Consulter le texte intégral de la thèse

Transcription

THÈSE
Pour l'obtention du grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS
UFR des sciences fondamentales et appliquées
Ecologie et biologie des interactions - EBI (Poitiers)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École doctorale : Sciences pour l'environnement - Gay Lussac
Secteur de recherche : Biologie des organismes ; Biotechnologies animales, végétales et
microbiennes
Présentée par :
Cyril Abadie
Exploration de la variabilité phénotypique d'Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh et caractérisation de l'effet d'un déficit
hydrique sur la photosynthèse et le contenu glucidique
foliaire des écotypes Col-0, Mt-0 et Shahdara
Directeur(s) de Thèse :
Jean-Philippe Biolley
Soutenue le 26 octobre 2012 devant le jury
Jury :
Président
Rémi Lemoine
Directeur de recherche, CNRS, Université de Poitiers
Rapporteur
Daniel Laffray
Professeur des Universités, Université de Paris 12
Rapporteur
Yves Jolivet
Professeur des Universités, Université de Nancy 1
Membre
Professeur des Universités, Université de Poitiers
Membre
Jean-François Masfaraud
Maître de conférences, Université de Metz
Membre
Jean-François Castell
Maître de conférences, INRA, AgroParisTech
Pour citer cette thèse :
Cyril Abadie. Exploration de la variabilité phénotypique d'Arabidopsis thaliana (L.) Heynh et caractérisation de
l'effet d'un déficit hydrique sur la photosynthèse et le contenu glucidique foliaire des écotypes Col-0, Mt-0 et
Shahdara [En ligne]. Thèse Biologie des organismes ; Biotechnologies animales, végétales et microbiennes. Poitiers
: Université de Poitiers, 2012. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>
THESE
Pour l'obtention du Grade de
DOCTEUR DE l'UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École doctorale : Sciences pour l'Environnement Gay Lussac
Secteur de recherche : Biologie des organismes ; Biotechnologies Animales,
Végétales et Microbiennes
Présentée par :
Cyril ABADIE
************************
Exploration de la variabilité phénotypique d'Arabidopsis thaliana (L.) Heynh
et① a a t isatio ①de①l’effet①d’u ①d fi it①h d i ue①su ①la①photos
th se①et①le①
contenu glucidique foliaire des écotypes Col-0, Mt-0 et Shahdara
************************
Travaux dirigés par Jean-Philippe Biolley
Soutenue le 26 octobre 2012 à Poitiers devant la commission d'examen
JURY
Yves Jolivet
Daniel Laffray
Jean-François Castell
Jean-François Masfaraud
Rémi Lemoine
Pr, UHP Nancy-Université
Pr, Université Paris Est
MC, INRA AgroParisTech
MC, Université de Metz
DR, UMR 7267, Poitiers
Pr, Université de Poitiers
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
Unité Mixte de Recherche 7267 CNRS Ecologie et Biologie des Interactions
Equipe Physiologie Moléculaire du Transport des Sucres chez les végétaux (PhyMoTS)
Bâtiment Botanique B31, 40 avenue du Recteur Pineau 86022, Poitiers
Résumé/Abstract
Exploration de la variabilité phénotypique d'Arabidopsis thaliana (L.) Heynh et caractérisation de
l’effet①d’u ①d fi it①h d i ue①su ①la①photos th se①et①le① o te u①glu idi ue①foliai e①des① ot pes①
Col-0, Mt-0 et Shahdara
Co pte te u des ha ge e ts li ati ues a o s, les v g tau
is ue t d’ t e
confrontés, dans un proche avenir, à des épisodes de sécheresse sévères de plus en plus fréquents.
Afi de p di e l’i pa t de telles o t ai tes su la p odu tivit et le e dement des plantes
ultiv es, il o vie t d’ tudie l’effet du a ue d’eau su l’a tivit photos th ti ue, le t a spo t et
l’a u ulatio des su es. Dans un premier temps, la croissance, le développement, la biomasse et la
photosynthèse de huit écotypes d’Arabidopsis thaliana ont été caractérisés. Trois de ces écotypes
(Col-0, Mt-0 et Shahdara) ont ensuite été soumis à une période de déficit hydrique. Une chute du
contenu relatif en eau des rosettes (RWC), de la conductance stomatique (gs) et de l'assimilation
nette (AN) a été observée précocement chez Mt-0, écotype initialement caractérisé par une très
fai le effi ie e de l’utilisatio de l’eau AN/E . E
po se au st ess, l’a al se des ou es AN/Ci de
chaque écotype montrait que la limitation stomatique s’a o pag e apide e t de li itatio s
métaboliques (baisse de la Vcmax). En fin de stress hydrique, une diminution des réserves en amidon a
conduit dans tous les cas à une accumulation de saccharose dans les feuilles. Les expressions des
gènes codant les principaux transporteurs foliaires de sucres (polyols, hexoses et saccharose) étaient
ua t à eu diff e
e t affe t s pa le a ue d’eau. Shahda a, ui est pa ve u à o se ve u
RWC elative e t lev , est l’ ot pe ui a le ieu tol
la o t ai te h d i ue. À l’oppos , Mt-0
présentait, en fin de stress, une inhibition de l'AN couplée à des altérations majeures et irréversibles
des photosystèmes II (chutes de qP et de Fv/Fm).
Mots clés : Amidon, Arabidopsis thaliana, biomasse, écotypes, courbes AN/Ci, croissance, échanges
gazeux, fluorescence chlorophyllienne, photosynthèse, stress hydrique, sucres solubles,
transporteurs de sucres.
Investigation of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh phenotypic variability and characterization of
drought stress effects on photosynthesis and leaf sugar content of Col-0, Mt-0 and Shahdara
ecotypes
Considering the predicted climate changes, plants are likely to face, in the future, severe and
frequent droughts. In order to evaluate the impact of such stress on productivity and crop yield, the
effect of water shortage on photosynthetic activity, sugar transport and accumulation was
investigated. Firstly, growth, development, biomass and photosynthesis of eight Arabidopsis thaliana
ecotypes have been characterised. Secondly, three of them (Col-0, Mt-0 and Shahdara) were
subjected to drought stress. The relative water content (RWC), the stomatal conductance (gs) and the
net assimilation (AN) decreased early in rosette leaves of Mt-0 which was initially characterized by a
very low water use efficiency (AN/E). In response to drought, AN/Ci curves analysis for each ecotype
showed that stomatal limitation was quickly related with metabolic limitations (lower Vcmax). At the
end of the stress, reduced starch content always led to a sucrose accumulation in leaves. The
expression of genes encoding the main leaf sugar carriers (polyols, hexoses and sucrose) was
differently impaired by the water shortage. Shahdara, that managed to maintain a relatively high
RWC, was the most tolerant ecotype to water stress. In contrast, at the end of the stress, Mt-0
exhibited an AN inhibition together with significant and irreversible photosystem II alterations (drop
of both qP and Fv/Fm).
Keywords : AN/Ci curves, Arabidopsis thaliana, biomass, chlorophyll fluorescence, drought stress,
ecotypes, gas exchanges, growth, photosynthesis, soluble sugars, starch, sugar transporters.
Remerciements
Remerciements
Ce travail achevé, je tiens à remercier tous ceux qui d'une façon ou d'une autre ont
contribué à sa réalisation.
Mes premiers remerciements vont ainsi à Rémi Lemoine et à Rossitza Atanassova qui
m'ont accueilli chaleureusement au sein de l'équipe PhyMoTS de l'UMR 7267 (Ecologie et
Biologie des Interactions). Je les remercie d'avoir mis à ma disposition les outils et les
moyens nécessaires au bon déroulement de ma thèse.
Je présente également mes remerciements à Jean-Philippe Biolley pour la confiance
qu'il m'a accordée en me proposant ce sujet de thèse. Je tiens à lui exprimer toute ma
gratitude pour l'aide précieuse qu'il m'a apportée tout au long de ces années et plus
particulièrement pendant la rédaction de ce mémoire.
Je tiens à remercier Daniel Laffray et Yves Jolivet de m'avoir fait l'honneur de juger ce
mémoire en tant que rapporteurs. Je remercie également Jean-François Castell et
Jean-François Masfaraud d'avoir accepté d'examiner mon travail de thèse.
Ce travail ne serait pas ce qu'il est sans l'aide de Jean-Michel Perrault et de Vincent
Lebeurre, c'est pourquoi je tiens à leur exprimer ici toute ma reconnaissance. Toutes les fois
où j'ai eu la chance et le plaisir de travailler à vos cotés, vous avez toujours fait preuve de
professionnalisme, de minutie et d'enthousiasme. Un grand merci à vous deux. J'adresse
également mes remerciements à Bruno Faure qui a participé, toujours avec entrain, aux
nombreuses séances de repiquage.
Je tiens à remercier Julien Jeauffre et Maryse Laloi de m'avoir enseigné toutes les
ficelles de la technique d'analyse de l'expression génétique par macro-array.
Je remercie également Pierrette Fleurat-Lessard pour m'avoir initié aux techniques
de microscopie et Florence Thibault qui a participé à l'ensemble des analyses
microscopiques présentées dans cette thèse.
Remerciements
Un grand merci à Virginie Portemer qui a su garder son calme et sa patience lorsque
je l'harcelais de questions et qui m'a apporté, avec Lucie Sauvaitre, une aide inespérée lors
de l'incident avec l'azote liquide au début de ma thèse.
Je tiens à remercier Nathalie Pourtau et Sylvain Lacamera qui ont veillé sur moi et pas
seulement pendant la formation aux statistiques pour les petits échantillons à Orléans...
Mes remerciements vont également à Mireille Faucher qui fut une incroyable tutrice
d'enseignement et qui m'a fait part de son expérience et d'inestimables conseils pour
préparer les séances de travaux pratiques.
Je tiens à remercier Alexis Riché qui a effectué un stage à mes côtés durant sa
troisième année de licence, qui a participé à la mise au point de la technique de purification
des extraits foliaires pour l'analyse en HPLC et qui a également contribué à l'élaboration de
la gamme de conversion des valeurs SPAD en teneur en chlorophylles totales.
Merci à Dany Mainson pour son aide dans la mise en place du protocole de
purification des extraits foliaires et dans la préparation de la gamme étalon de l'HPLC.
Mes remerciements vont également à Thierry Berges et à Matthieu Régnacq, pour
avoir pu bénéficier au quotidien de leur compagnie, de leurs conseils avisés et de leur
bienveillance. Côtoyer de si près des généticiens de cette qualité fut pour moi un grand
privilège. Je tiens également à les remercier de m'avoir parrainé lors de mon année d'ATER
en section 65 où j'ai pu m'essayer à Saccaromyces cerevisiae. Que ces deux excellents
enseignants chercheurs trouvent ici toute ma gratitude.
Un grand merci à Jenny Colas, véritable chef d'orchestre du troisième étage, pour
son aide et son soutien, mais surtout pour sa bonne humeur si communicative.
Un immense merci à Nathalie, Sylvain, Thierry et Matthieu pour leur relecture, je suis
conscient de l'importance de cette tâche étant donné l'épaisseur du manuscrit.
Remerciements
Je tiens à remercier Audrey Abot, Sébastien Richard et Laurent De Baglion pour leur
compagnie enrichissante lors des doctoriales Poitou-Charentes à La Rochelle. Je souhaite
remercier plus particulièrement Audrey ma colocataire du bureau 402A pour sa gaieté, son
optimisme envers et contre tous, ses histoires (drôles) rocambolesques et autres jeux de
mots improbables mais également pour m'avoir initié à la vie poitevine.
Merci à Jacky de m'avoir aidé dans le bricolage des chambres de culture. En ce qui
concerne la chambre de culture, je tiens à remercier Pierre Coutos-Thévenot ainsi que
l'équipe d'électriciens de l'université de Poitiers pour leurs nombreuses interventions.
J'adresse aussi mes remerciements à André Bourbouloux pour ces conseils judicieux
pour mener à bien la culture d'Arabidopsis thaliana aussi bien en terre qu'en hydroponie.
Merci à Geneviève Harika et à Sylvie Clercy-Morel pour leur aide dans l'élaboration
des bons de commande et dans l'organisation du congrès Arabidopsis à Madison.
Je remercie l'école doctorale Gay Lussac et plus particulièrement Sabrina Biais pour
sa patience et sa gentillesse.
Enfin je tiens absolument à remercier mes parents et mon frère pour leur soutien
inconditionnel tout au long de mon parcours universitaire effectué entre Créteil, le Brésil et
Poitiers.
Avant-propos
Avant-propos
Le travail expérimental présenté dans ce mémoire de thèse a été réalisé sous la
direction de Jean-Philippe Biolley dans l'équipe de Physiologie Moléculaire du Transport des
sucres chez les Végétaux (PhyMoTS) de l'UMR 7267 CNRS Ecologie et Biologie des
Interactions à Poitiers. Ce travail a été réalisé avec le concours financier de la Région
Poitou-Charentes.
Table des matières
Table des matières
Abréviations ........................................................................................................................ 1
Introduction ........................................................................................................................ 4
A.Synthèse bibliographique ....................................................................................... 6
1.Le déficit hydrique ................................................................................................................... 7
2.Effet d'un déficit hydrique sur la photosynthèse .................................................................... 9
2.1.La photosynthèse ................................................................................................................. 9
2.1.1. La phase claire................................................................................................................. 10
2.1.2. La phase sombre ............................................................................................................. 15
2.2.Effet du déficit hydrique sur la diffusion du CO 2 ............................................................... 16
2.2.1. Effet d'un déficit hydrique sur la conductance stomatique ........................................... 17
2.2.1.1.Les stomates................................................................................................................. 17
2.2.1.2.Mécanismes présidant à l'ouverture et à la fermeture des stomates......................... 18
2.2.1.3.Réponse stomatique au déficit hydrique ..................................................................... 25
2.2.2. La conductance mésophyllienne .................................................................................... 28
2.2.3. Effet glo al des li itatio s diffusives su l’assi ilatio
ette ....................................... 30
2.3.Déficit hydrique et limitations métaboliques .................................................................... 31
2.3.1. Effet d’u d fi it h d i ue su la aptu e d’ e gie lu i euse et le t a spo t des
électrons.................................................................................................................................. 31
2.3.1.1.Ralentissement du transfert des électrons à partir du PSII ......................................... 31
2.3.1.2.Génération d'espèce actives de l'oxygène (ROS) ......................................................... 32
2.3.1.3.Mécanismes de photo-protections .............................................................................. 33
. . . . .Puits alte atifs d’ le t o s o ou a t au
ai tie du t a sfe t le t o i ue .... 33
2.3.1.3.2.Maîtrise des ROS dans le chloroplaste par les antioxydants .................................... 41
2.3.1.3.3.Intervention du quenching non-photochimique ...................................................... 44
. . . . .Alt atio s li es à l’installation du stress oxydatif ................................................... 46
2.3.2. Effet d’u st ess h d i ue su la phase so
e de la photos th se ........................... 50
. . . .Effet du st ess h d i ue su la st u tu e, l’a u ulatio et l’a tivit de la
Rubisco.....................................................................................................................................50
2.3.2.2.Effet du stress hydrique sur d'autres enzymes du cycle de Calvin .............................. 53
.Effet du st ess h d i ue su l’a u ulatio , le t a spo t et la
pa titio des su es ........ 55
3.1.Effet du stress hydrique sur la teneur en amidon.............................................................. 55
3.2.Effet du stress hydrique sur la teneur en sucres solubles ................................................. 56
3.2.1. Accumulation de sucres solubles .................................................................................... 56
Table des matières
3.2.2. Perception et signalisation des sucres ............................................................................ 60
. .Effet su l’a tivit de t a spo t .......................................................................................... 62
3.3.1. Le chargement du phloème ............................................................................................ 63
3.3.2. Le déchargement des glucides........................................................................................ 64
3.3.3. Les transporteurs de disaccharides chez Arabidopsis thaliana ...................................... 65
3.3.4. Les transporteurs de monosaccharides (MST) chez Arabidopsis thaliana ..................... 67
3.3.4.1.Sugar Transport Protein (STP) ...................................................................................... 68
3.3.4.2.Les transporteurs de polyols AtPLT/AtPMT ................................................................. 71
Objectif de l'étude ................................................................................................................... 73
B. Matériels et méthodes ........................................................................................... 75
1.Arabidopsis thaliana (L.)........................................................................................................ 76
1.1.Taxinomie ........................................................................................................................... 76
1.2.Répartition géographique .................................................................................................. 76
1.3.Cycle de reproduction ........................................................................................................ 77
1.4.Choix des écotypes étudiés ................................................................................................ 78
2.Protocole cultural .................................................................................................................. 79
.P se tatio g
ale des essais, de l’ ha tillo
. .Essais visa t à a a t ise le ph
ot pe de
age et des a al ses effe tu es ............ 80
ot pes d’Arabidopsis thaliana .............. 80
3.2.Essais visa t à a a t ise l’effet d’u st ess h d i ue suivi d’u e ou te h d atatio
su
ot pes d’Arabidopsis thaliana ..................................................................................... 83
4.Détail des analyses effectuées .............................................................................................. 87
4.1.Caractérisation des paramètres de croissance et de développement des plantes
d’Arabidopsis thaliana.............................................................................................................. 87
4.2.Caractérisation des pertes en eau des pots, de la teneur et du contenu relatif en eau
(RWC) des rosettes d’Arabidopsis thaliana .............................................................................. 88
4.2.1. Caractérisation des pertes en eau des pots.................................................................... 88
4.2.2. Te eu et o te u elatif e eau des osettes d’Arabidopsis thaliana .......................... 89
. .Ca a t isatio de l’a tivit photos th ti ue foliai e : esu es d’ ha ges gazeu et de
fluorescence chlorophyllienne ................................................................................................. 90
4.3.1. Caractérisation des échanges gazeux instantanés ......................................................... 91
4.3.1.1.Principe......................................................................................................................... 91
4.3.1.2.Mode opératoire .......................................................................................................... 94
4.3.2. Réponse de l'assimilation nette à l’aug e tatio de la o e t atio i te e e
CO2........................................................................................................................................... 95
4.3.2.1.Principe......................................................................................................................... 95
4.3.2.2.Mode opératoire .......................................................................................................... 98
Table des matières
4.3.3. Mesure de la fluorescence chlorophyllienne ................................................................. 99
4.3.3.1.Principe......................................................................................................................... 99
4.3.3.2.Mode opératoire ........................................................................................................ 103
4.4.Quantification des chlorophylles foliaires totales ........................................................... 104
4.4.1. Estimation de la teneur relative en chlorophylles exprimée en unité arbitraire
(SPAD).................................................................................................................................... 104
4.4.2. Conversion des unités arbitraires (SPAD) en microgramme de chlorophylles totales par
milligrammes de matière fraîche. .......................................................................................... 104
. .A al se de l’e p essio des g
es pa
a o-arrays ...................................................... 106
4.5.1. Extraction des ARN ....................................................................................................... 106
4.5.2. Traitement des ARN à la DNase et purification des ARN totaux .................................. 107
4.5.3. V ifi atio de l’i t g it des ARN ............................................................................... 107
4.5.4. A al se de l’e p essio pa
a o-arrays .................................................................... 108
4.5.4.1.Production des sondes d'Arabidopsis thaliana .......................................................... 108
. . . .E t a tio d’ADN plas idi ue ................................................................................... 108
. . . .A plifi atio des f ag e ts d’ADN plas idi ue pa PCR ........................................ 109
4.5.4.4.Vérification su gel d’ le t opho se et ajuste e t de la o e t atio des
fragments d'ADN .................................................................................................................... 109
. . . .D pôt des so des d’ADN su
e
a e de
lo .................................................... 109
4.5.4.6.Synthèse et marquage radioactif des ADNc .............................................................. 110
4.5.4.7.Hybridation des membranes ...................................................................................... 110
4.6.Quantification des sucres solubles foliaires par Chromatographie Liquide à Haute
Performance (CLHP) ............................................................................................................... 112
4.6.1. Extraction de sucres solubles foliaires .......................................................................... 112
4.6.2. Analyse des sucres solubles par Chromatographie Liquide Haute Performance ......... 113
. .Dosage e z
ati ue de l’a ido .................................................................................... 114
4.7.1. Principe ......................................................................................................................... 114
4.7.2. Mode opératoire ........................................................................................................... 114
. .Mise e vide e et lo alisatio i situ de l’a ido p se t da s les feuilles
d’Arabidopsis thaliana............................................................................................................ 115
4.8.1. Fixation chimique des échantillons foliaires ................................................................. 115
4.8.2. Post-fixation, déshydratation et inclusion des échantillons foliaires dans la résine.... 115
4.8.3. Sections semi-fines et ultra-fines.................................................................................. 116
4.8.4. Localisation des réserves d'amidon .............................................................................. 116
5.Traitement statistique ......................................................................................................... 117
Table des matières
C.Résultats ....................................................................................................................... 118
1.Caractérisation de la croissance, du développement, de l'activité photosynthétique et de
l’e p essio de t a spo teu s de su es hez
ot pes d'Arabidopsis thaliana ................ 119
1.1.Croissance et développement.......................................................................................... 119
1.1.1. Variabilité des morphotypes......................................................................................... 119
1.1.2. Évolution du nombre de feuilles constitutives des rosettes ........................................ 121
1.1.3. Évolution du diamètre des rosettes ............................................................................. 121
1.1.4. Évolution de la surface foliaire ..................................................................................... 123
1.1.5. Biomasse et teneur en eau à 47 jours après la levée ................................................... 125
1.2.Paramètres photosynthétiques à 47 jours après la levée ............................................... 126
1.2.1. Quantification des chlorophylles foliaires totales ........................................................ 126
1.2.2. Détermination instantanée des échanges gazeux ........................................................ 128
1.2.3. Ca a t isatio de la t a spi atio et de l’effi ie e de l'utilisatio de l'eau .............. 131
1.3.Expression de gènes de quelques transporteurs de sucres ............................................. 134
1.4.Organisation de la diversité phénotypique des 8 écotypes au 47 ème jour après la levée
............................................. .................................................................................................. 137
2.Effet d'un déficit hydrique sur la photosynthèse et le phénotype glucidique de 3 écotypes
d'Arabidopsis thaliana. ........................................................................................................... 140
2.1.Gestion de l'eau au cours du stress hydrique. ................................................................. 140
2.1.1. Évolution du contenu relatif en eau des rosettes et de la transpiration foliaire ......... 142
2.1.2. Évolution de la réserve en eau du sol ........................................................................... 145
. .Effet d’u d fi it hydrique sur la photosynthèse............................................................. 147
2.2.1. Effet d’u d fi it h d i ue su la te eu e
hlo oph lles foliai es totales ................. 147
2.2.2. Effet d’u d fi it h d i ue su les ha ges gazeu i sta ta s et quelques paramètres
dérivés....................................................................................................................................149
2.2.3. Effet d’u d fi it h d i ue su la po se de l’assi ilatio ette à l’aug e tatio de la
concentration interne en CO2 et sur quelques paramètres photosynthétiques dérivés des
courbes AN/Ci .......................................................................................................................... 157
2.2.4. Effet d’u d fi it h d i ue su uel ues pa a t es photos th ti ues dérivés de la
fluorescence chlorophyllienne ............................................................................................... 166
. .Effet d’u d fi it h d i ue su
uel ues aspe ts du
ta olis e a o
................... 177
2.3.1. Évolution de la biomasse sèche en réponse à un déficit hydrique .............................. 177
2.3.2. Effet du déficit hydrique sur la teneur en amidon foliaire .......................................... 178
2.3.3. Effet du déficit hydrique sur la teneur en sucres solubles foliaires ............................. 180
2.3.4. Effet d’u d fi it h d i ue su l’e p essio de g es oda t uel ues t a spo teu s de
sucres..................................................................................................................................... 184
Table des matières
D.Discussion .................................................................................................................... 186
1.Caractérisation des écotypes .............................................................................................. 187
1.1.Croissance et développement.......................................................................................... 187
1.2.Paramètres photosynthétiques et transporteurs de sucres ............................................ 188
1.3.Présentation des écotypes Col-0, Mt-0 et Shahdara ....................................................... 190
1.3.1. L’ ot pe Mt-0 .............................................................................................................. 190
1.3.2. L'écotype Col-0.............................................................................................................. 191
1.3.3. L'écotype Shahdara ....................................................................................................... 192
.Effet d’u d fi it h d i ue su la oissa e, la photos th se et l’a u ulatio glu idi ue
des écotypes Mt-0, Col-0 et Shahdara ................................................................................... 193
2.1.Biomasse sèche et croissance .......................................................................................... 193
2.2.Contenu relatif en eau (RWC), transpiration et utilisation de la ressource en eau ......... 194
2.3.Effet du déficit h d i ue su la photos th se d’Arabidopsis thaliana .......................... 200
2.3.1. Limitations stomatiques et métaboliques .................................................................... 200
2.3.2. Effet du déficit hydrique sur la carboxylation .............................................................. 207
2.3.3. Effet d'un déficit hydrique sur la photochimie ............................................................. 208
. .Effet du d fi it h d i ue su l’a u ulatio et le t a spo t des su es .......................... 227
Conclusion et perspectives ..................................................................................... 232
Références bibliographiques ................................................................................. 237
Abréviations
Abréviations
α
Fraction de lumière absorbée par la feuille
AN
Assimilation nette de CO2
ABA
Acide abscissique
ACP
Analyse en Composantes Principales
ADNc
Séquence d'ADN complémentaire des ARN messagers
ADP
Adénosine diphosphate
ARN
Acide ribonucléique
ATP
Adénosine triphosphorique
BET
B o u e d’ thidiu
BSA
Albumine de Sérum Bovin
Cc
Concentration en CO2 dans les chloroplastes (ppm)
Ci
Concentration en CO2 dans le mésophylle (ppm)
Chl a, Chl b
Chlorophylle a, chlorophylle b
CLHP
Chromatographie Liquide Haute Performance
DH
Déficit hydrique
DNase
désoxyribonucléase
dNTP
d so
E
Taux de transpiration
ε
Coefficient d'extinction molaire
EDTA
Acide éthylène diamine tétra acétique
ETR
Electron Transport Rate
F0
Rendement de fluorescence minimal
Fm
Rendement de fluorescence maximal
F’m
Rendement maximal de fluorescence sous éclairement
Fs
Fluorescence stationnaire
Fv/Fm
Rendement quantique maximal du photosystème II
u l otide ’-triphosphate
1
Abréviations
gm
Conductance du mésophylle pour le CO2
gs
Conductance stomatique
IRGA
Analyseur de Gaz à Infra-Rouge
JAL
Jours Après la Levée
JT
Densité du flux d’ le t o s photos th ti ues
Jmax
De sit
KPa
Kilo Pascal
LB
Lysogeny broth
Lm
Limitation stomatique
Ls
Limitation métabolique
LED
Light-Emitting Diode
MF
Masse de matière fraîche
MS
Masse de matière sèche
NAD
Nicotinamide adénine dinucléotide
NADH,H+
Nicotinamide adénine dinucléotide réduit
NADP
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
NADPH,H+
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit
NPQ
Quenching non-photochimique
Φ PSII
Rendement quantique du photosystème II
PAR
Rayonnement Photosynthétiquement Actif
PC
Plastocyanine
PCR
Polymerase chain reaction (amplification en chaîne par polymérase)
Pi
Phosphate inorganique
PLT
Polyol Transporter
PMT
Polyol Monosaccharide
PPFD
Photosynthetic photon flux density (densité de flux de photons
a i ale du flu d’ le t o s photos th ti ues
photosynthétiques)
ppm
Parties par millions, en volume
2
Abréviations
PQ
Plastoquinone
PS I, II
Photosystèmes I, II
PVPP
Polyvinylpolypyrrolidone
qP
Quenching photochimique
Rn
Respiration mitochondriale nocturne
Rd
Respiration mitochondriale diurne
ROS
Espèces réactives de l'oxygène (Reactive Oxygen Species)
Rubisco
Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase oxygénase
RuBP
Ribulose bisphosphate
RWC
Contenu relatif en eau
SDS
Sodium dodécyl sulfate
SOD
Superoxyde dismutase
SSC
Tampon citrate de sodium
STP
Sugar Transporter Protein
SUC
Transporteur de saccharose (Sucrose Carrier)
TAE
Tampon tris/acétate/EDTA
TLA
Total Leaf Area
TPU
Vitesse d'utilisation des trioses-phosphate
Tris
Tris- (hydroxyméthyl) amino méthane
UV
Rayonnement ultraviolet
VNAT
Natural Variation of Arabidopsis thaliana
Vcmax
Vitesse maximale de carboxylation du RuBP par la Rubisco
VPD
Déficit de pression de vapeur (Vapor Pressure Deficit)
3
Introduction
Introduction
Au cours du siècle dernier, la température moyenne à la surface de la Terre a
augmenté d'environ 0,74 °C. Cette progression est liée aux émissions anthropiques de gaz à
effet de serre. Les modèles climatiques proposés par le GIEC (scénario A1B1) prévoient, pour
le siècle à venir, un réchauffement de 1,7 à 4,4°C (Pachauri et Reisinger, 2007). Les 10
dernières années les plus chaudes ont notamment été marquées, dans certaines régions, par
des déficits de précipitations conduisant à des sécheresses estivales importantes. Environ
70 % de la essou e e eau est utilis e pou l’i igatio des ultu es ag i oles et
ou itu e
% de la
o diale est issue d’u e ag i ultu e su sols i igu s (Chaves et Oliveira, 2004). La
diminution de la ressource en eau aura donc un effet direct sur les rendements agricoles et à
terme sur les sociétés (Chaves et Davies, 2010). En France, la température a augmenté
d’e vi o
°C au ou s du XXème siècle. Ce réchauffement est plus marqué au sud u’au o d
du pays et les températures minimales ont davantage augmenté que les températures
maximales.
