Méthodes d`étude des pectines

Méthodes d'étude des pectines
C. Renard
UMR SQPOV, Avignon
Fév 2010
Plan
• Les pectines: définition et structure
• Méthodes d'étude des pectines
– Rappels
– Dosages des constituants
– Le fractionnement et les techniques lourdes
• Les pectines en tant qu'additifs: sources, méthodes
d'extraction, propriétés et réactivité
• Les enzymes pectolytiques
• Les pectines in situ: biosynthèse, rôles dans les
parois et dans la transformation des fruits et légumes
• Quelques exemples de nos travaux
Structure des différents oses
ose
Polyalcool portant une fonction réductrice
(aldéhydique ou cétonique)
HC=O
HC-OH
HC-OH
H
aldose
HC-OH
HC=O
HC-OH
cétose
Dérivé du glyceraldéhyde (D ou L): oses de la série D ou L.
D
L
Construction de la série des aldoses
Cyclisations
Les plus courants: cinq ou six carbones => pentoses ou hexose
Possibilité de cyclisation => furanose ou pyranose
selon taille du cycle
6
H2C-OH
HC=O
HO-CH
HC-OH
HC-OH
CH2 OH
HC=O
HC-OH
HO-CH
HC-OH
HC-OH
CH2 OH
Cétose
Aldose
Fischer
5
H
CH2 OH
C
O
H
C4
OH
OH
C
3
H
1 C
H
C 2
OH
β
α
OH
H
Carbone anomérique
Haworth
La structure dans l’espace
Dérisés des sucres dans les pectines
Acides: acides uroniques : fonction carboxylique en C6
Acide D-galacturonique Acide D-glucuronique
Déoxy: déoxyhexose (méthylpentose): CH3 en C1
L-rhamnose
6-déoxy-L-mannose
L-fucose
6-déoxy-L-galactose
La liaison glycosidique
Liaison glycosidique: entre la fonction hémiacétal d'un
ose et un alcool d'un autre; plus rarement entre deux
fonctions hémiacétal.
6
5
Les plus courantes:
1
4
3
2
1-4
1-6
Possibilité de ramification
En général une extrémité réductrice (hémiacétal libre)
Stratégie d’analyse des pectines
• La logique:
– Des renseignements les plus globaux aux plus détaillées
– Des méthodes les plus simples aux plus couteuses
• Les points clés:
– Détermination de la composition
– Méthodes de fractionnement et d'étude de la distribution
intermoléculaire
– Dégradations controlées
– Méthodes physiques: RMN, Masse, IR
Dosage de l’acide galacturonique
• Le plus classique: titrimétrie
– Standardisation
– Teneur en GalA et estérification
– (mais acétyls?)
COOMe
COOH
Pectine
NaOH V1
NaOH
HCl
NaOH V2
DM = V2/(V1+V2)
GalA = CNaOH (V1 +V2)
• Les précautions indispensables
– NaOH fraichement dosé
– Eau bouillie (carbonatation)
– Correction acide: V’
Dosage de l’acide galacturonique
• Colorimétrie:
– le plus adapté aux échantillons nombreux
– Mais acide…
• En milieu acide concentré et à chaud:
– formation de dérivés furfuriques,
– différents chromophores (polycycliques aromatiques)
– globales ou spécifiques
• (méthode de Dubois – phénol sulfurique)
• Méthode au mhdp
• Méthode au carbazole
Dosage au mdhp
•
Pectine ou GalA en solution
– 3 tubes par échantillon (1 blanc, 2 dosages)
– Ajout acide sulfurique concentré de manière répétable
•
Déshydratation
– Chauffage en présence d’acide sulfurique concentré (1 / 6)
– Circa 5 min 100°C
– Echantillons, blancs et standards
•
•
Refroidissement
Ajout chromophore:
– 100 µl Mhdp 0,8 g/L dans NaOH 0,125 M (5g/L) (blanc: NaOH)
– Homogénéiser
HO
– 15 min à température ambiante
•
Lecture 520 nm
Quelques pièges et astuces
• Ajout tétraborate de sodium: Na2B4O8
– Égalise la réaction des différents acides uroniques
– Faire par bouteille entière (dissolution: 1 nuit, garder au
froid)
•
•
•
•
Attention à l’hydratation de l’acide sulfurique
Ajout
Température et durée de la déshydratation
Stabilité des solutions
– Garder le mhdp à 4°C et abri de la lumière
Dosage du méthanol
• Dosage spécifique après saponification
– Saponification: NaOH 0,1 M, 4°C, 2h
– MeOH et AcOH par HPLC
– MeOH par méthodes colorimétriques (enzymatiques)
• Oxydation en méthanal: alcooloxydase, permanganate
• Complexation avec
– MeOH par CPG
• Très faibles températures
– MeOH par GC-MS
• Standard interne: deutériométhanol
• Saponification et head-space (Renard & Ginies, 2009)
• Infra-rouge
Infra-rouge
• DM mais aussi amidation
– Déconvolution nécessaire
– Calibration
DM
Guillotin et al. 2007
Dosage des sucres
•
Deux étapes:
– Passage du polymère aux monomères
– Identification et dosage des monomères
•
L’étape la plus cruciale est celle de la libération des sucres
– Hydrolyse ou solvolyse
• hydrolyse acide (H2SO4, TFA)
• méthanolyse (HCl dans MeOH)
• enzymes
– Problème:
• les liaisons glycosidiques ont des résistances à l'hydrolyse/solvolyse
TRES variables; difficulté d'avoir une hydrolyse enzymatique totale.
