N° d`ordre : 2784 THÈSE DE DOCTORAT Présentée par

N° d’ordre : 2784
THÈSE DE DOCTORAT
Présentée par
Dr. Abdennasser BENJELLOUN
Discipline : Biologie
Spécialité : Epidémilogie prédictive et Microbiologie
Titre
ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DE LA FIEVRE DU WEST NILE :
ANALYSE DES VARIABLES CLIMATIQUES ASSOCIEES AVEC
L’OCCURRENCE DE LA FIEVRE DU WEST NILE AU MAROC ET
ENQUETE DE SEROPREVALENCE CHEZ LE CHEVAL
Soutenue le : 15 Juillet 2015 devant le jury composé de :
Président
-
Pr. Abdelkarim FILALI-MALTOUF, Professeur de l‘enseignement supérieur, Faculté des
Sciences de Rabat.
Rapporteurs
- Pr. Youssef BAKRI, Professeur de l‘Enseignement Supérieur, Faculté des Sciences de Rabat.
- Dr Ouafaa FASSI-FIHRI, Professeur de l‘Enseignement Supérieur, IAV Hassan II, Rabat.
- Dr. Mehdi El HARRAK, Directeur de Recherche et Développement à MCI.
- Pr. Bouchra BELKADI Professeur, Faculté des Sciences de Rabat.
Invités
-
Dr. Jamal MALIK, Président du Directoire Général de BIOPHARMA.
Dr. Chafiqa LOUTFI, Chef du Service de Virologie BIOPHARMA.
Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat – Maroc
Tel +212 (05) 537 77 18 34/35/38, Fax: +212 (05) 537 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma
PRODUCTION SCIENTIFIQUE
Publications:
A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, B. BELKADI.WEST NILE DISEASE EPIDEMIOLOGY IN
NORTHWEST AFRICA: Bibliographical review. Transboundary emerging diseases.
A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, P. CALISTRI, C. LOTFI, H. KABBAJ, A. CONTE, C.
IPPOLITI, M. L. DANZETTA, B BELKADI. A preliminary attempt to identify areas at risk for
WND inMorocco: a serosurvey in horses. Veterinary Medicine and Science.
P. CALISTRI, C. IPPOLITI, L. CANDELORO, A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, B
BELKADI, M. L. DANZETTA; D. SABATIO. A. CONTE. Analysis of climatic and environmental
variables associated with the occurrence of West Nile virus in Morocco. Preventive Veteretinary
Medecine.
A. CONTE, L. CANDELORO, C. IPPOLITI, F. MONACO, F. D. MASSIS, R.. BRUNO, M. L.
DANZETTA, A. BENJELLOUN, B. BELKADI, M. EL HARRAK, S. DECLICH, C. RIZZO, S.
HAMMAMI, T. HASSINE, P.CALISTRI, G. SAVINI Spatio-temporal identification of areas
suitable for West Nile Disease in the Mediterranean Basin and Central Europe. PLOS Computational
Biology.
Communications
1. A. BENJELLOUN, M. EL HARRAK, C. LOTFI, H. KABBAJ, B.BELKADI.
A preliminary attempt to identify areas at risk for WND in Morocco: a serosurvey in horses.
Risk Analysis as a tool for control of animal diseases and zoonoses in the Mediterranean Basin;
5-7 Novembre 2013, Teramo, Italie.
2. A. BENJELLOUN,M. EL HARRAK, C. LOTFI, B.BELKADI. A WND in Morocco and
prevention strategies. Emerging infections in the Mediterranean Basin and Eastern Europe. 20-21
Mai 2015, Erice (Trapani), Italie.
DEDICACES
Je dédie ce travail :
A la mémoire de mon père,
A ma mère Khadija,
A mon épouse Sabah et mes enfants Réda, Mohammed Amine et Iness,
A mon frère Younes, et mes sœurs Déya, Sakina, et Hanane,
A mes neveux,
A toute ma famille,
A tous mes amis,
A tous ceux qui m‘ont soutenu,
A tous mes collègues, mes confrères et mes camarades,
Et enfin à tous les miens.
AVANT - PROPOS
Le présent travail a été réalisé dans le Laboratoire de Microbiologie et Biologie moléculaire
de la Faculté des Sciences, Université Mohammed V Agdal, sous la direction du Pr. Bouchra
BELKADI et le Laboratoire National de BIOPHARMA (Société de Productions Biologiques et
Pharmaceutiques Vétérinaires) sous le co-encadrement du Dr Mehdi EL HARRAK. Une partie des
travaux a été réalisée à l‘Institut de Prophylaxie Animale IZS de Teramo, Italie (Istituto
Zooprofilattico dell‘Abruzzo e del Molise ‗G. Caporale‘
Ce travail a également bénéficié du soutien de Monsieur le le Général de Corps d‘Armée,
Hosni BENSLIMANE Responsable National de la lutte Contre la grippe avaiaire et H1.N1
Je tiens à exprimer toute ma gratitude :
A ma directrice de thèse le Professeur Bouchra BELKADI pour avoir encadré cette thèse,
avec beaucoup de compétence et d‘enthousiasme, pour ses conseils avisés et son optimisme et ce
malgré ses diverses occupations. Qu‘elle trouve ici une modeste expression de ma profonde
reconnaissance.
A mon co-encadrant, Mr Mehdi EL HARRAK, Directeur de Recherche et Développement
du Laboratoire Pharmaceutique Marocain M.C.I. Santé Animale, pour le choix pertinent du sujet, son
soutien, ses conseils et sa disponibilité. Il a suivi de près toutes les étapes de l‘élaboration de cet
ouvrage de recherche sur la Fièvre West Nile.
A Monsieur Abdlekarim FILALI-MALTOUF, Professeur à la Faculté des Sciences de
Rabat, responsable du Laboratoire de Microbiologie et de Biologie Moléculaire, de m‘avoir fait le
grand honneur d‘accepter la présidence du jury de thèse. Je lui exprime toute ma reconnaissance la
plus sincère.
A Monsieur Youssef BAKRI, Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat, pour avoir
accepté de rapporter cette thèse qu‘il accepte mes sincères remerciements pour avoir consacré son
temps àl‘analyse de mes travaux de recherche et d‘avoir exprimé ses jugements pertinents sur mon
manuscrit.
A Madame Ouafaa FASSI FIHRI, Professeur à l‘Institut Agronomique et Vétérinaire
Hassan II, qui a bien voulu consacrer de son temps pour être rapporteur de cette thèse, pour sa
collaboration scientifique fructueuse et pour ses conseils pertinents qui m‘ont été d‘un grand intérêt
dans l‘élaboration du document .
A Madame Chafiqa LOTFI pour son encadrement au sein du Laboratoire de Virologie de
BIOPHARMA et dont la compétence n‘a d‘égal que son dévouement et sa gentillesse qui a bien
voulu accepter d‘examiner ce travail.
Je remercie également le Dr Jamal MALIK, Président du Directoire du Laboratoire National
d‘Analyses Biologiques BIOPHARMA qui a bien voulu accepter d‘examiner ce travail.
A Monsieur le Général de Corps D‘Armée Hosni BENSLIMANE, Commandant de la
Gendarmerie Royale et Coordinateur National de la Lutte Contre La Grippe Aviaire et la grippe
H1N1 ainsi qu‘à Mr le coordonateur-adjoint Mr Abdelaziz ARIFI et Mr le Colonel MOHAMED
EL ARABI pour avoir soutenu ce travail.
Je remercie aussi toute l'équipe de l'Istituto Sperimentale Zooprofilattico dell'Abruzzo e del
Molise IZS de Teramo (Italie) spécialement Paolo CALISTRI, Annamaria CONTE, Carla
IPPOLITI et Maria Luisa DANZETTA pour leur collaboration et les enseignements qu‘ils ont bien
voulu me fournir.
Je remercie également les confrères vétérinaires qui ont participé aux prélèvements à Rabat,
Benslimane, Bouznika et Khémisset notamment le Dr Olga POPARCEA, le Colonel vétérinaire
Mohamed KAIDI, et le Commandant vétérinaire Mohamed BOUKHARTA, de même que le
personnel du Club Equestre Dar Essalem, les organisateurs des fantasias de Benslimane et Khémisset
et de la station de monte de Bouznika.
Je remercie, le personnel du laboratoire d‘analyses de BIOPHARMA qui a mis à ma
disposition tout le matériel et le savoir-faire nécessaires pour réaliser les tests de laboratoires en
particulier, Mlle Ghislane SEBBAR et Madame Nadia CHAFFAI en leur qualité de biologistes
spécialisées.
Je remercie l‘équipe du Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire de la Faculté
des Sciences, Université Mohammed V, notamment Mlle Chaimaa YATRIB pour sa précieuse
contribution dans l‘élaboration de ce document.
Enfin, je remercie toute personne ayant contribué de prés ou de loin à ce travail.
RESUME
La Fièvre West Nile est une arbovirose transmise par des moustiques vecteurs à plusieurs
espèces dont l‘Homme et le cheval. Au Maroc, la maladie a été signalée chez des équidés en 1996
causant la mort de 42 équidés et le décès d‘une personne. Elle est réapparue en 2003, causant la mort
de 5 chevaux parmi 9 infectés puis en 2010, l‘infection a touché 17 chevaux dont 8 sont morts.
Les variables climatiques associées avec l‘occurrence des épizooties (la pluviométrie, l‘indice
de végétation par différence normalisée et la température) ont été analysées. De même une enquête
sérologique a été menée sur 870 chevaux provenant de quatre différentes écorégions.
Les années des épizooties ont montré des pluviométries et des NDVI relativement élevés par
rapport aux autres années. La séroprévalence trouvée dans la zone bioclimatique du littoral
atlantique : 40.58%, 51.18%) s‘est avérée plus élevée que la prévalence globale : 30,80%.
Mots clés : Fièvre de West Nile, épidémiologie, variables climatiques, séroprévalence, Maroc
SUMMARY
The West Nile Disease is a mosquito born disease transmitted to many species including
humans and horses. In Morocco, the first cases were reported in equids in 1996 killing 42 horses and
one person. After an apparent epidemiological silence, the disease reappeared in 2003 causing the
death of 5 of 9 infected horses cases. Finally, in 2010, the disease has led to the infection of 17 horses
and the death of 8.
The climatic variables associated with the occurrence of the outbreaks (Rainfall, Normalized
Difference Vegetation Index and temperature) were analyzed. Thus, a serological survey was
conducted in 870 horses originating from four different eco regions.
Compared with other years, epizootic years exhibited higher NDVI and rainfall values.
Similarly, the Atlantic coast showed a significantly higher prevalence (45.83%, 95% CI = (40.58%,
51.18%)) compared to the overall prevalence 30.80%.
Keywords: West Nile Disease, epidemiology, climate variables, seroprevalence, Morocco
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE .........................................................................................................1
CHAPITRE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ...............................................................................2
I. Généralités : ......................................................................................................................................3
1.
Définition : ...................................................................................................................................3
2.
Historique : ..................................................................................................................................3
3.
Répartition géographique: ...........................................................................................................4
a.
Répartition mondiale:...............................................................................................................4
b.
La FWN au Maroc: ..................................................................................................................6
II. Etude du virus West Nile : ..............................................................................................................7
1.
Classification : .............................................................................................................................7
2.
Structure et génome : ...................................................................................................................7
3.
Caractères physico-chimiques : .................................................................................................10
4.
Diversité et virulence : ...............................................................................................................10
5.
Propriétés biologiques : .............................................................................................................12
6.
5.1.
Multiplication in vitro : ......................................................................................................12
5.2.
Multiplication in vivo : .......................................................................................................12
Propriétés antigéniques: .............................................................................................................13
6.1.
Pouvoir antigénique: ..........................................................................................................13
6.2.
Immunité: ...........................................................................................................................14
III.
Physiopathologie: .....................................................................................................................16
1.
Symptômes cliniques : ...............................................................................................................16
2.
3.
IV.
1.1.
Chez le cheval : ..................................................................................................................16
1.2.
Chez l‘Homme: ..................................................................................................................18
1.3.
Chez les oiseaux: ................................................................................................................19
Lésions: ......................................................................................................................................20
2.1.
Lésions macroscopiques: ....................................................................................................20
2.2.
Lésions microscopiques: ....................................................................................................20
Pathogénie: ................................................................................................................................16
Epidémiologie: .........................................................................................................................22
1.
Source du virus : ........................................................................................................................22
2.
Les vecteurs ...............................................................................................................................22
3.
Les espèces hôtes .......................................................................................................................26
4.
Cycle de transmission ................................................................................................................28
5.
4.1.
Cycle oiseaux-moustiques-oiseaux ....................................................................................28
4.2.
Autres voies d‘amplification ..............................................................................................30
Ecologie de la FWN ..................................................................................................................35
5.1.
Ecologie générale : .............................................................................................................35
5.2.
Ecologie de la FWN au Maroc ...........................................................................................40
V. Diagnostic : .....................................................................................................................................45
1.
Diagnostic épidémio-clinique : ..................................................................................................45
2.
Diagnostic biologique: ...............................................................................................................46
2.1.
Diagnostic direct ................................................................................................................46
2.2.
Diagnostic sérologique indirect: .........................................................................................47
VI.
Traitement :..............................................................................................................................52
VII.
Prophylaxie : ............................................................................................................................53
1.
Prophylaxie sanitaire : ...............................................................................................................53
2.
3.
1.1.
Mesures offensives: ............................................................................................................53
1.2.
Mesures défensives: ...........................................................................................................53
Prophylaxie médicale : ..............................................................................................................55
2.1.
Le choix de la vaccination :................................................................................................55
2.2.
Le point sur les vaccins : ....................................................................................................55
Mesures en cas de foyer : ..........................................................................................................56
3.1.
Mesures individuelles :.......................................................................................................56
3.2.
Mesures collectives de police sanitaire : ............................................................................56
CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE ..............................................................................57
I. Matériels et Méthodes utilisés pour l’analyse des variables climatiques associées avec
l’occurrence de la FWN au Maroc: ...................................................................................................58
1.
Données bibliographiques des épizooties de 1996, 2003 et 2010: ............................................58
2.
Les données climatiques de la télédétection spatiale: ...............................................................58
2.1.
Distribution des foyers: ......................................................................................................58
2.2.
Les données climatiques et analyse statistique: .................................................................59
II. Matériels et Méthodes de l’enquête sérologique .........................................................................62
1.
Aire de collecte des échantillons : .............................................................................................62
2
Echantillons: ..............................................................................................................................64
3
Techniques immunologiques .....................................................................................................64
4
3.1
ELISA compétition (IgG): .................................................................................................64
3.2
ELISA de capture (IgM) : ..................................................................................................66
3.3
Séroneutralisation sur culture cellulaire: ............................................................................68
Analyse statistique des résultats l‘enquête sérologique :...........................................................72
CHAPITRE III RESULTATS ...........................................................................................................73
I. Résultats de l’analyse des variables climatiques associées avec l’occurrence du virus de la
FWN au Maroc : .................................................................................................................................74
1.
Comparaison des NDVI dans les zones infectées: ....................................................................74
2.
Comparaison des données pluviométriques dans les zones infectées : .....................................76
3.
Comparaison des données de la température dans les zones infectées :....................................79
II. Résultats de l’enquête de séroprévalence : ..................................................................................82
1.
Résultats du test ELISA compétition IgG : ...............................................................................82
2.
Résultats du test de séroneutralisation : .....................................................................................82
3.
Résultats du test Elisa IgM de capture : ....................................................................................83
4.
Séroprévalence globale : ............................................................................................................84
5.
Séroprévalence par zone bioclimatique : ...................................................................................85
CHAPITRE IV DISCUSSION ..........................................................................................................89
CHAPITRE V : CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... Erreur ! Signet non défini.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................................107
ANNEXES .........................................................................................................................................141
LISTE DES ABBREVIATIONS
Abréviation
AC
Ae.
AMM
Aqua MODIS
ARNm
BAB
BHK
Bp
C6-36
CCL5
CDC
Cox-2
Ct
Cx.
DJ
DICT50
DIII
DL50 Dose Létale 50
D-MEM Dulbecco's Modified
DN50
Eagle's Medium
D-MEM
Dnase Désoxyribonucléase
dNTP
E
enveloppe
dNTP
E.coli
DO Escherichia coli
ECDC
European Centre for
E
Disease Control
ECDC
ECP
EDTA
ELISA
ENV
EOS
FC
FVR
FWN
GPS
HRP
IC95%
IFN
IgG
IgM
IHA
IL1β
Définition
Anticorps
Aedes
Autorisation de mise sur le marché
Satellite Terra du système Modis pour observation de l‘Eau
Acide ribonucléique messager
Tampon borate d‘albumine bovine
Cellule de rein d‘hamster
Paire de base (base pair)
Cellules de moustique Aedes albopictus
Chemokine (C-C motif) ligand 5
Center for Disease Control
Cyclooxygenase 2
Cycle Threshold ou seuil de cycle
Culex
Degrés – jours
Doses infectieuses du virus détruisant 50% de la culture
Domaine
tissulaire III de la protéine d'enveloppe
Dose Létale 50
Dose neutralisante 50% des unités testées
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
Désoxynucléotides tri phosphates
désoxyNucléotides Triphosohates
Densité optique
Enveloppe
European Centre for Disease Control
Effet cytopathogène
EDTA EthylèneDiamnine Tetraacetic Acid
Enzyme linked immunosorbent assay
Envellope
Earth Observing System (Système d‘observation de la Terre
Fragment constant des Immunoglobulines
Fièvre de la vallèe du Rift
Fièvre du West Nile
Global positionning system
Horseradish peroxidase
Intervalle de confiance à 95%
Interférons
Immunoglobuline G (IgG)
Immunoglobuline M (IgM)
Test d‘inhibition de l‘hémaglutination
Interleukin 1 beta.
IL-4
IL-6
iNOS
ITCZ
JAXA
JEV
kb
kDa
KUNV
LC
LCR
LST
MEM
MMP9
MO03
MODIS
Mor.1996 EQ
Mor.2003 EQ
MVEV
NASA
NC
NDVI
NS
NY99
OIE
Interleukine 4
Interleukin 6
Nitric oxide synthase
Indice de convergence de la zone intertropicale
Agence Spatiale Japonaise
Encephalitis Virus (Virus de l'Encéphalite Japonaise)
Kilobase
Kilo Dalton
Kunjin Virus (Virus Kunjin)
Langerhans Cell (Cellule de Langerhans)
Liquide Céphalo Rachidien
Température de la surface du sol
Eagle's Minimum Essential Medium
Matrix metallopeptidase 9
Souche Maroc 2003 du virus West Nile
Spectroradiomètre par imagerie à résolution modéré
Souche du virus West Nile isolée au Maroc en 1996 chez des
Souche
équidés du virus West Nile isolée au Maroc en 2003 chez des
Virus
de l'Encéphalite de la Vallée de Murray
équidés
Administration nationale américaine de l'aéronautique et de
l'espace
Non
Codant
Indice de végétation par différence normalisée
Proteines Non structurelle
Souche du virus West Nile New York 1999
Office International des épizooties
OIE
ONSSA
PFU
PCR
pH
prM
PRNT
PS Clone D
qRTPCR
Office International des Epizooties
Office National De Securite Alimentaire Des Produits
Plaque
forming units
Alimentaires
Polymérase Chain Reaction
Potentiel d‘ hydrogène
Précurseur de protéines transmembrabaire
Plaque reduction neutralization test
Lignée cellulaire des fibroblastes de rein du porc
Réaction de Polymérisation en Chaine en temps réel suite à une
Transcription Inverse
RE
RIMC
RIMH
RT-PCR
SIG
SLEV
SN
SNC
SOI
SST
Réticulum Endoplasmique
Réponses imunitaire à médiation cellulaire
Réponses immuniaire à médiation humorale
Reverse Transcriptase Polymérase Chain Reaction
Système d‘information géographique
Virus de l'Encepéhalite de Saint-Louis
Séroneutralisation
Système nerveux central
Indice d‘oscillation du sud (Southern Oscillation Index)
Températures de surface de la mer
SVF
TCD4
TCD8
Terra MODIS
TLR3
TMB
TNFα
TRMM
TSCZ
USUV
VERO
VFVR
VWN
WN-Ag
YFV
Sérum de veau fœtal
Les lymphocytes T auxiliaires
Lymphocytes T cytotoxiques
Satellite Terra du système Modis pour observation de la Terre
Toll-like Receptor 3
TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine)
Facteur de nécrose tumorale alpha
Tropical Rainfall Measuring Mission
Indice de convergence de la zone intertropicale
Usutu Virus (Virus Usutu)
Cellules épithéliales extraites du rein de singe vert africain
Virus de la fièvre de la vallée du Rift
Virus du West Nile
Antigène du virus West Nile
Yellow Fever Virus (Virus de la Fièvre Jaune)
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Cas cliniques et mortalités dues au VWN aux USA rapportés par le CDC par an de 1999
à 2014 ..............................................................................................................................................6
Tableau 2: Espèces de Culex impliquées dans la transmission du VWN ...........................................24
Tableau 3: Réservoirs et vecteurs possibles dans diverses régions du globe ......................................38
Tableau 4: Les espèces de moustiques rencontrés au Maroc ..............................................................42
Tableau 5 : Variation interannuelle des effectifs d‘oiseaux d‘eau recensés dans les cinq régions
marocaines pendant la période 1996-2000 ...................................................................................45
Tableau 6: Nombre et provenance des chevaux prélevés par zone et par localité. .............................64
Tableau 7 : Valeurs moyennes et ecart-type des NDVI de la période de mai à novembre par
polygone et par année de 2001 à 2010 ..........................................................................................75
Tableau 8: Les valeurs moyennes et écart-type des valeurs NDVI enregistrées de juin à novembre au
cours de la décennie 2001-2010 pour chaque foyer de FWN .......................................................76
Tableau 9: Nombre de jours avec «précipitations extrêmes» de 2001 à 2010 enregistrées entre juin et
novembre dans les zones touchées par la FWN. ...........................................................................76
Tableau 10: Dates du début et de la fin de l‘activité potentielle du moustique dans les aires d‘etudes
2003 et 2010 ..................................................................................................................................80
Tableau 11: Résultats du test ELISA compétitive IgG .......................................................................82
Tableau 12 : Pévalence par zone bioclimatique ..................................................................................86
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Répartition mondiale du VWN ..............................................................................................4
Figure 2: Carte d‘isolement du virus de la FWN dans le monde ..........................................................5
Figure 3: Apparence du virus West Nile en microscopie électronique .................................................8
Figure 4: Structure VWN ......................................................................................................................8
Figure 5: Structure du génome du virus ................................................................................................9
Figure 6: Représentation de la structure de la protéine d‘enveloppe.....................................................9
Figure 7: Arbre phylogénétique du VWN . .......................................................................................11
Figure 8: Mode multiplication du VWN .............................................................................................13
Figure 9 : Cinétique des anticorps anti-VWN .....................................................................................15
Figure 10: Lésions microscopiques du thalamus gauche et de la corde cervicale spinale ..................21
Figure 11: Lésions microscopiques observées chez le cheval: ...........................................................21
Figure 12 : Images de vecteurs de la FWN appartenant à la famille des Culicinae et Anophelinae ...23
Figure 13: Cycle biologique de Culex pipiens. ...................................................................................25
Figure 14: Voies de migration des oiseaux dans la région méditerranéenne ......................................27
Figure 15: Cycle de transmission du VWN. ........................................................................................28
Figure 16: Phases d'introduction, d'amplification puis d'émérgence du VWN ...................................29
Figure 17 : Quelques espèces de tiques impliquées dans la transmission du VWN34
Figure 18 : Localisation des zones humides d'importance internationale du Maroc ...........................41
Figure 19: Distribution au Maroc de quelques espèces de moustiques : .............................................43
Figure 20: Schéma expliquant la méthode de fixation du complément ..............................................48
Figure 21: Schéma de la réaction d‘hémagglutination et inhibition de l‘hémagglutination ................49
Figure 22: Principe de la technique ELISA compétitive pour la détection des IgG antiWN ..............49
Figure 23: Principe du test ELISA de capture pour la détection des IgM antiWN .............................50
Figure 24: Test de séroneutralisation : Observation de l‘effet cythopathogène sur culture cellulaire 51
Figure 25: Schéma de la plaque du test ELISA-compétitive ...............................................................65
Figure 26: Plaque de manipulation pour ELISA par micro capture IgM. ...........................................67
Figure 27 : Schéma de plaque de microtitrage des sérums pour le test de séroneutralisation .............70
Figure 28: Schéma de plaque de microtitrage pour lecontôle du test de séroneutralisation ................71
Figure 29: Répartition géographique des foyers de FWN en 2003 et en 2010 ...................................74
Figure 30: Données de précipitations de 3 jours d‘intervalle dans l‘aire d‘étude de 2003 .................77
Figure 31: Données de précipitations de 3 jours d‘intervalle dans l‘aire d‘étude de 2010 .................77
Figure 32: Valeurs maximales de pluies quotidiennes (en mm) ..........................................................78
Figure 33: Températures journalières de jour et de la nuit et leur moyenne de 2001 et 2010 ............79
Figure 34: Valeurs degrés-jours cumulées à partir du premier janvier de chaque année ....................80
Figure 35: Représentation graphique du début et de la fin de l‘accumulation d‘énergie par le vecteur
pour la décennie 2001-2010. .........................................................................................................81
Figure 36: Résultat synthétique des analyses sérologiques .................................................................82
Figure 37: Titre des anticorps séroneutralisants obtenus par SN dans les sérums positifs en IgG .....83
Figure 38: Cas positifs en IgG et prévalence par province ..................................................................85
Figure 39: Comparaison des taux de séroprévalence dans les quatre zones bioclimatiques moyennant
une approche bayésienne. ..............................................................................................................87
Figure 40: Prévalences en anticorps anti WN par zone bioclimatique ................................................88
INTRODUCTION GENERALE
L‘âgent de la Fièvre du Nile Occidental ou Fièvre du West Nile (FWN) est un arbovirus, de la
famille de Flaviviridae. Ce virus a été découvert en 1937, en Ouganda, dans le sérum d'une jeune
femme souffrant d'un syndrome fébrile bénin. Depuis cette date, il a été isolé à maintes reprises dans
de nombreux pays, chez I 'homme, le cheval, les oiseaux et les moustiques.
Au niveau mondial, après une phase d'éclipse d'une dizaine d'années, cette maladie a ressurgi
a la fin des années 90, notamment en Europe et aux Etats-Unis ou elle n‘avait jamais été signalée
causant une morbidité et une mortalité importantes chez l‘homme et chez les chevaux ainsi chez
d‘autres espèces.
Chez l‘Homme, la maladie est souvent asymptomatique. Cependant, environ 30% des
personnes infectées développent des symptômes allant d'un syndrome grippal à des symptômes
encéphalitiques, avec des taux allant de 3 à 17%. Dix pour cent des chevaux infectés par le VWN
présentent des troubles neurologiques (Castillo-Olivares, et al., 2004, Sambri et al., 2013).
Les analyses phylogénétiques basées sur l'analyse des séquences nucléotidiques ont montré
que les isolats du VWN de différentes régions géographiques sont classés en deux lignages majeures
(1 et 2), présentant 25 à 30% de différences nucléotidiques (Berthet et al., 1997; Lanciotti et al.,
2002).
Le lignage 1 regroupe des souches qui circulent en Afrique de l'Ouest, Moyen Orient, Europe
de l'Est, Amérique du Nord et Australie. Le lignage 2 ayant une répartition géographique restreinte
circule en Afrique sub-saharienne et Madagascar. Il a été retrouvé dernièrement en Europe et plus
précisément, en Hongrie, en Grèce et en Italie (Bakonyi et al., 2006; Bagnarelli et al., 20 11; Papa et
al., 2011).
En 1999 la souche virale du VWN appartenant au lignage 1 a été introduite en Amérique du
Nord et s‘est répandue à travers le continent pour atteindre la côte ouest en trois ans. Ainsi entre 1999
et 2010 environ, 1.8 million de personnes ont été infectés par le virus, plus de 12000 cas de malades
ont présenté des signes de méningite-encéphalitique et 1308 personnes sont mortes (Kilpatrick, A et
al., 2011).
Le Maroc a connu en 1996, 2003 et 2010 trois épizooties de la maladie de la FWN. Le virus
avait fait sa première apparition dans la région Nord-Ouest notamment les provinces de Kénitra et de
Larache, dès lors, plusieurs cas ont été déclarés dans d‘autres provinces.
Les motivations qui nous ont poussé à nous intéresser à I' étude de cette maladie ont été tout
d'abord le fait qu'il s'agisse d'une zoonose d'actualité mondiale en pleine expansion. C‘est une
arbovirose émergente nouvellement signalée dans différents pays et plusieurs zones d‘ombre
persistent encore sur les conditions et les mécanismes qui déterminent son apparition et sa
réémergence.
Ces travaux se sont basés sur l‘analyse des données des précédentes épizooties qu‘a connu le
Maroc, sur une enquête sérologique chez le cheval en vue d‘évaluer la distribution spatio-temporelle
de l‘infection après ces épizooties et l‘étude de l‘association entre l‘occurrence des cas de FWN au
Maroc et les données bioclimatiques de la télédétection spatiale telles que les valeurs du NDVI
(indice de végétation normalisé), la pluviométrie et la température.
1
CHAPITRE I :
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
2
I.
Généralités :
1. Définition :
La Fièvre West Nile (FWN) est une maladie commune à plusieurs espèces, c'est une arbovirose
émergente, le plus souvent asymptomatique, transmise à l'homme et à l‘animal par les moustiques.
Elle peut néanmoins se manifester par un syndrome de type pseudo-grippal. Après 3 à 15 jours
d'incubation des complications peuvent survenir et l'infection peut évoluer, dans moins de 15% des
cas symptomatiques, vers une méningite aseptique et une encéphalite. La mortalité dépend de la
virulence de la souche, du statut immunitaire et de l'âge des patients (Bunning et al., 2002).
Les oiseaux, qu'ils soient sauvages ou domestiques, constituent le réservoir principal du virus
et les oiseaux migrateurs jouent un rôle essentiel dans sa dissémination, en permettant notamment son
passage de l'Afrique vers les zones tempérées de l'Europe. Les moustiques s'infectent auprès des
oiseaux, amplifient le virus et peuvent contaminer l'homme et les équidés lors de leur repas sanguin,
(O.I.E, 2010). Ce virus a émergé, il y a quelques années, dans les régions tempérées d'Europe et
d‘Amérique du Nord. Cette arbovirose présente des risques sérieux aussi bien pour la santé publique
que pour la santé animale particulièrement pour les équidés et, depuis 1998, pour les oiseaux (Komar,
2000).
2. Historique :
Le virus West Nile (VWN) fut l'un des premiers virus responsables des arboviroses à être
documenté. II fut isolé pour la première fois en 1937 par Smithburn et Burke à partir du sérum d'une
femme adulte atteinte d'un syndrome fébrile bénin, habitant le district du West Nile en Ouganda. Ce
n'est que dans les années cinquante que l'écologie de cette arbovirose a été mise en évidence en
Egypte. Puis le VWN a été reconnu responsable de sévères méningo-encéphalomyélites humaines
chez des personnes âgées en Israël en 1951-54 puis 1957. Ensuite, des cas de maladie chez des
chevaux ont été observés en Egypte (Taylor, 1956) et d‘autres pays au début des années soixante.
Le virus a été détecté chez des oiseaux et des moustiques puis, il a été retrouvé chez l'Homme
et l'animal dans de divers pays (Roumanie et Maroc en 1996, Tunisie en 1997, Italie en 1998).
L‘apparition du VWN en Amérique du Nord en 1999, avec des cas d'encéphalites humaines et
équines, semble représenter une étape importante dans l'histoire de I' évolution de ce virus (Komar,
2000; Peiris et Amerasinghe, 1994). Plusieurs pays tels qu‘Israël, la France, le Portugal et le Mexique
ont rapporté des cas humains de l'infection par le VWN en 2003 ou 2004. En octobre 2003, un cas de
méningo-encéphalite due au VWN est rapporté dans le département du Var dans le Sud-Est de la
France. Il s‘agit du premier cas humain depuis 1964 (Mailles al., 2003).Le total des cas en France en
2003 s‘établit à six cas confirmés et un cas probable.
En juillet 2004, deux Irlandais développent des symptômes, une encéphalite et une fièvre,
après un séjour au Portugal. Des investigations menées dans ce pays confirment la présence des
moustiques infectées par le VWN (CDC, 2004).
Au Mexique, 6 personnes ont présenté une atteinte neurologique (Farfán et al., 2004). En
juillet 2004, un cas a été rapporté dans l'état de Sonara à la frontière du Texas.
3
3. Répartition géographique:
a. Répartition mondiale:
Le virus circule de façon enzootique et endémique en Afrique et en Asie (Figure 1). Dans le
reste du monde, notamment en Europe et en Amérique, il provoque régulièrement des épidémies et
des épizooties (Zientara et Lecollinet, 2010). L‘émergence inattendue du virus en 1999 en pleine ville
de New York, associant des cas humains d‘encéphalite mortelle et une mortalité aviaire importante
(Tableau 1) et la diffusion rapide sur le continent Nord-américain mais également en Amérique
Centrale et du Sud a entraîné un regain d‘intérêt pour cette virose. Ainsi en 10 ans et rien qu‘aux
Etats-Unis, la propagation du VWN a entrainé plus de 29 000 cas chez l‘homme associés à 1157
décès et au moins 25 000 cas équins (Pradier, 2010)
Figure 1: Répartition mondiale du VWN
Source : http://www.moustiquesinfo.sante.gouv.fr/spip.php?rubrique39.
Le VWN a été reconnu comme un agent pathogène humain en Afrique au cours de la
première moitié du 20ème siècle. Bien que plusieurs épidémies de FWN ont été décrites, l'encéphalite
due à l'infection par le VWN chez les humains a est été rarement observée avant 1996, depuis lors,
des épidémies d'encéphalite ont été signalés en Roumanie, la Russie, Israël, Amérique du Nord, la
France, la Tunisie, l'Italie et la Grèce.
Pendant les années 1960, La FWN a été rapportée chez des chevaux d'Egypte et la France
(Panthier et al., 1968; Schmidt & El Mansoury, 1963). Depuis 1998, des épidémies d‘encéphalite
équine dues au VWN ont été signalées par l'Argentine, le Canada, la France, Israël, l‘Italie, le Maroc,
l'Espagne et les États-Unis d'Amérique. En 2011, une épidémie d'encéphalite équine causée par le
virus Kunjin, a été signalée en Australie.
4
L'apparition de la maladie chez les humains et les animaux ainsi que des oiseaux et la
surveillance des moustiques pour l'activité du VWN ont démontré que l‘étendue de la répartition du
virus s‘est considérablement élargie, y compris en Amérique, en Europe, et autour du Bassin
méditerranéen.
Cette endémisation du virus en Méditerranée est particulièrement nette en Italie où, chaque
année depuis 2008, date de la réémergence du virus dans ce pays (Calistri et al., 2009), des cas de
FWN chez l‘homme sont diagnostiqués dans les régions du Nord de l‘Italie (Vénétie, Lombardie et
Emilie-Romagne) où co-circulent depuis 2012 les deux lignées du VWN (Capelli et al.,2013).
En effet, la lignée 1 a été responsable de la majorité des foyers identifiés en Europe avant,
que ne soit isolé, en 2004, en Hongrie la lignée 2 (Bakonyi et al., 2006) qui s‘est depuis étendue à
toute l‘Europe de l‘Est et à une partie de l‘Europe du sud. En ce qui concerne la surveillance des
équidés en 2013, des cas ont été diagnostiqués principalement en Italie, Grèce et Espagne, dans des
zones où le virus avait déjà été isolé en 2012 (OIE, 2012).
Cette implantation du VWN est aussi associée en 2013 à une extension de son aire de
répartition à d‘autres régions d‘Europe. Cette extension est particulièrement visible dans les Balkans
avec, en Serbie par exemple, 302 cas humains en 2013 pour 69 cas diagnostiqués en 2012.
Néanmoins, le nombre de cas humains cumulés par année au niveau des pays européens et des pays
voisins n‘est pas en faveur d‘une augmentation de l‘incidence du nombre de cas pour l‘année 2013.
Le VWN est donc bien implanté en Europe, avec de manière préoccupante une endémisation
dans certains pays comme l‘Italie ou la Grèce, et une extension progressive de la maladie à de
nouvelles régions (Sardaigne, Bulgarie, Macédoine, Albanie, Serbie, région de l‘Attique en
Grèce,…).
Figure 2: Carte d‘isolement du virus de la FWN dans le monde
(Calistri P. et al., 2010)
5
Tableau 1: Cas cliniques et mortalités dues au VWN aux USA rapportés par le CDC par an de 1999
à 2014
Maladie non
neuroinvasive
Maladie Neuroinvasive
Année
Nbre.
de Cas
Nbre. de
Morts
(%)
Nbre.
de Cas
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
59
19
64
2,946
2,866
1,148
1,309
1,495
1,227
689
386
629
486
2,873
1,267
1,347
7
2
10
276
232
94
104
162
117
41
32
54
42
270
111
87
12
11
16
9
8
8
8
11
10
6
8
9
9
9
9
6
Total
18.810
1,641
9
Total
(%)
Nbre.
de Cas
Nbre. de
Morts
(%)
3
2
2
1,210
6,996
1,391
1,691
2,774
2,403
667
334
392
226
2,801
1,202
858
Nbre.
de
Morts
0
0
0
8
32
6
15
15
7
3
0
3
1
16
8
10
0
0
0
1
(<1)
(<1)
1
1
(<1)
(<1)
0
1
(<1)
1
(<1)
1
62
21
66
4,156
9,862
2,539
3
4,269
3,63
1,356
720
1,021
712
5,674
2,469
2,205
7
2
10
284
264
100
119
177
124
44
32
57
43
286
119
97
11
10
15
7
3
4
4
4
3
3
4
6
6
5
5
4
22,952
124
(<1)
41,762
1,765
4
Source: ArboNET, Arboviral Diseases Branch, Centers for Disease Control and Prevention
b. La FWN au Maroc:
Le Maroc a connu trois épizooties dues au VWN en 1996, 2003 et 2010. En 1996, La maladie
aurait débuté au mois de mars chez un cheval âgé de 6 ans qui a présenté une parésie du train
postérieur et qui a finalement été abattu le 16 septembre 1996 dans la province de Benslimane.
Après un silence épidémiologique, la maladie est réapparue en juillet 1996 dans les provinces
de Kénitra et Larrache (périmètre irrigué) puis en aout 1996 une mortalité en série s‘est déclarée dans
différents douars au nord-ouest du pays avec une forte incidence durant la période de 23 aout au 07
septembre 1996. Une nette dimunition des cas et de la mortalité a été observée à partir de la dernière
semaine du mois de septembre 1996. Le dernier cas déclaré date du 12 octobre de la même année.
Depuis le début de la maladie et jusqu‘au 30 novembre 1996, 94 équidés ont été atteints dont
42 sont morts. Un seul cas humain d‘encéphalite mortelle attribuée au VWN a été rapporté à la même
époque
Des sérologies ont été effectuées et ont permis d‘exclure rapidement les maladies
contagieuses classiques compte tenu du contexte épidémiologique. Le diagnostic s‘est d‘abord porté
sur la forme nerveuse de la rhinopneumonie équine mais cette hypothèse a été écartée par la suite.
Les analyses sérologiques de L‘Institut Pasteur de Paris, ainsi que les études virologiques et
histologiques ont permis de suspecter le VWN (MAMVA, 1996).
6
En 2003, entre septembre et octobre, 9 cas équins avec des troubles neurologiques ont été
observés dans la région du Gharb au nord-est de Kénitra dans les localités de Ouled Slama, Ameur
Seflia et Mograne (Schuffenecker et al., 2003).
En 2010, entre le 20 juillet et le 17 août, seize foyers équins ont été identifiés au Maroc
essentiellement dans la région de Benslimane. Sur 111 chevaux, 17 ont présenté des signes cliniques
et 8 sont morts. (OIE, 2010).
Les souches qui circulent au Maroc ont une parenté génétique avec celles identifiées à l‘ouest
du bassin méditerranéen et elles se caractérisent par une virulence importante pour les équidés. Le
séquençage des isolats Mor.1996 EQ et Mor.2003 EQ montre une similitude nucléotidique de
98.9% par conséquent l‘hypothèse de la résurgence n‘est pas à exclure (Fassi-Fihri M.M., 2008).
Chez les équidés, plusieurs enquêtes sérologiques ont été menées dans les zones des
épizooties. Ainsi à Kénitra en 2003, la séroprévalence en anticorps anti-VWN, était de 41.92%,
(n=260) et dans la région de Laarache en 2006, elle était de 57% (n=251). Les chevaux ont montré
une prévalence supérieure aux mulets et aux ânes Ces prévalences étaient respectivement de 86.52
%(n=89), 49,02 %(n=51) et 36,94 % (n=111) (Iraqui H. H .2006).
La circulation du VWN a été signalée chez des oiseaux sauvages comme les merles noires
(Merulas Turdus), les moineaux (Passer domesticus) et les bouscarles de Cetti (Cettia Cetti)) au nord
de Kénitra en 2008 (Figuerola et al., 2008)
Dans le cadre de la recherche du VWN dans l‘avifaune du Maroc, Le VWN a été détecté aussi
dans les organes de 2 cormorans (famille des Phalacrocoracidés) originaires des régions de Boujdour
et Dakhla (El Kerfaz, 2008). Ces provinces représentent des sites de halte sur le trajet migratoire des
oiseaux sur la côte Atlantique
Chez l‘homme, en plus de la mort d'un personne, qui a été attribué à la maladie en 1996 (El
Harrak et al., 1997), la preuve de la circulation virale chez l'homme a été établie en 2011 par la
détection d‘anticorps séroneutralisants chez 59 personnes parmi 499 (11,8%) vivant dans les
alentours de Meknès (4,7% (n=150)) , Rabat (12% (n=200)) et Kénitra (18,8% (n=149)) (El
Rhaffouli et al., 2012).
Par ailleurs, une enquête sérologique chez le dromadaire a été menée sur 1392 sérums pour
étudier la prévalence en anticorps dirigés contre certaines maladies virales dont la FWN entre 2003 et
2009 sur différents sites au sud du Maroc a montré que non seulement le dromadaire présentait les
anticorps anti-VWN mais aussi que la séroprévalence des AC dirigés contre le VWN a augmenté au
cours de cette période de 10 à 13% (Touil et al., 2012).
II.
Etude du virus West Nile :
1. Classification :
Le VWN est un virus enveloppé à ARN simple brin de polarité positive, appartenant au genre
Flavivirus et à la famille des Flaviviridae. Ce genre regroupe de nombreux agents pathogènes
importants pour l‘homme et transmis par des arthropodes, tels que les virus de l‘encéphalite
japonaise, de la dengue, de la fièvre jaune ou de l'encéphalite à tiques. Pour les Flavivirus transmis
par les moustiques, 7 sérogroupes ont été identifiés sur la base des réactions croisées observées au
cours des tests d'inhibition de l'hémagglutination. Le VWN appartient au séro-complexe de
l‘encéphalite japonaise, comprenant également le virus de l‘Encéphalite Japonaise (JE), le virus de
l‘Encéphalite de la Murray Valley (MVE), le virus de l‘Encéphalite de Saint Louis (SLE), les virus
Usutu (USU), Koutango (KOU), Cacipacore (CPC) et Yaounde (YAO).
2. Structure et génome :
En microscopie électronique, le VWN apparaît comme un virus à la surface irrégulière.C‘est t
un virus enveloppé, d'environ 40-45 nm de diamètre, de forme sphérique ( Figure 3). Tout comme
les autres flavivirus Le génome consiste en un ARN+ monocaténaire qui se situe dans une
7
nucléocapside (protéine C) à symétrie icosaédrique. Deux protéines de surface sont enchâssées
dans la bicouche lipidique de l'enveloppe : la protéine d'enveloppe virale E et la protéine de
membrane M..
Figure 3: Apparence du virus West Nile en microscopie électronique
(Source : Site internet Bioquest: Community Resources for problem solving in biology)
Figure 4: Structure VWN
(Source: Microbe http://viralzone.expasy.org/all_by_species/24.html)
La taille de cet ARN génomique est de 11300 nt (ou Il, 3 kb.) et il code pour 10 protéines
virales. Les virions contiennent trois protéines qui sont codées à partir de l'extrémité 5' du génome et
les sept autres protéines, qui sont non structurales, sont codées à partir de l'extrémité 3'.
8
Figure 5: Structure du génome du virus
(Source : http://viralzone.expasy.org/all_by_species/24.html)
Les trois protéines structurales sont celles de la nucléocapside (C), celle d'un précurseur de
protéines transmembranaires (prM) et celle des spicules glycoprotéiques de surface (E). (figure 5).
La protéine de capside (C) est une protéine hautement basique de 11 kDa (Lindenbach et al.,
2007). Les résidus chargés sont situés dans les régions N- et C-terminales, séparées par une région
interne hydrophobe impliquée dans la structuration de la capside (Ma et al., 2004). Le domaine Cterminal hydrophobe sert de peptide signal pour la translocation au réticulum endoplasmique (RE) de
la protéine de membrane (M). Ce domaine est clivé de la protéine de capside mature par la serine
protéase virale (NS3) (Lobigs et al., 1993). Il n‘est pas encore bien établi comment les dimères de C
sont organisés au sein de la nucléocapside.
De nombreuses propriétés biologiques des Flavivirus, telles que le tropisme, l‘attachement et
la fusion cellulaire, la virulence, l‘hémagglutination et l‘antigénicité sont associées à la protéine
d‘enveloppe E. En effet, la protéine d‘enveloppe est la plus immunogène et induit la majorité des
anticorps neutralisants (Sanchez et al.,.2005). Elle est constituée de trois domaines structuraux, parmi
lesquels le domaine III est le plus immunogène. (Figure 6)
Figure 6: Représentation de la structure de la protéine d‘enveloppe