Co pte te u de es ha ge e ts li ati ues d’o es et d jà a o
is ue t do
s, les v g tau
d’ t e o f o t s, da s un proche avenir, à des épisodes de sécheresse
s v es de plus e plus f
ue ts ui pou aie t, à te
e,
odifie l’ o o ie des
gio s
fortement agricoles comme le Poitou-Charentes.
Afi de
ieu
o p e d e voi e de p di e l’i pa t ue pou ait avoi la sécheresse
su les e de e ts ag i oles, il o vie t ota
e t d’ tudie l’effet du d fi it h d i ue
d’u e pa t su l’a tivit photos th ti ue, et d’aut e pa t su l’a u ulatio , le t a spo t et
la
pa titio
atu elle de
des su es da s la pla te. L’e plo atio
po se au
a
ue d’eau pou ait
de la variabilité infra-spécifique
v le d’ ve tuelles st at gies adaptatives
utiles à cette compréhension. Dans tous les cas, une connaissance accrue des différents
processus qui peuvent limiter les rendements photosynthétiques pourrait aussi permettre
d'établir des programmes d'irrigation ajustés conjointement à la disponibilité de la ressource
hydrique et à la juste demande de la plante.
4
Introduction
Da s e o te te, ous avo s souhait
tudie l’effet de la s he esse su l’a tivit
photos th ti ue, le t a spo t et l’a u ulatio
des su es de quelques écotypes
d’Arabidopsis thaliana (L.).
Pour ce faire, nous avons, dans un premier temps, caractérisé durant 47 jours en
oissa e et le d veloppe e t de
conditions contrôlées, la
ot pes d’Arabidopsis
thaliana originaires de zones géographiques variées. Au 47ème jour après la levée, la
biomasse végétative aérienne, la teneur en eau des rosettes et la photosynthèse de chacun
de es
ot pes o t
t
a a t is es. L’e p essio
des p i ipau g
es oda t des
t a spo teu s d’he oses, de sa ha ose et de pol ols a gale e t t d te
L’a al se de ette dive sit ph
ot pi ue a pe
i
e.
is la s le tion de 3 écotypes (Col-0,
Mt-0 et Shahdara) qui ont ensuite été soumis à une période de déficit hydrique de 12 jours
pa a
t d’a osage. Au
ou s de
ette p iode de s he esse et ap s
jou s de
réhydratation, divers paramètres ont été régulièrement quantifiés. La teneur en eau, la
biomasse des rosettes et le phénotype glucidique foliaire (sucres solubles et amidon) ont été
d te
i
s. Pa
hlo oph llie
ailleu s,
e o t pe
des
is de
esu es
a a t ise
photos th ti ue et la ualit des photos st
su l’e p essio des g
L’e se
le de
d’ ha ges
gazeu
et
de
l’effet du d fi it h d i ue su
l’a tivit
es II. Pou fi i , l’i pa t du
ue d’eau
es oda t les t a spo teu s foliai es de su es a t p
es do
es pe
fluo es e e
ett a de
ieu
a
is .
omprendre la réponse
d’Arabidopsis thaliana au déficit hydrique.
5
Synthèse bibliographique
A. Synthèse bibliographique
6
1. Le déficit hydrique
L'eau est indispensable à la plante comme à tout être vivant, elle est le milieu
cellulaire, sa pression sur la paroi cellulosique contribue au port des végétaux, elle participe
au mouvement de divers organes comme par exemple l'ouverture et la fermeture des
stomates. L'eau transporte les substances nutritives ainsi que les déchets et les hormones.
Elle entre enfin dans la constitution et la réaction chimique de nombreux métabolismes.
La disponibilité de la ressource en eau est ainsi l’u des fa teu s li ita t la p odu tio
végétale en conditions naturelles, il existe en effet une relation linéaire entre la productivité
primaire nette aérienne et les précipitations annuelles (Boyer, 1970). La disponibilité en eau
est l’u des fa teu s p i ipau
ui li ite t la p odu tivit des
os st
es te est es. O ,
les végétaux doivent faire face à des variations de leur environnement, et comme ils vivent
fixés à leur support, ils ne peuvent pas fuir face à ces changements. Dès lors que les facteurs
externes sortent des conditions optimales de croissance de la plante ; ils provoquent un
stress qui affecte la croissance, le développement et la productivité de la plante. La plante
doit faire face au stress, et répond de multiples façons. Chaque espèce va répondre au stress
par des stratégies de résistance différentes lui permettant de survivre. Les mécanismes de
résistance sont groupés en trois catégories : l’ happe e t, l’ vite e t et la tol a e
(Chaves et al., 2003). L'échappement o e e les esp es apa les d’a o pli leu
de vie ava t ue le d fi it ph siologi ue e eau ’i te vie
le
e. C’est le as des pla tes des
régions arides effectuant leur cycle reproductif après une pluie et dont les graines
supportent de longues périodes de sécheresse (Sherrard et Maherali, 2006; McKay et al.,
2008). L’évitement consiste à maintenir le potentiel hydrique et à limiter au maximum les
pe tes e eau pa t a spi atio pou se p
fe
u i de l’e positio au st ess. Ce tai es pla tes
e t apide e t leu s sto ates, d’aut es li ite t la
asse foliai e. Les feuilles so t
parfois munies de cuticules épaisses (Chaves et al., 2003). Une allocation du carbone
p ivil gia t u
l’a
s au
s st
e a i ai e p ofo d et d velopp
pe
et
gale e t d’opti ise
essou es e eau.
7
Les plantes tolérantes
ette t e œuv e des
a is es leu pe
etta t de suppo te le
stress, en diminuant le potentiel hydrique, elles maintiennent la turgescence par
l’ajuste e t os oti ue, o te u pa l’a u ulatio d’io s
i
au et/ou de o pos s
organiques (Scott, 2000).
De plus il existe deux grandes stratégies qui caractérisent plus précisément la relation
entre le potentiel hydrique foliaire et la conductance stomatique (Tardieu et Simonneau,
1998). Les plantes isohydriques, arrivent à maintenir un potentiel hydrique au niveau des
feuilles o sta t au ou s d’u e p iode de s he esse. Les sto ates de es pla tes se aie t
directement contrôlés par le statut hydrique des feuilles. Lorsque le potentiel hydrique
di i ue, la se si ilit des ellules de ga de à l’acide abscissique (ABA) augmente ce qui
permet une fermeture rapide des stomates, limitant de ce fait les pertes en eau, stabilisant
l’ tat hydrique de la plante. À l'inverse, les espèces anisohydriques, voient leur potentiel
hydrique diminuer au fur à mesure que le st ess h d i ue s’i te sifie. Ce o po te e t
sulte ait de l’a se e d’u effet di e t du statut h d i ue de la feuille su les sto ates. La
se si ilit des ellules de ga de de es esp es est o sta te, ’est pou uoi la fe
etu e
des stomates est moins rapide lorsque le potentiel hydrique diminue.
La photos th se est l’u des p e ie s p o essus affe t pa le d fi it h d i ue, les
effets peuvent être directs, avec une limitation de la disponibilité de CO 2 causée par une
diminution de la conductance stomatique et mésophyllienne. La contrainte hydrique peut
aussi altérer les métabolismes liés à la photosynthèse ou être indirects ou secondaire
comme le stress oxydatif (Chaves et al., 2009). Les effets du déficit hydrique sur la
photosynthèse seront étudiés plus en détail dans la suite de ce travail.
8
2. Effet d'un déficit hydrique sur la photosynthèse
Le stress hydrique affecte la photosynthèse par des limitations diffusives réversibles
qui freinent la diffusion du CO2 ambiant jusqu'aux sites de carboxylation présents dans les
chloroplastes, ces limitations sont de nature stomatiques et mésophylliennes. À mesure que
le déficit hydrique s'intensifie l'inhibition de la photosynthèse est accrue par la mise en place
de nouvelles limitations dites métaboliques. Parfois irréversibles, elles affectent aussi bien la
phase claire que la phase sombre de la photosynthèse. Afin de mieux comprendre les
différents effets de la contrainte hydrique sur l'activité photosynthétique foliaire, un rappel
des processus engagés dans la photosynthèse sera fait dans un premier temps, puis dans un
second temps les effets des limitations diffusives et métaboliques sur ces processus seront
présentés.
2.1. La photosynthèse
Chez les plantes supérieures, la photosynthèse est définie par la succession dans le
temps de deux phases. La phase claire de la photosynthèse permet en présence de lumière,
la production d'oxygène associée à un transfert d'électrons dans une chaîne de composés
d'oxydo-réduction (Figure 1). Ce transfert conduit à la synthèse de NADPH,H+ et de
ferrédoxine réduite accompagnée d'une production d'ATP qui seront utilisés pour réaliser la
fixation du CO2 sur le ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP) par la Rubisco, la formation de
trioses-phosphate et la régénération du RuBP au sein d'un cycle métabolique appelé cycle de
Calvin, ces réactions représentent la phase sombre de la photosynthèse. La photosynthèse
se déroule dans les chloroplastes, riches en pigments photosynthétiques et caractérisés par
une structure lamellaire formant les thylacoïdes. Le chloroplaste est le site de capture des
photons et de la conversion de l'énergie des pigments excités en énergie chimique,
permettant la synthèse de trioses-phosphate qui seront soit transportés en dehors du
chloroplaste ou soit transformés en amidon et ainsi accumulés.
9
Figure 1. Schéma dit en "Z" présentant sur une échelle de potentiel d'oxydo-réduction
(E'0), les différents transferts d'électrons faisant intervenir les différents couples redox
concernés. Sachant qu'un couple a une tendance d'autant plus grande de céder ses
électrons que son E'0 est négatif et qu'un transfert d'électrons entre 2 couples redox
s'effectue spontanément dans le sens croissant des potentiels redox, la représentation du
schéma en Z indique le sens du trajet spontané (descendant) et non spontané (ascendant)
des électrons entre l'eau et un accepteur final le NADP+. Système de dégagement
d'oxygène (COE), photosystème I (PSI), photosystème II (PSII), antenne du PSI (LHCI),
antenne du PSII (LHCII), phéophytine (Pheo), plastoquinone (PQ), complexe b6f (b6f),
plastocyanine (PC), ferrédoxine (Fd), ferrédoxine NADP réductace (FNR).
2.1.1. La phase claire
Dans la membrane des thylacoïdes se trouvent deux photosystèmes différents, les
photosystèmes I et II (respectivement PSI et PSII) assurant la capture de l'énergie lumineuse
et sa conversion en énergie chimique et d'autres structures impliquées dans la
photosynthèse, un complexe cytochrome b6f et une ATP synthase. Les PSI se trouvent dans
les régions intergranaires et à la périphérie des grana dans les zones exposées au stroma. Les
PSII sont eux associés en ensembles dans les zones d'empilement granaires, et sont en
contact les uns avec les autres au niveau de leurs antennes périphériques (LHCII). Dans les
thylacoïdes les PSII et PSI fonctionnent en série et assurent le transfert d'électrons dans la
chaîne photosynthétique de composés redox. L'oxydation de l'eau alimente en électrons le
donneur primaire d'électrons du PSII, le P680. L'absorption d'énergie excitonique par les
donneurs d'électrons de chaque photosystème, P680 pour le PSII et P700 pour le PSI
transforme ces dimères de chlorophylles en réducteurs puissants.
Le photosystème II (PSII)
Le photosystème II (PSII) est constitué d'un complexe antennaire comprenant 3
antennes distinctes, une antenne périphérique (LHCII) formée de trimères associant des
protéines Lhcb1, Lhcb2 et Lhcb3 ; une antenne interne associée au centre réactionnel
constitué des protéines CP43 (psbC) et CP47 (psbB) et une antenne située entre l'antenne
périphérique et le centre réactionnel constituée de complexes protéines pigments CP29
(lhcb4), CP26 (lhcb5) et CP24 (lhcb6) (Zouni et al., 2001; Kamiya et Shen, 2003). Après avoir
absorbé la lumière les pigments associés aux protéines des antennes collectrices
(chlorophylles ou caroténoïdes) se trouvent à l'état excité (*), l'état excité d'un pigment est
alors appelé exciton. L'excitation est transférée au hasard d'un pigment excité à un pigment
à l'état fondamental, avant d'arriver sur une structure pigmentaire particulière (constituée
de
ol ules de hlo oph lle le e t e
a tio
el du PSII. Le œu du e t e
a tio
el
est constitué de 2 protéines D1 et D2 codées respectivement par les gènes chloroplastiques
PsbA et PsbD. Le P680 excité par l'énergie lumineuse (P680*) peut réduire alors une
phéophytine (PhéoD1). En parallèle le complexe à manganèse extrait des électrons à partir de
l'eau qui seront ensuite transmis au P680+ oxydé afin de le régénérer sous sa forme réduite.
10
Effectivement, l'électron nécessaire à la régénération du P680+ à l'état réduit provient d'une
tyrosine Yz de la chaîne protéique de D1 qui fait partie d'une chaîne redox alimentée en
électrons par la structure à manganèse. Cette structure constituée de 4 atomes de
manganèse, d'un atome de calcium et d'un atome de chlore et située dans une cavité de la
protéine D1 et assure l'oxydation de l'eau. Le complexe à manganèse extrait les électrons à
partir de l'eau qui seront transmis à la tyrosine Yz, ce complexe serait un accumulateur de
charges positives, qui ne se combinerait à une molécule d'eau que sous sa forme la plus
oxydée. Le complexe à manganèse existe sous 5 degrés d'oxydations croissants : S0, S1, S2, S3
et S4, le manganèse sous ses différents états oxydés est à l'origine de cette caractéristique.
L'état réduit S0 se reforme après fixation de 2 molécules d'H2O sur le complexe manganèse à
l'état S4 (le plus oxydé) (Hoganson et Babcock, 1997; Joliot, 2003). Le passage d'un état Sn à
Sn+1 se fait par l'éjection d'un électron à la tyrosine Yz qui transfert finalement son électron
au P680+ de plus chaque changement d'état est accompagné d'une libération d'un proton
dans le lumen.
La phéophytine (PhéoD1) sous sa forme oxydée est ensuite réduite par l'électron
libéré par le P680*, la phéophytine réduite transfert alors à son tour son électron à une
plastoquinone A (PQA) qui le transfert aussitôt à PQB. PQB est un accepteur à 2 électrons, PQB
est une plastoquinone appartenant à un pool de plastoquinones présent dans la membrane
du thylacoïde et peut se lier transitoirement à D1 dans un site appelé QB, après sa double
réduction et sa protonation, PQBH2 est libéré dans la membrane pour diffuser librement
dans la membrane jusqu'au complexe b6f (Okamura et al., 2004). À l'inverse de PQB, PQA
n'est pas échangeable et il est situé dans une zone hydrophobe de la protéine D2.
Après 4 fonctionnements successifs d'un centre PSII libérant ainsi 4 électrons injectés
dans le pool de quinones, 2 quinones réduites sont formées. Ces 2 quinones réduites seront
ensuite ré-oxydées au niveau d'un site QO du complexe b6f.
11
Le complexe b6f
Le complexe b6f est constitué de 4 protéines, le cytochrome B6, le cytochrome f, la
protéine de Rieske et une protéine appelée sous-unité IV liée au cytochrome b6. Le
complexe cytochrome b présente 2 sites pour les quinones, le premier (Q O) orienté face au
lumen responsable de la libération des protons à partir des quinones réduites (QH2) et le
second (Qi) situé vers le stroma est un site de formation des QH2. Les PQH2 sont oxydées au
niveau du site QO en libérant 2 protons dans le lumen et 2 électrons. L'un des électrons
réduit le centre FeS avant d'être transféré au cytochrome f puis l'électron est transmis à une
plastocyanine. Le second électron permet de régénérer la plastoquinone oxydée (PQ) (Kurisu
et al., 2003; Stroebel et al., 2003).
Le complexe b6f alimente alors le PSI en électrons via la plastocyanine qui est une
petite protéine hydrophile qui possède un centre redox constitué d'un atome de cuivre (Cu).
Quatre électrons sont ensuite transférés vers le PSI et 6 protons sont libérés dans le lumen.
Le photosystème I (PSI)
La plastocyanine localisée dans le lumen des thylacoïdes assure le transfert
d'électrons entre le complexe b6f et le P700. Le PSI est composé d'un complexe antennaire
externe (LHCI) constitué de 4 sous-unités protéiques codées par les gènes lhca1, lhca2, lhca3
et lhca4. Une antenne interne entoure le centre réactionnel formé lui même principalement
de 2 protéines A (psaA) et B (psaB) (Ben-Shem et al., 2003). Le centre réactionnel est
composé de 6 molécules de chlorophylle a, parmi ces 6 chlorophylles, 2 molécules forment
la paire spéciale du P700, 2 autres fonctionnent comme accepteurs primaires d'électrons
(A0) et enfin les 2 dernières chlorophylles, qualifiées d'accessoires (A), se trouvent en tant
que composés intermédiaires entre P700 et AO. Trois petites protéines C, D et E codées
respectivement par les gènes psaC, psaD et psaE sont liées aux protéines A et B, ces 3
protéines font saillies dans le stroma et participent au transfert des électrons aux
ferrédoxines présentes dans le stroma. De plus des trimères de LHCII phosphorylés peuvent
migrer sous éclairement et de façon réversible à partir des zones granaires vers les PSI où ils
se fixeraient sur le LHC I-680 (Allen, 2003).
12
L'énergie d'excitation des chlorophylles des antennes collectrices excitées par la
lumière circule de pigment à pigment au niveau de l'antenne interne avant d'arriver sur le
complexe pigmentaire du centre réactionnel, le P700. L'arrivée d'un exciton dans la paire
spéciale entraine son passage à l'état excité (photo-oxydé, P700*), dans cet état une des
chlorophylles de la paire spéciale expulse un électron qui sera fixé sur un accepteur primaire
A0 via vraisemblablement l'intervention de chlorophylles accessoires (A). L'expulsion de
l'électron de la chlorophylle du P700* laisse une charge positive sur la paire spéciale (P700 +)
qui sera à nouveau réduite par un électron provenant de la plastocyanine pour pouvoir jouer
à nouveau son rôle de donneur d'électron. Le P700 excité (P700*) va réduire en bout de
chaîne le NADP+ et se retrouve ensuite sous la forme oxydée P700+. L'électron issu du
donneur primaire P700 est ensuite cédé à la ferrédoxine, une protéine hydrophile à centre
soufre-fer (2Fe-2S), mobile qui emporte la charge négative dans le stroma. La ferrédoxine
réduite peut entrer en contact, dans le stroma, avec un complexe ferrédoxine-NADP+
réductase, qui transfère l'électron sur le NADP+.
Quatre photons permettent l'expulsion successive de 2 électrons dans la chaîne de
transport des électrons et assurent ainsi la réduction d'une molécule de NADP+ en
NADPH,H+, or 8 photons (soit 4 électrons) doivent être captés pour réduire, au sein du cycle
de Calvin, une molécule de CO2 sous forme de 2 molécules de 3-phosphoglycérate.
Transfert de protons couplé au transfert d'électrons
L'oxydation de l'eau libère des protons dans le lumen des thylacoïdes, 4H+ pour 2
H2O. Les quinones réduites sous forme protonée PQH2 sont oxydées au niveau d'un site QO
du complexe b6f et libèrent également 2 protons dans le lumen. Pour 4 électrons injectés
dans le complexe b6f, 4 protons sont libérés dans le lumen. Finalement pour 4 électrons
injectés dans la chaîne redox entre le PSII et le PSI, 8 protons sont libérés dans le lumen.
L'accumulation de protons dans le lumen des thylacoïdes est la principale source d'énergie
utilisée par l'ATP synthase pour réaliser la synthèse d'ATP (Mitchell, 1966). Le moteur de la
synthèse d'ATP est le potentiel électrochimique transmembranaire comprenant 2
composantes transmembranaires, un gradient électrique et un gradient de protons.
13
L'ATP synthase fonctionne comme une pompe à protons transmembranaire, elle est
caractérisée par 2 parties distinctes, une sous-unité F0 et d'un complexe globulaire F1 faisant
saillie dans le stroma des chloroplastes. Les protons suivent le gradient électrochimique à
travers la bicouche lipidique au niveau des rotors Fo. Ce flux provoque la rotation de F0,
rotation due à la neutralisation par les protons des charges portées par les asparagines
(Junge, 1999; Bottcher et Graber, 2000). Les
sous u it s α et β du o ple e F1 possèdent
u site de liaiso pou u ADP ou u ATP, toutefois seuls les u l otides des
sous u it s β
sont échangeables et ont ainsi un rôle dans la synth se d'ATP. La sous u it γ li e à F0 se
déplace grâce à la rotation de F0, d'u e sous u it β à u e autre. Elle est responsable des
changements de conformation : ouvert (open) faible affinité pour ADP et ATP, L (loose) forte
affinité pour les nucléotides et T (tight) site fermé. La synthèse d'ATP se fait à l'état T dans le
site fermé puis le passage au stade ouvert permet la libération de l'ATP et l'arrivée de
nouvelles molécules d'ADP et de phosphate (Boyer, 1997). La synthèse d'ATP se fait suivant
la réaction suivante :
ADP(3-) + PO4H2(2-) ==> ATP(4-) + H2O
La synthèse d'ATP résulte donc d'une conversion de l'énergie mécanique en énergie
chimique.
Le déroulement du cycle de Calvin consomme au total 3 ATP et 2 NADPH,H+. Or pour
4 électrons transportés dans la chaîne de transport photosynthétique, 2 NADP + sont réduits
en 2 NADPH,H+ et de 2 ATP sont produits (3 H+/ATP). La synthèse d'ATP couplée au transfert
d'électrons ne permet pas en soi la fixation d'une molécule de CO2. Des voies alternatives
comme les transferts cycliques et pseudo-cycliques (aussi appelé réaction de Mehler)
d'électrons assureraient une synthèse d'ATP supplémentaire sans toutefois produire du
NADPH,H+ notamment sous fort éclairement permettant le déroulement normal du cycle de
Calvin, ces 2 voies seront étudiées plus en détail par la suite.
14
Figure 2. Représentation schématique du cycle de Calvin, appelé également cycle de
du tio ①des①pe toses①phosphates.①La①stœ hio t ie①i di u e① o espo d①à① ① ol ules①
de CO2 fixées sur 3 RuBP.
2.1.2. La phase sombre
L'activité de carboxylation photosynthétique est assurée par la Rubisco, cette
réaction consiste en la fixation de CO2 sur le ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) et permet la
formation de 2 molécules de 3-phosphoglycérate (3-PG), il s'agit d'une réaction fortement
exothermique pratiquement irréversible (Pierce et al., 1986). La Rubisco catalyse également
la réaction d'oxygénation dans les mêmes sites et avec le même substrat (RuBP) (Portis,
1992). La Rubisco est activée après que le résidu lysine, présent au niveau du site
catalytique, soit carbamylé soit sous l'action de Mg2+ ou du CO2. De plus un inhibiteur (CA1P)
se fixe sur le site catalytique à l'obscurité, l'inhibiteur est évacué du site par la Rubisco
activase en présence d'ATP (Parry et al., 2002). La fixation du CO2 sur le RuBP, la
transformation du 3-PG en trioses-phosphate et la régénération du RuBP, participent au
cycle de Calvin ou cycle des pentoses phosphate (Benson et Calvin, 1950). Les molécules de
3-PG sont réduites en trioses-phosphate en 2 étapes, la première réaction est une
phosphorylation du 3-PG par l'intermédiaire d'une phosphoglycérate kinase en présence
d'ATP pour former du 1,3-bisphosphoglycérate. La seconde réaction est catalysée par une
3-phosphoglycéraldéhyde déshydrogénase en présence de NADPH avec libération de
phosphate inorganique (Pi) qui est ensuite réduit en 3-phosphoglycéraldéhyde.
La régénération du RuBP consiste en une série de réactions de condensation, de
scission et de réarrangements moléculaire pour aboutir à une phosphorylation du ribulose5-phosphate (Ru 5-P) (Figure 2). La régénération du RuBP débute par l'addition du
dihydroxyacétone phosphate (DHAP, 3C) par une transaldolase sur le 3-P-glycéraldéhyde
(G3P, 3C) pour former du fructose 1,6-bisphosphate (6C) qui est ensuite déphosphorylé par
une phosphatase pour former du fructose 6-phosphate (Fru 6-P, 6C), ce composé est utilisé
avec un aldose (EC) par une transcétolase pour produire du xylulose 5-P (5C) et de
l'érythrose 4-P (4C). L'érythrose 4-P (4C) réagit avec le fructose 6-P (6C) en présence d'une
transaldolase pour former du glycéraldéhyde 3-P et du sédohéptulose 1,7-bisphosphate qui
est ensuite déphosphorylé par une phosphatase pour libérer du sédohéptulose 7-phosphate
(7C). Une transcétolase produit, à partir du sédohéptulose 7-phosphate (7C) et d'un aldose
(3C), un xylulose 5-P (5C) et un ribose 5-P (5C).
