sommaire - Laboratoire de Chimie Bactérienne UMR 7283

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SOMMAIRE
Remerciements
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Programme
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Communications Orales
p 11
Liste des participants
p 65
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La 6ème Ecole Thématique de Microbiologie est organisée avec le
concours et les contributions :
Du CNRS
De l’INRA
De l’alliance AVIESAN
De l’INSTITUT PASTEUR
Et de l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la
Santé Aix-Marseille
Et l’aide de :
Le comité d’organisation de l’Ecole Thématique de Microbiologie :
Mireille Ansaldi, Laurent Aussel, Frédéric Barras, Vanessa
Bimbi, Jean Raphaël Fantino et Delphine Leroi.
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PROGRAMME
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Lundi 11 17 :15 Message de bienvenue : Frédéric Barras 17 :30 Conférence d’ouverture : Max Gottesman 19 :30 Repas 20 :30‐22 :00 Session ARN / Part 1 Ciaràn Condon P12 Fabien Darfeuille P13 Audrey Coornaert P14 Mardi 12 9 :00‐10 :30 Session ARN / Part 2 Etienne Dervyn P15 Sylvain Durand P16 Franck Pandiani P17 Pierre Mandin P18 10 :30 Pause 11 :00‐12 :30 Session évolution et adaptation / Part 1 Céline Brochier P19 Hélène Falentin P20 Pascal Lebourgeois P21 12 :30 Repas 16 :00‐17 :30 Session évolution et adaptation / Part 2 Mireille Ansaldi P22 Ariane Toussaint P23 Jihane Amarir‐Bouhram P24 17 :30 Pause 18 :00‐19 :30 Session évolution et biotechnologies François Iris P25 Session évolution et métabolisme Jean Weissenbach P26 20 :00 Repas 21 :00‐22 :00 Atelier bioinfo Antonin Marchais P27 Stéphane Descorps‐Declere P28 Laura Gomez‐Valero P29 Discussion Mercredi 9 :00‐10 :30 Session ADN / Part 1 Bénédicte Michel P30 Didier Mazel P31 13 8
Bao Ton‐Hoang P32 10 :30 Pause 11 :00‐12 :30 Session ADN / Part 2 Josep Casadesùs P33 P34 Sylvie Rimsky P35 12 :30 Repas 16 :00‐17 :30 Session ADN / Part 3 Olivier Espeli P36 Roxane Lestini P37 David Lane P38 Esma Gresse P39 17 :30 Pause 18 :00‐19 :30 Session métabolisme / Part 1 Alexandra Gruss P40 Josef Deutscher P41 Damien Leduc P42 Matthieu Arlat P43 20 :00 Repas 21 :00‐22 :00 Session métabolisme / Part 2 Vincent Fromion P44 Gaëlle Porcheron P45 Jeudi 14 9 :00‐10 :30 Session enveloppe cellulaire / Part 1 Eric Cascalès P46 Muriel Masi P47 Mathilde Lallemand P48 10 :30 Pause 11 :00‐12 :30 Session enveloppe cellulaire / Part 2 Ivo Gomperts‐Boneca P49 Rym Agrebi P50 Emmanuelle Bouveret P51 12 :30 Repas 16 :00‐17 :30 Session enveloppe cellulaire / Part 3 Erwan Gueguen P52 Thierry Doan P53 Session protéine / Part 1 Pierre Genevaux P54 Jean‐Michel Jault P55 Pause 17 :30 9
18 :00‐19 :30 Session protéine / Part 2 Ivan Mijakovic P56 Axel Magalon P57 Pierre Lebrun P58 Laurent Terradot P59 20 :00 Repas et soirée Vendredi 9 :30‐10 :30 Session Régulation Agnès Fouet P60 Christophe Bernard P61 Frédérique Van Gijsegem P62 Rozenn Gardan P63 15 10 :30 Pause 11 :00‐12 :00 Conférence de clôture : Steve Busby 10
COMMUNICATIONS ORALES
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METABOLISME DE L'ARN CHEZ B. SUBTILIS ET E. COLI: LE JOUR ET LA NUIT? Ciarán Condon IBPC, Paris, France Notre vision sur le métabolisme de l’ARN a été forgée par des études effectuées principalement chez Escherichia coli, en ce qui concerne le monde bacérien, et Saccharomyces cerevisiae, pour ce qui est des eucaryotes. Ces deux organismes restent aujourd’hui les modèles de référence dans ce domaine, mais il est clair depuis un bon moment que S. cerevisiae n’est pas représentatif de tous les eucaryotes. En revanche, c’est seulement depuis peu, et grâce notamment à des études réalisées sur l’organisme à Gram‐
positif Bacillus subtilis, que l’on s’est rendu compte qu’E. coli ne peut pas réprésenter toutes les bactéries. E. coli et B. subtilis possèdent des voies très différentes pour réaliser certains processus cellulaires fondamentaux, résultant d’une évolution séparée vieille de plus d’un milliard d'années. Les voies de maturation et la dégradation de l’ARN sont d’excellents exemples de cette différentiation. Ainsi, plus d’une trentaine de ribonucléases (RNases) identifiées chez ces deux organismes, huit seulement leur sont communes. Il est aussi remarquable de noter que même les RNases essentielles à la viabilité cellulaire pour chacun de ces deux organismes ne sont pas pareilles. Le mécanisme de la dégradation, tant au niveau de la chimie qu’à celui de son déclenchement, diffère également. B. subtilis possède une activité 5’‐3’ exoribonucléase par exemple, activité que l’on pensait jusqu’alors être caractéristique des voies de dégradation eucaryote uniquement. Il est également notable qu’aucune des enzymes impliquées dans les étapes finales de maturation des ARNr chez B. subtilis n’existe chez E. coli (et vice versa), en ceci en dépit de la très forte conservation de l’ARNr, et de tout l’appareil traductionnel chez les bactéries. Nous avons donc affaire à un remarquable cas d’évolution convergente. Ces constats démontrent l’importance de considerer un large spectre d’organismes afin d’obtenir une vision globale des mécanismes de maturation et de dégradation de l’ARN chez les bactéries. 12
ANALYSE DU TRANSCRIPTOME D’HELICOBACTER PYLORI Fabien Darfeuille INSERM U869, Université de Bordeaux, Bordeaux, France Helicobacter pylori est une bactérie gram négative qui colonise durablement l’estomac d’environ une personne sur deux dans le monde. L’infection par cette bactérie conduit la plupart du temps à une inflammation chronique de la muqueuse gastrique qui peut évoluer veut des pathologies plus graves telles que l’ulcère et le cancer. Alors que les facteurs protéiques impliqués dans la virulence et dans l’adaptation à l’acidité ont été particulièrement bien étudiés, peu d’informations sont disponibles concernant la régulation de l’expression de ces gènes. Par conséquent afin de découvrir les mécanismes de régulations de l’expression génique mis en œuvre par cette bactérie, nous nous sommes intéressés à une classe émergente de régulateurs post‐transcriptionnels : les petits ARNs non codants (aussi appellés sRNA pour « small RNA »). A l’instar des microARN chez les eucaryotes, les sRNA ciblent des ARNm, par complémentarité de bases, afin de réguler positivement ou négativement leur traduction et/ou leur stabilité. L’importance des sRNA au sein du monde bactérien est désormais établie : ils participent à la régulation de nombreux aspects de la physiologie bactérienne, allant de la régulation des gènes de virulence à la réponse au stress (dommage à l’ADN, stress membranaire, métabolisme du glucose, …etc). De manière assez surprenante aucun sRNA, parmi les centaines identifiés dans d’autres bactéries, n’ont pu être retrouvés par homologie de séquence chez H. pylori. Ainsi afin d’identifier les sRNA exprimés chez cette bactérie, nous avons en collaboration avec les groupes des Dr. J. Vogel (MPI Berlin) et P. Stadler (Leipzig) réalisé le séquençage massif des ARN totaux (méthode RNA‐seq, 454 pyrosequencing, Roche). Au cours de cette expérience nous avons spécifiquement enrichi nos banques d’ARN totaux en transcrits primaires, au détriment des fragments d’ARN dégradés. Outre l’identification d’une soixantaine de sRNA uniques à H. pylori, l’enrichissement en transcrits primaires a permis de visualiser et annoter, avec une précision de l’ordre du nucléotide près, les sites d’initiation de transcription ainsi que les promoteurs de centaines de gènes et d’opérons, jusqu’alors inconnus chez cet organisme. Enfin nous avons observé et confirmé une forte activité de transcription « antisens » sur l’ensemble du génome de la bactérie. 13
L'ARN RÉGULATEUR MICA MODULE L'EXPRESSION DU SYSTÈME À DEUX COMPOSANTS PHOQ‐PHOP LORS D'UN STRESS MEMBRANAIRE CHEZ E.COLI A. Coornaert1, P. Mandin2, S. Gottesman2, M. Springer1, M. Guillier 1 1
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Institut de Biologie Physico Chimique, 13 rue Pierre et Marie Curie 75005 Paris Laboratory of Molecular Biology, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD 20892, USA Les bactéries ont développé plusieurs stratégies leur permettant de survivre aux changements brusques et fréquents de leur environnement. Les systèmes à deux composants (SDC) constituent une de ces stratégies: le plus souvent, une kinase, stimulée dans des conditions spécifiques, active le régulateur transcriptionnel qui lui est associé, ce qui aboutit à la régulation de l'expression de ses gènes cibles. Le SDC PhoQ‐PhoP est par exemple activé dans des conditions de faible concentration de magnésium, d'acidification du milieu ou encore par la présence de peptides antimicrobiens et active l'expression de gènes impliqués entre autres dans le transport du magnésium ou la virulence bactérienne. Les ARN régulateurs (ARNreg) sont également un moyen rapide d'adaptation. On en retrouve dans tous les domaines du vivant. Chez les bactéries, l'action d'un grand nombre d'entre eux est dépendante de la présence de la protéine chaperonne à ARN Hfq. Leur mode d'action consiste alors à s'apparier directement à l'ARNm cible par complémentarité imparfaite de séquence. Il en résulte une régulation de la traduction et/ou de la stabilité de l'ARNm cible. MicA appartient à cette catégorie, et est produit sous le contrôle du facteur sigma alternatif σE, lui même activé en réponse à un stress membranaire. Nous avons mis en évidence un lien nouveau entre ces différents systèmes d'adaptation (ARNreg, SDC et facteurs sigma). En effet, nous avons montré que lors d'un stress membranaire, MicA réprimait l'expression de phoPQ. En utilisant des mutants compensatoires, nous avons de plus pu déterminer que MicA s'appariait directement à l'ARNm phoPQ au niveau du site de démarrage de la traduction, ce qui inhibe probablement la fixation de la sous‐unité 30S, empêchant ainsi le démarrage de la traduction. Par ailleurs, l'observation d'une forte augmentation de l'expression de phoPQ dans un mutant hfq en absence de MicA, nous a permis d'identifier un autre ARNreg impliqué dans la régulation de phoPQ. Nos résultats suggèrent donc que l'homéostasie du magnésium pourrait être sous le contrôle de plusieurs ARNreg. 14
NOUVELLE CARTE TRANSCRIPTIONNELLE DE BACILLUS SUBTILIS. P. Nicolas, A. Leduc, E. Marchadier, P. Bessières (Unité MIG, Jouy en Josas) E. Dervyn, T. Rochat*, F. Lecointe, N. Pigeonneau, P. Noirot (Institut MICALIS, Jouy en Josas) L. Le Chat, M. Jules, S. Aymerich (Institut MICALIS, Grignon) Travail collaboratif de membres des deux projets européens BaSysBio et SysMo: La modulation de l’activité transcriptionnelle est un mécanisme central utilisé par les bactéries pour s’adapter aux variations environnementales. Récemment, le développement de la technologie des puces ADN de haute densité (tiling arrays) a rendu l’annotation des unités transcriptionnelles (UT) accessible à un niveau de définition comparable à celles des données de séquence. Les objectifs de ce projet étaient d’établir une annotation fonctionnelle du génome de Bacillus subtilis et d’appréhender dans sa globalité l’architecture de son réseau de régulation. Une exploration exhaustive des différentes conditions de vie de cette bactérie a été entreprise afin de quantifier son activité transcriptionnelle. Les hybridations effectuées ont permis d’étudier des conditions physiologiques différentes : croissance en milieu riche ou minimum, conditions de stress, de sporulation, de mobilité, de formation de biofilm, de compétence… L’analyse bioinformatique des données a rendu possible l’identification de l’ensemble des UT actives. Une expression a été détectée pour pratiquement toutes les UT annotées sur le chromosome. Pour chacune des UT, un profil d’expression en fonction des conditions de vie a pu être établi et un ou plusieurs facteurs sigma lui a été associé. Les principaux résultats issus de cette analyse applicable à toutes les espèces bactériennes cultivables seront présentés. 15
REPROGRAMMATION DU METABOLISME ANAEROBIQUE PAR LE PETIT ARN FnrS Sylvain Durand1, Gisela Storz2 CNRS UPR 9073 (affiliated with Université de Paris 7‐Denis Diderot), Institut de Biologie Physico‐Chimique, Paris, France. 2 Cell Biology and Metabolism Program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda, MD, USA 1
Les petits ARNs régulateurs bactériens (sRNAs) sont induits le plus souvent en réponse à des stress environnementaux. Ils peuvent s’apparier à des ARNs messagers codés en trans et réguler ainsi l’expression des gènes correspondants. Ce mécanisme permet d’ajuster l’activité métabolique bactérienne aux conditions de stress. Nous avons caractérisé un nouveau petit ARN (FnrS), fixant Hfq, dont l’expression est induite lorsque E. coli passe de l’aérobie à l’anaérobie. FnrS est très conservé chez les entérobactéries. Son induction, lors du passage en anaérobiose, dépend largement du facteur de transcription FNR, mais aussi des régulateurs ArcA et CRP. Notre analyse transcriptomique démontre que l’induction de FnrS permet de réprimer l’expression d’au moins 32 gènes dont une grande variété de gènes codant pour des enzymes du métabolisme central. 15 des ARNm correspondants sont prédits pour s’apparier avec FnrS par le programme TargetRNA. L’analyse de la régulation de ses cibles dans des mutants de séquence FnrS révèle que 2 régions de cet ARN peuvent réguler indépendamment des cibles différentes. L’expression de la majorité des gènes ciblés par FnrS est connue pour être dépendante de FNR, bien qu’aucun promoteur répondant à FNR n’ait été identifié pour ces gènes cibles. L’expression de FnrS permettrait d’augmenter rapidement le nombre de gènes régulés par FNR et de faciliter l’adaptation à l’anaérobiose en réprimant la synthèse d’enzymes dispensables dans ces conditions. 16
ROLE DES HELICASES à ARN DANS L'ADAPTATION AU FROID DE BACILLUS CEREUS ATCC 14579 F. Pandiani 1, I. Iost 2, J. Brillard 1, C. Michaud 1, S. Chamot 1, I. Bornard 3, C. Nguyen‐the 1 et V. Broussolle 1 1
INRA, UMR408 Université d’Avignon, Site Agroparc, F‐84000 Avignon, France 2
Université Victor Segalen Bordeaux II, INSERM U869, F‐33076 Bordeaux, France 3
Unité de Pathologie Végétale F‐84143 Montfavet, France Bacillus cereus est un pathogène opportuniste, responsable de toxi‐infections alimentaires, dont certaines souches peuvent se développer aux températures de réfrigération des aliments. Le froid perturbe les systèmes en modifiant notamment la conformation des ribosomes ou en stabilisant des structures secondaires d'ARNm, empêchant l'initiation de la traduction. Certaines enzymes, nommées ARN hélicases, seraient capables de restaurer une traduction fonctionnelle à basse température. Le génome de B. cereus contient 5 gènes csh (cold shock helicase) codant pour des ARN hélicases (CshA à CshE), qui sont fortement surexprimées à 10°C par rapport à 37°C et de manière variable au cours de la croissance bactérienne. Trois des cinq mutants de délétion construits, ne présentent plus de croissance à 10°C, les cellules présentant néanmoins une intégrité membranaire intacte. Les limites de croissance basse des mutants diffèrent suggérant ainsi un rôle ou une importance variable pour chacune des ARN hélicases. Le mutant ΔcshA présente le phénotype de sensibilité au froid le plus marqué et sa morphologie est très affectée à basse température. En outre, le gène cshA peut restaurer le phénotype sauvage du mutant cryosensible ΔcshB. CshA aurait donc un rôle dominant dans l'adaptation au froid. La stabilité des ARN extraits des cellules ΔcshA est fortement réduite par rapport à la souche sauvage lors d’une baisse de température. L'absence de l'ARN hélicase CshA, qui est localisée préférentiellement avec la sous‐unité ribosomale 30S, conduit également à un mauvais repliement du ribosome qui pourrait expliquer le défaut de croissance de ces cellules à basse température. Réf : Pandiani F et al (2010) Appl Environ Microbiol, sous presse 17
