essais immunologiques-3

5.5.5 Exemple d’un essai immunologique
Test de grossesse
™
Test en forme de bâtonnet destiné à mettre en évidence
l'hormone spécifique de la grossesse, la gonadotrophine
chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine. Cet hormone
apparaît dans l'urine quelques jours après la conception et
sa concentration augmente rapidement dans les premières
semaines de grossesse.
219
™ Cet essai est effectué dans un format «sandwich» avec deux
anticorps.
™ Un anticorps, «l’anticorps de capture» est immobilisé de façon
covalente à la surface de la bandelette.
™ Le 2e anticorps, «l’anticorps traceur» est marqué avec un colorant.
L’anticorps traceur est imprégné sur la surface de la bandelette,
mais demeure mobile.
™ La bandelette est composée d’un matériau adsorbant. Lorsqu’un
échantillon d’urine est déposé à la surface, le liquide se déplace à
travers la bandelette par capillarité et les réactions de l’essai ont lieu
dans un flux.
220
bandelette
dans un
dispositif
en plastique
™ Une goutte d’urine est appliquée dans la fenêtre d’entrée.
™ Le liquide (urine) se déplace au-dessus de la zone contenant les anticorps
traceurs qui sont marqués avec un colorant.
™ Si la hCG est présente dans l’échantillon d’urine, elle formera un complexe
avec l’anticorps traceur.
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
221
™ Le complexe hCG-anticorps traceur formé continue à se déplacer au long
de la bandelette adsorbante et passe sur la région (fenêtre de test)
contenant l’anticorps de capture immobilisé.
™ Un sandwich est formé entre l’anticorps de capture immobilisé et l’anticorps
traceur avec la hCG entre les deux. L’anticorps traceur mobile est
immobilisé.
™ La quantité de complexe sandwich formé est directement proportionnel au
montant de hCG dans l’échantillon d’urine. Si la [hCG] excède une
concentration minimale, la couleur du colorant (attaché à l’anticorps traceur)
devient visible à l’œil.
exhibe toujours la couleur
du marqueur (colorant)
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
222
5.6 Radio-isotopes
™ Les radio-isotopes sont les premiers marqueurs utilisés dans le
méthodes immunologiques; il existe donc une vaste gamme
d’essais radio-immunologiques.
™ Les radio-isotopes sont facilement détectés à très faibles intensités,
les procédures de marquage sont simples et les marqueurs
radioactifs n’ont virtuellement pas d’effet sur la liaison anticorpsantigène.
™ Les radio-isotopes sont coûteux, dangereux et nécessitent un
contrôle et des procédures de destruction strictes.
™ La désintégration isotopique nécessite un remplacement régulier de
l’anticorps ou antigène marqué.
223
™ Les radio-isotopes utilisés:
Iode-125:
- Utilisé pour le marquage de grands antigènes
- Émission de particules β et de radiation γ (faible énergie)
- t1/2=60 jours
- Marqueur externe qui requiert un attachement covalent à l’antigène
(ex. substitution sur la tyrosine par oxydation). Ceci peut engendrer
une différence structurale entre l’antigène et l’antigène marqué
Carbone-14 et Hydrogène-3 (tritium):
- Utilisés pour le marquage d’haptènes
- Émetteurs de radiation β
- t1/2=5730 ans (C-14) et 12.3 ans (H-3)
- Marqueurs internes; les radio-isotopes remplacent des atomes
existants
™ Limite de détection pour les antigènes ≈ 10-12 M.
224
5.7 Fluorophores
™ Les fluorophores communément utilisés comme marqueurs:
O
O
O
+
OH
(H3C)2N
COOH
N(CH3)2
COOH
Fluorescein
O
HO
Tetraméthylrhodamine
O
Umbelliferone
™ Une limite de détection pour l’antigène de ~10-10 M est obtenue avec les
marqueurs fluorescents (2 ordres de grandeur plus élevés que celle des
essais avec radio-isotopes).
™ Il y a plusieurs options d’essais hétérogènes: indirect, compétitif et
sandwich.