AUA-AUA >> ON-AUA > AUA-ON >> Hex-Hex > Pent-Pent...
Hydrolyse
6 CH2OH
CH2OH
O
O
OH
O
OH
6 CH2OH
O
5
4
OH
3 2OH
CH2OH
1
H+ (hydrolyse acide)
O
O
OH
O
OH
Polysaccharide
O
5
HO
OH
4
3
1
2
OH
OH
Mélange d’oses libres
• Hydrolyse
– Acide sulfurique
• prétraitement par H2SO4 13 M pour "dissoudre" la cellulose
• hydrolyse par H2SO4 1M
– Acide trifluoroacétique 2M 120°C
• Risque de dégradation Xyl, AUAs
Exemples de cinétique d’hydrolyse
Oses pectiques en fonction du
temps d'hydrolyse (paroi de
betterave)
Glucose en fonction du temps de
préhydrolyse (MIA carotte)
% de la teneur maximale mesurée
100
120
100
80
% de la teneur maximale mesurée
80
60
40
60
40
20
Ara
Gal
Rha
20
0
0
0
20
40
60
Durée de préhydrolyse (min)
80
0
2
4
Durée d'hydrolyse (h)
6
8
Méthanolyse
• Méthanolyse: Rupture des liaisons glycosidiques et formation
de méthylglycosides (HCl; anhydre)
– Non quantitative pour les polygalacturonates
6 CH2OH
CH2OH
O
O
OH
O
OH
6 CH2OH
O
5
4
OH
3 2
OH
CH2OH
1
H+ (MeOH)
O
O
OH
O
OH
Polysaccharide
O
5
HO
OH
4
3
1
OCH3
2
OH
Mélange de méthylglycosides libres
Détection et quantification
• Directe par HPLC:
– HPAEC: fractionnement par échange d'ions en pH fortement
basique.
• détection en ampérométrie pulsée.
• TRES sensible (<0.1 mg/L) mais problème de stabilité des
réponses.
• Plus adapté aux oligomères
– Après méthanolyse: HPLC phase inverse
• Détection: indice de réfraction
• Mais: très nombreux pics.
– Après hydrolyse par échange d'ion (Aminex HPX-87…:
• Détection: indice de réfraction
• Mais: mauvaise séparation.
Détection et quantification
• CPG après dérivatisation:
– But: rendre les oses volatils
– Siloxanes (greffés), FID
– Méthodes:
• Acétates d'alditols: simple et robuste mais seulement oses
neutres; après hydrolyse.
• Dérivés triméthylsilylés: plus versatile mais nombreux pics / ose
(4-6); après méthanolyse.