ETUDE GLOBALE DE LA REGULATION DE LA TRADUCTION DE RPOS PAR LES ARN NON CODANT Pierre Mandin1,2 et Susan Gottesman1 1‐ LMB, NCI, CCR ‐ Bethesda, USA 2‐ Nouvelle Adresse : LCB – CNRS, UPR9043 ‐ Marseille, France RpoS est un facteur sigma de l’ARN polymérase qui contrôle l’expression de plus de 500 gènes impliqués dans la réponse au stress chez E. coli. Des travaux antérieurs ont montré que l’expression de RpoS est régulée par au moins 3 ARNnc : DsrA et RprA qui régulent positivement la traduction de l’ARNm rpoS, et OxyS qui exerce un contrôle post‐
transcriptionnel négatif sur cet ARNm. Afin d’étudier de manière globale le contrôle de l’expression de rpoS par les ARNnc, nous avons construit une librairie dédiée aux ARNnc de E. coli liant Hfq, une protéine chaperonne des ARN requise pour l’action des ARNnc en trans. Cette librairie permet de déterminer l’effet de la surexpression des ARNnc sur l’expression d’une fusion traductionnelle rpoS‐lacZ. Sur les 26 ARNnc étudiés, quatre, dont l’ARNnc OxyS, régulent négativement la fusion rpoS‐
lacZ. En plus de DsrA et RprA, nous avons identifié un troisième ARNnc régulant positivement l’expression de rpoS, ArcZ. ArcZ active directement la traduction de rpoS en s’appariant à l’ARNm et en empêchant la formation d’une structure en tige boucle inhibitrice dans la partie 5’ non traduite de l’ARNm rpoS. De plus, nous avons mis en évidence que ce nouvel ARNnc est sous le contrôle du système à deux composants ArcA/B qui régule de nombreux gènes nécessaires à la croissance en anaérobiose de la bactérie. ArcZ, qui est codé sur le brin opposé et en antisens au gène arcB, réprime l’expression de arcB créant ainsi une boucle de rétro inhibition permettant la régulation fine de rpoS et des autres membres du régulon ArcA/B en fonction des conditions environnementales. Ce travail démontre la validité de notre méthode afin d’identifier des ARNnc régulant des gènes d’intérêt et met à jour un nouveau pan de la régulation de rpoS par les ARNnc. 18
PHYLOGENIE ET EVOLUTION DES MICROORGANISMES Céline Brochier Université de Provence, Laboratoire de Chimie Bactérienne (LCB UPR 9043, CNRS) Depuis les travaux pionniers de Carl Woese et George Fox à la fin des années 70 l’utilisation de la phylogénie moléculaire comme outil de base pour l’étude des microorganismes s’est imposée progressivement dans des domaines très variés, comme par exemple : la taxonomie et l’élaboration de classifications phylogénétiques, l’étude de la biodiversité microbienne et plus récemment, pour l’interprétation et l’analyse des données génomiques et post‐
génomiques. Dans ce contexte, la reconstruction de phylogénies fiables reflétant l’histoire évolutive des microorganismes apparait particulièrement importante, mais représente un réel challenge en biologie évolutive. En effet, la reconstruction de phylogénie d’organismes sur la base de séquences moléculaires n’est pas triviale et ce pour plusieurs raisons. Tout d’abord, cette approche repose sur l’hypothèse forte que l’histoire évolutive des séquences est similaire à celle des organismes. Or cette hypothèse n’est pas toujours vérifiée car il existe des événements évolutifs (e.g. duplications/pertes, transferts horizontaux) affectant les séquences qui vont créer une déviation entre l’histoire évolutive de ces dernières et celle des organismes. Par ailleurs, la quantité de signal phylogénétique contenue dans les séquences d’ADN ou de protéines est très variable selon les échelles évolutives et les marqueurs considérés. Ceci implique que certaines régions des arbres phylogénétiques reconstruits vont être plus ou moins difficile à résoudre (en particulier celles correspondant aux événements évolutifs les plus anciens et les plus récents) et que le choix des marqueurs analysés est un point crucial de l'analyse. Enfin, les méthodes de reconstruction phylogénétiques sont sensibles à divers artefacts, liés aux différences de vitesse d’évolution, aux biais de composition en bases, aux effets stochastiques, etc., qui vont impacter les arbres inférés. Malgré ces difficultés, des avancées significatives ont été réalisées ces dix dernières années grâce notamment au développement de nouvelles approches et méthodes d’analyses, mais également à l’amélioration des modèles. Ces progrès ont profondément changé notre connaissance de l’histoire évolutive des microorganismes et ont ouvert des voies de recherche prometteuses. 19
GENOMIQUE COMPARATIVE DE PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII A L’AIDE DES NOUVELLES TECHNOLOGIES DE SEQUENCAGE Hélène Falentin1, Valentin Loux2, Valérie Barbe3,Gwenael Jan1, Anne Thierry1 Jean‐Francois Gibrat2 et Yves Le Loir1 1
UMR INRA‐AGROCAMPUS OUEST Science et Technologie du Lait et de l’Œuf 35310 Rennes 2 UNITE INRA Mathématique Informatique et Génome 78 Jouy en Josas 3
CEA Genoscope 91 Evry Les nouvelles technologies de séquencage permettent d’envisager la comparaison de génomes bactériens complets de différentes souches d’une même espèce à moindre cout. Propionibacterium freudenreichii est une Actinobactérie fromagère (productrice d’arômes dans les fromages à pâte pressée cuite) et probiotique (bifidogène chez l’homme et l’animal et immunomodulatrice). Dans le cadre d’une Action Incitative Programmée financée par l’INRA (PropioDive), nous nous proposons de comprendre les bases génétiques de la souche dépendance des caractères aromatisant et immunomodulateur de 24 souches de cette espèce. Le caractère immunomodulateur de ces souches a été quantifié grâce à un dosage d’IL10 et d’IL12 sécrétées par des PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) humaines stimulées par chacune de ces souches. Le caractère aromatisant de chaque souche a été évalué en quantifiant, par chromatographie en phase gazeuse, différents composés (acide gras et esters notamment), produits en culture en présence de matière grasse laitière. Le séquencage des 24 souches (dont la souche de référence) a été réalisé à l’aide de la technologie Solexa‐Illumina pairée. Selon les souches, entre 120 et 160 ‘scaffolds’ ont été obtenus. Ces ‘scaffolds’ ont ensuite été ordonnés sur le génome de référence de P. freudenreichii (obtenu préalablement en séquencage Sanger, Falentin et al. PlosOne 2010). Les séquences des génomes sont actuellement annotées automatiquement à l’aide de la plate‐forme AGMIAL. Premièrement, des analyses par blast bidirectionnel permettent de classer une partie des gènes comme appartenant soit au génome cœur soit au génome accessoire. L’analyse du génome accessoire doit permettre de déterminer des gènes candidats potentiellement impliqués dans les caractères aromatisant et immunomodulateur (étude d’association). Deuxièmement, les mutations (Single Nucleotide Polymorphism, insertion/ deletion) situées dans les régions codantes sont classées en synonyme et non synonyme de manière à détecter de potentiels pseudogènes. L’ensemble de ces informations doivent permettre d’établir une liste de gènes/ d’allèles impliqués dans les caractères aromatisant et immunomodulateur de P. freudenreichii. L’impact de ces séquences sur les différents phénotypes reste à valider à l’aide d’outils de transcriptomique, de protéomique et d’inactivation de gènes. Après cette phase, le criblage de la collection de P. freudenreichii (~ 500 souches) du Centre de Ressources Biologiques de Rennes (CIRM‐BIA) sur des bases génétiques devrait permettre la sélection de levains adaptés aux marchés fromager et probiotique. 20
SEULS LES GENES DU GENOME COEUR REVELENT LA DOMESTICATION DE LACTOCOCCUS LACTIS. Delphine Passerini 1, Charlotte Beltramo 2, Michele Coddeville 1, Yves Quentin 1, Paul Ritzenthaler 1, Marie‐Line Daveran‐Mingot 1, Pascal Le Bourgeois 1 1
LMGM du CNRS ‐ Université de Toulouse, 2 SOREDAB, La Boissière‐Ecole L’explosion des données de génomique a bouleversé notre conception de la diversité bactérienne et soulève de nouvelles questions sur la définition des espèces et leur contenu génique. Pour certaines bactéries pathogènes (S. agalactiae) et/ou modèles (E. coli), le séquençage du génome de quelques souches ne permet pas de caractériser l’ensemble des gènes spécifiques de ces espèces (pangénome). Pour les bactéries « non‐modèles », pour lesquels très peu de génomes sont séquencés, la caractérisation de ce pangénome nécessite de décrire au préalable l’étendue de la variation génétique intraspécifique par une approche « naturaliste ». En utilisant deux méthodes de typage moléculaire complémentaires, la MLST (multilocus sequence typing) et la PFGE (pulsed field gel electrophoresis), nous avons initié l’étude de la diversité génétique et génomique de Lactococcus lactis, une bactérie lactique de la famille des Streptococcaceae utilisée par l’Homme depuis le néolithique pour la fermentation du lait. Une collection de souches possédant des macroprofils de restriction distincts a été constituée et un nouveau schéma MLST a été mis en place selon une approche « top‐down ». Une analyse des estimateurs statistiques généralement utilisés dans les analyses MLST nous a permis de proposer l’utilisation d’un nouvel estimateur de la diversité intraspécifique, la diversité nucléotidique maximale ( max). L. lactis ssp lactis apparait comme une population essentiellement clonale avec peu de recombinaison intra‐ et intergéniques. De plus, malgré son statut de sous‐espèce, elle possède une diversité génétique aussi élevée que la plupart des streptocoques. Nous proposons une nouvelle classification des souches basée sur une séparation écologique entre souches « environnementales », isolées de divers biotopes (plantes, animaux, lait cru) et souches « domestiquées », isolées de produits fermentés ou utilisées comme levain. L’analyse de ces souches par PFGE montre une variabilité de taille génomique de 20 %, une valeur retrouvée pour des espèces capables de coloniser différentes niches écologiques et impliquant un pangénome étendu. Cependant, les caractéristiques génomiques des souches ne corrèlent pas la phylogénie déterminée par MLST, suggérant peu de lien entre l’évolution des génomes cœur et accessoire et indiquant que la diversification clonale se fait essentiellement par une évolution rapide du génome accessoire. 21
GENOMIQUE DES PROPHAGES Mireille Ansaldi Laboratoire de Chimie Bactérienne CNRS UPR9043, Institut de Microbiologie de la Méditerranée L’accumulation de données de séquençage à haut débit a révélé la prédominance des séquences virales dans l’environnement. Ainsi, les bacteriophages sont les entités biologiques les plus abondantes de la biosphère (>1030 au total), et en particulier dans les eaux où ils peuvent atteindre des concentrations de 107 virions/mL d’eau de mer. Les phages sont des vecteurs majeurs de transfert horizontal de matériel génétique, et aujourd’hui l’abondance des séquences disponibles suggère qu’ils sont le principal réservoir de diversité génétique des génomes bactériens. Les phages, dans leur grande majorité, sont dits lysogéniques ou tempérés de part leur propriété à maintenir leur génome dans leur hôte en état de réplication passive. Cependant, ils peuvent devenir défectifs et perdre l’intégrité de leur génome ainsi que leurs propriétés infectieuses. Alors qu’ils peuvent être parfaitement compétents pour s’exciser du génome de l’hôte, ils y sont maintenus, suggérant une pression de sélection positive et la mise en œuvre d’un mécanisme de régulation pour les maintenir. Les questions posées sont : Comment les prophages, et en particulier les prophages défectifs, sont maintenus ? Comment sont‐ils détectés et identifiés dans les génomes bactériens? Quelles sont les conséquences de leur maintien ou de leur perte pour leurs hôtes ? 22
VERS UNE VISION MODULAIRE DES GENOMES DE BACTERIOPHAGES: L'EXEMPLE DES PHAGES TRANSPOSABLES Gipsi Lima‐Mendez, Ariane Toussaint and Raphaël Leplae Laboratoire de Bioinformatique des Génomes et des Réseaux Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium Un nombre équivalent de génomes de bactéries et de phages sont actuellement séquencés. Afin de tirer parti de l'information présente sous forme de prophages fonctionnels et cryptiques au sein des génomes bactériens complètement séquencés, les prophages on été prédits dans ces génomes en utilisant l'algorithme Prophinder (1). Un sous‐ensemble sélectionné de prophages prédits a été introduit dans la base de données ACLAME (2). Les protéines de prophage et de phage on été groupées en familles, et ces dernières annotées en suivant le protocole décrit pour ACLAME DB. Une classification réticulée construite à partir de cette population de phages et prophages et des groupes de gènes co‐occurant dans ces génomes, appelés "modules évolutionels cohésifs" (ECM), ont été assemblés comme décrit (3). Contrairement à la plupart des ECMs dérivés précédemment d'un groupe de 300 séquences génomiques de phages, un nombre important des modules dérivés de l'ensemble des phages et prophages prédits ont une fonction reconnaissable. Nous utiliserons le groupe des phages et prophages transposables/mutateurs pour illustrer comment par une combinaison de prédiction de prophages et l'analyse des ECMs, il est possible de prédire de nouveaux types d'organisation de génomes phagiques, la fonction de certrains gènes non caractérisés et l'étendue de la spécificité d'hôtes d'un groupe particulier de phages. Références: 1.Leplae R, Lima‐Mendez G, Toussaint A. (2010) ACLAME: a CLAssification of Mobile genetic Elements, update 2010. Nucleic Acids Res. (Database issue):D57‐61. Epub 2009 Nov 23. 2.Lima‐Mendez, G., Tousaint, A. and Leplae, R. (2008) Prophinder: A computational method for prophage detection in prokaryotic genomes. Bioinformatics. 15;24(6):863‐5. 3.Lima‐Mendez G, Van Helden J, Toussaint A, Leplae R. (2008) 23
DECOUVERTE DE NOUVELLES RECOMBINASES DE BACTERIOPHAGE Jihane Amarir‐Bouhram1, Anne Lopes2, Guilhem Faure2, Raphaël Guerois2 et Marie‐Agnès Petit1 1 – INRA, UMR1319, Micalis, 78350 Jouy‐en‐Josas, France 2 – CEA, iBiTecS, 91191 Gif sur Yvette, France Les génomes de bactériophages évoluent très rapidement par recombinaison et par mutagenèse. Une des particularités liées à cette capacité remarquable d’évolution est le mosaïcisme des génomes de phages tempérés. En effet, lorsque des phages sont apparentés, on observe une architecture mosaïque, à savoir des régions très conservées (~90% d’identité de séquence) à l’intérieur de leur squelette (~50% d’identité de séquence). Nous faisons l’hypothèse que ces mosaïques sont produites par recombinaison homéologue entre séquences d’ADN divergées, grâce à la présence sur ces génomes de gènes de recombinase capables de favoriser ce type d’événement. En effet, ceci a déjà été montré pour Redβ, la recombinase du phage Lambda [1]. Pour tester cette hypothèse, une recherche globale de toutes les recombinases phagiques a d’abord été effectuée. Nous sommes partis des 465 génomes de bactériophages entièrement séquencés présents dans la base de donnée ACLAME [2]. Parmi ceux‐ci, seuls 20% étaient pourvus d’une recombinase connue. Une étude bioinformatique de détection d’homologie lointaine entre recombinases nous a permis de conclure à l’existence de 2 superfamilles de recombinases, l’une apparentée à Rad52, l’autre à Rad51. Et une analyse complémentaire de contexte génétique a permis de révéler une 3ème superfamille apparentée à Gp2.5 du phage T7. Nous avons validé ces prédictions expérimentalement, en testant si les différentes recombinases prédites étaient capables d’apparier de l’ADN simple brin in vivo. Nous avons conclu de cette étude que les recombinases prédites étaient capables d’apparier de l’ADN simple brin in vivo, et au final, il a été possible de détecter une recombinase chez 41% des génomes de phages [3]. La suite de ces travaux consiste actuellement à tester si des représentants des différentes familles de recombinases phagiques ont effectivement une capacité particulière à faire de la recombinaison homéologue. Ceci conduirait à expliquer la présence de mosaïques dans les génomes de phages par la recombinaison homéologue. [1] PLoS Genet. 2008; The lambda red proteins promote efficient recombination between diverged sequences: implications for bacteriophage genome mosaicism. Martinsohn JT, Radman M, Petit MA. [2] Nucleic Acids Res. 2010;ACLAME: a CLAssification of Mobile genetic Elements, update 2010. Leplae R, Lima‐
Mendez G , Toussaint A. [3] Nucleic Acids Res. 2010; Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Lopes A, Amarir‐Bouhram J, Faure G, Petit MA, Guerois R. 24
