performance et la validité des différents protocoles disponibles seront présentés durant le cours. Afin d’éviter toutes implications directes avec une quelconque firme commerciale, il a toutefois été décidé de procéder à l’extraction d’ADN en utilisant la méthode au CTAB, un protocole validé et souple qui a fait ses preuves avec une grande variété de matrices. Après l’extraction d’ADN, les échantillons (ainsi que les produits de la PCR) seront analysés par l’électrophorèse sur gel d’agarose (module 5). Les principes, les avantages et les inconvénients de la réaction de polymérisation en chaîne seront présentés dans le module 6. Comme mentionné ci-dessus, l’utilisation efficace de techniques modernes pour la détection d’OGM dépend de la disponibilité d’informations précises. La détection d’OGM nécessite au minimum une connaissance partielle de la séquence génétique cible et du type de modification génétique. Les caractéristiques spécifiques des lignées transgéniques du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready® seront présentées dans le module 7. Différentes approches de la PCR ont été élaborées pour la détection d’OGM autorisés. La spécificité de la PCR dépend du choix précis des amorces. Les amorces de PCR peuvent être dirigées vers différents éléments utilisés dans le processus de transformation. Une « vaste gamme » de systèmes de détection PCR, généralement appelés « méthodes de criblage », peut être obtenue en désignant des amorces spécifiques aux séquences les plus fréquemment utilisées dans la transformation. Il s’agit généralement de séquences régulatrices (promoteurs et terminateurs). Des végétaux génétiquement modifiés peuvent aussi être subdivisés en « catégories » en fonction du gène structurel qui y est inséré. Un moyen supplémentaire pour diriger la spécificité de la réaction consiste à choisir des amorces spécifiques aux séquences d’ADN situées dans divers éléments génétiques (par exemple, promoteur-gène structurel ou gène structurel-terminateur). Enfin, pour autant que l’on dispose d’informations spécifiques et complètes sur la séquence afin d’obtenir des méthodes réellement spécifiques à une plante génétiquement modifiée, il est possible de mettre au point des systèmes « spécifiques de la lignée » (ou de l’événement de transformation) en sélectionnant une combinaison de séquences Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 9 « uniques » présentes exclusivement dans cette lignée transformée. Pour y parvenir, on conçoit des amorces s’hybridant dans la région de l’ADN qui établit la jonction avec le site d’insertion. La jonction entre l’ADN inséré (ADN-T) et l’ADN hôte offre une séquence de nucléotides unique qui constitue une cible idéale pour la réalisation d’un test PCR très spécifique. Les méthodes utilisées durant le cours sont résumées dans la Figure 1 et seront décrites en détail dans le module 8. La partie expérimentale des méthodes et des protocoles est reprise dans le module 9. Comme indiqué ci-dessus, la nécessité de quantifier la quantité d’OGM présents dans un échantillon a conduit au développement de nombreux protocoles basés sur la PCR, qui fournissent non seulement une réponse qualitative (présence/absence), mais aussi une indication plus ou moins précise (en fonction de la méthode choisie) de la quantité relative d’OGM présents dans un échantillon donné. Les deux approches basées sur l’ADN les plus courantes sont la PCR compétitive et la PCR en temps réel (module 10). Cette dernière s’effectue à l’aide d’instruments spécifiques et sophistiqués qui ne sont disponibles actuellement qu’auprès de quelques entreprises commerciales. Les protocoles qui seront appliqués durant la formation sont décrits dans le module 11. Enfin, le module 12 présente, dans les grandes lignes, l’approche sérologique de la détection d’organismes génétiquement modifiés. La technique ELISA y sera en particulier exposée, tandis que le protocole permettant d’exécuter un test ELISA spécifique au Roundup Ready® sera détaillé. Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 10 Homogénéisation de l’échantillonnage Non exécutée durant le cours Extraction d’ADN Matériaux bruts et matériaux transformés Contrôle de l’ADN du végétal par PCR + - ADN végétal présent Pas d’ADN végétal détectable Détection d’éléments régulateurs (promoteur 35S et terminateur nos) PCR de dépistage + Végétal GM PCR des gènes de la lectine pour le soja et de la zéine pour le maïs Végétal non GM Détection spécifique d’OGM par la PCR nichée Détection d’OGM avec la méthode ELISA Quantification de l’ADN par spectrophotométrie Quantification de l’OGM par la PCR en temps réel Figure 1 : schéma des méthodes appliquées durant le cours Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 11 Références Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC International 83, 919–927. Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504. Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928. Pietsch, K., Waiblinger, H.-U., Brodmann, P. and Wurz, A. (1997). ScreeningVerfahren zur Identifizierung „gentechnisch veränderter” plfanzlicher Lebensmittel. Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35–38. Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E., Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R., Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. and Anklam, E. (2002). The certification of reference materials of dry-mixed soja powder with different mass fractions of Roundup Ready™ soja. Certified Reference Materials IMMR-410S. (https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta chements/ERM-BF410_report.pdf). (Dernière connection Janvier 2010) Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H., Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). The certification of reference materials of dry mixed maize powder with different mass fractions of MON810 maize. Certified Reference Materials IMMR-413. (https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta chements/ERM-BF413_report.pdf). (Dernière connection Janvier 2010) Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 2