(Forme homodimérique présente à la surface des particules virales matures)
(Lidenbach et al., 2007).
9
La figure montre une vue par-dessus et de côté de la protéine. La protéine d‘enveloppe
possède trois domaines dont le peptide de fusion.
Les sept protéines non structurales, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5, varient selon
leur poids, leur taille et leur fonction :
-NS1 n'a pas un rôle exact dans l'assemblage de virion mais elle aiderait dans le processus de
réplication (Westaway E.G et al., 2002).
-NS2A, NS2B, NS4A, NS4B et inhibent la réponse immunitaire fuser contre l'infection virale dans le
corps (Liu W.J.et al., 2004.)
- La protéine NS3: elle a des fonctions d'hélicase, de protéase et elle participe également au complexe
de l‘ARN polymérase.
-La protéine NS5: il s'agit de l‘ARN polymérase, qui joue un rôle important dans la réplication virale
(Fenner et al., 1993).
Les régions non-codantes (NC) se trouvent aux extrémités 5‘ et 3‘ possèdent une coiffe m7GpppA
qui est reconnue par la protéine cytoplasmique eIF4B (Facteur eucaryotique d‘initiation à la
traduction) (Chui et al., 2005; Clyde et Harris, 2006). Ce complexe recrute la petite sous-unité
ribosomale pour la traduction de la polyprotéine virale.
Les régions 3‘ non codante possède une structure en épingle à cheveux hautement conservée qui
sert de promoteur de synthèse du brin ARN positif (+) (Shi et al., 1996), ainsi qu‘une séquence de
cyclisation. Cette séquence induit l‘interaction entre les parties 5‘ et 3‘ du génome virale, ce qui est
nécessaire pour la réplication (khromykh et al., 2009a ; Thurner et al., 2004 ; You et Padmanbhan,
1999).
3. Caractères physico-chimiques :
A l‘instar des autres Flavivirus, le VWN est peu stable dans l'environnement et il est
facilement inactivé par la chaleur, par la lumière et par des désinfectants contenant des détergents ou
des solvants lipidiques, c'est-à-dire tous les désinfectants communs. Les prélèvements organiques
susceptibles de le contenir doivent être conservés à -70°C (Fenner et al., 1993).
4. Diversité et virulence :
Les relations antigéniques entre les Flavivirus ont été étudiées en utilisant les testsd‘inhibition de
l‘hémagglutination et de séroneutralisation. Les études sur les anticorps monoclonaux ont révélé la
complexité des relations entre les virus, montrant l‘existence de groupes de Flavivirus, sous-groupes,
sérocomplexes avec des déterminants antigéniques spécifiques de type et de souche.
L‘identification et la classification de différentes souches de VWN ont été réalisées en
utilisant les tests de séroneutralisation et d‘immunofluorescence indirecte, mais l‘analyse de la
séquence nucléotidique du génome viral (à partir des gènes codant les protéines E ou NS5, ou le
génome viral complet) a permis d‘identifier plus clairement les relations/distances entre les souches
virales et de définir la notion de lignage de virus (avec des différences nucléotidiques d‘au moins 2030% entre lignages (Castillo-Olivares, 2004).
Ainsi , des analyses phylogénétiques basées sur l'analyse des séquences nucléotidiques d'un
fragment de 255 pb du gène codant pour la glycoprotéine E, ont montré que les isolats du VWN de
différentes régions géographiques sont classés en deux lignages majeures (1 et 2), présentant 25 à
30% de différences nucléotidiques (Berthet et al., 1997; Lanciotti et al., 2002) et en plusieurs sousclades ou clusters (Berthet etal., 1997; Lanciotti et al., 1999; Savage et al., 1999; Scherret et al.,
2001; Charrel et al., 2003).
10
Figure 7: Arbre phylogénétique du VWN.
(Elena S et al. , 2009).
La barre d‘échelle indique le nombre de sibstitutions de base par site. Tous les isolats appartiennent à
1a lignée 1, sauf Kunjin (outgroup) qui appartient au 1b. (b) Détails de l‘arbre phylogénétique montre
(a), dans lequel la branche comprenant tous les isolats de la Méditerranée occidentales
Le lignage 1 regroupe des souches qui circulent en Afrique de l'Ouest, Moyen Orient, Europe
de l'Est, Amérique du Nord et Australie. Le lignage 2 a une répartition géographique restreinte; il
circule en Afrique sub-saharienne et Madagascar. Récemment, il a été retrouvé en Europe et plus
précisément, en Hongrie, en Grèce et en Italie (Bakonyi et al., 2006; Bagnarelli et al., 20 11; Papa et
al., 2011). D'autres souches du VWN ont été isolées et présentent des différences génétiques
considérables par rapport aux deux lignages 1 et 2 (Lvov et al., 2004); le lignage 3 inclût le virus
Rabensburg isolé en République Tchèque en 1997 (Bakonyi et al., 2005), le lignage 4 est représenté
11
par une seule souche isolée en Russie (Bakonyi et al., 2005) et le lignage 5 correspond à une souche
isolée en Inde en 1980 (Bondre et al., 2007).
Les souches de virus sont nommées avec les règles suivantes : des lettres correspondant au
lieu où la souche a été isolée. (Exemple, It=Italie, Ro=Roumanie, Ken=Kenya, Tu=Tunisie,
Hu=Hongrie, NY=New York, Is=Israël, Tx=Texas, Eg=Egypte,Chin=Chine, Ind=Inde, Rus=Russie,
Rab=Rabensburg, Car=République d'Afrique Centrale, SA=Afrique du Sud, Ug=Uganda), 2 numéros
correspondant à l'année d'isolement (ex:00=2000, 96=1996) et le numéro d'accès GenBank. Le virus
de l'Encéphalite Japonaise (JEV), un Flavivirus proche du West Nile, a été utilisé pour constituer la
racine de l'arbre phylogénétique.
Les différentes souches de VWN diffèrent en virulence et en pouvoir neuro-invasif. Etant
donné que les souches neuroinvasives appartenaient plutôt au lignage 1, les souches de lignage 2
étaient auparavant considérées comme moins virulentes. Cependant des études récentes ont montré
que des souches de lignage 2 très virulentes et neuroinvasives ont été détectées en Afrique du Sud
(Venter et Swanepoel, 2010) et qu'elles étaient capables d'induire des signes cliniques chez les
chevaux et les humains (Venter et al., 2009). Ces différences de virulence dans les souches
circulantes de VWN ont été avancées pour expliquer en partie les situations épidémiologiques
différentes entre les Etats-Unis et l'Europe ou l'Amérique Centrale et du Sud, en particulier les
souches comportant un résidu proline au niveau d'un acide aminé critique de la protéine non
structurale 3 (NS3-249), comme les souches nord-américaines, la souche hongroise de lignage 2
ayant émergé en 2004 (Brault et al., 2007) et la souche ayant sévi en Grèce en 2010 (Papa et al.,
2011), pourraient être associées à une virulence accrue pour les oiseaux.
5. Propriétés biologiques :
5.1.Multiplication in vitro :
Le VWN se multiplie bien in vitro et provoque des effets cytopathiques sur de nombreux
types de cellules de mammifères: les cellules Véro (Cellules épithéliales extraites du rein de singe
vert africain), les cellules BHK-21 (Baby hamster kidney : rein de hamster nouveau-né), les
fibroblastes embryonnaires de poussin et de canard et les cellules PS Clone D (Fenner et al., 1993).
Ce virus se multiplie également sur des cellules de moustiques mais sans provoquer d'effet
cytopathique, ce qui témoigne à la fois, de leur réceptivité et de leur résistance vis-à-vis de ce virus.
Les cellules concernées sont les cellules C6/36, dérivées d‘Aedes albopictus et les cellules AP-61,
dérivées de Aedes pseudoscutellaris ainsi que des cellules dérivées de Aedes aegypti (Peiris et al.,
1994). Le VWN se multiplie aussi sur des cultures de cellules primaires et sur des lignées de cellules
humaines et murines appartenant aux lignées des monocytes et macrophages.
5.2. Multiplication in vivo:
La réplication virale se passe dans le cytoplasme de la cellule hôte en étroite association avec
le réticulum endoplasmique (Figure 8). Le VWN infectieux s'attache aux cellules susceptibles
(monocytes, macrophages, neurones, etc.), puis pénètre dans celle-ci par fusion avec la membrane
cytoplasmique de la cellule hôte soit par le dépôt de la nucléocapside dans le cytoplasme ou la
formation d'une vésicule (endosome) par l'invagination de la membrane cytoplasmique. Il y a
réplication de l‘ARN viral et synthèse des protéines en plusieurs copies par l'utilisation des
mécanismes de réplication de la cellule hôte, l‘assemblage et la libération des virus matures de la
12
cellule infectée se fait par bourgeonnement. (Gollins et Porte field, 1985). Le virus a un
neurotropisme marqué (Burke et al., 2004).
Figure 8: Mode multiplication du VWN
Source http://www.nature.com/nrmicro/journal/v11/n2/fig_tab/nrmicro2950_F1.html
6. Propriétés antigéniques:
6.1. Pouvoir antigénique:
Le pouvoir antigénique est caractérisé par l'existence d'antigènes de groupe communs aux
membres du complexe antigénique de l'encéphalite japonaise et d'antigènes spécifiques révélés
notamment par des tests d'IHA et de neutralisation.
Comme la grande majorité des arbovirus, le VWN :
 Est hémagglutinant et hémadsorbant sur globules rouges de poulet et d'oie, et suscite la
formation d'anticorps inhibant l'hémagglutination.
 Entraîne la synthèse d'anticorps fixant le complément, après le contact du virus avec un
organisme sensible.
 Provoque la formation d'anticorps neutralisants permettant les diagnostics sérologiques tardifs
par réaction de séroneutralisation sur souris et sur culture cellulaire.
13
6.2. Immunité:
Les réponses humorale (RIMH) et cellulaire (RIMC) assurent une protection contre les
diverses infections occasionnées par les flavivirus. Les effecteurs de l'immunité comprennent les
lymphocytes T cytotoxiques, les anticorps neutralisants et non neutralisants ainsi que les anticorps à
effet cytotoxique (Castillo-Olivares et Wood, 2004).
Pour le VWN, il ressort des études (King et al., 2007) que la RIMH est requise pour éliminer
le virus du plasma et prévenir une dissémination future, alors que la RIMC intervient dans la
clairance virale des tissus.
a. La réponse immunitaire à médiation humorale:
La réponse humorale est importante dans le contrôle de l'infection virale et de la
dissémination. Pour le VWN, le tableau clinique de la maladie est accentué chez une souris à laquelle
il manque des cellules de type B fonctionnelles, une situation qui peut être contrecarrée par le
transfert passif d'anticorps provenant d'une souris de type sauvage immunisée (Diamond et al., 2003).
Des études sérologiques ont montré que les chevaux infectés naturellement développaient une
forte réponse en anticorps neutralisants (Davidson et al., 2005). L‘essentiel de ce contrôle est
supporté par les anticorps neutralisants (King et al., 2007), qui reconnaissent des épitopes localisés
préférentiellement au niveau de la glycoprotéine virale E. Ces anticorps inhibent l'attachement viral.
l'internalisation du virus et la réplication virale (Oliphant et al., 2005).
La protéine non-structurale 1 (NS1) est une protéine sécrétée qui est très conservée parmi les
flavivirus. Les anticorps Anti NS1 protègent de la maladie induite par le flavivirus et peuvent être
utilisés à des fins prophylactiques et thérapeutiques dans les modèles animaux (Falgout B et al.,
1990).
Le mécanisme de protection fait intervenir la fixation du complément sur la partie constante
(Fc) de l'anticorps. Un phénomène immunopathologique impliquant la réponse humorale aux
flavivirus, connu comme "Antibody-dependant enhancement of infection" ou ADE, peut intervenir. Il
se produit lorsque les complexes anticorps-virus sont internalisés dans les cellules via le segment
Fragment Constant (Fc) des Immunoglobulines (Peiris et Porterfield 1979).
.
Chez la souris, un épitope majeur T332 localisé sur la surface latérale du domaine DIII de la
protéine de l‘enveloppe E du VWN joue une rôle majeur dans la réponse neutralisante (Beasley et
Barrett, 2002, Oliphant et al., 2005). Chez le cheval, cet épitope joue un rôle important dans la
réponse immunitaire mais il n'est pas immunodominant (Sanchez et al., 2007),. Ainsi la réponse en
anticorps neutralisants chez le cheval apparaît comme variable et polyclonale, avec des épitopes
présents aussi bien sur le domaine DIII de La protéine d‘enveloppe E que sur d'autres protéines.
En ce qui concerne la différence entre la RIMH suite à l'infection par un virus à lignage 1 ou à
lignage 2, il a été montré que l'infection expérimentale entraîne une réponse avec un profil en
anticorps sériques similaire en utilisant les techniques de séroneutralisation et ELISA. La réponse
neutralisante en anticorps médiée par les IgG persiste plus longtemps que la réponse spécifique IgM
(Zeller et al., 2004). (Figure 9), il n'y a pas de différence suite à une infection par un virus de lignage
1 ou un virus de lignage 2, puisque les sérums d'animaux infectés présentent une activité
neutralisante comparable lors d‘infection par l‘un ou l‘autre lignage (Castillo-Olivares et al., 2011).
14
Figure 9 : Cinétique des anticorps anti-VWN
(Zeller et al., 2004).
Après inoculation du virus Le temps d‘incubation chez les équidés varie de 3 à 15 jours, une
virémie de 6 à 7 jours est suivie d‘une production des IgM au bout de 8 à 10 jours, (Figure 9)
Ils persisteraient moins de 3 mois (Ostlund et al., 2001). Les anticorps IgG, responsables de la
mémoire immunitaire, sont produits à partir du dixième jour post-infection.Ils persistent plus d‘une
année.
Le rôle de la RIMH est considéré comme important, permettant d'éliminer le virus du sérum. Les
caractéristiques précises de cette réponse chez le cheval restent encore à explorer.
b. La réponse immunitaire à médiation cellulaire :
Le VWN induit la production par le SNC d'une chémokine, cytokine dont le rôle principal est
l'activation cellulaire et la stimulation de la migration des leucocytes (Burteau et al., 2007) nommée
CCL5, qui recrute des lymphocytes T exprimant le récepteur CCL5 ainsi que des macrophages qui
ont un effet protecteur dans le SNC aussi bien chez la souris que chez l'humain (Glass et al., 2005).
D'autres cytokines telles que IFN-α IFN-β, IFN-ɣ sont également produites (Keller et al., 2006, Liu et
al., 2006, Sitati et Diamond, 2006).
La vaccination de chevaux sains avec un virus inactivés induit une réponse antigénique
spécifique cellulaire caractérisée par la production par les lymphocytes de CD4+ et CD8+ d'IFN-ɣ,
par une prolifération cellulaire et par l'expression d‘IL-4 par les lymphocytes CD4+. En général, les
réponses observées étaient augmentées par un rappel vaccinal. réponse lymphocytaires (Davis et al.,
2008)
Les lymphocytes CD8+ sont particulièrement importants pour la clairance virale des tissus, le
contrôle de l'infection et la prévention de la persistance virale (Shrestaet Diamond, 2004). Les
lymphocytes CD4+ jouent un rôle de régulation de l'encéphalite à VWN et également dans la
clairance de la maladie. Il semble également qu‘une communication croisée entre les lymphocytes
CD4+ et CD8+ soit mise en place. (Burke et al., 2004). Ces réponses modulées par les lymphocytes
T, bien qu'elles soient importantes pour la clairance virale, peuvent provoquer également des
dommages chez l'hôte infecté. Les mécanismes immunopathologiques médiés par les cellules T
contribuent à la maladie et il a été montré que les lymphocytes CD8+ ont à la fois un effet protecteur
15
et délétère dans le modèle murin (Wang et al., 2003). Les lymphocytes B semblent également
importants (King et al., 2007), mais leur rôle n'est pas encore défini. On peut donc affirmer que les
lymphocytes B et T agissent de concert dans le cas d'une infection à VWN.
III.
Physiopathologie:
1. Pathogénie:
Lors de la piqure d‘un moustique infecté, le VWN est déposé dans les tissus extravasculaires.
La salive des moustiques contiendrait des composants (protéines) qui modulent les premières étapes
de l‘infection en altérant la réponse immunitaire au site de piqure de l‘hôte. Au lieu d‘une
dissémination rapide du VWN dans le courant sanguin, le VWN se développe d‘abord dans les tissus
sous-cutanés spécifiquement dans les cellules de Langherhans (CL), les CL infectées migrent vers les
nodules lymphatiques via les canaux lymphatiques pour atteindre le courant sanguin. La réplication
virale est observée au bout de 12 à 24 heures dans les tissus lymphoïdes secondaires
La virémie primaire donne lieu à l‘infection des leucocytes et des tissus tels que la rate, le foie
et les reins. La réplication virale dans les leucocytes infectés, les transforme en réservoir du virus et
agissent par conséquent comme un cheval de Troie.Le pic de virémie est observé 4 à 6 jours après
l‘infection
Des capteurs viraux (comme la TLR3) reconnaissentt le VWN et initient la production des
métalloproteinases comme la MMP9, et les cytokines, comme la TNFα, qui sont connues toutes les
deux le pouvoir d‘augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et par conséquent de
faciliter la dissémination du virus dans le cerveau. Les cellules microgliales répondent par la
libération des médiateurs pro-inflammatoires qui causent des lésions létales des neurones. Ces
médiateurs causent aussi une altération de la barrière hémato-encéphalique.LeVWN est détecté dans
plusieurs sites du cerveau et les parties inférieures et supérieures de la moelle épinière, 4 jours après
l‘inoculation. Cette neuro-invasion et la neuro-virulence facilitées par la protéine E de l‘enveloppe du
virus causent une encéphalo-myélite aiguë et souvent fatale au bout de 9 à 10 jours post-infection
(Chambers et Diamond, 2003).
2. Symptômes cliniques :
Tous les flavivirus appartenant au même sérocomplexe dit de l‘encéphalite japonaise y
compris le VWN sont connus cliniquement par une forte fièvre et surtout des atteintes neurologiques.
La symptomatologie varie selon les parties du système nerveux touchées : méninges, cerveau et
moelle épinière. Les principales manifestations sont l‘altération de l‘état de conscience, la paralysie
flasque et les troubles moteurs (Salomon, 2004).
2.1.Chez le cheval :
Chez le cheval, la virémie est faible et limitée, alors que la période d‘incubation est en général
de trois à six jours, mais dans certains cas peut atteindre jusqu'à quinze jours (Flinois, 2000). Dans de
nombreux cas, la contamination par un moustique infecté ne se traduira par aucun signe clinique mais
uniquement par une séroconversion. Ce n‘est que lorsque le virus atteint le système nerveux central
que les signes cliniques vont se manifester. Il semble que de nombreux facteurs conditionnent
l‘intensité du tableau clinique tels que l‘âge, le mode d‘élevage, l‘état d‘entretien, la virulence de la
16
souche virale, la susceptibilité génétique de l‘hôte et les infections antérieures par d‘autres Flavivirus
(Zientara et al., 2004 ; Steinman et al., 2002). Par conséquent, la symptomatologie chez le cheval
varie d‘une forme asymptomatique à une méningo-encéphalite mortelle en passant par un simple
syndrome grippal.
 Forme aiguë neurologique typique:
Cette forme évolue en plusieurs périodes: l‘incubation est en général de 3 à 6 jours pouvant
atteindre 15 jours. Le tableau clinique comprend une fièvre biphasique, qui évolue sur deux ou trois
semaines: le premier pic thermique est suivi d‘une réemission de quelques jours avant l‘apparition
d‘un deuxième pic thermique. Ce dernier correspond à la phase d‘état de la maladie, c‘est-à-dire à la
localisation névraxique du virus. On peut observer alors des symtomes liés à l‘atteinte de la moelle
épiniaire, l‘encéphale ou des deux:
L‘atteinte de la moelle épinaire donne lieu à un syndrome de type myélitique, qui se caractérise
surtout par une incoordination motrice et la parésie du train postérieur, ce qui attire l‘attention du
propriétaire de l‘animal. Il présente alors une démarche ébrieuse et lourde, avec trébuchements,
ataxie, des déplacements en rond difficiles et une faiblesse des membres, l‘examen des réflexes
montre des perturbations importantes: la sensibilité cutanée est particulièrement ou totalement abolie,
l‘animal ne réagissant plus à la piqure, que celle-ci soit superficielle ou profonde, et cela dans les
parties postérieurs du corps. De même, les réflexes tendineux des membres postérieurs sont négatifs
et les réflexes sphinctériens sont diminués. Ces signes nerveux évoluent vers la paralysie et sont
parfois accompagnés d‘amaurose. Après un décubitus de quelques jours, le cheval peut mourir ou
simplement guérir, avec ou sans séquelles (Flinois, 2000).
L‘extension de l‘infection au cerveau donne lieu à un syndrome encéphalomyélitique: les signes
nerveux apparaissent dès le début, avec vacillements du train postérieur, le cheval peut tomber dès
qu‘il doit tourner et il est souvent ataxique. Cette période dure entre 2 et 4 jours et cela sans signes
généraux importants. L‘appétit reste normal, l‘hyperthermie peut être très forte. L‗atteinte
encéphalitique se manifeste parfois par l‘agressivité et l‘hyperexcitabilité chez certains sujets ou
l‘abattement et la dépression chez d‘autres. Les organes des sens sont généralement atteints: des
signes de surdité apparaissent parfois, ainsi que des troubles visuels (amaurose plus ou moins
complète). L‘examen ophtalmologique révèle une mydriase, une opacification du milieu de l‘œil et
un tapis sombre gris et des vaisseaux mal délimités. Le reflexe d‘occlusion palpébral, parfois
supprimé, est lent et incomplet, de même que le réflexe photomoteur. De plus des déviations ou des
paralysies unilatérales de la tête, avec ptose palpébrale marquée peuvent être observées.
Même à ce stade les signes généraux restent discrets avec une faible hyperthermie et un
appétit conservé. Cependant, pendant les périodes chaudes, l‘hyperthermie peut être très importante;
elle est accompagnée d‘un ictère franc ou d‘un subictère, très visible sur les muqueuses oculaires.
Cette phase d‘état dure de 4 à 6 jours en moyenne. Alors que la phase terminale présente une
évolution très variable: l‘animal est en parésie complète, après un coma, il survit avec des séquelles
qui nécessitent en général l‘abattage (Flinois, 2000).
Il est a retenir que la présentation clinique de la forme nerveuse varie d‘un animal à l‘autre et pendant
la progression de la maladie.En fonction de facteurs tels que l‘âge, la méthode d‘élevage, les
17
conditions de logement, la virulence de la souche, l‘infection antérieure par d‘autres Flavivirus(
Autorino G.I et al., 2002.
D‘autres formes plus discrêts peuvent être observées :
 Formes fébriles : Ce sont des formes de type grippal difficiles à déceler,
 Formes frustes: Elles sont caractérisées par des troubles locomoteurs bénins, rapidement
résolutifs et sans séquelles.
2.2. Chez l’Homme:
L‘infection par le VWN peut se manifester de trois façons différentes chez l‘Homme. La
première est une infection asymptomatique chez la grande majorité des gens qui ne présentent aucun
trouble apparent (80 % des cas passent inaperçus), la seconde est un discret syndrome fébrile,
semblable à la grippe, la troisième enfin, est une maladie neuroinvasive appelée méningite ou
encéphalite du Nil Occidental. Chez les personnes infectées le ratio entre les trois états est à peu près
de 110:30:1 (Tsai et al., 1998).
Dans la seconde éventualité, l‘épisode fébrile apparaît après une période d'incubation de 3 à 6
jours. Il se caractérise par la survenue, accompagnée de maux de tête et de dos, de frissons, de sueurs,
de douleurs musculaires, d'un gonflement des ganglions du cou, d'une toux, et de symptômes
respiratoires. En plus de ce syndrome grippal, il existe parfois une brève éruption cutanée et certains
patients présentent des symptômes gastro-intestinaux avec des nausées, des vomissements, une perte
d'appétit ou des douleurs abdominales, ainsi que de la diarrhée.
Tous les symptômes sont spontanément résolutifs en 7 à 10 jours, mais la fatigue peut se
prolonger pendant plusieurs semaines et les adénopathies peuvent persister jusqu‘à deux mois. Dans
moins de 15 % des cas, des complications peuvent survenir telles que méningites, encéphalites, ou
autres.
L'encéphalite qui est la forme la plus grave se manifeste par des symptômes similaires aux
précédents mais aussi par une baisse de la vigilance, pouvant aller jusqu‘à un état comateux. Les
réflexes ostéo-tendineux sont d'abord vifs, puis abolis. Il existe également des troubles
extrapyramidaux. La récupération est marquée par une longue période de convalescence avec une
grande fatigue.
La survenue de flambées récentes a conduit à une étude plus approfondie de la maladie et
d'autres formes, plus rares, ont été identifiées. La moelle épinière peut être infectée, avec apparition
d‘une myélite antérieure avec ou sans encéphalite (Sejvar JJ, et al., 2003). L‘association avec le
syndrome de Guillain-Barré a été identifiée (Ahmed S, et al., 2000) et parmi d'autres effets rares on a
observé une choriorénite multifocale qui possède une spécificité à 100 % pour l'identification d‘une
infection par le VWN chez les patients atteints d'encéphalite (Abroug F, et al., 2006), une hépatite,
une myocardite, une néphrite, une pancréatite et une splénomégalie (Perelman A, et al.,1974) (Omalu
BI, et al., 2003) (Mathiot CC et al.,1990).
Aux États-Unis, les personnes de tous les âges semblent être sensibles à l'infection par le
VWN, mais l'incidence de la maladie dans sa forme neuroinvasive semble augmenter avec l‘âge chez
les sujets de 60 à 89 ans.Les patients de sexe masculin sont plus exposés. En 2002, l'âge médian des
cas de maladies neuroinvasives était de 64 ans (intervalle de 1 mois à 99 ans), comparativement à un
18
âge médian de 49 ans (extrêmes 1-97 ans) pour les cas de FWN. Sur les 2.942 cas de maladies
neuroinvasives, 276 (9%) ont été mortels.
De 2002 à 2004, 1.051 cas de maladie due au VWN chez les enfants agés de moins de 19 ans
ont été signalés aux États-Unis, 317 (30%) avaient une maladie neuroinvasive et 106 (34%) d'entre
eux étaient âgés de moins de 10 ans (CDC, 2005). Deux patients pédiatriques (0,6%) atteints
d'infection neuroinvasive par le VWN sont morts: un nourrisson et un garçon de 14 ans avec un
dysfonctionnement immunitaire.
2.3. Chez les oiseaux:
L‘évolution de l‘infection chez les oiseaux est encore mal connue. Même lorsqu‘ils sont
virémiques, ils présentent rarement des signes cliniques. La maladie engendre souvent une forme
asymptomatique. En effet, le virus a été considéré comme non pathogène pour les oiseaux jusqu‘en
1998 où, en Israël, certaines espèces d‘oiseaux migrateurs, dont des cigognes, mais aussi des oiseaux
domestiques (oies) ont présenté des atteintes nerveuses avec mortalité (Lvov et al., 2002). Aux Etats
Unis, des mortalités ont été rapportées chez de très nombreuses espèces d‘oiseaux résidents,
principalement les corvidés, et tout particulièrement le corbeau américain (Corvus brachyryncos) et
les geais bleus (Cyanocitta cristata), mais aussi chez des rapaces (Steele et al., 2000). Des oiseaux du
Bronx et Queens (New York) ont également trouvé la mort. En 2002 ce sont plus de 14000 oiseaux
qui sont morts du virus dont 7719 corbeaux et 4948 geais. (CDC, 2003)
La mortalité aviaire exceptionnelle observée aux Etats-Unis a fait croire à certains auteurs que
les espèces d‘oiseaux américaines étaient plus sensibles que les espèces de la région paléarctique
(Campbell, et al. 2001). Cette sensibilité serait peut être dûe à l‘absence de l‘ immunité ou à une
sensibilité génétique. La mise en évidence d‘un gène de sensibilité au virus chez la souris corrobore
cette hypothèse (Guenet et Despres 2002).
Dans la nature, un grand nombre de ces oiseaux possède des anticorps neutralisants, ce qui
indique que beaucoup d‘entre eux survivent à l‘infection (Acha et al., 1989). Les inoculations
expérimentales ont également permis de mesurer les taux de virémie pendant les jours suivants les
inoculations.
Ainsi chez les oiseaux sauvages les résultats expérimentaux indiquent que la plupart des
espèces inoculées sont réceptives au VWN mais la réceptivité et la sensibilité peuvent être variable.
Les réponses à l'infection fluctuent également en fonction de la souche inoculée. Les passereaux et
les corvidés semblent étre très réceptifs à l'inoculation par le virus NY99, les virémies obtenues sont
élevées (Komar et al., 2003).
Par contre chez les oiseaux domestiques : toutes les espèces domestiques aviaires testées sont
réceptives a l‘infection par le VWN, tout comme les oiseaux sauvages, mais les taux de virémie
semblent souvent trop faibles pour infecter des moustiques lors de la piqûre. Ainsi, les poulets ou les
dindes ne pouvaient pas transmettre le virus aux moustiques pendant la phase virémique car les taux
de virus circulants n'étaient pas suffisamment élevés (Mclntosh, et al. 1969; Senne, et al. 2000;
Swayne, et al., 2000, Langevin et al., 2001). Ces espèces peuvent donc être utilisées comme des
espèces sentinelles car elles ne risquent pas d'amplifier la transmission du virus dans la zone
surveillée.
19
Des études de séro-surveillance ont été conduites dans de nombreux pays, notamment dans le
pays où les épidémies/épizooties de West Nile ont été déclarées. Ces études ont pu donner une idée
de la prévalence de l'infection dans l‘avifaune locale. En période d'épidémie, il est clair que la
prévalence chez les oiseaux porteurs d'anticorps anti-VWN augmente. Quand le virus semble avoir
disparu de la zone épidémique, la séroprévalence diminue. Ainsi, en Roumanie lors de l'épizootie de
l996. La séroprevalence aviaire était de 41%. Elle tombée à 8% en 1999 (Campbell. et al. 2001).
3. Lésions:
Il a été observé, dans les cas mortels de méningo-encéphalite, une généralisation des lésions
au niveau du cerveau et de la moelle épinière, avec une inflammation diffuse, de petites hémorragies,
des manchons péri-vasculaires et une dégénérescence des neurones (Peiris et al., 1994).
Chez l‘homme, le VWN a un tropisme positif pour les tissus dans lesquels les cellules
réticulo-endothéliales sont prédominantes. Cependant, la maladie est le résultat d‘une dégénérescence
des cellules infectées dans le système nerveux central. Des faits similaires ont été décrits chez les
primates et les chevaux. Chez les oiseaux, le tropisme est positif pour le rein et le cœur, mais d‘autres
tissus peuvent être infectés. (Komar, 2000).
3.1. Lésions macroscopiques:
L‘aspect des chevaux lors de l‘autopsie est normal en général. Nous pouvons toutefois noter
que, sauf dans les formes très fébriles où nous pouvons trouver parfois un ictère ou un subictère et, de
temps en temps, une dégénérescence des cellules hépatiques, aucune lésion viscérale ne peut être
observée. Au contraire, l‘hypertrophie ganglionnaire localisée et parfois généralisée, est quasi
constante. Dans les formes très graves, nous pouvons voir des lésions septicémiques avec congestion
généralisée. L‘aspect macroscopique reste donc très décevant (Peiris et al., 1994).
3.2. Lésions microscopiques:
Elles sont plus intéressantes, même si peu d‘entre elles sont réellement spécifiques. L‘unicité
des lésions névraxiques dans les formes aiguës se définit par une poliomyélite avec atteinte des
cornes ventrales, motrices, de la moelle épinière, surtout intense dans les segments postérieurs.
En revanche, le cerveau présente en général des lésions discrètes, constituées soit par de
l‘œdème en région méningée et sous-méningée, ainsi que dans la couche des cellules de Purkinje du
cervelet, soit par une péri vascularité lymphocytaire; il s‘agit d‘une myélite aiguë atteignant, à la fois,
la substance grise et la substance blanche, avec une certaine prédilection pour les cornes ventrales,
l‘intensité des lésions médullaires contrastant avec la discrétion des lésions cérébrales (Peiris et al.,
1994).
Les résultats de l'examen clinique et neuropathologique des chevaux soumis à l'épizootie
d'Italie en 1998 montrent que l'infection de tous les chevaux était caractérisée par une
poliencéphalomyélite lymphocytaire légère à modérée avec implication des branches ventrales et
latérale de la moelle épinière thoracique et lombaire, avec parfois une hémorragie modérée à sévère
(Cantile et al., 2001): Une lymphocytose et une inflammation monocytaire avec des foyers éparpillés
20
de microgliose furent observées sur la région de la moelle allongée et des ponts et dans une moindre
mesure sur le noyau basal, le thalamus et le mésencéphale (figure 6).
Pour les chevaux ayant subi l'épisode de New-York en 2001, les résultats microscopiques
observés étaient semblables à ceux observés chez les chevaux italiens. Dans les zones les plus
sévèrement affectées, une dégénérescence neuronale était proéminente et caractérisée par une
chromatolyse centrale, un gonflement cellulaire ou un rétrécissement cellulaire. Chez les chevaux
américains, les lésions étaient présentes au niveau du noyau basal, de la substance grise au niveau du
thalamus, des cornes ventrales et latérales de la moelle épinière spinale. Une diapédèse leucocytaire,
avec une hémorragie périvasculaire modérée à sévère, une dégénérescence et une nécrose
occasionnelle de la paroi des vaisseaux avec présence de neutrophiles ont été mises en évidence. Au
niveau des sites inflammatoires, les antigènes viraux du VWN étaient principalement localisés au
niveau de la substance grise. L'absence d'antigène au niveau des tissus extra-neuraux indique que
chez le cheval l'infection est limitée à l'atteinte du système nerveux central. Il est important de noter
que les différents variant génétiques du VWN peuvent exprimer différents tropismes tissulaires, selon
les espèces atteintes si ce sont des mammifères ou des oiseaux.
Figure 10: Lésions microscopiques du thalamus gauche et de la corde cervicale spinale
: Hémorragies sévères, multifocales aiguës incluant la substance grise. (Cantile et al., 2001)
Figure 11: Lésions microscopiques observées chez le cheval:
Prolifération focale gliale, périvasculite non suppurative et encéphalite causée par une infection à
VWN de lignage 2, coloration hematoxyline-eosine, Observation au microscope optique x
200.(Cantile et al., 2001)
21
IV.
Epidémiologie:
1. Source du virus :
Le VWN a été isolé, dans la nature, à partir de différents espèces d'oiseaux et de mammifères
et cela dans différentes régions du globe, Des enquêtes sérologiques indiquent la présence d'anticorps
à VWN chez l'homme, chez une grande variété d'espèces d'oiseaux sauvages et domestiques, chez
des mammifères sauvages comme les lémuriens, les chimpanzés, les rongeurs, les chauve-souris et
chez des mammifères domestiques comme les chameaux, les chevaux, les mulets, les ânes, les
chèvres, les vaches, les buffles, les moutons et les porcs.
Aprés la découverte du VWN, les premiers travaux ont été conduits en Egypte depuis les
années 1950, (Work, et al., 1955 ; Taylor et al., 1956). Des anticorps anti-VWN ont été détectés chez
40 % des oiseaux. Parmi 420 individus de différentes espèces. Les prévalences les plus élevées ont
été observées chez les corbeaux et les moineaux. Ainsi, 57% des moineaux domestiques (Passer
dormesticus), 88% des corneilles (Corvus corone), 48% des tourterelles maillées (Streptopelia
senegalensis), 68% des hérons garde-bœufs (Bubulcus ibis) présentaient des anticorps anti-VWN, ce
qui prouve un passage viral chez ces espèces sauvages. Des sérologies réalisées sur des pigeons
domestiques ou semi domestiques ont également prouvé que le virus circulait chez ces oiseaux
(Work, et al. 1953). Une deuxième étude conduite par Taylor a montré également que le virus peut
circuler chez les oiseaux domestiques (poulets, canards, et oies) et chez les oiseaux sauvages et semi
domestiques (corneilles. hérons, pigeons et moineaux) (Taylor, et al. l956).
.
Des inoculations expérimentales ont permis de mesurer les virémies de différentes espèces
d'oiseaux dans les jours suivants l‗inoculation. Les niveaux de virémie mesurés chez des corbeaux et
des moineaux étaient suffisamment élèves chez ces oiseaux pour infecter des moustiques. Les
inoculations sont montre que la sensibilité des espèces pouvait varier ainsi le moineau et la corneille
noire se sont avérés très sensibles alors que le faucon crécerelle, le héron garde-bœufs et la tourterelle
maillée ne l'étaient pas. Ces travaux ont permis de prouver pour la première fois que dans cette zone
endémique d'Egypte, le virus était transmis aux oiseaux et que les oiseaux pouvaient le transmettre.
L‘implication des moustiques de genre Culex comme vecteurs principaux et des oiseaux
comme principaux hôtes amplificateurs a été démontrée. Ces derniers développent une virémie
suffisante pour permettre l‘infection des moustiques lors de la prise du repas de sang. Après une
période d'incubation extrinsèque, le moustique peut infecter d‘autres oiseaux.
Des infections chez d‘autres espèces animales telles que les lapins sauvages, des chiens
domestiques et des amphibiens (Rana ridibunda) ont été rapportés (Peiris et Amerzsinghe, 1994).
Ces espèces n'occupent pas la même place dans le cycle de transmission du VWN :puisque certaines
sont des réservoirs, et d'autres, des hôtes accidentels
.
2. Les vecteurs
Le VWN est transmis par les moustiques au sein des populations d‘oiseaux et peut être
transmis plus rarement aux hôtes accidentels et sensibles qui sont l‘homme et le cheval. Plus de 70
espèces de moustiques ont été trouvées naturellement infectées par le VWN, cependant, elles ne sont
pas toutes impliquées dans la transmission. En effet, une espèce naturellement infectée ne signifie pas
automatiquement qu‘elle soit vectrice.
22
D‘un point de vue systématique les moustiques appartiennent à la classe des insectes, à l‘ordre des
diptères et à la famille des Culicidés. Les moustiques sont cosmopolites et sont groupés en deux sousfamilles, Culicinae et Anophelinae. (Figure12)
Figure 12 : Images de vecteurs de la FWN appartenant à la famille des Culicinae et Anophelinae
(a) : Cx pipiens; (b): Cx quinquefasciatus ; (c) : aedes egypti; (d): aedes albopictus
(Source : https://www.vectorbase.org/organisms)
Les espèces impliquées dans la transmission du VWN appartiennent essentiellement au genre
Culex. (Tableau 2). Les espèces du genre Culex sont cosmopolites sédentaires et crépusculaires. Par
contre les espèces du genre Aedes sont ornithophiles et anthropophiles ou zoophiles vivant dans les
habitations humaines (sous-sols, garages, greniers, débarras) ou animales (écuries, étables), ou bien
dans des niches à l‘extérieur (espèces exophiles). Culex pipiens est l‘espèce la plus répandue et la
plus fréquente, suivie par cx.modestus et cx. univittatus. D‘autres espèces pourraient également être
impliquées comme Cx. hortensis, Cx marttinii et Cx. Impudicus.
23
Tableau 2: Espèces de Culex impliquées dans la transmission du VWN
Pays/ Région
Espèces
Auteurs
Égypte
Cx. univittatus
Cx. antennatus
Cx. pipiens
(Taylor et al., 1956),
Israël
Cx. pipiens
(Nir et al., 1972)
Europe et Russie
Cx. pipiens
Cx. modestus
(Mouchet et al., 1970; Berezin, 1971;
Savage et al., 1999)
Afrique du Sud
Culex theileri
(McIntosh et al., 1967).
Asie
Cx. tritaeniorhynchus,
Cx. quinquefasciatus t
Cx. vishnui
(Pavri & Singh, 1965).
États-Unis
Cx. tarsalis,
Cx. pipiens,
Cx. restuans,
Cx. salinarius
Cx. erraticus
Cx. quinquefasciatus
Cx. nigripalpus
(Andreadis et al., 2004; Lukacik et
al.,2006; Gujral et al., 2007)
(Reisen et al., 2004; Hayes et al.,
2005).
Amérique centrale et aux Cx. nigripalpus,
Cx. bahamensis
Caraïbes
Cx. quinquefaciatus
(Lefrançois et al., 2006; Barrera et
al., 2008).
La vie du moustique Cx. pipiens est composée de deux phases distinctes: une phase aquatique
et une phase aérienne (Figure 12). Après l‘accouplement, les femelles prennent un repas sanguin
nécessaire à l‘élaboration des oeufs. Cependant, les femelles de Cx. pipiens peuvent produire une
première ponte sans repas sanguin, elles sont dites autogènes. Elles utilisent les réserves accumulées
durant leur stade larvaire.
24
Figure 13: Cycle biologique de Culex pipiens.
Source :http://biodiversite.wallonie.be/servlet/Repository/?ID=28509
Les moustiques s‘infectent lors d‘un repas sanguin en ingérant le virus. Après passage à
travers la barrière intestinale. Le virus doit se répliquer localement puis atteindre les glandes
salivaires pour pouvoir être transmis lors d‘un repas sanguin ultérieur. Cette étape indispensable dite
période extrinsèque, est liée directement aux conditions climatiques (température, hygrométrie) qui
sont des facteurs déterminants en terme d‘activité des vecteurs et de durée de transmission. Les
espèces dites compétentes sont les espèces véritablement impliquées dans le cycle de transmission du
virus (Zientara et Lecollinet, 2010).
La multiplication du VWN chez les moustiques et la dynamique des populations de ces
insectes étant fortement dépendante des conditions climatiques, principalement de température et
d‘hygrométrie, les foyers de la FWN apparaissent selon un mode saisonnier à la fin de l‘été ou en
automne, dans les régions tempérées d‘Europe (Zeller et Schuffenecker, 2004). La persistance du
virus au cours de l‘hiver n‘a jamais été mise en évidence en Europe, mais elle ne peut être exclue.
Elle pourrait résulter du maintien d‘une transmission à bas bruit pendant l‘hiver, d‘une infection
chronique chez les oiseaux ou de la persistance du virus chez le vecteur (Zientara et Lecollinet,
2010).
Le virus pourrait persister dans la femelle pendant l‘hibernation. On a déjà découvert chez Cx
.pipiens, pendant l‘hiver, le virus de l‘encéphalite de St Louis (Maryland, fin des années 1970) ou le
25
VWN (New York, hiver 1999/2000) (Nasci, et al., 2001). En principe, les femelles qui prennent un
repas sanguin avant d‘hiberner ne survivent pas longemps à l‘hiver, ce qui laisserait penser que cette
hypothèse n‘est pas solide. Pourtant il a été démontré que certaines femelles utilsaient le sang du
repas pour fabriquer un corps gras juste avant d‘hiberner, et surviveraient à l‘hiver (Nasci, et al.,
2001).
Un autre mécanisme suggère la persistance du virus chez les vecteurs pendant l‘hiver grâce à
la transmission à l‘œuf soit par la transmission transovarienne, du virus aux œufs ou soit par
transmission à l‘oeuf directement. Ce mode de transmission verticale a été prouvé pour des infections
de la FWN, de l‘Encéphalite de St Louis et de l‘Encéphalite Japonaise. Pourtant les taux d‘infection
de l‘œuf restent très faibles de l‘ordre de 1 pour 1000 (Turell et al. 2002).
La transmission par des vecteurs autres que les moustiques a été suspectée car le VWN a été
détecté chez des Cératopogonidés (diptères siphonaptères tels que les puces) (Sabio et al., 2006) et
chez divers ectoparasites des oiseaux : Hippoboscidés (Farajollahi et al., 2005, Gancz et al., 2005).
Le virus fût isolé chez differentes espèces de tiques et sont considérées comme des vecteurs
potentiels (Hayes 1989, Lvov et al., 2004, Mumcuoglu et al., 2005)
Le virus a été isolé chez les tiques dures : Hyalomma marginatum detritum, Rhipicephalus
turanicus mushamae, Amblyomma variegatum, Dermacentor marginatus (Hubalek & Halouzka
1999, Murgue et al., 2002, Lvov et al., 2004), et les tiques molles : Argas hermanni, Ornithodoros
capensis (Hubalek & Halouzka 1999, Murgue et al., 2002, Lvov et al. 2004, Mumcuoglu et al.,
2005) ainsi que chez d‘autres acariens nidicoles (Mumcuoglu et al. 2005). Des infections
experimentales ont été probantes sur diverses espèces telles que Ornithodoros savignyi, O. moubata,
O.maritimus, O.erraticus, Rhipicephalus sanguineus, R. rossicus, Dermacentor reticulatus et
Haemaphysalis leachit (Hubalek & Halouzka 1999). Des transmissions verticales du virus ont été
mises en évidence chez Argas arboreus (Abassy, et al.1993)
3. Les espèces hôtes
Les oiseaux représentent les hôtes amplificateurs et naturels du virus, les oiseaux résidents
assurent son amplification locale alors que les oiseaux migrateurs assureraient sa dissémination, son
introduction ou sa réintroduction périodique. Chez l‘oiseau réceptif au virus, une virémie se met en
place environ 1 à 4 jours après infection. Le niveau de virémie varie selon les espèces d‘oiseaux et sa
durée est assez courte (de l'ordre de quelques jours). Le mode principal d‘exposition est la piqûre par
un moustique infecté, cependant des cas de transmission directe par voie alimentaire ou par contacts
directs entre oiseaux ont été décrits expérimentalement (Genain et al., 2010). Puis l‘oiseau va
développer une immunité stérilisante qui reste présente pendant toute la vie de l‘animal. En Europe,
la mortalité des oiseaux suite à l‘infection par le VWN est rare, cependant en Israël et aux Etats-Unis
lors de l‘épidémie de New-York en 1999, de nombreux oiseaux (cigognes, oies, corbeaux, geais et
oiseaux exotiques) sont morts de l‘infection. Le VWN a été détecté aux Etats- Unis sur des animaux
morts appartenant à 138 espèces (Komar, 2000).
De très nombreuses espèces animales peuvent être également infectées par le virus, dont des
reptiles, des amphibiens, des carnivores; ainsi aux Etats-Unis l'infection a été décrite dans plus de 29
espèces de mammifères. A la différence de ce qui est observé chez les oiseaux, ces espèces ne
développent généralement pas une virémie d‘un niveau suffisant pour permettre la transmission du
virus à des vecteurs compétents.
26
Le réservoir aviaire du virus est constitué d‘oiseaux domestiques et d‘oiseaux sauvages
migrateurs de la famille des ardéiformes (hérons, aigrettes, pigeons…) et des passeriformes
(moineaux, corneilles, corbeaux,…). L‘infection demeure généralement inapparente malgré une
virémie de longue durée à des titres élevés. Aux Etats Unis, la mortalité chez les oiseaux, les corvidés
notamment, apparait comme un indicateur précoce de la présence de VWN dans une zone donnée, les
cas équins signifient que la transmission a eu lieu.
Figure 14: Voies de migration des oiseaux dans la région méditerranéenne
Voie de l‘Ouest
Voie de l‘Est
Foyers déclarés ches les humainsou les animaux du 1 août au 7 oct 2010
http://www.episouthnetwork.org/sites/default/files/outputs/note_west_nile_episouth_2010_2011_201
2__june2013.pdf
.
Les migrations d'oiseaux apparaissent être le mécanisme principal de dissémination. Les
oiseaux répandent le virus lorsqu'ils sont en état virémique ou lorsqu'ils servent d'hôtes à des tiques
infectées. Les migrations d'oiseaux, peuvent être aussi le mécanisme majeur de l‘introduction du
virus dans des zones tempérées où l'hiver est trop froid pour permettre la transmission du virus par les
moustiques d'une année sur l'autre. Des similarités antigéniques qui existent entre les souches de
VWN des pays d‘Afrique, et d‘Europe, peuvent être attribuées à la circulation du virus entre ces pays
par l'intermédiaire des oiseaux. De même que la souche isolée au Maroc en 1996 présente une grande
similitude génomique avec la souche isolée du Culex spp au Sénégal en 1993 (Fassi Fihri, M.M
2007). Toutefois l‘introduction du virus dans le nouveau monde en absence des voies migratoires
27
suggère qu‘il s‘agirait plus d‘une introduction liée aux activités commerciales qu‘à à la migration
d‘oiseaux.
4. Cycle de transmission
4.1. Cycle oiseaux-moustiques-oiseaux
Le virus est maintenu dans un cycle enzootique «oiseau-moustique-oiseau». Cependant il
existe des infections dites «cul de sac» ou accidentelles chez le cheval et l‘homme. Chez ces derniers
la virémie est insuffisante pour permettre par la suite l‘infection du moustique (Work et al., 1953,
Hurlbut, 1956; Hurlbut et al., 1956; Taylor et al., 1956).
D‘autres cycles de transmission ont été toutefois décrits impliquant certains amphibiens ou
reptiles comme hôtes amplificateurs (Kostyukov et al., 1985; Klenk et al., 2004).
L‘infection humaine résulte le plus souvent des piqûres de moustiques infectés mais le virus
peut aussi se transmettre par contact avec d‘autres animaux infectés, avec leur sang ou d‘autres tissus.
Une très faible proportion d‘infections humaines s‘est produite lors de transplantations d‘organes, de
transfusions sanguines ou de l‘allaitement au sein. On a signalé un cas de transmission
transplacentaire du VWN. Jusqu‘à présent, on n‘a signalé aucune transmission interhumaine du
VWN par les contacts de la vie courante, ni de transmission à des agents de santé en milieu médical
toutefois des cas de transmission du VWN à des personnels de laboratoire ont été signalés (OIE,
2013)
Figure 15: Cycle de transmission du VWN.
(Zientara et al. 2004)
C‘est souvent l‘apparition de cas cliniques chez les hôtes sensibles (hommes et/ou chevaux)
qui révèle la présence du VWN dans une région. Cette phase d‘émergence soulève différentes
questions sur l‘origine, la date de son introduction et la durée de sa circulation. Comme pour de
nombreux autres arbovirus (Lord & Calisher 1970, Hubalek 2004), il est considéré que le VWN est
28
véhiculé par les oiseaux, durant les migrations, à partir de régions où il circule de façon endémique
ou épidémique (Zeller & Murgue 2001, Malkinson & Banet 2002).
Cette phase d‘introduction est nécessaire si le virus n‘était pas présent auparavant dans la
zone considérée, mais n‘est pas suffisante pour expliquer l‘apparition concomitante de cas chez les
espèces sensibles. Une phase d‘amplification doit exister au préalable de la phase d‘émergence
(figure 16). Cette seconde phase repose sur un cycle primaire de transmission mettant principalement
en jeu des oiseaux et des moustiques ornithophiles. Elle est essentielle puisqu‘elle va permettre une
augmentation progressive du niveau de circulation virale (c‘est-à-dire une augmentation du nombre
de vecteurs et d‘hôtes infectés). Sa compréhension est complexe car elle dépend de nombreux
facteurs.
Figure 16: Phases d'introduction, d'amplification puis d'émérgence du VWN
(Jouradin E. 2006)
Le cycle biologique peut être divisé en deux étapes :
Un premier cycle moustiques-oiseaux, ces derniers permettant l'amplification de la
circulation virale.
Une seconde phase révélatrice de cette amplification et caractérisée par l'atteinte des hôtes
secondaires qui sont l'homme et les équidés principalement.
L‘amplification mettant en jeu des oiseaux et des moustiques ornithophiles necessite des
moustiques, des oiseaux compétents et des conditions favorables.
Le cycle primaire d‘amplification implique une succession d‘évènements, d‘une part pour que
les hôtes s‘infectent à partir des moustiques et, d‘autre part, pour que les moustiques s‘infectent à
partir des hôtes.
29
La réalisation de ces différentes étapes dépend de facteurs associés aux vecteurs (moustiques),
aux hôtes (oiseaux) et aux diverses interactions entre les hôtes et les vecteurs :
 Des moustiques compétents
La compétence vectorielle est l‘aptitude d‘un arthropode à être infecté par un pathogène, à
assurer son développement et à le transmettre efficacement à un nouvel hôte sensible (Rodhain et al.,
1985, Weaver et al., 2004). Elle est évaluée en laboratoire. Elle varie en fonction de divers facteurs,
intrinsèques et extrinsèques, comme par exemple la température (Dohm et al., 2002).