• Dérivés méthylés: analyse des liaisons
– Calculs: standard interne (inositol)
Acétates d’alditols
1
CH2OH
1
CH2OAc
NaBH4
2
en milieu alcalin
CHOH
CHOAc
3
CHOH
Anhydride acétique 2
(N-méthylimidazole)
4
6 CH2OH
O
5
HO
OH
4
3
1
2
OH
OH
Mélange d’oses libres
3
CHOAc
CHOH
4
CHOAc
5
CHOH
5
CHOAc
6
CH2OH
6
CH2OAc
Alditol
Acétate d’alditol
Rhamnose
Fucose
Arabinose
Xylose
Mannose
Galactose
Glucose
Inositol
Triméthylsylilés après méthanolyse
6 CH2OH
OH
4
Hexaméthyldisilane +
triméthylchlorosilane
O
5
HO
3
1
OH
Glc
Gal
***
*
*
GalUA
*
Gal
* *
*
Glc
**
*
Minutes
-19
10
20
OCH3
2
OTMS
*GlcUA
GalUA
Xyl
0
*
* Fuc
*
Ara
50
1
(Kits commerciaux)
Xyl (Ara)
Fuc
Rha
3
Ara
100
OTMS
4
Mannitol
Man
mVolts c:\star\data\std_1.run
150
OCH3
O
5
TMSO
pyridine
2
6 CH2OTMS
30
40
50
Les séquences correctes
•
Paroi (avec cellulose)
– Préhydrolyse + hydrolyse:
oses neutres et GalA
– (Hydrolyse: oses neutres
par différence estimation
cellulose)
– Saponification: méthanol
•
Pectines extraites
– Saponification: mméthanol
et GalA
– Hydrolyse: oses neutres
Identification des liaisons glycosidiques:
la réaction de perméthylation
6 CH2OH
5
O
4
OH
3
CH2OCH3
O
1
O
O
OCH3
O
2
O
1- Méthylation
OH
OCH3
Polysaccharide
Polysaccharide perméthylé
2- Hydrolyse
CH2OCH3
1
CHDOAc
1
CHDOH
2
CHOCH3
2
CHOCH3
3
CHOCH3
3
CHOCH3
4
CHOAc
4
CHOH
5
CHOAc
5
CHOH
6
CH2OCH3
6
CH2OCH3
4- Acétylation
Acétates d ’alditols
partiellement méthylés
D-alditols
partiellement méthylés
O
HO
OCH3
OH
OCH3
Oses partiellement méthylés
3- Réduction
(deutérium)
Perméthylation
•
Méthylation: en milieu anhydre (DMSO)
–
–
–
–
•
•
dissolution dans DMSO anhydre
présence d'anion methylsulfinylméthanide (dimsyl)
généré par KH, NaH, n-butyllithium, NaOH solide…
purification: dialyse, échange de phase, LH-20 (chloroformeméthanol)
Hydrolyse: à peu près idem polysaccharide initial; TFA.
Réduction: deutéro-réduction: marque les C-1
– (NaBD4 dans NH4OH, 3h).
•
Acétylation: anhydride acétique
– N-méthylimidazole, T°...
Quelques cas particuliers
• Polysaccharides acides: réduire les fonctions
carboxyliques:
– NaBH4 (NaBD4), pH 7, carbodiimide
– LiAlH4 en milieu organique (éther)
• Oligomères: éviter la dégradation des oses
réducteurs ("peeling"): préréduction (NaBH4)
Identification des oses partiellement
méthylés
•
CPG: deux colonnes pour résoudre les pics superposés, de
polarités différentes (OV1 (diméthylsiloxane), OV225
(cyanoalkylphénylsiloxanes))
•
Standard interne (Inositol) mais utilisation de facteurs de
réponse calculés.
•
Identification par spectrométrie de masse (impact électronique)
– rupture préférentielle entre deux méthylés.
– perte de CH3CO+.
– fragmentation secondaire: sur le C en β: perte de méthanol (-42) ou
d'acide acétique (-60) .
Schéma de fractionnement
Exemples de spectres
1,4,5-tri-O-acetyl-(1-deuterio)1,2,5,6-tetra-O-acetyl-(2-deuterio)3,4-di-O-methyl hexitol
2,3,6-tri-O-methyl hexitol
Méthodes de fractionnement
•
Précipitations sélectives
– Ethanol
• Pectines très facilement précipitées: oligomères (% EtOH, T°)
• Arabinanes
– Cuivre (puis lavage acide)
•
Chromatographies:
– échange d'ions:
• fractionnement en fonction de la densité de charges
• Contre-ion NH4+ pour un rendement élevé
– exclusion stérique
•
Dégradations sélectives:
– enzymes
– hydrolyse acide controlée
Chromatographie d’échanges d’ions
• Séparation en fonction de la densité de charge
• DEAE (faible), QAE (fort – oligomères)
• polysaccharides chargés / neutres
• pectines: en fonction DM et distribution
Na+
+
-
+
Na+ +
+ +
+
+
++
+ +
+
+ + - Cl
Liaison
(faible teneur en sels)
Cl+
+
+
+ Cl+
+
Cl- +
+
+
+ +
+ Cl+ +
ClDésorption
(forte teneur en sels)
Na+
-
-
Na+ Na+ -
Quelques exemples de fractionnements
en échange d’ions
• Suivi de déméthylation des pectines
PME A.niger à pH 4,5
PME pomme à pH 7,0
69
72
75
20
Volume d'élution (ml)
monochaîne
0
40
DM
Tampon acétate (M)
Tampon acétate (M)
63
Réponse colorimétrique
Réponse colorimétrique
42
0
0.5
0.5
DM
43
64
69
72
75
0
20
Volume d'élution (ml)
multichaîne
0
40
Absorbance (arbitrary unit)
• DEAE préparative
Exemple du safou
(Ella-Missang)
A
D
C
B
0.5
E
0
0
200
Monosaccharide composition (mol%)
Fractions Gal.A Rha Fuc Ara
Xyl Man Gal
A
B
C
D
E
94.9
40.4
0.3
1.9
2.0
0.4
7.6
0.6
1.1
0.7
0.1
0.6
21.7
37.8
34.6
1.1
28.1
1.0
2.5
1.4
1.3
1.2
22.9
8.6
6.8
0.4
2.1
23.3
38.5
48.2
1.5
19.2
400
600
Elution volume (ml)
DM
Glc Gal.A/Rha (%)
DA
(%)
30.2
10.2
6.7
0.3
0.8
7
23
218
5
71
38
800
1000
Sodium acetate buffer molarity
1
Utilisation conjointe des échanges d’ions
et exclusion stérique BP
Echange d'ion sur BioRad AG 1X8 (après dialyse)
Pulpe de betterave
Rha: 25 mg/g
Concentration (mg/L)
800
Conductivité (mS)
50
600
0
400
Soluble
Rha
GalA
Ara
Gal
6 mol%
13 mol%
65 mol%
13 mol%
200
0
0
500
1000
1500
2000
2500
Volume d'élution (mL)
Fractions retenues: AUA, Rha
Purification et caractérisation
Concentration (mg/L)
250
Rha/GalA: 1/1
200
150
100
50
0
0,0
0,5
Kav
1,0
Chromatographie d’exclusion stérique
• Principe
–
–
–
–
Diffusion dans un gel poreux (Kav)
Distribution des volumes hydrodynamiques
Courbes de calibration
le rayon hydrodynamique RH peut être décrit comme la
partie de la molécule qui ne permet pas la libre circulation du
solvant.