15
Figure 3. Représentation schématique des voies de synthèse de 2 produits terminaux de la
photosynthèse, le saccharose et l'amidon. La synthèse du saccharose se déroule dans le
cytoplasme, à partir de trioses-phosphate transportés depuis le chloroplaste en échange
de phosphate inorganique (Pi). La voie de synthèse de l'amidon est chloroplastique.
Fructose 2,6-bisphosphatase (FBPase), UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase),
saccharose phosphate synthase (SPS), saccharose phosphate phosphatase (SPP) et ADPglucose pyrophosphorylase (AGPase).
La dernière étape permet la régénération du RuBP par phosphorylation en présence d'ATP
du ribose 5-P, cette réaction est catalysée par une ribulose 5-P kinase. Quatre réactions du
cycle de Calvin sont fortement exergoniques et par conséquent quasiment irréversibles, la
carboxylation (Rubisco), les déphosphorylations du fructose et de l'heptulose-bisphosphate
et la phosphorylation du ribulose 5-monophosphate. À l'inverse les transaldolases catalysent
des réactions réversibles.
Pour 3 molécules de CO2 fixées, 6 molécules de 3-PG sont formées et réduites en
trioses-phosphate et pour régénérer un RuBP, 2 NADPH et 3 ATP sont consommés (Figure 2).
Une partie des trioses-phosphate sert à la synthèse d'amidon, une autre partie est exportée
vers le cytosol à l'aide de transporteurs qui couplent la sortie de trioses-phosphate à l'entrée
de phosphate inorganique (Pi) (Figure 3).
2.2. Effet du déficit hydrique sur la diffusion du CO2
Lors d'un stress hydrique la fermeture des stomates permet à la plante de limiter ses
pertes en eau par transpiration et de préserver le stock en eau du sol. Cependant une baisse
de la conductance stomatique limite l'entrée du CO2 ambiant dans la chambre sous
stomatique. De plus une seconde conductance qualifiée de mésophyllienne est responsable
du trajet du CO2 dans le mésophylle, des espaces intercellulaires vers les sites de
carboxylation dans les chloroplastes. Comme la conductance stomatique, la conductance
mésophyllienne diminue en réponse au stress hydrique, ces deux conductances sont
responsables des limitations diffusives de l'assimilation nette de CO2, en altérant la diffusion
du CO2 ambiant au travers des stomates et du mésophylle, qui se répercute par une baisse
de la concentration en CO2 dans le chloroplaste. Les mécanismes de fermeture des stomates
notamment en réponse à un stress hydrique seront présentés dans une première partie,
puis les processus à l'origine de la conductance mésophyllienne seront abordés dans une
seconde partie.
16
2.2.1. Effet d'un déficit hydrique sur la conductance stomatique
Une fermeture des stomates est classiquement observée chez des plantes soumises à
un déficit hydrique afin de limiter les pertes en eau par transpiration, notamment chez Oriza
sativa (Blouin et al., 2007), Helianthus annuus (Gimenez et al., 1992; Dejana Pankovic, 1999),
Rhamnus ludovici-salvatoris (Nerprun), Vitis vinifera (Flexas et al., 2004b), Phaseolus vulgaris
(cv. Carioca), Vigna unguiculata (Cruz de Carvalho et al., 1998), Podocarpus lawrencii
(Brodribb, 1996), Glycine max, Nicotiana tabaccum (Flexas et al., 2006). Plus
particulièrement chez Arabidopsis thaliana (Col-0) une diminution de la conductance
stomatique (gs) en réponse à un déficit hydrique induit par arrêt d'arrosage a été observée.
La gs diminue effectivement dans un premier temps de 20 % sans qu'une variation du
contenu relatif en eau (RWC) ne soit observée avant de chuter de 60 % pour un RWC de
65 % (Poulson et al., 2006). La première baisse de la conductance stomatique serait la
conséquence d'une perception d'un signal originaire des racines et serait donc indépendante
de l'état hydrique des feuilles. Afin de mieux comprendre les mécanismes intervenant dans
la fermeture des stomates en réponse à un déficit hydrique, un rappel sur les processus
régulant l'ouverture et la fermeture des stomates est proposé.
2.2.1.1.Les stomates
Un stomate est constitué de deux cellules de garde non-jointives dont la turgescence
modifie la taille d'une ouverture au niveau de l'épiderme, l'ostiole, permettant les échanges
gazeux entre la plante et son environnement. Ces cellules sont caractérisées par une paroi
extérieure, opposée à l'ostiole, mince et une paroi interne caractérisée d'un épaississement
cellulosique. De plus elles possèdent un réseau de microfibrilles de cellulose à orientation
radiale. Lorsque ces cellules sont turgescentes, la paroi extérieure plus mince et plus souple
se dilate plus que la paroi interne plus épaisse et plus rigide, les cellules de garde s'incurvent
et l'ostiole s'ouvre. Les cellules de garde sont les seules cellules de l'épiderme de la feuille à
posséder des chloroplastes et sont isolées du réseau symplastique des cellules épidermiques
et du mésophylle du fait de l'absence de plasmodesmes (Wille et Lucas, 1984).
17
Les stomates sont responsables de 90-95 % des pertes en eau par transpiration au niveau
des feuilles (Steudle, 2002). Les stomates ne sont pas toujours situés exclusivement sur la
face inférieure des feuilles, la répartition des stomates varie en effet selon les espèces, une
espèce est dite hypostomatique lorsque les stomates ne se trouvent que sur la face abaxiale
du limbe comme Laurus nobilis, épistomatique quand les stomates sont répartis sur la face
adaxiale dans le cas des plantes aquatiques comme Nymphea alba et amphistomatique
lorsque les stomates sont présents sur les 2 faces du limbe comme chez Arabidopsis thaliana
(Hetherington et Woodward, 2003; Boccalandro et al., 2009).
2.2.1.2.Mécanismes présidant à l'ouverture et à la fermeture des stomates
Les mouvements d'ions et d'eau au travers de canaux présents sur les membranes
plasmiques et les membranes des vacuoles modifient la turgescence et le volume des
cellules de garde et régulent de ce fait l'ouverture des stomates (Pandey et al., 2007). Les
cellules de garde sont sensibles aux signaux environnementaux reçus au niveau des feuilles
qu'ils soient abiotiques ou biotiques, ainsi que ceux provenant des racines (Kim et al., 2010).
Les stomates s'ouvrent sous l'effet de la lumière bleue et rouge (Shimazaki et al., 2007),
d'une humidité élevée et de faibles concentrations en CO2. À l'inverse les stomates se
ferment en réponse à un déficit hydrique, à des concentrations élevées en ozone et à
l'obscurité pour les plantes avec un métabolisme de type C3 et C4. Effectivement les plantes
CAM conservent leurs stomates fermés en journée afin de préserver leurs réserves en eau et
accumulent le CO2 sous forme de malate la nuit. Une concentration élevée en CO2 induit
également une fermeture des stomates car leur ouverture n'est plus indispensable à une
entrée importante de CO2 dans la chambre sous stomatique (Israelsson et al., 2006).
18
Figure 4. Représentation schématique de la signalisation cellulaire et de la régulation des
canaux ioniques dans les cellules de garde. Ce schéma se concentre sur l'induction et la
transduction d'un signal induit par l'ABA et ses effets sur la membrane plasmique et
vacuolaire (Kim et al., 2010).
Ouverture des stomates
L'activation des H+/ATPases des membranes plasmiques des cellules de garde est
indispensable à l'ouverture des stomates (Shimazaki et al., 1986), elle induit effectivement
une hyperpolarisation de la membrane plasmique qui entraine une entrée de K + au travers
des canaux K+ entrants (Lebaudy et al., 2007) (Figure 4). L'entrée de K+, Cl-, NO3- et la
production de malate à partir d'amidon augmentent la turgescence des cellules de garde et
induit l'ouverture des stomates. Le K+ est accumulé dans les vacuoles des cellules de garde
par l'activité de transporteurs de type antiport H+/K+ et les anions sont eux transportés par
des canaux anioniques à faible affinité ou par des mécanismes d'échange H +/anions (Hafke
et al., 2003; Kovermann et al., 2007). L'acide abscissique (ABA) inhibe l'ouverture des
stomates par l'inhibition de l'activité des canaux entrants de K+ et des H+/ATPases (Kinoshita
et al., 1995). L'ABA est un sesquiterpénoïde à 15 atomes de carbone (C15) contenant un
cycle et une chaîne latérale portant 2 insaturations. L'ABA est synthétisé à partir des
caroténoïdes (C40), les phases précoces de cette synthèse ont lieu dans les plastes et
aboutissent à la libération de xanthoxine (C15) qui est alors convertie en ABA dans le cytosol
(Cutler et Krochko, 1999; Nambara et Marion-Poll, 2005).
Fermeture des stomates
Lors d'un stress hydrique, l'ABA induit la fermeture des stomates afin de réduire les
pertes en eau par transpiration, ce mécanisme nécessite l'activation de canaux ioniques
S-type comme SLAC1, de canaux potassium vacuolaire TPK1, des canaux K+, de pompes H+
comme OST2 et des canaux Ca2+présents sur la membrane plasmique (Figure 4). Lorsque les
cellules de garde perçoivent une augmentation de la concentration en ABA, leur volume et
leur turgescence diminuent, ce qui induit une fermeture des stomates. Cette baisse de
turgescence est le résultat d'une sortie d'anions et d'ions potassium (K+), ainsi que
l'induction de la synthèse d'amidon à partir de malate (MacRobbie, 1998). L'ABA déclenche
une augmentation de la concentration en calcium (Ca2+) qui active ensuite deux types de
canaux anioniques : à activation lente, durable et faiblement dépendante du voltage (Slow
activating sustained S-type) et à activation rapide transitoire et fortement dépendante du
voltage (Rapid-transient, R-type) (Siegel et al., 2009).
19
Les canaux anioniques S-type (comme SLAC1 chez Arabidopsis thalianna) auraient un rôle
crucial dans le mécanisme de fermeture des stomates (Grabov et al., 1997; Pei et al., 1997;
Vahisalu et al., 2008). Les canaux "S-type" pourraient correspondre à des protéines ABC (ATP
binding cassette) et notamment la protéine AtMRP5 (Multidrug Resistance Protein 5). Chez
Arabidopsis thaliana le mutant AtMRP5 présente effectivement une absence de réponse des
cellules de garde à des signaux dont l'ABA induisant l'ouverture ou la fermeture des
stomates (Klein et al., 2003). Cependant, AtMRP5 aurait plus une fonction de régulation de
différents signaux participant aux mécanismes de fermeture plutôt qu'un effet lié à l'activité
des canaux ioniques (Suh et al., 2007).
L'activation des canaux anioniques des membranes plasmiques des cellules de garde
est réputée être une étape critique dans le mécanisme de fermeture des stomates (Pei et al.,
1997). La sortie d'anion via les canaux ioniques génère une dépolarisation de la membrane
qui entraine un efflux de K+ des cellules de garde au travers des canaux potassiques sortant
(GORK chez Arabidopsis thaliana, Hosy et al., 2003).
Plus de 90 % des solutés libérés par les cellules de garde, sont originaires des
vacuoles (MacRobbie, 1998). La concentration élevée en Ca2+ active en effet les canaux
vacuolaires à potassium (VK) (Gobert et al., 2007). Trois types de canaux potassiques ont été
caractérisés dans la membrane vacuolaire des cellules de garde Slow-Vacuolar (SV), Fast
Vacuolar (FV) et Vacuolar K+-selective (VK) (Roelfsema et Hedrich, 2005). Chez Arabidopsis
thaliana le représentant de la famille TPC (Two Pore Channel), TPC1 (ou TPK1)
correspondrait au canal Slow-Vacuolar (Peiter et al., 2005). Toutefois les canaux TPC1/TPK1
ne seraient pas les seuls responsables des mécanismes de libération du K+ présent dans les
vacuoles, des mutants tpk1 maintiennent effectivement une réponse résiduelle à l'ABA à
l'origine de la fermeture des stomates (Gobert et al., 2007).
20
Figure 5. Représentation schématique des mécanismes d'ouverture des stomates en
réponse à la lumière bleue (Shimazaki et al., 2007).
Réponse des stomates à la Lumière
L'ouverture des stomates est induite par la lumière bleue qui agit comme un signal et
par la lumière rouge qui représente également un signal mais aussi une source d'énergie
(Zeiger, 1983). La lumière bleue active les H+/ATPases présentes sur la membrane plasmique
des cellules de garde, hyperpolaryse la membrane avec en parallèle une acidification de
l'apoplaste et entraine une entrée de K+ au travers des canaux K+ voltages dépendants
(Briggs et Christie, 2002; Vavasseur et Raghavendra, 2005) (Figure 5). La lumière rouge
représente une source d'énergie pour la photosynthèse dans les chloroplastes des cellules
du mésophylle mais aussi dans ceux des cellules de garde et conduit à une diminution de la
concentration interne en CO2 (Ci) consommée par la photosynthèse. L'ouverture des
stomates par la lumière rouge peut résulter d'une combinaison de réponses des cellules de
garde à la diminution de Ci et à un effet direct des chloroplastes des cellules de garde.
L'accumulation d'ions K+ dans les cellules de garde doit être compensée par des anions,
principalement sous la forme de malate2-. Or la lumière rouge est nécessaire à la synthèse de
malate (Vavasseur et Raghavendra, 2005). Les cellules de garde accumulent également
d'autres anions comme le Cl- et NO3- en réponse à l'augmentation de la concentration en K+
(Guo et al., 2003).
La lumière bleue a un effet 20 fois plus important sur l'ouverture des stomates que la
lumière rouge (Karlsson, 1986). Cette réponse extrêmement sensible à la lumière bleue
devient encore plus importante en présence de lumière rouge. La lumière bleue est un signal
d'ouverture des stomates et même une faible période de lumière bleue (30-60 s) entraine
une ouverture des stomates maintenue pendant 10 min après le flash de lumière bleue (Iino
et al., 1985). Des récepteurs à la lumière bleue existeraient sous deux formes inter
convertibles : la première physiologiquement active et la seconde inactive. La conversion de
la forme active à la forme inactive est induite rapidement par la lumière et cette forme
active retourne graduellement à l'état inactif par des réactions thermiques (Kinoshita et al.,
2001). La zéaxanthine par exemple, pigment présent dans les membranes des thylacoïdes,
est un récepteur de la lumière bleue dans les chloroplastes des cellules de garde.
21
La zéaxanthine ainsi activée par la lumière pourrait alors à son tour exciter des
phototropines et des sérines/thréonines kinases (Frechilla et al., 1999; Zeiger et al., 2002).
Les phototropines sont les récepteurs de la lumière bleue, chez Arabidopsis thaliana, 2
phototropines ont été identifiées PHOT1 et PHOT2 (Kinoshita et al., 2001). Les protéines
14-3-3 participent également à la voie de signalisation induite par la perception de la lumière
bleue dans les cellules de garde. Les protéines 14-3-3 sont des activateurs des H+/ATPases
présentes sur les membranes plasmiques via leur phosphorylation en présence de lumière
bleue (Kinoshita et Shimazaki, 2002). Les protéines 14-3-3 ont la particularité de se fixer
également aux phototropines et d'induire leur phosphorylation, cette fixation précéderait
l'activation des H+/ATPases membranaires (Kinoshita et al., 2003). Des serines/thréonines
protéines kinases pourraient être activées par la lumière bleue et participeraient également
à la phosphorylation des H+/ATPases (Kinoshita et Shimazaki, 1999). Les H+/ATPases
induisent une sortie de protons, ce qui a comme conséquence d'intensifier le potentiel
électrochimique négatif à l'intérieur des cellules de garde à l'origine de l'activation des
canaux K+ entrants liée à l'hyperpolarisation de la membrane. L'ABA inhibe la
phosphorylation, induite par la lumière bleue, des H+/ATPases par une augmentation de la
production d'H2O2 dans les cellules de garde via l'activation de NADPH oxydases des
membranes plasmiques (Zhang et al., 2004) et par la production de monoxyde d'azote (NO)
qui stimule la fermeture des stomates (Bright et al., 2006).
La lumière rouge améliore l'activation de la conductance stomatique par la lumière
bleue dans les feuilles de Paphiopedilum dont les cellules de garde sont dépourvues de
chloroplastes (Zeiger et al., 1983). La réponse directe des cellules de garde serait assurée par
leurs chloroplastes, effectivement des cellules de garde isolées de Paphiopedilum,
dépourvues en chloroplastes, ne présentent aucune réponse à la lumière rouge (Zeiger et
al., 1983). De plus dans des cellules de garde contenant des chloroplastes cette réponse est
inhibée par l'ajout de DCMU réputé être un inhibiteur du transfert photosynthétique des
électrons (Olsen et al., 2002). La chute de Ci induite par l'activation de la photosynthèse est
également un des paramètres participant à l'ouverture des stomates en réponse à la lumière
rouge.
22
Toutefois ce signal ne serait pas indispensable, sachant que la lumière rouge active tout de
même l'ouverture des stomates même lorsque la Ci est maintenue constante (Messinger et
al., 2006). Les chloroplastes des cellules de garde fournissent du NADPH,H+ et de l'ATP au
cytoplasme sous un éclairage à la lumière rouge, ces composés sont nécessaires à la
synthèse de malate formé à partir d'oxaloacétate (OAA) par la malate déshydrogénase
(Shimazaki et al., 2007).
Concentration en CO2
Une longue exposition à des concentrations élevées en CO2 s'accompagne d'une
diminution de la densité des stomates présents sur les feuilles réduisant de fait la
conductance stomatique (Lake et al., 2002). À court terme, des concentrations élevées en
CO2 activent les canaux ioniques et les canaux de K+ sortant chez Vicia faba (Raschke et al.,
2003), ce qui déclenche la sortie de Cl- des cellules de garde et une dépolarisation de la
membrane plasmique (Hanstein et Felle, 2002). La signalisation liée au CO2 pourrait être
ressentie directement au niveau des cellules de garde ou indirectement par les cellules du
mésophylle, ces deux hypothèses pourraient dans les faits participer en synergie à la
fermeture des stomates. Chez Arabidopsis thaliana, la protéine GCA2 participerait à la
transduction du signal lié au CO2. Des mutant gca2 présentent effectivement une réponse
altérée aux concentrations élevées en CO2 (800 ppm) dans les feuilles intactes et dans les
lambeaux d'épidermes. Chez ces mutants les modifications de concentrations en CO 2
n'induiraient aucun changement au niveau de la concentration en Ca 2+ dans le cytoplasme
des cellules de garde, la dépolarisation des membranes en réponse au CO2 serait affectée
(Young et al., 2006). La protéine SLAC1 participerait également à cette voie de signalisation,
car les mutants slac1 ne sont pas capables de fermer leurs stomates en réponse aux
concentrations élevées en CO2 (Negi et al., 2008; Vahisalu et al., 2008). Cette protéine aurait
donc un rôle central dans le contrôle de la fermeture des stomates induite par l'ABA et le
CO2 (Schroeder et Hagiwara, 1989). Une protéine kinase HT1 (High Leaf Temperature 1) a
été identifiée comme régulant et inhibant la réponse aux fortes concentrations en CO 2, le
mutant ht1-2 présente en effet et quel que soit la concentration en CO2, une fermeture des
stomates à la fois pour des cellules de garde isolées du mésophylle et pour des feuilles
intactes (Hashimoto et al., 2006).
23
Une seconde protéine participerait aussi à l'inhibition du signal CO2, il s'agit du transporteur
responsable de l'entrée de malate (ABC) présent sur la membrane plasmique des cellules de
garde, la fermeture des stomates est effectivement accélérée en présence de CO2 chez des
mutants atabcb14 et inhibée chez les plantes sur-exprimant la protéine AtABCB14 (Lee et
al., 2008). L'entrée de malate dans les cellules de garde via le transporteur ABC aurait un
rôle important dans la régulation des mécanismes de fermeture des stomates en réponse à
des concentrations élevées en CO2. Enfin la sous-unité KAT2 du transporteur responsable de
l'entrée de K+ dans les cellules de garde prendrait part également à la fermeture des
stomates en réponse au CO2, les mutants incapables d'exprimer cette sous unité sont
effectivement insensibles au CO2 (Lebaudy et al., 2008).
Les protéines capables de se lier au CO2 et responsables de la perception du signal et
de l'induction de la voie de signalisation conduisant à terme à la fermeture des stomates
sont encore inconnues. Toutefois 2 anhydrases carboniques (βCA1 et βCA4) seraient des
intermédiaires nécessaire à la réponse au CO2 directement au niveau des cellules de garde
(Hu et al., 2010). L'analyse de mouvements stomatiques de lambeaux d'épidermes détachés
des cellules du mésophylle a montré une fermeture des stomates en réponse à des
concentrations élevées en CO2, confirmant le rôle direct des cellules de garde à la réponse
du signal CO2 (Lee et al., 2008). Des études des mouvements stomatiques sur des cellules de
garde isolées ou greffées à des cellules du mésophylle indiquent que les cellules du
mésophylle participent à la réponse des stomates au CO2 (Mott et al., 2008). En réponse à
des concentrations élevées en CO2, du malate serait libéré des cellules du mésophylle, ce
malate alors présent dans l'apoplaste induirait l'activation des canaux ioniques et la fuite
d'anions des cellules de garde et par conséquent la fermeture des stomates (Hedrich et
Marten, 1993; Hedrich et al., 2001).
24
2.2.1.3.Réponse stomatique au déficit hydrique
Des expériences utilisant des mutants de biosynthèse de l'ABA chez de nombreuses
espèces dont Arabidopsis thaliana ont montré chez ces mutants une sensibilité accrue au
stress hydrique liée à une absence de régulation des mouvements stomatiques. De plus
l'application d'ABA exogène sur ces plantes a permis la réversion du phénotype (Koornneef
et al., 1984; LeonKloosterziel et al., 1996; Marin et al., 1996). Ces expériences ont confirmé
l'importance de l'ABA endogène comme principal signal responsable de la fermeture des
stomates en réponse à un stress hydrique.
Rôle de L’ABA da s la fe
etu e sto atique
L'acide abscissique (ABA) apoplastique est perçu par les cellules de garde car celles-ci
sont dépourvues de plasmodesmes, c'est pourquoi des récepteurs à l'ABA extracellulaires
ont été recherchés. Des travaux utilisant une forme imperméable de l'ABA couplée à de la
BSA sur des cellules de garde d'Arabidopsis thaliana confirment cette hypothèse. En effet
ces cellules ont montré l'induction de l'expression de certains gènes de réponse à l'ABA et
l'activation des canaux potassiques sortants (Jeannette et al., 1999). La membrane
plasmique des cellules de garde contiendrait donc des récepteurs protéiques à l'ABA (Pedron
et al., 1998). Etant donné que l'ABA est un acide faible caractérisé par un pKa de 4,8, l'ABA
est majoritairement présente sous forme anionique (ABA-) non diffusive dans un milieu au
pH neutre et sous la forme neutre (ABAH) diffusible en milieu acide. L'entrée d'ABA dans les
cellules de garde de Commelina communis est capable d'induire la fermeture des stomates
(Allan et al., 1994), c'est pourquoi des récepteurs à l'ABA intra cellulaires seraient également
présents. Récemment, les protéines GTG1/GTG2 (Pandey et al., 2009) et PYR/PYL/RCAR (Ma
et al., 2009; Park et al., 2009) ont été identifiées comme des protéines capables de se lier à
l'ABA et à l'origine de la voie de signalisation induisant la fermeture des stomates.
25
L'homéostasie de l'ABA est contrôlée par sa synthèse, son inactivation via la
conjugaison avec des dérivés du glucose et sa dégradation (Cutler et Krochko, 1999). Une
augmentation rapide de la concentration en ABA en réponse à un stress hydrique peut être
expliquée par une activation des gènes codant des protéines de la voie de biosynthèse
comme l'enzyme NCED3 (Tan et al., 2003). Le stress hydrique active aussi la conversion des
formes inactives de l'ABA conjuguées comme l'ABA-glucose ester (ABA-GE) qui pourrait
contribuer à augmenter la concentration en ABA. Effectivement, pendant une période de
déficit hydrique, l'hydrolyse de l'ABA-GE par la β-glucosidase AtBG1 est induite (Lee et al.,
2006). L'ABA 8'-hydrolase est une enzyme participant à la voie de catabolisme de l'ABA, elle
convertit l'ABA actif en forme 8'-hydroxy ABA inactive, l'expression de gènes (CYP707A1 à
A4) codant cette enzyme est activée lors de période de réhydratation de plantes stressées
(Kushiro et al., 2004) et en réponse à des taux d'humidité importants (Okamoto et al., 2009).
Au ou s d’u
pisode de s he esse, la s th se d'a ide a s issi ue ABA) est
stimulée dans les racines et dans les feuilles (Davies et Zhang, 1991). Cette augmentation de
la concentration en ABA est souvent corrélée à une fermeture stomatique (Davies et Zhang,
1991; Tardieu et al., 1993; Zhang et Outlaw, 2001). Des expériences de séparation de
l'appareil racinaire entre un premier compartiment arrosé régulièrement et un second en
condition de stress hydrique ont permis d'observer une fermeture des stomates malgré un
état hydrique optimal des parties aériennes, confirmant ainsi l'importance du signal racinaire
(Gowing et al., 1990). La conductance stomatique est affectée par le stress hydrique avant
que le potentiel hydrique des feuilles ne soit altéré (Poulson et al., 2006). Cette fermeture
des stomates précoce a été corrélée à une augmentation de la concentration en ABA dans la
sève brute liée à l'état hydrique des racines (Zhang et Davies, 1990). Toutefois, l’ABA
racinaire ne serait peut-être pas le signal longue distance tant recherché. Effectivement des
études immunohistochimiques menées afin de localiser des enzymes participant à la
synthèse de l'ABA comme l'ABA2, la NCED3 et la AAO3 ont montré en réponse à un stress
hydrique, chez Arabidopsis thaliana, que les cellules du parenchyme des tissus vasculaires
des feuilles étaient les principaux sites de biosynthèse de l'ABA (Endo et al., 2008).
26
De plus des constructions de Solanum lycopersicum obtenues par greffe de parties aériennes
su des a i es de
uta ts i apa les de s th tise l’ABA, répondent à un déficit hydrique
du sol en fermant leurs stomates (Holbrook et al., 2002). Ce résultat montre ainsi que la
fermeture des stomates chez Solanum lycopersicum n'est pas conditionnelle à une
production d'ABA par les racines. Le stress hydrique induirait une augmentation du pH de la
sève xylémienne (Wilkinson, 1999) d favo a le à la diffusio de l’ABA da s les ellules du
soph lle de telle so te ue la plupa t de l’ABA
majoritairement di ig ve s l’ pide
l
ie
ui a ive da s la feuille se ait
e et les ellules de ga de où il activerait la fermeture
des stomates sans pour autant qu'une réelle augmentation de la concentration en ABA
foliaire soit constatée (Wilkinson et al., 1998; Wilkinson et Davies, 2002; Chaves et al., 2009).