INGENIERIE MOLECULAIRE & PRODUCTION DE BANQUES DE BACTERIOPHAGES VIRULENTS POUR LE CONTROLE DE PATHOGENES BACTERIENS EMERGENTS François Iris , Flavie Pouillot , Julien Noelig2, Hélène Blois2. 1
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1: Bio‐Modeling Systems; Paris, France. 2: Pherecydes‐Pharma; Romainville, France. L’émergence ou la résurgence de souches bactériennes pathogènes multi résistantes aux antibiotiques reste une menace constante et imprévisible et constitue de réels dangers tant en termes de santé humaine et vétérinaire qu’en termes de bio‐défense. Des moyens permettant de rapidement déceler la présence de tels pathogènes et de sélectivement les détruire sans avoir recours aux vaccins ou aux antibiotiques sont un besoin urgent. Les bactériophages pourraient être une solution à ce problème. Mais les bactéries sont en co‐
évolution permanente avec leurs prédateurs viraux depuis près de 4 milliards d’années, et de nombreuses souches pathogènes ont développé des mécanismes leur permettant de très vite résister à toute attaque répétée par un bactériophage donné. Nous avons utilisé des approches de modélisation heuristique (biologie des systèmes) pour étudier ces phénomènes et identifier les mécanismes clé. Ceci a permis le développement de technologies d’ingénierie moléculaire innovantes et efficaces permettant, par des approches stochastiques ciblées, de rapidement produire, à partie d’un phage virulent (T4 n’étant qu’un exemple), des banques de variants d’où des particules capables de contrecarrer ces stratégies d’échappement ainsi que de déceler et infecter des espèces bactériennes très éloignées de l’hôte d’origine (yersinia, pseudomonas, etc.) peuvent être très rapidement isolées et amplifiées (Pouillot F. et al. 2010). Outre leurs applications larges dans la lute contre les pathogènes bactériens multi résistants, ces banques de phages constituent des sources très diversifiées de nano‐particules permettant le transport et les apports ciblés de petites molécules. Pouillot F, Blois H, Iris F. (2010): Genetically engineered virulent phage banks in the detection and control of emergent pathogenic bacteria. Biosecur Bioterror. 8(2):155‐69. 25
NOUVELLES ACTIVITES BIOCATALYTIQUES CHEZ LES PROCARYOTES Jean Weissenbach CEA, DSV, Genoscope‐Centre national de séquençage, CNRS, UMR8030, Université d'Evry Val d'Essonne Le déluge de données de séquences de novo, qui ne fait que s'amplifier, s'accompagne d'une accumulation croissante de gènes dont les fonctions restent totalement inconnues, en particulier chez les microorganismes. Parmi les nombreuses fonctions biologiques à explorer et exploiter, les activités biocatalytiques occupent une place particulière pour de nombreuses raisons : (1) il subsiste un bon millier d'activités enzymatiques décrites dans la littérature (avec identifiant EC) dont le gène n'est pas connu. (2) S'il est vrai que la plupart des voies du métabolisme central et intermédiaire sont connues, il reste des voies métaboliques à identifier, même chez des organismes modèles. De plus, les 3,6 milliards d'années d'évolution qu'ont connu les procaryotes ont été à l'origine d'une diversité d'activités enzymatiques dont on ne fait que soupçonner l'étendue. Elles ont permis aux procaryotes de coloniser la quasi‐totalité de la planète et de métaboliser l'impressionnante variété de substances naturelles synthétisées par le vivant. De plus, le répertoire des activités biocatalytiques continue de s'étendre, en particulier par un réajustement d'activités existantes, à des molécules nouvellement apparues dans la nature. (3) Des analyses bioinformatiques, même sommaires, indiquent que 30% à 50% des gènes de procaryotes prédits codent pour des enzymes dont substrats et produits sont inconnus. (4) Dans une perspective de modélisation des systèmes biologiques telle que l'envisage la biologie systémique, il importe, pour une modélisation utile, que toutes les fonctions, et notamment les fonctions métaboliques, soient parfaitement connues. (5) La découverte de nouvelles activités enzymatiques peut être à l'origine d'applications dans les domaines de la chimie de synthèse et de la bioremédiation. Il n'existe pas à ce jour de méthode générale d'identification de nouvelles activités enzymatiques. Cependant, un ensemble d'approches aussi bien expérimentales que in silicio permettent de proposer et de valider des hypothèses. Des exemples illustrant ces approches seront présentés. 26
LA CO‐EVOLUTION DES ELEMENTS CODANTS ET NON‐CODANTS CHEZ LES BACTERIES A. Marchais , C. Bohn , M. Naville1, S. Duperrier 2, S. Durand2, P. Stragier 2, P. Bouloc1, D. Gautheret1 1
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Université Paris‐Sud, CNRS‐UMR8621, Institut de Génétique et Microbiologie, Bâtiment 400, 91405 Orsay Cedex, France. 2
CNRS‐UPR9073, Université Paris‐Diderot, Institut de Biologie Physico‐Chimique, 13 rue Pierre et Marie Curie, 75005 Paris, France. La classification phylogénétique de tous les éléments non codants bactériens, que nous avons inaugurée par le développement de la méthode NAPP, nous a permis d’observer le regroupement (co‐héritage) d’un nombre significatif d’ARN non codants et de protéines spécifiques. Ainsi par déduction, cette méthode nous a servi entre autre à détecter un premier set de plusieurs nouveaux ARNnc chez S.aureus et de les confirmer expérimentalement. Nos travaux récents, en collaboration avec des équipes de génétique bactérienne, se focalisent sur la confirmation expérimentale des relations fonctionnelles entre éléments codants et non codants des groupes significatifs. 27
L'ASSEMBLAGE DE NOVO DE GENOMES BACTERIENS A L'AIDE DES TECHNOLOGIES NGS Stéphane Descorps‐Declère Institut Pasteur (GENOPOLE) Les technologies de séquençage massivement parallèles (454, Illumina, SOLiD, et Helicos, …), en raison de leurs coûts faibles et des temps d'expérimentation courts, sont devenu aujourd'hui la technologie de choix pour le séquençage de novo de génomes complets. Contrairement aux appareils de génération précédente, les séquenceurs NGS sont caractérisés par des lectures de petites tailles produites en très grandes quantités (il existe un facteur 15000 entre la capacité de production d'un séquenceur Sanger et celle d'un séquenceur NGS). Du point de vue bio‐informatique, ces innombrables lectures de petites tailles apportent un surplus de complexité important. Ainsi certains problèmes, que nous tenions pour correctement traités, se trouvent aujourd'hui de nouveau reposés. C'est le cas de l'assemblage de novo. Cette étape critique du séquençage génomique complet consiste à ordonner et fusionner une collection de fragments génomiques, extrait de façon aléatoire (les lectures ou reads), afin de créer une liste de séquences plus grandes continues et contiguës si possible (les contigs). Les logiciels classiquement utilisés ne sont pas ou peu adapté au traitement des données NGS, aussi une nouvelle génération de logiciel a recensement vu le jour ... L'objectif de cet exposé est de présenter au travers de quelques algorithmiques (et des logiciels les implémentant) mon expérience de l'assemblage de novo de génomes bactériens, en insistant particulièrement sur les paramètres les plus importants influant sur la qualité des résultats. 28
DETECTION ET ORIGINE DES « EUKARYOTIC‐LIKE PROTEINS » DES LEGIONELLES L. Gomez‐Valero, C. Rusniok, and Buchrieser C. Institut Pasteur, Biologie des Bactéries Intracellulaires and CNRS URA 2171, 28 Rue du Dr Roux, 75724 Paris Les légionelles sont des bactéries environnementales vivant en milieu aquatique ou solide. Elles parasitent habituellement les amibes, mais certaines espèces sont également capables d’infecter l’homme par le biais d’aérosols. Les bactéries peuvent atteindre les alvéoles pulmonaires où elles sont phagocytées par les macrophages. Une fois phagocytées, elles vont se multiplier dans la cellule, lyser leurs hôtes et causer de graves pneumonies. Cette remarquable capacité de réplication intracellulaire est le résultat d'une longue co‐évolution entre Legionella et des cellules eucaryotes (protozoaires aquatiques). Le génome de Legionella reflète cette co‐évolution, car on y trouve un nombre élevé de gènes codants pour des protéines ayant une forte similarité avec des protéines eucaryotes dénommées les eukaryotic‐like proteins. Dès leur découverte, nous avons proposé que ces protéines soient des facteurs de virulence qui aident Legionella à moduler les fonctions de la cellule hôte pour les détourner à son avantage. A ce jour, cette hypothèse a en effet été démontrée expérimentalement pour plusieurs de ces protéines. Parmi celles‐ci, on trouve : des protéines à domaine F‐Box, U‐Box, Sel‐1, des protéines à ankyrin repeat ou une sphingosin‐
1‐phosphate lyase. Des eukaryotic‐like proteins ont également été trouvées dans d’autres espèces bactériennes mais Legionella pneumophila reste le pathogène dans lequel celles‐ci sont présentes en plus grandes variétés, ce qui fait de Legionella un organisme de choix pour l'étude d’adaptation d’une bactérie à son hôte. Le genre Legionella contient 57 espèces, dont certaines sont pathogènes pour l’homme. Dans le but de connaître le répertoire des eukaryotic‐like proteins présents dans le genre Legionella, d’étudier leur mécanisme d’acquisition et leur origine nous avons développé une nouvelle méthode de détection automatique des membres de cette famille dans la séquence génomique. Ensuite, nous avons réalisé une analyse phylogénétique pour les protéines identifiées dans L. pneumophila et L. longbeachae pour comprendre leur origine. En effet, cette étude suggère que, pour certaines d’entre elle, un transfert entre l’hôte eucaryote et Legionella a eu lieu. 29
DEVENIR DES FOURCHES DE REPLICATION ARRETTES CHEZ ESCHERICHIA COLI Bénédicte Michel, Zeynep Baharoglu, Hasna Boubakri, Stéphane Duigou, Anne Langlois de Septenville, Marie LeMasson, Roxane Lestini, Guiseppe Lia. Centre de Génétique Moléculaire CNRS Bâtiment 26 91198 Gif sur Yvette Chez les procaryotes, la réplication est initiée à l’origine oriC par DnaA, et est ré‐initiée à partir de fourches de réplication inactivées grâce à l’action de la protéine PriA. La découverte du rôle crucial joué par les protéines qui redémarrent la réplication a conduit à la notion que les fourches de réplication ne progressent pas de façon continue le long du chromosome, mais sont susceptibles d’être arrêtées par divers obstacles. De plus, l’action des protéines de redémarrage de la réplication est souvent précédée par celle de protéines de recombinaison, et/ou par l’action d’hélicases accessoires de la réplication. Les protéines de la recombinaison homologue exercent donc une fonction importante lors du redémarrage de la réplication, en plus de leur rôle dans la réparation des lésions de l’ADN. L’action de PriA est essentielle pour le redémarrage de la réplication quelle que soit la raison de l’arrêt, mais les réactions qui précèdent ce redémarrage sont variées et dépendent de la cause initiale de l’inactivation de la réplication. Le complexe de recombinaison RecBCD est essentiel pour la viabilité de souches où la réplication a été arrêtée par l’inactivation d’une protéine du réplisome, ou par l’inactivation de l’hélicase Rep. Dans ces conditions, une réaction appelée réversion des fourches de réplication convertit les fourches arrêtées en une jonction de Holliday adjacente à une extrémité double‐brin. RecBCD restaure des fourches de réplication fonctionnelles après réversion par son action spécifique sur les extrémités double‐brin d’ADN. RecFOR et RecA se fixent également sur les fourches inactivées dans les mutants de réplication, mais leur action est délétère et est contrecarrée par l’hélicase UvrD. Par contre, ces protéines sont essentielles pour le retour à une réplication normale après irradiation aux rayonnements ultra‐violets. RecFOR agit spécifiquement sur les interruptions simple‐brin de l’ADN, et, via son action de promotion de la formation de filaments RecA il protège l’ADN de la dégradation par des nucléases. Enfin, trois hélicases accessoires (Rep, UvrD et DinG) exercent une activité redondante essentielle en délogeant les molécules d’ARN polymérase lorsque celles‐ci bloquent la réplication. Michel B, Boubakri H, LeMasson M, Baharoglu Z, and Lestini R (2007) DNA Repair 6:967‐980. Boubakri H, Langlois de Septenville A, Viguera E, and Michel B (2010) EMBO J, 29 145‐157. 30
ADN SIMPLE BRIN ET TRANSFERTS GENETIQUES HORIZONTAUX Didier Mazel Unité Plasticité du Génome Bactérien, Institut Pasteur, Paris Les mécanismes qui permettent les échanges de matériel génétique entre bactéries, tels que la conjugaison et la transformation naturelle, ont pour support exclusifs des molécules ADN simple brins. Cette forme particulière de l’ADN implique la mise ne œuvre de mécanismes régulateurs spécifiques sur les molécules échangées, et induit aussi une réponse physiologique dans la cellule réceptrice. Ces mécanismes seront particulièrement illustrés par les résultats obtenus dans l’étude des intégrons et de leur transfert chez les bactéries à Gram négatif. Ces élément génétiques mobiles particuliers sont trouvés dans un grand nombre de bactéries et sont directement impliqués dans le développement des résistances multiples aux antibiotiques. 31
LES TRANSPOSASES Y1 ET LA DYNAMIQUE DES GENOMES 1
Bao Ton Hoang , Catherine Guynet , Cécile Pasternak2, Patricia Siguier1, Suzanne Sommer2, Michael Chandler1 1
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Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires, CNRS, UMR5100, 118 Rte de Narbonne, F31062 Toulouse Cedex, France 2
Université Paris‐Sud, Institut de Génétique et Microbiologie, CNRS, UMR8621, LRC CEA 42V, Bât. 409, Orsay, France. Les transposons jouent un rôle fondamental dans la dynamique des génomes bactériens. Nous étudions le mécanisme de transposition d'une famille originale de séquences d'insertion bactériennes (IS), la famille IS200/IS605. Contrairement aux ISs classiques, ces éléments ne portent pas de répétitions inversées aux extrémités, mais plutôt des séquences sous‐terminales capables de se structurer en palindromes et s'insèrent dans des cibles spécifiques. La transposase, TnpA, est différente des transposases connues mais ressemble aux relaxases des plasmides conjugatifs et aux endonucléases Rep impliquées dans la réplication en cercle roulant de certains plasmides. Étant donné que ces protéines utilisent un seul résidu tyrosine pour la catalyse, nous les avons appelé les transposases Y1. Nos études in vitro montrent que ces ISs transposent en utilisant obligatoirement des intermédiaires d'ADN simple brin pour l’excision et l’insertion. Nous décrivons ici le lien entre la transposition et la réplication et la réparation de l’ADN de deux membres de la famille: IS608 et ISDra2, deux processus qui peuvent générer de l’ADN simple brin in vivo. 32
EPIGÉNÉTIQUE BACTERIENNE Josep Casadesús Departamento de Genética, Universidad de Sevilla, Séville, Espagne "Not everything that is inherited is genetic" a écrit Boris Ephrussi dans les années 60, indiquant l’existence de gènes que l’on ne pouvait qualifier ni de sauvage, ni de mutant en raison certains phénomènes de transmission non‐mendelienne. À son tour, la biologie moléculaire a détecté au niveau des chromosomes des signaux « épigénétiques » liés à l’information contenue sur la séquence nucléotidique. Aujourd’hui, l’« eucaryocentrisme » présente souvent les phénomènes épigénétiques comme exclusifs des eucaryotes supérieurs. Cependant, on connaît des exemples de transmission épigénétique dans tous les règnes du vivant, y compris chez les protistes et les bactéries. Une autre idée simpliste a tenté de relier les évènements épigénetiques exclusivement à l’ADN et à la chromatine, oubliant l’existence de structures cellulaires capables d’auto‐organisation grâce à leur capacité à fonctionner comme des « moules ». Les cellules peuvent ainsi hériter de modèles d’activité métabolique. On peut généraliser le fait que la transmission épigénétique existe toujours sous forme d’une boucle de rétroaction qui reste stable pendant la division cellulaire : une sorte de « mémoire » transmise aux cellules‐filles. Les phénomènes épigénétiques bactériens on été peu étudiés, à l’exception de l’étude de la méthylation de l’ADN. À côté des ADN méthyltransférases qui font partie des systèmes de restriction‐modification des bactéries, on trouve aussi des ADN méthyltransférases « solitaires » avec de multiples rôles dans la physiologie cellulaire. Les exemples classiques sont la méthylase Dam chez les gamma‐protéobactéries et la méthylase CcrM chez les alpha‐