Théorique
Mw
106
Kav = 0
Exclusion totale
Kav = 1
103
V0
Vt Ve
Kav = Ve-V0/Vt-V0
SEC pour les pectines
• Il faut écranter les charges
– NaNO3 0,1M, acétate Na 0,4M pH 3…
• Calibration
– Le volume hydrodynamique des PS est > protéines pour
même masse molaire
– Le volume hydrodynamique des pectines est > pullulanes et
dextranes
– HPSEC-MALLS
• Utilisation en suivi de dégradation
Exemples
Size-exclusion
7h-CW
0.5
Buffer molarity
Colorimetric response (mV)
24h-CW
1h-CW
0
20
40
60
Elution time (min)
0
80
24h-CW
Colorimetric response (mV)
Ion-exchange
7h-CW
1h-CW
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Kav values
Xylogalacturonane de pois
NaOH
HCl
+ RGase
pH 7
Electrophorèse capillaire
• Distribution intermoléculaire des groupements
carboxyles libres
– Position et forme des pics
– Influence DP
Interprétation des courbes d’EC
Mobilité électrophorétique
Densité de charge
Fraction de carboxyles libres
RMN
• Enchaînement des sucres
– Oligosaccharides
• Distribution des groupements méthyles
– RMN du proton ou du 13C
– RMN du proton: les H4, H1 et H5 ont des signaux qui
shiftent selon l’état de substitution du GalA et de ses voisins
– Calcul de la distribution intra moléculaire
– 80°C, D2O, pectines ou homogalacturonanes neutralisés (pH
6) puis deux échanges D2O
Signaux caractéristiques
Rhamnogalacturonane
GalA
Rha
H-1
H-4
Int
5.00
4.41
r.e. (α/β)
5,28/4,55
4,38/4,32
n.r.e.
5,00
4,29
H-1
H-4
Int
5.27
3.40
r.e. (α/β)
5,22/4,93
3.47/3.33
n.r.e.
5,23
3.35
Lié au Rha
en r.e. (α/β)
5,08/5,16
4,41
U-n.r.e.
5,13
5,81
Homogalacturonane
H-4
Acide
4.45
Estérifié
4.50
H-1
Aa
5.10
Ae
5.15
Ea
4.92
Ee
4.98
Dénes et al., 2000
Interprétation du spectre RMN 1H
E
EE
O
EEE
COOR O
DO
OD
EEG
GEG
O
H-4
COOR O
DO
H-5 O O
GE GG
H-1
OD
O
EG
EGE
GGE EGG
G
GGG
COOR O
DO
GEE
ppm
5.25
4.75
Spectres RMN 1H : monades (H4), dyades (H1), triades (H5)
4.25
Méthodes de spectrométrie de masse
• Suivi de dégradations enzymatiques
Nombre GalA, nombre Me
• MSn: identification d’enchaînements
Principe de fractionnement en MSn
•
•
Extrémité réductrice: 18O
A:
– C et B: fragments contenant
l’extrémité non réductrice
– Y et Z: fragments contenant
l’extrémité réductrice
•
B: rupture du cycle
glycosidiques
Conclusion
• Etude de la structure des pectines:
– Extraction
– Fractionnement: échange d’ions, (SEC)
– Fractions purifiées:
• Analyse des liaisons
• Dégradations enzymatiques
– Purification des oligomères: établissement des séquences
• RMN
• MS: FAB, ESI-MS (HPAEC-MSn)