Des oiseaux compétents
Par analogie avec les vecteurs, la notion de compétence d‘hôte a été suggérée. Selon les
auteurs, elle est appelée host-competence (Reisen et al., 2003b, Komar et al., 2005, Reisen et al.,
2005, Kilpatrick et al., 2006) ou réservoir compétence (Ostfeld & Keesing 2000, Komar et al., 2003).
Elle correspond à la « capacité d‘une espèce hôte à être infectée et à présenter l‘âgent infectieux à des
vecteurs » (Komar et al., 1999).Tout comme la compétence vectorielle, la compétence d‘hôte est
évaluée au laboratoire : des vecteurs indemnes de l‘infection sont nourris sur des hôtes préalablement
infectés, soit artificiellement (par injection), soit naturellement (par un vecteur), et le pourcentage de
vecteurs infectés est ensuite évalué (Ostfeld & Keesing 2000). Un index de compétence Ci, indique
le nombre de vecteurs infectants obtenus à partir d‘un oiseau d‘une espèce donnée, a été proposé
(Komar et al., 2003). Il est calculé de la façon suivante :
Ci=s * i * d

s : sensibilité (proportion d‘oiseaux de cette espèce qui, chaque jour, devient infectés après
piqûre par des vecteurs infectés),

i : infectivité journalière moyenne (proportion de vecteurs exposés qui, chaque jour, deviennent
infectants après repas sanguin sur un oiseau infecté de l‘espèce considérée