Réponse des cellules de garde aux variations du flux transpiratoire
Les stomates répondraient aussi à un changement direct de l'état hydrique de la
feuille et par conséquent aux variations de flux transpiratoire, tous deux dépendant de la
conductance hydraulique du xylème qui varie en fonction de l'état hydrique du sol. Les
stomates sont également capables de répondre aux variations de l'humidité de l'air via des
changements du potentiel hydrique foliaire sans qu'aucun signal racinaire ne soit émis
(Comstock et Mencuccini, 1998). Des phénomènes de cavitation peuvent également se
produire dans le xylème en réponse à de fortes tensions et à la formation d'embolies
gazeuses (Sack et Holbrook, 2006). Une forte demande évaporatoire ou un déficit hydrique
du sol entrainent une diminution du potentiel hydrique du xylème et induisent un
changement d'état de l'air dissous dans l'eau et par conséquent une augmentation du risque
de cavitation. La fermeture des stomates limite la transpiration et maintient une
transpiration qualifiée de critique, transpiration maximale permettant de préserver la
continuité hydraulique entre le sol et les feuilles et d'éviter les risques de cavitation (Sperry
et al., 2002). Un signal hydraulique précoce permettrait de réguler l'ouverture des stomates
en fonction de la disponibilité en eau dans le sol (Christmann et al., 2007). Ainsi des
variations du trajet de l'eau du sol aux feuilles induisent une réponse rapide au niveau des
stomates, de l'ordre de la minute (Saliendra et al., 1995; Cochard, 2002).
27
L'augmentation du pH de la sève xylémienne en réponse à un stress hydrique pourrait
constituer à elle seule le signal parvenant des racines responsable de la fermeture des
stomates (Wilkinson et Davies, 2002). Ces modifications du pH de la sève xylémienne
induiraient également la synthèse d'ABA (Jiang et Hartung, 2008).
2.2.2. La conductance mésophyllienne
Il existe une autre limitation diffusive indépendante de la limitation stomatique : la
conductance mésophyllienne (gm). Cette conductance est relative au trajet du CO2 dans le
mésophylle, des espaces intercellulaires jus u’au sites de a o latio à l'i t ieu des
chloroplastes. La conductance mésophyllienne a deux composantes, la première est une
résistance du trajet du CO2 en phase gazeuse dans les espaces intercellulaires et la seconde
une résistance en phase liquide à travers les membranes des cellules et des chloroplastes
(Pons et al., 2009). La résistance en phase gazeuse dépend de la structure de la feuille, de sa
porosité, de la forme et de la densité des cellules. Elle dépend surtout du trajet suivi,
o ditio
pa le deg
d’h t og
it de l’ouve tu e des sto ates (Morison et al., 2005).
La résistance en phase liquide repose su l’a ato ie fi e de la feuille, o
e l’ paisseu des
parois cellulaires, la surface des membranes des cellules du mésophylle et celles des
chloroplastes. Les mécanismes à l'origine des variations de la conductance du mésophylle ne
sont pas encore claires, cependant des réarrangements à l'intérieur des chloroplastes, des
anhydrases carboniques ainsi que des aquaporines pourraient participer à la régulation de la
conductance mésophyllienne (Flexas et al., 2008). Les anhydrases carboniques permettent la
conversion de HCO3- en CO2 au niveau des chloroplastes. Des plants transgéniques de
Nicotiana tabacum sur-exprimant un gène codant pour une anydrase carbonique sont en
effet caractérisés par une gm plus élevée que celle des plantes sauvages (Price et al., 1994).
Cependant cette corrélation positive n'est pas toujours vérifiée et dépendrait principalement
de l'espèce (Gillon et Yakir, 2000). Chez Arabidopsis thaliana, 14 gènes (8 AtαCA et 6 AtβCA)
codent pour des anhydrases carboniques différentes qui sont localisées sur les membranes
plasmiques, dans le cytosol et dans les chloroplastes ; ces différentes anhydrases pourraient
contribuer à la diffusion du CO2 à différents niveaux cellulaires (Fabre et al., 2007).
28
Les aquaporines pourraient également contribuer à la régulation de la gm en assurant le
transport du CO2. Effectivement des plants de Phaseolus vulgaris et Vicia faba traités au
HgCl2, inhibiteur non-spécifique de certaines aquaporines, ont présenté une diminution de
leur gm (Terashima et Ono, 2002). Des plants de Nicotiana tabacum mutés au niveau du gène
NtAQP1 qui code pour une aquaporine sont caractérisés par une faible gm, alors que celles
sur-exprimant ce gène ont présenté une gm plus élevée par rapport à celle des plantes
sauvages (Flexas et al., 2006). Ce dernier résultat a également été observé chez Oriza sativa
où la sur-expression d'une aquaporine a aussi été corrélée à une forte g m (Hanba et al.,
2004). L'aquaporine NtAQP1 de Nicotiana tabacum aurait un rôle important dans la réponse
rapide de la gm aux variations de concentrations en CO2 (Flexas et al., 2006). NtAQP1 serait
localisé dans les membranes plasmiques et dans la membrane interne des chloroplastes et
participerait avec les anhydrases carboniques à l'entrée de CO2 dans le chloroplaste
(Kaldenhoff et Fischer, 2006). Enfin des mutations altérant la forme des chloroplastes par
une accumulation de phytochromes (Sharkey et al., 1991) ou des mutations entrainant des
réarrangements des chloroplastes (Tholen et al., 2007; Tholen et al., 2008) ont dans les deux
cas affiché des baisses de gm.
Tout comme la conductance stomatique (gs), la conductance mésophyllienne (gm)
varie en fonction des variations de certains paramètres environnementaux tels que la
concentration en CO2, la lumière, la température et le déficit de pression de vapeur (VPD)
(Flexas et al., 2008). La gm répond comme la gs aux variations de la concentration en CO2
ambiante, en présence de faibles concentrations en CO2 la gm augmente (Centritto et al.,
2003; Flexas et al., 2007). À l'inverse, les plantes soumises à de fortes concentrations en CO2
sont caractérisées par de faibles gm (During, 2003; Flexas et al., 2007). Les feuilles ombragées
présentent une gm inférieure à celle des feuilles soumises à la lumière (Laisk et al., 2005;
Warren et al., 2007). Une augmentation du déficit de pression de vapeur (VPD) a induit une
baisse de la gm chez Olea europea (Bongi et Loreto, 1989). La gm varie également en fonction
de la température sans pour autant qu'un profil général de réponse puisse être défini,
toutefois plusieurs études ont pu corréler une augmentation de la gm en réponse à une
augmentation de la température de 10 à 25°C (Bernacchi et al., 2002; Yamori et al., 2006;
Warren, 2008).
29
Une baisse de la conductance du mésophylle est à l'image de la conductance stomatique
classiquement affectée par le stress hydrique, qu'il soit obtenu par une interruption de
l'arrosage (Flexas. et al., 2004; Flexas et al., 2006; Galmes et al., 2007; Galmés et al., 2007),
par un traitement à l'ABA (Flexas et al., 2006), par un traitement au PEG (Warren et al.,
2004) ou par un stress salin (Centritto et al., 2003; Loreto et al., 2003).
La diminution de la conductance mésophyllienne entraine une chute de la
concentration en CO2 dans les chloroplastes (Cc) qui induit un ralentissement de l'activité de
carboxylation de la Rubisco (Galmés et al., 2011). Effectivement une forte corrélation a été
observée entre la conductance mésophyllienne et l'assimilation nette (A N) chez Arabidopsis
thaliana (écotype Col-0) (Flexas. et al., 2007) et une étude rassemblant les résultats obtenus
chez 81 espèces différentes confirme bel et bien la corrélation positive entre la gm et l'AN
(Niinemets et al., 2009).
2.2.3. Effet global des limitations diffusives sur l’assimilation nette
En réponse à un déficit hydrique, les stomates se ferment, ce qui a comme
o s
ue e d'isole
le
soph lle pa
appo t à l’at osph e a
ia te, ainsi la
concentration en CO2 directement en contact avec les cellules du mésophylle (Ci) va
diminuer (Flexas et Medrano, 2002). Da s e as p
is l’assi ilatio
ette di i ue du fait
d'une limitation en CO2 à l'intérieur des chloroplastes (Cornic, 2000). Les cellules du
mésophylle ainsi isolées ne sont plus alimentées par le CO2 de l’ai a
ia t, elles vo t
progressivement épuiser le CO2 restant, Ci di i ue jus u’à e ue l’assi ilatio e CO2 et les
pe tes espi atoi es s’
uili e t (Renou et al., 1990). Par exemple, chez Arabidopsis
thaliana et plus particulièrement pour l'écotype Col-0 soumis à un déficit hydrique, une
chute de 20 % de la conductance stomatique a été corrélée à une chute de même ordre (20
%) de l'assimilation nette, en fin de stress hydrique la gs chute de 80 % et l'AN de 60 %
(Poulson et al., 2006).
Lo s d’u
st ess h d i ue, la fermeture des stomates est largement considérée
comme étant la première réponse, permettant de limiter rapidement les effets de la
sécheresse (Yordanov et al., 2000; Flexas et Medrano, 2002).
30
Toutefois comme la conductance mésophyllienne semble également être affectée
rapidement en réponse à un stress hydrique, cette composante n'est pas à négliger dans
l'étude des effets des limitations diffusives sur la photosynthèse (Flexas et al., 2004; Flexas
et al., 2006; Galmes et al., 2007a; Galmés et al., 2007b).
2.3. Déficit hydrique et limitations métaboliques
Lorsque le déficit hydrique s'intensifie, des limitations métaboliques peuvent
s'ajouter aux limitations diffusives et participer à l'inhibition de l'assimilation nette (Flexas,
et al. 2004). Si ces limitations n'altèrent que le fonctionnement du métabolisme
photosynthétique alors elles sont réversibles, en revanche lorsque la structure de certaines
protéines ou complexes protéiques est altérée alors elles peuvent être irréversibles. Ces
limitations métaboliques affectent aussi bien la phase claire que la phase sombre de la
photosynthèse (Flexas et Medrano, 2002).
2.3.1. Effet d’un déficit hydrique sur la capture d’énergie lumineuse et
le transport des électrons
L'altération de la capacité de capture de l'énergie lumineuse au niveau des antennes
des photosystèmes et du transport des électrons dans la chaîne de transport des électrons
classiquement observée en réponse à un stress hydrique pourrait inhiber l'assimilation nette
de CO2, en limitant la fourniture de NADPH,H+, de ferrédoxine réduite et d'ATP,
indispensables au fonctionnement du cycle de Calvin et à la régénération du substrat de la
Rubisco, le RuBP.
2.3.1.1.Ralentissement du transfert des électrons à partir du PSII
Des plantes soumises à un déficit hydrique présentent classiquement une baisse
progressive du rendement quantique du photosystème II (ΦPSII) chez Hordeum vulgare
(Golding et al., 2004), Spinacea oleracea (Jia et al., 2008), Triticum aestivum (Lu et Zhang,
1998) et Arabidopsis thaliana (Jung, 2004; Woo et al., 2008).
31
Un ralentissement du flux total des électrons dans la chaîne de transport
photosynthétique (JT) est également observé en réponse à un déficit hydrique chez
notamment Haberla rhodopensis (Peeva et Cornic, 2009), Vitis vinifera (Flexas, J. et al.,
1999), Rhamnus ludovici-salvatoris, Phaseolus vinifera et Nicotiana sylvestris (Bota et al.,
2004), Rosa rubiginosa (Meyer et Genty, 1999), Oryza sativa (Zhou et al., 2007) et
Arabidopsis thaliana (Jung, 2004; Woo et al., 2008). Ce ralentissement voire l'arrêt du
transport des électrons dans la chaîne photosynthétique induit un transfert accru des
électrons à l'O2 et par conséquent l'augmentation de la production d'espèces actives de
l'oxygène (ROS) qui, à terme, pourront altérer de nombreux composants cellulaires (Lawlor
et Cornic, 2002).
2.3.1.2.Génération d'espèce actives de l'oxygène (ROS)
Le stress oxydatif peut être défini comme une perturbation de la balance entre
systèmes prooxydants et antioxydants en faveur des premiers, conduisant à des dommages
potentiels (Sies, 1997). Un stress oxydatif est donc de facto la conséquence de la diminution
des apa it s a tio da tes et/ou d’u e aug e tatio de la p odu tio de ROS. Lorsque les
ROS sont produites et accumulées en concentrations supérieures à la concentration normale
autrement dit lo s u’elles e peuve t plus t e a e
es, pa les s st
es a tio da ts
cellulaires, à la concentration physiologique normale et requise (dépassement des capacités
a tio da tes de l’o ga is e , les ROS nombreuses et non maîtrisées (notamment OH•)
pourront p ovo ue d’importants dégâts cellulaires :
assu es et
utatio s de l’ADN
(nucléaire, mitochondrial et chloroplastique), altération oxydative et inactivation de
p ot i es et d’e z
lipop ot i es ou des
es, peroxydation lipidique au sein des acides gras polyinsaturés, des
e
a es ellulai es… (Moller et al., 2007). Deux stratégies non
exclusives concourent à limiter des ROS : la prévention et la détoxication (Mittler, 2002; Apel
et Hirt, 2004).
32
La prévention fait intervenir des mécanismes qui instaurent des conditions peu
favorables à la production des ROS soit en limitant les possibilités de saturation des chaînes
de t a spo teu s d’ le t o s
gulatio s dive ses au iveau des a te
photo s a o pag
ajuste e t de tout le
i te ve tio
es d’u
d’o dases alte atives
ito ho d iales… soit e
AOX
es olle t ices de
ta olis e photos th ti ue,
da s les thylacoïdes et les membranes
faisa t i te ve i des a tio da ts
o
e z
ati ues
ui
peuvent, par exemple, en permettant la désexcitation des chlorophylles (quenching) éviter
u’elles
e
de t u
le t o
à l’O2. La détoxication fait quant à elle classiquement
intervenir des molécules antioxydantes non enzymatiques et des enzymes antioxydantes qui
peuvent nécessiter plus ou moins directement du pouvoir réducteur pour leur bon
fonctionnement. Ce pouvoir réducteur est alors utilisé soit directement comme co-substrat
soit pour permettre la régénération de la forme active de la molécule antioxydante (Cruz de
Carvalho, 2008).
2.3.1.3.Mécanismes de photo-protections
En condition de déficit hydrique, une surproduction de ROS peut être contenue voire
inhibée par l'intervention d'un certain nombre de mécanismes comme : (i) l'augmentation
de l'activité de puits alternatifs consommateurs d'électrons, (ii) la mise en place de systèmes
évacuateurs d'énergie et (iii) l'intervention de systèmes protecteurs mettant en jeu de
puissantes molécules antioxydantes. L'ensemble de ces mécanismes sont définis sous le
terme de photo-protection (Halliwell, 1991; Cornic et Fresneau, 2002).
2.3.1.3.1.Puits alternatifs d’électrons concourant au maintien du transfert
électronique
Des voies métaboliques capables de consommer du NADPH,H+ et de l'ATP ou des
enzymes activées par une régulation de leur état redox par la thiorédoxine peuvent être
qualifiées de puits alternatif consommateurs d'électrons. Malgré un ralentissement de
l'activité photosynthétique, ces puits alternatifs d'électrons permettent de maintenir un
transfert des électrons dans la chaîne de transport photosynthétique des thylacoïdes afin de
réduire le transfert des électrons à l'O2 et de limiter ainsi la production de ROS et retarder
l'installation de processus de photo-inhibition.
33
Figure 6. Représentation schématique des réactions de photorespiration aussi appelées
voie du glycolate. Ces réactions nécessitent 3 compartiments cellulaires, le chloroplaste, le
peroxysome et la mitochondrie. Enzymes participant à la voie du glycolate : 1. Rubisco, 2.
phosphoglycolate phosphatase, 3. glycolate oxydase (GOX), 4. catalase, 5. glyoxylate
aminotransférase, 6. glycine décarboxylase (GDC), 7. sérine hydroxyméthyltransférase
(SHMT), 8. glutamate aminotransférase, 9. hydroxypyruvate réductase, 10. glycérate
synthase, 11. glutamine synthase, 12. glutamate synthase (GOGAT). Oxaloacétate (OAA),
glutamine (Gln), glutamate (Glu), hydroxypyruvate (OH-pyruvate).
La photorespiration
L'activité oxygénase de la Rubisco assure la fixation d'un O2 sur une molécule de
RuBP et par conséquent la production d'une molécule de 3-phosphoglycérate et une
molécule de phosphoglycolate (Figure 6). Le phosphoglycolate est hydrolysé en glycolate par
une phosphoglycolate phosphatase. Le glycolate sort ensuite du chloroplaste pour subir une
série de transformations qualifiée de voie du glycolate et fait intervenir en plus des
chloroplastes deux autres types d'organites, les peroxysomes et les mitochondries. Dans les
peroxysomes le glycolate est oxydé par une glycolate oxydase pour produire du glyoxylate et
du peroxyde d'hydrogène (H2O2) ; la photorespiration est réputée être responsable de la
production de 70 % de l'H2O2 cellulaire (Noctor et al., 2002). Toutefois l'H2O2 produit est
immédiatement pris en charge par une catalase pour former de l'H2O et
O2. Le glyoxylate
est aminé en glycine par une glyoxylate aminotransférase.
La glycine produite dans le peroxysome entre ensuite dans la mitochondrie où 2 molécules
de glycine seront transformés. Une première molécule de glycine est décarboxylée en
présence de NAD+ par une glycine décarboxylase, cette réaction libère une molécule de CO2,
un NADH et une molécule d'ammoniac. Le deuxième carbone restant de la glycine est fixé
par un cofacteur, le tétrahydrofolate (THF) pour former le méthylène tétrahydrafolate
(CH2-THF), ce carbone est ensuite transféré sur la seconde molécule de glycine par la sérine
hydroxyméthyltransférase (SHMT) pour former une molécule de sérine.
Après sa sortie de la mitochondrie, la sérine est transportée dans le peroxysome,
transformée en hydroxypyruvate par une aminotransférase qui libère le groupe aminé (NH2).
L'hydroxypyruvate est réduit en glycérate par une hydroxypyruvate réductase en présence
de NADH, issu du péroxysome. Effectivement le NADH,H+ produit dans les chloroplastes
et/ou les mitochondries est utilisé par la malate déshydrogénase pour produire à partir de
l'oxaloacétate du malate qui sera transporté dans le péroxysome pour y fournir du NADH. Le
glycérate quitte le peroxysome et entre dans le chloroplaste où il est phosphorylé en
3-phosphoglycérate (3-PG) par une glycérate kinase. Enfin le 3-PG est utilisé dans le cycle de
Calvin pour régénérer le RuBP (Wingler et al., 2000).
34
La photo espi atio
est, ap s l’assi ilatio
du CO2, le second processus
consommateur de NADPH,H+ et d'ATP, principalement lors de la régénération du RuBP par le
cycle de Calvin. En conditions normales, 25 % des électrons transportés dans la chaîne de
transport photosynthétique sont utilisés pour produire du pouvoir réducteur et de l'énergie
nécessaire à la photorespiration. Lors d'un ralentissement de l'activité photosynthétique
notamment en réponse à un déficit hydrique via la fermeture des stomates, cette activité
métabolique consomme du pouvoir réducteur permettant ai si d’ va ue les ha ges
électroniques en excès qui tendraient à engorger les photosystèmes (Biehler et Fock, 1996;
Osmond et al., 1997; Haupt-Herting et Fock, 2000; Wingler et al., 2000; Cornic et Fresneau,
2002; Lawlor et Cornic, 2002). C'est pourquoi, la photorespiration pourrait limiter voire
retarder l’i stallatio d’u p o essus de photo-inhibition de la photosynthèse en conservant
u flu d’ le t o s elative e t o sta t
alg
u e hute de l’assi ilatio
ette. De plus le
métabolisme photorespiratoire produit de la glycine qui est un précurseur du glutathion,
métabolite de la voie de l'ascorbate-glutathion participant à la prévention des effets du
stress oxydatif (Noctor et al., 1999; Wingler et al., 2000).
Classiquement, en début de stress hydrique lorsque l'assimilation nette est limitée
par la fermeture des stomates et la diffusion du CO2, les enzymes participant à la
photorespiration ne sont pas atteintes et sont même dans certains cas activées, comme par
exemple la glycolate oxydase (Mittler et Zilinskas, 1994; Rizhsky et al., 2004). C'est pourquoi
une augmentation du rapport photorespiration/assimilation nette accompagne souvent la
chute du contenu relatif en eau (RWC) et la baisse de la concentration interne en CO2 (Ci)
(Lawlor, 1976; Wingler et al., 2000). Cependant, certains auteurs n'ont pu observer
d'augmentation en valeur absolue de la photorespiration (Lawlor et Fock, 1977; Gerbaud et
André, 1980; Biehler et Fock, 1996). Durant un stress hydrique sévère, l'assimilation de CO2
comme la photorespiration peuvent être inhibées par des limitations métaboliques comme
la régénération du RuBP inhibant de ce fait certaines réactions enzymatiques du cycle de
Calvin (Sharkey et Seemann, 1989; Wingler et al., 2000).
35
Figure 7. Représentation schématique de la réaction de Mehler et du cycle de l'ascorbateglutathion se déroulant dans le stroma des chloroplastes. L'ascorbate ainsi que la
superoxyde dismutase (SOD), l'ascorbate peroxydase (APX) et la monodéshydro-ascorbate
réductase (MDA-FAD) participent au sein du cycle de l'ascorbate-glutathion à la
détoxification de l'anion radical superoxyde (O2•-) produit par la réaction de Mehler.
L'ascorbate est ensuite régénéré à partir du déshydro-ascorbate (DHA) par l'action d'une
déshydro-ascorbate réductase en présence de glutathion réduit, qui est enfin reformé à
partir de glutathion oxydé par l'action d'une glutathion réductase en consommant du
NADPH,H+.
Toutefois, chez Phaseolus vulgaris, lorsque la photorespiration est inhibée par de
faibles concentrations en O2 durant le stress hydrique et à de fortes intensités lumineuses, le
rendement quantique maximale de la réaction photochimique du PSII (F v/Fm) n'est pas
affecté (Brestic et al., 1995). La photorespiration ne serait pas essentielle, chez Phaseolus
vulgaris, aux processus de photo-protection retardant l'installation de la photo-inhibition
durant le stress hydrique. Enfin l'observation d'une augmentation de la consommation en O 2
accompagnée par une diminution de la photorespiration (déterminée par le suivi du
glycolate) durant le stress hydrique, suggère un transfert des électrons à O2 accru, assuré par
une augmentation des réactions de Mehler (Biehler et Fock, 1996).
La réaction de Mehler, le cycle du glutathion-ascorbate et la catalase
Dans les chloroplastes, la réaction de Mehler, aussi appelée transfert pseudo
cyclique des électrons ou "water-water cycle", réalise la photo-réduction de l'O2 en H2O au
niveau du PSI à partir des électrons produits par le PSII (Asada, 2000) (Figure 7). La réaction
de Mehler représente un puits alternatif d'électrons mais comme cette réaction produit
l'anion radical superoxyde (O2•-), son rôle dans la photo-protection est souvent discuté
(Radmer et Kok, 1976; Asada, 2000). Toutefois l'O2•- est rapidement dismuté par une
superoxyde dismutase membranaire (SOD) produisant ainsi du peroxyde d'hydrogène (H2O2)
(Kliebenstein et al., 1998) qui est ensuite converti en eau par une ascorbate peroxydase
(APX) en présence d'ascorbate (Asada, 1999). Lo s ue l’a tivit du
le de Calvin approche
de la saturation, cette réaction consomme alors 20 à 30 % du flu d’ le t o s p oduit pa
l’a tivit
des photosystèmes (Asada, 1999). Un épisode de sécheresse induit une
augmentation de la consommation d'O2, cette consommation a été parfois attribuée à une
augmentation de l'activité des réactions de Mehler. L'O2 devient un accepteur important des
électrons transportés dans la chaîne de transport dans les membranes des thylacoïdes
(Smirnoff, 1993). Cette augmentation a été observée chez Triticum aestivum (Biehler et
Fock, 1996), Helianthus annuus (Sgherri et al., 1996), Lycopersicon esculentum (HauptHerting et Fock, 2000), Vitis vinifera (Flexas et al., 1999). Biehler et Fock (1996) ont relevé
chez Triticum aestivum et en réponse à un déficit hydrique une augmentation des réactions
de Mehler de 50 % par rapport à celles des plantes témoins.
36
Chez Lycopersicon esculentum et Vitis vinifera l'augmentation de la consommation d'O2 a été
rapportée à la photorespiration et à la réaction de Mehler (Flexas et al., 1999; Haupt-Herting
et Fock, 2000).
Afin d'observer plus précisément l'évolution des réactions de Mehler, durant une
période de déficit hydrique, un suivi de l'activité de la super oxyde dismutase (SOD) est
souvent réalisé. L'activité des SOD totales augmente durant une période de sécheresse chez
Arabidopsis thaliana (Jung, 2004), Coffea canephora (Pinheiro et al., 2004), Triticum
monococcum (Badiani et al., 1990), Phaseolus vulgaris (Turkan et al., 2005), Olea europaea
(Sofo et al., 2005), Pisum sativum (Mittler et Zilinskas, 1994) et Oryza sativa (Sharma et
Dubey, 2005). Une baisse de l'activité des SOD totales a été observée chez Phaseolus
acutifolius durant un stress hydrique, ce qui a induit chez ces plantes une diminution de la
production d'O2•- par les réactions de Mehler, en maintenant une légère ouverture des
stomates, évitant ainsi une inhibition totale de la fixation de CO2 (Turkan et al., 2005). De
plus des plantes transgéniques sur-exprimant des gènes codant des SOD ont montré une
tolérance accrue aux stress oxydatifs (McKersie et al., 1996; Alscher et al., 2002; Wang et al.,
2005). La SOD forme du peroxyde d'hydrogène (H2O2) qui devra être ensuite réduit en eau
par l'ascorbate peroxydase fonctionnant en présence d'ascorbate. La réduction de
l'ascorbate est assurée par le cycle de l'ascorbate-glutathion.
Au cours du cycle de l'ascorbate-glutathion, le déshydro-ascorbate (DHA) réagit avec
le glutathion sous forme réduite (GSH) pour produire de l'ascorbate et du glutathion sous
forme oxydée (GSSG) (Figure 7). L'ascorbate peut être alors oxydé par l'H2O2 pour donner du
DHA. Le GSH est régénéré à partir du GSSG en présence de NADPH,H+ (Noctor et Foyer,
1998). L'activité des deux principales enzymes participant au cycle de l'ascorbate-glutathion,
l'ascorbate peroxidase (APX) et la glutathione reductase (GR) augmente durant une période
de sécheresse chez Arabidopsis thaliana (écotype Col-0) (Jung, 2004) Coffea canephora
(Pinheiro et al., 2004), Pisum sativum (Mittler et Zilinskas, 1994), Anoda cristata (Ratnayaka
et al., 2003), Triticum aestivum (Keles et Oncel, 2002), Phaseolus acutifolius (Turkan et al.,
2005), Oryza sativa (Sharma et Dubey, 2005) et Glycine max (van Heerden et Kruger, 2002).
37
Figure 8. Représentation schématique du transfert cyclique des électrons entre le PSI et le
complexe b6f. Cette voie ne fait pas intervenir le PSII, il n'ya donc pas de production
d'oxygène et pas de transfert d'électrons jusqu'au NADP+. Ce transfert assure toutefois la
synthèse d'ATP, le trajet des électrons entre le pool de plastoquinones B (PQB) et la
plastocyanine (PC) via le complexe b6f libèrent en effet des protons dans le lumen des
thylacoïdes. Système de dégagement d'oxygène (COE), photosystème I (PSI),
photosystème II (PSII), antenne du PSI (LHCI), antenne du PSII (LHCII), phéophytine (Pheo),
plastoquinone (PQ), complexe b6f (b6f), plastocyanine (PC), ferrédoxine (Fd), ferrédoxine
NADP réductace (FNR).