protéobactéries. Dam et CcrM méthylent la position N6 des adénosines qui se trouvent respectivement sur les cibles 5’GATC3’ et 5’GANTC3’. La formation de N6‐methyl‐adenine diminue la stabilité thermodynamique de l’ADN et change sa courbure. Ces effets structuraux affectent certaines interactions ADN‐protéine, et contrôlent la fixation de l’ARN polymérase et des facteurs de transcription sur certains promoteurs et régions régulatrices. La discrimination entre sites GATC méthylés et hémi‐
méthylés entraîne la transcription de certains gènes à un niveau spéficique du cycle cellulaire. D’autre part, la fixation de protéines peut éviter la méthylation de certains sites GATC. La formation de sites GATC hémi‐méthylés ou non‐méthylés contrôle alors la transcription de certains gènes, et génère des modèles de méthylation transmissibles comme ceux présents sur les chromosomes eucaryotes. 33
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BASES MOLECULAIRES DE L’EFFET ANTAGONISTE DES PROTEINES PARALOGUES H‐NS ET LER SUR LE PROMOTEUR DE L’OPERON LEE5 DE LA SOUCHE EPEC Aïda Boughammoura, Ahmad Khodr, Victoria Fairweather and Sylvie Rimsky LBPA, Bacterial chromatin and regulation UMR 8113 CNRS / ENS Cachan 61, avenue du Président Wilson 94235 Cachan cedex De nombreuses bactéries à Gram négatif pathogènes des animaux et des plantes ont développé un système de sécrétion spécialisé, le système de sécrétion de type III, leur permettant d’injecter, telle une seringue, des protéines effectrices dans le cytosol des cellules hôtes qui perturbent les voies de signalisation cellulaire. Escherichia coli EPEC est une bactérie entéro‐pathogène de l’homme à l’origine de diarrhées infantiles qui peuvent parfois s’avérer mortelles. Elle colonise le tractus digestif selon un mécanisme singulier dit d’attachement/effacement (AE) caractérisé par l’adhésion aux entérocytes, la perte de la bordure en brosse des microvillosités et la réorganisation du cytosquelette des cellules épithéliales. La virulence bactérienne requiert un ensemble de 41 gènes formant un îlot de pathogénicité nommé LEE (Locus for Enterocyte Effacement). Ce dernier est organisé en 5 opérons majeurs LEE1 à LEE5 codant en particulier pour l’intimine (adhésine) et son récepteur, ainsi que l’appareil de sécrétion de type III et les protéines effectrices qu’il injecte dans la cellule hôte. Au niveau moléculaire la régulation du LEE n’est pas élucidée. L’expression des gènes de l’îlot est finement régulée et répond en particulier aux changements environnementaux comme le pH, la température, l’osmolarité et la densité bactérienne en impliquant des régulateurs spécifiques et globaux. Parmi eux, deux protéines jouent un rôle clé, H‐NS et Ler (LEE‐Encoded Regulator) : la protéine H‐NS (Nucleoid Structuring protein) régule négativement les opérons du LEE alors que Ler, qui est le produit du premier gène de l’opéron LEE1 régule positivement l’ensemble de la région. Bien que ces protéines aient un effet antagoniste sur la régulation elles présentent de fortes homologies de séquence, et sont des paralogues. H‐NS est un régulateur global réprimant la transcription des gènes et dont l’effet est sensible aux facteurs environnementaux. Cette protéine présente une affinité plus marquée pour les ADNs riches en AT qui sont souvent des séquences intrinsèquement courbes. De plus H‐NS reconnaît spécifiquement un motif de 10 paires de bases qui constitue un site de nucléation à partir duquel la protéine va occuper de longues régions sur l’ADN, induisant le silencing des gènes. Notre but est de comprendre les mécanismes d’action de Ler, protéine paralogue qui va empêcher H‐NS de jouer son rôle de « silencer ». Nous avons déterminé les sites de fixations des deux protéines sur l’opéron LEE5, modifié leurs séquences et observé le résultat de ces mutations in vivo sur l’expression du promoteur et in vitro sur la fixation des deux protéines à l’ADN. 35
MatP ET L’ANNEAU SEPTAL CONTROLENT LA LOCALISATION DU MACRODOMAINE TER DU CHROMOSOME D’E. COLI Romain Borne, Pauline Dupaigne, Axel Thiel, Frédéric Boccard et Olivier Espeli Centre de Génétique Moléculaire – CNRS, avenue de la terrasse, 91198 Gif sur Yvette. Des approches bioinformatique et génétique nous ont permis de mettre en évidence une protéine spécifiquement dédiée à l’organisation d’une grande région du chromosome d’E. coli, le macrodomaine Ter. Cette protéine, de fonction inconnue jusqu’alors, a été appelée MatP (MAcrodomaine Ter Protein). MatP se lie in vivo et in vitro sur 23 sites matS répartis sur l’ensemble du domaine Ter (1Mb) et participe ainsi à la condensation du chromosome et à l’établissement d’une longue période de co‐localisation entre chromatides sœurs dans cette région. MatP contraint la mobilité des loci étiquetés dans le macrodomaine Ter, il participe donc à l’établissement du territoire du macrodomaine Ter. Ce territoire est localisé pendant une grande partie du cycle cellulaire au centre des cellules. Pour comprendre la raison d’être de cette localisation nous avons perturbé l’organisation du chromosome en le linéarisant. Nous avons mis en évidence que MatP permet la cyclisation d’un chromosome linéarisé et télomérisé à dif. Les deux bras de réplication sont rapprochés l’un de l’autre à un moment précis du cycle cellulaire. Le contact entre les deux bras du chromosome s’établi de manière durable et dépendante de MatP au centre de la cellule. Nous avons pu montrer, dans des cellules à chromosome circulaire ou à chromosome linéaire, la synchronisation parfaite entre l’arrivée de MatP au centre de la cellule et l’apparition de l’anneau de FtsZ. La co‐localisation entre MatP et FtsZ est maintenue jusqu'au début de la fermeture de l’anneau septal. En utilisant des plasmides dépourvus de systèmes de partition nous avons également démontré que la présence de sites matS sur ces plasmides permet de les adresser à l’anneau septal dans un processus dépendant de MatP et de FtsZ. Une interaction directe entre MatP et l’anneau septal semble donc être impliqués dans la formation du territoire du macrodomaine Ter. 36
L’HELICASE/NUCLEASE HEF, DE LA FAMILLE XPF/MUS81/FANCM, OU LA RESOLVASE DE JONCTION DE HOLLIDAY HJC, EST ESSENTIELLE A LA VIABILITE DE L’ARCHEE HALOFERAX VOLCANII Roxane Lestini1, Zhenhong Duan2, Thorsten Allers2 1 Laboratoire d’Optique et Biosciences, Ecole Polytechnique, CNRS UMR7645 – INSERM U696, 91128 Palaiseau Cedex, France 2 Institute of Genetics, School of Biology, University of Nottingham, Queen’s Medical Centre, Nottingham NG7 2UH, United Kingdom Les protéines de la famille XPF/MUS81 présentent une conservation de structure qui leur permet de jouer divers rôles dans la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génétique. Nous nous intéressons au rôle de l’hélicase/nucléase Hef, unique membre de la famille XPF/MUS81 présent au sein de l’ archée Haloferax volcanii dont les outils génétiques bien développés permettent l’étude fonctionnelle de gènes in vivo. Nous avons testé l’implication de Hef dans la réparation de l’ADN après lésions UVs, comme observé pour les XPF eucaryotes. Nous avons pu montrer que l’absence de la protéine Hef n’a aucun effet sur la sensibilité des cellules aux lésions UVs. Nous avons ensuite testé l’effet de l’absence de Hef sur la réparation de l’ADN après traitement par différents agents génotoxiques sans qu’aucun effet significatif soit observé. Nous avons alors testé la possibilité d’une redondance fonctionnelle entre Hef et d’autres endonucléases et montré qu’il n’est pas possible de déléter à la fois le gène hef codant la protéine Hef et le gène hjc codant la protéine responsable de la résolution des jonctions de Holliday. Ainsi la présence de Hef ou de Hjc est essentielle pour la viabilité de H. volcanii en absence de traitements génotoxiques. Afin de comprendre quelle fonction essentielle est assurée par Hef ou par Hjc, nous avons testé l’effet de l’absence de Hef ou de Hjc dans un contexte où la recombinaison homologue a été inactivée par délétion du gène radA codant la protéine RadA, acteur central de la recombinaison homologue. Les résultats indiquent que Hef et Hjc n’assurent pas un même rôle cellulaire de façon redondante puisque Hjc semble agir avec la voie de recombinaison homologue tandis que Hef agit indépendamment de la voie de recombinaison homologue. Par ailleurs, nous avons montré que les activités hélicase et nucléase de Hef sont essentielles pour la viabilité en absence de la protéine Hjc. En s’appuyant également sur des données biochimiques existantes et les connaissances acquises sur les membres de la famille XPF/MUS81 eucaryotes, nous proposons que Hef et Hjc agissent dans deux voies alternatives de redémarrage des fourches de réplication arrêtées. 37
ACTIVATION OF THE F PLASMID PARTITION SYSTEM BY A SINGLE UNPAIRED PARTITION COMPLEX Jérôme Rech & David Lane Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires, CNRS, Toulouse La ségrégation mitotique des replicons bactériens (dit partition) est supposée depuis longtemps d'être dépendante de l'appariement des copies des replicons issues de la réplication, à l'image de la métaphase eucaryote. Cependant, malgré des évidences que des complexes de partition sont capables de s'apparier, il n'existe aucune évidence que cet appariement est nécessaire à la partition. Nous avons essayé de tester la possibilité que la localisation des plasmides et la dynamique des ATPases de partition se produisent sans que l'appariement ait lieu. Notre approche consiste en la mise en œuvre du système de partition SopABC du plasmide F d'Escherichia coli pour examiner ces activités chez les cellules infectées par un seul virion d'un phage qui porte le centromère sopC. E.coli exprimant cI (répresseur) du phage, tetR::gfp, sopB et soit sopA soit sopA::xfp a été infectée à basse m.o.i. par ‐sopC avec une suite des opérateurs tetO adjacente au centromère. Les positions de l'ADN entrant et de la CherryFP ont été suivies par microscopie à fluorescence. Lors de l'infection, ‐sopC migre rapidement du point d'entrée (le plus souvent polaire) au centre de la cellule, et y reste. Chez les souches n'exprimant pas les gènes sopAB ou avec un phage sans sopC l'ADN infectant reste au point d'entrée. La SopA::cherryFP, pleinement fonctionnelle en partition, réagit à l'entrée de sopC par l'auto‐association en un nuage mobile, comme elle fait lors de la partition du plasmide mini‐F; elle ne montre aucune réponse à un sans sopC. Un ne portant qu'une des dix unités répétées de sopC migre lui aussi au centre et stimule le mouvement de SopA, ce qui est compatible avec la stabilité d'un mini‐F portant une telle sous‐unité. Ces résultats montrent que l'appariement direct des complexes de partition, et donc leurs copies sœurs du plasmide, ne contribue aucun élément essentiel au mécanisme de la partition. Cette conclusion est parallèle aux indications in vitro que les deux bouts des proto‐
filaments de l'ATPase de partition ParM sont stabilisés par des complexes de partition distincts. 38
LA POLYMERASE I CHEZ HELICOBACTER PYLORI, SOURCE DE VARIABILITE GENETIQUE Maria Victoria García‐Ortiz, Stéphanie Marsin, Esma Gresse et J. Pablo Radicella Institut de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire, CEA, Fontenay aux Roses L’ADN polymérase I est une polymérase multifonctionnelle impliquée dans la réplication, la réparation et la recombinaison de l’ADN. Le génome d’Escherichia coli code en plus de la Pol I quatre autres polymérases : la polymérase réplicative Pol III et les polymérases translésionnelles Pol II, Pol IV et Pol V. Ces dernières permettent la réplication d’un ADN portant des lésions sur le brin servant de matrice. Helicobacter pylori est une bactérie pathogène qui colonise essentiellement la muqueuse gastrique humaine. Une de ces caractéristiques les plus remarquables est sa grande variabilité génétique lui conférant sa capacité d’adaptation. L’analyse de son génome met en évidence la présence de deux gènes codant pour des ADN polymérases potentielles : Pol I et la polymérase réplicative Pol III. Aucun orthologue des polymérases translésionnelles n’a été trouvé. Cette absence soulève la question des mécanismes impliqués dans la réplication de l’ADN en présence de lésions, un processus critique pour la survie d’un organisme soumis à un stress génotoxique. Nous montrons ici que le gène HP1470 (polA) code effectivement pour l’ADN polymérase I chez H. pylori. La sensibilisation du mutant polA après traitement par différents agents génotoxiques comme les rayonnements ionisants, les UV ou encore certains agents alkylants montre l’implication de Pol I dans la réparation de l’ADN. De manière inattendue, Pol I semble permettre, chez H. Pylori, de générer de la variabilité génétique. En effet, l’inactivation de polA réduit le taux de mutagenèse spontanée alors que sa surexpression conduit à un phénotype hypermutateur. De plus la protéine Pol I, purifiée, est capable de répliquer des ADN portant des lésions bloquantes. L’ensemble de ces résultats in vivo et in vitro suggère un rôle inattendu de la polymérase I dans la variabilité génétique et l’adaptation de H. Pylori. 39
IMPACT DES MOLECULES LIPOPHILES EXOGENES DANS LA VIE ET LA MORT DES BACTERIES A GRAM‐POSITIFS Alexandra Gruss Institut Micalis UMR 1319, INRA, Jouy en Josas 78352, France [email protected] Chaque cellule vivante est protégée par une membrane, qui agit comme le lieu d’échanges avec l'environnement. Les nombreuses protéines comprenant des membranes bactériennes ont des rôles spécifiques, dans l’import ou l’export des nutriments, cofacteurs, ions et molécules de signalisation. Les activités de ces protéines sont modulées par les constituants lipidiques de la membrane, les phospholipides, qui sont eux‐mêmes construits d’acides gras. La plupart des organismes synthétisent leurs propres acides gras. Cependant, la composition lipidique des membranes doit varier avec les conditions environnementales comme le pH, la température, le taux d’oxygène, …, afin d’ajuster la fluidité membranaire. De telles altérations affectent les activités de "communication" de la membrane. Moins considéré dans les études en microbiologie jusqu’à présent, est la capacité des bactéries à assimiler les acides gras et autres molécules lipophiles directement de leur environnement. Des études récentes affirment qu’en dehors de leur utilisation comme source d'énergie, les acides gras s’insèrent dans les membranes pour compléter, et même pour supplanter le besoin de la synthèse endogènes de novo d’acides gras. En conséquence, l’environnement pourrait remodeler la composition de la membrane de la bactérie à son image. Les aliments et les organes d'animaux constituent une source riche en acides gras. L’observation de l’intégration efficace des acides gras et d'autres lipophiles dans la membrane des bactéries à Gram‐positif nous a conduit à une conclusion évidente : les molécules lipophiles exogènes peuvent reprogrammer les activités bactériennes1,2. Les conséquences peuvent être dramatiques, car l’intégration de certains acides gras peut conduire à la survie bactérienne dans une condition préalablement mortelle, ou, au contraire, elle peut provoquer la mort cellulaire. Dans cette présentation, je discuterai les études de différents laboratoires qui illustrent les effets des molécules lipophiles sur le comportement des bactéries à Gram‐
positif. 1. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram‐positive pathogens. Brinster S, Lamberet G, Staels B, Trieu‐Cuot P, Gruss A, Poyart C. Nature. 2009 458:83‐6. 2. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Brinster S, Lamberet G, Staels B, Trieu‐Cuot P, Gruss A, Poyart C. Nature. 2010 463, E4‐E5. Reply. 40