225
™ Essai indirect: pour la quantification d’anticorps
Ag
Ag
Ag: Ab1
Ab1 Ab1
+ (sérum)
Ag
Ab2-F
+
Ag
Ag: Ab1
Ag
Ag
Ag: Ab1: Ab2-F
Ag
Ab2-F
Ab2-F
Ab2-F
Ag: Ab1: Ab2-F
Ag
L’intensité de la fluorescence augmente avec la [anticorps] dans l’échantillon.
™ Essai compétitif: pour la quantification d’antigène ou d’haptène
Ab
Ab
Ab
Ab
+
Ag Ag
Ag Ag
Ag Ag-F
Ag-F Ag
Ab: Ag
incubation
+ rinçage
Ab: Ag
Ab: Ag-F
Ab: Ag
™ L’intensité de la fluorescence diminue avec la [antigène] dans l’échantillon.
226
™ Essai sandwich: pour la quantification d’antigène ayant au moins deux
épitopes distincts
Ab
Ab
Ab
+
Ag
Ag
Ag
Ab
Ab: Ag
Ab: Ag
Ab
Ab-F Ab-F
Ab: Ag
+
Ab-F
Ab-F Ab-F
Ab-F Ab-F
Ab: Ag: Ab-F
incubation
+ rinçage
Ab
Ab: Ag: Ab-F
Ab: Ag: Ab-F
L’intensité de la fluorescence augmente linéairement avec la [antigène] dans
l’échantillon.
227
5.8. Dosage par la méthode ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
™ Les enzymes sont actuellement les
marqueurs les plus utilisés pour les
essais immunologiques.
enzyme
Ab
substrat
™ Un seul marqueur enzymatique catalyse
la production de multiples copies d’une
espèce détectable (par absorption,
taux de roulement:
fluorescence ou électrochimie) générant
~1000 à 100,000/s
ainsi un grand signal (phénomène
d’amplification catalytique).
produit
détectable
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
™ Avantage d’une méthode immunoenzymatique: une amplification du signal
qui rend possible l’analyse quantitative de
faibles concentrations d’échantillon
™ Désavantage d’une méthode immunoenzymatique: besoin d’ajouter un substrat
et d’avoir une autre étape de réaction
228
™ La méthode ELISA est un essai hétérogène sur phase solide dans lequel le
complexe antigène:anticorps (Ag:Ab1) est détecté par un antigène ou un
deuxième anticorps (anti-Ab1) marqué avec une enzyme qui catalyse la
conversion d’un substrat incolore en produit coloré.
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
™ Les méthodes ELISA:
• emploient généralement un anticorps immobilisé dans les puits d’un
plateau de microtitration en polystyrène (analyse automatisée)
• sont effectuées dans le mode compétitif ou non compétitif
229
5.8.1 ELISA - mode compétitif
™ L’antigène dans l’échantillon (analyte, Ag) et l’antigène marqué avec
enzyme (Ag-E) sont en compétition pour un nombre limité (et insuffisant)
de sites anticorps.
™ Après incubation, le support solide est rincé pour enlever les antigènes
non-liées et une concentration saturante du substrat enzymatique est
ajoutée.
™ La conversion du substrat en produit peut être mesurée en mode cinétique.
Dans ce cas, la vitesse de conversion du substrat diminue lorsque [Aglibre]
dans l’échantillon augmente.
(D’après Mikkelsen & Cortòn,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
230
™ Plus souvent, une approche à
temps fixe est utilisée.
Courbe d’étalonnage à temps fixe
™ Après un certain temps
d’incubation avec le substrat,
la réaction enzymatique est
arrêtée par l’addition d’un
acide ou d’une base forte qui
dénature l’enzyme.
™ La quantification du produit
formé donne une courbe
d’étalonnage dans laquelle la
[produit] diminue lorsque la
[Aglibre] dans l’échantillon
augmente.
(D’après Mikkelsen & Cortòn,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
231
5.8.2 ELISA - mode non compétitif
™ Les méthodes ELISA non compétitives
sont basées sur la formation de
«complexes sandwich».
™ Un anticorps primaire (Ab1) immobilisé est
présent en excès et lie quantitativement
tout l’antigène (analyte).
™ Un 2e anticorps (anti-Ab1) avec marqueur
enzymatique (Ab2-E) réagit avec
l’antigène lié, formant un complexe
sandwich qui est détecté par une mesure
de l’activité de l’enzyme liée à la surface
du support solide.
™ Une courbe de calibration est obtenue
dans laquelle la [produit] augmente avec
la [Ag] dans l’échantillon.