Une diminution de l'activité des enzymes participant au cycle de l'ascorbate-glutathion
pendant un stress hydrique qualifié de sévère a parfois été observée mais rapprochée à une
réduction de la production de pouvoir réducteur sous la forme de NADPH,H+ et une
diminution des substrats comme l'ascorbate et le glutathion réduit (Iturbe-Ormaetxe et al.,
1998).
La catalase réalise également la dismutation de l'H2O2 sous forme d'H2O (SanchezCasas et Klessig, 1994; Kliebenstein et al., 1998). Une augmentation de l'activité de la
catalase pendant une période de déficit hydrique a été observée chez Arabidopsis thaliana
(Jung, 2004), Coffea canephora (Pinheiro et al., 2004), Olea europaea (Sofo et al., 2005),
Pisum sativum (Mittler et Zilinskas, 1994). Cependant d'autres études ont montré un profil
de réponse différent avec une activité de la catalase qui demeure inchangée ou qui diminue
pendant une période de sécheresse, par exemple chez Sorghum bicolor, Helianthus annuus,
Festuca arundinacea, Poa pratensis , Oryza sativa et Phaseolus acutifolius (Zhang et Kirkham,
1996; Fu et Huang, 2001; Sharma et Dubey, 2005; Turkan et al., 2005). Il semblerait donc
qu'une augmentation de l'activité de la catalase ne soit observée seulement en condition de
déficit hydrique sévère (Luna et al., 2005), car durant un stress modéré l'H2O2 serait
préférablement piégé par l'ascorbate au travers du cycle de l'ascorbate-glutathion. La
catalase possède une affinité pour l'H2O2 inférieure à celle de l'ascorbate peroxydase (APX),
elle n'utiliserait ainsi que l'H2O2 produit en excès qui pourrait attaquer et inhiber les APX
(Cruz de Carvalho, 2008).
Le flux cyclique des électrons
Ce flux, responsable des photophosphorylations cycliques (Figure 8), est un flux
d'électrons, associé au fonctionnement du PSI (indépendamment du PSII), qui permet la
synthèse d'ATP sans formation concomitante de NADPH,H+ (Kramer et Evans, 2011). Ce
transfert cyclique, entre le PSI et les plastoquinones via le complexe cytochrome b6f, fait
intervenir 2 complexes enzymatiques : une ferredoxine-plastoquinone réductase (FQR) et
une NADPH déshydrogénse (NDH) (Johnson, 2005). La voie enzymatique permettant le
transfert des électrons des ferrédoxines réduites au pool de plastoquinones est considérée
comme majoritairement responsable du transport cyclique des électrons (Munekage et al.,
2008).
38
Figure 9. Représentation schématique des réactions de chlororespiration. Ces réactions
font intervenir une NADPH/H+ plastoquinone oxydoréductase, le pool de plastoquinone
(PQ) présent dans la membrane des thylacoïdes et une terminale oxydase. La
chlororespiration croise la chaîne de transport des électrons au niveau du pool de
plastoquinone. Photosystème I (PSI), photosystème II (PSII), antenne du PSI (LHCI),
antenne du PSII (LHCII), plastoquinone (PQ), complexe b6f (b6f), plastocyanine (PC),
ferrédoxine (Fd), ferrédoxine NADP réductace (FNR) (Peltier et Cournac, 2002).
En transférant un à un ses deux électrons, qui retournent vers le PSI, au complexe
cytochrome b6f, chaque plastoquinone réduite (PQH2, plastoquinol) libère ensuite dans le
lu e
deu
ta s e
p oto s
ui pa ti ipe t à l’ ta lisse e t d’u
a ai e sou e d’u e fo e p oto ot i e g
g adie t p oto i ue
e par le gradient de pH) à
l’o igi e d’u efflu de H+, via les ATP s thases, ui pe
et la phospho latio d’ADP e
ATP.
L’i po ta e du ôle du t a sfe t
li ue des le t o s da s les p o essus de photo-
protection a notamment été démontrée en réponse à un stress lumineux. Une petite
protéine (PGR5, Proton Gradient Regulation 5) présente au niveau des thylacoïdes est
esse tielle au t a sfe t des
le t o s depuis les fe
do i es jus u’au plasto ui o es
(Okegawa et al., 2008). Des mutants pgr5 d'Arabidopsis thaliana incapables de synthétiser
cette protéine et ainsi d'assurer le transfert cyclique des électrons, présentent d’u e pa t
une accélération de l'installation de la photo-inhibition liée à l'altération des PSII et d’aut e
part à une chute du quenching non-photochimique (NPQ) reflétant en partie une chute des
mécanismes de dissipation de l'énergie excitonique sous forme de chaleur (Munekage et al.,
2008; Takahashi et al., 2009).
La chlororespiration
La chlororespiration est définie comme une chaîne de transport respiratoire dans la
membrane des thylacoïdes des chloroplastes qui est en interaction avec le transport
photosynthétique des électrons (Figure 9). La chlororespiration participerait au quenching
non-photochimique et à l'oxydation des plastoquinones (Bennoun, 2002; Peltier et Cournac,
2002). Deux enzymes thylacoïdiennes participent à la chlororespiration, la NADH
déshydrogénase (NADH DH) et la terminale oxydase (PTOX). La NADH DH représente le point
d'entrée des électrons dans la chaîne photosynthétique de transport des électrons,
responsable d'une réduction non-photochimique des plastoquinones. La terminale oxydase
(PTOX) assure le transfert des électrons des plastoquinones réduites à l'oxygène en
produisant de l'eau. La NADH DH est aussi impliquée dans le transfert cyclique des électrons,
cette enzyme participerait donc aux processus de photo-protection.
39
Effectivement des plants transgéniques de Nicotiana tabacum incapables de produire cette
enzyme et exposés à de fortes intensités lumineuses ont présenté une sensibilité accrue
caractérisée par l'installation de processus de photo-inhibition (chute du Fv/Fm) et par le
développement de chloroses (Endo et al., 1999). Chez Spathiphyllum wallisii, les plantes
soumises à une combinaison de stress (stress hydrique, thermique et lumineux) ont présenté
un contenu en NADH DH multiplié par 2 et en PTOX multiplié par 2,3 comparativement à
ceux des plantes témoins (Ibanez et al., 2010).
La réduction des nitrates
En conditions optimales, la réduction des nitrates utilise entre 5 et 20 % du flux
d’ le t o s issu de la chaîne photosynthétique de transport des électrons (Lawlor et Cornic,
2002). Ce métabolisme fait intervenir successivement 4 enzymes, la nitrate réductase (NR)
localisée dans le cytoplasme, la nitrite réductase (NiR), la glutamine synthase (GS1
cytosolique et GS2 chloroplastique) et la glutamate synthase (GOGAT), toutes 3 localisées
dans les chloroplastes, où elles utilisent directement l'ATP et le pouvoir réducteur (sous
fo
e de fe
do i e
duite p oduits. Lo s d’u st ess h d i ue, l’a tivit de la it ate
réductase est inhibée chez Zea mays (Foyer et al., 1998), Triticum durum (Fresneau et al.,
2007) et Arabidopsis thaliana, écotype Col-0 (Hummel et al., 2010). Un stress osmotique
pratiqué à l'aide de PEG induit également une réduction de l'activité de la NR chez Triticum
aestivum, cependant un traitement à l'ABA n'influence pas l'activité de la NR (Larsson et al.,
1989).
La "soupape" à malate
En fin de déficit hydrique, lorsque le rapport NADPH,H+/NADP+ devient important
dans le chloroplaste du fait d'un ralentissement de l'assimilation nette (et de la
photorespiration), l'oxydation du malate augmente grâce au fonctionnement accru de la
"soupape" à malate (Ocheretina et al., 2000; Igamberdiev et al., 2001; Scheibe et al., 2005).
La malate déshydrogénase est activée notamment par les systèmes ferrédoxinethiorédoxine (Scheibe, 1991), elle utilise l'excès de NADPH,H+ pour convertir l'OAA en malate
afin de régénérer l'accepteur d'électron (NADP+) (Raghavendra et Padmasree, 2003; Scheibe
et al., 2005).
40
Le malate exporté dans le cytosol pourra ensuite (i) fournir du NADPH pour la réduction des
nitrates, (ii) être oxydé par les mitochondries et générer de l'ATP (Siedow et Umbach, 1995;
Lawlor et Cornic, 2002), (iii) participer à la photorespiration et (iv) être stocké dans la
vacuole (Scheibe et al., 2005).
Enfin, le métabolisme des acides aminés et d'autres réactions chimiques comme la
synthèse de métabolites secondaires pourraient également être considérés comme des puits
alternatifs d'électrons et auraient un rôle dans l'adaptation des plantes à un stress hydrique
long. Toutefois la consommation de pouvoir réducteur et d'ATP par ces réactions est parfois
considérée comme négligeable (Lawlor et Cornic, 2002). Par exemple une accumulation de
proline est généralement observée en réponse à un déficit hydrique or la synthèse de
proline nécessite la consommation de NADPH,H+. Cependant cette consommation est
négligeable et l'adaptation au stress hydrique par l'accumulation de proline est
vraisemblablement à rapprocher à ses qualités d'osmoprotecteur (Delauney et Verma,
1993).
2.3.1.3.2.Maîtrise des ROS dans le chloroplaste par les antioxydants
Un grand nombre de systèmes antioxydants sont présents dans les chloroplastes afin
de piéger les ROS produits inévitablement par la photosynthèse. Une augmentation de la
teneur en molécules anti-oxydantes comme les flavonoïdes, les caroténoïdes, le glutathion
ou comme l'α-tocophérol est classiquement observée en réponse au stress hydrique afin de
remédier à une production accrue de ROS. Ces molécules retardent voire empêche
l'oxydation de composants cellulaires (protéines, lipides, ADN...), en neutralisant des
radicaux libres en acceptant ou en cédant un électron. Après réaction, l'antioxydant peut
devenir lui même un radical libre, mais moins réactif que l'espèce qu'il a neutralisé et pourra
à son tour être neutralisé par un autre antioxydant ou dissiper son énergie d'excitation par
une émission de chaleur.
41
Les flavonoïdes
Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires issus de la voie de biosynthèse des
phénylpropanoïdes (Li et al., 1993; Pietta, 2000). Ils possèdent un important pouvoir
antioxydant lié à leur capacité à réduire et à piéger les radicaux libres. Les flavonoïdes
désactivent l'oxygène singulet grâce à leur structure phénolique (Tournaire et al., 1993),
piègent l'H2O2 et OH• (Gould et al., 2002). Ils protègent également les plantes des radiations
UV, grâce à leur propriétés d'absorption et dégradent également les ROS générés par ce type
de radiation (Shirley, 1996; Harborne et Williams, 2000). Des plantes transgéniques
d'Arabidopsis thaliana mutées au niveau du gène codant une chalcone isomérase et
caractérisées par un contenu en flavonoïdes fortement diminué ont présenté une
augmentation de photo-dommages corrélée à une sensibilité accrue aux rayons UV (Li et al.,
1993; Fiscus et Booker, 2002). Une augmentation de la teneur en flavonoïde corrélée à une
chute de la photosynthèse est généralement observée en réponse à un déficit hydrique
(Smirnoff, 1993; Rizhsky et al., 2002). Une augmentation de la teneur en flavonoïdes a été
relevée sur une suspension cellulaire de Glycyrrhiza inflata Batal (la réglisse) pour des
teneurs en PEG comprises entre 5 et 15 %, cette accumulation était accompagnée d'une
hausse de l'activité de la phénylalanine ammonia-lyase participant à la voie de biosynthèse
des flavonoïdes (Yang et al., 2007). Chez des plants de Cistus clusii réputés être
particulièrement résistant à la contrainte hydrique une augmentation de la teneur totale en
flavonoïdes a été relevée pour des RWC compris entre 75 et 60 % (Hernandez et al., 2004).
Chez Arabidopsis thaliana une augmentation significative de 36 % de la teneur en
anthocyanes a été observée en réponse à un déficit hydrique, confirmant le rôle de photoprotecteur des anthocyanes et leur capacité à piéger les ROS produits lors de la période de
stress (Jung, 2004). Une accumulation d'anthocyanes est souvent corrélée à une tolérance
accrue à la contrainte hydrique (Chalker-Scott, 1999) notamment chez des plantes de
résurrection qui peuvent accumuler jusqu'à 4 fois plus d'anthocyanes pendant une période
de déshydratation (Sherwin et Farrant, 1998). L'accumulation d'anthocyanes permet de
diminuer le potentiel osmotique des feuilles qui contribuerait à une diminution de la
conductance stomatique (Choinski et Johnson, 1993).
42
Les caroténoïdes
La voie de synthèse du 2-C-méthyle-D-érythritol-4-phosphate fournit des
isopetenylpyrophosphates permettant la synthèse de geranylgeranyl diphosphate qui est un
intermédiaire indispensable à la voie de synthèse des chlorophylles, des gibbérellines, du
tocophérol et des caroténoïdes (Pogson et al., 1996; Park et al., 2002; DellaPenna et Pogson,
2006). Les caroténoïdes préservent la chlorophylle triplet contre l'attaque de l'oxygène, et
passent à leur tour à l'état triplet. La désexcitation des caroténoïdes triplet par émission de
chaleur les régénère à l'état singulet sans dommages pour la molécule (Frank et Cogdell,
1996; Havaux, 1998). Les caroténoïdes ont aussi la capacité de piéger l'oxygène singulet et
de neutraliser les radicaux peroxyls. Les xanthophylles se lient aux protéines des LHC des PSI
et PSII et se trouvent à proximité des chlorophylles afin de piéger l'énergie excitonique des
chlorophylles présentes à l'état triplet (Kuhlbrandt et al., 1994). Les β-carotènes participent
à la dissipation de l'1O2 produit par l'interaction du P680 sous l'état triplet avec l'oxygène
(Telfer et al., 1994). Les caroténoïdes sont des antioxydants importants dans les processus
de photo-protection, effectivement des mutants d'Arabidopsis thaliana déficients en
zéaxanthines et lutéines ont présenté une sensibilité accrue à des lumières saturantes
(Niyogi, 1999). Chez Arabidopsis thaliana une augmentation de la teneur en
antheraxanthine, neoxanthine, violaxanthine, lutéine et β carotène a été observée pour des
feuilles jeunes et matures soumises à un déficit hydrique, cette accumulation de
caroténoïdes a été corrélée à une augmentation du NPQ (Jung, 2004).
Le tocophérol (vitamine E)
Du fait de sa nature hydrophobe, l'α-tocophérol se retrouve uniquement dans la
bicouche lipidique des membranes et plus particulièrement au niveau des membranes
plastidiales. La tête chromanol et la queue hydrophobe des tocophérols proviennent de
voies métaboliques localisées dans les plastes (Della Penna et Pogson, 2006). L'α-tocophérol
participe à la détoxification des radicaux peroxyls et alkoxyls et prévient ainsi la
peroxydation des lipides. Il interagit avec les lipides polyinsaturés et les produits résultant de
l'oxydation des lipides et à la capacité de piéger l'1O2 et l'OH• (Munne-Bosch, 2005).
43
À l'intérieur des membranes plastidiales, le tocophérol protège spécifiquement le PSII contre
la photo-inhibition et les membranes contre la peroxydation des lipides (Havaux et al., 2005;
Inoue et al., 2011). Le radical tocophéroxyl formé doit être ensuite réduit par le glutathion
ou par l'ascorbate pour régénérer le tocophérol (Fryer, 1992). Une augmentation de la
teneur en α-tocophérol contribue généralement à la tolérance des plantes au stress
hydrique, alors qu'une chute est souvent corrélée à l'installation de dommages induits par
un stress oxydatif (Munne-Bosch, 2005). Cet anti-oxydant puissant des thylacoïdes et des
membranes des chloroplastes est accumulé pendant une période de contrainte hydrique
chez Pisum sativum, Cistus clusii, Cistus albidus, Gossypium hirsutum et Gossypiu barbadense
(Moran et al., 1994; Munne-Bosch et al., 2003; Ratnayaka et al., 2003; Munne-Bosch, 2005).
2.3.1.3.3.Intervention du quenching non-photochimique
La dissipation thermique d'énergie (NPQ) est la forme de dissipation de l'énergie
lumineuse la plus importante, elle permet en effet de dissiper plus de la moitié de l'énergie
absorbée même chez les plantes bien irriguées (Chaves et al., 2002). La dissipation
thermique peut s'élever jusqu'à 70-90 % de l'énergie disponible lors d'un stress hydrique
qu'il soit modéré ou sévère (Flexas et Medrano, 2002). Les premiers mécanismes de
dissipation de l'énergie lumineuse excédentaire ont lieu au niveau des antennes collectrices.
Lorsque la chlorophylle passe de l'état excité à l'état stable, l'énergie libérée est importante,
si elle n'est pas utilisée pour initier le transport d'électrons des ROS peuvent se former.
Le gradient transmembranaire de protons produit par le transfert d'électrons au
niveau de la chaîne de transport des des thylacoïdes est à l'origine du quenching énergétique
(qE) qui s'accompagne d'une diminution de la fluorescence des centres fermés ou ouverts.
En effet, les bas pH présents dans le lumen augmentent la déperdition d'énergie excitonique
au niveau des antennes du PSII sous forme de chaleur. L'énergie ainsi dissipée n'est plus
utilisable par la trappe à énergie du PSII, ce qui a comme conséquence une diminution de la
capacité à expulser des électrons par les centres réactionnels du PSII. Le rendement
quantique de la fourniture d'électrons par la réaction photochimique du PSII chute
(Farineau, 2007).
44
De plus, un autre quenching non-photochimique de moindre amplitude est observable plus
lentement sous éclairement (qT) ; il est dû à la diminution de la taille de l'antenne externe
du PSII à la suite de la phosphorylation des trimères LHCII ayant migré vers les antennes du
PSI. Ce qT a comme effet une diminution de la fluorescence totale qui rend compte d'une
diminution de la capacité de capture des photons par le PSII, ce qui entraine une baisse de
l'activité photochimique du PSII.
Les xanthophylles sont des pigments qui appartiennent à la famille des caroténoïdes
et permettent également d'évacuer l'énergie en excès par dissipation thermique et seraient
ainsi les principaux composés quencher participant au qE (et qZ Zeaxanthin dependent
quenching) (Havaux et Niyogi, 1999; Nilkens et al., 2010). Le cycle des xanthophylles
participe à la dissipation de l'excès d'énergie lumineuse, ce processus est activé par l'acidité
du lumen du thylacoïde, provoquée par la saturation du transport d'électrons qui entraine
un ralentissement de l'utilisation des protons pour la phosphorylation des ADP et
s'accompagne ainsi d'une augmentation de la concentration en protons. L'acidification active
la violaxanthine dé-époxydase, qui convertit la violaxanthine en anthéraxanthine et
zéaxanthine. La zéaxanthine se lie ensuite aux complexes protéiques de l'antenne (LHC) du
PSII, afin de désactiver les molécules de chlorophylles excitées en dissipant leur énergie sous
forme de chaleur. La protonation de la protéine PsbS et la liaison de la zéaxanthine changent
la conformation protéique du PSII, ce qui favorise la dissipation de l'énergie sous forme de
chaleur (Müller et al., 2001; Horton et Ruban, 2005; Niyogi et al., 2005; Adams III et al.,
2006). La zéaxanthine est convertie en violaxanthine par la zéaxanthine époxydase. La
protéine PsbS, formant un complexe protéine-pigment appartenant à l'antenne du PSII, joue
un rôle essentiel dans le transfert d'énergie vers la zéaxanthine (Niyogi et al., 2005; Murchie
et Niyogi, 2011). En effet, des mutants d'Arabidopsis thaliana dépourvus de cette protéine
ne présentent pas de quenching qE bien que la zéaxanthine soit détectée (Li et al., 2000). Les
plantes dépourvues de PsbS sont défectives en qE et sont par conséquent plus sensibles à la
photo-inhibition (Li et al., 2002) et présentent des rosettes et un nombre de feuilles moins
important que les plantes témoins (Krah et Logan, 2010). Bien que cette protéine
appartienne à la famille des protéines LHC, elle ne jouerait aucun rôle dans la collecte de
l'énergie lumineuse mais elle pourrait être un senseur du pH présent dans le lumen,
nécessaire à l'induction et la relaxation du quenching énergétique (qE) (Li et al., 2004).
45
Plus la protéine PsbS est présente dans les feuilles, plus grande est la capacité de quenching
énergétique (Li et al., 2002), ainsi des mutants surexprimant le gène codant pour cette
protéine développent, sous fort éclairage, des rosettes plus grandes que celles des témoins
(Logan et al., 2008).
2.3.1.3.4.Altérations liées à l’installation du stress oxydatif
Malgré l'existence de mécanismes efficaces de dissipation de l'énergie excitonique
(NPQ), des feuilles placées sous un fort éclairement pendant plusieurs heures, manifestent
une diminution de l'activité des photosystèmes II correspondant au phénomène de photoinhibition de la photosynthèse (Farineau, 2007). Toutefois le rendement quantique
maximum (Fv/Fm) reflétant l'état des photosystèmes II est relativement résistant au stress
hydrique et ne semble être atteint dans la plupart des études qu'en fin de période de
sécheresse et pour des stress hydriques sévères chez Haberla rhodopensis (Peeva et Cornic,
2009), Triticum aestivum (Lu et Zhang, 1998) et Arabidopsis thaliana (Jung, 2004; Woo et al.,
2008). Une chute de Fv/Fm reflète une dégradation des photosystèmes et est généralement
induite par une production accrue d'espèces réactives de l'oxygène en réponse à un déficit
hydrique (Adams III et al., 2006).
Altération des acides nucléiques par les ROS
L'ADN peut être modifié par les ROS plus particulièrement par l'HO• et l'1O2 qui
attaquent principalement la base azotée guanine et produit du 8-hydroxyguanine (Wiseman
et Halliwell, 1996). L'oxydation de l'ADN par les ROS peut aussi aboutir à des perturbations
des processus de méthylation des cytosines qui sont des éléments importants dans la
régulation de l'expression des gènes (Halliwell, 2006). En dehors des réactions d'oxydation,
les ROS peuvent modifier l'ADN indirectement. Certaines réactions de peroxydation des
lipides forment du malondialdéhyde (MDA) qui peut alors former avec la guanine du
Pyrimido[1,2-a]-purin-10(3H)-one (M1G) (Jeong et al., 2005). De nombreux mécanismes de
réparation de l'ADN sont disponibles, incluant la réparation directe, le remplacement des
bases voire même de l'ensemble des nucléotides altérés (Tuteja et al., 2001).
46
Altération des sucres solubles par les ROS
Les radicaux hydroxyles (HO•) peuvent également réagir avec les sucres solubles et
les polyols (Smirnoff et Cumbes, 1989), l'oxydation des sucres produit de l'acide formique
(Isbell et al., 1973). La capacité des sucres à interagir avec les ROS a notamment été prouvée
chez des plants de Nicotiana tabacum transgéniques accumulant de grandes quantités de
mannitol dans les chloroplastes, ces plantes ont présenté une résistance accrue au stress
oxydatif (Shen et al., 1997). Cette résistance a été rapportée à la capacité du mannitol à
interagir avec les HO•, les dissipant avant qu'ils ne puissent entrer en contact avec des
composants vitaux de la cellule.
Altération des lipides des thylacoïdes par les ROS
Les acides gras polyinsaturés comme l'acide linoléique (18:2) et l'acide linolénique
(18:3) sont les acides gras les plus présents dans les membranes galactolipidiques des
thylacoïdes et dans les membranes phospholipidiques. Les acides gras polyinsaturés sont
particulièrement sensibles aux attaques de l'1O2 et des HO• et leur peroxydation donne
naissance à des aldéhydes comme le 4-hydroxy-nonenal (HNE) et le malondialdéhyde (MDA),
à des hydroxyles et des cétoacides gras (Mueller, 2004). Une augmentation des réactions de
peroxydation des acides gras polyinsaturés diminue la fluidité des membranes, augmente la
perméabilité et induit une altération des protéines incluses dans les membranes (Halliwell,
2006). Les produits de la dégradation des aldéhydes peuvent ensuite former des réactions
avec les protéines et l'ADN (Moller et al., 2007). La glutathion peroxydase utilise le
glutathion afin de réduire l'H2O2 et les lipides hydroperoxydés, parmi ces peroxydases, la
phospholipid-hydroperoxyde glutathion peroxydase peut agir directement sur les lipides
hydroperoxydés sans libérer d'hydroperoxy-acides gras (Milla et al., 2003).
47
Altération des protéines par les ROS
L'oxydation des protéines est une modification covalente induite par les ROS. Les
acides aminés soufrés sont particulièrement sensibles aux ROS et plus particulièrement à
l'1O2 et l'HO•. Les réactions de carbonylation sont des modifications des protéines par
oxydation irréversible (Shacter, 2000). L'oxydation par les ROS d'acides aminés comme
l'arginine, l'histidine, la lysine, la proline, la thréonine et le tryptophane produit des groupes
carbonyles libres. La réaction de nitrosylation attache de manière covalente un monoxyde
d'azote (NO•) à un groupement thiol d'une cystéine, cette réaction participe à la régulation
de la fonction de certaines protéines (Moller et al., 2007). Certaines réactions de
nitrosylation et d'oxydation des cystéines et méthionines sont réversibles et peuvent servir à
la régulation de la fonction de ces protéines. Les oxydations comme celles du tryptophane et
les carbonylations sont, elles, irréversibles et peuvent être à l'origine d'altérations des
protéines. La carbonylation des protéines augmente pendant un stress hydrique. Les
protéines oxydées sont normalement dégradées rapidement par un nombre important de
protéases présentes dans tous les compartiments cellulaires (Moller et al., 2007).
Exemples de protéines altérées par les ROS
Les ROS et plus particulièrement les radicaux hydroxyles (HO•) et l'anion radicalaire
superoxyde (O2•-) provoquent la dégradation de la grande sous unité de la Rubisco en 5
principaux fragments. Cette dégradation de la Rubisco observée en réponse à un traitement
lumineux et pour de basses températures, est stimulée en présence de FeSO 4 et inhibée en
présence de chélateurs d'ions ferriques (Nakano et al., 2006). La dégradation de la Rubisco
serait donc dépendante de la formation de HO• via les réactions de Fenton entre les ions
ferriques et l'H2O2. De plus, il existe une corrélation négative entre la concentration en H 2O2
et l'activité initiale de la Rubisco (Zhou et al., 2007), l'accumulation d'H2O2 lors d'une période
de stress, dégraderait également la grande sous-unité de la Rubisco (Ishida et al., 1998).
48
Dans des feuilles intactes éclairées normalement mais soumises à de basses
températures, une dégradation des photosystèmes I résultant de la destruction des centres
Fe-S et de la sous-unité PSI-B a lieu (Scheller et Haldrup, 2005). Les radicaux hydroxyles
(HO•) sont produits par les réactions de Fenton entre les centres Fe-S photo réduits et le
peroxyde d'hydrogène (H2O2). La photo-destruction des PSI a comme conséquence une
libération de fer libre des centres Fe-S endommagés, cette libération de fer des membranes
des thylacoïdes dans le stroma des chloroplastes peut alors induire la production de HO • qui
pourront altérer les protéines présentes dans le stroma comme la Rubisco.