REGULATION DU METABOLISME DU CARBONE PAR LE SYSTEME PHOSPHOTRANSFERASE Josef Deutscher MICALIS, INRA/AgroParisTech, Thiveral‐Grignon Chez de nombreuses bactéries, le système PEP:sucre phosphotransférase (PTS) transporte et phosphoryle des hydrates de carbone comme le glucose, le fructose, etc. Le PTS est composé de 5 protéines ou domaines, dont 4 (EI, HPr, EIIA et EIIB) constituent une cascade de phosphorylation en utilisant le phosphoénolpyruvate comme donneur de phosphate. Les protéines du PTS sont phosphorylées sur des résidues His ou Cys. La 5ème protéine est insérée dans la membrane et fixe le substrat, qui après phosphorylation est relargué dans le cytoplasme. Les composants du PTS exercent aussi de nombreuses fonctions régulatrices. Ils peuvent phosphoryler d’autres protéines (régulateurs de transcription, enzymes cataboliques) ou interagir avec d’autres protéines (régulateurs de transcription, transporteurs des hydrates de carbone) en réponse à leur état de phosphorylation. Chez les firmicutes (bactéries à Gram‐positif à haut GC%), un composant du PTS (HPr) est également phosphorylé par une protéine kinase ATP‐dépendante sur une sérine. Cette phosphorylation est contrôlée par des intermédiaires de la glycolyse et entraîne exclusivement des fonctions régulatrices. La P‐Ser‐
HPr interagit avec CcpA (catabolite control protein A), le régulateur central de la répression catabolique chez les firmicutes, et permet à cette protéine de se fixer sur les sites cre (catabolite response elements) situés en amont ou au début des opérons cataboliques et ainsi d’inhiber leur expression. L’expression de près de 10% des gènes des firmicutes est contrôlée par ce mécanisme. P‐Ser‐HPr contrôle également le transport des sucres par les transporteurs ABC, comme l’utilisation du maltose chez L. casei. En revanche, P‐His‐HPr interagit avec des régulateurs de transcription comme YesS de B. subtilis et stimule leur activité ou phosphoryle des activateurs de transcription, comme MtlR, ou des antiterminateurs, comme LicT. Ces derniers possèdent des domaines spécifiques PRD (PTS regulation domain), qui sont des cibles de phosphorylation par les composants du PTS comme P‐His‐HPr, P‐EIIA ou P‐EIIB. De plus, l’interaction du domaine EIIB en état non‐
phosphorylé avec des activateurs de transcription est essentielle pour leur fonction. En conclusion, les composants du PTS forment un large réseau de régulation des différentes fonctions cellulaires en interagissant ou en phosphorylant de nombreuses protéines non‐
PTS. 41
SYSTEMES COUPLES DE DEAMIDATION/TRANSPORT D'ACIDES AMINES REQUIS POUR LA COLONISATION PAR HELICOBACTER PYLORI Damien Leduc, Julien Gallaud, Kerstin Stingl, Hilde de Reuse Institut Pasteur, Unité Pathogenèse de Helicobacter, Département de Microbiologie 75724 Paris cedex 15, France Helicobacter pylori est une bactérie pathogène qui infecte plus de la moitié de la population humaine mondiale. Cette bactérie provoque une gastrite qui peut évoluer en ulcère ou en cancer gastrique. Elle utilise préférentiellement des acides aminés comme source d'énergie et de carbone dont des quantités importantes d'aspartate, de glutamate et de leurs amides respectives (asparagine, glutamine). De fortes activités asparaginase et glutaminase ont été rapportées précédemment : elles produisent de l'ammoniac à partir de l'hydrolyse d'asparagine et de glutamine. Le rôle de ces activités dans la nutrition et la survie de H. pylori chez son hôte était encore mal connu. Des travaux récents (Shibayama et al. 2007) ont montré que l'hydrolyse de la Gln extracellulaire est dépendante de la γ‐glutamyltranspeptidase (Hp‐γGT), une protéine induisant l'apoptose. L'analyse du génome de H. pylori a permis l'identification des gènes Hp0723, Hp1506 et Hp0724 comme codant des candidats pour une asparaginase (Hp‐AnsB), un transporteur de glutamate (Hp‐GltS) et un transporteur d'asparagine (Hp‐DcuA). Le transport d'acides aminés radioactifs ainsi que les activités de déamidation ont été mesurés chez des souches sauvage et mutantes de H. pylori. Nous avons montré que Hp‐AnsB et Hp‐γGT sont des déamidases actives dans le périplasme. Elles produisent de l'ammoniac et de l'aspartate ou du glutamate à partir d'asparagine et de glutamine, respectivement. Hp‐GltS est l'unique transporteur du glutamate, tandis que l'aspartate est exclusivement transporté par Hp‐DcuA. L'action conjuguée de déamidases périplasmiques et de leurs transporteurs respectifs permet donc l'acquisition de glutamine, asparagine (indirectement), glutamate et aspartate (directement). De plus, ces systèmes sont actifs à pH neutre plutôt qu'à pH acide, suggérant une meilleure efficacité à proximité des cellules épithéliales de l'hôte. Enfin, Hp‐DcuA, comme les autres composantes de ces systèmes de déamidation/transport, est essentiel pour la colonisation par H. pylori d'un modèle animal. En conclusion, ces systèmes d'acquisition d'acides aminés régulés par le pH forment un mécanisme essentiel lors de la colonisation (Leduc et al, 2010). Nous proposons un modèle dans lequel ces deux systèmes non‐redondants participent à la virulence de H. pylori en produisant de l'ammoniac toxique et en déplétant les cellules gastriques et/ou immunitaires d'acides aminés protecteurs.
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L’ACQUISITION DE NUTRIMENT, UN NOUVEAU ROLE POUR LES RECEPTEURS DEPENDANTS DE TONB CHEZ LES BACTERIES PHYTOPATHOGENES, AQUATIQUES OU SYMBIOTIQUES DE L’HOMME Matthieu Arlat*, Guillaume Dejean, Alice Boulanger, Martine Lautier*, Servane Blanvillain‐
Baufumé, Claudine Zischek, Pauline Rival, Nicolas Hollebeck, Laurent Noël et Emmanuelle Lauber Laboratoire des Interactions Plantes‐Microorganismes – UMR 2594 INRA/CNRS – F‐31326 Castanet‐Tolosan, France. *Université Paul Sabatier, Toulouse 3, 118 route de Narbonne 31062 Cedex 9, France. Xanthomonas campestris pathovar campestris (XCC) est une bactérie Gram négatives phytopathogène infectant les crucifères (chou, navet radis, Arabidopsis). L’analyse du génome de 3 souches de XCC a révélé que les transporteurs dépendants de TonB (TBDTs) sont surreprésentés chez ce pathogène. Jusqu’alors, les TBDTs étaient surtout connus pour leur rôle dans le transport des complexes fer/sidérophore. Une analyse contextuelle du génome de XCC couplée avec des études fonctionnelles a révélé un nouveau rôle pour certains TBDTs : le transport de molécules végétales. Ces TBDTs sont alors associés avec des enzymes, des transporteurs de la membrane interne et des régulateurs, pour former des systèmes, appelés systèmes CUT (Carbohydrate Utilization with TBDTs systems), impliqués dans le métabolisme de molécules végétales. Nous avons caractérisé 4 systèmes CUTs chez XCC, impliqués dans l’utilisation du saccharose, de la pectine, du xylane et des glycanes. Ces systèmes CUT sont actifs in planta et permettent l’accomplissement du cycle infectieux de XCC. Ils sont particuliers car ils permettent le transport de molécules végétales complexes (>600 Da) avec une très forte affinité. Des études de génomique comparative ont révélé que ces 4 systèmes CUTs sont uniques au genre Xanthomonas et qu’ils sont notamment absents chez des bactéries non phytopathogènes proches sur le plan taxonomique. Il semble donc que ces systèmes soient spécifiques de l’association des Xanthomonas avec les plantes et représentent donc un facteur d’adaptation de ces bactéries. Nos études ont aussi permis de répertorier plusieurs espèces bactériennes présentant une surreprésentation des TBDTs et d’étendre la notion de système CUT. Ces bactéries proviennent d’environnements très diverses tels que les milieux aquatiques, (Caulobacter; Pseudoaleromonas); les plantes en décomposition (Saccharophagus degradans ; Cellvibrio japonicum) ou bien encore l’intestin humain (Bacteroides). Elles partagent la particularité de pouvoir exploiter des macromolécules d’origine végétale ou animale. L’ensemble de ces données souligne donc l’importance des TBDTs pour l’acquisition de certains nutriments dans des environnements très diverses. Cette fonction insoupçonnée des TBDTs semble confirmée par des travaux récents de métagénomique des milieux marins ou de la phyllosphère. 43
RECENT PROGRESSES ON THE METABOLISM MODELING OF BACTERIA: DEFINITION OF LOCAL AND GLOBAL MODULES AND A FIRST EXPLANATION OF THEIR EMERGENCE Vincent Fromion Institut National de la Recherche en Agronomie, Unité de Mathématique, Informatique et Génome UR1077, F‐78350 Jouy‐en‐Josas, France Growth is a highly optimized process in bacteria since the battle for the conquest of ecological niches is though. Understanding the key elements governing the growth rate management is then crucial to further understand and predict the bacterium behavior with respect to various environmental conditions. Constraint‐based approaches integrating the whole metabolic network of an organism such as Flux Balance Analysis successfully predicted the maximum growth rate reachable in various conditions [1]. However, limitations exist since they fail to predict a number of commonly observed metabolic strategies. Here we showed that the sharing of resources between the cellular processes intrinsically and structurally limits the growth rate [2]. We formalized the problem of resource repartition at the cell scale as an optimization problem and demonstrated the existence of a trade‐off for the protein repartition between the translation apparatus and the metabolic network. Moreover, the resolution of this optimization problem for Bacillus subtilis allows the estimation for a given medium composition of (i) the maximal growth rate reachable; (ii) the concentrations of ribosomes, the concentration of proteins involved in the metabolic network and more generally the resource repartition between cell components; (iii) the flux distribution. Besides, we also predicted the induction and repression of metabolic sub‐systems with respect to the environmental condition which correspond to the recently identified elementary modules of Bacillus subtilis [3]. Finally we also recovered the well‐known evolution of ribosomes and metabolic proteins with respect to the growth rate of the Copenhagen school [4]. This study shows that the formalization of constraints acting on the the cell as an optimization problem allows us to provide a first explanation of the emergence of functional modules in the metabolic network regulation of bacteria. [1] Edwards J, Palsson BO. The Escherichia coli MG1655 in silico metabolic genotype: its definition, characteristics, and capabilities. Proc Natl Acad Sci USA, 97(10):5528–5533, 2000. [2] Goelzer A, Fromion V, Scorletti G. Cell Design in Bacteria As a Convex Optimization Problem. 48th IEEE Conference on Decision and Control, Shangai, Chine, 2009. [3] Goelzer A, Bekkal Brikci F, Martin‐Verstraete I, Noirot P, Bessières P, Aymerich S, and Fromion V, Reconstruction and analysis of the genetic and metabolic regulatory networks of the central metabolism of Bacillus subtilis, BMC Systems Biology (2) 1–20, 2008. [4] Marr AG. Growth rate of Escherichia coli. Microbiol Rev. 55(2) :316–333, 1991. 44
METABOLISME DES OLIGO‐FRUCTOSES PAR UNE SOUCHE D'ESCHERICHIA COLI PATHOGENE Gaëlle Porcheron , Emmanuel Kut , Gabrielle Potocki‐Veronese2 et Catherine Schouler1 1
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: Laboratoire de Pathologie et Immunologie Aviaires, UR1282‐Unité Infectiologie Animale et Santé Publique, INRA, F‐37380, Nouzilly, France 2
: Equipe de Catalyse et Ingénierie Moléculaire Enzymatiques, Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, INSA‐UMR INRA 792‐UMR CNRS 5504, 135 avenue de Rangueil, F‐31077, Toulouse cedex 4, France Pour la première fois, nous avons montré la capacité d’une bactérie pathogène, la souche d'Escherichia coli à virulence extra‐intestinale d'origine aviaire BEN 2908, à métaboliser les fructooligosaccharides à chaîne courte ou scFOS. Ces oligomères sont les prébiotiques majoritairement utilisés à l’heure actuelle en tant qu’additif alimentaire dans les élevages et chez l’Homme. Ils stimuleraient de façon sélective la croissance et/ou l'activité des bactéries probiotiques, conduisant entre autres à une diminution de la population de bactéries pathogènes du microbiote intestinal. Chez la souche BEN 2908, ce métabolisme est médié par un groupe de gènes, nommé région fos, situé sur l’îlot de pathogénicité AGI‐3. La propriété à assimiler les scFOS contribue largement à la capacité de la souche à s’implanter dans sa niche, l’intestin, ceci dans les 8 premiers jours post‐inoculation orale, mais n’interviendrait pas dans la phase de maintenance. La région fos est composée de 6 gènes organisés en opéron codant pour un transporteur de sucres, deux glycosyl‐hydrolases de la famille 32, une fructokinase et deux protéines de fonction inconnue, et d’un gène transcrit de façon divergente codant pour un régulateur transcriptionnel putatif de la famille LacI/GalR. Afin de comprendre le fonctionnement de cette région, nous avons suivi la croissance de la souche et l’expression des gènes fos par dosage de l’activité d’un gène rapporteur codant pour la luciférase dans différents milieux et dans différents fonds génétiques (souche sauvage et dérivés dans lesquels soit le gène codant pour le transporteur FosT soit le gène codant pour le régulateur FosR ont été délétés). Nous avons démontré que l’expression des gènes fos est réprimée par FosR. Nous avons également pu montrer que les scFOS induisent l’expression des gènes fos et que cette expression est sous le contrôle de la répression catabolique. En présence de contenu caecal, l’expression des gènes fos est très élevée même dans la souche délétée du gène fosT, suggérant qu’un autre inducteur que les scFOS pourrait exister. De plus, nous avons caractérisé partiellement les deux glycosyl‐
hydrolases, FosE1 et FosE2. FosE1 est une fructan‐β‐(2,1)‐fructosidase qui hydrolyse les liaisons existant entre les unités fructose des scFOS. Elle a également un rôle de saccharase, hydrolysant la liaison α1‐β2 reliant le glucose et le fructose de ces oligomères. FosE2 est une fructan‐β‐(2,6)‐fructosidase, elle est spécifique des liaisons reliant les unités fructose dans les oligomères de type levane. Une hypothèse est qu’un sucre dérivé du levane soit un autre inducteur de l’expression des gènes fos. 45
ASSEMBLAGE DES SYSTEMES DE SECRETION DE TYPE VI Eric Cascalès LISM, Marseille De nombreux systèmes macromoléculaires traversent l’enveloppe pour permettre l’assemblage de structures extracellulaires ayant pour fonction d’adhérer à des supports ou des cellules, de se mouvoir, ou de sécréter des macromolécules dans le milieu extérieur. Ces complexes protéiques doivent donc à la fois se former correctement, mais également jouer avec la présence de membranes et de peptidoglycane. Au laboratoire nous utilisons le système de sécrétion de Type VI d’un variant pathogène d’Escherichia coli comme modèle d’étude. Au cours de cette présentation, je discuterai nos derniers résultats qui ont permis d’identifier certains sous‐complexes de ce système de sécrétion ainsi que de caractériser les composants ancrés dans la membrane externe ou interagissant avec le réseau de peptidoglycane. 46
PROTEIN SECRETION IN BACTERIA VIA THE ATP BINDING CASSETTE TRANSPORTER (T1SS) Muriel Masi and Cécile Wandersman2 1
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Université Paris Sud Orsay ; Institut Pasteur CNRS URA 2172 Gram‐negative bacteria secrete many proteins, including hemophores, via the type 1 secretion system (T1SS). The latter consists of three proteins powered by the inner membrane ABC protein. Proteins secreted by T1SS have a C‐terminal signal, essential for secretion that interacts with the ABC protein. We have shown that the Serratia marcescens hemophore has regions located outside of the C‐terminal signal sequence that bind to the ABC protein. They are linear numerous and distributed throughout the polypeptide. These sequences drive the T1SS assembly, maintain its integrity and maximize hemophore secretion. Consequently they are named anchoring sites. The C‐terminal signal triggers ATP hydrolysis and disassembly of the T1SS proteins. We are presently testing whether anchoring sites are present on other T1SS substrates. We are also testing whether the insertion of recombinant peptides between the anchoring sites and the C‐terminal secretion signal improves secretion of recombinant proteins. 47