d : durée d‘infectivité (nombre de jours pendant lesquels un oiseau infecté de cette espèce
présente une virémie infectieuse).
4.2.Autres voies d’amplification
Les cycles de transmission du virus n'impliquent pas les mêmes espèces réservoirs et les
mêmes vecteurs d'une région à l'autre ou d'un continent à l'autre. En effet, la transmission du virus
dépend de la population d'hôtes et des vecteurs potentiels, elle-même dépendante des conditions
climatiques et écologiques. Les réservoirs dépendent également de la spécificité trophique des
vecteurs (McLean, et al. 2002).
Ainsi d‘autres facteurs pourraient également jouer un rôle clé dans l‘amplification du VWN,
en particulier si celle-ci ne repose pas uniquement sur un cycle primaire oiseau-moustique-oiseau.
D‘autres mécanismes de transmission sont en effet suspectés : tels que la transmission non
vectorielle ; la transmission vectorielle non virémique , la transmission vectorielle chez des vertébrés
autres que des oiseaux et la transmission vectorielle par des arthropodes autres que des moustiques.
30
a. Transmission vectorielle non virémique
La possibilité pour le VWN d‘être transmis directement d‘un moustique à un autre, sans
passage par la circulation sanguine de l‘hôte, a été montrée expérimentalement sur un modèle souris
(Higgs et al. 2005). Ce mécanisme de transmission non systémique avait déjà été décrit pour les
tiques (Lawrie et al. 2004).
Chez les oiseaux, la transmission non virémique du VWN serait favorisée par le fait que les
moustiques se concentrent pour piquer leur hôte sur les parties du corps dénuées de plumes (contour
de l‘œil, base du bec, pattes). Quand la densité de moustiques est importante, l‘amplification du
VWN pourrait donc être accélérée, grâce à une augmentation du nombre de vecteurs infectés, même
si les hôtes présents sont de mauvais amplificateurs. Les oiseaux immunisés ou peu compétents et les
différents hôtes considérés jusqu‘à présent comme des culs-de-sac épidémiologiques pourraient donc
en réalité permettre passivement l‘amplification du VWN chez les vecteurs.
La possibilité d‘une transmission d‘oiseau à oiseau en l‘absence de moustiques a été
mise en évidence pour différentes espèces en conditions de laboratoire (McLean et al., 2001, Komar
et al., 2003). En conditions naturelles, cette transmission non vectorielle pourrait s‘avérer
particulièrement importante pour les espèces qui vivent en communauté (Banet-Noach et al., 2003,
Ward et al., 2005). Elle implique que le virus soit excrété par les individus infectés (fèces, salive,
sécrétions naso-pharyngées, fluides oculaires), qu‘il survive dans l‘environnement, et qu‘il infecte un
nouvel hôte par voie orale, respiratoire, muqueuse ou cutanée (Kuno, 2001).
La possibilité pour le VWN d‘être transmis directement d‘un moustique à un autre,
sans passage par la circulation sanguine de l‘hôte a été montrée expérimentalement sur un modèle
souris (Higgs et al., 2005). Ce mécanisme de transmission non systémique avait déjà été décrit pour
les tiques (Lawrie et al., 2004).
Le VWN a été mis en évidence à plusieurs reprises dans la cavité oro-pharyngée d‘oiseaux
infectés (Langevin et al., 2001, Komar et al., 2002, Komar et al., 2003). La présence du virus a aussi
été observée dans les fientes chez plusieurs espèces domestiques, notamment le poulet (Senne et al.,
2000, Kuno 2001, Langevin et al., 2001), la dinde (Swayne et al., 2000) et le canard (Fedrova et
Stavskiy 1972 cité par Kuno 2001). Chez les oiseaux sauvages, le VWN a été détecté sur des
écouvillons cloacaux de plusieurs espèces américaines infectées expérimentalement (Komar et al.,
2003, Weingartl et al. 2004) ou naturellement (Komar et al. 2002). Néanmoins, la survie du virus
dans les fientes serait limitée dans le temps : à température ambiante, la quantité de virus détectée
chuterait de 99% en 24 heures (Langevin et al., 2001).
Les modalités selon lesquelles la transmission d‘oiseau à oiseau se produit sont mal connues.
La possibilité d‘une infection suite à l‘inhalation d‘aérosols contaminés par le VWN a été démontrée
au laboratoire sur des singes, des souris et des hamsters (Kuno 2001). Chez les oiseaux, la production
d‘aérosols à partir de fientes contaminées pourrait être induite par les battements d‘ailes et entraîner
la contamination de congénères par voie respiratoire. Par ailleurs, les contacts sociaux entre individus
pourraient faciliter la mise en contact d‘un oiseau naïf avec des sécrétions ou excrétions contaminées.
Les poussins, en particulier, pourraient être infectés par leurs parents à l‘occasion du nourrissage par
régurgitation (Kuno 2001b).
31
La possibilité d‘une contamination par voie orale a été prouvée expérimentalement chez cinq
espèces d‘oiseaux sauvages par administration dans la cavité buccale d‘une solution virale ou d‘un
moustique infecté (Komar et al. 2003a). Cette voie d‘infection pourrait être particulièrement
importante pour les oiseaux de proie et les charognards qui se nourrissent d‘autres oiseaux. On peut
d‘ailleurs remarquer que le virus est fréquemment observé chez les rapaces (Anderson et al., 1999,
Garmendia et al., 2000, Gancz et al., 2005, Stout et al., 2005, Wunschmann et al. 2005, Bakonyi et et
al., 2006, Hull et al., 2006, Joyner et al., 2006). De même, chez les Corvidés, la transmission du virus
pourrait être accrue du fait de leur comportement charognard (Marra et al., 2004). Enfin, le VWN
pourrait aussi être transmis aux oiseaux par ingestion de moustiques ou d‘autres arthropodes infectés.
Cette situation est envisageable pour des espèces insectivores mais aussi pour d‘autres espèces, par
exemple lors du comportement de défense vis-à-vis des moustiques ou de l‘entretien mutuel du
plumage.
b. Hôtes amplificateurs autres que les oiseaux
La présence d‘anticorps vis-à-vis du VWN a été rapportée chez de nombreux mammifères
domestiques ou sauvages (Hubalek & Halouzka 1999, McLean et al., 2002).
Il est classiquement admis que les mammifères n‘interviennent pas en tant que source de virus
pour les moustiques (Hayes et al., 2005). En revanche, les isolements sont rares (Taylor et al., 1956,
Berezin 1971, Hubalek & Halouzka 1999). Les infections expérimentales sur différentes espèces ont
montré que la virémie développée après inoculation du virus est en général faible chez les
mammifères (Taylor et al., 1956, Schmidt & El Mansoury 1963, Chippaux et al., 1970, Joubert et al.
1971, Oudar et al. 1971, Bunning et al. 2002, McLean et al.. 2002, Austgen et al.. 2004, Teehee et
al.2005). Ceux-ci sont donc considérés comme moins importants que les oiseaux dans le maintien du
cycle de transmission du VWN (Hubalek & Halouzka 1999).
Les équidés sont les mammifères les plus sensibles à l‘infection par le VWN, avec de
véritables épizooties d‘encéphalite et une letalité d‘ennviron 40% (Ostlund et al., 2001 ; Dauphin et
al., 2004). Chez le cheval, le niveau de virémie a été déterminé comme inférieur à 103 particules
virales/ml et est trop faible pour permettre l'infection des vecteurs (Bunning et al., 2002).
Les premières infections expérimentales d‘equidés leur attribue une virémie insuffisante pour
infecter les moustiques (Taylor et al., 1956, Schmidt & El Mansouri, 1963).
Plus récemment la virémie obtenue chez des chevaux innoculés s‘est avéré inférieure à 102,7
PFU/ml est donc insuffisante pour infecter Ae. albobictus (Bunning et al., 2002). Néanmoins toutes
ces expériences ont été réalisées avec des chevaux adultes. En France des infections expérimentales
ont été menées avec des équidés de differents âges (Guillon et al. ; 1968 ; Lapras et al., 1968 ; Oudar
et al.,1971). Ces auteurs décrivent que la virémie des poulains est plus elevée que les adultes en
particulier les poulains en mauvais état général (à cause du parasitisme par exemple) (Joubert et et
al.,1971).
Ces auteurs considèrent que la virémie des poulains est suffisante pour infecter des vecteurs.
Cet effet de l‘âge a été mis en évidence pour d‘autres espèces telles que le poulet, la souris ou le porc.
Les animaux développent une virémie d‘autant plus intense qu‘ils sont jeunes (Hurlbut, 1956 ; Taylor
32
et al., 1956 ; Teehee et al., 2005). Les poulains pouvaient alors de source du virus. Ce phenomène ne
doit pas être quanitativement important si ce n‘est lors des épizooties intenses.
La plupart des espèces mammifères infectées expérimentalement developpent des virémies de
courte durée et de faible intensité: (Van Der Meulen et al., 2005).
Le macaque rhesus (Ratterree et al., 2004) ; le mouton (Taylor et al., 1956 ; Oudar et al.,
1972) ; le chien et le porc adulte (Oudar et al.,1972 ; Teehee et al.,2005).
Néanmoins pour certain la virémie semble suffisante pour l‘infection du moustique, comme
le chat, chez qui la virémie dure 3 à 5 jours (Austgen et al., 2004). Les lémuriens (lemur fulvis)
présentent quant à eux des virémies pendant 5 à 6 jours qui permettent d‘infecter à maintes reprises
des femelles d‘Ae. aegypti (Rhodin et al., 1985). Pour les petits mammifères la situation semble
differente puisque me transmission entre moustiques et hamster sont possibles en condition de
laboratoire (Philipe et Smadel et al., 1943 ; Davis et Yoshpe-Purer 1954 ; Vermeil et al., 1960) et que
le lapin à queue blanche (Sylvilagus floridanus) présente une virémie suffisante pour infecter Cx.
pipiens, Cx. salinarus, Ae. albopictus et Ae. aegypti (Tiawsirisup et al., 2005). Ainsi le rôle de la
plupart des mammifères en tant que source du VWN pour le vecteur est sans doute minime avec des
exceptions. C‘est pourquoi le rôle des mammifères ne devrait pas être a priori négligé de l‘étude du
cycle de transmission.
L'apparition de cas chez l'homme et le cheval est liée à une circulation importante du
virus dans l'avifaune, via des vecteurs ornithophiles et mammophiles, capables de s'infecter à partir
d'oiseaux virémiques et de piquer ultérieurement un hôte sensible (Zientara et Lecollinet, 2010).
Le cheval ou l‘homme constituent ainsi des hôtes sans issue, des culs-de-sac
épidémiologiques (Zientara, 2002). Cependant, en termes de santé publique, les chevaux, par leur
sensibilité au VWN, peuvent servir de sentinelles du niveau d‘amplification du virus. Ils sont
considérés à juste titre comme des révélateurs épidémiologiques de la circulation du virus et peuvent
permettre de prévenir les autorités sanitaires vétérinaires et médicales de l‘imminence possible du
passage du virus à l‘homme.
Enfin, la circulation du VWN a aussi été montrée chez les reptiles et les amphibiens (Berezin
1971, Nir et al. 1972). Les investigations menées jusqu‘à présent ont montré qu‘une virémie
suffisante pour infecter des moustiques vecteurs est observée chez certaines espèces mais pas chez
d‘autres (McLean et al. 2002, Klenk & Komar 2003, Klenk et al. 2004). Certains reptiles et
amphibiens pourraient donc aussi avoir un rôle significatif dans l‘amplification du VWN.
c. Transmission par des vecteurs autres que les moustiques
Le VWN a été détecté chez des Cératopogonidés (Sabio et al. 2006) et chez divers
ectoparasites des oiseaux : Hippoboscidés (Farajollahi et al,. 2005b, Gancz et al, 2005), tiques dures
(Hubalek & Halouzka 1999, Murgue et al, 2002, Lvov et al, 2004), tiques molles (Hubalek &
Halouzka 1999, Murgue et al, 2002, Lvov et al, 2004, Mumcuoglu et al, 2005) et autres acariens
nidicoles (Mumcuoglu et al, 2005, Valiente Moro et al., 2005). Les tiques, en particulier, sont
considérées comme des vecteurs potentiels (Hayes 1989, Lvov et al.,. 2004, Mumcuoglu et al, 2005).
33
La présence du virus chez ces ectoparasites hématophages ne permet cependant pas de
conclure qu‘ils sont des vecteurs de l‘infection. Pour arriver à cette conclusion, il est nécessaire de
démontrer expérimentalement que l‘arthropode est un vecteur compétent, c‘està-dire qu‘il est capable
de se contaminer à partir d‘un oiseau puis de transmettre le virus à un autre oiseau (Rodhain et Perez
1985, Eldridge 2000).
De plus, pour pouvoir affirmer que le parasite joue réellement un rôle important dans
l‘amplification virale, il faut démontrer :
1. Que des membres de la population de parasites se nourrissent fréquemment sur les
oiseaux en conditions naturelles ;
2. Qu‘il existe une association biologique dans le temps et dans l‘espace entre le virus et
la présence de l‘infection chez les oiseaux
3. Que les parasites collectés en conditions naturelles sont fréquemment porteurs du virus
(Eldridge 2000).
En pratique, seule la compétence vectorielle de certaines tiques molles a été démontrée
(Hurlbut 1956, Abbassy et al. 1993, Anderson et al. 2003, Lawrie et al. 2004, Hutcheson et al. 2005).
En revanche, la présence du virus dans les ectoparasites laisse supposer qu‘il existe un risque de
contamination des oiseaux par voie orale si les parasites infectés sont ingérés, par exemple lorsque
les oiseaux se lissent les plumes (Anderson et al. 2003, Komar et al. 2003a, Marra et al. 2004).
Hyalomma marginatum detritum
Rhipicephalus turanicus
Hyalomma dromedarii
Amblyomma variegatum,
Dermacentor marginatus
Ornithodoros sp.
Figure 17 : Quelques espèces de tiques impliquées dans la transmission du VWN
(Souce : http://www.nhc.ed.ac.uk/index.php?page=24.25.119)
34
Au cours des infections experimentales chez les Ixodidae, ces derniers se sont révélées
incapables de transmettre le VWN, Après inoculation, les tiques dures sont moins aptes que les
moustiques à amplifier le VWN (Hulbrut 1956). Le taux d‘infection de larves, nymphes ou adultes,
fixés sur des animaux virémiques est faible (10 à 40%) pour Dermacentor variabilis (Say), Ixodes
scapularis (Say), Dermacentor andersono (Stiles) et Amblyomma americanum (Linnaeus) (Whitman
et Aitken 1960 ; Anderson et al., 2003) ou nul pour Ixodes ricinus (Linnaeus)(Lawrie et al., 2004).
Pour les individus infectés, le virus peut être maintenu par transmission trans-stadiale jusqu'à
l‘adulte, mais n‘est pas transmis à la descendence (Whitman et Aitken 1960 ; Anderson et al., 2003).
Aussi , les tiques dures ne semblent-elles jouer aucun rôle dans la transmission. La situation est
differente pour les Argasidae. Certaines espèces sont réfractaires à l‘infection et se montrent
incapables de transmettre le VWN : Ornithodoros savignyi (Audoin), Argas persicus (Oken) et
A.hermanni (Hulbut 1956 ; Abbassy et al, ,1993). Au contraire, d‘autres s‘infectent sur animaux
virémiques (taux inférieur à 50%) et sont capables de transmettre le virus à plusieurs centaines de
jours après l‘exposition, par exemple après 10 mois pour Carios coniceps (Canestrini) ; 45 jours
Ornithodoros moubata (Murray)(Whitman et Aitken 1960; Lawrie et al, ,2004),418 jours pour Argas
reflexus (Fabricius) (Hannoun et Rau, 1970), 20 jours pour Argas arboreus Kaiser , Hoogstraal et
Kohls (Abassy et al, , 1993) et 35 jours pour Carios carpensis (Neumann)(Hutcheson et al, ;2005).
La conservation du VWN dans les tiques molles est imparfaite ; en effet le titre viral ou le nombre
d‘individus infectés décroît avec le temps (Whiteman et Aitken 1960 ; Hutcheson et al. 2005). Une
transmission verticale n‘est mise en évidence que chez A.arboreus (Abbassy et al., 1993). La
transmission est souvent mise en évidence par le biais d‘une infestation massive (Whiteman et
Aitken, 1960), sauf chez certaines espèces telque :C. coniceps ou A. reflexus (Vermeil et al.,1960,
Hannoun et Rau, 1970)
5. Ecologie de la FWN
L‘épidémiologie de la FWN est liée aux facteurs environnementaux qui conditionnent le
maintien du cycle de transmission de la maladie :
5.1.
Ecologie générale:
a. La température
Il existe une échelle de températures « permissives » pour le fonctionnement du
système vecteur/virus, et une fourchette plus fine pour laquelle le virus est transmis plus
efficacement. Une augmentation de la température entraîne un métabolisme plus important et un taux
de survie journalier plus grand du vecteur (Mellor et Leake, 2000), un raccourcissement de la durée
de vie des stades pré imaginaux, une augmentation du nombre de repas de sang et de pontes, ainsi
qu‘une diminution de la durée du cycle extrinsèque de l‘âgent pathogène (temps de développement à
l‘intérieur du moustique) (Rodhain et al., 2003). La recherche de l‘hôte par les femelles est reliée à
une certaine température au crépuscule. Lorsque cette température diminue, l‘activité des femelles
diminue (Ponçon, 2003).Turell (1989) a montré expérimentalement l‘importance de la température
sur la capacité vectorielle d‘Aedes fowleri (présent au Sénégal) pour le virus FVR, les conditions
35
optimales de transmission du virus étant obtenues aux plus hautes températures testées. Par contre, la
température ne paraît pas avoir d‘influence sur le taux d‘infection d‘Aedes fowleri par le même virus.
Plus tard, il a montré qu‘au contraire le taux d‘infection des femelles adultes Culex
pipiens d‘origine égyptienne par le virus de la FVR augmentait de manière significative avec la
température (Brubaker et Turell, 1998). Les œufs d‘Aedes qui n‘éclosent pas subissent un
phénomène de diapause induit par des conditions particulières, essentiellement une baisse des
températures (Horsfall, 1956). (MacHaffey, 1972) a étudié plus précisément les facteurs influençant
le pourcentage d‘entrée en diapause d‘œufs d‘Aedes vexans dans l‘état de Washington (USA). Il a
montré qu‘à 32°C, la photopériode n‘a pas d‘influence sur l‘entrée en diapause des œufs, alors qu‘à
25°C, le pourcentage d‘entrée en diapause augmente si la photopériode diminue. Il a également
observé que des températures basses entraînaient une augmentation de ce pourcentage. L‘éclosion
des œufs en diapause est favorisée par une diminution soudaine des températures, comme cela se
passe souvent lors d‘une pluie (Horsfall, 1956; Mondet, 1999).
b. Photopériode
Nous venons de voir son influence sur le pourcentage d‘entrée en diapause des œufs
d‘Aedes. Chez quelques espèces anautogènes (espèces de moustiques où les femelles nécessitent un
repas de sang pour la formation des œufs), comme les souches hématophages de Culex pipiens
pipiens, l‘exposition à certaines photopériodes conduit les femelles moustiques à entrer en diapause,
et stoppe du même coup leur développement ovarien (Clements, 1992).
c. Pluviométrie
Elle conditionne la présence, la taille et la persistance des gîtes de ponte et des gîtes
larvaires (Mellors et Leake, 2000). Les œufs d‘Aedes embryonnés en diapause sont connus pour
nécessiter plusieurs séries d‘hydratation et de déshydratation pour pouvoir éclore après une longue
période d‘assèchement, et particulièrement Aedes vexans (Mondet et al., 2004). Le stimulus
d‘éclosion des œufs le plus efficace est la désoxygénation de l‘eau de pluie qui se réalise au moment
où celle-ci entre en contact avec le sol (Mondet, 1999).
d. L’humidité
A une haute température, une forte humidité tend à augmenter le taux de survie et la capacité
de dispersion active (Mondet, 1999) du vecteur mais elle favorise aussi le développement de
bactéries ou de champignons pathogènes pour celui-ci. Une faible humidité, au contraire, diminue le
taux de survie du vecteur mais peut entraîner une augmentation du nombre de prises de repas de sang
dans certains cas (Mellors et Leake, 2000).
e. Le vent
Le vent peut transporter les moustiques infectés sur de grandes distances, et être à l'origine
d'une propagation à large échelle. Le vent ne se propage pas de la même façon au dessus des
continents. La topographie modifie la vitesse et la direction du vent. Le relief ne permet pas au vent
de se propager de façon continue, mais plutôt par « saut ». Les montagnes semblent être responsables
d'une limitation de la propagation de la maladie (Mondet, 1999).
A 3 000 mètres d'altitude, soit à une pression de 700 hPa, la température est d'environ 2°C et
l'humidité relative se situe entre 48 et 70%. Ces conditions ne permettent pas aux moucherons
36
Culicoïdes d'être transportés par le vent à une telle altitude. En revanche les conditions de
température et d'humidité deviennent favorables pour des altitudes inférieures à 2 000 mètres, c'est-àdire 15-27°C et 65-80% d'humidité.
f. Les ressources trophiques
La présence de nourriture conditionne la présence des adultes. La nécessité pour les femelles
hématophages de trouver un hôte entraîne leur dispersion active à partir de leur gîte d‘origine. Cette
dispersion active sera plus ou moins importante suivant la facilité avec laquelle la femelle va trouver
son hôte. Chaque espèce présente ses préférences trophiques. Ainsi, Aedes vexansse se nourrit
préférentiellement sur les gros mammifères : bovins, moutons, chevaux, ainsi que sur l‘homme et,
dans une moindre mesure, sur les poulets (Fontenille, 1989).
La distance parcourue dépend également de l‘âge des femelles et de l‘accès à de la nourriture
sucrée, source d‘énergie. Pour des femelles Aedes vexans à la recherche d‘un hôte, des distances
parcourues de 15 kilomètres en une nuit ont été rapportées (Ponçon, 2003).
g. La végétation
Le cycle de développement des moustiques du genre Mansonia nécessite la présence de
végétation aquatique. En effet, leurs larves vivent fixées par leur siphon respiratoire aux tiges et
racines des plantes aquatiques. Elles y prélèvent l‘air nécessaire à leur respiration au niveau des
vaisseaux aérifères (Ponçon, 2003).
Le développement des Culex pipiens semble être favorisé lorsque leur gîte larvaire se situait
dans des biotopes riches en feuilles mortes, qui forment une litière riche en matières organiques
(Wynn et Paradise, 2001). En effet, un tel milieu favorise la multiplication de bactéries qui, avec les
particules organiques constituent l‘alimentation des larves. Une augmentation de la biomasse
végétale favorisera une augmentation de la taille des larves, puis des adultes, entraînant une meilleure
fécondité des femelles, ainsi qu‘une augmentation du taux de survie des mâles et des femelles. Une
augmentation de l‘apport organique favorise aussi une diminution du temps de développement
larvaire et une augmentation du nombre de moustiques adultes.
h. Interaction vecteur-hôtes
Un cycle d‘amplification ne peut exister que si les hôtes et les vecteurs partagent, à une même
période, la même niche écologique. Leur probabilité de rencontre dépend de leur répartition
réciproque dans l‘espace et dans le temps, à l‘échelle de la saison mais aussi celle du nycthémère.
Komar (2000) a répertorié les espèces d'oiseaux et de moustiques qui peuvent intervenir dans le cycle
du VWN en fonction de différentes régions du globe où il circule (Tableau 3.)
37
Tableau 3: Réservoirs et vecteurs possibles dans diverses régions du globe
Localisation
Europe
Espèces d’oiseaux
réservoirs
Moineau domestique
Afrique
Moineau domestique
Corbeau
Autres oiseaux
Moyen Orient
Afrique du Sud
Tourtelle
Autres oiseaux
Oiseaux
Océanie
Amérique du Nord
Hérons Autres oiseaux
Moineau domestique
Espèces de moustique vecteurs
Cx.pipiens
Cx.modestus
Coquillettidia richardii
Cx. univittatus
Cx.poilicilpes
C. antennatus
Cx decens
Aedes albocephalus
Mimomyia sp.
Cx. univittatus
Cx. vishnui
Cx. quinquefasciatus
Coquillettidia richardii
Coquillettidia annulirostris
Cx. pipiens
Pour les oiseaux diurnes, la période principale d‘exposition aux piqûres de moustiques est la
nuit, quand ils sont inactifs et immobiles. Or, c‘est justement à la tombée du jour et pendant la nuit
que la plupart des moustiques ornithophiles partent en quête d‘hôte et prennent leur repas de sang
(Scott & Edman 1991). A l‘échelle de la saison, on peut s‘attendre à ce que les interactions entre
oiseaux et vecteurs soient différentes selon que le pic d‘abondance de ces derniers survient pendant la
migration de printemps (nombreux oiseaux de passage), la nidification (nombreux poussins
immobiles et sans plumage protecteur), ou la migration d‘automne (nombreux jeunes de l‘année et
oiseaux de passage).
La rencontre entre les oiseaux et les moustiques est conditionnée par leur répartition dans
l‘espace, y compris verticale. En effet, pour certains vecteurs, les individus en quête d‘hôte sont plus
abondants au niveau de la canopée qu‘au niveau du sol (Stamm 1966, Chunikhin 1973, Anderson et
al., 2004, Deegan et al., 2005, Russell & Hunter 2005, Balenghien et al., 2006, Darbro & Harrington
2006). En fonction de la hauteur à laquelle ils se trouvent pendant la nuit, les oiseaux seront plus ou
moins exposés à ces moustiques. En général, le critère utilisé pour évaluer cette exposition est la
hauteur des nids (Emord & Morris 1984).
En fonction des espèces, les moustiques sont attirés par une gamme d‘hôtes plus ou moins
large. Les moustiques ornithophiles choisissent en général un oiseau pour effectuer leur repas
sanguin mais ils peuvent également piquer d‘autres vertébrés (Chunikhin 1973).
Le tropisme des moustiques dépend de différents facteurs relatifs à l‘hôte (odeur, émission de
CO2, chaleur, mobilité, forme) et à l‘environnement extérieur (température, humidité) (Chunikhin
1973, Scott & Edman 1991, Russell & Hunter 2005). L‘attractivité d‘un individu dépend de son
38
espèce et de son âge. Chez le Moineau domestique Passer domesticus par exemple, il a été montré
que les jeunes poussins au nid exercent une attraction chimique beaucoup plus faible que les
moineaux adultes (Scott et al. , 1990, Scott & Edman 1991).
i. Densité et diversité des vecteurs
La densité de population des arthropodes joue un rôle significatif dans la transmission. En
effet, même s‘il est un très bon vecteur, un moustique rare ne jouera aucun rôle épidémiologique.
Inversement, un moustique dont la compétence vectorielle est modérée, mais qui est très abondant,
pourra jouer un rôle majeur dans la transmission d‘un arbovirus. Il existe donc, pour les vecteurs, une
densité critique en dessous de laquelle la transmission ne peut avoir lieu (Rodhain & Perez 1985).
Toutefois, quand la densité augmente fortement, une modification des relations vecteurs–
oiseaux peut être observée. Des investigations en laboratoire ont montré que l‘augmentation de la
densité de moustiques entraîne une augmentation significative du comportement de défense des
oiseaux (Edman et al. 1972, Scott & Edman 1991). Il en résulte que, pour un moustique donné, la
probabilité de succès de repas sanguin sur un oiseau est plus faible quand la densité de moustiques
augmente. Les moustiques pourraient alors être amenés à se tourner vers d‘autres hôtes vertébrés, par
exemple les mammifères. Ainsi, il a été montré que, quand la densité de certains moustiques
ornithophiles est très élevée, la proportion de repas sanguins effectués sur mammifères augmente
significativement (Edman & Taylor 1968, Nelson et al. 1976).
En outre, dans un environnement donné, la présence simultanée de vecteurs n‘ayant pas les
mêmes caractéristiques (compétence vectorielle, préférences écologiques, préférences trophiques,
longévité, dynamique saisonnière) complique très probablement la circulation du virus au sein de la
population d‘oiseaux. En Camargue, par exemple, le rôle relatif des deux principales espèces de
moustiques ornithophiles (Cx. pipiens et Cx. modestus) dans l‘amplification du VWN reste à évaluer.
j.
Densité et diversité des oiseaux
La dynamique de transmission du VWN au sein d‘une population d‘oiseaux est corrélée de
façon complexe à la taille de cette population, la nature des espèces présentes et l‘abondance relative
de chaque espèce.
Par exemple, si une augmentation de la densité d‘oiseaux concerne des espèces fortement
compétentes, la transmission du virus au sein de la population de vecteurs est favorisée. Cela
correspond à la situation épidémiologique observée en Californie où le niveau d‘infection des
populations de vecteurs par le VWN est particulièrement élevé dans les zones à forte densité de
Corvidés (Reisen et al., 2006a). Ceux-ci ayant une mortalité élevée associée au VWN (Yaremych et
al. 2004b), ils ne peuvent en effet intervenir de façon significative dans la transmission que s‘ils ont
une population de grande taille (Dobson & Foufopoulos 2001). De la même façon, une augmentation
de la diversité des oiseaux qui a pour conséquence de rassembler des hôtes ayant un rôle
complémentaire dans la circulation du virus (par exemple, des individus réservoirs ou introducteurs
et d‘autres très bons amplificateurs) favorise l‘amplification (Dobson & Foufopoulos 2001).
Inversement, si l‘augmentation de densité ou de diversité concerne des oiseaux peu ou pas
amplificateurs, elle entraîne un effet de dilution du virus (Schmidt & Ostfeld 2000, Dobson &
Foufopoulos 2001),
39
5.2. Ecologie de la FWN au Maroc
a. Le biotope
Le biotope le plus favorable pour les épidémies de la FWN comprend des zones marécageuses
lieux de passage et de résidence d‘oiseaux migrateurs et niches larvaires d‘arthropodes vecteurs.Dans
le bassin méditerranéen cette situation se rencontre à titre d‘exemple dans le delta du Nile, le delta du
Danube, le delta du Rhône ou le delta de Guadalquivir en Andalousie. Le Maroc possède des zones
humides naturelles ou artificielles connues pour leur grande diversité et leur originalité, qui se traduit
par la présence d‗un grand nombre de sites d‘importance internationale et qui font l‘objet d‘efforts de
conservation par la convention RAMSAR
Le Maroc est caractérisé par la présence de plusieurs chaines de montagnes, qui culminent à
2000-4000 m d'altitude et supportent un réseau hydrographique dense et bien arrosé et une grande
diversité des habitats littoraux développés sur une cote de 3500 kilomètres, donnant lieu à plusieurs
lagunes et à des dizaines d‗embouchures de rivières, qui témoignent également de diverses
empreintes du régime climatique méditerranéen
En outre, il existe des systèmes oasiens relativement étendus et artificialisés, notamment le
long des grands oueds présahariens et d‘innombrables zones humides artificielles, dont certaines
remontent à des millénaires mais qui sont dominés actuellement par les lacs de barrages; ces derniers
ayant acquis une grande importance pour les oiseaux d‗eau
A cela s‘ajoute, au niveau des habitats de montagne (sources, cours d'eau et lacs), des réseaux
de sites relais nécessaires à la migration et/ou l‗hivernage de millions d'oiseaux d‗eau de la région
paléarctique. (Dakki et al., 2011)
La zone de l‘épizootie marocaine, le Gharb, est une plaine parcourue par plusieurs rivières
(Oued Loukkos, O. Sebou et O.Bourgreg) avec lagunes (Merja Zerga notamment) ; un important
réseau d‘irrigation et de nombreuses dayats (étangs) en saison des pluies. C‘est une plaine à climat
maritime humide avec des précipitations automnales et hivernales abondantes. La pluviométrie d‘une
année normale varie entre 370 mm et 578 mm. La température maximale journalière en été est de
30°C. En hiver la température minimale journalière est de 5°C. Cette plaine offre des conditions
propices pour le séjour des oiseaux migrateurs dans la direction SudNordSud et
EstOuestEst au printemps et à la fin de l‘été-début automne. Ces périodes correspondent
justement aux périodes d‘éclosion des épizooties de 1996, 2003 et 2010. Cette plaine constitue un site
privilégié d‘étude de la FWN (Fassi-Fihri; M.M, 2007).
40
Figure 18 : Localisation des zones humides d'importance internationale du Maroc
(Dakki et al., 2011)
b. Les vecteurs
Au Maroc, 42 espèces de moustiques appartennant à la sous famille des Anophelinae et à la
sous famille de Culcinae ont été répertoriées. Elles sont issues des genres: Anopheles, Aedes,
Coquillettidia, Culex, Culiseta, Ochlerotatus, Orthopodomyia et Uranotaenia (Trari et al., 2002)
(Tableau 6).
41
Tableau 4: Les espèces de moustiques rencontrés au Maroc
(Trari et al., 2002).
Sous famille
des Anophelinae
Sous famille
des Culcinae
1. Anopheles algeriensis
10. Aedes vexans
26. Culiseta longiareolata
2. An.claviger
11. Ae. Aegypti
27. Cs fumipennis
3. An.marteri
12. Coquillettidia buxtoni
28. Cs.litorea
4. An. labranchiae
13. Cq. Richardii
29. Cx.annulata
5. An. Ziemanni
14. Culex modestus
30. Cx suboehrea
6. An. d’bali
15. Cx. Brumpti
31. Ochlerotatus echinus
7. An. sergenti
16. Cx lateinetus
32. Oc. Geniculatus
8. An. Cinereus
17. Cx mauritanieus
33. Oc. berlandi
9. An. Multicolor
18. Cx mimetius
34. Oc. caspius
19. Cx perexiguus
35. 35- Oc. coluzzii
20. Cx pipiens
36. Oc. Detritus
21. Cx theleri
37. Oc. mariae
22. Cx deserticola
38. Oc. pulcritarsis
23. Cx hortensis
39. Oc. rusticus
24. Cx.Impudieus
40. Orthopodomyia
25. Cx. Martinii
pulchripalpis
41. Uranotaenia unguiculata
42. Ur. balfouri
Ces espèces de moustiques n‘ont pas la même distribution au Maroc, ainsi Cx .pipiens ,Cx
theileri et Cx.perexiguus semblent être endemiques alors que Cx modestus et Coquilletidia richiardii
semblent confinées au Nord-Ouest. (Brunhes et al., 2003)
Des captures dans la région de Larache en 2006, ont montré que 3 espèces prédominent dans
la région, Cx. theileri (48%), Anopheles labranchiae avec 27% et Coquillettidia richiardii 18%
(Iraqui, H.H, 2006).
42
>4000m
3000-4000m
2000-3000m
1500-2000 m
1000-1500m
600-1000m
200-600m
0-100
<0
Ocean
Point de capture
Figure 19: Distribution au Maroc de quelques espèces de moustiques :
Cx. modestus, Cx perexiguus, Cx.pipiens, Cx. theileri et Coquilletidia richiardii
(Brunhes et al., 2003)
43
c. Les hôtes
L‘avifaune du Maroc comprend 309 espèces migratrices, dont 80 espèces aquatiques (FassiFihri M.M, 2007). elles appartiennent aux familles des Podocipédidés, Phalacrocoracias, Ardéidés,
Phœnicoptéridés, Anatidés, Accipitridés, Falconidés, Rallidés, Récurvirostridés, Charadriidés,
Scolopacidés, Laridés, Sternidés, Alaudidés, Motacillides, Turdidés, Sylviidés, Corvidés,, Sturnidés,
et Emberizidés. (Annexe N° 1) (Dakki et al, 2001).
Parmi ces espèces certaines sont révélées réceptives lors des épizooties américaines, dans les
conditions naturelles et leur réceptivité se traduit par de la morbidité et de la mortalité. Par exemple :
-
La corneille de rivage (Corvus corone sandonius) ;
L corneille d‘Amérique (Corvus brachyrhyncos) ;
Le moineau domestique (Passer domesticus) ;
Le pigeon biset (Columbia livia) ;
Le geai bleu (Cyanocitta cristata) ;
La mouette artricille (Larus atricilla) ;
Le merle migrateur (Turdus migratorius) ;
Le colvert (Anas platyrhyncos) ;
La cigogne blanche (Ciconia ciconia) ;
La tourterelle (Streptopellia senegalensis) ;
Le faucon crécelle (Falco tinnuculus) ;
Le héron bihoreau (Bulbulus Ibis) ;
Parmi ces espèces certaines sont rencontrées au Maroc et parmi les oiseaux migrateurs du
Maroc, réservoirs potentiels du virus, on peut citer :
-
Les hirondelles (Hirondo rustica ; h. riparia ; h. rupestris ; h. dauricarufula)
Les pluviers (Charaddrius apricarius, c. squatarola, c. morinellus)
Les hérons (Ardea cinerea, A. purpurea)
Les mouettes (Streptopelia turtur)
Les canards (Anas platyrhyncos, A.clypeata, A.penelope)
Même s‘il existe des variations interannuelles des effectifs des oiseaux, les plus grandes
concentrations des oiseaux du Maroc se trouvent au Nord-Ouest (48%) et au Sud (16%) (Dakki, et
al., 2001)
44
Tableau 5 : Variation interannuelle des effectifs d‘oiseaux d‘eau recensés dans les cinq régions
marocaines pendant la période 1996-2000 (Dakki, et al., 2001)
NOM DE LA REGION
Nord-Ouest
1996
1997
1998
1999
2000
120722 263845 211965 227097 285350
MOYENNE
%
238770
48
Nord-Est
566
53511
35288
36812
34639
40481
8
Centre Atlantique
47470
52882
66587
62782
43111
80502
16
Moyen et Haut Atlas
298
6203
14073
7078
5449
8636
2
Sud
84677
113935
36879
111573 101872
127272
26
253733 490376 364792 445342 470421
495661
100
Total Maroc
V.
Diagnostic :
Le diagnostic de l‘infection par le VWN se base sur l‘examen épidémio-clinique et des tests
de laboratoire qui mettent en évidence une réaction immunitaire consécutive à l‘exposition aux
antigènes viraux.
1. Diagnostic épidémio-clinique :
Toute affection nerveuse avec ou sans hyperthermie survenant chez un équidé séjournant ou
ayant séjourné dans les trois semaines précédentes dans une zone à risque et exposée à des piqures de
moustiques doit provoquer une suspicion de FWN.
Cette maladie s‘intègre à la fois dans les arboviroses à syndrome pseudo grippal, que dans
celles à tropisme viscéral ou neurologique (encéphalites et encéphalomyélites). Cela montre que la
FWN se caractérise par l‘absence des signes spécifiques, ce qui complique d‘autant le diagnostic, en
dehors de la notion de localisation géographique, sachant que d‘autres maladies non virales, ou dues
à des virus n‘appartenant pas au groupe des arbovirus, associent le même tableau clinque, ainsi dans
certains cas nous pouvons seulement observer un état fébrile isolé, qui sera assez rapidement résolutif
(Peiris et al., 1994).
Des études précédentes sur le diagnostic clinique de FWN ont révélé que la maladie évolue,
en général chez l‘homme et le cheval, suivant deux phases qui retracent l‘évolution pathogénique.
Dans un premier temps, le virus se multiplie dans le sang avec de l‘hyperthermie, l‘anémie, la
leucopénie consécutive sans doute à l‘atteinte médullaire. Dans un deuxième temps, la localisation du
virus est encéphalique, puis myélitique. Le virus sera donc isolable tout d‘abord à partir du sang, puis
à partir du système nerveux des malades.
45
2. Diagnostic biologique:
2.1. Diagnostic direct
a. Isolement du virus :
Le VWN peut être isolé à partir de divers prélèvements et sur plusieurs types de cellules, il
peut être isolé à partir de plusieurs espèces de moustiques, de chauve-souris, d‘oiseaux, chez les
équidés et chez l‘homme.
Cependant, les tentatives visant à détecter le virus de chevaux vivants, cliniquement malades
ne sont pas généralement couronnées de succès en raison de la virémie passagère.
Les échantillons destinés à l'isolement du virus comprennent le cerveau (en particulier le
cerveau postérieur) et la moelle épinière de chevaux encéphalitiques décédés (Ostlund et al., 2001),
une variété de tissus d'oiseaux y compris le cerveau, le cœur ou le foie peut être utilisé avec succès
(Steele et al., 2000). Le VWN peut également être isolé à partir de moustiques. En général, les isolats
de virus sont obtenus plus facilement à partir d'échantillons aviaires et dans une moindre mesure à
partir de moustiques et chevaux.
Le virus peut être propagé dans des cultures cellulaires sensibles, tels que le rein de lapin
(RK-13), les cellules rénales du singe vert d'Afrique (Vero), ou de cellules rénales de porc.
L'isolement primaire dans des œufs de poule embryonnés ou des lignées de cellules d‘Aedes
albopictus (C6/36) suivi de passages dans des cellules de mammifères (notamment la souris) peut
également être utilisé. Le passage sur culture cellulaire permet d'observer l'effet cytopathique (ECP).
La mise en évidence des isolats du VWN est réalisée par coloration fluorescente indirecte des
anticorps de cultures infectées ou par les méthodes de détection des acides nucléiques.
b. Identification du virus:
Une fois le virus isolé et amplifié par culture cellulaire ou chez le souriceau nouveau-né, il
peut être identifié par des méthodes de neutralisation du virus (en utilisant des sérums spécifiques),
par technique ELISA ou encore par détection de séquences d‘ARN spécifique au VWN (Komar,
2000). L‘identification nécessite l‘analyse du génome du virus isolé et responsable d‘une épidémie
d‘encéphalite car les méthodes sérologiques ne sont pas suffisantes. Cette analyse génétique est
réalisée grâce à l‘amplification par RT-PCR d‘un fragment du gène codant pour la protéine prE de
l‘enveloppe et grâce à l‘étude comparative de cette séquence avec plus de quarante souches virales de
VWN aujourd‘hui répertoriées.
c. Diagnostic moléculaire par RT-PCR :
Les méthodes de diagnostic direct pour la détection des acides nucléiques utilisent la PCR
(Polymérase Chain réaction). Plusieurs variantes de PCR ont été décrites pour l'identification du
VWN et certaines sont disponibles sous forme des kits commerciaux.
La technique RT-PCR recommandée par l‘OIE dans le manuel terrestre 2013 (OIE, Terrestrial
Manual 2013) est basée sur la méthode développée par Eiden et collaborateurs en 2010 pour
l‘identification du lignage 1 et du lignage 2 du VWN. La procédure a été légèrement modifiée
notamment en ce qui concerne le choix des amorces et les sondes.
46
Apres une incubation de transcription inverse, suivie par 45 cycles d'amplification. Les
échantillons avec des valeurs de Ct (Cycle Threshold ou cycle seuil) de 37 ou moins sont considérées
comme positifs pour le VWN. Les valeurs de Ct de 37,1 à 42 indiquent que ces échantillons sont
considérés comme suspects, et doivent être analysés. Des valeurs supérieures à 42 montrent qu‘ils
sont négatifs.
Pour que la PCR soit valide, les valeurs de Ct des contrôles positifs et négatifs doivent se
situer dans la fourchette prévue.
Les amorces et la sonde correspondante à la région NS2A du génome du VWN sont recommandées
par l‘OIE pour la RT-PCR :