Sous éclairement normal, la protéine D1 présente un taux de turnover important
(synthèse-dégradation). La destruction de la protéine D1 serait due à la production
d'oxygène singulet (1O2) par le centre réactionnel du PSII (P680, Okada et al., 1996).
Cependant l'oxygène singulet ne serait pas le responsable per se de la dégradation de la
protéine D1. Effectivement cette dégradation n'est pas observée chez des plantes incapables
de produire la protéase FtsH. La formation d'acides aminés oxydés dans la protéine D1 par
l'augmentation de la production d'1O2 induit des modifications de la conformation de la
protéine la rendant plus susceptible d'être reconnue et détruite par la protéase FtsH (Silva et
al., 2003).
49
2.3.2. Effet d’un stress hydrique sur la phase sombre de la
photosynthèse
La diminution de l'assimilation nette de CO2 en réponse à un déficit hydrique, liée à la
fermeture des stomates et par conséquent à une baisse de la concentration en CO 2 dans le
chloroplaste, est responsable d'un ralentissement de l'activité des enzymes du cycle de
Calvin. Toutefois, une baisse de la concentration en CO2 contribuerait à l'augmentation des
réactions de photorespiration qui pourraient se substituer aux réactions de carboxylations et
consommer ainsi du RuBP qui devra être ensuite régénéré par le cycle de Calvin (Wingler et
al., 1999). Lors d'une période de déficit hydrique, le ralentissement de l'activité des enzymes
du cycle de Calvin pourrait induire une diminution de la régénération du RuBP (Lawlor et
Cornic, 2002; Flexas, J. et al., 2004). La régénération du RuBP peut également être limitée
par une diminution conjointe de la production d'ATP et de NADPH,H + (Tezara et al. 1999) et
par une chute de la vitesse d'utilisation des trioses-phosphate (Lawlor et Cornic, 2002).
2.3.2.1. Effet du stress hydrique sur la structure, l’accumulation et l’activité de la
Rubisco
Les études réalisées sur l'effet d'un déficit hydrique sur l'activité de la Rubisco sont
nombreuses mais parfois contradictoires. Généralement une baisse de l'activité de la
Rubisco est observée chez des plantes soumises à une contrainte hydrique. Cette baisse
d'activité pourrait être expliquée par une répression des gènes codant les différentes sousunités de la Rubisco et induire par conséquent une diminution de sa teneur foliaire. Une
chute de l'activité de la Rubisco serait aussi induite par une altération des mécanismes
d'activation de l'enzyme via une diminution de l'activité de la Rubisco activase et/ou par la
fixation d'un inhibiteur qui conduirait aussi à des modifications de la conformation du site
actif. L'activation de la Rubisco nécessite la fixation de Mg2+ et de CO2 au résidu de lysine du
site actif pour induire sa carbamylation (Quick et Neuhaus, 1997). À l'inverse, la fixation
d'inhibiteurs naturels sur le site actif inhiberait l'activité de l'enzyme.
50
La fixation du RuBP dans un site actif de la Rubisco non carbamylé et la fixation de
2-carboxy-arabinol-1-phosphate (CA1P), qui se trouve naturellement en abondance la nuit et
dégradé le jour, empêcheraient la carbamylation du résidu lysine par le Mg2+ et le CO2.
L'activation de la Rubisco, par la libération du RuBP et du CA1P est catalysée par la Rubisco
activase, cette réaction nécessite une consommation d'ATP (Portis, 1995), de plus l'activité
de cette enzyme est connue pour être inhibée par l'ADP (Quick et Neuhaus, 1997). L'activité
de la Rubisco activase est donc régulée par le ratio ATP/ADP mais également par son état
redox, dépendant des thiorédoxines présentes dans le stroma des chloroplastes (Portis et
al., 2008). Elle est donc fortement dépendante de l'état redox de la chaîne de transport des
électrons assurant la production d'ATP et la réduction des thiorédoxines.
Le contenu foliaire en Rubisco est le résultat d'un équilibre entre sa synthèse et sa
dégradation, cette enzyme est relativement stable avec une demi-vie de quelques jours. De
plus, cette stabilité a pu être vérifiée même pendant un stress hydrique (Webber et al.,
1994). Des études confirment cette caractéristique : un stress hydrique a présenté peu
d'effets sur l'activité de la Rubisco chez Helianthus annuus (Gimenez et al., 1992) et
Lycopersicon esculentum (Gunasekera et Berkowitz, 1993). Cependant une diminution rapide
de l'activité de la Rubisco en début de stress hydrique a pu être observée chez Glycine max
(Majumdar et al., 1991; Flexas et al., 2006), Nicotiana tabaccum (Flexas et al., 2006) et
Helianthus annuus (Tezara et al., 1999). Un stress hydrique induit par le PEG chez Oryza
sativa, a montré une baisse de la vitesse maximale de carboxylation (Vcmax) accompagnée
d'une chute de l'activité initiale et totale de la Rubisco, ainsi qu'une diminution du
pourcentage d'enzymes activées (Zhou et al., 2007). De plus une diminution rapide de
l'abondance des transcrits de la petite sous unité de la Rubisco lors d'une période de déficit
hydrique a notamment été observée chez Arabidopsis thaliana (Williams et al., 1994),
Lycopersicon esculentum (Bartholomew et al., 1991) et Oryza sativa (Vu et al., 1999). Chez
Helianthus annuus et pour différentes graminées une diminution de la teneur en Rubisco a
été relevée en réponse à un déficit hydrique (Heckathorn et al., 1997; Dejana Pankovic,
1999), cependant une baisse de la teneur en Rubisco ne semblerait pas être la seule cause
de la diminution de l'activité de cette enzyme.
51
Effectivement, une étude sur l'effet d'un déficit hydrique chez Trifolium subterraneum a
montré une baisse de l'activité initiale de la Rubisco sans pour autant être liée à une
diminution de sa teneur foliaire. Cette baisse de l'activité spécifique et non de l'état
d'activation de l'enzyme suggère la fixation d'inhibiteurs sur les sites actifs de la Rubisco
(Medrano et al., 1997). Chez des plants de Nicotiana tabaccum soumis à une période de
sécheresse, une baisse de l'activité de la Rubisco étant corrélée à une diminution de l'activité
catalytique d'enzymes activées (Kcat), ces auteurs ont donc également proposé l'effet d'une
accumulation d'inhibiteurs au niveau des sites catalytiques de l'enzyme (Parry et al., 1993;
Parry et al., 2002).
La fermeture des stomates accompagnée par une baisse de la concentration interne
en CO2 (Ci) pourrait inhiber l'activité de la Rubisco. Un seuil de conductance stomatique
spécifique à chaque espèce a été mis en évidence, en dessous de ce seuil, l'activité initiale de
la Rubisco diminue (Flexas et al., 2004a; Flexas et al., 2006). Cette baisse de l'activité initiale
de la Rubisco pourrait être la conséquence d'une diminution de l'état d'activation de
l'enzyme, notamment par une diminution de la concentration en CO2, indispensable à la
carbamylation et à l'activation de l'enzyme (Cheng et al., 2002; Lawlor et Cornic, 2002; Parry
et al., 2002; Zhou et al., 2007). Les limitations diffusives de l'assimilation nette pourraient
donc induire via une baisse de la concentration en CO2 dans le chloroplaste (Cc), une
limitation métabolique liée à une baisse de l'activité de la Rubisco.
52
2.3.2.2.Effet du stress hydrique sur d'autres enzymes du cycle de Calvin
Parmi les enzymes du Cycle de Calvin la Rubisco a reçu une attention particulière et
de nombreux travaux se sont penchés sur la variation de l'activité de la Rubisco en réponse à
un stress hydrique. En revanche peu d'études se sont portées sur l'activité des autres
enzymes du cycle de Calvin. Parmi les enzymes participant au cycle de Calvin, la
sedoheptulose-1,7-bisphophatase (SBPase) et la fructose-1,6-bisphosphatase apparaissent
comme des enzymes clés car elles catalysent des réactions irréversibles (Quick et Neuhaus,
1997). L'expression du gène codant la sedoheptulose-1,7- bisphosphatase (SBPase) est
réprimée en réponse à un déficit hydrique chez Arabidopsis thaliana (Seki et al., 2002),
Hordeum vulgare (Wingler et al., 1999) et Triticum aestivum (Xue et al., 2008). Des plants de
Suaeda salsa soumis à un stress salin ont également présenté une répression du gène codant
la SBPase (Li et al., 2011). Toutefois, cette tendance ne semble pas être une réponse
générale au stress hydrique, en effet une induction de l'expression du gène codant la SBPase
chez Vitis vinifera a été relevée en réponse à un stress hydrique (Cramer et al., 2007).
L'activité initiale et totale de la fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) chloroplastique
est altérée par un déficit hydrique chez Casuarina equisetifolia (le Filoa) (SanchezRodriguez
et al., 1997; Sanchez-Rodriguez et al., 1999), Phaseolus vulgaris (Vassey et Sharkey, 1989) et
Triticum durum (cv Adamello) (Loggini et al., 1999). De plus l'expression du gène codant la
FBPase chez Triticum aestivum est réduite en réponse à une période de stress hydrique (Xue
et al., 2008). Des suspensions de chloroplastes de Spinacia oleracea soumises à un stress
osmotique, ont présenté un ralentissement conjoint de la vitesse d'activation de la FBPase et
de la SBPase (Boag et Portis, 1984). Les auteurs de cette étude ont émis l'hypothèse que la
disponibilité en substrat, un ralentissement du transport des électrons et une altération de
l'état redox de ferrédoxine et de la thiorédoxine en réponse au stress osmotique pourraient
expliquer cette diminution de l'activation de la FBPase et de la SBPase (Boag et Portis, 1984).
53
D'autres enzymes du cycle de Calvin ont aussi leur activité altérée par la contrainte
hydrique. Chez Morus alba (Mûrier blanc), par exemple, l'activité de la déglyceraldéhyde3phosphate déshydrogénase, de la ribulose-5-phosphate kinase et de la 3-phosphoglycerate
kinase diminue au fur et à mesure que le déficit hydrique s'intensifie (Thimmanaik et al.,
2002).
Ce ralentissement de l'activité des enzymes du cycle de Calvin, en réponse à un déficit
hydrique induit alors une diminution de la régénération du RuBP (Gunasekera et Berkowitz,
1993). Or la disponibilité en RuBP, substrat de la Rubisco, pourrait représenter une limitation
de l'assimilation nette de CO2 mais aussi des réactions liées à la photorespiration. De plus la
régénération du RuBP consomme de l'ATP dont la disponibilité est également réduite
pendant un stress hydrique (Tezara et al., 1999).
54
3. Effet du stress hydrique sur l’accumulation, le transport et
la répartition des sucres
3.1. Effet du stress hydrique sur la teneur en amidon
La voie de synthèse de l'amidon comprend 4 étapes, (i) le fructose 6-P est isomérisé
en glucose 6-P puis en glucose 1-P par une hexose-P-isomérase et une P-glucomutase ; (ii)
L'ADP glucose pyrophosphorylase catalyse la formation d'ADP glucose à partir de glucose 1-P
et d'ATP ; (iii) l'ADP glucose est incorporé grâce à une amidon synthase à un fragment
primaire α-glucane formant ainsi de l'amylose (chaîne linéaire glucosidique, α -4) ; et (iv)
une enzyme branchante hydrolyse une unité glucose avant de la lier à une autre unité
glucose de la même chaîne mais en position 1,6 pour former des chaînes branchées de
glucose, l'amylopectine (Smith et al., 1997). L'amidon est formé de 20 à 30 % d'amylose et
de 70 à 80 % d'amylopectine. L'amidon s'accumule au cours de la journée dans les feuilles
sous forme de grains localisés dans le stroma plastidial. La nuit 80 % de l'amidon stocké est
hydrolysé en glucose phosphate puis en trioses-phosphate pour fournir des substrats à la
respiration et à la synthèse de saccharose. Chez Arabidopsis thaliana plus de 50 % des
assimilâts photosynthétiques sont stockés sous forme d'amidon (Zeeman et Ap Rees, 1999).
Une étude sur la distribution de l'amidon dans les organes végétatifs d'Arabidopsis thaliana
a mis en évidence une accumulation d'amidon dans les plastes des cellules de l'épiderme, du
mésophylle, des tissus vasculaires et des cellules de la coiffe mais très peu dans les cellules
des racines (Tsai et al., 2009).
Les feuilles soumises à un déficit hydrique d'Eucalyptus globulus, d'Helianthus
annuus, Lupinus albus et de Vitis vinifera ont présenté un épuisement des réserves en
amidon (Quick et al., 1992). De même une baisse de 92 % de la teneur en amidon a
également été observée pour des feuilles de Glycine max soumises à un stress hydrique (Liu
et al., 2004). Chez Oryza sativa une diminution de 92 % de la teneur en amidon a été aussi
observée en fin de déficit hydrique pour des plantes soumises à des concentrations en CO 2
de 350 ppm et de 88 % pour des plantes cultivées à une concentration en CO 2 de 700 ppm
(Widodo et al., 2003).
55
De plus lors d'un stress hydrique progressif, l'expression de 2 gènes codant des
enzymes participant à la dégradation de l'amidon (une α et une β amylase) a été induite et
accompagnée d'une absence de réserve en amidon dans les feuilles d'Arabidopsis thaliana,
chez l'écotype Col-0 (Harb et al., 2010). L'induction des gènes codant l'α et la β amylase,
mais aussi une α glucosidase, qui catalyse l'hydrolyse du maltose, a aussi été observée chez
Col-0, lors d'un stress hydrique combiné à un stress thermique (38°C) (Rizhsky et al., 2004).
Ces auteurs émettent l'hypothèse que cette induction de l'expression de gènes codant des
enzymes participant à la dégradation de l'amidon contribuerait à l'augmentation de 23 % de
la teneur en saccharose observée par rapport à celle des plantes témoins (Rizhsky et al.,
2004).
3.2. Effet du stress hydrique sur la teneur en sucres solubles
La contrainte hydrique entraîne u e di i utio de l’assi ilatio de CO2, toutefois
une augmentation de la concentration en sucres solubles dans les feuilles est souvent
appo t e. Cette aug e tatio de la o e t atio e su e est li e à l’i hi itio de leu
transport et à un ralentissement de leur utilisation pendant le stress hydrique (Chaves et
Oliveira, 2004).
3.2.1. Accumulation de sucres solubles
Malgré une chute de la photosynthèse, des feuilles de Lupinus albus et d'Eucalyptus
globulus soumises à un déficit hydrique ont présenté une augmentation de leur teneur en
saccharose alors que celles d'Helianthus annuus et de Vitis vinifera n'ont montré aucune
différence dans leur teneur en saccharose comparativement à celle des plantes témoins
(Quick et al., 1992). Ces plantes ont maintenu voire augmenté leur teneur en saccharose par
une consommation accrue des réserves d'amidon et par un ralentissement du transport de
saccharose à longue distance de 10 à 80 % en journée et par une augmentation de la
séquestration du saccharose altérant ainsi son chargement dans le phloème (Quick et al.,
1992).
56
Chez Helianthus annuus, d'autres auteurs ont aussi corrélé une multiplication par 2 de la
teneur en saccharose, malgré une chute de l'assimilation nette, à une baisse de la teneur en
amidon (
3) pour des feuilles présentant des RWC décroissant en réponse à un stress
hydrique (Kanechi et al., 1998). Une accumulation de sucres solubles pendant un stress
hydrique a été également corrélée chez Glycine max à un ralentissement de l'activité des
organes puits comme les racines et à une diminution du métabolisme des sucres dans les
feuilles induisant une inhibition du transport à longue distance de la ressource carbonée
(Westgate et Peterson, 1993). Quatre variétés de coton (Gossypium hirsutum) ont présenté
aussi une augmentation comprise entre 40 et 70 % de la teneur en glucose en réponse à la
contrainte hydrique (Timpa et al., 1986). Toutefois, pour les feuilles de Glycine max soumises
à une contrainte hydrique, une baisse de la teneur en amidon (-92 %) a été également
observée mais cette fois-ci, corrélée à une baisse de la teneur en saccharose (-33 %) et à une
multiplication par 3 de la teneur en hexoses (glucose et fructose) liée au maintien de
l'activité des invertases solubles pendant la période de stress (Liu et al., 2004). Chez Zea
mays une accumulation de glucose et de fructose liée à une augmentation de l'activité d'une
invertase a été observée en réponse à un déficit hydrique (Pelleschi et al., 1997). Les feuilles
de 2 espèces de Triticum durum ont également présenté une augmentation de leur teneur
en glucose et fructose corrélée à une chute de leur contenu relatif en eau (RWC). Ainsi pour
un RWC compris entre 50 et 55 %, les feuilles des plantes stressées ont présenté des teneurs
multipliées en moyenne par 5 pour le glucose, par 3 pour le fructose mais aussi par 1,7 pour
le saccharose (Kameli et Lösel, 1993).
D'autres types de stress abiotiques induisent aussi une accumulation de sucres
solubles, par exemple, de jeunes feuilles de Populus euphratica soumises à un stress salin
ont effectivement présenté une augmentation de 66 % de la teneur en sucres solubles
totales pour une concentration en chlorure de sodium de 250 mM (Watanabe et al., 2000).
De plus un stress osmotique appliqué à Triticum aestivum a aussi provoqué une
augmentation progressive de la teneur en sucres solubles totaux et en saccharose (Sawhney
et Singh, 2002). Lors d'un stress hydrique similaire une diminution de la taille des graines de
Triticum aestivum a été observée et rapprochée à un ralentissement du transport des sucres
vers ces organes puits (Hossain et al., 1990).
57
Plus particulièrement, dans les feuilles d'Arabidopsis thaliana (Col-0) soumises à une
période de déficit hydrique, la teneur en hexose a augmenté de 26 %, celle en saccharose a
été multipliée par 2,4 et la teneur en amidon a diminué de 42 %, cette accumulation de
sucres solubles a été accompagnée d'une baisse de l'activité des invertases acides et d'une
hausse de l'activité de la malate déshydrogénase (Hummel et al., 2010). D'autres auteurs ont
mis en évidence toujours chez Arabidopsis thaliana (Col-0) une accumulation significative de
glucose, fructose, mannose, saccharose et de tréhalose accompagnée d'une augmentation
de l'activité d'enzymes participant à la dégradation de l'amidon (α a
les, β a
lase et
α glucosidase), à la voie de synthèse des pentoses phosphates (hexokinase , glucose-6phosphate déshydrogénase) et à la synthèse du saccharose (SPS, fructokinase, SaccharoseUDP glucosyltransférase) (Rizhsky et al., 2004). Cette accumulation de sucres solubles a été
également observée chez Arabidopsis thaliana (Col-0) en réponse à un stress salin, avec
notamment une baisse de la teneur en amidon corrélée à une augmentation de l'activité de
deux β a
lases BMϒ1 et BMϒ7), une accumulation importante de glucose et de fructose
liée à un accroissement de l'activité d'une invertase et une augmentation importante de la
teneur en raffinose accompagnée d'une hausse de l'activité de 3 galactinol synthases (GolS1,
GolS2 et GolS3) et d'une raffinose synthase (Kempa et al., 2008).
Au vu de toutes ces études, l'accumulation de sucres solubles dans les feuilles de
plantes soumises à un déficit hydrique est donc généralement rapportée à un ralentissement
de l'activité des organes puits et par conséquent d'une baisse du transport des sucres à
longue distance (Ingram et Bartels, 1996), à un maintien ou à une augmentation de l'activité
de la saccharose phosphate synthase (SPS) et de la saccharose synthase (SuSy) (Keller et
Ludlow, 1993; Ingram et Bartels, 1996), à une consommation accrue de la réserve en amidon
(Fox et Geiger, 1986; Geigenberger et al., 1997) et à une synthèse de sucres solubles
favorisée en condition de stress par rapport à la synthèse d'amidon (Quick et al., 1989;
Kanechi et al., 1998). L'accumulation de saccharose est généralement accompagnée d'une
baisse de l'activité des invertases (Shinozaki et Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Harb et al., 2010;
Hummel et al., 2010).
58
À l'inverse une augmentation de la concentration en hexose est souvent corrélée à une
augmentation de l'expression de gènes codant pour des invertases (Kempa et al., 2008) et
une augmentation de l'activité de ces invertases (Keller et Ludlow, 1993; Pelleschi et al.,
1997).
Effets de l'accumulation des sucres solubles
L'accumulation de sucres solubles pendant une période de déficit hydrique pourrait
participer à un ajustement osmotique permettant une baisse du potentiel osmotique dans
les cellules assurant ainsi la turgescence et le maintien du volume cellulaire (Morgan, 1984;
Lo Bianco et al., 2000). Des plantes transgéniques accumulant des sucres solubles comme le
mannitol (Karakas et al., 1997) et le tréhalose (Iordachescu et Imai, 2008) ou bien des
fructanes (Pilon-Smits et al., 1995) ont présenté une résistance accrue au stress hydrique.
Chez Craterostigma plantagineum qui est une plante de résurrection, une période de déficit
hydrique s'accompagne par une conversion de 90 % des sucres solubles totaux en
saccharose qui représente alors 40 % de la biomasse sèche (Bianchi et al., 1991). Chez cette
plante l'accumulation de saccharose a été logiquement corrélée à une augmentation de
l'activité de la SPS (Elster, 1995). L'étude de chloroplastes isolés de Spinacia oleracea, a
permis de mettre en évidence qu'une accumulation de raffinose réduisait la désactivation du
transport des électrons induite par différents stress abiotiques (Santarius, 1973). De plus les
membranes des thylacoïdes pourraient être protégées du stress hydrique par l'accumulation
de raffinose dans les chloroplastes, la stabilisation des membranes dépendrait de la
concentration et de la taille des sucres accumulés : c'est pourquoi l'accumulation d'un
trisaccharide comme le raffinose assurerait une meilleur stabilisation qu'un disaccharide
(comme le saccharose) ou un monosaccharide (comme le glucose) (Santarius et Milde,
1977). Des expériences réalisées in vitro sur des membranes du réticulum endoplasmique
lisse soumises à un stress hydrique ont pu mettre en évidence le rôle protecteur de
l'accumulation de tréhalose sur ces membranes. En réponse au stress hydrique, ces vésicules
ont tendance à fusionner entre elles alors qu'en présence de tréhalose la fonction et
l'intégrité de ces vésicules sont conservées (Crowe et al., 1983; Crowe et al., 1992).
59
L'accumulation de sucres en tant qu'osmoprotecteur comme le tréhalose participe donc à la
stabilisation des protéines et des membranes des cellules (Chen et Murata, 2002; Hincha et
Hagemann, 2004). Effectivement, l'accumulation de saccharose, de maltose et de tréhalose
permet de stabiliser l'activité et l'intégrité de la phosphofructokinase qui en réponse au
stress hydrique est généralement altérée est dissociée irrémédiablement sous une forme
inactive (Carpenter et al., 1987). Si généralement l'accumulation de saccharose est liée à une
augmentation de l'activité de la SPS, certains auteurs ont pu mettre en évidence que cette
accumulation observée lors d'une période de stress hydrique participerait à la diminution de
l'activité de la saccharose phosphate synthase (SPS) (Vassey et Sharkey, 1989; Lawlor et
Cornic, 2002; Flexas, J. et al., 2004; Hummel et al., 2010). Cette inhibition pourrait être
expliquée par une augmentation de la phosphorylation de la SPS (Sugden et al., 1999).
Il est accepté qu'une augmentation de la teneur en sucres solubles participe à la
résistance et à la tolérance des plantes au déficit hydrique (Ingram et Bartels, 1996),
cependant ces variations de concentrations pourraient en réponse à un stress hydrique être
perçues comme un signal et modifier par conséquent l'expression d'un certain nombre de
gènes (Hare et al., 1998).
3.2.2. Perception et signalisation des sucres
Les su es
e ep se te t pas
u’u e sou e a o
e pou les ellules et le
métabolisme énergétique : ils jouent aussi un rôle important comme molécules de
signalisation et régulent par conséquent l'expression de certains gènes codant pour des
protéines participant à la photosynthèse, la respiration, la synthèse et à la dégradation
d'amidon et de saccharose et au métabolisme azoté (Koch, 1996; Rolland et al.,
2006). Pendant un stress hydrique, le contenu en sucres dans les feuilles est altéré en qualité
et en quantité, ce qui pourrait jouer un rôle de signal métabolique dans la réponse au stress
hydrique (Chaves et al., 2003).
60
Plusieurs systèmes de détection de la concentration en sucres ont été suggérés : une voie de
signalisation hexokinase-dépendante (Koch, 1996; Jang et Sheen, 1997; Smeekens et Rook,
1997), une voie de signalisation hexokinase-indépendante (Martin et al., 1997; Roitsch,
1999), une voie de signalisation métabolisme-dépendante (Lejay et al., 2008) et enfin une
voie de signalisation saccharose spécifique (Chiou et Bush, 1998; Rook et al., 1998). Chez
Arabidopsis thaliana ces différentes voies de signalisation ont pu être identifiées (Xiao et al.,
2000).
De nombreux processus sont contrôlés par la voie de signalisation hexokinasedépendante, le principal étant l'inhibition de gènes codant des protéines participant à la
photosynthèse (Goldschmidt et Huber, 1992). Ainsi l'accumulation de sucres inhiberait
l’e p essio de g
es oda t u e ATPase th la oïdie
e ATP-δ) chez Chenopodium rubrum
(Krapp et al., 1993), une protéine de liaison aux chlorophylles a et b (CAB) et une
plastocyanine (PC) chez Arabidopsis thaliana (Dijkwel et al., 1996), une protéine D1 (PSBA) et
la grande sous unité de la Rubisco (RBCL) chez Euglena gracilis (Reinbothe et al., 1991), un
translocateur de trioses phosphate (PT) chez Nicotiana tabacum (Knight et Gray, 1994) et la
petite sous unité de la Rubisco (RBCS) chez Arabidopsis thaliana, Chenopodium rubrum et
Solanum tuberosum (Cheng et al., 1992; Krapp et al., 1993). À l'inverse une diminution de la
concentration en sucres à pour effet une augmentation de l’a tivit photos th ti ue (Koch,
1996; Pego et al., 2000).
La voie de signalisation hexokinase-dépendante pourrait également contrôler la
synthèse de l'ABA. Une augmentation de la transcription de gènes codant des protéines
participant à la voie de ios th se de l’ABA pa le glu ose a t o se v e chez Arabidopsis
thalianna (Cheng et al., 2002). L’ABA et les su es auraient une action synergique sur
l’e p essio de g
es oda t des p ot i es pa ti ipa t à l'i hi ition de la photosynthèse et
l'induction de gènes contribuant au stockage des sucres via une interaction entre les sucres
et le facteur de transcription ABI4 (Rook et al., 2006).
61
Figure 10. Observation au microscope électronique d'une nervure d'Arabidopsis thaliana
(Col-0). ST : tubes criblés (Sieve tube), CC : cellules compagnes (Companion Cells), BS :
gaine périvasculaire (Bundle Sheath), PP : parenchyme phloémien (Parenchyma). Cliché :
C.Abadie, F.Thibault et P.Fleurat-Lessat.