(D’après Mikkelsen & Cortòn, 232
Bioanalytical Chemistry, 2004)
5.8.3 Marqueurs enzymatiques pour les ELISAs
™ Caractéristiques d’un marqueur enzymatique idéal:
™
™
™
™
™
un taux de roulement élevé
un produit facilement détecté
un substrat qui n’interfère pas avec la mesure
un faible coût
une stabilité et résistance aux interférences possibles
™ Normalement, l’enzyme, substrat et produit ne doivent pas être
présent dans les échantillons analysés.
™ Il y a cinq enzymes qui sont communément utilisés comme
marqueurs.
233
1.
Horseradish peroxydase (EC 1.11.1.7, MM 40kDa) est l’enzyme
la plus utilisée dans les essais immuno-enzymatiques, due à sa
grande activité spécifique (4500 U/mg à 37°C = taux de roulement
de ~3000 molécules de substrat par seconde par molécule de
HRP) et le fait que la HRP est relativement non spécifique vers le
substrat secondaire.
™
Une variété de colorants (forme réduite) peuvent être utilisés
comme substrats qui sont convertis à leur forme oxydée colorée:
OH
OH
OH
+ H2O2
2
OH
pyrogallol
HRP
O
OH
HO
+ 3H2O
HO
coloré
234
2.
Phosphatase alcaline (EC 3.1.3.1, MM 100 kDa) a un pH
optimal autour de 9 et une activité spécifique de 1000 U/mg à
37°C (taux de roulement de ~1700/s):
O
O P O+ H2O
OO2N
+ HPO42-
O2N
p-nitrophénylphosphate
3.
OH
AP
p-nitrophénylphénol
λ=450 nm
β-Galactosidase (EC 3.2.1.23, MM 540 kDa) a un pH optimal
autour de 7 et une activité spécifique de 600 U/mg à 37°C (taux
de roulement de ~5400/s):
OH
o-Nitrophényl-β-D-galactose + H2O
+ D-Galactose
NO2
coloré
235
4.
Glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.49, MM 104
kDa) a un pH optimal autour de 7.8 et une activité spécifique de
400 U/mg à 37°C (taux de roulement de ~700/s):
D-Glucose-6-phosphate + NADP+
5.
G-6-P
D-Glucono-δ-lactone-6 phosphate
+
NADPH
absorbance
(λ=340 nm)
ou
fluorescence
Uréase (EC 3.5.1.5, MM 483 kDa) a une activité spécifique de
10,000 U/mg à 37°C et pH 7.0 (taux de roulement de ~80,000/s):
O
uréase
2NH4+ + HCO3- + OHH2N C NH2 + 3H2O
urée
236
5.8.4 Exemple d’un essais ELISA
Détection d’anticorps au virus de l’immunodéficience humaine
(VIH) par ÉLISA
™ La détection des anticorps VIH repose sur le fait que les anticorps VIH se lie
spécifiquement au VIH (antigène).
™ Étapes de l’essai: Immobilisation du VIH dans un puit de plateau à microtitration > rinçage > ajout de l’échantillon de sérum sanguin et incubation >
rinçage > ajout d’un 2e anticorps (anti-anticorps VIH) avec marqueur
enzymatique > rinçage > ajout du substrat enzymatique > production d’un
produit coloré- lecture de l’absorbance par spectrophotométrie UV-vis.
237
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
5.9 Essais homogènes de type EMIT (EnzymeMultiplied Immunoassay Technique)
™ Le dosage par la méthode homogène EMIT est utilisé pour la
quantification d’haptènes (hormones, substances thérapeutiques et
les drogues)
™ Cette méthode est basée sur une compétition entre l’haptène dans
l’échantillon (analyte) et un haptène marqué avec enzyme pour une
quantité limitée d’anticorps:
(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)
238
™ De l’enzyme contenant de l’haptène libre exhibe une activité
enzymatique élevée, tandis que la liaison de l’anticorps à l’haptène
diminue drastiquement l’activité enzymatique due à l’encombrement
stérique ou à des changements structuraux au site actif de
l’enzyme.
™ L’activité enzymatique augmente avec la concentration haptène
dans l’échantillon.
™ La limite de détection typique est d’environ 1 ng/mL.
239