DISSECTION DES INTERACTIONS ENTRE LES COMPOSANTS DU SYSTEME DE SECRETION DE TYPE II CHEZ LA BACTERIE PHYTOPATHOGENE ERWINIA CHRYSANTHEMI Mathilde A. Lallemand et Vladimir E. Shevchik Microbiologie, Adaptation et Pathogénie, UMR 5240 CNRS‐UCB‐INSA‐Bayer CropSciences, Université Lyon1, Bat. Lwoff, 10 rue Dubois, 69622 Villeurbanne France Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d’enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l’une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double‐hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l’activité d’adénylate cyclase. Nous avons démontré que le motif de type ferredoxine, situé en C‐terminus d’OutL et d’OutM, est directement impliqué dans l’homo‐ et l’hérérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d’OutC et d’OutD a été aussi détectée. Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple‐hybride ont été réalisées en co‐exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats montrent qu’OutL empêche l’interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l’activation de l’ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d’analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double‐hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N‐terminus du TMS et BlaM au C‐terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi‐partenaires entre les TMS d’OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull‐down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS‐TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne. 48
LE PETIDOGLYCANE: UNE MACROMOLECULE FASCINANTE Ivo Gomperts Boneca Institut Pasteur, Paris Le peptidoglycane est un composant majeur et unique de la paroi bacterienne. Cet heteropolymere est le garant de l'integrite cellulaire et de la forme caracteristique de chaque bacterie. Ainsi, celui‐ci est la cible de differentes classes d'antibiotiques comme les beta‐lactamines et les glycopeptides entre autres. De plus, ce marqueur unique aux bacteries a ete mis a profit par les eukaryotes pour detecter la presence des bacteries dans leur environnement. En utilisant helicobacter pylori comme modele d'etude, je presenterais les mecanismes mis en place par cette bacterie pour controler sa forme grace a des modifications de son peptidoglycane. De plus, /h. Pylori /met a profit l'activite biologique de son peptidoglycane pour induire une inflammation et regule son metabolisme du peptidoglycane pour moduler le niveau de reponse de l'hote. 49
IDENTIFICATION DE LA MACHINERIE MOLECULAIRE RESPONSABLE DE LA MOTILITE AVENTURIERE CHEZ MYXOCOCCUS XANTHUS Rym Agrebi*, Jennifer Luciano*, Anne Valérie Le Gal, Francesca Fiegna, Céline Brochier, Tâm Mignot Laboratoire de Chimie Bactérienne CNRS UPR9043. Institut de Microbiologie de la Méditerranée. 31, chemin Joseph Aiguier. 13009 Marseille. France *co‐premiers auteurs La motilité aventurière (motilité‐A), également appelée motilité de type “gliding” chez Myxococcus xanthus est définie comme le déplacement “actif” d’une cellule sur un substrat en absence de tout appendice extracellulaire visible et de tout changement morphologique de l’enveloppe. Malgré plusieurs décennies de recherches et divers modèles proposés, le mécanisme de la motilité aventurière n’est pas réellement compris et aucune machinerie moléculaire n’a pu être clairement identifiée. De récents travaux suggèrent que la motilité‐A impliquerait l’existence de points d’adhésion répartis le long du corps cellulaire, où seraient couplés l’adhésion au substrat et la traction sur un cytosquelette interne. Alors que de nouvelles données confirment que le cytosquelette MreB est directement impliqué dans le positionnement de ces points d’adhésion, le cœur de la machinerie qui connecte ce cytosquelette au substrat reste non identifié. Nous avons ré‐analysé des gènes préalablement identifiés lors de cribles génétiques chez M. xanthus comme étant nécessaires à la motilité à la recherche de gènes codant plus particulièrement pour des protéines sécrétées et/ou contenant des motifs spécifiques d’interaction protéine‐protéine et également conservés dans d’autre myxobactéries capable de « gliding ». Par une approche bioinformatique, nous avons pu mettre en évidence un cluster de gènes codant pour une potentielle machinerie de motilité‐A. Nous avons également pu établir l’histoire évolutive de ces gènes chez des bactéries apparentées. L’analyse fonctionnelle de mutants de ces gènes a par ailleurs confirmé leur rôle critique dans la motilité‐A et nous a permis de les définir en tant qu’éléments structuraux de la machinerie. Les expériences en cours permettant de caractériser la fonction de ces gènes nouvellement identifiés vous seront présentées. 50
RÉGULATION DES GÈNES DE SYNTHESE DES PHOSPHOLIPIDES EN REPONSE AU STRESS CHEZ E. COLI E. Bouveret, A. Wahl, L. My, R. Dumoulin LISM, IMM, CNRS, 31 chemin Joseph Aiguier 13009 Marseille La composition en phospholipides de la membrane plasmique des bactéries doit être contrôlée de façon robuste afin d’assurer le maintien de l’homéostasie membranaire. Si la voie de biosynthèse des phospholipides est bien décrite, en revanche les mécanismes de régulation génétique restent étonnamment mystérieux car peu étudiés. En effet, la composition en phospholipides majeurs (phosphatidyl‐ethanolamine, phosphatidylglycérol et cardiolipine) ne varie pas quel que soit le taux de croissance, ce qui suggère une expression constitutive liée au taux de croissance et une régulation au niveau enzymatique par feedback des différentes espèces lipidiques. Pourtant, des études transcriptomiques récentes ont mis en évidence que les gènes de synthèse des phospholipides répondent de façon de manière coordonnée à des stress touchant l’enveloppe bactérienne ou la croissance. Nous avons étudié en détail la régulation du couple des gènes voisins plsB et dgkA codant pour l’acyl‐glycerol‐3‐phosphate transférase et la diacylglycérol kinase, deux enzymes clefs dans la voie de biosynthèse des phospholipides chez E. coli. Nous avons montré que ces gènes sont régulés de façon antagoniste lors de divers stress, par des mécanismes variés : en réponse à des stress d’enveloppe soit par le facteur alternatif SigmaE, soit par le système à deux composants BasRS, et en réponse à des carences nutritionnelles par le ppGpp. L’expression de plsB est contrôlée par deux promoteurs, l’un responsable de l’expression constitutive de plsB qui permettrait la coordination de la synthèse des phospholipides avec le taux de croissance, et l’autre responsable de la réponse au stress dépendante de SigmaE. L’expression de dgkA est activée par le système à deux composants BasRS. Ce système à deux composants active des enzymes de modifications du LPS, dont une phospho‐
ethanolamine transférase qui prélève un groupement phosphoethanolamine sur les phospholipides de la membrane interne pour le greffer sur le LPS. L’action de DgkA est alors de recycler ces lipides endommagés afin de les réintégrer dans la voie de biosynthèse des phospholipides. Le locus plsB‐dgkA apparaît donc comme un point crucial de régulation de la biosynthèse des phospholipides, pour l’intégration de différents signaux de réponse au stress. 51
LA REPONSE PHAGE‐SHOCK‐PROTEINE REQUIERT L’ACTIVATION DU COMPLEXE MEMBRANAIRE PspBC ET L’ASSOCIATION DU REPRESSEUR PspA A LA MEMBRANE BACTERIENNE Erwan Gueguen*, Saori Yamaguchi, N. Kaye Horstman et Andrew J. Darwin Department of Microbiology, New York University School of Medicine, New York, NY, USA * Laboratoire actuel: Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires, CNRS – UPR9027, Marseille, France Chez le pathogène Yersinia enterocolitica, l’expression du système de sécrétion de type III, qui est requis pour infecter l’hôte, impose un stress membranaire à la bactérie qui déclenche en réponse l'expression d'un groupe de gènes appelé régulon Phage‐shock‐protein (Psp). Le système Psp permet alors à Yersinia enterocolitica de rester viable. Les 4 protéines essentielles à la réponse Psp sont PspA, PspB, PspC et PspF. PspF est l’activateur transcriptionnel du promoteur Psp. Celui‐ci est réprimé par PspA en absence de stress. PspB et PspC sont 2 protéines de la membrane interne qui « détectent» le signal. En présence de stress, il est proposé que le signal serait transmis de PspBC à PspA qui « libèrerait » alors PspF. Une fois leur expression activée, PspA, PspB et PspC joueraient alors des fonctions effectrices. Le mécanisme qui mènerait à la libération de PspF en cas de stress n’est pas connu. En utilisant des mutants de PspBC et de PspA qui activent ou répriment constitutivement le système Psp, nous avons montré que le complexe PspBC existe sous une forme active et non active et que l’activation de ce complexe en cas de stress conduit à la localisation de PspA à la membrane interne. L’obtention des mutants PspBC nous a permis aussi de définir les domaines de ces protéines requis pour la transmission du signal. Nous proposons un modèle dans lequel PspA est majoritairement présent dans le cytoplasme en absence de stress mais s’associe à la membrane interne et au complexe actif PspBC en cas de stress. PspF, en restant cytosolique, peut alors activer le système Psp. 52
BACTERIAL MEMBRANE FISSION Thierry Doan, Erdem Karatekin, Kathleen A. Marquis, Briana M. Burton, and David Z. Rudner Harvard Medical School, Boston, USA Laboratoire de Chimie Bactérienne, CNRS, Marseille, France Les événements de fusion et de fission membranaire sont essentiels chez tous les êtres vivants. Ils sont beaucoup étudiés chez les virus et les eucaryotes. Cependant, on ne sait presque rien des mécanismes impliqués dans les remaniements membranaires chez les bactéries. Nous avons étudié la fission membranaire au cours de la sporulation chez Bacillus subtilis. Au début de cette différenciation morphologique, une division asymétrique génère deux cellules adjacentes mais distinctes. Peu après, les membranes de la grande cellule‐
mère migrent autour de la petite préspore de manière similaire à une endocytose. Finalement, lorsque les extrémités des membranes de la cellule‐mère se rencontrent au pole opposé de la préspore, la fission membranaire se produit pour achever le processus d'endocytose. Nous avons identifié une protéine membranaire, appelée FisB, qui est nécessaire à la fission de manière spécifique. En particulier, l'absence de FisB ne perturbe pas les étapes précoces du processus d'endocytose. Remarquablement, la localisation de FisB au pole de la préspore est corrélée avec la fission dans l'espace et dans le temps. In vitro, FisB forme des oligomères de forte affinité qui sont "résistants au SDS", comme les complexes eucaryotes et viraux de fusion membranaire. La capacité de FisB à former des complexes in vitro, sa localisation au site de fission et la fission membranaire in vivo dépendent du domaine extracellulaire hydrophobe de FisB. Ces résultats supportent l'idée que FisB catalyse directement la fission membranaire : lorsque les extrémités des membranes migrantes se rejoignent au pole de la préspore, des complexes de FisB permettraient de "tirer" ces membranes l'une vers l'autre pour causer la déstabilisation des bicouches lipidiques nécessaire à la fission. Pour tester cette hypothèse, nous nous sommes demandé si FisB était capable d'induire la fusion (ou la fission) de protéoliposomes in vitro. De manière surprenante, nos résultats indiquent que la présence de FisB dans une seule vésicule suffit à induire la fusion de celle‐ci avec une autre vésicule. Cela suggère que le domaine extracellulaire de FisB est capable d'interagir en trans avec les lipides pour rapprocher deux bicouches lipidiques, de manière similaire aux protéines virales de fusion membranaire. 53
DE NOVO PROTEIN FOLDING IN BACTERIA Pierre Genevaux LMGM, Toulouse The early in vitro classical work by Anfinsen showed that the native form of a protein is determined by its primary amino acid sequence. Yet, protein folding in the crowded cellular environment is not always a spontaneous process. In vivo, efficient protein folding depends upon the essential assistance of the so‐called "molecular chaperones", which protect non‐
native proteins from misfolding and aggregation, off‐pathways in protein biogenesis. Molecular chaperone generally act through cycles of binding and release of hydrophobic polypeptide stretches that are often buried in the native form of proteins. Client segments can also be present in native macromolecular complexes and in this case, molecular chaperones can orchestrate the assembly or disassembly of these complexes. In agreement with such properties, bona fide molecular chaperones functions are critical for de novo protein folding and in response to denaturing stresses, for signal transduction pathways and for protein translocation through biological membranes. Hence, newly made polypeptides emerging from the ribosome are assisted by a pool of molecular chaperones and targeting factors, which enable them to efficiently partition as cytoplasmic, integral membrane, or exported proteins. It is known that de novo protein folding in the cytosol of the bacterium Escherichia coli is mainly orchestrated by the chaperones Trigger Factor, DnaK (Hsp70) and GroEL (Hsp60). The ribosome‐bound Trigger Factor is the first chaperone to interact co‐translationally with nascent polypeptides, and it is thought that the majority of the newly synthesized polypeptides can reach their native state in the cytoplasm without further help. Yet, a substantial portion of cytoplasmic proteins need further co‐ and/or post‐translational assistance by either the DnaK/DnaJ/GrpE or the GroEL/GroES chaperone machines for their correct folding. Recent studies have highlighted the fact that these major chaperone machines can cooperatively act on newly synthesized polypeptides, and display significant functional complementarities and overlapping substrate specificity. The apparent plasticity of such chaperone networks is of central importance and reflects in large part the cellular capacity to adapt to a plethora of stress stimuli and environmental insults. 54
EngA, UNE FAMILLE DE GTPases BACTERIENNES AUX PROPRIETES UNIQUES Anne‐Emmanuelle Foucher1, Céline Freton2, Christophe Grangeasse3, Anne Galinier2 & Jean‐
Michel Jault1 1
Institut de Biologie Structurale, UMR 5075 UJF/CEA/CNRS, Grenoble ; 2Laboratoire de Chimie Bactérienne, Marseille, 3Institut de Biologie et Chimie des Protéines, Lyon. Il existe chez la plupart des bactéries une GTPase unique, EngA (pour ‘Essential nesserial GTPase A’), avec deux domaines de fixation du GTP en tandem, GD1 et GD2, suivi par un domaine KH (pour ‘K homology’). Cette GTPase, qui est essentielle pour les bactéries, interagit avec le ribosome et est très vraisemblablement impliquée dans sa biogenèse. EngA purifiée à partir de différentes espèces possède une activité GTPase intrinsèque élevée contrairement aux GTPases eucaryotes qui agissent plutôt comme des interrupteurs moléculaires. Nous avons purifié et caractérisé l’activité GTPase d’EngA de Bacillus subtilis, soit la protéine entière, soit ses deux moitiés indépendamment, GD1 et GD2‐KH. L’activité GTPase d’EngA est similaire à celle du domaine GD1 seul, alors que GD2‐KH possède une très faible activité GTPase. De manière intéressante, le potassium stimule fortement l’activité GTPase de chacune des constructions protéiques. Néanmoins, ce cation ne modifie ni l’affinité pour les nucléotides, ni l’état monomérique d’EngA. Ainsi, comme cela a été initialement proposé pour une autre GTPase bactérienne, MnmE, le potassium agirait comme une GAP (‘pour GTPase Activating Protein’) chimique . Cependant et contrairement à MnmE, cela n’impliquerait pas de mécanisme de dimérisation chez EngA. D’après les structures 3‐D connues, un mécanisme moléculaire permettant au potassium de stimuler l’activité GTPase d’EngA ou de ses domaines isolés est proposé. Récemment, EngA a été trouvé phosphorylée dans deux études de phosphoprotéomes et in vitro, PrkC est capable de phosphoryler EngA. Il existe ainsi vraisemblablement un niveau supplémentaire de contrôle de l’activité GTPase d’EngA via un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation.