Certains transporteurs de sucres identifiés chez Arabidopsis thaliana pourraient intervenir
dans la voie de signalisation hexokinase-indépendante, comme par exemple AtSUC3 connu
pour être un homologue de senseurs de glucose (SNF3 et RGT2) caractérisés chez la levure
(Lalonde et al., 1999), dépourvus de toute activité de transport et dont la structure suggère
plutôt un rôle de senseur de saccharose (Barker et al., 2000).
3.3. Effet sur l’activité de transport
Une partie des glucides produits par la photosynthèse est directement utilisée pour
répondre aux besoins de la cellule elle-même. Le reste des glucides est transféré vers les
organes puits (fleurs, fruits, racines...) pour assurer leur croissance ou pour y être stocké. Le
transport des sucres à longue distance se réalise principalement sous forme de saccharose à
travers le phloème, système complexe constitué de tubes criblés et de cellules compagnes
(Figure 10). Le phloème assure la distribution des sucres produits au cours de la
photosynthèse,
dans
les
organes
sources,
vers
l'ensemble
des
organes
non
photosynthétiques (organes puits). Les sucres transportés par le phloème constituent la
source énergétique des tissus constituant les organes puits. Les cellules qui composent les
tubes criblés s'organisent en longues fibres cellulaires dont les cribles, perforés de nombreux
pores, laissent circuler librement la sève phloèmienne. Ces cellules subissent de nombreuses
modifications nécessaires à leur fonction de transport et sont ainsi privées d'organites (Van
Bel, 2003). De ce fait, elles dépendent pour leur approvisionnement en protéines et en
métabolites des cellules compagnes. Les modifications des parois des éléments criblés
conduisent à un épaississement des parois latérales. Chaque cellule criblée est associée à
une ou plusieurs cellules compagnes qui possèdent au contraire une densité élevée
d'organites, ce qui leur assure une activité métabolique intense. Le chargement des sucres
dans le phloème est contrôlé au niveau du complexe cellule compagne-élément criblé
(Lalonde et al., 2003). La connexion entre l'élément criblé et les cellules compagnes est
assurée par la présence de plasmodesmes branchus (Dinant, 2008). Le flux de sève à
l'intérieur des tubes criblés est maintenu par un gradient de pression de turgescence généré
par le chargement à partir des organes sources et le déchargement dans les organes puits.
Le transport de la sève phloèmienne dans les tubes criblés est essentiellement dû à un flux
de masse.
62
Figure 11. Représentation schématique du transport des sucres à partir des organes
sources jusqu'aux organes puits. Dans les cellules du mésophylle (ME), le saccharose et
d'autres sucres tels que les polyols et les sucres phosphate sont transportés de cellule à
cellule au travers de plasmodesmes pour atteindre les cellules du parenchyme phloémien
(PPA) pour être ensuite libérés dans l'apoplasme. Le saccharose comme les polyols sont
récupérés par les cellules compagne (CC) par un complexe de transport de type symport
alimenté par des pompes à protons (H+/ATPases). Dans les organes puits le déchargement
des sucres se fait principalement par la voie symplastique. ST : tubes criblés et XV :
vaisseaux du xylème (Dinant et Lemoine, 2010).
La forte concentration en saccharose dans les organes sources, dans le phloème des
nervures foliaires, crée un puissant appel d'eau qui pousse la sève phloèmienne hors de la
feuille vers les organes puits. Il est important de comprendre que ce transport dépend du
déchargement en continu et de l'utilisation du saccharose au niveau des organes puits mais
aussi du maintien de l'évaporation de l'eau par transpiration (Farineau, 2007). Comme la
différence de concentration en saccharose entre les cellules mésophylliennes et les cellules
des tubes criblés est très importante, un mécanisme de chargement utilisant de l'énergie est
nécessaire dans les tubes criblés.
3.3.1. Le chargement du phloème
Chez Arabidopsis thaliana, le chargement s'effectue par la voie apoplastique (Lalonde
et al., 2004; Farineau, 2007; Dinant et Lemoine, 2010) (Figure 11), le passage se fait par les
espaces péricytoplasmiques au contact des parois cellulaires. Le saccharose pourrait d'abord
diffuser dans l'apoplasme avant d'être chargé dans le complexe conducteur par un transport
actif, un système de co-transport protons saccharose associé à des ATPases plasmiques à
protons fournissant l'énergie nécessaire pour charger le saccharose contre son gradient de
concentration. Les ATPases maintiennent une différence de concentration en protons entre
l'intérieur et l'extérieur des cellules compagnes (Sauer, 2007). L'ATP est fourni par les
nombreuses mitochondries des cellules compagnes. Chez d'autres espèces, le chargement
s'effectue par la voie symplastique, le chargement en sucre du phloème est réalisé par
diffusion simple, grâce au gradient de concentration en sucre décroissant entre le cytosol
des cellules du mésophylle et les cellules criblées et à la haute densité de plasmodesmes qui
assure une continuité cytoplasmique entres ces cellules (Turgeon et Beebe, 1991;
Sonnewald, 1997).
Chez Ricinus communis le maintien du transport phloémien durant un stress hydrique
sévère a été corrélé a une augmentation en solutés dans les tubes criblés qui a comme
conséquence le maintien d'une pression de turgescence positive dans le phloème (Smith et
Milburn, 1980), cette observation a été faite aussi chez le coton et le sorgho (Sung et Krieg,
1979).
63
Les auteurs ont également observé une augmentation du flux de soluté au travers du
phloème corrélée à une diminution du potentiel hydrique du xylème (Smith et Milburn,
1980).
Le chargement semblerait donc relativement résistant au déficit hydrique, cependant
un ralentissement du transport de saccharose à longue distance de 10 à 80 % en journée
ainsi qu'une inhibition totale à l'obscurité a également était observée en réponse au stress
hydrique chez Helianthus annuus et Vitis vinifera (Quick et al., 1992). La réponse du
transport à longue distance au déficit hydrique ne semble donc pas tranchée et peu d'études
se sont penchées sur cette problématique.
3.3.2. Le déchargement des glucides
Le déchargement des assimilâts dans les organes puits peut lui aussi se faire soit par
voie apoplastique ou soit par voie symplastique (Frommer et Sonnewald, 1995) (Figure 11).
Pour la plupart des organes puits le déchargement du phloème se fait par la voie
symplastique (Patrick, 1997; Imlau et al., 1999). Le déchargement des sucres dans
l'apoplasme du phloème depuis le complexe cellules criblées/cellules compagne est assuré
par des différences importantes de concentrations en saccharose transmembranaire
(Patrick, 1990). Les flux de saccharose peuvent être réalisés par diffusion grâce à des
facilitateurs, par un transport actif du saccharose couplé à un transport de protons et par
l'activité d'invertases extracellulaires qui hydrolysent le saccharose en hexoses qui seront
transportés dans les cellules de l'organe puits par des transporteurs d'hexoses (Lalonde et
al., 2003). Le saccharose déchargé par la voie symplastique atteint par la suite les cellules
puits grâces aux différents plasmodesmes (Schulz, 1995). Cependant, dans certains cas
comme dans les interactions hôte/pathogène ou tissus maternels/filiaux et dans le cas où
l'organe puits accumule de grandes quantités d'osmolytes, le transport symplastique peut
être interrompu par une étape apoplastique qui permet de réduire le retour des sucres dans
le phloème (Patrick, 1997). Dans tous les cas, le saccharose et les hexoses pourront être
ensuite stockés dans les vacuoles des cellules puits par des transporteurs spécifiques, ou
sous la forme d'amidon dans les amyloplastes (Lalonde et al., 2003).
64
3.3.3. Les transporteurs de disaccharides chez Arabidopsis thaliana
Le saccharose, sucre non réducteur, est un élément essentiel du métabolisme
énergétique de la plante, c'est pourquoi le saccharose est la forme principale de transport
des glucides à longue distance (Dinant, 2008). Chez Arabidopsis, neufs séquences codent des
transporteurs de saccharose de la famille des AtSUC (Sucrose transporter) :
AtSUC1 est un transporteur de saccharose possédant un Km de 0,5 mM (Sauer et
Stolz, 1994), situé au niveau des membranes plasmiques. Le gène AtSUC1 est fortement
exprimé dans le pollen (Stadler et al., 1999; Bock et al., 2006; Sivitz et al., 2008), les
trichomes, les racines (Stadler et al., 1999), les jeunes feuilles et les feuilles matures
d’Arabidopsis thaliana (Sauer et Stolz, 1994). L'expression de ce gène est connue pour être
gul e
gative e t pa la p se e o joi te d’u e fo te o e t atio e sa ha ose et
d'un facteur de transcription (ABI5) dépendant lui-même d'une augmentation de la
concentration en ABA (Sivitz et al., 2008; Hoth et al., 2010). Ce transporteur aurait un rôle
important dans la signalisation. L'expression des gènes de la voie de biosynthèse des
anthocyanes est réprimée dans les mutants SUC1, alors qu'elle est induite chez les sauvages
en réponse à de fortes concentrations en saccharose (Solfanelli et al., 2006; Sivitz et al.,
2008).
AtSUC2 est un transporteur de saccharose qui est caractérisé par un Km de 0,77 mM
(Sauer et Stolz, 1994). AtSUC2 est exprimé dans les cellules compagnes (Chandran et al.,
2003) et dans les cellules de garde (Meyer et al., 2004). Les plantes mutées pour ce gène
développent de toutes petites rosettes et accumulent beaucoup plus de sucres solubles
(glucose, fructose et saccharose) et d'amidon que les sauvages (Srivastava et al., 2008). Ces
observations indiquent le rôle essentiel de ce transporteur de saccharose dans le
chargement du phloème et le transport à longue distance des photo-assimilâts. De plus ce
gène est activé par les attaques des pathogènes, son expression étant induite dans les
syncytiums produit par des nématodes au niveau des racines (Juergensen et al., 2003).
65
AtSUC3 diffère des autres transporteurs de cette famille par sa taille et son nombre
d'introns (Meyer et al., 2004). Le Km de ce transporteur pour le saccharose est de 1,9 mM, de
plus il possède aussi une affinité pour le maltose (K m= 1,6mM) (Meyer et al., 2000). Le gène
AtSUC3 est exprimé dans les cellules des tubes criblés mais aussi dans différents organes
puits tels que les cellules de garde des jeunes feuilles, les trichomes, les grains de pollen, les
racines, dans les téguments des graines... suggérant un rôle dans l'approvisionnement en
saccharose de ces différents organes puits (Meyer et al., 2004; Endler et al., 2006).
L'expression de ce gène est connue pour être induite en réponse aux blessures (Meyer et al.,
2004). Un rôle hypothétique de ce transporteur de saccharose dans les voies de signalisation
est toujours soumis au débat (Barker et al., 2000).
AtSUC4 est un transporteur de saccharose de type symporteur (saccharose/H+)
(Schneider et al., 2011). Ce transporteur est caractérisé par un Km de 11,6
0,6 mM et il est
principalement localisé dans les nervures secondaires des feuilles sources où une grande
capacité de transport du saccharose est nécessaire pour son chargement dans le phloème
(Weise et al., 2000; Endler et al., 2006). Plus précisément, chez Arabidopsis thaliana ce
transporteur serait localisé exclusivement au niveau du tonoplaste et également exprimé
dans des organes puits comme la stèle des racines, dans les anthères en développement et
les tissus méristématiques des organes aériens (Schneider et al., 2011).
AtSUC5 est un transporteur de saccharose codé par un gène dont l'expression est
uniquement rapportée dans l'endosperme et induite durant le développement des graines
entre 0 et 4 jours après la floraison (Baud et al., 2005).
Les transporteurs de saccharose AtSUC6, AtSUC7 et AtSUC8 partagent un degré
important d'homologie de séquences dans leurs régions codantes, au niveau de leurs introns
mais aussi au niveau de leurs extrémités 5' et 3' (Sauer et al., 2004). AtSUC6 et AtSUC7
codent des protéines aberrantes et ne représenteraient que des pseudos gènes de
transporteurs de saccharose, notamment pour l'écotype Ler un codon stop a été découvert
dans l'ORF du gène AtSUC6 (Sauer et al., 2004).
66
AtSUC8 est un transporteur de saccharose caractérisé par un Km de 0,15 mM (Sauer
et al., 2004) qui peut transporter aussi du maltose. L'expression de ce gène n'a été observée
qu'au niveau des fleurs (Sauer et al., 2004).
AtSUC9 est un transporteur de saccharose possédant une très forte affinité pour le
saccharose (Km = 0,5 mM), présent dans les membranes plasmiques de cellules d'organes
puits comme les fleurs et les siliques mais également dans les feuilles (Sauer et al., 2004;
Sivitz et al., 2007). Trois lignées mutantes AtSUC9 ont montré des phénotypes de floraison
rapide avec des conditions d'éclairement de jours courts. Ainsi l'activité d'AtSUC9 au niveau
des feuilles diminuerait le chargement du phloème en saccharose en maintenant une faible
concentration en saccharose extracellulaire, ce qui repousserait ainsi la période de floraison
(Sivitz et al., 2007).
3.3.4. Les transporteurs de monosaccharides (MST) chez Arabidopsis
thaliana
Certains organes puits tels que les grains de pollen, les tubes polliniques, les cellules
du tapetum des anthères, l'embryon en développement, les cellules de garde... sont isolés
d'un transport et d'un déchargement symplastique. Ces organes ne peuvent importer les
photo-assimilâts contre le gradient seulement grâce à des transporteurs présents dans leur
membrane plasmique dont notamment des transporteurs de monosaccharides (Büttner et
Sauer, 2000). De plus certains de ces transporteurs sont aussi présents dans les cellules du
mésophylle qui réalisent la photosynthèse où leur fonction est de récupérer les sucres
perdus par les cellules, par diffusion dans l'apoplasme. Les protéines appartenant à cette
famille de transporteurs accumulent leur substrat contre le gradient de concentration, en
utilisant l'énergie du gradient de proton et la différence de potentiel transmembranaire. La
plupart de ces transporteurs de monosaccharides sont des symporteurs de sucres/H +,
espo sa les d’u t a spo t a tif des su es (Büttner et Sauer, 2000). Chez Arabidopsis, la
famille des transporteurs de monosaccharides est constituée de 53 membres, impliqués
aussi bien dans le transport des sucres à longue distance, que dans leur répartition au sein
même de la cellule.
67
Figure 12. Arbre phylogénétique des transporteurs de monosaccharides identifiés chez
Arabidopsis thaliana (Büttner, 2007).
Les 53 gènes codant pour ces transporteurs peuvent être regroupés en 7 familles
distinctes : les AtSTP, AtVGT, AtTMT, AtpGlcT, AtPMT, AtINT et AtERD6-like (Figure 12),
parmi elles 2 familles ont été choisies pour cette étude : les transporteurs AtSTP
responsables du transport du glucose et du fructose produits à partir du saccharose qui est
le principal sucre transporté à longue distance (Büttner, 2007) et les transporteurs AtPMT
assurant le transport des polyols, dont le rôle est réputé être important en condition de
stress (Noiraud et al., 2001).
3.3.4.1.Sugar Transport Protein (STP)
Cette famille de transporteur a été choisie en priorité car ses transporteurs sont
responsables du transport des molécules de glucose et de fructose qui sont tout deux les
constituants du saccharose. Si le saccharose est le vecteur du transport à longue distance de
la ressource carbonée, une fois déchargé le saccharose peut être hydrolysé en glucose et
fructose par des invertases. Ces 2 monosaccharides pourraient ensuite être accumulés par
les différentes cellules des organes puits grâce aux STP.
AtSTP1 est un transporteur de sucre identifié comme un monosaccharide/H+
symporteur par une analyse fonctionnelle chez la levure (Sauer et al., 1990). Il est capable de
transporter le glucose, le galactose, le xylose et le mannose mais pas le fructose (Sherson et
al., 2003). L'expression d'AtSTP1 a été observée au niveau des jeunes feuilles en
développement, des feuilles matures mais aussi au niveau des racines (Yamada et al., 2011),
ainsi AtSTP1 aurait un rôle dans le transport de glucose au niveau d'organes puits à partir du
saccharose présent dans l'apoplasme (transporté par les SUC) et hydrolysé par les
différentes invertases (Sherson et al., 2003). AtSTP1 a été observé également au niveau des
cellules de garde (Stadler et al., 2003; Yamada et al., 2011), où il participerait à la régulation
du rythme nycthéméral. L'expression d'AtSTP1 est réduite pendant la phase de jour et
rapidement exprimée au crépuscule, il contribuerait ainsi à l'osmorégulation des cellules de
garde. AtSTP1 participe à l'entrée de glucose (présent dans l'apoplaste) dans les cellules de
garde, ce glucose proviendrait de la dégradation la nuit et dans les cellules du mésophylle de
l'amidon (Stadler et al., 2003).
68
Le gène codant le transporteur AtSTP2 est exprimé pendant la maturation des grains
de pollen et durant la germination des graines d'Arabidopsis thaliana. ce transporteur
possède une haute affinité pour les hexoses (glucose, galactose et mannose) et pour les
pentoses avec des Km de l'ordre du µM (Truernit et al., 1999). Ce transporteur de sucres est
donc responsable des apports en monosaccharides au niveau du gamétophyte mâle
d'Arabidopsis thaliana.
AtSTP3 est e p i
da s les feuilles d’Arabidopsis, faiblement dans les organes
floraux et les tiges. AtSTP3 accepte comme substrats de nombreux monosaccharides
(glucose, xylose, mannose, galactose et fructose) et possède un Km de 2 mM pour le
D-glucose. Ce Km lev pou ait i di ue
u’AtSTP se ait plus u fa ilitateu plutôt u’u
transporteur de monosaccharide dépendant d'un gradient protonique assuré par des
H+/ATPases. U e i du tio de l’e p essio d'AtSTP3 a été observée en réponse à un stress
de blessure (M. Büttner, 2000).
AtSTP4 est un transporteur présent sur les membranes plasmiques des cellules des
racines et des fleurs d'Arabidopsis thaliana (Truernit et al., 1996). L'expression d'AtSTP4 est
induite en réponse à la blessure et après une infection par Pseudomonas syringae et
Erysiphe cichoracearum (Truernit et al., 1996; Fotopoulos et al., 2003) mais réprimée par
une infection induite par Heterodera schachtii (Hofmann et al., 2009).
AtSTP6 est un transporteur d'hexoses dont l'expression hétérologue chez
Saccharomyces cerevisiae a démontré sa capacité à transporter le glucose, le galactose, le
mannose et le fructose. AtSTP6 pourrait avoir un rôle important dans le transport de
fructose, étant donné qu'il est l'un des rares transporteurs de la famille des AtSTP à assurer
un taux de transport de fructose important (à l'inverse d'AtSTP1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 et 11)
(Büttner, 2010). Le gène AtSTP6 est exprimé au niveau du pollen et uniquement lors des
derniers stades de maturation du pollen (Scholz-Starke et al., 2003).
69
AtSTP5 et AtSTP7 sont des transporteurs codés par deux gènes qui complémentés
chez Saccharomyces cerevisiae n'ont pas permis de mettre en évidence une activité de
transport pour les principaux hexoses comme le glucose, le fructose, le galactose, le
mannose ou même les pentoses comme le ribose et le xylose (Büttner, 2010). Le gène
AtSTP5 est exprimé dans la graine tout au long de son développement alors qu'AtSTP7 est lui
exprimé transitoirement. De plus AtSTP7 est également exprimé dans les racines,
principalement dans les zones de maturation (Büttner, 2010). Une répression de l'expression
d'AtSTP7 a été observée dans les racines d'Arabidopsis thaliana en réponse à une infection
par un nématode (Heterodera schachtii) (Hofmann et al., 2009).
AtSTP8 est un transporteur localisé dans les graines d'Arabidopsis thaliana et plus
particulièrement au niveau de la chalaze (Büttner, 2010).
AtSTP9 est un transporteur de monosaccharides avec un Km de l'ordre du micro
molaire et possède une haute affinité pour le glucose. Ce gène est exclusivement exprimé au
niveau des fleurs et restreint au gamétophyte mâle. Il aurait un rôle important dans la
germination et le développement du tube pollinique (Schneidereit et al., 2003; Büttner,
2010).
Le gène qui code le transporteur AtSTP10 est exprimé dans le pollen en germination
et le tube pollinique (Wang et al., 2008; Qin et al., 2009; Büttner, 2010).
AtSTP11 est un transporteur de monosaccharides localisé exclusivement au niveau
du pollen lors de sa germination et dans les tubes polliniques (Schneidereit et al., 2005;
Büttner, 2010).
AtSTP12 est un transporteur d'hexoses localisé dans les graines (Büttner, 2010).
L'expression d'AtSTP12 est induite dans les racines d'Arabidopsis thaliana infectées par un
nématode (Heterodera schachtii) (Hofmann et al., 2009).
70
AtSTP13 est un transporteur de sucres à forte affinité hexose/H+. À l'image d'AtSTP6
ce transporteur est l'un des seuls à posséder un taux de transport important pour le fructose
(Büttner, 2010). L’e p essio
de
e g
e est fo te e t i duite lo s de st ess
environnementaux et plus particulièrement dans les tissus subissant une mort cellulaire
programmée (PCD) (Nørholm et al., 2006). Les données disponibles sur le site NASC
suggèrent une expression induite en réponse à un stress abiotique (Craigon et al., 2004), une
induction de l'expression AtSTP13 a également été observée dans les racines d'Arabidopsis
thaliana en réponse à un stress salin et à un traitement à l'ABA (Yamada et al., 2011).
AtSTP14 est un transporteur de monosaccharides localisé dans l’e dode
e des
cotylédons, dans les feuilles matures, dans les tiges et les fleurs. Ce gène code un
transporteur spécifique de gala tose. L’e p essio de e g
e se ait
gul e pa des fa teu s
induits lors de la dégradation de la paroi. AtSTP14 aurait ainsi un rôle dans le recyclage du
galactose présent dans la paroi (Poschet et al., 2010).
3.3.4.2.Les transporteurs de polyols AtPLT/AtPMT
Le contenu en polyols augmente en réponse à une période de sécheresse ou à un
stress salin (Noiraud et al., 2001). Toutefois, Arabidopsis thaliana est une espèce réputée
pour transporter principalement le saccharose et le raffinose en moindre quantité et le
transport de polyols est ainsi rarement rapporté (Haritatos et al., 2000). Après la première
a a t isatio d’u t a spo teu de pol ols hez Arabidopsis thaliana (AtPLT5) par Klepek
e
, e tai s auteu s o t e a u
ue l’a o
e hoisi tait déjà utilisé pour les
gènes PLETHORA1 (PLT1) et PLETHORA2 (PLT2). C’est pou uoi pou
les
auteu s
t availla t
su
es
t a spo teu s
o t
hoisi
vite toute o fusio
l’a o
e
PMT
(Polyol/Monosaccharides Transporters) pour désigner les transporteurs de polyols.
AtPMT1 et AtPMT2 sont deux transporteurs de fructose et de xylitol. Ce transport est
voltage dépendant et catalyse un transport de ses substrats de type symporteur avec
protons. Ces protéines sont localisées dans les membranes plasmiques des grains de pollen,
des tubes polliniques, des hydathodes et des jeunes cellules du xylème (Klepek et al., 2010).
71
AtPMT5 a été le premier transporteur de polyols étudié, ce transporteur est de type
symporteur avec proton et possède une faible affinité, permettant ainsi le transport
d’he oses, de pe toses et de polyols à travers la membrane plasmique (Klepek et al., 2005;
Reinders et al., 2005).
Les transporteurs AtPMT3 et AtPMT6 n'ont pas encore été caractérisés mais leur
expression a toutefois été étudiée dans ce travail dans les feuilles matures de différents
écotypes d'Arabidopsis thaliana et en réponse à un stress hydrique par une analyse en
macro-array.
72
Objectif de l'étude
Les plantes s'adaptent à la contrainte hydrique en limitant leurs pertes en eau via la
fermeture de leurs stomates. Cette régulation est antagoniste à l'entrée du CO 2 au travers
des stomates jusqu'aux sites de carboxylation à l'intérieur des chloroplastes. Le déficit
hydrique induit donc une baisse de l'activité photosynthétique et par conséquent une
diminution de la productivité végétale. Le chargement et le transport des sucres à longue
distance représentent également un facteur déterminant pour la productivité végétale.
Effectivement, ce transport assure la répartition du carbone photo-assimilé au niveau des
organes sources (feuilles) où a lieu la photosynthèse, vers les organes puits (les racines, les
fleurs, les fruits...) où il sera utilisé. Les effets du stress hydrique sur l'allocation du carbone
dans ces organes puits sont souvent négligés et donc jusque là très peu étudiés. Il convient
donc d'étudier conjointement l'effet du déficit hydrique sur la production des sucres
(photosynthèse) et sur leur transport à longue distance via l'expression des principaux
transporteurs de sucre.
Actuellement de nombreuses études utilisent une approche basée sur l'utilisation de
mutants pour mettre en évidence et mieux comprendre les mécanismes de réponse des
plantes à la contrainte hydrique. L'objectif de ce genre d'étude est de produire des plantes
génétiquement modifiées présentant une résistance accrue à la contrainte hydrique. Dans
ce travail, une nouvelle approche est utilisée, elle repose sur l'exploration de la variabilité
naturelle d'Arabidopsis thaliana, pour révéler et étudier les réponses et les stratégies mises
en place par ces plantes face à un déficit hydrique.
Pour ce faire, une analyse de la diversité phénotypique a permis, dans un premier
temps, la sélection de 3 écotypes (Col-0, Mt-0 et Shahdara) qui ont ensuite été soumis à une
p iode de d fi it h d i ue de
jou s pa a
t d’a osage. Au ou s de ette p iode de
sécheresse et après 4 jours de réhydratation, divers paramètres ont été régulièrement
quantifiés. La teneur en eau, la biomasse des rosettes et le phénotype glucidique foliaire ont
été déterminés.
73
Par ailleurs, des mesures d’ ha ges gazeu et de fluo es e e hlo oph llie
e o t pe
is
de a a t ise l’effet du d fi it h d i ue su l’a tivit photos th ti ue et la ualit des
photos st
es II. Pou fi i , l’i pa t du
a
ue d’eau su l’e p essio des g
es oda t les
transporteurs foliaires de sucres a été précisé.
74
Matériels et méthodes
B. Matériels et méthodes
75
Figure 13. Arbre phylogénétique réalisé à partir d'une analyse moléculaire des espèces
appartenant au genre Arabidopsis (O'Kane et Al-Shehbaz, 2003). L'espèce Arabidopsis
pedemontana n'est pas présente sur cet arbre car absente de l'étude. L'espèce Arabidopsis
arenosa regroupe 3 sous espèces qui n'apparaissent pas sur l'arbre phylogénétique.
Figure 14. Dist i utio ① g og aphi ue① d’Arabidopsis thaliana. Les zones vertes
correspondent à la distribution des différents écotypes. Les 300 accessions collectées et
disponibles dans les centres de stock sont représentées par un point rouge (Alonso-Blanco
et Koornneef, 2000).
1. Arabidopsis thaliana (L.)
1.1. Taxinomie
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (Holl et Heynhold, 1842) ou Arabette des Dames, est
une plante modèle classiquement utilisée pour la recherche en biologie végétale (AlonsoBlanco et Koornneef, 2000). Arabidopsis thaliana est une petite herbacée annuelle de la
famille des Brassicaceae. Elle appartient au genre Arabidopsis qui regroupe neuf espèces et
huit sous-espèces (Figure 13) (Al-Shehbaz Ihsan et O'Kane Steve, 2009). Cette classification
repose sur des études phylogéniques, morphologiques et moléculaires (O'Kane et AlShehbaz, 2003; Al-Shehbaz Ihsan et O'Kane Steve, 2009).