Amorce sens: GGG-CCT-TCT-GGT-CGT-GTT-C
Amorce inverse : GAT-CTT-GGC-YGT-CCA-CCT-C
Sonde: FAM-CCA-CCC-AGG-AGG-TCC-TTC-GCA-A-BHQ
La PCR nichée constitue une variante de la technique PCR. Elle est dite de nested-PCR se
pratique comme la PCR avec le couple d‘amorces externes pour dix cycles d‘amplification. A cette
étape on ajoute un excès d‘une ou de deux amorces internes avant de prolonger l‘amplification pour
encore 25 cycles environ. Cette procédure permet le plus souvent d‘obtenir l‘amplification spécifique
d‘un seul fragment.
On utilise deux couples d‘amorces. Des amorces externes dont la spécificité peut permettre
d‘amplifier à la fois un petit nombre de séquences homologues et des amorces internes permettant
d‘amplifier spécifiquement une des séquences révélées par le couple d‘amorces externes.
La région cible est la région E du VWN et Les amorces spécifiques conseillées par l‘OIE
(OIE, Manuel terrestre 2013) sont :
Amorces externes:
 1401F: ACC-AAC-TAC-TGT-GGA-GTC
 1845R: TTC-CAT-CTT-CAC-TCT-ACA-CT
Amorces internes:
 1485F: GCC-TTC-ATA-CAC-ACT-AAA-G
 1732R: CCA-ATG-CTA-TCA-CAG-ACT
2.2.Diagnostic sérologique indirect:
L‘exposition aux antigènes du VWN donne lieu à une réponse immunitaire décelable par
diverses techniques immunologiques :
a. Méthode de fixation du complément:
Le système du complément est un groupe de 35 protéines connues du sérum (5% des
protéines sériques), dont l‘activation séquentielle concourt à de nombreux effets biologiques
participant au maintien de l‘immunité innée. La méthode de fixation du complément permet de
détecter la présence d‘anticorps vis-à-vis d‘un antigène donné. La méthode consiste en un pré
47
incubation du sérum à tester avec l‘antigène, en présence d‘une quantité minimale de complément
purifié obtenu chez le cobaye : il peut alors se former des complexes immuns s‘il existe des anticorps
spécifiques. Puis, des hématies recouvertes d‘anticorps anti-hématies sont ajoutées. L‘absence
d‘hémolyse indique alors que tout le complément a été fixé par les complexes immuns du couple
antigéniques.
Figure 20: Schéma expliquant la méthode de fixation du complément
(Texas Department of State Health Services -. dshs.state.tx.us)
Les anticorps fixant le complément apparaissent précocement dans la seconde semaine de la
maladie, le pic de concentration étant atteint la troisième semaine pour commencer à diminuer sept
mois après le début de la maladie. Il s‘agit d‘une méthode sensible et spécifique, mais la technique
est longue et délicate. En effet, le complément est un système protéique fragile, qui se conserve mal.
De plus, un excès de complément entraine une hémolyse trop importante. Il existe également des
faux positifs (Omilabu et al., 1990).
b. Méthode d’inhibition de l’hémagglutination (IHA) :
Le VWN est hémagglutinant et hémadsorbant, il entraine la formation d‘anticorps inhibant
l‘hémagglutination. La méthode d‘inhibition de l‘hémagglutination (IHA) implique tout d‘abord un
traitement des sérums au kaolin pour éviter que des substances inhibent l‘hémagglutination d‘une
manière non spécifique. De plus, les sérums peuvent contenir des agglutinines contre les hématies
d‘oie utilisées et ainsi, provoquer de fausses réactions positives. Pour éviter cela, une saturation du
sérum par une suspension d‘hématies d‘oie est réalisée systématiquement. Puis une solution de BAB
est mélangée au sérum, puis ce mélange est dilué, avant d‘y ajouter l‘antigène (on utilise des
48
antigènes saccharose-acétone dilués). Ensuite les plaques sont recouvertes et conservées à 4°C
jusqu‘au lendemain. Enfin, les hématies d‘oie sont ajoutées au mélange et la lecture peut avoir lieu
30 minutes ou une heure après.
Figure 21: Schéma de la réaction d‘hémagglutination et inhibition de l‘hémagglutination
( Source : http://site.motifolio.com/images/Hemagglutination-and-hemagglutination-inhibition-test1021217.png)
Le titre inhibiteur de chaque sérum (titre IHA) est donné par l‘inverse de la plus grande dilution
de sérum qui inhibe complètement l‘hémagglutination. Cette méthode a été utilisée lors d‘une
enquête portant sur l‘étude des anticorps inhibant l‘hémagglutination due au VWN et réalisée sur des
sérums humains et animaux au Nigeria en 1989 (Olaleye et al., 1990).
c. Technique ELISA :
La technique ELISA (Enzyme-LinkedImmuno-Sorbent Assay) permet de détecter et de doser
les anticorps dirigés contre un antigène défini et purifié. Un conjugué anticorps-enzyme permet la
révélation des anticorps (Omilabu et al., 1990).
Figure 22: Principe de la technique ELISA compétitive pour la détection des IgG antiWN
49
(Source : http://www.fcoinfo.fr/local/cache-vignettes/L350xH303/ELISA_Sandwich-fa4b1.jpg)
Pour le diagnostic d‘une infection à VWN, il existe deux variantes de test ELISA selon le type
d‘anticorps recherchés :
Le test ELISA indirect sur IgG révèle la présence des immunnoglobulines IgG qui témoignent
une infection ancienne. Il donne des résultats positifs avec des sérums prélevés plus de 20 jours après
le début de l‘infection. Des réactions faussement positives peuvent apparaitre en raison de la présence
de facteurs rhumatoïdes ou dans les sérums.
Le test ELISA par capture consiste à fixer sur la plaque d‘ELISA un anticorps anti IgM
d‘équidés qui fixera les anticorps IgM présents dans le prélèvement. Ce test est à la fois sensible et
spécifique en ce qui concerne le VWN. Les IgM sont recherchées dans le but de savoir si l‘infection
est récente.
Figure 23: Principe du test ELISA de capture pour la détection des IgM antiWN
(Benjelloun A, 2015)
Une limite des tests ELISA réside dans leur difficulté à différencier le VWN des autres
flavivirus, en particulier les virus du même séro-complexe. Pour cette raison, la technique de
référence de la séroneutralisation, plus spécifique (Minke et al., 2008), est utilisée pour confirmer un
résultat positif au test ELISA (IgM ou IgG).
La réponse immunitaire à un vaccin anti VWN (Duraxyn ®VWN) chez 20 chevaux et poneys
âgés de 3 à 21 ans, a montré que tous ces chevaux à l'exception de deux d'entre eux ont produit des
anti-corps anti-VWN. 10 chevaux ont donné une réponse positive (limitée) en IgM ce qui suggère
50
que le test ELISA capture IgM ne peut pas être fiable pour distinguer les chevaux infectés
naturellement en phase aigüe des chevaux vaccinés (Jonquiere et al., 2004).
d. Méthode de neutralisation :
L‘exposition au VWN donne lieu à la production d‘anticorps capables de reconnaitre
l‘enveloppe virale et neutralisant la fixation et l‘invasion cellulaire, possédant une forte affinité pour
l‘antigène. Ainsi, ils peuvent bloquer spécifiquement l‘action infectieuse du virus, en réalisant une
compétition avec les récepteurs du virus sur les cellules cibles de l‘organisme. Ces anticorps bloquent
les protéines de l‘enveloppe virale, nécessaires à la fixation de celui-ci sur les membranes des
cellules cibles.
La technique de séroneutralisation sur culture cellulaire (figure 24) est largement utilisée pour
identifier les souches virales (Omilabu et al., 1990).
Elle permet d‘autre part d‘obtenir une notion quantitative, non disponible avec un test ELISA,
puisqu‘elle permet de déterminer un titre en anticorps neutralisants pour l‘échantillon de sérum
considéré. C‘est une technique plus longue, qui implique la manipulation du virus et donc entraîne la
nécessité du respect de règles d‘hygiène et de sécurité passant par un travail en zone confinée de
niveau 3. Les résultats définitifs ne seront obtenus qu‘au bout de 4-5 jours.
Le dosage en microplaques de la neutralisation du virus est capable d'identifier et de
quantifier les anticorps contre le VWN présents dans échantillons. Sa performance est comparable à
la PRNT (test de neutralisation par réduction de plaque), mais elle nécessite un volume d'échantillon
moindre et est plus adaptée lorsque seulement de petites quantités d'échantillons sont disponibles.
Figure 24: Test de séroneutralisation : Observation de l‘effet cythopathogène sur culture cellulaire
(à gauche) absence d‘ECP, (à droite) présence d‘ECP. (Benjelloun A., 2015)
51
Un échantillon est considéré comme positif quand il neutralise plus de 90% d‘ECP à la
dilution la plus faible (1/10). Le titre du sérum représente la plus haute dilution du sérum capable de
neutraliser plus de 90% d‘ECP dans 50% des cultures cellulaires.
Un titre viral supérieur ou égal à 1/10 est généralement considéré comme spécifique pour le
VWN. Cependant il convient de noter que les oiseaux et les mammifères peuvent présenter des
réactions croisées à ce niveau après l'infection ou la vaccination contre d‘autres flavivirus tels que les
agents de l'encéphalite japonaise ou de l‘encéphalite de St Louis.
Il est à noter que pour interpréter les résultats sérologiques, la technique de séroneutralisation ne
permet pas de statuer si les Ac présents dans le sérum ont été produits suite à une infection récente ou
à une infection ancienne. Par ailleurs cette technique est moins sensible que L‘ELISA et ne permet
pas de détecter les Ac présents en faible concentrations notamment au début de l‘infection.De même
il faut tenir compte du statut vaccinal dans l‘interprétation des résultats, en particulier pour l‘ELISA
IgG et pour la séroneutralisation (Minke et al., 2008).
VI.
Traitement :
Il n‘existe pas de traitement spécifique contre les flavivirus, seul un traitement symptomatique
de soutien reposant sur une fluidothérapie associée à des anti-inflammatoires non stéroïdiens
(phénylbutazone, flunixine méglumine) et du DMSO (diméthylsulfoxyde) permet d‘atténuer les
symptômes.
La flunixine méglumine administrée à une dose de 1,1 mg/kg toutes les 12 heures, par voie
intraveineuse, rapidement après l‘installation de la maladie, semble diminuer la sévérité des
tremblements musculaires et des fasciculations en quelques heures (Sellon et Long, 2006).
L‘utilisation des corticostéroïdes est controversée.
La thérapie lors de la présence d‘un cheval couché est généralement plus agressive et peut
inclure l‘administration de déxamethasone (0,05-0,1 mg/kg chaque 24 heures par voie intraveineuse)
et du mannitol (0,25-2,0 g/kg chaque 24 heures par voie intraveineuse).
La Détomidine (0,02-0,04 mg/kg par voie intraveineuse ou intramusculaire) est efficace pour
une tranquillisation prolongée. De même, de faibles doses d‘acépromazine (0,02 mg/kg par voie
intraveineuse ou 0,05 mg/kg par voie intramusculaire) fournissent un excellent soulagement à
l‘anxiété chez les chevaux couchés ou debout.
Une antibioprophylaxie sera mise en place uniquement en cas de corticothérapie afin d‘éviter
des complications bactériennes. De même, lors d‘infections qui surviennent souvent chez les chevaux
couchés (blessures, pneumonie), on administre des antibiotiques.
L‘intérêt d‘administrer des interférons, en particulier l‘interféron α, est encore discuté. Son
utilisation se base sur des rapports peu nombreux dans la littérature médicale humaine et vétérinaire
et il n‘y a que peu d‘informations sur son efficacité chez le cheval (en particulier pas d‘étude
cas/témoin).
Une thérapie basée sur l‘administration intraveineuse d‘immunoglobulines dirigées contre le
VWN a été également recommandée aux Etats-Unis. Cependant ce traitement plasmatique ne change
pas la donne quant au pronostic et à la sévérité de la maladie (Sellon et Long, 2006).
Il faut isoler les chevaux atteints dans un local calme, semi éclairé, désinsectisé. Le cheval
atteint par le virus West-Nile n‘est pas contagieux ni pour l‘homme ni pour ses congénères (Fort
Dodge, 2009).
52
VII. Prophylaxie :
La FWN est une maladie réputée contagieuse, est placée dans le groupe des méningoencéphalomyélites virales des équidés et est inscrite comme telle sur la liste des maladies réputées
contagieuses dans de nombreux pays. La lutte contre cette maladie est nécessaire en raison de la
pathogénicité du virus pour l'homme et le cheval et des risques sanitaires et des enjeux économiques
importants qu'elle entraîne.
1. Prophylaxie sanitaire :
La transmission par les moustiques à partir d'oiseaux sauvages infectés rend la lutte contre la
maladie délicate. Ce ne sont pas les chevaux malades qui sont source de virus, mais les réservoirs
(Genain et al., 2010).
1.1. Mesures offensives:
Les insecticides sont un moyen simple et efficace pour réduire les populations de moustiques
ainsi la lutte anti vectorielle vis à vis des larves et des adultes peut être utilisée, cependant elle
présente un coût écologique, qui n'est pas forcément signe d'efficacité (Artois, 2009).
Afin de contrôler l'origine principale des moustiques, il faut se concentrer sur la destruction
des zones de reproduction (gîtes larvaires) et réduire ainsi le nombre de larves par épandage
d'insecticides. La désinsectisation des moyens de transport des chevaux peut aussi être employée.
1.2. Mesures défensives:
Dans les zones où les facteurs favorisant l'apparition du virus sont réunis tels que la présence
d'oiseaux migrateurs et l‘existence de climat et de zones humides favorables à la multiplication des
moustiques des mesures défensives doivent être prises :
a. Protection contre le vecteur chez le cheval:
Dans les écuries, il faut changer l'eau des abreuvoirs ou de tout autre récipient d'eau au moins
tous les quatre jours, ou de préférence si possible tous les jours. Il faut laisser les couvercles sur les
poubelles et autres conteneurs. Il faut limiter l'exposition des chevaux au vecteur, garder si possible le
cheval à l'écurie le soir, lorsque les moustiques sont plus actifs, il faut éteindre les lumières la nuit
(Fort Dodge, 2009).
On peut également utiliser des répulsifs en zone infectée que l'on applique sur les chevaux et
des moustiquaires peuvent être posées aux portes des boxs (Genain et al., 2010).
b. Protection contre le vecteur chez l'homme:
Les mesures de protection individuelle revêtent une importance majeure dans la réduction du
risque de transmission du VWN, en l‘absence de moyens permettant d‘éradiquer totalement ce
risque. Une protection optimale est apportée par l‘utilisation combinée des moyens de protection
suivants :
- Le port de vêtements longs et amples,
- Les répulsifs cutanés,
- Les produits d‘imprégnation des tissus,
- L‘utilisation de moustiquaires pré-imprégnées.
53
c. Contrôle des populations de chevaux à risque:
Le contrôle sérologique à travers les tests ELISA et l'isolement (quarantaine) des équidés en
provenance de zones infectées sont également utilisés (Genain et al., 2010).
d. Epidémio-surveillance :
La surveillance doit permettre la détection la plus précoce possible de toute circulation virale
grâce au signalement rapide de tous les cas humains ou animaux suspects ou/et confirmés d‘infection
à VWN afin de mettre en œuvre le cas échéant des actions de prévention des maladies humaines et
équines. Elle s‘applique donc aux hôtes et vecteurs du virus et comprend des volets humain, équin,
aviaire et entomologique. Elle repose sur un dispositif national pérenne et un dispositif de
surveillance renforcée activé dans les zones géographiques où le risque de circulation du virus est
accru et à la période d‘activité des moustiques vecteurs.
La surveillance doit reposer sur quatre volets complémentaires mis en œuvre en période
d‘activité vectorielle :
- Volet humain : une surveillance des cas humains d‘infections neuroinvasives, susceptibles d'être
dues au VWN, dans les établissements hospitaliers.
- Volet équin : une surveillance clinique des cas d'encéphalites équines, ainsi qu‘une surveillance
active de la circulation virale chez les équidés.
- Volet aviaire : une surveillance de la circulation du VWN dans l‘avifaune et de détection précoce
d'une surmortalité.
- Volet entomologique : une surveillance entomologique consistant en un inventaire des espèces
culicidiennes et une recherche du VWN sur des moustiques capturés autour des foyers équins et/ou
humains (Lecollinet et al., 2004).
 Surveillance passive :
La surveillance équine repose avant tout sur une surveillance passive des cas neuro-invasifs
d‘infection à virus WN. Cette surveillance clinique est assurée sur l‘ensemble du territoire grâce à la
déclaration obligatoire des suspicions d‘encéphalites équines par les vétérinaires.
Pour être pleinement efficace, la surveillance passive fait appel à une sensibilisation et à une
formation des vétérinaires praticiens équins à la sémiologie, au diagnostic et à la surveillance de
l‘infection à VWN (Lecollinet et al. 2008).Cette surveillance est renforcée lorsque des cas équins
sont identifiés ou lorsque les autres volets de la surveillance détectent une circulation virale avec des
cas humains ou aviaires (Languille et al., 2005; Zientara et al., 2004). Des enquêtes de
séroprévalence sont alors menées dans les centres équestres et les élevages à l‘intérieur des zones de
circulation virale identifiées par la surveillance nationale (Lecollinet et al., 2008).
La surveillance des cas cliniques équins, qui repose sur la vigilance des propriétaires équins et
des vétérinaires praticiens présente beaucoup d‘intérêt, la population équine étant généralement
hautement médicalisée et peu mobile et la réalisation de prélèvements sanguins étant techniquement
aisée (Lecollinet et al., 2010).
54
 Surveillance active:
La surveillance passive peut être renforcée de mesures actives nécessitant le développement
de réseaux spécifiques d‘épidémio-surveillance pour le suivi sérologique régulier de sentinelles
aviaires (oiseaux captifs, volailles domestiques ou oiseaux sauvages identifiés) ou équines.
2. Prophylaxie médicale :
L‘absence de traitement efficace contre la maladie due au VWN et l‘efficacité relative des
mesures de prophylaxie sanitaire, jointe à l‘extraordinaire flambée de la maladie chez l‘Homme
comme chez les chevaux a encouragé le développement d‘un vaccin dans le but de prévenir
l‘infection.Aux Etats-Unis, l‘impact négatif du VWN sur l‘industrie du cheval a renforcé l‘intérêt
commercial du développement d‘un vaccin chez le cheval. Les études mises en place après la
commercialisation du premier vaccin en 2003 ont souligné l‘efficacité de la vaccination chez le
cheval (Dauphin et Zientara, 2007). La FWN est la seule maladie du cheval pour laquelle trois types
différents de vaccins de seconde génération (issus de la technologie de l‘ADN recombinant) ont eu
une autorisation de mise sur le marché (A.M.M.) (Minke et al., 2008).
2.1. Le choix de la vaccination :
La vaccination contre le VWN est possible mais certains pays la déconseillent, car l'efficacité
des vaccins contre certaines souches européennes n‘est pas connue (or le vaccin disponible en Europe
est produit avec le virus américain). De plus la disponibilité d‘un vaccin en Europe dans l‘espèce
équine, protégeant des formes cliniques de la maladie, pourrait influencer la sensibilité de la
surveillance clinique équine (en fonction du taux de couverture vaccinale) comme seulement 10%
des chevaux infectés présentent des signes cliniques, la virémie est considérée comme l‘indicateur le
plus sensible d‘une infection. L‘efficacité vaccinale est donc mesurée par le monitoring de la virémie
chez des chevaux vaccinés et non vaccinés (Dauphin et Zientara, 2007).
Divers vaccins candidats ont été développés depuis 2000, certains ont déjà été commercialisés
ou en sont à différentes étapes de développement. L‘utilisation de vaccins comportant des flavivirus
hétérologues induit une protection plus réduite, même si cette vaccination peut limiter la sévérité et la
progression de la maladie (Dauphin et Zientara, 2007).
2.2. Le point sur les vaccins :
Aux Etats-Unis, quatre vaccins sont actuellement disponibles avec A.M.M. (Dauphin et
Zientara, 2007).
- un vaccin inactivé adjuvé à virus entier disponible depuis 2001 (West Nile-Innovator®, Pfizer™)
lequel a également obtenue une A.M.M. en Europe (Duvaxin VWN®, Pfizer™).
- un vaccin recombinant, basé sur un vecteur Canarypox virus vectorisé commercialisé depuis 2004
(Recombitek equine VWN® Merial™). Les gènes codant pour les protéines prM et E ont été insérés
dans le vecteur Canarypox. C‘est ce vaccin qui a été utilisé lors de l‘épizootie de 2010 par les
autorités sanitaires marocaines pour la vaccination de chevaux dans les foyers de FWN déclarés.
55
- un vaccin vivant chimèrique recombiné non adjuvé commercialisé en 2008 utilisant comme base un
virus atténué de la fièvre jaune dont les gènes structuraux ont été remplacés par ceux du VWN
(PreveNile®, Intervet™). Ce vaccin exprime les protéines prM et E dans le vecteur viral atténué de la
fièvre jaune.
- un vaccin ADN adjuvé incluant les gènes codant pour prM et E, disponible depuis 2008 mais dont
le prix de revient est trop élevé et donc non commercialisé (West Nile Innovator-DNA®, Pfizer™)
Le vaccin recombinant Recombitek equine VWN® nécessite une primo-vaccination avec
deux doses par voie intramusculaire espacées de 5 semaines, il fournit d‘après le fabricant une
protection contre la virémie et protège les chevaux de l‘infection pendant un an (des rappels annuels
sont nécessaires). Le taux de protection contre la virémie est de 100% et le vaccin induit également
une réponse immunitaire cellulaire comme attendu avec un vecteur canarypoxvirus (Dauphin et
Zientara, 2007).
La vaccination ne conduit donc pas à restreindre les transports internationaux des chevaux,
mais elle peut interférer avec la surveillance sur le long terme. Le vaccin West-Nile peut être utilisé
le même jour que les autres vaccins classiques, en deux points d'injections séparés. Le délai
d'apparition de l'immunité est de 3 semaines après la seconde injection de primo-vaccination et la
durée d'immunité d'au moins 12 mois. Même si le vaccin est indiqué pour réduire la virémie (résumé
des caractéristiques), les expériences américaines démontrent indéniablement que la vaccination
protège à la fois de la virémie, mais aussi des signes cliniques et de la mort (Vandaële, 2009).
3. Mesures en cas de foyer :
3.1. Mesures individuelles :
Instaurer un traitement symptomatique pour les chevaux atteints comme décrit précédemment
et isoler les chevaux atteints dans un local calme, semi éclairé, désinsectisé. Le cheval atteint par le
virus West-Nile n‘est pas contagieux ni pour l‘homme ni pour ses congénères (Fort Dodge, 2009).
3.2. Mesures collectives de police sanitaire :
En cas de suspicion le vétérinaire sanitaire doit être alerté. Il fera procéder à l‘isolement des
animaux malades et réalisera les prélèvements permettant d‘établir un diagnostic.
- L‘exploitation sera mise sous surveillance dans l‘attente des résultats d‘analyse et des mesures
telles que le recensement des équidés, avec indication, pour chaque espèce, du nombre d'équidés
morts ou suspects d'encéphalite virale seront prises ainsi que l'isolement et l'interdiction de tout
mouvement des équidés suspects d'encéphalite virale.
- Si la maladie est confirmée, l‘exploitation est placée en quarantaine, les équidés présents seront
recensés et interdit de mouvement après la réalisation d'une enquête épidémiologique, le traitement
par insecticide autorisé des équidés présents et des locaux d‘hébergement, la levée de la quarantaine a
lieu 15 jours après la mort ou la guérison du dernier animal atteint.
56
CHAPITRE II :
PARTIE EXPERIMENTALE
57
Les variables éco-climatiques sont connues pour influencer la survenue des arboviroses. En
effet, des conditions climatiques et environnementales convenables favorisent l'abondance de
moustiques et l‘augmentation de la densité des hôtes sensibles. Elles constituent ainsi les principaux
facteurs influençant la survenue des foyers de FWN (Cantile et al., 2000).
Pour rechercher les variables climatiques associées avec l‘occurrence des épizooties de FWN
au Maroc certaines variables ont été explorées telles que la température, la pluviométrie et l‘indice de
végétation.
Ce travail a été complété par une enquête sérologique pour déterminer la séroprévalence des
anticorps dirigés contre le VWN et évaluer la circulation virale du VWN au Maroc.Ceci permet aussi
de détérminer la distribution géographique de l‘infection et de mieux connaitre le bioptope favorable
pour la survenue de la maladie..
I. Matériels et Méthodes utilisés pour l’analyse des variables climatiques associées avec
l’occurrence de la FWN au Maroc:
Dans le but déterminer les variables climatiques associées avec l'occurrence de la FWN au
Maroc les données concernant les épizooties précédentes telles que la situation géographique des
foyers ainsi que les indices de végétation NDVI, la température et la pluviométrie dans les zones
infectées.
1. Données bibliographiques des épizooties de 1996, 2003 et 2010:
Trois épizooties majeures ont eu lieu au Maroc : 1996 (Tber A., 1996) ; en 2003
(Schuffenecker et al., 2003) et en 2010 (OIE,2010). Les données des deux derinieres épizooties ont
été explorées notamment la situation géographique des foyers.
2. Les données climatiques de la télédétection spatiale:
2.1. Distribution des foyers:
Seules les coordonnées géographiques de quelques foyers ont été mesurées par GPS (Système
de positionnement géographique), pour la plupart la position géographique a été déterminée à partir
du nom du village et la position qui ont validée en utilisant les images haute résolution de Google
Earth (Google Earth.2011. Google, Inc.).(Annexe 2)
Toutefois, vue l‘incertitude concernant les localisations des foyers, l‘analyse par point a été
jugée inappropriée et une zone tampon circulaire de 10 km de rayon a été représentée arbitrairement
autour de chaque foyer. Ce choix a été dicté par l‘erreur possible de la localisation geographique et
par l‘etandue de la dispersion du Culex.
Le polygone résultant fût considérée comme l‘entité la plus convenable pour une
caractérisation géographique de la zone englobant le foyer.
Les deux aires d‘étude ont été délimitées par:
 10 polygones contenant les foyers de 2010 : « Aire d‘étude 2010»
 2 polygones contenant les foyers de 2003 : « Aire d‘étude 2003».
58
2.2. Les données climatiques et analyse statistique:
Les facteurs climatiques pris en considération sont l‘indice de végétation par différence
normalisée (NDVI) et la pluviométrie et la température de surface du sol ou LST (Land surface
température).
Les données de télédetection spatiale utilisées dans l‘analyse sont issues de MODIS Land
Surface Temperature & Emissivity (MOD11A2), MODIS Vegetation Indices (MOD13Q1) et les
valeurs des precipitations sont issues du TRMM (Tropical Rainfall Measuring Mission project). Les
données de 2001 à 2010 ont été téléchargées et converties en un système unique de coordonnées
(WGS84/UTM/zone 30). Les valeurs enregistrées de juin à november de chaque année ont été
exploitées.
Le choix de limiter l'analyse à cette période de l'année est basé sur l'épidémiologie de la
maladie, les dates de notification des cas en 2003 et 2010 et la période d'incubation de la maladie
chez les équidés.
a. Le NDVI:
Le NDVI est la mesure de l‘abondance de la chlorophylle et l‘absorption de la lumière. Il est
utilisé par exemple comme mesure de la couverture végétale, Le NDVI est calculé comme (Tucker,
1979):
ρNIR = réflexion proche de l‘infrarouge
ρRed = réflexion acquise dans la bande spectrale rouge.
Le NDVI, varie théoriquement entre -1,0 et +1,0, dans une zone ou la couverture végétale est
dense il s‘approche des valeurs positive entre (0,3 et 0,8) alors que les nuages et les champs
recouverts de neige sont caractérisés par des valeurs négatives.
Les eaux (Océans, mers, lacs et rivières) ont une réflexion plutôt faible dans les 2 bandes
spectrales, d‘où une valeur proche de zéro ou légèrement positive.
Les sols, qui présentent généralement une réflexion proche infrarouge plus grande que le
rouge, tendent à générer des valeurs NDVI légèrement positifs soit (0,1 à 0,2) (Hay, 2000).
Les données NDVI MODIS ou spectroradiomètre par imagerie à résolution modéré, ont été
obtenues auprès du Centre d‘Archive Actives Terrestres LPDAAC (Land Process Distributed Active
Archive Center) relevant de l‘âgence Nationale Américaine de l‘Aeronautique et de l‘administration
de l‘espace N.A.S.A (National Aeronautics and Space Administration)
MODIS est une série d‘instruments d‘observation scientifique couplés à un système embarqué
satellitaire, lancé par la N.A.S.A à bord du satellite Terra (E0S AM) en 1999, puis à bord du satellite
Aqua (EOS PM) deux satellites du système EOS (Système d‘observation de la Terre).
L‘orbite du satellite Terra autour de la terre est programmée pour passer du Nord au Sud audessus de l‘équateur le matin alors que le satellite Aqua passe du sud au nord au-dessus de l‘équateur
dans l‘après-midi.
Terra MODIS et Aqua MODIS observent l‘ensemble du globe terrestre chaque 1 à deux jours,
fournissant des données dans 36 bandes spectrales ou groupe de longueurs d‘onde.
59
Ainsi, le produit MOD13Q1.005 -MODIS/Terra Végétation Indices 16-Day L3 Global 250m
SIN Grid téléchargé à l‘adresse ftp://e4ftl01u.ecs.nasa.gov/MOLT/MOD13Q1.005/, a été traité.
Le traitement des images comprend également la transformation des données brutes, plus
précisément:
- Les données NDVI entiers brutes ont été transformées en nombres flottants dans la plage 0 - 1;
- Des données binaires précipitations ont été lus conformément aux instructions préconisées
(Huffman, 2011).
Pour chaque date la valeur moyenne des NDVIdes pixels coïncidant avec chaque polygone a
été calculée. Les valeurs de 2001 à 2010 ont été comparées en se focalisant sur les données
appartenant à la période entre le mois de mai et de novembre où l‘activité du vecteur est supposée
être élevée.
La valeur moyenne de tous les pixels de chaque polygone a été calculée pour chaque image
NDVI (période de 16 jours). L‘ensemble des données résultantes des 11 valeurs NDVI pour chaque
polygone et l‘année ont été analysés en utilisant le test des rangs signés de Wilcoxon pour
échantillons appariés (Wilkoxon Rank Sum test). Ce test permet de déterminer si les échantillons
proviennent de populations ou de distributions identiques et dans ce cas il permet de voir s‘il y a une
différence significative entre les années épidémiques et non épidémiques (2003 avec les autres, 2010
avec les autres années).
Comme les comparaisons sont multiples (n=10) la méthode de Bonferroni a été adoptée : le
niveau de signification a été fixé à 0.005 (p valeur de 0.05/10). Dans le cas de comparaisons
multiples, la règle de a été utilisée pour la correction du niveau de signification du test.
Toutes les analyses de données, y compris le téléchargement et le traitement, ont été
effectuées en utilisant le logiciel R, version 2.131 (R Development Core Team, 2011). Cependant des
librairies additionnelles ont été utilisées pour effectuer des opérations comme le chevauchement et la
lecture/écriture des données spatiales.
Même si le NDVI est intimement dépendant de l‘usage du sol, cette variable est considérée
comme un indicateur fiable des précipitations naturelles au Maroc et faiblement influencé par
l‘activité de l‘Homme (Höpfner et Scherer 2011).
b. Les données pluviométriques :
Les données pluviométriques du projet TRMM ont été obtenues à partir des archives du GES
DISC DAAC (Goddard Earth Distributed Active Archive Center). La TRMM est une mission
conjointe unissant l‘âgence spatiale américaine NASA et l‘âgence JAXA lancée en 1997 pour
observer et étudier des précipitions tropicales, entre les latitudes 50°N and 50°S afin de d‘aider à
comprendre le cycle de l‘eau dans le système climatique actuel et les interactions entre la vapeur
d‘eau, les nuages et la pluie.
Le
produit
TRMM_3B42_daily.006,
est
téléchargé
à
partir
du
site
ftp://disc2.nascom.nasa.gov/data/s4pa/TRMM_L3/TRMM_3B42_daily/ a été pris en charge pour
obtenir le taux de précipitations quotidiennes au format (mm/jour).
60
Pour chaque date, la valeur maximale des précipitations dans les pixels couvrant chaque polygone a
été sélectionnée.
Le 95° centile (valeur telle que 95% des valeurs sont en dessous et 5 % au–dessus) de la
distribution mensuelle des taux de précipitations a été calculé à partir de l‘ensemble des données
(mm/j). Le test du χ² a été appliqué au nombre de jours avec les précipitations supérieures au 95 °
centile qui peut être qualifié de précipitations exceptionnelles pour identifier les années avec un
nombre significativement élevé de jours à « précipitations exceptionnelles ».
c.
La température
La température contrôle le taux de développement de nombreux organismes. Les plantes et les
animaux invertébrés, y compris les insectes et les nématodes, nécessitent une certaine quantité de
chaleur pour se développer à partir d'un point dans leur cycle de vie à une autre. Cette mesure de la
chaleur accumulée est connue que le temps physiologique.
Théoriquement, le temps physiologique fournit une référence commune pour le
développement des organismes. La quantité de chaleur nécessaire pour compléter le développement
d'un organisme donné ne varie pas la combinaison de la température (entre les seuils minimal et
maximal) et le temps sera toujours le même. Le temps physiologique est souvent exprimé et estimé
en unités appelées degrés-jours (DJ).
Pour évaluer le rôle de la température dans les épizooties de la FWN au Maroc, les
températures journalières du jour et de la nuit on été assemblées et leur moyennes calculées pour
chaque période de 8 jours de l‘année 2001 à l‘année 2010 dans les zones des épizooties de 2003 et
2010.
Les valeurs des températures au sol ou LST ont permis de calculer les valeurs le nombre des
DJ selon le modèle décrit par Zou et al., 2007. La valeur du seuil minimal a été fixée à 14.3°C et les
données traitées sous forme d‘une onde sinusoïdale avec une amplitude égale à la variation
journalière de température. Les analyses de données utilisant le logiciel de R, Version 2.13.1 (R
Development Core Team, 2011).
Le niveau minimum de l‘accumulation d‘énergie est 109 dans les 12 jours selon le modèle
décrit par (Zou et al.2007).
Pour l‘ensemble de ces températures la fonction spline (lissage) a été appliquée pour calculer
les températures quotidiennes selon la méthode décrite par Lapierre et al., 2011.
Les résultats des calculs des DJ pour les zones concernées par les épizooties en 2003 et en
2010 ont été obtenus par calcul en ligne et un modèle DJ a été appliqué sur ces températures
quotidiennes (http://www.ipm.ucdavis.edu/WEATHER/index.htm)
61
II.
Matériels et Méthodes de l’enquête sérologique
1. Aire de collecte des échantillons :
Les prélèvements qui ont été effectués au cours des mois de mai juin et juillet 2011 ont
concernés des chevaux provenant de quatre zones différentes d‘un point de vue bioclimatique
(altitude, pluviométrie, température). Il s‘agit du littoral atlantique, du littoral méditerranéen, des
plaines intérieures et des zones montagneuses de l‘Atlas et ses régions :
1.1 Zone 1 : Littoral Atlantique :
Le littoral atlantique Nord allant de la péninsule tangéroise à El-Jadida. Elle connaît un climat
méditerranéen à influence océanique. Elle est fortement soumise aux perturbations océaniques venant
de l'Atlantique pendant la période des pluies qui commence en octobre et peut se prolonger jusqu'en
mai dans l'extrême Nord. L'été y est sec et ensoleillé, mais cela n'empêche pas l'existence de bancs de
brumes matinaux et la rosée nocturne, assez fréquents pendant cette période. Cependant la variabilité
des précipitations est très forte : elles sont divisées de moitié du Nord au sud. Si le cumul annuel des
précipitations est plus de 810 mm à Tanger, il est de 740 à Larache, 620 à Kénitra, 560 à Rabat et
plus de 400 à Casablanca. Quant aux températures elles sont plutôt homogènes, et les courants
atlantiques radoucissent le climat, l'hiver est plus doux et l'été plus clément. Ce climat a été favorable
pour faire de ces régions de grandes zones agricoles telles que la plaine du Gharb et le bassin du
Loukkos. On y trouve également des forêts de chênes verts, chênes lièges et d'eucalyptus.
La région des plaines de Doukkala au bassin du Souss s'étend de Safi au sud d'Agadir. Le
climat de cette région est une dégradation du climat des plaines atlantiques Nord, avec une aridité
croissante en allant vers le sud, en raison des influences sahariennes qui commencent à se faire sentir.
Le cumul des précipitations est de 350 mm à Safi, 290 mm à Essaouira et 250 mm à Agadir.
La période des pluies est inférieure à six mois et se concentre essentiellement entre novembre
et mars. Les températures sont fortement influencées par le front alizé qui souffle tout au long de
l'année. Elles varient, donc, très peu entre l'hiver et l'été, et s'échelonnent de 14 à 16 °C en janvier et
19 à 22 °C en juillet. Cependant cette région peut ponctuellement subir des remontées d'air saharien
qui peuvent faire grimper les températures au-delà de 40 °C.
Le littoral atlantique sud subit l‘influence océanique mais il avoisine le domaine saharien qui
est située au sud du massif de l'Atlas. Le climat y est typiquement désertique. Les précipitations sont
quasi-absentes moins de 100 mm par an (80 mm à Errachidia, 30 mm à Dakhla). Les températures
sont très contrastées (14 °C en moyenne en hiver à 35 °C en été). Sur le littoral atlantique les
amplitudes thermiques sont plus faibles de 18 °C en hiver à 23 °C en été. Dans le désert les nuits
peuvent être très fraîches en hiver.
1.2 Zone 2 : Littoral méditerranéen :
Cette zone est constituée du littoral méditerranéen et d'un arrière-pays montagneux : le Rif
(plus de 2 000m d'altitude). À l'est, près de la frontière algérienne, le relief s'abaisse vers les plateaux
de la basse Moulouya. Le climat est typiquement méditerranéen sur le littoral avec un hiver doux (10
à 12 °C) et arrosé, doublé d'un été chaud et sec (24 à 26 °C).
62
Les reliefs de l'arrière-pays sont beaucoup plus arrosés avec de la neige et des températures
fraîches en hiver. Les précipitations peuvent atteindre 2 000 mm par an sur les reliefs alors qu'elles ne
sont que de 300 à 600 mm sur le littoral. Encore une fois il existe un contraste entre l'ouest qui est
plus exposé aux dépressions venues de l'Atlantique et par conséquent plus humide, et l'est plus abrité
et donc plus sec. On passe de 600 mm en moyenne à Al-Hoceima à près de 350 mm à Oujda.
La chaîne du Rif est relativement verdoyante et luxuriante, les pins poussent près du littoral,
et les massifs sont couverts de chênes verts, de cèdres voire de sapins. Dans l'est plus sec on trouve
du maquis et des pins d'Alep.
1.3. Zone 3 : Plaines intérieures :
Cette zone forme un croissant allant de Fès au nord-est à Marrakech dans le sud-ouest. Elle
comprend les plaines et plateaux du Saïss, de la Chaouia, d'Abda et du Haouz. Il s'agit en réalité
d'une dégradation des deux climats précédents avec une continentalité relativement marquée.
En fait cette zone pourrait être divisée en deux, une aride dans le sud plus proche du climat
du Souss et une autre plus humide dans le nord plus proche du climat des plaines du Nord. En effet si
Fès et Meknès reçoivent entre 500 et 600 mm de pluie par an cette quantité chute drastiquement en
dessous des 300 mm au sud de Settat avec notamment 250 mm à Marrakech.
La continentalité de cette région lui confère une faible humidité de l'air, et les amplitudes
thermiques y sont très importantes aussi bien sur l'année qu'au cours d'une même journée. Les
températures moyennes en hiver vont de 9 à 11 °C, et montent en été jusqu'à 26 à 28 °C. Mais il faut
également savoir que le gel est relativement fréquent en hiver et les journées souvent torrides en été.
1.4. Zone 4 : Atlas et pré- Atlas :
Le climat subit des influences océaniques et méditerranéennes sur le versant nord exposé aux
dépressions venues de l'Atlantique, quant au versant sud abrité, il subit les influences sahariennes. Si
le Moyen Atlas reçoit entre 1000 et 1500 mm de précipitation en moyenne par an (1200 mm à
Ifrane), le Haut Atlas n'en reçoit lui que 600 à 900 mm, voire 400 mm seulement pour les versants les
plus abrités.
Les chutes de neiges sont très abondantes pendant l'hiver et peuvent se prolonger jusqu'au mois
de mai. Pendant l'été la zone est fréquemment touchée par des épisodes orageux. Quant aux
températures, elles sont très rudes en hiver avec des gelées permanentes (jusqu'à -18 °C), tandis que
pendant l'été elles sont assez agréables avec 20 °C en moyenne.
Les prélèvements ont été effectués lors de rassemblements de chevaux à l'occasion des
manifestations sportives, (fantasias, Semaine du Cheval à Dar Salem,) et au cours de la saison de
monte dans la station de saillie de Ben Slimane.
63
2
Echantillons:
L‘échantillonnage a porté sur 870 chevaux sains sans aucun signe en rapport avec la maladie et
sans distinction de sexe. Tous les chevaux sont âgés de plus 3 ans. Les prelevement ont été éfféctué
au cours des mois de mai, juin et juillet 2011. les chevaux proviennent en majorité des provinces de
Ben Slimane, Khemisset et Kenitra connues pour être les sièges des foyers observés en lors des
épizooties précedentes mais aussi de provinces éloignées.
Tableau 6: Nombre et provenance des chevaux prélevés par zone et par localité.
Zone
Littoral atlantique
Littoral méditerranéen
Plateaux intérieurs
Pré Atlas + Atlas
Localités (nombre de chevaux)
Kénitra (17), Larache (17), Témara (15),
Benslimane (113), Casablanca (22), Chtouka
Ait Baha (1), Doukala (1), El-Jadida (2),
Essaouira (1), Mediouna (14), Mohammedia
(21), Nouacer (16), Safi (31), Sidi Banour
(28), Agadir (4), Sidi Ifni (3), Dakhla (17),
Guelmim (13)
Sidi Slimane (10), Taourirt (17), Taza (48),
Taounate (35), Oujda (16)
Benguerir (28), Berchid(1), Chichawa(1),
Khouribga (53), Marrakech (1), Rhamna(32),
Settat(47), Elhajeb(14), Fès (35), Khémisset
(106), Sidi Kacem (50),
Tadla (3), Beni Mellal (20), Fqih Ben Saleh
(26) Khénifra (17)
Total
Total
504
116
199
51
870
Les prélèvements de sang ont été acheminé à 4°C, au laboratoire National BIOPHARMA, les
sérums obtenus par centrifugation ont été numérotés et mis dans des tubes eppendorf, étiquetés et
conservés à -20°C jusqu‘à utilisation.
3 Techniques immunologiques
3.1 ELISA compétition (IgG):
Le kit commercial ID Screen West Nile IgG Competition a été utilisé, Il permet détection des
anticorps IgG anti-pr-E du VWN dans les sérums de chevaux et d‘oiseaux dont la référence est WNC
ver 0110 GB. (Annexe 3)
a. Principe :
Le principe de la technique d‘ELISA compétition repose sur la détection dans les sérums testés,
des anticorps dirigés contre la protéine pr-E de l‘enveloppe virale du VWN. De ce fait, les micropuits
de la plaque d‘ELISA sont recouverts d'un extrait purifié du virus. Les échantillons à tester et les
sérums contrôles sont additionnés aux puits. Si l‘anticorps anti pr-E est présent, un complexe
64
antigène-anticorps serait formé. Ensuite un anticorps conjugé à la peroxydase est ajouté dans les puits
qui se fixent sur les épitopes pr-E restant libres, formant ainsi un complexe antigène-conjugéperoxydase. Après le lavage effectué pour éliminer l‘excès du conjugé, une solution de substrat
(TMB : 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) est additionnée. La coloration résultante dépend de la quantité
des anticorps spécifiques présents dans les échantillons à tester :
 En absence d‘anticorps : une coloration bleue apparait, qui devient jaune après l‘ajout de la
solution stop.
 En présence d‘anticorps : aucune coloration n‘apparait.
b. Protocole expérimental :
Le protocole utilisé est celui établi du fabricant du kit, ainsi avant de commencer l‘analyse,
tous les réactifs sont laissés à température ambiante (21°C ± 5°C), et sont bien homogénéisés avant
toute utilisation.
Dans les plaques sensibilisées avec l‘antigène, on ajoute le tampon de dilution 2, les contrôles
positifs et négatifs et les échantillons à tester (voir figure 25). Une Incubation de 90 min ± 6 min à
21°C (± 5°C), est effectuée pour permettre le contact Ag-AC, et puis le conjugué (1X) préalablement
préparé est additionné aux micropuits après la réalisation d‘une série de lavages avec la solution de
lavage (1X) qui sera diluée dans l‘eau distillé ionisée, ensuite une seconde Incubation de 30 min ± 3
min à 21°C (± 5°C) est nécessaire pour permettre l‘attachement du conjugué au complexe AC-Ag
déjà formé. Une dernière série de lavages est indispensable avant l‘ajout de la solution du substrat et
l‘incubation de la plaque pendant 15 min ± 2 min à 21°C (± 5°C) et à l‘obscurité. Finalement un
volume égal de la solution stop (H2SO4 0.5M) est ajouté pour arrêter la réaction. La lecture de la DO
se fait à 450 nm.
1
50 µl du tampon
de dilution 2 + 50
µl Contrôle positif
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
B
C
50 µl du tampon
de dilution 2 + 50
µl Contrôle négatif
D
50 µl du tampon de dilution 2 + 50 µl
des échantillons à tester
E
F
G
H
Figure 25: Schéma de la plaque du test ELISA-compétitive
65
11
12
Le test est valide si :
 La valeur moyenne de DO des contrôles négatifs est supérieure à 0.7
 la valeur moyenne de DO des contrôles positifs est inferieure à 0.3
Pour chaque échantillon on calcule le pourcentage S/N (Sample ou échantillon /négatif) :
% S/N = DO échantillon / DO CN X 100
 % S/N inférieure ou égale à 40%, l‘échantillon est considéré positif
 % S/N est strictement supérieure à 40% et inférieure ou égale à 50%, l‘échantillon est considéré
douteux
 % S/N est strictement supérieure à 50%, est considéré négatif.
Les sérums considérés positifs ou douteux après le test d‘ELISA compétitive ont été analysés par la
technique de séroneutralisation qui est une méthode spécifique.
3.2 ELISA de capture (IgM) :
Le kit commercial ID Screen West Nile IgM Capture utilisé permet la détection des anticorps
IgM anti-WNV dans le sérum ou le plasma des chevaux sa référence est WNIGM ver 0111 GB
(Annexe 4).
a. Principe :
Le kit commercial comprend des plaques dont les cupules sont recouvertes par un anticorps
polyclonal anti-IgM des chevaux, les échantillons à tester et les sérums contrôles sont additionnés
dans les micropuits, les anticorps IgM seront capturés dans les plaques. Ces dernieres seront lavées,
et l‘antigène du VWN est ajouté dans les cupules, ce dernier va fixer l‘IgM anti-VWN capturé dans
la plaque. Après lavage, afin d‘éliminer l‘excès de l‘antigène, un anticorps monoclonal anti-prE
conjugué à HRP (Horseradish peroxidase) est ajouté, qui sera fixé sur l‘antigène précédemment
capturé par l‘IgM anti-VWN. Un dernier lavage est effectué pour éliminer l‘excès du conjugué, on
ajoute la solution du substrat TMB (3,3', 5,5‘-tetramethylbenzidine). Selon les instructions du
fabriquant
Ainsi la coloration obtenue dépend de la quantité d‘IgM présente dans l‘échantillon testé .La
lecture s‘effectue à 450 nm.
 En présence d‘anticorps ; une coloration bleue apparait, qui deviennent jaune après
addition de la solution stop (H2SO4 0.5 Mol).
 En absence d‘anticorps : aucune coloration n‘apparait
b. Protocole expérimental
Avant de commencer l‘analyse, tous les réactifs sont laissés à la température ambiante (21°C
± 5°C), et bien homogénéisés avant toute utilisation.
Dans la plaque ELISA, on répartit le tampon de dilution des sérums dans toutes les cupules, le
contrôle négatif dans les cupules A1, B1 et A2, B2 ; le contrôle positif dans les cupules C1, D1 et C2,
D2 et les sérums à tester dans les puits restants, chaque échantillon doit être déposé à deux reprises
dans les puits pairs et impair adjacentes (figure 26). Les plaques sont incubées pendant 1heure ± 5
min à 37°C (± 3°C). Une série de lavage est réalisée avec la solution de lavage pré diluée dans l‘eau
66
distillée (1X). L‘antigène WN (prêt à l‘emploi) est ensuite ajouté dans les colonnes paires, et le
tampon de dilution dans les colonnes impaires. L‘ensemble est incubé toute une nuit (16 - 20h) à
21°C (± 5°C). Le lendemain le conjugué dilué selon les instructions du fournisseur est ajouté dans
toutes les cupules après avoir réalisé une série de lavage. Les plaques sont incubées 30min ± 3 min à
21°C (± 5°C) puis lavées trois fois avant d‘additionner la solution du substrat. Après incubation 15
minutes à 21°C (± 5°C) et à l‘obscurité, la réaction est arrêtée par ajout d‘un volume égal de la
solution stop dans toutes les cupules. La lecture de la DO se fait à 450 nm.
D13
1
WNAg
2
A
CN
B
C
CP
D
D13
WNAg
D13
WNAg
D13
WNAg
D13
WNAg
D13
WNAg
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
S5
S5
S13
S13
S21
S21
S29
S29
S37
S37
S6
S6
S14
S14
S22
S22
S30
S30
S38
S38
S7
S7
S15
S15
S23
S23
S31
S31
S39
S39
S8
S8
S16
S16
S24
S24
S32
S32
S40
S40
E
S1
S1
S9
S9
S17
S17
S25
S25
S33
S33
S41
S41
F
S2
S2
S10
S10
S18
S18
S26
S26
S34
S34
S42
S42
G
S3
S3
S11
S11
S19
S19
S27
S27
S35
S35
S43
S43
H
S4
S4
S12
S12
S20
S20
S28
S28
S36
S36
S44
S44
Figure 26: Plaque de manipulation pour ELISA par micro capture IgM.
Les échantillons déposés en double dans les puits pair et impair adjacents, CN : contrôle négatif ;
CP : contrôle positif ; S : sérum ; D13 : tampon de dilution 13 ; WN-Ag : Antigène West Nile
Pour exprimer et valider les résultats on calcule la DO corrigée pour chaque échantillon testés
ainsi les contrôles comme suit : DO corrigée = DO colonne pair - DO colonne impair
Le test est valide si :
 La valeur moyenne de la DO corrigée du contrôle positif est strictement supérieure à 0.350 (DOCP>
0.350).
 Le ratio des valeurs moyennes du DO des contrôles positif et négatif est supérieur à 3 (DOCP /
DOCN>3)
Pour chaque échantillon on calcule le pourcentage S/P selon la formule suivante :
% S/P = DO corrigée d’échantillon - DO corrigée CN /DO corrigée CP - DO corrigée CN
 % S/P inférieure ou égale à 35%, l‘échantillon est considéré négatif
 % S/P est strictement supérieure à 35% et strictement inférieure à 45%, l‘échantillon est considéré
douteux.
 % S/P est supérieure ou égal à 45%, est considéré positif.
67