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PROTEOMIQUE A HAUTE RESOLUTION ET LA TRANSDUCTION DE SIGNAL CHEZ LES BACTERIES Ivan Mijakovic MICALIS UMR 1319, AgroParisTech‐INRA, 78850 Thiverval‐Grignon Protéomique en spectrométrie de masse à haute résolution a récemment apporté une petite renaissance dans le domaine de signalisation cellulaire chez les microorganismes. Cette approche a permit l’identification des modifications post traductionnelles (phosphorylation, methylation, acétylation, glycosylation) avec une haute précision (détermination de site exact de la modification) et d’une manière semi‐quantitative (quantification relative). Par exemple, la phosphorylation sur Ser/Thr/Tyr chez les bactéries a été traditionnellement considérée comme une occurrence très rare, mais aujourd’hui nous sommes capables d’identifier de centaines de sites de phosphorylation de ce type. Un grand nombre de ces événements participent dans les processus de régulation cellulaire, et certains sont aussi impliqués dans les relations pathogène‐hôte. Les approches de protéomique quantitative (SILAC, ICAT) nous permettent de comparer le taux de modifications post‐traductionnelles d’une manière globale entre deux (ou plusieurs) souches différentes, ou entre les conditions de croissance différentes. Cet outil devient donc indispensable en biologie systémique et permet d’étudier le dynamisme de réseau de modifications post traductionnelles ; ce qui est une avantage essentiel pour la compréhension de la transduction de signal. Cette présentation traitera les outils et approches d’analyse protéomique à haut débit chez les bactéries, et les exemples concrets ou cette analyse a approfondi notre compréhension en matière de traduction de signal chez la bactérie modèle Bacillus subtilis. 56
BIOGENESE DES COMPLEXES RESPIRATOIRES ANAEROBIES CHEZ LA BACTERIE ESCHERICHIA COLI Axel Magalon Laboratoire de Chimie Bactérienne, Institut de Microbiologie de la Méditerranée, CNRS, Université Aix‐
Marseille, Marseille, France [email protected]‐mrs.fr La biogenèse des métalloprotéines regroupe l’ensemble des événements post‐
traductionnels permettant à une apoprotéine par l’insertion d’un ou de plusieurs centres métalliques d’aboutir à une holoprotéine mature et fonctionnelle. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines accessoires qui ne font pas partie de la structure finale de l’enzyme. La coordination dans le temps et dans l’espace de ces événements post‐
traductionnels s’avère être un élément crucial du processus de biogenèse [1]. A ce jour, de nombreuses questions restent en suspens et notamment concernent le rôle exercé par les protéines accessoires spécifiques. Nous avons choisi de répondre à ces questions en nous intéressant à un complexe respiratoire membranaire majeur retrouvé chez de nombreux organismes procaryotes, le complexe nitrate réductase. Il s’agit d’un complexe de trois sous‐unités comportant pas moins de huit centres métalliques. La mise en place de ce complexe et son activité dépendent strictement de la présence de la protéine accessoire NarJ codée par l’opéron narGHJI [2]. Les études menées ces dernières années montrent que la protéine NarJ a pour fonction d’orchestrer différents événements de biogenèse. NarJ coordonne l’insertion séquentielle des différents centres métalliques dans la sous unité catalytique NarG [3]. Par ailleurs, la fixation de NarJ sur l’extrémité N‐terminale de NarG évite l’ancrage prématuré de l’enzyme à la membrane [4]. La fixation de la protéine accessoire spécifique à l’extrémité N‐
terminale de la métalloprotéine en cours de maturation est un phénomène également retrouvé dans le cas de métalloprotéines exportées ; le peptide correspond dans ce cas à la séquence signal d’adressage à la machinerie Tat. Les bases structurales et moléculaires de la reconnaissance de l’extrémité N‐terminale de la métalloprotéine par le chaperon NarJ seront décrites sur la base d’approches pluridisciplinaires alliant biochimie, biologie moléculaire, microcalorimétrie et RMN [5]. Par ailleurs, la mise en évidence d’une haute flexibilité structurale du chaperon permet de rendre compte du caractère multifonctionnel de ce dernier au cours du processus de biogenèse. L’ensemble de ces données permettra de décrire un modèle global de biogenèse pour un large groupe de métalloprotéines impliquées dans les processus de respiration bactérienne en anaérobiose. [1] Magalon,A., and Mendel, R. R. 2008. EcoSal—Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. http://www.ecosal.org. [2] Blasco, F., Pommier, J., Augier, V., Chippaux, M., Giordano, G., (1992) Molecular Microbiology 6, 221‐230 [3] Lanciano, P. ; Vergnes, A. ; Grimaldi, S. ; Guigliarelli, B. ; Magalon, A. (2007) The Journal of biological chemistry 282,17468‐74 [4] Vergnes, A., Pommier, J., Toci, R., Blasco, F., Giordano, G., and Magalon, A. (2006) The Journal of biological chemistry 281, 2170‐2176 [5] Zakian S, Lafitte D, Vergnes A, Pimentel C, Sebban‐Kreuzer C, Toci R, Claude JB, Guerlesquin F and Magalon A. (2010) FEBS Journal 277:1886‐95. 57
ETUDE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE HBHA, UNE ADHESINE MAJEURE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS P. Lebrun, J. Segers, S. Lecher, F. Allain, M. Carpentier, J.M. Wieruszeski, G. Lippens, D. Raze, C. Locht CIIL ‐ Center for Infection and Immunity of Lille, INSERM U1019 ‐ CNRS UMR 8204 Univ Lille Nord de France, Institut Pasteur de Lille La tuberculose est une maladie infectieuse très contagieuse causée par Mycobacterium tuberculosis. Le mécanisme d'infection se déroule en deux grandes phases : la primo‐infection pulmonaire suivie par la dissémination systémique extra pulmonaire vers d'autres organes (rein, rate, os) provoquant dans 5 à 10% des cas une forme active de la maladie. La protéine Heparin‐Binding Haemagglutinin (HBHA) est une adhésine majeure située à la surface de M.tuberculosis. Au cours de l'infection, elle joue un rôle crucial dans la dissémination des bacilles du fait de sa capacité à interagir avec les cellules épithéliales via les polymères de Glycoaminoglycannes (GAGs) situés à leur surface. HBHA montre des propriétés biochimiques et biophysiques la rattachant à la famille des Protéines Intrinsèquement Déstructurées (PIDS). Elle subit une maturation post traductionnelle consistant en la méthylation des lysines situées à l'extrémité C‐terminale. Par des méthodes de « cross‐linking » nous avons montré que la HBHA est dimérique en solution. L’application de cette méthode sur bactéries entières a montré qu’in vivo, dans un contexte membranaire, la HBHA est également dimérique. Différents domaines impliqués dans la dimérisation ont été identifiés par la construction de protéines recombinantes tronquées. En plus de la dimérisation, nous avons caractérisé la liaison de la HBHA aux GAGs. Nous avons déterminé la taille minimale des GAGs nécessaire pour interagir avec HBHA et obtenir le ligand le plus homogène possible. Ce ligand nous a permis d'utiliser des techniques d'études structurales en solution comme le Dichroïsme Circulaire (CD) et la RMN afin de montrer le caractère singulier du mécanisme d’interaction HBHA / GAGs. A l’inverse d’autres « Heparin Binding Proteins » riches en lysines, HBHA ne se structure pas en coiled‐
coil après la formation du complexe. Ces études apportent des informations nouvelles permettant de mieux comprendre le mécanisme d’action de la HBHA et ainsi d’augmenter nos connaissances sur la pathogenèse de la tuberculose et d’autres maladies causées par les mycobactéries. 58
ETUDE STRUCTURALE DE L’HELICASE REPLICATIVE D’HELICOBACTER PYLORI Meike Stelter 1, Irina Gutsche 2, Ulrike Kapp 1, Marc Jamin 2, Joanna Timmins 1, Laurent Terradot 1,3 1. Structural Biology Group, ESRF, B.P. 220, 6 rue Jules Horowitz, F‐38043 Grenoble Cedex, France. 2. UVHCI, FRE 2854 CNRS‐UJF, B.P. 181, 6, rue Jules Horowitz, F‐38042 Grenoble Cedex 9, France. 3. IBCP, Structural Biology of bacterial Macromolecular Complexes, 7, passage du Vercors, 69007 Lyon, Cedex, France. Chaque cellule doit répliquer son ADN génomique avant de procéder à la division cellulaire. Chez les bactéries, ce processus démarre par étape d’initiation durant laquelle la protéine DnaA interagit avec des séquences d’ADN définies, appartenant à une région spécifique (oriC) du chromosome bactérien. Une fois formé, le complexe DnaA‐ATP‐oriC entraîne l’ouverture d’une zone de l’ADN riche en A‐T. Le complexe DnaA‐oriC sert ensuite de plateforme pour charger un hexamère de l’hélicase réplicative DnaB sur chaque simple brin de la fourche. Chez E. coli, une autre protéine, DnaC facilite le chargement de DnaB. Elle forme un complexe avec DnaB et également avec DnaA. DnaB est une AAA+ ATPase hexamèrique dont plusieurs structures cristallographiques sont disponibles. Elles indiquent que l’hexamère possède deux faces distinctes : un anneau formé par les domaines N‐
terminaux de symétrie 3 et un anneau contenant les domaines C‐terminaux de symétrie 6. L’activité ATPase est contenue dans le domaine C‐term alors que le domaine N‐ter est essentiel pour l’activité hélicase et la formation de l’hexamère. Chez le pathogène humain Helicobacter pylori (Hp), les mécanismes de la réplication sont mal cernés et les protéines HpDnaA et HpDnaB ont un degré de similarité relativement faible avec leurs homologues chez E. coli. En particulier, une insertion d’environ 40 acides aminés est présente dans le domaine C‐terminal de DnaB et semble jouer un rôle dans la multimérisation de la protéine. Par ailleurs, H. pylori ne possède pas d’homologue de séquence de DnaC dans son génome. Des travaux ont aussi montré que lorsqu’elle est exprimée en « trans », HpDnaB est capable de complémenter un mutant ∆DnaC d’E. coli. Afin de mieux comprendre ces propriétés particulières d’HpDnaB, nous avons déterminé la structure du domaine ATPase de HpDnaB par cristallographie aux rayons X ainsi que la structure de la protéine entière par microscopie électronique. Ces structures révèlent un arrangement original de DnaB et suggèrent que l’insertion en C‐terminal entraine des différences structurales importantes avec les autres DnaB connues. Ces structures nous conduisent à émettre des hypothèses nouvelles sur les mécanismes de chargement des hélicase réplicatives chez H. pylori mais également chez les autres bactéries. 59
LIEN ENTRE REGULATION DE L’EXPRESSION DES FACTEURS DE VIRULENCE ET ETAT METABOLIQUE CHEZ BACILLUS ANTHRACIS Alice Chateau, Willem Van Schaik, Anne Six et Agnès Fouet Toxines et Pathogénie Bactériennes, Institut Pasteur CNRS, URA2172 Bacillus anthracis, agent responsable de la maladie du charbon, est une bactérie à Gram positif, sporulante. Les spores résident dans le sol. Après ingestion par l’hôte mammifère, elles germent et les bacilles synthétisent des facteurs de virulence, les principaux étant une toxine tripartite et une capsule (1). Leur synthèse est contrôlée par des facteurs environnementaux, équilibre CO2‐bicarbonate et température, signant la présence dans l’hôte mammifère (2). Un régulateur transcriptionnel majeur a été décrit, AtxA, qui active l’expression des gènes de la toxine et, dans une moindre mesure, celle de l’opéron de biosynthèse de la capsule (3). La transcription des gènes des composants de la toxine est maximale à l’entrée en phase stationnaire des bactéries. Ceci suggère l’intervention de régulateurs dits «de transition de phase». De tels régulateurs, dont CodY, ont été décrits chez Bacillus subtilis, organisme modèle des bactéries à Gram positif. Chez les bactéries à Gram positif pathogènes où son rôle a été étudié, CodY est un répresseur de la virulence ; par contre, chez B. anthracis il en est un activateur (4). L’activité de CodY étant dépendante de la présence de co‐facteurs, GTP et acides aminés branchés, sa nécessaire présence pour la virulence de B. anthracis lie métabolisme et virulence. CodY active indirectement l’expression des gènes de la toxine en augmentant l’accumulation d’AtxA. Ce contrôle se fait au niveau post‐traductionnel. CodY est cependant sans effet sur la synthèse de la capsule, la quantité résiduelle d’AtxA étant suffisante pour la pleine expression de l’opéron cap. Les mutants codY sont de virulence atténuée indépendamment du fond génétique utilisé, y compris dans des souches atoxinogènes, suggérant que CodY contrôle l’expression de gènes de facteurs associés à la virulence, en plus de ceux de la toxine. Une étude transcriptomique a indiqué que CodY active l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du fer. De fait, une souche codY est, contrairement à la souche parentale, incapable de croître dans des milieux où la seule source de fer est organique (5). Métabolisme du fer, contrôlé par CodY, et virulence sont liés. 1. 2. 3. 4. Mock M & Fouet A (2001) Annu Rev Microbiol 55, 647‐671. Fouet A & Mock M (2006) Curr Opin Microbiol 9, 160‐166. Fouet A Res Microbiol in press. van Schaik W, Chateau A, Dillies MA, Coppee JY, Sonenshein AL, & Fouet A (2009) Infect Immun 77, 4437‐
4445. 5. Château A, van Schaik W, Six A, & Fouet A, en préparation 60
LE SYSTEME A DEUX COMPOSANTS PPRA/PPRB CONTROLE DIRECTEMENT LA FORMATION DU BIOFILM ET LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES CHEZ PSEUDOMONAS AERUGINOSA Christophe S. Bernard, Caroline Giraud, Christophe Bordi & Sophie de Bentzmann. Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes macromoléculaires, CNRS, Aix‐Marseille Université, 31 chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille cedex 20. Les bactéries vivent le plus souvent sous forme de communautés sédentaires englobées dans une matrice d’exopolysaccharides autoproduite. Si elles privilégient ce mode de vie, c’est qu’elles en tirent des avantages en termes de survie, de compétition et d’évolution. Le biofilm constitue, en particulier, un moyen accru de résistance aux agressions environnementales comme c’est le cas pour Pseudomonas aeruginosa qui forme, au cours d’infections pulmonaires chroniques, un biofilm résistant au système immunitaire et aux antimicrobiens. La compréhension des mécanismes liant biofilm et résistance aux antibiotiques est nécessaire car elle pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le système à deux composants (TCS) PprA/PprB a été identifié comme contrôlant la perméabilité membranaire et la résistance aux aminoglycosides chez P. aeruginosa. Au sein du laboratoire, nous avons démontré qu’il active directement l’expression de deux loci jouant un rôle dans le développement du biofilm, les gènes tad et le locus cupE codant respectivement pour une machinerie de piliation de type IVb (Bernard et al, 2009) et pour des fimbriae assemblés par la voie Chaperone‐Usher (Giraud et al, soumis). Afin d’identifier d’autres cibles de ce TCS, nous avons déterminé le régulon PprB par une approche transcriptomique. L’action régulatrice directe ou indirecte de ce TCS a été validée sur un certain nombre de nouvelles cibles potentielles par la construction des fusions transcriptionnelles correspondantes et des expériences d’EMSA. Nous avons identifié une nouvelle cible directe du TCS PprA/PprB. Il s’agit des gènes PA1875‐1877, codant pour un ABC transporteur décrit comme une pompe à efflux pour les aminoglycosides. Ce cluster est co‐activé par le TCS PprA/PprB en même temps que le gène adjacent PA1874 qui code pour une protéine possédant des motifs homologues à ceux de l’adhésine LapA de Pseudomonas fluorescens. Des résultats préliminaires nous permettent de proposer l’hypothèse selon laquelle cette protéine serait sécrétée par l’ABC transporteur, adressée à la surface de la bactérie et impliquée dans la formation du biofilm. Nos données démontrent que le TCS PprA/PprB représente un régulateur important, reliant pour la première fois directement deux processus fondamentaux, le biofilm et la résistance aux antibiotiques. 61