3.3 Séroneutralisation sur culture cellulaire:
La technique de séroneutralisation sur culture cellulaire se base sur la révélation des anticorps
neutralisant l‘effet cytopathogène de particules virales. Cette neutralisation se manifeste par
l‘absence de toute lésion cellulaire lors d‘observation au microscope après incubation.
a. Principe :
La SN est réalisée sous un volume de 50µl dans des microplaques à fond plat pour culture
cellulaire, utilisant deux dilutions par sérums et quatre cupules par dilution. Les dilutions croissantes
des sérums sont mises en contact avec une quantité égale du virus contenant 100 doses infectieuses
de 50% de la culture tissulaire (DICT50). Les cellules sont utilisées pour la révélation de l‘effet
cytopathogène du virus libre qui n‘a pas été neutralisé. Des témoins sérums négatifs et sérums
positifs sont inclus dans chaque test.
b. La lignée cellulaire :
La lignée cellulaire VERO établie par Yasumura et Kawakita., en 1963 est utilisée pour le
dépistage des anticorps anti-VWN par séroneutralisation sur culture cellulaire, en assurant la
prolifération du virus.
c. Production de la souche virale :
Pour la réalisation d‘un test de séroneutralisation, un stock de virus de travail doit être établi
en quantité suffisante à partir d‘une souche de référence ou d‘une souche locale isolée et identifiée.
La souche virale utilisée pour la réalisation du test de séroneutralisation a été isolée sur les
cellules BSR (clone de cellules BHK : Baby Hamster Kidney cells) en 1996 à partir d'un prélèvement
de cerveau d'une jument qui a succombée à la suite de la maladie de la FWN à Bouznika (El Harrak
M. et al., 1997).
Cette souche designée « Mor.1996 EQ », a été adaptée sur les cellules VERO. Le virus à son
ème
7 passage sur ces cellules a été utilisé pour les tests de séroneutralisation sur culture cellulaire.
Ainsi un tapis cellulaire jeune de 48 heures de confluence est inoculé avec la souche
« Mor.1996 EQ » utilisant une multiplicité d'infection de 1 dose pour 100 cellules. L'inoculum est
mis en contact avec les cellules pour adsorption pendant 60 min à 37°C. Les cellules inoculées sont
incubées à 37 °C et suivies quotidiennement par observation microscopique pour la détection de
l'effet cytopathogène (ECP). Une fois l'ECP est généralisé avec une destruction de presque 50% des
cellules, le virus est récolté, réparti dans des tubes puis conservé à -80°C. Des prélèvements pour le
contrôle de qualité sont effectués sur le lot réparti. Ce stock de virus servira pour effectuer plusieurs
séries de test de séroneutralisation.
d. Préparation de la suspension cellulaire :
Les cellules utilisées dans le test de séroneutralisation sont entretenues in vitro par subculture,
qui se fait deux fois par semaine par trypsination d‘un tapis confluent. Les cellules en culture sont
ensemencées dans des flacons de 80 cm² en polystyrène stérile en présence du milieu de croissance
68
additionné de sérum de veau. Après la numération d‘un échantillon de la suspension cellulaire, on
ajuste la suspension cellulaire à 100 000 cellules par ml avec du milieu de croissance. (Annexe 5)
e. Préparation des échantillons :
La réaction de SN est effectuée sur les prélèvements de sérum révélés positifs par le test
ELISA après inactivation à 60°C pendant 30 min dans un bain-marie. La décomplémentation des
sérums à analyser et des sérums de contrôle se fait en une seule fois.
Les sérums de contrôle comportent :
 Un sérum de contrôle positif provenant d‘un cheval convalescent
 Un sérum de cheval négatif testé pour culture cellulaire.
.
f. Préparation de la suspension virale :
La suspension virale à utiliser a été préalablement titrée et diluée de façon à avoir 100
DICT50 par 50 µl. Le titre représente l‘inverse de la dilution la plus élevée qui donne un ECP chez
50% des unités inoculées. Le titrage a été effectué dans des plaques de microtitrage de 96 puits
d‘aprés la méthode de Rossiter et Jessett en 1982, selon les étapes suivantes :
 Dans des tubes à hémolyse, des dilutions virales sont préparées de 10-¹ à 10-6.
 La répartition des dilutions réalisées dans les plaques à 96 puits, à raison de 100 μl dans 6
cupules/dilution.
 Une suspension cellulaire (VERO) ajustée à 10 000 cellules/ml est ajoutée dans toutes les cupules
à raison de 150 μl/cupule. Ainsi que des cellules témoins ne contenant que le milieu d‘entretien.
(Annexe 7)
 Incubation des plaques dans une étuve à 37°C et 5% de CO2.
 Lecture après 5 jours
Le titre viral infectieux est calculé selon la méthode de « Spearman Karber » exprimé en log
DICT50%/ml (logarithme de l‘inverse de la dilution initiale donnant 50% de l‘ECP).Il est calculé
comme suit :
TI = d + (∑n + N/2) r/N
Avec :
d : Dilution la plus élevée présentant 100% d‘effet cytopathogène.
r : Raison de dilution.
N : Nombre de cupules par dilution.
∑n : Somme des nombres des cupules des dilutions présentant un effet cytopathogène entre 0
et 100%.
69
Pour le calcul des 100 DICT50, le virus de travail est dilué de façon à avoir 100 doses par 50
µl de la supsension virale à additionner aux dilutions de sérum
Pour la réalisation du test de séroneutralisation les étapes suivantes ont été suivies:
Sous une hôte à flux laminaire, les plaques de microtitration sont préparées, de façon à avoir 12
sérums par plaque avec 2 dilutions par sérums et 4 cupules par sérum (figure 27).
Le milieu d‘inoculation à 1 % sérum de veau fœtal (SVF) est réparti dans toutes les cupules de la
plaque. Ensuite on ajoute 25μl de chaque sérum à tester dans chacune des quatre cupules de la
première colonne, d‘où on prélève 25μl qui seront transférés à la deuxième colonne. Une fois bien
homogénéisé par aspiration et refoulement, les 25μl de la deuxième dilution sont éliminés. Aussi les
sérums de contrôle (CN et CP) seront dilués de la même manière. Ensuite on répartit la suspension
virale 100 DICT50 déjà préparée dans toutes les cupules. Puis l‘incubation est effectuée pendant 1
heure en atmosphère humide à 37°C et 5% de CO2. Par la suite on ajoute la suspension cellulaire déjà
préparée et ajustée à 100 000 cellules par ml. Les plaques sont homogénéisées délicatement et
laissées à 37 °C à 5% de CO2 pendant 5 jours, par la suite les tapis cellulaires sont observés à l‘aide
d‘un microscope inversé.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
Sérum1
Sérum5
Sérum9
C
Sérum3
Sérum7
Sérum11
D
E
Sérum2
Sérum6
F
Sérum10
G
Sérum4
Sérum8
Sérum12
H
Figure 27 : Schéma de plaque de microtitrage des sérums pour le test de séroneutralisation
70
 Préparation de la plaque de contrôle :
Chaque test de séroneutralisation est validé par les résultats du titrage en retour des 100 doses
mises en contact avec les sérums à dépister et par le titre du sérum positif et négatif inclus dans le
test. Cette plaque est préparée de la manière suivante (figure 28) :
 Titrage viral : Effectué selon le protocole décrit précédemment
 Titrage en retour de la dilution de travail 100 doses DICT50 :
La suspension virale utilisée dans la réaction de séroneutralisation, est titrée à son tour, en
effectuant les dilutions 1/10, 1/100 et 1/1000 dans des tubes à hémolyse avec du milieu d‘inoculation
à 1% SVF. Ensuite 50 μl par cupule de la dilution de travail (pure) non diluée est répartie dans 12
cupules.et puis les dilutions préparées sont réparties dans la plaque de contrôle à raison de 50 μl par
cupule et 12 cupules par dilution. Enfin 50 μl du milieu d‘inoculation à 1% SVF sont ajoutés dans
toutes les cupules du titrage en retour. Le contrôle de la suspension cellulaire est réalisé en
répartissant 100 µl des cellules dans 12 cupules.
1
2
3
4
5
6
Titrage en retour de la suspension à
100DICT50
A
B
Pur à 100DICT50
7
8
9
10
11
12
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
C
D
10-1=10 DICT50
Recontrole du titre virus
du stock travail
E
F
10-2=1 DICT50
G
H
10-3= 0,1 DICT50
Témoin cellules
.
Figure 28: Schéma de plaque de microtitrage pour lecontôle du test de séroneutralisation
71
 Expression et validation des résultats :
La validation du test est confirmée en contrôlant :
 Le titre du virus utilisé qui ne doit pas varier de ± 0,3 log.
 Le titrage en retour de la dilution du travail qui doit présenter 100 % d‘ECP à la dilution 1/10,
au moins une cupule positive à la dilution 1/100 et 0% d‘ECP à la dilution 1/1000.
 Le titrage du sérum positif ne doit pas varier de plus de 0,24 log.
 Le témoin sérum négatif qui ne doit pas montrer une neutralisation ou même une réduction de
ECP au niveau de la plus faible dilution.
 Le témoin cellules ne doit présenter aucune lésion.
4
Analyse statistique des résultats l’enquête sérologique :
Les taux de séroprévalence dans les quatre régions (Littoral atlantique, la côte
méditerranéenne, les plaines intérieures et les zones montagneuses) ont été comparés en utilisant une
approche bayésienne à distribution β (n +1, n-s +1) où n = 870 est le nombre total d'échantillons
testés et s = 284 sont les échantillons positifs. Les intervalles de confiance à 95% ont été calculés
pour chaque distribution de probabilité selon la formule :
= moyenne observée, s= écart type observé s et n= taille de l‘échantillon de taille. La valeur de tα
à 95% est de 1,96 selon la table de la loi normale en lecture inverse.
72
CHAPITRE III
RESULTATS
73
I.
Résultats de l’analyse des variables climatiques associées avec
l’occurrence du virus de la FWN au Maroc :
Les données concernant les épizooties de 2003 et 2010 ont été assemblés ainsi que les données
sur l'indice de végétation NDVI et la pluviométrie dans les zones infectées.
L‘emplacement des foyers et de leur zone tampon relative de 10 km de diamètre sont représentés
sur carte (Figure 29).
Figure 29: Répartition géographique des foyers de FWN en 2003 et en 2010
La zone tampon de 10 km a été tracée autour des foyers pour permettre l‘analyse statistique
car les coordonnées GPS sont indisponibles
1. Comparaison des NDVI dans les zones infectées:
Les valeurs moyennes et écart-type des valeurs de l'indice de végétation par différence
normalisée ont été calculés pour la période de juin à novembre au cours de la décennie 2001-2010
pour chaque zone touchée par des cas FWN. (Tableau 7)
74
Tableau 7 : Valeurs moyennes et ecart-type des NDVI de la période de mai
à novembre par polygone et par année de 2001 à 2010
Année
Polygone
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
2010 / 1
0,243
(0,018)
0,255
(0,027)
0,269
(0,043)
0,274
(0,026)
0,262
(0,019)
0,267
(0,015)
0,278
(0,026)
0,276
(0,033)
0,284
(0,016)
0,295
(0,021)
2010 / 2
0,282
(0,026)
0,291
(0,041)
0,302
(0,044)
0,322
(0,038)
0,298
(0,027)
0,306
(0,022)
0,298
(0,031)
0,282
(0,045)
0,304
(0,024)
0,328
(0,032)
2010 / 3
0,277
(0,032)
0,33
(0,072)
0,352
(0,084)
0,359
(0,078)
0,278
(0,03)
0,304
(0,045)
0,296
(0,067)
0,27
(0,042)
0,346
(0,063)
0,351
(0,072)
2010 / 4
0,207
(0,018)
0,239
(0,045)
0,261
(0,05)
0,254
(0,039)
0,21
(0,017)
0,239
(0,028)
0,226
(0,033)
0,217
(0,028)
0,257
(0,037)
0,273
(0,053)
2010 / 5
0,252
(0,022)
0,29
(0,053)
0,309
(0,067)
0,311
(0,056)
0,249
(0,016)
0,293
(0,044)
0,26
(0,022)
0,277
(0,058)
0,294
(0,035)
0,338
(0,081)
2010 / 6
0,222
(0,017)
0,256
(0,049)
0,282
(0,059)
0,276
(0,047)
0,227
(0,016)
0,254
(0,033)
0,248
(0,048)
0,243
(0,049)
0,275
(0,038)
0,303
(0,076)
2010 / 7
0,3
(0,023)
0,336
(0,064)
0,345
(0,063)
0,361
(0,057)
0,305
(0,025)
0,342
(0,045)
0,297
(0,024)
0,321
(0,063)
0,336
(0,036)
0,361
(0,077)
2010 / 8
0,308
(0,017)
0,319
(0,048)
0,371
(0,068)
0,371
(0,05)
0,292
(0,019)
0,344
(0,03)
0,295
(0,027)
0,323
(0,072)
0,347
(0,031)
0,371
(0,076)
2010 / 9
0,324
(0,026)
0,356
(0,058)
0,358
(0,05)
0,368
(0,046)
0,315
(0,027)
0,348
(0,042)
0,314
(0,03)
0,333
(0,053)
0,367
(0,054)
0,364
(0,05)
2003-2010 /
10
0,317
(0,034)
0,331
(0,044)
0,377
(0,054)
0,378
(0,053)
0,293
(0,021)
0,333
(0,029)
0,298
(0,02)
0,306
(0,048)
0,363
(0,028)
0,36
(0,041)
2003 / 11
0,231
(0,042)
0,269
(0,077)
0,29
(0,089)
0,288
(0,071)
0,226
(0,036)
0,245
(0,046)
0,252
(0,076)
0,243
(0,057)
0,264
(0,059)
0,293
(0,076)
La comparaison des valeurs moyennes des NDVI dans l‘aire d‘étude 2003 et l‘aire d‘étude
2010 au cours de la décennie 2001 à 2010 a donné les résultats suivants :
Dans l‘aire d‘étude 2003, les valeurs des NDVI enregistrées en 2001-2002 et de 2005 à 2008
étaient significativement inférieures à celle enregistrées en 2003.
- De même que dans l‘aire d‘étude 2010 les valeurs des NDVI étaient significativement
inférieures à celles de l‘année 2010 à l‘exception de 2004.
Les moyennes et les déviations standards du NDVI par polygone et par année en considérant les
mois allant du mois de mai à novembre sont représentées dans le tableau suivant :
75
Tableau 8: Les valeurs moyennes et écart-type des valeurs NDVI enregistrées de juin à novembre au
cours de la décennie 2001-2010 pour chaque foyer de FWN
ZONE
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2003
0.260*
(0.048)
0.289*
(0.066)
0.311
(0.065)
0.313
(0.064)
0.257*
(0.045)
0.287*
(0.054)
0.259*
(0.039)
0.271*
(0.0065)
0.301
(0.065)
0.314
(0.067)
2010
0.268**
(0.043)
0.293**
(0.061)
0.314**
(0.067)
0.318
(0.061)
0.271**
(0.041)
0.299**
(0.052)
0.273**
(0.035)
0.284**
(0.065)
0.314**
(0.056)
0.332
(0.073)
* Les valeurs nettement inférieures à la valeur NDVI enregistrée en 2003
** Valeurs nettement inférieures à la valeur NDVI enregistrée en 2010
(Test des rangs signés de Wilcoxon pour échantillons appariés p-valeur appariés <0,005)
2. Comparaison des données pluviométriques dans les zones infectées :
La comparaison entre le nombre de jours de «précipitations extrêmes» enregistré entre juin et
novembre dans les deux zones a permis de constater qu‘un nombre nettement plus élevé de jours de
«précipitations extrêmes » a été observé en 2003 au cours du mois d‘ août, et en 2010 au cours du
mois de juin et de juillet 2010, (Tableau 9).
Tableau 9: Nombre de jours avec «précipitations extrêmes» de 2001 à 2010 enregistrées entre juin et
novembre dans les zones touchées par la FWN.
Année
Juin
Juillet
Août
Septembre
Octobre
Novembre
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
3
2
8
6
7
7
0
0
9
10*
1
0
4
9
2
11*
3
3
3
12*
7
4
12*
4
8
8
6
2
3
7
4
2
2
1
1
4
2
12*
13*
1
0
4
7
6
3
2
6
6
0
6*
0
8*
6
2
4
2
4
7
2
4
1,3
0,5
0,9
5
20,2
25,9
95° percentile des
précipitations
(mm)
* Les valeurs significativement plus élevées que prévu pour ce mois (test χ2, P <0,05).
76
Les séries des précipitations moyennes de chaque 3 jour respectivement en 2003 et 2010 dans
les aires d‘étude (période du 15 juillet au 31 Août pour chaque année a été effectuée. Ainsi au cours
des deux années, des pics de précipitations sont clairement présents (Figures 30 et 31).
Années
▲2010
■ 2003
● Autres
Figure 30: Données de précipitations de 3 jours d‘intervalle dans l‘aire d‘étude de 2003
du 15 Juillet-31 Août pour les années 2001-2010.
Années
▲2010
■ 2003
● Autres
Figure 31: Données de précipitations de 3 jours d‘intervalle dans l‘aire d‘étude de 2010
du 15 Juillet- 31 Août pour les années 2001-2010.
77
En outre, la distribution géographique des valeurs maximales des précipitations par jour au cours
du mois d‘Août confirme la présence de précipitations abondantes en 2003 et de 2010 (Figure 32).
Figure 32: Valeurs maximales de pluies quotidiennes (en mm)
pendant le mois d‘août de 2001 à 2010, dans les régions touchées par la FWN.
78
3. Comparaison des données de la température dans les zones infectées :
Le relevé des températures de jour et de la nuit de la surface du sol (LST) a permis de calculer
les températures moyennes de chaque zone d‘épizooties de 2001 à 2010.
Aire d‘étude 2003
Aire d‘étude 2010
Figure 33: Températures journalières de jour et de la nuit et leur moyenne de 2001 et 2010
A partir des moyennes quotidiennes l‘accumulation d‘énergie DD a été calculée en ligne
températures quotidiennes selon la méthode décrite par Lapierre et collaborateurs, 2011.
Le modèle degrés-jour (DJ) a été appliqué sur ces températures quotidiennes
(http://www.ipm.ucdavis.edu/WEATHER/index.htm).La valeur du seuil minimal a été fixée à 14.3°C
(Zou et al., 2007) et les données traités sous forme d‘une onde sinusoïdale avec une amplitude égale
à la variation journalière de température.
Le niveau minimum de l‘accumulation d‘énergie est 109 dans les 12 jours selon le modèle
décrit par (Zou et al.2007).
Les résultats du calcul des degrés jours pour les zones des épizooties de 2003 et 2010 (Figure 34)
ont permis d‘obtenir la date de début et la date de fin de la fin de l‘activité potentielle du vecteur
(Tableau 10).
79
Figure 34: Valeurs degrés-jours cumulées à partir du premier janvier de chaque année
de 2001 à 2010
Tableau 10: Dates du début et de la fin de l‘activité potentielle du moustique
dans les aires d‘etudes 2003 et 2010
Aire d’étude de 2003
Année Date de début Date de la fin
Jour du début
Jour de la fin
2001
2002
17/5/01
26/4/02
4/11/01
11/10/02
137
116
308
284
2003
12/5/03
7/10/03
132
280
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
24/5/04
26/4/05
11/5/06
4/5/07
29/4/08
4/5/09
27/4/10
29/10/04
13/10/05
30/10/06
24/10/07
6/10/08
27/10/09
11/10/10
145
116
131
124
120
124
117
303
286
303
297
280
300
284
Année
Date de début
Aire d’étude de 2010
Date de la fin
Jour du début
Jour de la fin
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
12/04/2001
16/05/2002
12/05/2003
23/05/2004
28/04/2005
10/05/2006
05/05/2007
28/04/2008
04/05/2009
15/10/2001
12/10/2002
13/10/2003
15/10/2004
13/10/2005
27/10/2006
23/10/2007
06/10/2008
29/10/2009
102
136
132
144
118
130
125
119
124
288
285
286
289
286
300
296
280
302
2010
27/04/2010
11/10/2010
117
284
80
L‘analyse des jours du début et de la fin de l‘activité potentielle des moustiques comptés à
partir du 1er janvier dans les aires des épizooties de 2003 et de 2010 sont représentés dans le tableau
10 et la figure 35.
Figure 35: Représentation graphique du début et de la fin de l‘accumulation d‘énergie par le vecteur
pour la décennie 2001-2010.
Ainsi au Maroc, L‘accumulation d‘énergie nécessaire pour le vecteur commence entre le 102ème
et le 144ème jour de l‘année et finit entre le 208 ème et le 302ème jour.
A partir du graphe et tableau on peut conclure qu‘il n y a pas de différences dans les années 2003
et 2010 par rapport au reste de la décennie.
81
II.
Résultats de l’enquête de séroprévalence :
1. Résultats du test ELISA compétition IgG :
Le test ELISA compétition est utilisé dans le but de détecter des anticorps IgG anti pr-E du
virus WN. Sur un total de 870 sérums analysés, nous avons obtenus 321 cas positifs présentant un %
S/N inferieur ou égale à 40%, 546 cas négatifs avec un % S/N strictement supérieur à 50% et 3 cas
douteux dont le % S/N est strictement supérieur à 40% et inferieur ou égale à 50% (Tableau 5)
Ainsi, 36.89 % des sérums analysés se sont révélés positifs et 62.75 % négatifs .La présence
des 3 cas douteux est due à la sensibilité de la technique.
Tableau 11: Résultats du test ELISA compétitive IgG
Résultats ELISA compétitive IgG
321
Positifs
546
Négatifs
3
Douteux
Total sérums analysés
870
2. Résultats du test de séroneutralisation :
Sur les 324 sérums non négatifs en ELISA, 56 sérums ne présentaient pas d‘anticorps
neutralisants le VWN. Par contre, les 268 restants contiennent des anticorps neutralisants dirigés
contre le VWN. (Figure 36)
Figure 36: Résultat synthétique des analyses sérologiques
82
Ainsi au final 268 chevaux sont positifs par les deux techniques soit une prévalence globale
de 30.80% IC95%=(27,83%, 33,95%).
Le titre de SN supérieure ou égale 1/10 correspondant à 1.02log est généralement considéré
comme spécifique pour le VWN selon le manuel des tests de diagnostics et des vaccins pour animaux
terrestres de l‘OIE (2013).
Par conséquent tout sérum présentant un titre neutralisant inférieur à 1.02 log DN50 est
considéré négatif. La plupart des sujets considérés positifs ont montré un titre neutralisant supérieurs
ou égale à 1.5log DN50 (237cas) (Figure 37).
Figure 37: Titre des anticorps séroneutralisants obtenus par SN dans les sérums positifs en IgG
Sur les 268 sérums positifs par séroneutralisation. 237 de ces sérums ont montré un titre
supérieur ou égal à 1.5log DN50 soit 27,55 % de l‘effectif global testé (Figure 37).
3. Résultats du test Elisa IgM de capture :
Le test ELISA IgM capture a été effectué sur 78 sérums positifs en IgG provenant des régions
impliquées dans les précédentes épizooties. Les régions choisies sont Benslimane (18 chevaux),
Kénitra (17 chevaux), Larache (17 chevaux), Sidi Kacem (23 chevaux), Sidi Slimane (3 chevaux).
Pour tous les sérums analysés on a obtenu un pourcentage (% S/P) inférieur à 35%. Ce test qui a pour
but de différencier une infection récente d‘une infection ancienne n‘a mis en évidence aucun cas
positif.
83
4. Séroprévalence globale :
La prévalence moyenne pour les 870 échantillons, issus de différentes régions analysées,
prélevés chez des chevaux entre Mai et Juin 2011, est de 30.80% (IC95%=(27,83%, 33,95%).
Au cours de la même année entre mars et avril, une enquête sérologique a été réalisée chez
l‘homme au Maroc révélant un taux de séroprévalence global de VWN estimé à 11.8% (EL Rhaffouli
et al., 2012) sachant que la prévalence était significativement plus élevée à la province de Kénitra
(18.8%) qui est une zone très humide suivie de la région de Rabat (12%) puis la province de Meknès
(4.7%) .
Même si la distribution des cas de FWN ne respecte pas le découpage administratif, et le
nombre d'échantillon n'est pas égal entre les provinces il nous a semblé nécessaire de comparer les
différentes prévalences. (Annexe 8)
Ainsi on remarque que les prévalences les plus élevées sont rencontrées dans les provinces de
Sidi Slimane (100%), Kénitra (94,12%), Larache (94,12%) Guelmim (69,23%), Dakhla (64,71%),
Sidi Kacem (64%), Benslimane (58,41%), El Hajeb (50%), Mediouna (35,75%), Sidi Ifni (33,33%)
et Safi (32,26%). Ces provinces ont en effet une prévalence supérieure à la prévalence globale qui est
de 30,80%,(IC95%=(27,83%, 33,95%).
Une prévalence intermédiaire a été trouvée dans les provinces suivantes: Fqih Bensaleh
(30,77%), Taounate (28,57%), Témara (26,67%), Agadir (25%), Nouaceur (25%), Mohammedia
(23,81%), Taza (22,92%), Fès (22,86%), Sidi Banour (14,29%), Khémisset (14,15%), Beni Mellal
(10%), Rhamna (9,38%), Casablanca (9,09%), Khouribga (7,55%), Settat (6,38%) et Oujda (6,25%),
A l'inverse certaines provinces ont une prévalence nulle telles que Benguerir (0/2), Berchid
(0/1), Chichawa(0/1), Chtouka Ait Baha (0/1), El Jadida(0/3), Essaouira(0/1), Khénifra (0/17),
Marrakech (0/1), Tadla (0/3) et Taourirt (0/3), A l‘exception de la province de Khénifra et de
Taourirt l‘effectif des échantillons provenant de ces provinces est trop faible pour avoir une
signification statistiques (Figure 38).
84
Figure 38: Cas positifs en IgG et prévalence par province
5. Séroprévalence par zone bioclimatique :
Les conditions biotiques et abiotiques sont deux déterminantes importants de l‘épidémiologie
de la FWN (Shlomit .P. et SemenzaC., 2013) ainsi il nous a paru nécessaire de comparer la
distribution des cas positifs par zone bioclimatique.
Le climat au Maroc est déterminé par les différentes influences que subit le pays : influences
océaniques, méditerranéennes, montagnardes, continentales et sahariennes.
Les échantillons proviennent essentiellement de 4 zones bioclimatiques distinctes à savoir le
littoral atlantique, le littoral méditerranéen, les plaines intérieures, et l‘Atlas et le pré-Atlas. Chaque
une de ses régions est différente en matière de température, humidité, végétation ...etc.
85
En reportant les prévalences par zone bioclimatique , la prévalence constatée de la zone
bioclimatique du littoral atlantique est de 45,83%,( IC95%=(40,58%, 51,18%)), celle des plaines
intérieures est de 23,30% (IC95%=(19,19%-27,99%) celle du littoral méditerranéen 18,97%
IC95%=(12,89%-27,07%)) et enfin celle de la région de l‘Atlas et du pré- Atlas est de 15,15%
IC95%=(8,49%-25,74%) (Tableau 11).
Tableau 12 : Pévalence par zone bioclimatique
Zone
Caractéristiques
Littoral
Atlantique
Littoral
méditerranéen
Plaines
intérieures
Atlas et
pré- Atlas
Altitude
0-500m
0 à 2000 m
250 à 500m
500-4165 m
Pluviométrie
en mm/an
Température
400-850
350 – 600
250-600 mm
600 à 1400
Hiver : 12 à 13°C
Eté : 23°C
Hiver : 10 à 12°C
Eté : 26 à 28°C
Hiver : 9 à 11°C
Eté : 26 à 28°C
Hiver : gelée à -18 °C
Eté : 20°
Humidité
Humide à
subhumide
Sub humide à sec
sec
sec
Positifs
154
22
82
10
testés
336
116
352
66
Prévalence
45,83%
18,97%
23,30%
15,15%
IC 95%
40,58%-51,18%
12,89%-27,07%
19,19%-27,99%
8,49%-25,74%
Les résultats de l‘analyse bayésienne des taux de séroprévalence dans les quatre régions
(Littoral atlantique, la côte méditerranéenne, les plaines intérieures et les zones montagneuses)
moyennant une approche bayésienne à distribution ß (n +1, n-s +1) où n = 870 est le nombre total
d'échantillons testés et s = 268 sont les échantillons positifs et en calculant les intervalles de
confiance à 95% ont montré que le littoral atlantique a une prévalence (45,83%, IC95%=(40,58%,
51,18%)) nettement supérieure par rapport à la prévalence globale (30,80%, IC95%=(27,83%,
33,95%)) et aussi aux autres zones bioclimatiques. Les prévalences de ces dernières ne sont pas
statistiquement différentes car elles se chevauchent entre elles dans l‘intervalle de confiance de 95%.
Ainsi les séroprévalences des plaines intérieures (23,30%, IC95%,=(19,19%-27,99%)), du
littoral méditerranéen (18,97%, IC95%=(12,89%-27,07%)) et de la région du l‘Atlas et du pré-Atlas
(15,15%, IC95%=(8,49%-25,74%)) sont considérées comme très similaires d‘un point de vue
statistique (Figure 39).
86
Figure 39: Comparaison des taux de séroprévalence dans les quatre zones bioclimatiques moyennant
une approche bayésienne.
* n = 870 est le nombre total d'échantillons testés, s = 284 sont les échantillons positifs. Les
intervalles de confiance à 95% ont été calculés pour chaque distribution de probabilité
L‘utilisation du système d‘information géographique (SIG) a permis de visualiser sur la carte
les distributions des prévalences par zone bioclimatique. Nous remarquons que la zone du littoral
atlantique notamment nord-ouest présente un nombre plus élevé de cas positifs. A l‘inverse les autres
zones dont le climat est aride ou semi-aride présentent des prévalences très basses (Figure 40).
87
Figure 40: Prévalences en anticorps anti WN par zone bioclimatique
88
CHAPITRE IV DISCUSSION
89
La maladie de la FWN est une arbovirose commune à l'homme, le cheval et à de nombreux
vertébrés (mammifères, oiseaux etc.) qui a touché le Maroc en 1996, 2003 et 2010. Même si son
impact est réduit sur la santé dans le bassin méditerranéen par rapport à l‘Amérique du Nord, Cette
maladie suscite l‘inquiétude par les morbidités et mortalités qu‘elle occasionne ainsi que le
changement de son comportement durant les vingt dernières années avec notamment la première
détection du lineage 2 en Europe et une augmentation soudaine du nombre de foyers de maladies
neuroinvasives exprimées par des cas neurologiques humains ou équins.
L‘objectif de ce travail a été d‘une part d‘identifier les facteurs et processus épidémiologiques
expliquant l‘émergence de foyers de FWN au Maroc en mettant en œuvre une approche écoépidémiologique par l‘étude des variables environnementales et climatiques associées à son
apparition et d‘autre part d‘évaluer la situation épidémiologique par le biais d‘une enquête de
séroprévalence chez les chevaux.
Nous savons que l‘occurrence des épidémies dues à cette anthropozoonose est clairement liée
à l‘abondance des vecteurs, en particulier les moustiques du genre Culex (Komar, 2000).Ce sont des
arthropodes poïkilothermes très sensibles aux conditions de l‘environnement et les variables
climatiques ont été largement utilisées pour prédire leur distribution et leur abondance (Hay et al.,
2006).
Nous savons aussi que la télédétection permet de délimiter les espaces pertinents pour repérer
les biotopes propices au développement des parasites rendant ainsi possible d‘analyser les facteurs
affectant la distribution et la survie de la population des moustiques qui conditionnent la survenue et
la diffusion de l‘infection, en présence d‘espèces d‘oiseaux jouant le rôle de réservoir.
Par conséquent nous avons mis à profit les données de la télédétection spatiale pour l‘étude de
l‘épidémiologie de la FWN au Maroc. Les facteurs pris en considération ont été la température par le
biais de la LST, la végétation révélée par l‘indice de végétation par différence normalisée (NDVI) et
la pluviométrie.
Une fois les foyers des épizooties localisés géographiquement, les données numériques ont été
structurées dans un système d‘information géographique (SIG) qui est un système de traitement
informatique comprenant des modules fonctionnels permettant de construire, de modifier,
d‘interroger de représenter cartographique ment, les bases de données, selon les critères sémantiques
et spatiaux.
Dans le cadre de ce travail nous sommes intéressés à la comparaison des ces indices entres les
années épizootiques (1996, 2003 et 2013) et des années non épizootiques pour identifier les zones
favorables à la FWN et les représenter sur carte.
Dans plusieurs études ces outils ont permis d‘élaborer un modèle prédictif qui peut servir à
cibler les zones d‘intervention des autorités sanitaires se présentant ainsi comme des outils d‘aide à la
décision.
Le NDVI est une mesure indirecte de la disponibilité de l'eau et il est l'indice de végétation le
plus couramment utilisé dans les études de santé. Il a été appliqué pour décrire la distribution du
VWN en Amérique du Nord (Rogers et al., 2002) ainsi que les valeurs de NDVI plus élevées ont été
associées à des cas humains groupés à New York (Brownstein et al., 2002). En outre, le NDVI a été
inclus comme variable explicative dans plusieurs modèles spatiaux épidémiologiques pour le FWN
au États-Unis (Ward al., 2007; Ward, 2009).
Cette étude a mis en évidence l‘association entre l‘indice de végétation ainsi que la
pluviométrie d‘une part et l‘occurrence de foyers de FWN au Maroc d‘autre part.
90
A notre connaissance c‘est la première fois que le lien épidémiologique entre les valeurs
NDVI et la transmission de la FWN chez des chevaux en 2003 et 2010 au Maroc a été démontrée
pour le continent africain.
Des études menées en Afrique de l‘Est sur la fièvre de la vallée du Rift, au Kenya plus
particulièrement, ont montré l‘existence d‘une relation entre abondance des pluies, pullulation des
moustiques et émergence de cette maladie, ce qui a permis la construction de modèles assez fiables,
reposant principalement sur les indices pluviométriques et l‘utilisation de la détection.
La relation entre la pluviométrie et le risque d'apparition de foyers épizootiques ou
épidémiques a été explorée dans de nombreuses études. L'utilisation de différents indices corrélés à la
pluviométrie, permettent de détecter ses variations, et pouvoir ainsi prévoir le risque d‘occurrence de
la maladie et prendre les mesures nécessaires pour la contrôler ou, du moins, diminuer son impact.
L‘ITCZ ou Indice de convergence de la zone intertropicale correspond au point de rencontre
des vents venant du Nord et de ceux venant du Sud. A partir d‘avril, il remonte vers le Nord jusqu‘au
18° ou 20° N, puis redescend vers le Sud à partir de juillet-août. Dans une zone donnée, l‘apparition,
l‘importance et la durée des pluies et du couvert nuageux correspondent à une certaine position de
l‘ITCZ. En Afrique de l‘Est (Kenya, Tanzanie, Zambie), les pluies sont liées à une remontée de
l‘ITCZ.
Le SOI index Southern Oscillation Index est l‘index le plus utilisé pour caractériser le
phénomène ENSO (El Niño Southern Oscillation), qui affecte principalement les pays situés au bord
ou dans les océans Pacifique et Indien (Glantz, 1991; Chagas et Puppi, 1986). Il compare les
pressions atmosphériques de Tahiti et de Darwin (Australie), qui se situent dans l‘océan Pacifique. Il
s‘exprime sous forme d‘une déviation standard par rapport à une moyenne calculée entre 1951 et
1980
En Afrique de l‘Est, l‘apparition des épizooties de la FVR a très vite été reliée à la survenue
de pluies surabondantes (Linthicum al., 1983), et ce, en particulier lorsqu‘elles succèdent à des
périodes de sécheresse prolongées (Saluzzo, 1989). En 1930, au Kenya, on avait déjà remarqué que
l‘épizootie faisait suite à une saison des pluies particulièrement violente (Daubney al.,1931). A partir
de fin octobre 1997 jusqu‘en janvier 1998, des pluies torrentielles de 60 à 100 fois les moyennes
saisonnières sont tombées sur la majeure partie de l‘Afrique de l‘Est entraînant les plus importantes
inondations de la corne africaine depuis 1961. Une relation similaire entre pluies intenses et
apparition des épizooties a été rapportée en Afrique du Sud (MacIntosh al., 1980).
Dans la présente étude des pics élevés de la pluviométrie ont été observés dans les aires
impliquées dans la transmission de la FWN, Le nombre de jours avec des précipitations extrêmes
enregistrés entre juin à novembre est significativement élevé par rapport au reste de la décennie et un
nombre élevé de jours avec des précipitation extrêmes a été observé au cours du mois d‘août pour
2003 et au cours des mois de juin à juillet en 2010 juste quelques semaines avant l‘apparition des cas
cliniques de FWN.
L‘influence des précipitations sur la dynamique de la population des moustiques (donc sur la
transmission du VWN) est plus controversée et dépend, entre autres, des espèces de moustiques
considérées. La surface de l‘eau est déterminante dans le développement de la larve, ainsi de fortes
précipitations sont susceptibles d‘augmenter la surface de l'eau stagnante, défavorisant ainsi les
moustiques qui utilisent les sources d'eau permanentes, telles que Cx. hortensis.
D'autre part, de fortes pluies peuvent également diluer les nutriments pour les larves de
diminuer ainsi le taux de développement (Dieng, H et al., 2009).
91
D'un point de vue épidémiologique, Il a été démontré que la sécheresse peut favoriser la
transmission du VWN aux États-Unis car l'eau stagnante devient plus riche en nutriments.
D'autre part, la réduction de la surface d'eau peut augmenter la concentration d'oiseau autour
des points d'eau et augmenter ainsi le contact entre les hôtes et vecteurs (Epstein, P. et al., 2001;
Shaman, J. et al.,2005 ; Chase J. et al., 2003).
Concernant la température les données de la télédétection obtenues à partir MODIS LST et
emissivity (MOD11A2) n‘ont révélé aucune différence significative entre la température moyenne
enregistrée de 2001 à 2010 dans les deux zones des épizooties de 2003 et 2010.
Les analyses de données utilisant le logiciel R, Version 2.13.1 (R Développent Core Team, 2011)
n‘ont permis de trouver aucune différence entre la température moyenne enregistrée de 2001 à 2010
dans les deux zones. De même, que les différences entre le nombre de jours avec des degrés-jours audessus du seuil inférieur ne sont pas significatives (Aire d‘étude 2003: χ² = 7.22, P = 0,611; Aire
d‘étude 2010: χ² = 16.33, P = 0,06).
On sait toutefois qu‘une augmentation de la température entraine chez le vecteur un
métabolisme plus important et un taux de survie journalier plus grand du vecteur (Mellor et Leake,
2000) de même qu‘une baisse soudaine de température induit le phénomène de diapause d‘œufs de
certaines espèces de moustiques (MacHaffey, 1972) et que les données de la température ont été
utilisées comme facteur explicatif pour les épidémies de FWN enregistrés en 2002 dans la région du
nord-est des Etats Unis d‘Amérique et du Québec (El Adlouni et al., 2007).
Pour que ces associations épidémiologiques entre NDVI et pluviométrie soient utilisées au
Maroc à des fins prédictives et préventives une meilleure investigation est nécessaire, en tenant
compte non seulement de l‘apparition de la maladie chez les chevaux mais aussi de données plus
spécifiques sur la circulation du virus chez l‘homme, les oiseaux et les mammifères dans les zones
concernées.
Afin d‘avoir une meilleure idée sur la distribution spatio-temporelle de l‘infection. Nous
avons menés une enquête de séroprévalence chez les 870 chevaux appartenant à quatre zones
bioclimatiques différentes. Les données de l‘enquête de séroprévalence ont été représentées sur carte
et traitées géographiquement en utilisant le SIG.
Les méthodes de diagnostic de laboratoire qui ont été utilisées sont les tests ELISA capture
pour des IgM et ELISA de compétition pour les IgG ainsi que la séroneutralisation. Ces techniques
sont largement utilisées pour le diagnostic et la surveillance lors des récentes épidémies de FWN
dans le monde (Autorino GI et al., 2002) Murgue B et al., 2000).
L‘utilisation de l‘ELISA de compétition et la séroneutralisation a permis de détecter 268 cas
positifs par les deux techniques (30.08 IC95%=(27,83%, 33,95%)).
Cette prévalence s‘approche de celle observée en Tunisie. En effet une étude sérologique
équine a indiqué que le taux de séroprévalence est de l‘ordre de 28% (Bargaoui al.,2013), alors qu‘en
Andalousie (Sud d‘Espagne), une étude similaire a confirmé la présence d‘anticorps anti-VWN chez
7.1% des chevaux analysés (García-Bocanegra et al., 2012). Au Brésil, à Pantanal, des signes
sérologiques équins d‘infection par le VWN ont été estimé à 8% (Melandri et al., 2012). Aussi, une
étude récente en Iran a signalée 1.3% des cas humains et 2.8% cas équins séropositifs pour le VWN
(Chinikar S et al., 2013).
92
Les deux tests IgM et IgG ELISA semblent sensibles mais ils donnent des réactions croisées
avec les anticorps d'autres flavivirus. La séroneutralisation, plus spécifique, a été utilisée avec succès
comme un outil de diagnostic de l'infection par le VWN chez les chevaux (Bunning et al., 2002 ;
Ostlund et al., 2001).
Les 56 sérums positifs en ELISA IgG et ne présentant pas d‘anticorps séroneutralisants
suggèrent que cette différence des résultats entre les deux techniques peut être attribuée à la
sensibilité élevée de la technique ELISA par rapport à la neutralisation mais aussi à l‘existence d‘une
réaction croisée avec d‘autres Flavivirus.
Au Maroc, la circulation d‘autres flavivirus doit être envisagée. En effet en2008, des anticorps
dirigés contre le virus USUTU ont été détectés chez 3 oiseaux sauvages capturés tels que merles
noirs (Turdus merulas), passereaux (Passer domesticus), Bouscarle de Cetti (Cettia cetti) parmi 360
individus capturés dans la région de Kénitra près de la rivière Sebou (Figuerola J et al.,2008)
suggérant la circulation simultanée des deux virus.
Sur les 268 sérums positifs par séroneutralisation. 237 ont montré un titre supérieur ou égal à
1.5log DN50 soit 88.43% des échantillons positifs et 27,55 % de l‘effectif global testé. Ces titres
élevés peuvent être expliqués par une exposition prolongée et répétée au virus qui circule de façon
endémique. Cette exposition a un effet de rappel qui permet d‘obtenir des titres élevés.
La détection de faibles titres d‘anticorps IgG neutralisants (0.9 et 0.78 log DN50) témoigne
probablement d‘une ancienne exposition aux antigènes du VWN ou à d‘autres flavivirus. Ces
anticorps tendent à diminuer progressivement avec le temps, (Zeller et al., 2004).
Comme dans toute étude épidémiologique des biais sont possibles telles que des biais de
sélection, des biais de confusion. Dans cette étude la vaccination reste le principal biais qui peut
occasionner la distorsion des valeurs des prévalences.
Durant l‘épizootie de 2010, un vaccin recombinant a été utilisé dans certains élevages pour
endiguer l‘avancée de la maladie (données officielles sur le nombre de chevaux vaccinés non
disponibles). Ce vaccin commercialisé depuis 2004 sous le nom Recombitek equine VWN®
Merial™, est préparé à base d‘un vecteur recombinant qui est le poxvirus du canari sur lequel ont été
greffés des antigènes du VWN capables de stimuler une réponse immunitaire protective.
Il est très délicat de distinguer les anticorps vaccinaux des anticorps naturels. Cette distinction
pourrait se faire grâce à la détection des anticorps naturels dirigés spécifiquement contre la protéine
non structurelle NS-1. Cette protéine étant associée à la réplication du génome et sachant que les
protéines des Flavivirus (prM, NS1, NS3 et NS5) sont également identifiées comme antigéniques,
prM et NS3 peuvent donc être reconnues par des antisérums spécifiques de la souris et du cheval.
La protéine NS1 est glycosylée et exprimée à la surface des cellules infectées et peut être
également sécrétée. Les anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre la protéine NS1 ont
permis d‘identifier le type complexe et épitopes spécifiques des Flavivirus. Cette protéine joue un
rôle dans la conformation du virus. Elle a également été démontrée comme ayant des propriétés
antigéniques et a été utilisée comme antigène dans la technique ELISA (Castillo- Olivares et Wood
2004).
Les erreurs d‘interprétation des prévalences peuvent être aussi évitées par inclusion dans
l‘enquête d‘espèces de mammifères vivant dans les zones d‘intérêt qui n‘ont jamais été vaccinés et
qui sont exposées autant que les chevaux tels que les chiens, les ânes, mulets ou divers ruminants.
La détection des IgM permet de révéler une infection récente. En effet après exposition
l‘animal produit des anticorps IgM au bout de 8 à 10 jours post-infection, ils persisteraient moins de
93
3 mois (Zeller et al. 2004). Parmi les 78 sérums testés par ELISA IgM dans le but de détecter une
infection récente, aucun échantillon n‘était positif. Donc aucune infection récente n‘a été détectée,
ceci est dû au fait probablement que les prélèvements ont été effectués en dehors de la période
épizootique. Par conséquent on peut dire que, les chevaux objets de cette enquête, n‘ont pas été
exposés au VWN au cours des 3 mois qui ont précédé les prélèvements.
Les échantillons proviennent essentiellement de 4 zones bioclimatiques différentes à savoir le
littoral atlantique, Le littoral méditerranéen et les plaines intérieures, et l‘Atlas et le pré-Atlas.
Chacune une de ses régions est différente en matière de température, humidité, végétation ...etc.
Les variations géographiques sont des facteurs influençant la transmission du VWN et
explorés dans de nombreuses études épidémiologiques.
Les études épidémiologiques estiment que les variations géographiques influencent la
transmission du VWN selon l'abondance des oiseaux et des vecteurs compétents. La répartition
géographique des cas clinique si dépend de la densité spatiale de l'homme et du cheval. Dans le SIG
trois types de couches sont ainsi pris en compte dans les études éco-épidémiologiques: l'abondance
de moustiques, l'abondance des oiseaux sauvages et l'abondance des hôtes accidentels. Une fois
séparément mappé, ces couches sont superposées et combinées pour calculer et indices carte de
risque.
Ainsi Les données de l‘enquête de séroprévalence ont été analysées pour comparer des taux
de séroprévalence dans les quatre régions (Littoral atlantique, la côte méditerranéenne, les plaines
intérieures et les zones montagneuses) moyennant une approche bayésienne à distribution ß (n +1, n-s
+1) puis représentées sur carte et traitées géographiquement en utilisant le logiciel SIG. Les résultats
confirment l'importance des conditions bioclimatiques dans la déclaration des foyers au Maroc.
La prévalence la plus élevée se situe dans la zone où les conditions bioclimatiques sont
optimales pour la survie du vecteur et la présence des oiseaux migrateurs. C‘est le cas notamment de
l‘écorégion du littoral atlantique et plus particulièrement dans le Nord-Ouest qui présente un climat
humide, une pluviométrie élevée qui peut atteindre 850 mm/an, un hiver doux et des températures
estivales qui oscillent autour de 23°C.
Cette zone comprend de nombreuses zones humides répondant à la définition de la
Convention de Ramsar (Convention internationale relative aux zones humides d'importance
internationale) (1971), selon laquelle les zones humides correspondraient à "des marais, fagnes,
tourbières ou d'eaux naturelles ou artificielles, permanentes ou temporaires, où l'eau est stagnante ou
courante, douce, saumâtre ou salée, y compris des étendues d'eau marine dont la profondeur à marée
basse n'excède pas six mètres". Ce sont des écosystèmes de transition entre les milieux terrestres et
aquatiques qui offrent des conditions idéales pour les oiseaux migrateurs ou résidents et donc
l‘introduction ou le maintien du virus.
A noter qu‘en Tunisie, la distance au site Ramsar le plus proche était la variable explicative la
plus importante dans l‘apparition des cas de FWN (Baragouin et al., 2013).
Les autres zones ont des conditions moins favorables : les plateaux intérieurs ont un climat
aride à semi aride et une pluviométrie plus faible qui varie entre 250 à 500mm. Quant au pré Atlas et
l‘Atlas, l‘altitude varie entre 500 à 4165m et les écarts thermiques sont grands entre les saisons.
L‘augmentation de l‘altitude a été décrite comme ayant un effet négatif sur les moustiques (Bisanzio
et al., 2011)
Pour le littoral méditerranéen l‘altitude varie de 0 à 2000m et la pluviométrie varie entre 350
et 600 mm, l‘hiver est doux (9 à11°C) mais l‘été est sec et chaud (24 à 26°C).
94
Les données disponibles concernant les épidémies précédentes, l'association prouvée entre les
variables climatiques et l'apparition de FWN au Maroc et les résultats préliminaires de cette enquête
sérologique suggèrent que le risque de récidive de la maladie est plus élevé dans la partie nord de la
côte atlantique où les conditions sont adaptées pour la réintroduction ou la résurgence et la
propagation du VWN.
Les changements d‘attitude du VWN, notamment en virulence et en extension de l‘aire de
géographique, ont donné lieu à de nombreuses études visant la compréhension et la prédiction des
épidémies afin de mettre en œuvre des systèmes de surveillance efficients et adaptés.
Ainsi en Amérique du Nord, de nombreuses études de modélisation ont été menées pour la
compréhension, la prévision et l'évaluation des risques de transmission et / ou d‘émergence de la
FWN. Ces modèles sont soit statistiques (temps / espace) ou basés sur des calculs. Certains
s‘intéressent aux vecteurs et visent la prévision de la dynamique des populations de moustiques
(Chen, C et al., 2014) ou d'évaluer le risque d'infection à partir d'une piqûre de moustique dans un
espace donné (Baleghien, T et al ., 2006) . D‘autres études se basent sur la population cible et
l‘établissement de liens entre l‘incidence de la FWN et les données de température (Ward, M.P.,
2005 ; Zou, L et al.,2007) ou de simuler la circulation du FWN dans un système épidémiologique
(Bowman, C et al.,2005)(Wonham, M.J.; et al., 2004).
Les modèles mathématiques peuvent être utilisés pour améliorer la compréhension des
processus épidémiologiques impliqués, afin d'évaluer l‘impact des changements environnementaux
ou de tester l'efficacité des mesures de contrôle à l‘échelle marocaine.
Dés les années 1980, des modèles statistiques ont été développés pour prédire l‘occurrence
des épidémies de FVR dans la région des Dambos au Kenya. Ces modèles sont basés sur l‘indice
ENSO (El Nino Souhern Oscillation) reflétant les variations de la température de surface de l‘océan
indien, d‘autre part sur l‘NDVI qui révèle les conditions d‘humidité et de végétation favorables au
développement des populations de moustiques (Linthicium et al., 1999) ces indices dérivés d‘images
satellites à basse résolution permettent d‘établir des cartes de riques à l‘echelle de grandes régions.
L‘indice ENSO ayant une valeur prédictive de l‘intensité des pluies , il est alors possible de lancer
des alertes réélement précoces, antérieures à la circulation virale.
Cette proprièté est utilisée et relayée par des agences internationales, telles que la FAO, pour
déclencher dans les états concernés des mesures de surveillance et de prévention de la FVR comme
cela a ét le cas pour le Kenya en 2006 (Anymba et al.2006).
Ce pendant les modèles évoqués ci-dessus qui visent à expliquer et à prévoir la dynamique du
vecteur ne sont pas suffisemment aboutis pour être appliqués dans les conditions opérationnelles de
la surveillance.
La complexité de la maladie de la FWN rend nécessaire de réaliser les études intégrées afin de
prédire l‘occurrence des épidémies. Le comportement des moustiques demeure un déterminant
majeur qui façonne l‘épidémiologie des arboviroses. Le risque pour les hôtes accidentels dépend des
préférences des moustiques qui y vivent. Elle dépend également de la disponibilité de l‘hôte. La
disponibilité de ses derniers varie dans le temps en fonction d‘une dynamique saisonnière de chaque
espèce migratrice (Chevalier et al., 2004).
Il est primordial d‘intégrer simultanément la biodiversité de vecteurs, la biodiversité des
hôtes, la population et la dynamique de transmission dans l‘analyse des facteurs de risque.
95
Un système de surveillance des vecteurs, de la population de l‘oiseau, et du climat ainsi qu‘un
système d'alerte précoce sont essentiels pour détecter la circulation du virus et de prendre des
mesures de prévention pour limiter la propagation de la maladie à la population et aux animaux.
Ce système doit inclure une surveillance active humaine, vétérinaire (équidés et avifaune) et
entomologique afin de détecter de façon précoce une circulation du VWN. Ce dispositif qui implique
les acteurs de la santé humaine et animale (Ministère de la santé, l‘ONSSA, le Haut commissariat aux
Eaux et forêts).
La surveillance humaine est fondée sur le signalement de cas suspects d‘encéphalite, de
méningite, de polyradiculonévrite, et de paralysie flasque aiguë à VWN par les médecins praticiens.
La population cible est constituée de tout adulte (≥ 15 ans) hospitalisé dans ces zones entre le 1 er juin
et le 31 octobre, présentant un état fébrile (fièvre ≥ 38,5°C), des manifestations neurologiques et un
liquide céphalo-rachidien clair.
La surveillance vétérinaire est basée sur la detection de tous les cas cliniques d'encéphalites
équines et la déclaration obligatoire auprès des services vétérinaires compétents particulièrement
dans les zones à risque.
Les prélèvements biologiques doivent être adressés aux laboratoires vétérinaires de référence
de l‘ONSSA pour analyse et confirmation de l‘infection par les techniques sérologiques et
virologiques sur les serums ou les organes prélevés sur les nimaux décedes.
Une surveillance de l‘avifaune consistant d'une part, à détecter précocement une circulation
virale par la recherche de séroconversions sur des oiseaux sentinelles comme cela se fait dans de
nombreux pays tels que la France et la Tunisie et, d'autre part, à identifier sur l'ensemble du territoire
l'apparition de souches entraînant des mortalités d'oiseaux sauvages.
Le contrôle sérologique d‘oiseaux sentinelles revêt un intérêt particulier toute séroconversion
doit susciter une déclaration et une investigation approfondie.
96
La maladie de la FWN est une arbovirose commune à l'homme, le cheval et à de nombreux
vertébrés (mammifères, oiseaux etc.) qui a touché le Maroc en 1996, 2003 et 2010. Même si son
impact est réduit sur la santé dans le bassin méditerranéen par rapport à l‘Amérique du Nord, Cette
maladie suscite l‘inquiétude par les morbidités et mortalités qu‘elle occasionne ainsi que le
changement de son comportement durant les vingt dernières années avec notamment la première
détection du lineage 2 en Europe et une augmentation soudaine du nombre de foyers de maladies
neuroinvasives exprimées par des cas neurologiques humains ou équins.
L‘objectif de ce travail a été d‘une part d‘identifier les facteurs et processus épidémiologiques
expliquant l‘émergence de foyers de FWN au Maroc en mettant en œuvre une approche écoépidémiologique basée sur la recherche des variables environnementales et climatiques associées à
son apparition d‘une part et d‘autre part sur l‘évaluation de la situation épidémiologique par le biais
d‘une enquête de séroprévalence des anticorps dirigés contre le VWN chez les chevaux du pays.
Nous savons que l‘occurrence des épidémies dues à cette anthropozoonose est clairement liée
à l‘abondance des vecteurs, en particulier les moustiques du genre Culex (Komar, 2000). Ce sont des
arthropodes poïkilothermes très sensibles aux conditions de l‘environnement d‘où la large utilisation
des variables climatiques pour prédire leur distribution et leur abondance (Hay et al., 2006).
Nous savons aussi que la télédétection permet de délimiter les espaces pertinents pour repérer
les biotopes propices au développement des parasites rendant ainsi possible d‘analyser les facteurs
affectant la distribution et la survie de la population des moustiques qui conditionnent la survenue et
la diffusion de l‘infection, en présence d‘espèces d‘oiseaux jouant le rôle de réservoir.
Par conséquent nous avons mis à profit les données de la télédétection spatiale pour l‘étude de
l‘épidémiologie de la FWN au Maroc. Les facteurs pris en considération ont été la température par le
biais de la LST, la végétation révélée par l‘indice de végétation par différence normalisée (NDVI) et
la pluviométrie.
Une fois les foyers des épizooties localisés géographiquement, les données numériques ont été
structurées dans un système d‘information géographique (SIG) qui est un système de traitement
informatique comprenant des modules fonctionnels permettant de construire, de modifier,
d‘interroger de représenter cartographiquement, les bases de données, selon les critères sémantiques
et spatiaux.
Dans le cadre de ce travail nous sommes intéressés à la comparaison des ces indices entres les
années épizootiques (1996, 2003 et 2010) et des années non épizootiques. Les zones favorables à la
FWN ont été identifiées et représenteés sur carte.
Dans plusieurs études ces outils ont permis d‘élaborer un modèle prédictif qui peut servir à
cibler les zones d‘intervention des autorités sanitaires se présentant ainsi comme des outils d‘aide à la
décision.
Le NDVI est une mesure indirecte de la disponibilité de l'eau et il est l'indice de végétation le
plus couramment utilisé dans les études de santé. Il a été appliqué pour décrire la distribution du
VWN en Amérique du Nord (Rogers et al., 2002) ainsi que les valeurs de NDVI plus élevées ont été
associées à des cas humains groupés à New York (Brownstein et al., 2002). En outre, le NDVI a été
inclus comme variable explicative dans plusieurs modèles spatiaux épidémiologiques pour le FWN
au États-Unis (Ward al., 2007; Ward, 2009).
Cette étude a mis en évidence l‘association entre l‘indice de végétation ainsi que la
pluviométrie d‘une part et l‘occurrence de foyers de FWN au Maroc d‘autre part.
97
A notre connaissance c‘est la première fois que le lien épidémiologique entre les valeurs
NDVI et la transmission de la FWN chez des chevaux en 2003 et 2010 a été démontrée au Maroc.
Des études menées en Afrique de l‘Est sur la fièvre de la vallée du Rift, au Kenya plus
particulièrement, ont montré l‘existence d‘une relation entre abondance des pluies, pullulation des
moustiques et émergence de cette maladie, ce qui a permis la construction de modèles assez fiables,
reposant principalement sur les indices pluviométriques et l‘utilisation de la détection.
La relation entre la pluviométrie et le risque d'apparition de foyers épizootiques ou
épidémiques a été explorée dans de nombreuses études. L'utilisation de différents indices corrélés à la
pluviométrie, permettent de détecter ses variations, et pouvoir ainsi prévoir le risque d‘occurrence de
la maladie et prendre les mesures nécessaires pour la contrôler ou, du moins, diminuer son impact.
L‘ITCZ ou Indice de convergence de la zone intertropicale correspond au point de rencontre
des vents venant du Nord et de ceux venant du Sud. A partir d‘avril, il remonte vers le Nord jusqu‘au
18° ou 20° N, puis redescend vers le Sud à partir de juillet-août. Dans une zone donnée, l‘apparition,
l‘importance et la durée des pluies et du couvert nuageux correspondent à une certaine position de
l‘ITCZ. En Afrique de l‘Est (Kenya, Tanzanie, Zambie), les pluies sont liées à une remontée de
l‘ITCZ.
Le SOI (index Southern Oscillation) est l‘index le plus utilisé pour caractériser le phénomène
ENSO (El Niño Southern Oscillation), qui affecte principalement les pays situés au bord ou dans les
océans Pacifique et Indien (Glantz, 1991; Chagas et Puppi, 1986). Il compare les pressions
atmosphériques de Tahiti et de Darwin (Australie), qui se situent dans l‘océan Pacifique. Il s‘exprime
sous forme d‘une déviation standard par rapport à une moyenne calculée entre 1951 et 1980.
En Afrique de l‘Est, l‘apparition des épizooties de la FVR a très vite été reliée à la survenue
de pluies surabondantes (Linthicum al., 1983), et ce, en particulier lorsqu‘elles succèdent à des
périodes de sécheresse prolongées (Saluzzo, 1989). En 1930, au Kenya, on avait déjà remarqué que
l‘épizootie faisait suite à une saison des pluies particulièrement violente (Daubney al.,1931). A partir
de fin octobre 1997 jusqu‘en janvier 1998, des pluies torrentielles de 60 à 100 fois les moyennes
saisonnières sont tombées sur la majeure partie de l‘Afrique de l‘Est entraînant les plus importantes