GACA, PECS, MFBR : 3 REGULATEURS CLES CONTROLANT LA VIRULENCE CHEZ DICKEYA DADANTII William Nasser2, Nadia Mehdbi, Sylvie Reverchon2, Pierrette Malfatti, Stephane Gaubert, Benoit Alunni, Emilie Chapelle, Frederique Van Gijsegem Laboratoire interaction plantes pathogenes lipp umr217 inra/agroparistech/upmc f‐75005 paris, france [email protected]; 2microbiologie, adaptation et pathogenie umr5240 cnrs/insa/ universite lyon 1 f‐69621 villeurbanne Dickeya Dadantii (Erwinia chrysanthemi) est l’agent causal de la pourriture humide chez de nombreuses plantes. La macération de la plante infectée est causée par la production et la sécrétion d’une batterie d’enzymes capables de dégrader la paroi végétale. Cependant d’autres facteurs comme des systèmes d’acquisition du fer, la résistance aux stress ou la mobilité sont également importants dans la virulence. La production de ces facteurs de virulence est contrôlée par des voies de régulation complexes qui répondent aux conditions environnementales comme la T°, le pH ou la phase de croissance. GacA, PecS et MfbR, 3 régulateurs globaux impliqués dans la virulence de D. dadantii , seront présentés ici. Durant l’infection de la plante modèle Arabidopsis, la plupart des transcrits codés par les gènes de virulence de D. dadantii s’accumulent de manière concertée au moment où, en l’absence de symptômes, la population bactérienne se stabilise dans la feuille infectée. Le système à 2‐
composants GacA‐GacS est nécessaire à cette activation, il agit au moins partiellement via le système de régulation post‐transcriptionnel Rsm et en inactivant le répresseur PecT. Le système Gac n’est cependant pas impliqué dans le contrôle de l’expression des gènes de virulence par la phase de croissance. PecS contrôle quant à lui l’expression de plus d’une centaine de gènes incluant la plupart des gènes de virulence déjà identifiés. A la fois in vitro et in planta, l’inactivation de PecS provoque une activation plus précoce des gènes de virulence. L’analyse de double mutants montre que GacA et PecS agissent de manière séquentielle durant l’infection : PecS prévient une production prématurée des facteurs de virulence au début de l’infection alors que GacA active la production de ces facteurs permettant une macération systémique. Le régulateur Mfbr active également l’expression des gènes codant les enzymes dégradatifs de la paroi végétale à la fois in vitro et durant l’infection. L’activité de MfbR est modulée in vivo par le pH, un stress rencontré par les phytopathogènes au cours des premières étapes de l’infection. Un modèle intégrant ces divers contrôles dans le réseau de régulation gouvernant la production des facteurs de virulence chez D. dadantii sera présenté. 62
UN NOUVEAU MECANISME DE QUORUM SENSING SPECIFIQUE DES STREPTOCOQUES Betty Fleuchot1, Christophe Gitton1, Alain Guillot2, Colette Besset1, Véronique Monnet1, 2 & Rozenn Gardan1 Equipe Peptides et Communication Bactérienne1, Plateforme d’Analyse Protéomique de Paris Sud‐Ouest2 INRA, Institut MICALIS UMR 1319, Domaine de Vilvert, 78352 Jouy‐en‐Josas Cedex, France Les régulateurs transcriptionels de la famille Rgg ont été principalement étudiés et caractérisés chez les streptocoques où ils contrôlent l’expression de gènes codant des protéines impliquées dans la virulence comme des glycosyltransférases chez S. gordonii ou une cystéine protéase chez S. pyogenes. Nous avons identifié, dans quasiment tous les génomes de streptocoques séquencés, une sous‐famille de ces régulateurs Rgg associés à de petits peptides hydrophobes (SHP) : leurs gènes codants sont adjacents et transcrits de manière divergente. Nous avons étudié un de ces loci chez S. thermophilus, le locus SHP:Rgg_1358 et montré que le régulateur Rgg_1358 contrôle l’expression de 2 gènes, le gène ster_1357 codant un petit peptide cyclique sécrété et le gène shp_1358. Nous avons aussi mis en évidence que l’expression de ces 2 cibles est contrôlée par le SHP_1358 ainsi que par le transporteur d’oligopeptide Ami. Ces résultats nous ont conduit à proposer un nouveau modèle de régulation par quorum sensing où le SHP_1358, réimporté par Ami, jouerait le rôle d’une phéromone contrôlant l’activité du régulateur Rgg_1358, lui‐même contrôlant l’expression des gènes ster_1357 et shp_1358. A l’aide d’approches génétique et biochimique, nous avons validé toutes les étapes de ce nouveau mécanisme : sécrétion et réimportation de la phéromone SHP_1358, identification de sa forme mature, interaction de SHP_1358 avec le régulateur Rgg_1358 et l’interaction de ce dernier avec les séquences promotrices des gènes ster_1357 et shp_1358. Nous avons montré, pour la première fois, qu’un régulateur de la famille Rgg peut être impliqué dans un mécanisme de communication cellulaire et répondre à la présence d’un peptide naturellement synthétisé ou synthétique. Jusqu’à ce jour aucun signal n’avait été identifié pour ce type de régulateur. Nous sommes actuellement en train de valider la fonctionnalité de ce nouveau mécanisme chez deux streptocoques pathogènes, S. mutans et S. agalactiae. La présence de gènes shp codant des séquences similaires dans de nombreux génomes de streptocoques ouvre la possibilité d’un dialogue inter‐espèces dans certaines niches écologiques. Cet aspect sera aussi étudié. 63
64
LISTE DES PARTICIPANTS
65
66
AGREBI Rym
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
AUSSEL Laurent
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
ALLOING Geneviève
IBSV-CNRS
Sophia Antipolis
[email protected]
AYMERICH Stéphane
MGM-INRA
Thiverval-Grignon
[email protected]
AMARIR-BOUHRAM Jihane
MICALIS-INRA
Jouy en Josas
[email protected]
BALL Geneviève
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
ANGELINI Sandra
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
BARRAS Frédéric
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
ANSALDI Mireille
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
BENNACEUR Imène
MICALIS-INRA
Thiverval-Grignon
[email protected]
ARLAT Matthieu
LIPM-INRA
Castanet Tolosan
[email protected]
BENOMAR Saida
BIP-CNRS
Marseille
[email protected]
ASCHTGEN Marie Stéphanie
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
BERGE Mathieu
LMGM
Toulouse
[email protected]
AUBERT Sylvie
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
BERNARD Christophe
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
67
BIGOT Sarah
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
BOUVERET Emmanuelle
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
BIMBI Vanessa
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
BRANDELET Géraldine
CEA CADARACHE
Saint Paul lez Durance
[email protected]
BIZARD Anna
IGM-CNRS
Orsay
[email protected]
BRILLARD Julien
SQPOV-INRA
Avignon
[email protected]
BOCCARD Frédéric
CGM-CNRS
Gif sur Yvette
[email protected]
BROCHIER Céline
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
BONECA-GOMPERTS Ivo
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
BROUSSOLLE Véronique
SQPOV-INRA
Avignon
[email protected]
BORKOWSKI Olivier
MICALIS-INRA
Thiverval-Grignon
[email protected]
BRUNET Yannick
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
BOUGHAMMOURA Aida
LBPA-CNRS
Cachan
[email protected]
BRUTESCO Catherine
CEA CADARACHE
Saint Paul Lez Durance
[email protected]
BOULOC Philippe
IGM-CNRS
Orsay
[email protected]
BUSBY Steve
Université de Birmingham
Birmingham
[email protected]
68
CADORET Frédéric
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
CHAMBOST Jean Pierre
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
CAM Yvan
LIPM-INRA
Toulouse
[email protected]
CHAMP Stéphanie
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
CARPOUSSIS Agamemnon
LMGM-CNRS
Toulouse
[email protected]
CHOMMY Hélène
IGM-CNRS
Orsay
[email protected]
CASADESUS Josep
Université de Séville
Séville
[email protected]
CODDEVILLE Michèle
LMGM-CNRS
Toulouse
[email protected]
CASCALES Eric
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
CONDON Ciaran
IBPC-CNRS
Paris
[email protected]
CAZALE-NOEL Anne Claire
LIPM-INRA
Toulouse
[email protected]
COORNAERT Audrey
IBPC-CNRS
Paris
[email protected]
CECCALDI Pierre
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
COUMES Stéphanie
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
CHABALIER Maïalène
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
69
DACUNHA Violette
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
DERVYN Etienne
MICALIS-INRA
JOUY EN JOSAS
[email protected]
DALMASSO Marion
STLO-INRA
Rennes
[email protected]
DESCORPS-DECLERE Stéphane
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
DANNE Camille
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
DEUTSCHER Josef
MICALIS-CNRS
Thiverval Grignon
[email protected]
DARFEUILLE Fabien
INSERM
Bordeaux
[email protected]
DOAN Thierry
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
DE LUCA Gilles
CEA CADARACHE
Saint Paul Lez Durance
[email protected]
DREYFUS Marc
IBPC-CNRS
Paris
[email protected]
DENIS Yann
Plateforme Transcriptome-CNRS
Marseille
[email protected]
DU VERGER Yohann
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
DENIZOT François
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
DUMONT Audrey
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
DE REUSE Hilde
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
DUQUESNE Katia
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
70
DURAND Sylvain
IBPC-CNRS
Paris
[email protected]
FOUET Agnès
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
ESPELI Olivier
CGM-CNRS
Gif sur Yvette
[email protected]
FRETON Céline
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
EZRATY Benjamin
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
FROMION Vincent
MIG-INRA
Jouy en Josas
[email protected]
FAIRWEATHER Victoria
LBPA-CNRS
Cachan
[email protected]
GALLAUD Julien
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
FALENTIN Hélène
STLO-INRA
Rennes
[email protected]
GARDAN Rozenn
MICALIS-INRA
Jouy en Josas
[email protected]
FANTINO Jean-Raphaël
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
GAUGUE Isabelle
IBPC-CNRS
Paris
[email protected]
FERDINAND Pierre-Henri
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
GENEVAUX Pierre
LMGM-CNRS
Toulouse
[email protected]
FOGLINO Maryline
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
GERMAIN Elsa
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
71
GIGANT Emmanuelle
CGM-CNRS
Gif dur Yvette
[email protected]
HADDAD Nabila
SECALIM-INRA
Nantes
[email protected]
GOMEZ-VALERO Laura
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
IRIS François
BMSYSTEMS
Paris
[email protected]
GOTTESMAN Max
Université de Columbia
New York
[email protected]
IZE Bérengère
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
GRANGEASSE Christophe
IBCP-CNRS
Lyon
[email protected]
JAULT Jean Michel
IBS-CNRS
Grenoble
[email protected]
GRESSE Esma
CEA
Fontenay aux Roses
[email protected]
JOHNSTON Calum
LMGM-CNRS
Toulouse
[email protected]
GRUSS Alexandra
MICALIS-INRA
Jouy en Josas
[email protected]
JOURNET Laure
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
GUEGUEN Erwan
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
KHODR Ahmad
LBPA-CNRS
Cachan
[email protected]
GUISSEPI Annick
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
KKOREPANOV Alexey
IBPC-CNRS
Paris
[email protected]
72
LALLEMAND Mathilde
INSA
Lyon
[email protected]
LEDUC Damien
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
LAMRABET Otmane
IRD198-CNRS
Marseille
[email protected]
LEROI Delphine
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
LANE David
IBCG-CNRS
Toulouse
[email protected]
LESTINI Roxane
LOB-CNRS
Palaiseau
[email protected]
LANGLOIS DE SEPTENVILLE Anne
CGM-CNRS
Gif sur Yvette
[email protected]
MAGALON Axel
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
LAVERGNE Jean-Pierre
IBCP-CNRS
Lyon
[email protected]
MAGUIN Emmanuelle
MICALIS-INRA
Jouy en Josas
[email protected]
LE BOURGEOIS Pascal
LMGM-CNRS
Toulouse
[email protected]
MANDIN Pierre
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
LE GLEUHER Marie
IBSV-INRA
Sophia Antipolis
[email protected]
MAOUCHE Rim
LISM-CNRS
Marseille
[email protected]
LEBRUN Pierre
CIIL-INSERM
Lille
[email protected]
MARCHAIS Antonin
IGM-CNRS
Orsay
[email protected]
73
MARTIN Aurélie
URC-INRA
Le Rheu
[email protected]
ORILLARD Emilie
CEA
Fontenay aux Roses
[email protected]
MASI Muriel
IBBMC-CNRS
Paris
[email protected]
PANDIANI Franck
SQPOV-INRA
Avignon
[email protected]
MAZEL Didier
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
PASSERINI Delphine
LMGM-INSA
Toulouse
[email protected]
MENOUNI Rachid
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
PIERETTI Isabelle
BGPI-CIRAD
Montpellier
[email protected]
MICHEL Benedicte
CGM-CNRS
Gif sur Yvette
[email protected]
POMPEO Frédérique
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
MIGNOT Tâm
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
PORCHERON Gaëlle
IASP-INRA
Nouzilly
[email protected]
MIJAKOVIC Ivan
MICALIS
Thiverval Grignon
[email protected]
REDKO Yulia
Institut Pasteur
Paris
[email protected]
NOUAILLE Sébastien
INSA-INRA
Toulouse
[email protected]
RIMSKY Sylvie
LBPA-CNRS
Cachan
[email protected]
74
RINALDI Dana
LMGM-CNRS
Toulouse
[email protected]
TON HOANG Bao
LMGM-CNRS
Toulouse
[email protected]
ROMILLY Cédric
IBMC-CNRS
Strasbourg
[email protected]
TOUSSAINT Ariane
ULB
Belgique
[email protected]
SCHMITT Céline
COBM-CNRS
Mulhouse
[email protected]
VALENS Michèle
CGM-CNRS
Gif sur Yvette
[email protected]
SPRINGER Mathias
IBPC-CNRS
Paris
[email protected]
VAN GIJSEGEM Frédérique
IPP-INRA
Paris
[email protected]
TARDIF Chantal
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
VOLANT Aurélie
Hydrosciences Montpellier
Montpellier
[email protected]
TERRADOT Laurent
IBCP-CNRS
Lyon
[email protected]
WALLBURGER Anne
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
THOME Rémi
LCB-CNRS
Marseille
[email protected]
WEISSENBACH Jean
CNS-CNRS
Evry
[email protected]
TIMSIT Youri
IGS-CNRS
Marseille
[email protected]
ZGHIDI-ABOUZID Ouafa
INSA-CNRS
Lyon
[email protected]
75