inondations de la corne africaine depuis 1961. Une relation similaire entre pluies intenses et
apparition des épizooties a été rapportée en Afrique du Sud (MacIntosh al., 1980).
Dans la présente étude des pics élevés de la pluviométrie ont été observés dans les aires
impliquées dans la transmission de la FWN, Le nombre de jours avec des précipitations extrêmes
enregistrés entre juin à novembre est significativement élevé par rapport au reste de la décennie et un
nombre élevé de jours avec des précipitation extrêmes a été observé au cours du mois d‘août pour
2003 et au cours des mois de juin à juillet en 2010 juste quelques semaines avant l‘apparition des cas
cliniques de FWN.
L‘influence des précipitations sur la dynamique de la population des moustiques (donc sur la
transmission du VWN) est plus controversée et dépend, entre autres, des espèces de moustiques
considérées. La surface de l‘eau est déterminante dans le développement de la larve, ainsi de fortes
précipitations sont susceptibles d‘augmenter la surface de l'eau stagnante, défavorisant ainsi les
moustiques qui utilisent les sources d'eau permanentes, telles que Cx. hortensis. De fortes pluies
peuvent également diluer les nutriments pour les larves et diminuer ainsi le taux de développement
(Dieng, H et al., 2009).
D'un point de vue épidémiologique, Il a été démontré que la sécheresse peut favoriser la
transmission du VWN aux États-Unis car l'eau stagnante devient plus riche en nutriments.
98
La réduction de la surface d'eau peut augmenter la concentration d'oiseau autour des points
d'eau et augmenter ainsi le contact entre les hôtes et vecteurs (Epstein, P. et al., 2001; Shaman, J. et
al.,2005 ; Chase J. et al., 2003).
Concernant la température, les données de la télédétection obtenues à partir MODIS LST et
emissivity (MOD11A2) n‘ont révélé aucune différence significative entre les années de la décenie
2001 - 2010 dans les deux zones des épizooties de 2003 et 2010.
Eneffet, les analyses de données utilisant le logiciel R, Version 2.13.1 (R Développent Core
Team, 2011) n‘ont permis de trouver aucune différence entre la température moyenne enregistrée de
2001 à 2010 dans les deux zones. De même, les différences ne sont pas significatives entre les
nombres de jours nécessaires pour avoir des degrés-jours au-dessus du seuil inférieur dans les deux
aires d‘étude (Aire d‘étude 2003: χ² = 7.22, P = 0,611; Aire d‘étude 2010: χ² = 16.33, P = 0,06).
On sait toutefois qu‘une augmentation de la température entraine chez le vecteur un
métabolisme plus important et un plus grand taux de survie journalier (Mellor et Leake, 2000) de
même qu‘une baisse soudaine de température induit le phénomène de diapause d‘œufs de certaines
espèces de moustiques (MacHaffey, 1972) et que les données de la température ont été utilisées
comme facteur explicatif pour les épidémies de FWN enregistrés en 2002 dans la région du nord-est
des Etats Unis d‘Amérique et du Québec (El Adlouni et al., 2007).
Pour que ces associations épidémiologiques entre NDVI et pluviométrie soient utilisées au
Maroc à des fins prédictives et préventives une meilleure investigation est nécessaire, en tenant
compte non seulement de l‘apparition de la maladie chez les chevaux mais aussi de données plus
spécifiques sur la circulation du virus chez l‘homme, les oiseaux et les mammifères dans les zones
concernées.
Afin d‘avoir une meilleure idée sur la distribution spatio-temporelle de l‘infection. Nous
avons menés une enquête de séroprévalence chez les 870 chevaux appartenant à quatre zones
bioclimatiques différentes. Les données de l‘enquête de séroprévalence ont été représentées sur carte
et traitées géographiquement en utilisant le SIG.
Les méthodes de diagnostic de laboratoire qui ont été utilisées sont les tests ELISA capture
pour des IgM et ELISA de compétition pour les IgG ainsi que la séroneutralisation. Ces techniques
sont largement utilisées pour le diagnostic et la surveillance lors des récentes épidémies de FWN
dans le monde (Autorino GI et al., 2002, Murgue B et al., 2000).
L‘utilisation de l‘ELISA de compétition et la séroneutralisation a permis de détecter 268 cas
positifs par les deux techniques (30.08 IC95%=(27,83%, 33,95%)).
Cette prévalence reste importante , elle s‘approche de celle observée en Tunisie. En effet une
étude sérologique équine a indiqué que le taux de séroprévalence est de l‘ordre de 28% (Bargaoui al.,
2013), alors qu‘en Andalousie (Sud d‘Espagne), une étude similaire a confirmé la présence
d‘anticorps anti-VWN chez 7.1% des chevaux analysés (García-Bocanegra et al., 2012). Au Brésil, à
Pantanal, des signes sérologiques équins d‘infection par le VWN ont été estimé à 8% (Melandri et
al., 2012). Aussi, une étude récente en Iran a signalée 1.3% des cas humains et 2.8% cas équins
séropositifs pour le VWN (Chinikar S et al., 2013).
Entre mars et avril 2010, une enquête sérologique a été réalisée chez l‘homme au Maroc
révélant un taux de séroprévalence global de VWN estimé à 11.8% (EL Rhaffouli et al., 2012)
sachant que la prévalence était significativement plus élevée à la province de Kénitra (18.8%) qui est
une zone très humide suivie de la région de Rabat (12%) puis la province de Meknès (4.7%) .
99
Concernant les tests adoptés, les deux tests IgM et IgG ELISA semblent sensibles mais ils
donnent des réactions croisées avec les anticorps d'autres flavivirus. La séroneutralisation, plus
spécifique, a été utilisée avec succès comme un outil de diagnostic de l'infection par le VWN chez les
chevaux (Bunning et al., 2002 ; Ostlund et al., 2001).
Les 56 sérums positifs en ELISA IgG et ne présentant pas d‘anticorps séroneutralisants
suggèrent que cette différence des résultats entre les deux techniques peut être attribuée à la
sensibilité élevée de la technique ELISA par rapport à la neutralisation mais aussi à l‘existence d‘une
réaction croisée avec d‘autres Flavivirus.
Au Maroc, la circulation d‘autres flavivirus doit être envisagée. En effet en 2008, des
anticorps dirigés contre le virus USUTU ont été détectés chez 3 oiseaux sauvages capturés tels que
merles noirs (Turdus merulas), passereaux (Passer domesticus), Bouscarle de Cetti (Cettia cetti)
parmi 360 individus capturés dans la région de Kénitra près de la rivière Sebou (Figuerola J et al.,
2008) suggérant la circulation simultanée des deux virus.
Sur les 268 sérums positifs par séroneutralisation. 237 ont montré un titre supérieur ou égal à
1.5log DN50 soit 88.43% des échantillons positifs et 27,55 % de l‘effectif global testé. Ces titres
élevés peuvent être expliqués par une exposition prolongée et répétée au virus VWN qui circule de
façon endémique. Cette exposition a un effet de rappel qui permet d‘obtenir des titres élevés.
La détection de faibles titres d‘anticorps IgG neutralisants (0.9 et 0.78 log DN50) témoigne
probablement d‘une ancienne exposition aux antigènes du VWN ou à d‘autres flavivirus. Ces
anticorps tendent à diminuer progressivement avec le temps, (Zeller et al., 2004).
Comme dans toute étude épidémiologique des biais sont possibles telles que des biais de
sélection ou des biais de confusion. Dans cette étude la vaccination reste le principal biais qui peut
occasionner la distorsion des valeurs des prévalences.
Durant l‘épizootie de 2010, un vaccin recombinant a été utilisé dans certains élevages pour
endiguer l‘avancée de la maladie (données officielles sur le nombre de chevaux vaccinés non
disponibles). Ce vaccin commercialisé depuis 2004 sous le nom Recombitek equine VWN®
Merial™, est préparé à base d‘un vecteur recombinant qui est le poxvirus du canari sur lequel ont été
greffés des antigènes du VWN capables de stimuler une réponse immunitaire protective.
Il est très délicat de distinguer les anticorps vaccinaux des anticorps naturels. Cette distinction
pourrait se faire grâce à la détection des anticorps naturels dirigés spécifiquement contre la protéine
non structurelle NS1 associée à la réplication du génome. Chez les Flavivirus les protéines (prM,
NS1, NS3 et NS5) sont également identifiées comme antigéniques ainsi les protèines prM et NS3
peuvent être reconnues par des antisérums spécifiques de la souris et du cheval.
La protéine NS1 est glycosylée et exprimée à la surface des cellules infectées et peut être
également sécrétée. Les anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre la protéine NS1 ont
permis d‘identifier le type complexe et épitopes spécifiques des Flavivirus. Cette protéine joue un
rôle dans la conformation du virus. Elle a également été démontrée comme ayant des propriétés
antigéniques et a été utilisée comme antigène dans la technique ELISA (Castillo-Olivares et Wood
2004).
Les erreurs d‘interprétation des prévalences peuvent être aussi évitées par inclusion dans
l‘enquête d‘espèces de mammifères vivant dans les zones d‘intérêt qui n‘ont jamais été vaccinés et
qui sont exposées autant que les chevaux tels que les chiens, les ânes, mulets ou divers ruminants.
100
Alors que la détection des IgM permet de révéler une infection récente, aucun échantillon
parmi les 78 sérums testés par ELISA-IgM n‘a été positif. Or on sait qu‘après exposition aux
antigènes viraux l‘animal produit des anticorps IgM au bout de 8 à 10 jours post-infection, ils
persisteraient moins de 3 mois (Zeller et al. 2004). Donc aucune infection récente n‘a été détectée et
les chevaux objet de cette enquête, n‘ont pas été exposés au VWN au cours des 3 mois qui ont
précédé les prélèvements.ceci est dû probablement au fait que les prélèvements ont été effectués en
dehors de la période épizootique.
Les échantillons proviennent essentiellement de 4 zones bioclimatiques différentes à savoir le
littoral atlantique, Le littoral méditerranéen, les plaines intérieures, et l‘Atlas et le pré-Atlas. Chacune
une de ses régions est climatiquement différente en termes de température, d‘humidité, de végétation
...etc.
Les études épidémiologiques estiment que les variations géographiques influencent la
transmission du VWN en influençant l'abondance des oiseaux et des vecteurs compétents. La
répartition géographique des cas cliniques dépend aussi de la distibution spatiale des poulations
humaines et équines.. le SIG est un outil de choix qui permet d‘intégrer les données pertinentes telles
que l'abondance de moustiques, l'abondance des oiseaux sauvages et l'abondance des hôtes
accidentels et les superposer avec les données climatiques, les cas d‘infection observés afin
d‘élucider les associations épidémiologiques possibles..
Ainsi Les données de l‘enquête de séroprévalence ont été analysées pour comparer des taux
de séroprévalence dans les quatre régions (Littoral atlantique, la côte méditerranéenne, les plaines
intérieures et les zones montagneuses) moyennant une approche bayésienne à distribution ß (n +1, n-s
+1) puis représentées sur carte et traitées géographiquement en utilisant le logiciel SIG. Les résultats
confirment l'importance des conditions bioclimatiques dans la déclaration des foyers au Maroc.
La prévalence la plus élevée se situe dans la zone où les conditions bioclimatiques sont
optimales pour la survie du vecteur et la présence des oiseaux migrateurs. C‘est le cas notamment de
l‘écorégion du littoral atlantique et plus particulièrement dans le Nord-Ouest qui présente un climat
humide, une pluviométrie élevée qui peut atteindre 850 mm/an, un hiver doux et des températures
estivales qui oscillent autour de 23°C.
Cette zone comprend de nombreuses zones humides répondant à la définition de la
Convention de Ramsar (Convention internationale relative aux zones humides d'importance
internationale) (1971), Les zones humides correspondraient à des marais, fagnes, tourbières ou d'eaux
naturelles ou artificielles, permanentes ou temporaires, où l'eau est stagnante ou courante, douce,
saumâtre ou salée, y compris des étendues d'eau marine dont la profondeur à marée basse n'excède
pas six mètres. Ce sont des écosystèmes de transition entre les milieux terrestres et aquatiques qui
offrent des conditions idéales pour les oiseaux migrateurs ou résidents et donc l‘introduction ou le
maintien du virus.
A noter qu‘en Tunisie, la distance par rapport au site Ramsar le plus proche fût utilisée
comme la variable explicative la plus importante dans l‘apparition des cas de FWN (Baragouin et al.,
2013).
Les autres zones ont des conditions moins favorables : les plateaux intérieurs ont un climat
aride à semi aride et une pluviométrie plus faible qui varie entre 250 à 500 mm. Quant au pré Atlas et
l‘Atlas, l‘altitude varie entre 500 à 4165m et les écarts thermiques sont grands entre les saisons.
L‘augmentation de l‘altitude a été décrite comme ayant un effet négatif sur les moustiques (Bisanzio
et al., 2011)
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Pour le littoral méditerranéen, l‘altitude varie de 0 à 2000 m et la pluviométrie varie entre
350 et 600 mm, l‘hiver est doux (9 à11°C) mais l‘été est sec et chaud (24 à 26°C).
Les données disponibles concernant les épidémies précédentes, l'association prouvée entre les
variables climatiques et l'apparition de FWN au Maroc et les résultats préliminaires de cette enquête
sérologique suggèrent que le risque de récidive de la maladie est plus élevé dans la partie nord de la
côte atlantique où les conditions sont adaptées pour la réintroduction ou la résurgence et la
propagation du VWN.
Les changements d‘attitude du VWN, notamment en virulence et en extension de l‘aire de
géographique, ont donné lieu à de nombreuses études visant la compréhension et la prédiction des
épidémies afin de mettre en œuvre des systèmes de surveillance efficients et adaptés.
Ainsi en Amérique du Nord, de nombreuses études de modélisation ont été menées pour la
compréhension, la prévision et l'évaluation des risques de transmission et / ou d‘émergence de la
FWN. Ces modèles sont soit statistiques (temps/espace) ou basés sur des calculs. Certains
s‘intéressent aux vecteurs et visent la prévision de la dynamique des populations de moustiques
(Chen, C et al., 2014) ou d'évaluer le risque d'infection à partir d'une piqûre de moustique dans un
espace donné (Baleghien, T et al ., 2006) . D‘autres études se basent sur la population cible et
l‘établissement de liens entre l‘incidence de la FWN et les données de température (Ward, M.P.,
2005 ; Zou, L et al.,2007) ou de simuler la circulation du FWN dans un système épidémiologique
(Bowman, C et al.,2005 ; Wonham, M.J.; et al., 2004).
Les modèles mathématiques peuvent être utilisés pour améliorer la compréhension des
processus épidémiologiques impliqués, afin d'évaluer l‘impact des changements environnementaux
ou de tester l'efficacité des mesures de contrôle à l‘échelle marocaine.
Dés les années 1980, des modèles statistiques ont été développés pour prédire l‘occurrence
des épidémies de FVR dans la région des Dambos au Kenya. Ces modèles sont basés sur l‘indice
ENSO (El Nino Souhern Oscillation) reflétant les variations de la température de surface de l‘océan
Indien, d‘autre part sur l‘NDVI qui révèle les conditions d‘humidité et de végétation favorables au
développement des populations de moustiques (Linthicium et al., 1999) ces indices dérivés d‘images
satellites à basse résolution permettent d‘établir des cartes de riques à l‘echelle de grandes régions.
L‘indice ENSO ayant une valeur prédictive de l‘intensité des pluies , il est alors possible de lancer
des alertes réélement précoces, antérieures à la circulation virale.
Cette proprièté est utilisée et relayée par des agences internationales, telles que la FAO, pour
déclencher dans les états concernés des mesures de surveillance et de prévention de la FVR comme
cela a ét le cas pour le Kenya en 2006 (Anymba et al., 2006).
Ce pendant les modèles évoqués ci-dessus qui visent à expliquer et à prévoir la dynamique du
vecteur ne sont pas suffisemment aboutis pour être appliqués dans les conditions opérationnelles de
la surveillance.
La complexité de la maladie de la FWN rend nécessaire de réaliser les études intégrées afin de
prédire l‘occurrence des épidémies. Le comportement des moustiques demeure un déterminant
majeur qui façonne l‘épidémiologie des arboviroses. Le risque pour les hôtes accidentels dépend des
préférences des moustiques qui y vivent. Elle dépend également de la disponibilité de l‘hôte. La
disponibilité de ses derniers varie dans le temps en fonction d‘une dynamique saisonnière de chaque
espèce migratrice (Chevalier et al., 2004).
Il est primordial d‘intégrer simultanément la biodiversité de vecteurs, la biodiversité des
hôtes, la population et la dynamique de transmission dans l‘analyse des facteurs de risque.
102
Un système d'alerte précoce doit inclure un système de surveillance des vecteurs, de la
population des‘oiseaux, et du climat ainsi que la démonitorig de la circulation du virus .Il permettera
de de prendre des mesures de prévention pour limiter la propagation de la maladie au sein des
populations humaines et animales.
Ce système doit inclure une surveillance active de la santé humaine et la santé vétérinaire
(équidés et avifaune) et une surveillance entomologique afin de détecter de façon précoce une
circulation du VWN. Ce dispositif implique les acteurs de la santé humaine et animale (Ministère de
la santé, l‘ONSSA et le Haut commissariat aux Eaux et forêts).
Chez l‘Homme la surveillance sanitaire est fondée sur le signalement de cas suspects
d‘encéphalite, de méningite, de polyradiculonévrite, et de paralysie flasque aiguë à VWN par les
laboratoires agrées et dans les milieux hospitaliers. La population cible est constituée de tout adulte
(≥ 15 ans) hospitalisé dans ces zones entre le 1er juin et le 31 octobre, présentant un état fébrile
(fièvre ≥ 38,5°C), des manifestations neurologiques et un liquide céphalo-rachidien clair.
Chez l‘animal, la surveillance vétérinaire s‘interessera aux cas cliniques d'encéphalites et
d‘encéphalomyètite équines ou de maladies neuroinvasives et la déclaration obligatoire des cas de
FWN sur l'ensemble du territoire par les vétérinaires du secteur privé et du secteur public aux
autorités vétérinaires compétentes.
Les prélèvements biologiques sur des animaux vivants ou morts doivent être adressés aux
laboratoires vétérinaires de référence pour confirmation aux laboratoires de référence de l‘ONSSA
pour analyse virologique sur encéphales.
Une surveillance de l‘avifaune comporte d'une part, la détection précoce de la circulation
virale par la recherche de séroconversions sur des oiseaux sentinelles comme cela se fait dans de
nombreux pays tels que la France et la Tunisie et, d'autre part, l‘observation sur l'ensemble du
territoire l'apparition de souches entraînant des mortalités inhabituelles d'oiseaux sauvages.
Le contrôle sérologique d‘oiseaux sentinelles revêt un intérêt particulier toute séroconversion
doit susciter une déclaration et une investigation approfondie.
103
CHAPITRE V :
CONCLUSION GENERALE
ET PERSPECTIVES
104
La FWN est une zoonose dont l‘épidémiologie est complexe. Elle implique un très grand
nombre d‘espèces animales, à la fois domestiques et sauvages, invertébrées et vertébrées, oiseaux,
reptiles et mammifères.
L‘apparition de foyers épidémiques et/ou épizootiques demeure difficilement prévisible en
raison de la complexité des facteurs d‘émergence/réémergence du VWN. Ces facteurs sont
principalement liés à l‘écosystème.et conditionnent l‘interaction vecteur/avifaune . Des facteurs tels
que des espèces animales présentes (autochtones ou de passage), la nature géologique et végétale du
site et les conditions météorologiques etc. sont d‘une importance capitale dans l‘épidémiologie de la
maladie. A cela s‘ajoutent des facteurs déterminants liés au virus (virulence de la souche circulante)
et au statut immunologique des populations infectées.
Cette étude a permis de démontrer clairment le lien entre les variables climatiques telles que
la pluviométrie et l‘indice de végétation par différence normalisée et l‘occurrence des foyers de FWN
au Maroc. Ce qui peut constituer un outil d‘alerte précoce dans la prévention de cette arbovirose.
Par ailleurs selon les résultats préliminaires de cette enquête sérologique la prévalence
trouvée chez les chevaux testés est de 30.80%, IC95% = (27,83%, 33,95%). Les chevaux ont été
testés positifs pour les anticorps IgG dirigés contre le VWN. Dans la majorité des sérums positifs
(237 sur 268 sérums (88,43 %)) les titres neutralisants étaient supérieurs ou égaux à 1.5log.
Les sérums testés par ELISA IgM se sont avérés tous négatifs. Ce qui est en faveur d‘une
ancienne exposition aux antigènes du VWN.
D‘un point de vue bioclimatique les localités du littoral atlantique ont la plus forte prévalence
en particulier au Nord, suivi par les autres régions qui ne présentent pas de différences statistiques
entre elles: la prévalence de la zone bioclimatique du littoral atlantique est de 45,83%,
IC95%=(40,58%, 51,18%), celle des plaines intérieures est de 23,30%, IC95%=(19,19%-27,99%)
celle du littoral méditerranéen est de 18,97% , IC95%=(12,89%-27,07%) et enfin celle de la région
de l‘Atlas et du pré- Atlas est de 15,15% , IC95%=(8,49%-25,74%).
Les données disponibles concernant les épidémies précédentes, l'association prouvée entre les
variables climatiques et l'apparition de FWN au Maroc et les résultats préliminaires de cette enquête
sérologique suggèrent que le risque de récidive de la maladie est plus élevé dans la partie nord de la
côte atlantique où les conditions sont adaptées pour la réintroduction ou la résurgence et la
propagation du VWN.
Par conséquent, un système de surveillance des vecteurs, des oiseaux migrateurs et résidents,
associé à l‘intégration des données climatiques comme la couverture végétale et la pluviométrie
devrait être mis en œuvre dans le domaine de la lutte contre cette zoonose. Un système d'alerte
précoce pour détecter la circulation du virus permet de prendre des mesures de prévention pour
limiter la propagation de la maladie aux humains et aux animaux.
105
Parmi les perspectives de cette étude, on peut citer l‘utilisation des facteurs bioclimatiques
comme facteurs explicatifs pour l‘occurrence d‘autres maladies vectorielles sur le territoire marocain.
A titre d‘exemple on peut citer la fièvre catarrhale des petits ruminants qui est une maladie virale non
contagieuse, transmise par des moucherons piqueurs du genre Culicoides (famille
des Ceratopogonidae) dont l‘impact économique est important dans les élevages de l‘Afrique du
Nord.
Les méthodes d'analyse de l'influence de paramètres climatiques sur les pathosystèmes
peuvent être améliorées par des relevés agrométéorologiques issus des mesures directes ou indirectes
d‘un réseau de capteurs répartis sur l‘ensemble du territoire.
La recherche d‘autres flavivirus est souhaitable dans les zones d‘activité des moustiques et ce
notament au nord ouest du littoral atlantique. Cela sera possible par la mise au point des test de
laboratoire conformes au recommandations de L‘OIE.
Par ailleurs, devant la complexité de l‘épidémiologie de la FWN, l‘application de la
modélisation dans les conditions marocaines permettra certainement d‘aboutir à la conception des
outils de prévision épidémiologiques et d‘alerte précoce . Ces modèles descriptifs, explicatifs ou
prédictifs simulent les phénomènes épidémiologiques réels comme la simulation de la dynamique de
transmission et l‘interaction vis-à-vis de l‘homme et l‘animal sur un territoire donné.
De même que, l‘approche stochastique qui fait appel au calcul stochastique ( étude des
phénomènes aléatoires dépendant du temps) semble puissante dans sa capacité à simuler une situation
complexe comme l‘estimation d‘une probabilité de survenue d‘une maladie .
106
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Manuscript
Title: WEST NILE DISEASE EPIDEMIOLOGY IN NORTHWEST AFRICA: Bibliographical
review
Running title: WEST NILE DISEASE IN NORTHWEST AFRICA
Authors: Benjelloun Abdennasser1, 2, El Harrak Mehdi3, Belkadi Bouchra1*
(*) Corresponding author : Pr. BELKADI Bouchra, Laboratoire de Microbiologie et Biologie
Moléculaire, Faculté des Sciences, Université Mohammed V Agdal, B.P. 1014, Rabat, Maroc Tel et
Fax: 00212537775461 GSM: 00212672069814 Email: [email protected]
Authors informations :
1
Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, Faculty of Science, University Mohammed V
BP 1014 Rabat Morocco
² Poste de Commandement Central de Lutte Contre La Grippe Aviaire, Route de Zaer, BP 5039,
Rabat, Morocco
3 Société de Produits biologiques et pharmaceutiques vétérinaires (Biopharma), Rabat, Morocco, Av.
Hassan II, 10100 Rabat, Morocco
Author e-mails:
Benjelloun Abdennasser: [email protected], El Harrak Mehdi
:[email protected], Belkadi Bouchra :[email protected].
127
Place of the work
This work has been done in the University Mohammed V, Science Faculty, Rabat, Morocco.
________________________________________________________________________________
SUMMARY
West Nile fever (WNF) or West Nile disease (WND) is a mosquito-borne viral disease that
can affect birds, humans and horses. West Nile virus (WNV) is a member of the genus Flavivirus in
the family Flaviviridae. WNV is maintained in a mosquito–bird–mosquito transmission cycle,
whereas humans and horses are considered dead end hosts. In human and horses symptoms range
from unapparent infection, to mild febrile illness, meningitis, encephalitis, or death.
Birds were considered as asymptomatic carriers of WNV until the WNV responsible for the
U.S. outbreak (NY99) caused huge mortality in birds during 1999 outbreaks. (Petersen and Roehrig,
2001).
WNV has a wide geographical range that includes portions of Europe, Asia, Africa, Australia
(Kunjin virus) and in North, Central and South America. Migratory birds are thought to be primarily
responsible for virus dispersal, including reintroduction of WNV from endemic areas into regions
that experience sporadic outbreaks (Burke and Monath, 2001).
The occurrence of disease in humans and animals along with birds and mosquitoes
surveillance for WNV activity demonstrate that the virus range has dramatically expanded including
North, Central and South America as well as Europe and countries facing the Mediterranean Basin.
WND infection in humans have been reported in Morocco in 1996 (El Harrak et al., 1997), in
Tunisia in 2007(Murgue et al., 2001)(Triki et al., 2001) and 2003 (Bargaoui, 2012) and in Algeria in
1994 (Pradier et al., 2012) . Outbreaks of equine encephalitis have been also reported in Morocco in
1996 (Tber, 1996), in 2003 (Schuffenecker et al., 2003) and in 2010 (WAHID, 2010). Serologic
evidence of WNV has been demonstrated in the three countries in many species.
The aim of this review is to assess the epidemiological situation of WND in Northwest Africa
comprising Morocco, Algeria, and Tunisia, with an updated literature review based on of human
cases and equine outbreaks reports as well as serological studies in these countries.
Keywords: North Africa, Horse, Human, Morocco, Tunisia, Algeria, West Nile Virus.
128
INTRODUCTION
West Nile virus is a flavivirus belonging to the Flaviviridae family and to the Japanese
encephalitis sero-complex, which contains a number of viruses also associated to human encephalitis
(Petersen and Roehrig, 2001). It is commonly found in Africa, Europe, the Middle East, North
America and West Asia. It is maintained in nature by a cycle involving transmission between birds
and mosquitoes.
In the vector insect, the virus follows a cycle of intrinsic development. The air temperature
has a great influence on the speed of the cycle as well as on female survival and also the duration of
the transmission period.
When local ecological conditions are suitable for virus amplification the Infection of humans
and horses can occur and other mammals can also be infected during the blood meals. There has been
confirmed transmission of WNV in humans by blood transfusion, organ transfer and breast milk, but
most human infections occur by natural transmission from mosquitoes.(OIE. 2013)
Horses, just like humans, are ―dead-end‖ hosts, meaning that while they become infected,
they do not spread the infection. Clinical signs in equines are fever, weakness, locomotor
dysfunction, ataxia and blindness. In the most severe cases paraplegia occurs and evolves in 5 to 10
days to death.
In most humans, WNV infection is sub-clinical, but approximately 20%–40% of those
infected may develop symptoms of WNV disease ranging from West Nile fever (fever, headache,
malaise, lymphadenopathy, myalgia, fatigue, skin rash, diarrhea, and vomiting) to meningoencephalitis (muscle weakness, tremors, paralysis, and cognitive impairment) or flaccid paralysis (a
polio-like syndrome), and, less frequently, death (Lindsey et al. 2010).
Hepatitis, pancreatitis, and myocarditis have also infrequently been described to occur
(Kramer et al. 2007). In addition, long-term squealae, including weakness, persistent movement
disorders, and cognitive deficits, frequently occurring in patients that have suffered from West Nile
neuro-invasive disease (Cao et al.2005, Sejvar, 2014).
Although inactivated and recombinant vaccines are available for animal use, no vaccines or
antiviral therapies are currently approved for humans (De Filette, 2012).
WND infection has been reported in Morocco, Tunisia and Algeria. Serologic evidence of
WND has been found in the three countries during last decades in both species but outbreaks of
equine encephalitis due to WNV have been reported only in Morocco while in Algeria and Tunisia
epidemics in humans without any apparent clinical cases in horses were observed.
Virus isolation
WNV was first isolated in North Africa in Algeria in 1968, from a pool of 215 mosquitoes of
the genus Culex in the region of Djanet in Illizi‘s province (extreme southeast of Algeria) as part of
an investigation on African Horse Sickness outbreaks that occurred in 1965. (Pilo et al., 1970).
129
The virus was also isolated for the first time in 1996 in Morocco from a horse‘s brain tissue
(El Harrak et al.,1997) that died when unusual disease appeared in horses living in the Atlantic
coastal area northwest of the country as reported by veterinary services. The West Nile virus strains
circulating in Morocco are closely related to other Western Mediterranean strains and are
characterized by high virulence in horses. The genome analysis of the WNV strains isolated in
Morocco showed that they belong to WNV Lignage1, Clade 1a (Zientara et al., 2009).
Phylogenetic analyses showed also that WNV Morocco/96 strain was very similar to
mosquitoes WNV Senegal/93 strain and equids France/2000 strain, (Schuffenecker et al., 2003).
One year later in Tunisia, in 1997, WNV was isolated in humans during a meningoencephalitis epidemic and the strain belonged also to lineage 1 but was very close to the virulent
strains isolated in Israel in 1998 and in New York in 1999 (Bahri et al., 2010).
In 2003, the WNV strain isolated in equids in Morocco during an outbreak proved to be far
more pathogenic than other Western Mediterranean viruses (Sotelo et al., 2009, Sotelo et al., 2011).
However no human meningo-encephalitis caused by equine WN/2003 was reported.
In the three countries, all the WNV isolated strains belong to the
European/Mediterranean/Kenyan cluster, which are characterized by moderate pathogenicity for
horses and humans and limited or no pathogenicity for birds (Calistri et al., 2010). This is not the
case for the strains grouped in the Israeli /American cluster which are characterized by high rate of
avian deaths and, in the United States by high rates of morbidity and mortality in humans and horses.
(Calistri et al., 2010).
WND In humans:
Despite the virus isolation from the vector in 1968 (Pilo et al., 1970) in mosquitoes in
Algeria, and serologic evidence found in humans (1973-1975-1976) and in animals (1975) in the
region WND, clinical cases were never reported in humans in Northwest Africa until 1994
(Metallaoui, 2008) (Table 1).
During this year an outbreak was reported in the South of Algeria (Timimoun, Adrar
province), where about 50 suspect cases including 8 deaths were reported (Murgue et al., 2001). The
patients had a high fever associated with neurological signs and other symptoms, sometimes
presenting additionally a comatose state. Among 18 samples collected, 83,3 % were positive
(Pradier et al., 2012). However, the virus could not be isolated.
In Morocco, 1 fatal case was notified during 1996 WND outbreak, and a year later, during the
autumn 1997, Tunisa reported human epidemics of meningo-encephalitis caused by WNV, 173 cases,
with 8 deaths were observed. Cases were reported in South Eastern Tunisia (Sfax and Mehdia)
(Murgue et al., 2001).In 2003, another epidemic re-occurred, mostly in the same areas but also in
other localities, WND was confirmed in 31 cases from 94 suspected cases. No virus isolated or
characterized by molecular analyzes and no animal cases declared. (Bargaoui, 2012)
In October 2010, WND was diagnosed in 2 children from Jendouba region (Northern TunisiaAlgeria border) and in October 2011 WND was diagnosed in 3 women aged 61, 70 and 77 years in
Kébili, (South of Tunisia) in the region of the oasis located near Al Chott Eljerrid (ONMNE, 2012)
130
In 2011, evidence of human infection in Morocco was confirmed serologically by the
detection of WND neutralizing bodies in 59 (p=11.8%) among 499 healthy persons living in the
vicinities of Meknes, Rabat and Kénitra cities (center and northwest) (EL Rhaffouli et al., 2012).
The prevalence varied between 4.7-28% depending on the distance from the coastline.
In 2012, from July, through to December 21, the surveillance of West Nile Virus Infections in
Tunisia (ONMNE, 2012) demonstrated the disease in 86 confirmed cases with neurological forms
and the death of 12 persons. In the same time one confirmed clinical case was reported in Algeria
(Episouth, 2012).
Table 1: Reports of WND infection in humans in Northwest Africa
Morocco
Algeria
Country
Year
1965
(Metallaoui, 2008)
1973
(Metallaoui, 2008)
1975
(Metallaoui, 2008)
1976
(Metallaoui, 2008)
1994 *
(Pradier et al., 2012)
In 2012 *
(Episouth, 2012)
1996
(El Harrak et al., 1997)
2011
(EL Rhaffouli et al., 2012)
Tunisia
1968
(Haddad, 1980)
1970‘s
(Bargaoui, 2102)
1997* (Murgue et al., 2001) (Triki et
al.,2001)
2003 *(Bargaoui, 2012)
2007 (Bargaoui, 2012)
2010 (Bargaoui, 2012)
2011 (Bargaoui,2012)
2012 , (ONMNE, 2012)
Area
Tested
Results
N=281
P=0%
Djanet (Illizi)
171
P=14,6%
Illizi et Djanet (Illizi)
Tamanrasset
Biskra
Ouled Djellal (Wilaya of Biskra)
48
143
24
21
P=58.3%
P=3.5 %
P=3,5%
19%
Timimoune (Adrar)
18
P=83,3%
Jijel (littoral between Alger et Annaba)
1 case
1 case
Gharb region (Northwest)
1 case
1 case
Rabat
Kénitra
Meknès
200
149
150
24 (12%)
28 (18.8%)
7 (4.7%)
Different regions
705
1,80%
Jerba
Tunis
Gabes
Other regions
1094
205
85
22
129
3.8%
7.8%
7%
9.0%
111 cases
(87%)
31
Northern Algeria
Sfax,Mahdia and Other region
Monastir, Mahdia, Sfax et Gabès
Kairaouan
Bizerte
Sfax
Jendouba (North)
Kébili (South)
Monastir, Kébili Jendouba , Bizerte
Tozeur, Kairouan, Nabeul Sousse,
Gabes Mahdia, Sfax Sidi Bouzid,
Medenine
* Meningo-encephalitis epidemic
131
94
2
3
86
confirmed
cases
27.7%
0.7%
7.5%
2 cases
3
86 confirmed
12 deaths
WND in horses
Equine encephalitis caused by WNV In North Africa , was reported In 1996 in Morocco in
Benslimane region (center) and the infection spread to neighboring cities (in the central and North
western regions) (Tber, 1996), where 42 horses and one person died. After an apparent
epidemiological silence, WND re-occurred in Morocco in 2003(Schuffenecker et al., 2003) when 9
equine cases (with 5 deaths) were detected. Equine clinical cases were reported from three locations
(Ouled Slama, Ameur Seflia, Mograne) 20 to 30 km northeast of Kénitra (center) close to the Sebou
River delta and the Atlantic Ocean.In 2010, in central and northwestern part of the country in
Benslimane, Khémisset, Mohammedia and Casablanca provinces, WND were confirmed in 17
horses, within 111 suspected cases (with 8 deaths) (WAHID, 2010).
Neither in Algeria nor Tunisia clinical cases in equids were reported. Instead, many
serosurveys on equids and other mammals demonstrate WNV circulation in these countries. (Table
2)
Table 2: Reports of WND infection in Equids in Northwest Africa
Morocco
Algeria
Country
Year
Aera
Tested /Case
Confirmed
1975
(Metallaoui. 2008)
Djanet (Southeast)
Donkeys (n=52)
p=96,6%
1996 *
(Tber, 1996)
Benslimane
(Center)
Gharb region
(Northwest)
Horses
42 deaths
Horses, donkeys,
mules (n=1200)
63% horses
44% donkeys
37% mules
2003*
(Schuffenecker et al., 2003)
Gharb region
(Northwest)
9 equine cases
9 equines
5 deaths
2010 *
(WAHID, 2010)
Benslimane,
Khémisset,
Mohammedia and
Casablanca provinces
(Center and
northwest)
Benslimane,
Khémisset and other
regions
Different regions-
Horses : 111 cases
confirmed in 17
horses
8 deaths
Horses (n=840)
248 positive
p=29.52 %
Donkeys (n= 205),
horses (n=296), and
mules (n=55)
Horses, donkeys,
mules. (n=269)
2 positive
2011
(Benjelloun et al., 2012)
1980
(Haddad et al., 1980)
Gabes, Sfax, Mahdia,
Mounastir, Nabeul
and Bizerte
2007
(Boubaker, 2008)
2008
(Ben Hassine et al., 2011)
Mounastir, Sfax
equids (n=127)
Bizerte, Jendouba and
El Kef(North-west)
133 equids (n=133) :
Donkeys (n=93) ,
horses (n=23) , mules
(n=17)
Tunisia
2005
(Bargaoui et al., 2012)
(*) Outbreaks
132
86 positive
p=25% / Horses
p=37 % /
(Donkeys,
mules)
30% positive
36 positive
(p=27.1%).
WND evidence in other animals
As many reports have suggested that several species of wild mammals are commonly exposed
to WNV, occasionally with high associated sero-prevalence rates, some studies concerning small
animals were carried out in the region.
In 1976 haemagglutination -inhibiting antibodies against West Nile virus were detected in
19.8 % of 156 small animals‘s sera, mainly from Mus spp., Rattus rattus, Eliomys tunetae in the
northern part of Tunisia and from Ctenodactylus gundi and Pipistrellus kuhli in the south (Chastel et
al., 1977).
Small wild mammals (rodents, insectivora) trapped in Northern Morocco in March 1979, were found
positive to West Nile: 0.8% (n = 128) (Chastel et al., 1982).
In 2008, The circulation of West Nile virus has been reported in wild birds in Morocco , northeast
Kénitra city, and in particular individuals of Black birds (Turdus merulas), Sparrows (Passer
domesticus) and Cetti‘s warbler (Cettia cetti) (Figuerola et al., 2008).
In Tunisia, in 2011, investigations on migratory birds captured during migration period and on
domestic fowl (Gallus gallus domesticus) living in areas frequented by wild birds, showed that the
seroprevalence of antibodies against WNV in birds was 50% (n = 4), for the gazette egret (Egretta
garzetta), 40% (n = 25) for the greylag goose (Anser anser), 25% (n = 4) for moorhen (Gallinula
chloropus, 33% (n = 3) for avocet (Recursivostra avosetta), 6% (n = 17) for mallard (Anas
plathyrhyncus), 41% (n = 75) in the domestic fowl (Gallus gallus domesticus) and 27% (n = 11) in
the starling (Sturnus vugaris).(Bargaoui, 2012)
A serological survey on camels in South Morocco was conducted on 1344 sera, over two
different time spans (2003 and 2009) and across different sites of South Morocco, proved that out of
556 tested sera taken in 2003 and 788 sera taken in 2009, the sero-prevalence was respectively 10%
and 13.6 % .(Touil et al., 2012).
Fig 1: WNV circulation in Morocco, Algeria and Tunisia
133
DISCUSSION
The data collected on the WND in North West Africa on clinical cases of meningoencephalitis due to WND in humans in Algeria (1994), Morocco (1996) and Tunisia (1997, 2003,
2012), the outbreaks of WND in horses Morocco (1996, 2003 and 2010), and the serologic evidence
found in humans, equids and other species, suggest that WNV is endemic in Northwest Africa.
(Table 3)The presence of the virus may be the result of the introduction by migratory birds or an
endemisation resulting of overwintering cycles in local birds and mosquitoes during the winter
season (Monaco, 2011).
Furthermore, the studied area is situated along major migratory flyways and the role of
migratory birds in relation with the introduction of virus in Europe and Mediterranean Basin was
clearly assessed by numerous studies (Calistri et al., 2010).
Even though the five sixths (5/6) of this region is covered by the desert, a coastal plain exists
delimited and demarcated by a large mountain range (Tell in Algeria, Atlas in Morocco) .Thus the
existence natural and artificial inland wetlands, are favorable to the concentration and confluence of
different species around water points increasing, as a consequence, the contact and between WND
vectors and hosts putting human populations and animals at greatest risk of acquiring this arboviral
disease.
These countries have favorable conditions for maintaining the WND transmission cycle such
as environmental factors, and climatic conditions (Rogers and Randolph, 2006). Those conditions
sustain virus circulation, and when the density of vector mosquitoes is enhanced and sensitive hosts
are available, outbreaks are observed.
Triggering factors for WND outbreaks in the Morocco were explored by the analysis of climatic and
environmental variables such as normalised difference vegetation index (NDVI) , precipitation and
land surface temperature by Calistri et al., (2013). NDVI and precipitation values recorded during
epidemic years (2003 and 2010) proved to be significantly higherthan those observed during the
years with no WND cases in Morocco (Calistri et al., 2013)
Table 3: Comparison of West Nile infection between Algeria, Morocco and Tunisia
Virus Isolation
Human confirmed Cases
Equid Outbreaks
Serologic evidence
Humans
Equids
Camels
Birds
Small mammals
Algeria
Morocco
Tunisia
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
We note that the recursive infection is cyclical notably in Morocco where the outbreaks
occurred in seven years interval since 1996. This is probably due to a decline in the general immunity
134
among the equids population when renewed by non-immunized individuals unable to fight against a
reintroduced virus by migratory birds.
We also see that there are differences between these three countries in reporting infections
caused by WNV. While Morocco has experienced outbreaks of WND in equids and no meningoencephalitis epidemics in humans have been reported , in Algeria and Tunisia it is exactly the
opposite that is observed: In these two countries human‘s meningo-encephalitis epidemics with
mortality have been reported but no outbreaks of WND in equids.(Table 3)
Two hypotheses can be proposed to explain this difference. The first one is that the virus‘s
strains circulating in these countries may have different patterns, in terms of sensitive species and
clinical expression of the disease.
Phylogeography can support this hypothesis because there are genetic and phenotypic
differences between the circulating serotypes in the region witch all belong to lineage 1 Clade a. For
example, the Moroccan isolate (96-111) is contained in cluster 2 and more precisely in the
Mediterranean subtype grouping isolates from France, Portugal and Italy while the Tunisian isolate
(PaH001) of 1997 belongs to the cluster 4 which contains all the isolates from Americas, Israel
(1998) and Hungry (2003). However the Tunisian isolate diverged by amino acid substitutions (May
et al.,, 2011) and differentiated from all the remaining isolates in this cluster associated with avian
mortality.
The paucity of isolates from North Africa makes it difficultto refinethis hypothesis and leads
to a second more plausible hypothesis according to which WND is under-reported or underdiagnosed in humans and in horses. This may be due to the non specific symptoms of the infection or
the lack of an effective surveillance system implementation in these countries. This assumption is
supported by the serologically high prevalence reported by many serological surveys conducted in
both human and animals.
Otherwise conclusions of this bibliographical review may be influenced by a bias due to the
fact that the large majority of the reported studies are ELISA based with no WNV specific
neutralization assay raising the risk of false positive due an immune response raised against other
eventual circulating flaviviruses.
CONCLUSION
WNV is endemic in Northwest Africa countries. Its circulation is permanent and is probably
accentuated by the reintroduction by migratory birds.
Although cases are mostly human in Algeria and Tunisia, as opposed to the prevalence in
horses in Morocco being the situation, it is likely that the virus circulates in both species without
distinction as evidenced by serology. This infection is cyclical and is probably dependent upon the
immune status of the population, the abundance of the vector, the availability of amplifying hosts and
climatic factors.
This viral circulation requires further investigation including the possible viral persistence in
some hosts and vectors, the identification of mosquito species responsible for the infection of birds
and mammals, the role of other vectors in the maintenance of infection such as ticks, the identifying
135
of the species of resident or migratory species birds involved in the introduction and reintroduction of
the disease etc.
Wetlands should be thoroughly monitored and any abnormal nearby mortality in wild or
resident birds investigated, as should the occurrence of outbreaks in horses and epidemics of
meningo-encephalitis in humans.
A regional and an international collaboration would certainly improve the knowledge of the
dynamic of viral circulation and other aspects of the disease in the region. Understanding WND
epidemiology in the area will certainly contribute to prevent the re-occurrence of the infection among
humans and animals.
Acknowledgements
This study was supported by the University Mohammed V, Science Faculty Rabat Morocco.
The authors would like to thank the Central Command Post For the Fight Against Bird Flu and the
Society of Veterinary Biological and Pharmaceutical Products (BIOPHARMA).
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
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A PRELIMINARY ATTEMPT TO IDENTIFY AEREAS AT RISK FOR WEST
NILE DISEASE IN THE MEDITERRANEAN BASIN
A. Benjelloun 1.2 M. El Harrak 2. C.Lotfi2, H. Kabbaj 1, B. Belkadi 1
1. Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, Faculty of Science, University Mohammed
V, Rabat Morocco
2. Laboratoire National Biopharma, Morocco
West Nile disease( WND) is one of the most widespread vector borne disease in the world In
Morocco. The first WND cases were reported in equines in 1996, then WND re-occured in 2003 and
in 2010. For the first time since the onset of WND in Morocco a serological survey was conducted to
determine the prevalence of West Nile infection in horses in Morocco in 2011.
During the months of May, June and July 2011, 840 serum samples were collected from four
different regions in terms of environement features such altitude, temperature and precipitations.
These regions are The Atlanic coast, the Meditterranean coast, the inland plains and the Atlas
Mountains and their surroundings.
All samples were tested for IgG antibodies to West Nile by ELISA ans positive sera were tested by
virus neutralization. A total of 248 samples (29, 52%) were positive by both techniques. The
prevalence of infection was higher in those aeras were ecological ans climatic conditions were more
suitable for WND transmission.Particulary this is the case of the Atlantic coast in the northern part of
the country where humid climate, high rainfall reaching 850 mm/ year, a mild winter ans dummer
temperatures around 23°C exist. In the same aeras the presence of migratory bird settelments may
support the risk of virus introduction and spread.Given the serosurvey a prrelimninary risk map for
WND is done
139
COMMUNICATION 2 A. BENJELLOUN. M. EL HARRAK, C. LOTFI, B BELKADI.
West Nile disesase in Morocco and prevention strategies. Emerging infections in the Mediterranean
basin and Eastern Europe. Erice,Trapani(Italie) Mai 2015
SUMMARY: West Nile fever is a mosquito-borne viral disease that can afffect birds, humans and
horses causing inapparent infection, mild febrile illness, meningitis, encephalitis, or death.
West Nile virus (WNV) is a member of the genus Flavivirus in the family Flaviviridae Th.e
genus Flavivirus also includes Japanese encephalitis virus , St Louis encephalitis virus, Murray
Valley virus, Usutu virus, and Kunjin virus, among others (Burke & Monath, 2001)
Morocco has experienced three West Nile fever episodes, respectively in 1996, 2003 and
2010. The horses were the main species affected. As the transmission of this arboviral disease
involves insect vectors (mosquitoes) and natural reservoir (birds), it is very likely that the
introduction or the reintroduction of this disease in Morocco was made via migratory birds that stop
in the Moroccan territory during their migration from Africa to Europe. Overwintering has also been
suspected and many studies are in favour for the endemicity of this zoonosis
This presentation will address WND previous outbreaks and WND situation in
Morocco.Serological investigations made on different species and finally prevention measures and
strategies taken in the country.
140
ANNEXES
141
Annexe 1 : Espèces d’oiseaux existantes au Maroc et possible réservoir de la fièvre West Nile
(Dakki et al., 2001)
Famille
Podocipédidés
Phalacrocoracias
Ardéidés
Phœnicoptéridés
Anatidés
Accipitridés
Falconidés
Rallidés
Récurvirostridés
Charadriidés
Scolopacidés
Laridés
Sternidés
Alaudidés
Motacillides
Turdidés
Nom commun
Grèbe castagneux
Grèbe huppé
Grèbe a cou noir
Grand Cormoran
Héron garde boeufs
Aigrette garzette
Flamant rose
Tadorne de Belon
Canard siffleur
Canard chipeau
Sarcelle d'hiver
Canard colvert
Canard pilet
Canard souchet
Fuligule morillon
Busard des roseaux
Buse variable
Faucon émerillon
Râle d'eau
Gallinule poule d‘eau
Foulque macroule
Echasse blanche
Avocette élégante
Grand Gravelot
Gravelot collier interrompu
Pluvier doré
Pluvier argenté
Vanneau huppé
Barge à queue noire
Bécasseau minute
Bécasseau variable
Bécassine des marais
Bécassine sourde
Chevalier aboyeur
Chevalier culblanc
Chevalier gambette
Chevalier sylvain
Courlis cendré
Goéland leucophée
Goéland railleur
Mouette mélanocéphale
Mouette pygmée
Mouette rieuse
Sterne caugek
Alouette des champs
Pipit farlouse
Bergeronnette printaniére
Bergeronnette grise
Traquet tarier
Rougequeue noir
Rougegorge a front blanc
142
Nom latin
Tachybaptus ruficoffis
Podiceps cristatus
Podiceps nigricollis
Phalacrocorax carbo
Bubulcus ibis
Egretta garzetta
Phoenicopterus ruber
Tadornes tadorna
Anas penelope
Anas strepera
Anas crecca
Anas plaltyrhynchos
Anas acuta
Anas clypeata
Aythya fuligula
Circus aeruginosus
Buteo buteo.
Falco columbarius
Rallus aqualicus
Gallinula chloropus
Fulica atra
Himantopus himantopus
Recurvirostra avosetta
Charadrius hiaticula
Eudromias morinellus
Pluvialis apricaria
Pluvialis squatarola
Vanellus vanellus
Limosa limosa
Calidris minuta
Calidris alpine
Gallinago gallinago
Lymnocryptes min imus
Tringa nebularia
Tringa ochropus
Tringa totanus
Tringa glareola
Numenius arquata
Larus cachinnans
Larus genei
Larus melanocephalus
Larus minutus
Larus ridibundus
Sterna sandvicensis
Alauda arvensis
Anthus pratensis
Matacila flava
Motacilla alba
Saxicola rubeta
Phoenicurus ochruros
Phoenicurus Phoenicurus
Statut
Ns.H
Ns.H
Ns.H
Nr.H
Nr.MrH
Nr.M.H
MH
H
H
Nr.H
h
NsH
M.H
NrH
H
Ns.H
Ns.H
Hr
Nsr.H
Ns
Ns.H
Ne/s. M.
Nr.M.H
M.H
Ns.H
H
M.H
Nr.H
M.H
M.H
M.H
M.H
Hr
M.H
M.H
M.H
M.H
M.H
Ns
Nsr Hr
H
M.H
H
M.H
Nsr .H
.H
Ne.M.Hr
Ns .H
.M
Nsr .H
Ner.M
Sylviidés
Corvidés
Sturnidés
Emberizides
Gorgebleue a miroir
Pouillot véloce
Locustelle tachetée
Fauvette a lunettes
Cisticole des joncs
Bouscarle de Cetti
Corneille noire
Choucas des tours
Etourneau sansonnet
Bruant des roseaux
Luscinia svecica
Phylloscopus collybita
Locustella naevia
Sylvia conspicillala
Cislicola juncidis
Cettia cetti
Corvus corone
Corvus monedula
Sturnus vulgaris
Emberisa schoeniclus
M.H
Nsr.M.Hr
.M.Hr
Ne.M
N.s
Ns
.Ns
H
Nsr .Hr
N : Espèce nicheuse au Maroc
Ne= nicheur estivant : l'espèce se reproduit au Maroc puis, en principe, gagne ses quartiers d‗hiver généralement situés en
Afrique subsaharienne.
Ns= nicheur sédentaire : espèce dont la plupart des individus demeurent au Maroc en-dehors de la saison de reproduction,
ce qui n'exclut pas un certain erratisme par exemple des montagnes vers les plaines, ou du nord au sud des Atlas.
Nr= nicheur rare 1‘espèce pour laquelle quelques cas de reproduction ont été constatés dans la période contemporaine,
alors que l‗immense majorité des individus nichent en d'autres lieux 1 ou alors, nicheur très localisé.
Ne/s = espèce dont une partie de la population quitte le Maroc a la mauvaise saison, une autre partie restant sur place.
M : Espèce migratrice
Observable en migration en périodes pré et/ou postnuptiale, le plus souvent au passage entre l'Europe et l'Afrique
subsaharienne
.\lr = migrateur rare 1 seuls quelques individus passent par le Maroc, situe pour
certaines especes, sur la frange de leurs voies migratoires,
H : Espèce hivernante
Observable en hivernage, provenant le plus souvent d'Europe de l'Ouest, mais aussi d‘Europe de l'Est, de l'est du bassin
Méditerranéen, ou autre.
Hr = hivernant rare : seuls quelques individus parviennent jusqu'au Maroc ou alors d‘une espèce nicheuse, y demeurent;
ou enfin, d'une espèce migratrice. Ne franchissant pas le Sahara.
143
Annexe 2 : Coordonnés géographique des foyers de l‘ aire d‘étude 2003 et l‘aire d‘étude 2010
Zone Région
2003 Gharb-Chrarda-Beni Hssen
Gharb-Chrarda-Beni Hssen
Gharb-Chrarda-Beni Hssen
2010 Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Chaouia Ouardigha
Chaouia Ouardigha
Chaouia Ouardigha
Chaouia Ouardigha
Chaouia Ouardigha
Grand Casalanca
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Rabat-Sale-Zemmour-Zaer
Meknes-Tafillalet
Tadla-Azilal
Tadla-Azilal
Tadla-Azilal
PROVINCE
Kenitra
Kenitra
Kenitra
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Khemisset
Benslimane
Benslimane
Benslimane
Benslimane
Benslimane
Nouaceur
Rabat
Rabat
Rabat
Kenitra
Fqih Bensaleh
Fqih Bensaleh
Fqih Bensaleh
COMMUNE
Ouled Slama
Ameur Safila
Mograne
Ain Johara
Sidi Allal Bahraoui
Marchouche
Rommani
Sidi Yahia
0ualmes
Jamaa Haudrane
Sidi Allal Msader
Ait Malek
Ait Ouribel
Sidi Ghandour
Sbt Ait Ikkou
Ouled Yahia Outa
Fedallat
Cercle Urbain
Bir Nasr
Ain Tizga
Beniyekhlef
Ain Atig
Loulalda
Sale
Kenitra
Dar Ouled Zidouh
Ben moussa
Ouled Ayoub
144
LATITUDE
LONGITUDE
34,366321
-5,421224
34,273522
-6,306384
34,391306
-6,231431
34,102500
-6,354460
34,008200
-6,528711
33,557700
-6,692830
33,535300
-6,608410
34,315084
-6,312332
33,426069
-6,001968
33,717486
-6,260147
33,877592
-6,148567
33,960000
-6,500000
33,750642
-6,179850
33,916013
-6,009521
33,666925
-6,134148
33,500751
-7,184372
33,579159
-7,272949
33,622624
-7,126007
33,500751
-7,184372
33,693781
-7,109013
33,681782
-7,344360
33,898917
-6,954346
33,907216
-6,921473
34,031600
-6,820310
34,266580
-6,604130
32,324276
-6,918640
32,253200
-6,966640
32,478488
-6,595917
Annexes 3 : Manuel du kit ID WNC ID vet ver 0110 GB :
Kit de détection des anticorps anti-pr-E du virus West Nile dans les sérums de chevaux et d'oiseaux.
Ce kit de diagnostic est destine a la mise en évidence, par la méthode ELISA de
compétition, d'anticorps de chevaux et d'oiseaux diriges contre la protéine
d'enveloppe (pr-E) de la West-Nile, contenant un épitrope commun au virus de
l‘Encéphalite Japonaise.
Description et principe
Les cupules sont sensibilisées avec un extrait purifie du virus de la West Nile.
Les échantillons a tester et les contr61es, dilues au 1/2, sont distribues dans les
cupules. Les anti corps anti- pr-E, s'ils sont présents, forment un complexe antigèneanticorps-PO.
après élimination du conjugué un excès par lavage, la réaction est révélée par une
solution de révélation (TMB).
La coloration qui en résulte est liée à la quantité d'anticorps spécifiques présents dans
l'échantillon à tester en l‘absence d'anticorps dans l'échantillon, il apparaît une
coloration bleue qui devient jaune après blocage. en présence d'anticorps dans
l'échantillon n'apparait pas de coloration.
la lecture est réalisée à une longueur d'onde de 450 nm.
Composant du kit
Réactifs *
Microplaques sensibilisées avec l'antigène purifié
Conjugé Concentré (10x)
Contrôle positif
Contrôle négatif
Tampon de dilution 2
Solution de lavage concentré (20x)
Solution de révélation (TMB)
Solution d'arrêt (H2SO4 0,5M)
* La composition du kit est indiquée sur I‘ étiquette de dessus de kit :
1 le conjugué, les contrôles, et la solution de révélation doivent être stockés à 5°C
(+ou - 3°C)
2 Les autres réactifs (dont les plaques) peuvent être stockés entre +2°C et +26°C.
3 Les composants portant la méme dénomination (solution de lavage, tampons de
dilution) peuvent être utilisés dans l'ensemble de la gamme ID-Vet
Matériel nécessaire non fournis

Pipettes de précision mono ou multi-canaux capables de délivrer des
volumes de 10 µI, 100 micro µI,200 µI.

Embouts de pipettes à usage unique.

Lecteur de microplaques à 96 puits.

Eau distillée ou désionisée

Système de lavage manuel ou automatique.
Remarques et précautions d'emploi
1.
Ne pas pipeter a la bouche.
2.
La solution de révélation peut être irritante pour la peau.
3.
La solution d'arrêt (H2SO4. 0,5M) peut provoquer de graves brûlures
(R35). En cas de contact avec la peau ou les yeux, laver immédiatement et
4.
abondamment a I‘ eau et consulter un médecin Ne pas exposer la solution
de révélation a une lumière vive ni a des agents oxydants.
5.
Décontaminer tous les réactifs avant élimination.
Préparation des échantillons
Pour réduire la différence des temps d'incubation entre les échantillons, il est possible
de préparer une microplaque de 96 puits contenant les échantillons a tester et les
échantillons de contrôle, puis de les transférer dans la plaque ELISA avec une pipette
multicanaux.
Si nécessaire, ramener la Solution de lavage concentrée (20X) a température ambiante
(21°C ( ± 5°C) et bien agiter pour assurer la dissolution des cristaux.
Préparer la Solution de lavage (1X) par dilution de la
Solution de lavage (20X) dans de I‘ eau distillée/des ionisée.
Préparation de la Solution de lavage
Si nécessaire, ramener la Solution de lavage concentrée (20X) a température ambiante
(21°( :t 5°C) et bien agiter pour assurer la dissolution des cristaux.
Préparer la Solution de lavage (1X) par dilution de la Solution de lavage (20X) dans de
I‘ eau distillée désionisée.
.Mode opératoire
Ramener tous les réactifs à température ambiante (21°C ± 5°C°) avant l'emploi et les
homogénéiser par retournement ou au Vortex.
1 Distribuer

50 µl de Tampon de dilution 2 dans chaque puits.

50 µl de Contrôle Positif dans les cupules A1 et B1

50 µl de contrôle Négatifs dans les cupules C1 et D1.

50 µl de chaque échantillon à tester dans des cupules restantes.
5 Distribuer 100 µl de Conjugué 1X dans chaque cupule.
6 Incuber 30 min à 21 °C (± 5°C°)
7 Laver 3 fois chaque cupules avec environ 300 µl de Solution de lavage. Eviter le
desséchement des cupules entre les lavages.
8 Distribuer 100 µl de Solution de révélation dans chaque cupule.
9 Incuber 1S min :t 2 min a 21.( (:tS.C) a I‘ obscurité.
10 Distribuer 100 ~I de Solution d'arret dans chaque cupule pour arrêter la réaction.
Mesurer et enregistrer les densités optiques.
Validation Interprétation
Le test est valide si
. La valeur moyenne de densité optique des Contrôles Négatifs (DO CN> est
supérieure a 0,700.
.la valeur moyenne de densité optique des Contrôles positifs (DO CP) est inferieure à
30 % de la DO CN
DOCP/DOCN< 0,3
Interprétation
Pour chaque échantillon; calculer le pourcentage S/N (% S/N) :
DO échantillon
S/N = ----------------------x 100
DO CN
Les échantillons présentant un S/N inferieur ou égal à 40% sont considérés comme
positifs
Les échantillons présentant un S/N inferieur ou égal à 50% sont considérés comme
négatifs
Les échantillons présentant un S/N supérieur à 50% sont considérés comme négatifs
2 Incuber 90 min ± 6 min à 21°C (±5°C).
3 laver 3 fois chaque cupule avec environ 300 µl de solution de lavage. Eviter le
desséchement des cupules entre les lavages.
4 Préparer le Conjugué 1X en diluant le Conjugué 10X au 1/10 eme Tampon de dilution
145
Résultat
S/N ≤40%
40% <S/N≤ 50%
S/ > 50%
Statut
POSITIF
DOUT UX
NEGATIF
Annexe 4:
146
147
Annexe 5: Numération de la culture cellulaire
Homogénéiser par agitation la suspension cellulaire.
Prélever quelques millilitres dans un flacon à 2 ml.
Nettoyer la cellule de numération avec un mouchoir en papier imbibé à l‘alcool à 70%.
Montrer la lamelle sur la lame en humectant les bords.
Dans un flacon propre de 2 ml, mettre 900 µl de la solution du bleu de trypan et y ajouter 100 µl du
prélèvement de la suspension cellulaire.
Bien mélanger e faire déposer une goutte entre lame et lamelle dans la première chambre et une autre
goutte dansla deuxième chambre.
1ère chambre
2ème chambre
B
Carreau 1
Carreau 2
Carreau 3
Placer la lame de numération sur la plainte du microscope (grossissement x100) et compter les
cellules vivantes dans trois carreaux en diagonales dans chaque chambre de la lame en utilisant le
compteur manuel.
Les cellules vivantes apparaissent rondes et brillantes avec un contour régulier, les cellules mortes
sont colorées en bleu.
Calculer la concentration cellulaire par millilitres C en utilisant la formule suivante :
C=(N/6)x104 x10
Avec :
N : le nombre de cellules compté dans les six carreaux de la cellule de numération.
104 : profondeur de la lame.
10 : facteur de dilution de la suspension cellulaire (100 µl de cellules + 900 µl du bleu de trypan).
148
Annexe 7 : milieux de cultures utilisés
Les milieux de cultures utilisés sont :
 Le milieu d‘inoculation virale qui est un milieu d‘entretien MEM à 1% du sérum fœtal de
veau permettant la survie des cellules.
 Composition du milieu :
- DMEM
- Glucose
- Hydrolysat de lactalbumine
- Kanacycine-Vancomycine
- Bicarbonate de Sodium
- Eau bidistillée stérile
- Sérum de veau fœtal
 Le milieu de croissance MEM à 5% de sérum de veau normal permet, comme son nom
l‘indique, la croissance et la formation du tapis cellulaire.
 Composition du milieu :
- DMEM
- Glucose
- Hydrolysat de lactalbumine
- Glutamine
- Pénicilline dihydrostreptomycine
- Eau bidistillée stérile
- Bicarbonate de sodium
- Sérum de veau fœtal
149
Annexe 8: Distribution des cas positifs par zones géographique
Littoral
méditerranéen
Plaines intérieurs
Atlas et préAtlas
Littoral Atlantique
Zone
Région
Kénitra
Larache
Témara
Benslimane
Casablanca
Chtouka ait baha
El Jadida
Essaouira
Mediouna
Mohammedia
Nouaceur
Safi
Sidi Banour
Agadir
Sidi Ifni
Dakhla
Guelmim
Tadla
Beni mellal
Fqih Ben Saleh
Khénifra
Benguerir
Berchid
Chichawa
Khouribga
Marrakech
Rhamna
Settat
Elhajeb
Fes
Khémisset
Sidi Kacem
Sidi Slimane
Taourirt
Taza
Taounate
Oujda
Total
Positifs
16
16
4
66
2
0
0
0
5
5
4
10
4
1
1
11
9
154
0
2
8
0
10
0
0
0
4
0
3
3
7
8
15
32
10
82
0
11
10
1
22
150
Total Prévalence (%)
17
94,12
17
94,12
15
26,67
113
58,41
22
9,09
1
0,00
3
0,00
1
0,00
14
35,71
21
23,81
16
25,00
31
32,26
28
14,29
4
25,00
3
33,33
17
64,71
13
69,23
336
45,83
3
0,00
20
10,00
26
30,77
17
0,00
66
15,15
2
0,00
1
0,00
1
0,00
53
7,55
1
0,00
32
9,38
47
6,38
14
50,00
35
22,86
106
14,15
50
64,00
10
100,00
352
23,30
17
0,00
48
22,92
35
28,57
16
6,25
116
18,97