1.2. Répartition géographique
Arabidopsis thaliana est u e esp e o igi ai e d’Eu ope et d’Asie e t ale (Vander
Zwan et al., 2000) qui peut actuellement être rencontrée naturellement dans différentes
régions du monde, cette répartition serait synanthropique (Figure 14). Son aire de
répartition est déterminée par la présence de conditions climatiques particulières. Des
températures trop faibles au printemps et en automne (< 22°C) ainsi que de faibles
précipitations en été limitent sa répartition principalement à l'hémisphère nord (Hoffmann,
2002). Arabidopsis thaliana occupe des habitats variés, ouverts ou « perturbés ». Elle
prolifère effectivement sur des sols souvent sablonneux ou limoneux tels que les berges des
rivières, le bord des routes, les pentes rocheuses, les terrains en friche ou cultivés. Elle a été
également découverte à des altitudes dépassant les 4 000 mètres (Al-Shehbaz et O'Kane,
2002). Sa forte capacité à s'adapter et à coloniser des habitats aux situations géographiques
et climatiques variées est probablement à mettre en relation avec des stratégies
reproductrices particulières. Ces nombreuses sous-espèces ou populations locales
d'Arabidopsis thaliana dont les caractéristiques génétiques sont adaptées à leur milieu sont
qualifiés d'écotypes.
76
Figure 15. Les écotypes d'Arabidopsis thaliana peuvent être définis selon leur cycle de
reproduction, soit en annuel d'été ou soit en annuel d'hiver. Un écotype qui germe à la fin
de l'été ou au printemps et qui croît l'hiver pour initier sa phase de reproduction au
printemps est qualifié d'annuel d'hiver. À l'inverse les écotypes qualifiés d'annuels d'été
sont capables d'achever leur cycle de reproduction au cours de la saison estivale, tant que
les conditions climatiques sont appropriées pour la production de semence (Shindo et al.,
2007).
1.3. Cycle de reproduction
Les écotypes d'Arabidopsis thaliana peuvent être classés parmi les plantes annuelles
d'été ou les plantes annuelles d'hiver suivant leur période de floraison (Figure 15). En
générale les jours longs, les températures élevées et la vernalisation induisent la floraison
d'Arabidopsis thaliana (Lempe et al., 2005).
Les écotypes caractérisés par un cycle de reproduction de type « annuel d'hiver »
produisent des graines qui germent à partir de la fin de l'été jusqu'à l'automne ; ils
développent leurs rosettes pendant l'hiver et fleurissent à l'été.
À l'inverse, les écotypes de type « annuel d'été », ont un cycle de reproduction court
et sont ainsi capables d'accomplir la totalité de leur cycle de vie durant l'été, aussi longtemps
que les conditions de culture restent favorables au développement de la plante (c'est-à-dire
en dehors de tout stress abiotique). Ainsi les écotypes caractérisés par un cycle de
reproduction estival produisent des graines à forte dormance comparativement à celles
issues des
ot pes d’hive (Shindo et al., 2007). L'existence de ces deux stratégies de cycle
de vie est un paramètre indispensable pour bien comprendre et analyser les stratégies de
réponse des différents écotypes à la contrainte hydrique.
Dans le sud de l'Europe, les écotypes d'Arabidopsis thaliana peuvent-être de type
annuel d'hiver ou d'été, alors que dans le nord de l'Europe, ils sont typiquement de type
annuel d'hiver (Koornneef et al., 2004; Shindo et al., 2007). Certains écotypes de type annuel
d'hiver, fleurissent exclusivement après une période de vernalisation, ils se rencontrent
principalement dans le nord de l'Europe, et plus particulièrement au dessus du 45 ème
parallèle nord (Shindo et al., 2005). Aucune relation claire n'a pu être observée entre la
répartition géographique et le type de floraison (Nordborg et Bergelson, 1999; Shindo et al.,
2005). Cependant, un gradient lié à la latitude a pu être démontré (Stinchcombe et al.,
2004).
77
Figure 16. Analyse en composantes principales des plantes témoins d'écotypes
d'Arabidopsis thaliana. TLA = Total Leaf Area, EL = Electrolytes Leakage, RWC = Relative
Water Content, WKA = Water Keeping Ability (Bouchabke et al., 2008). En vert les
écotypes choisis pour ce travail.
Tableau 1. Liste des 8 écotypes définis par leur nom d'accession, leur numéro de collection
(Natural Variation of Arabidopsis thaliana, VNAT) et les caractéristiques géographiques de
leur habitat naturel.
Accession
INRA Versailles
Ressource Centre
Identification
An-1
96 AV
Bl-1
42 AV
Col-0
186 AV
Cvi-0
166 AV
Ge-0
Core
collection
Pays
Latitude
Longitude
Altitude
(m)
Belgique
N51°13'
E4°25'
1-100
Italie
N 44°29'
E 11°20'
100-200
Pologne
N 52°44'
E 15°15'
1-100
8
Cap Vert
N 16°00'
W 24°00'
1100-1200
101 AV
16
Suisse
N 46°12'
E 6°10'
500-600
Mt-0
94 AV
16
Libye
N 32°34'
E 22°46'
100-200
Oy-0
224 AV
8
Norvège
N 60°23'
E 6°13'
1-100
Shahdara
236 AV
8
Tadjikistan N 37°29'
E 71°30'
3300-3400
24
Un écotype « a
uel d’ t » originaire d'une zone géographique où la disponibilité en
eau est limitante (bassin méditerranéen, Afrique du nord...) ne développe pas
obligatoirement des stratégies permettant de faire face à la rareté de la ressource en eau,
mais réalise son cycle de reproduction avant d'être affecté par la contrainte hydrique. Un
écotype issu d'un habitat aride n'est pas forcément un écotype possédant des adaptations et
des mécanismes de résistance à la contrainte hydrique importants.
1.4. Choix des écotypes étudiés
Quinze écotypes ont été initialement choisis à partir des
sultats issus d’u e a al se
en composantes principales (ACP) proposée par Bouchabke et al. (2008). Cette ACP visait à
organiser la diversité de réponse au déficit hydrique de 24
ot pes d’Arabidopsis thaliana
sur la base de quelques paramètres physiologiques et hydriques (Figure 16). Les 15 écotypes
ete us avaie t l’ava tage de ep se te la dive sit des
factoriel 1X2. Les se e es des
ot pes hoisis o t t
o
po ses e p i
es pa le pla
a d es à l’INRA de Ve sailles
(VNAT). Dans un premier temps, seuls les écotypes amenés à floraison afin de produire un
stock suffisamment important de graines pour l'ensemble des expérimentations ont été
conservés. Pour cela les différents écotypes ont été mis en culture dans des conditions
identiques à celles des différents essais. À l'apparition de la hampe florale, des ARACON
(Arasystem®, Belgique) sont placés sur chaque pot afin d'isoler les hampes et ainsi éviter les
fécondations croisées entres les écotypes. Afin d'amener l'écotype Ge-0 à floraison, les
plants Ge-0 ont été placés en chambre froide (4°C et photopériode de 8h) pendant 2
semaines. Le stock de semence produit a été suffisant pour mener à bien l'ensemble des
essais présentés. Certains de ces écotypes ne développant que de petites rosettes avec de
petites feuilles ne pouvaient être étudiés à l'aide d'outils de mesure de l'activité
photosynthétique et ont donc été écartés de cette étude. Enfin, une étude préliminaire
(croissance, développement, comportement vis-à-vis de la sécheresse) portant sur les
écotypes restant a permis de sélectionner 8 écotypes particulièrement intéressants. Ces
écotypes présentent en outre des morphotypes très différents. Les 8 écotypes retenus pour
cette étude sont : An-1, Bl-1, Col-0, Cvi-0, Ge-0, Mt-0, Oy-0 et Shahdara. Ils sont originaires
de zones géographiques variées caractérisées par des climats contrastés (Tableau 1).
78
Figure 17. Photographie de la chambre de culture où les plantes sont cultivées dans des
conditions contrôlées : photopériode de 8h ; densité de flux de photons photosynthétique
(PPFD) comprise entre 60 et 100 µmol.m-2.s-1; température diurne de 22°C et nocturne de
18°C ; humidité relative diurne de 60 % et nocturne de 90 %.
2. Protocole cultural
Les ultu es d’Arabidopsis thaliana ont été effectuées dans un mélange de terreau
horticole (Tref, Jiffy®) (3/4, v/v) préalablement tamisé et de vermiculite (1/4, v/v). Avant
utilisation, le mélange est autoclavé (20 min à 110°C / 2,5 bars) pour éliminer toute présence
organique pouvant contaminer la culture.
Les g ai es d’Arabidopsis thaliana sont semées dans des barquettes qui sont ensuite
sto k es deu
d’ho og
jou s à l’o s u it
e
ha
ise la lev e e t e les diff e ts
e f oide
°C . Cette op atio
pe
et
ot pes. Les a uettes sont ensuite placées
en chambre de culture dans les conditions suivantes : photopériode de 8h ; températures
diurne de 22°C et nocturne de 18°C ; humidités relatives diurne de 60 % et nocturne de
90 %. La stabilité des conditions de culture a été confirmée par des enregistrements, toutes
les 5 min, de la température et de l'humidité relative par un enregistreur ECOLOG TH1
(ELPRO®) placé à l'intérieur du phytotron. La chambre de culture est éclairée par des tubes
fluo es e ts a a t is s pa u spe t e d’ mission de type lumière du jour (masterTLD
36W/830, Philips®). Les plantes disposées à 40 cm sous les tubes reçoivent une densité de
flux de photons comprise entre 60 et 100 µmol.m-2.s-1. Arabidopsis thaliana, étant une
plante de jour long, son exposition à une photopériode inférieure à sa photopériode critique
(10 h) permet de la maintenir dans un état végétatif. La germination est observée cinq jours
après le semis. Les plantes sont ensuite repiquées individuellement dans des pots de 90 mL
treize jours après leur levée. Les pots sont régulièrement hydratés. Pour ce faire, ils sont
baignés une heure dans une solution nutritive (N 3 %, P2O5 1 %, K2O 7 %, Mg 0,5 %) diluée à
6.10-4 (flora series, GHE®). La fréquence des arrosages a été ajustée entre le 1er jour après la
levée (JAL) et le 40ème JAL de
a i e à vite d’u e pa t u e o t ai te h d i ue o
souhait e et d’aut e pa t la p olif atio de
tes (Tableau 2). À partir du 40ème JAL, les
plantes (non soumises à une contrainte hydrique) ont été hydratées régulièrement et
systématiquement tous les 3 jours.
79
Tableau 2. Calendrier cultural appliqué rigoureusement pour chaque essai, aussi bien pour
les essais visant à caractériser les écotypes (jusqu'au 47ème JAL), que ceux de stress
hydrique (jusqu'au 65ème JAL).
3. Présentation générale des essais, de l’échantillonnage et
des analyses effectuées
T ois t pes d’essai o t été réalisés au cours de cette étude :
- des essais préliminaires visant à sélectionner sur la base de différents critères [croissance,
développement,
assi ilatio
paramètres
photosynthétiques
photos th ti ue
simple
(conductance
stomatique,
ette… ] 8 é ot pes d’Arabidopsis thaliana parmi les 15
initialement retenus (données non présentées) ;
- des essais ayant pour objectif de caractériser plus finement la croissance, le
d veloppe e t et les a a t isti ues photos th ti ue des
ot pes d’Arabidopsis
thaliana retenus (An-1, Bl-1, Col-0, Cvi-0,Gé-0, Mt-0, Oy-0 et Shahdara) sachant que ces
essais avaie t gale e t pou o je tif d’ide tifie les
ot pes Col-0, Mt-0 et Shahdara)
qui seraient ultérieurement soumis à un déficit hydrique ;
- des essais visa t à a a t ise les effets d’u st ess h d i ue suivi d’u e ou te p iode de
réhydratation sur la photosynthèse et quelques autres paramètres (croissance, sucres
solu le, a ido , e p essio de uel ues t a spo teu s de su es foliai es…) exprimés par les
ot pes d’Arabidopsis thaliana (Col-0, Mt-0, Shahdara) finalement choisis.
3.1. Essais visant à caractériser le phénotype de 8 écotypes
d’Arabidopsis thaliana
Deux essais expérimentaux identiques ont été effectués pour chacun des 8
écotypes sélectionnés. Au total 16 essais (8 écotypes X 2 essais) ont donc été réalisés.
Chaque essai expérimental a duré en moyenne 55 jours : 8 jours entre le semis et la levée
des pla tules et
ét
jou s au ou s des uels la
tudi . Le de ie jou de l’e p i e tatio
oissa e et le d veloppe e t de l’ ot pe a
ème
JAL) différents paramètres capables
de e d e o pte de l’a tivit photos th ti ue de l’ ot pe o t t
esu s.
80
À cette même date, des plantes ont également été sacrifiées pour permettre la
détermination des biomasses végétatives aériennes fraîches et sèches des rosettes ainsi que
leur teneur en eau. Pendant toute la durée des essais, compte tenu de la photopériode
imposée, les plantes sont restées dans un état végétatif. Pour chaque essai, 200 plantules
ont été individuellement repiquées 13 jours après leur levée (JAL) dans des pots de 90 mL à
aiso d’u e pla tule pa pot. Co pte te u des
esu es et de l’ ha tillo
age e visag s,
seuls trois essais au maximum pouvaient être conduits simultanément et de manière
synchronisée dans le phytotron qui accueillait donc 600 pots (200 pots x 3 écotypes)
(Figure 17).
Au 14ème JAL, 20 plantes, homogènes et représentatives du phénot pe de l’ ot pe,
ont été identifiées et photographiées. Ces mêmes 20 plantes seront ensuite régulièrement
photog aphi es tous les
jou s jus u’au
ème
JAL (9 séries de photographies au total par
essai). Sachant que deux essais ont été réalisés par écotype, une banque de 360
photographies (20 photographies x 9 dates x 2 essais) a été constituée pour chacun des 8
ot pes. T ait es à l’aide d’u logi iel d’a al se d’i age, es photog aphies o t se vi à
déterminer, entre le 14ème JAL et le 47ème JAL, l’ volutio du o
e de feuilles, du dia
te
et de la surface foliaire projetée des rosettes.
Pour trois des 8 essais (ceux correspondant aux écotypes Col-0, Mt-0 et Shahdara),
l’ volutio de la su fa e foliai e p ojet e des osettes a t
o pa e ave l’ volutio de la
surface foliaire totale (= surface foliaire réelle de la rosette). La comparaison a été effectuée
tous les 4 jours depuis le 18ème JAL jusqu'au 42ème JAL, puis au 47ème, 53ème et 63ème JAL. Pour
ha ue
ot pe et ha ue date de
esu e,
pla tes o t d’a o d t photog aphi es pou
permettre la détermination de leur surface foliaire projetée puis sacrifiées pour permettre la
détermination de leur surface foliaire réelle. Pour chacun des 3 écotypes cette étude a donc
nécessité 100 photographies et le sacrifice de 100 plantes.
81
Au 47ème JAL, en plus du suivi de croissance et de développement effectué depuis le
14ème JAL, d’aut es pa a
t es pe
etta t de a a t ise les écotypes ont été mesurés :
- les biomasses fraîches et sèches des rosettes et leur teneur en eau ;
- l’a tivit photos th ti ue ;
- la teneur des feuilles en chlorophylles totales.
Les biomasses fraîches et sèches ainsi que la teneur en eau (exprimée par rapport à la
masse de matière fraîche des rosettes) ont été déterminées su des pla tes ’a a t se vi à
aucune autre mesure. Pour chaque essai, 10 rosettes par écotype ont été sacrifiées. Deux
essais différents ayant été réalisés par écotype, in fine, 20 mesures de biomasse et de teneur
en eau étaient disponibles par écotype (10 plantes x 2 essais). Les plantes ont toutes été
sacrifiées le matin à la même heure.
Quatre paramètres photosynthétiques [conductance stomatique (gs), concentration interne
en CO2 (Ci), assimilation nette de CO2 (AN), et transpiration (E)] ont été déterminés à l’aide
d’u
appa eil de
esu e d’ ha ges gazeu
(CIRAS-2 PP Systems) sur des feuilles
individuelles matures de plantes différentes de celles photographiées. Pour chaque essai, 3
feuilles par plante et 4 plantes par écotype ont été échantillonnées. Deux essais différents
ayant été réalisés par écotype, in fine, 24 mesures par écotype (4 plantes x 3 feuilles x 2
essais) étaient disponibles pour chacun des paramètres mesurés.
La teneur en chlorophylles totales a
t
d te
i
e à l’aide d’u
hlo oph lle-mètre
(SPAD-502, KONIKA MINOLTA®) sur des feuilles individuelles matures de pla tes ui ’o t
servi à aucune autre mesure. Pour chaque essai, 4 feuilles par plante et 10 plantes par
écotype ont été échantillonnées. La mesure qui caractérise une feuille est en fait la moyenne
de 4 mesures effectuées sur différentes parties de son limbe. Deux essais différents ayant
été réalisés par écotype, in fine, 320 mesures de chlorophylles par écotype (10 plantes x 4
feuilles x 4 mesures par feuilles x 2 essais) étaient disponibles.
82
3.2. Essais visant à caractériser l’effet d’un stress hydrique
suivi d’une courte réhydratation sur 3 écotypes d’Arabidopsis
thaliana
Trois essais expérimentaux de stress hydrique ont été conduits, de manière
identique, sur chacun des 3 écotypes sélectionnés : Col-0, Mt-0 et Shahdara. Quels que
soient les paramètres mesurés au cours du stress et après réhydratation, le profil de réponse
de ha ue
les
ot pe s’est av
si ilai e pou les
essais. Pou
ha u des
ot pes, seuls
sultats issus du de ie essai pa ti uli e e t o plet puis u’il i t g e ota
e t
les données de fluorescence chlorophyllienne) seront présentés dans le présent document.
Au total
essais e p i e tau de st ess h d i ue o espo da t ha u à l’ tude d’u
écotype seront donc comparés et discutés. Ces 3 essais expérimentaux sont totalement
indépendants de ceux réalisés pour la caractérisation phénotypique des écotypes évoquée
précédemment.
Chacun des 3 essais expérimentaux a duré en moyenne 72 jours : (i) 8 jours entre le
semis et la levée des plantules ; (ii) 47 jours au cours desquels les plantes ont été cultivées
dans des conditions identiques a celles qui ont permis de caractériser leur phénotype ; (iii)
12 jours pendant lesquels la moitié des plantes a été soumise progressivement à un déficit
h d i ue o te u pa a
t de l’a osage alo s ue l’aut e
oiti des pla tes a t h d at e
au rythme habituel ; (iv) 5 jours pendant lesquels les plantes soumises au déficit hydrique
ont été réhydratées, l’ tape de
h d atatio a a t eu lieu le soi du de ie jou de st ess
(59ème JAL).
Pour chaque essai, 500 plantules ont été individuellement repiquées 13 jours après
leur levée (JAL) dans des pots de 90 mL à aiso d’u e pla tule pa pot. Co pte te u des
esu es et de l’ ha tillo
age e visag s, les
essais (un par écotype) ont été réalisés
successivement dans le temps.
Au soir du 46ème JAL les 500 plantes de l’essai o t toutes t a os es. Au
ati du
47ème JAL, elles ont été réparties en deux lots qualifiés de « stressé » et de « témoin ».
83
Les 250 plantes constitutives du lot témoin ont continué à être arrosées régulièrement (au
th e ha ituel pe da t les
jou s u’a du
l’e p i e tatio de st ess h d i ue alo s
que les 250 plantes du lot stressé ont été privées d’a osage pe da t ette
e p iode.
Au soir du 12ème et dernier jour de stress, les plantes du lot stressé ont toutes été
réhydratées.
Durant toute la période de stress, puis pendant la période de réhydratation des
plantes stressées, différentes mesures ont été effectuées simultanément sur un nombre
identique de plantes stressées et de plantes témoins. L’ ha tillo
age elatif à hacune de
ces mesures est précisé ci-après.
L’hu idit ① elative①du①su st at①et①la① asse①de①
①pots①t
oi s①et①de①
①pots①st ess s ont
été déterminées tous les jours depuis le 47ème JAL (t=0, début de la période de stress
hydrique jus u’au
ème
JAL [12 jours après le début du stress]. Tout au lo g de l’essai, les
mesures ont été effectuées le matin, à la même heure, sur les mêmes pots. Les pots
ide tifi s pou
es
esu es ’o t se vi à au u e aut e
esu e.
Les biomasses fraîches et sèches ainsi que le contenu relatif en eau (Relative Water
Content = RWC) des rosettes de 10 plantes témoins et de 10 plantes stressées ont été
déterminées depuis le 47ème JAL (t=0), tous les 3 jours pendant les 12 jours de contrainte
hydrique (5 points de mesure au total : t=0, J+3, J+6, J+ 9, J+12) et une dernière fois 4 jours
après la réhydratation des plantes stressées (+16 j). Vingt plantes ont donc été sacrifiées le
matin, toujours à la même heure, à chaque date de mesure. Cent vingt plantes ont été
sa ifi es pou la totalit de l’essai.
Les échanges gazeux instantanés [conductance stomatique (gs), concentration interne en
CO2, assimilation nette de CO2 (AN), et transpiration (E)] et les paramètres dérivés de la
fluorescence chlorophyllienne (Fv/Fm, ΦPS2, ETR, qP et NPQ) o t t d te
d’u appa eil de
i
s, à l’aide
esu e d’ ha ges gazeu CIRAS-2, PP Systems), sur 3 feuilles individuelles
matures de 4 plantes témoins et de 4 plantes stressées.
84
Ces mesures ont été effectuées depuis le 47ème JAL (t=0) tous les 3 jours pendant les 12 jours
de contrainte hydrique (5 points de mesure au total : t=0, J+3, J+6, J+9, J+12) et une dernière
fois 4 jours après la réhydratation des plantes stressées (J+16). Les mêmes 8 plantes
(4 t
oi s et
st ess es ide tifi es o t t suivies pe da t toute la du e de l’essai. Elles
’o t se vi à au u e aut e
esu e. Les
ème
es feuilles ide tifi es au
JAL ont été
a al s es jus u’au de ie jou du st ess h d i ue. La de i e s ie de mesures, effectuée
après réhydratation, a été réalisée sur les mêmes plantes mais sur des feuilles différentes de
elles jus u’alo s a al s es ui taie t t op s
es e tes pou
t e utilisa les.
Les courbes de réponse de type AN/Ci (assimilation nette / concentration interne en CO2)
ont été élaborées sur 1 feuille individuelle mature de 3 plantes témoins et de 3 plantes
stressées. Elles ont notamment permis de déterminer la vitesse maximale de carboxylation
du RuBP par la Rubisco (Vcmax), la densité maximale du flux d'électrons photosynthétiques
(Jmax) et la vitesse d'utilisation des trioses-phosphate (TPU). Compte tenu d’u e pa t du
te ps d volu à la olle te des poi ts
(2 heures) et, d’aut e pa t, de la
i f ieu e à la photop iode
d’ la o e plus de
essai es à l’ la o atio
essit
iti ue pou
d’u e ou e A N/Ci
d’e pose les pla tes à u e photop iode
vite d’i dui e la flo aiso , il ’a pas été possible
ou es da s u e
e jou
e. Ces
esu es o t t effe tu es
depuis le 48ème JAL (J+1) tous les 3 jours pendant les 12 jours de contrainte hydrique
(5 points de mesure au total : t= J+1, J+4, J+7, J+10, J+13) et une dernière fois 4 jours après la
réhydratation des plantes stressées (J+17). Elles ont donc été réalisées systématiquement un
jou
ap s la date à la uelle les
chlorophyllienne o t
t
d te
i
esu es d’ hanges gazeux et de fluorescence
es
a
il
’ tait pas possi le de
e e
à
ie
simultanément toutes les mesures. Au 48ème JAL, les plantes ne subissent pas encore la
contrainte hydrique (le dernier arrosage ayant eu lieu au soir du 46ème JAL). Les mêmes 6
plantes (3 témoins et 3 stressées) identifiées ont été suivies pendant toute la durée de
l’essai. Elles ’o t se vi à au u e aut e
esu e. Les
es feuilles ide tifi es o t té
a al s es jus u’au de ie jou du st ess h d i ue. La de i e s ie de
esu es, effe tu e
après réhydratation, a été réalisée sur les mêmes plants mais sur des feuilles différentes de
elles jus u’alo s a al s es ui taie t t op s
es e tes pou
t e utilisables.
85
La teneur en chlorophylles totales a
t
d te
i
e à l’aide d’u
hlo oph lle-mètre
(SPAD-502, KONICA MINOLTA®) sur 4 feuilles individuelles matures de 7 plantes témoins et
de 7 plantes stressées. La mesure qui caractérise une feuille est en fait la moyenne de 4
mesures effectuées sur différentes parties de son limbe. Ces mesures ont été effectuées
depuis le 47ème JAL (t=0) tous les 3 jours pendant les 12 jours de contrainte hydrique (5
points de mesure au total : t=0, J+3, J+6, J+9, J+12) et une dernière fois 4 jours après la
réhydratation des plantes stressées (J+16). Les mêmes 14 plantes (7 témoins et 7 stressées)
ide tifi es o t t suivies pe da t toute la du e de l’essai. Elles ’o t se vi à au u e aut e
mesure. La dernière série de mesures, effectuée après réhydratation, a été réalisée sur les
es pla ts
ais su des feuilles diff e tes de elles jus u’alo s a al s es ui taie t
trop sénescentes pour être utilisables.
Les teneurs moyennes en amidon et en sucres solubles des rosettes ont été déterminées
sur les mêmes feuilles matures de 5 plantes témoins et de 5 plantes stressées. Pour ce faire,
10 plantes ont été régulièrement sacrifiées, depuis le 47ème JAL (t=0), tous les 3 jours
pendant les 12 jours de contrainte hydrique (5 points de mesure au total : t=0, J+3, J+6, J+9,
J+12) et une dernière fois 4 jours après la réhydratation des plantes stressées (J+16). Les
feuilles matures récoltées le soir en fin de photopériode (Caspar et al., 1985), toujours à la
e heu e, o t t i
diate e t o gel es da s l’azote liquide puis conservées à
-80°C.
L’e p essio ① des① g
es① oda t①
① t a spo teu s① de① su es① et① de① pol ols① solu les① a① t ①
recherchée et semi-quantifiée dans les feuilles matures de 2 plantes témoins et de deux
plantes stressées. Les 4 plantes ont été sacrifiées 9 jours après le début du stress hydrique
(J+ . Les feuilles
atu es p lev es o t t i
liquide (-180 °C) puis conservées à -
diate e t o gel es da s de l’azote
°C jus u’à a al se.
86
4. Détail des analyses effectuées
4.1. Caractérisation des paramètres de croissance et de
développement des plantes d’Arabidopsis thaliana.
La
oissa e et le d veloppe e t des osettes d’Arabidopsis thaliana ont été
estimés par le biais de 5 paramètres : le nombre total de feuilles de la rosette, le diamètre
des rosettes, la surface foliaire projetée, la biomasse fraîche et la biomasse sèche des
rosettes. Le lien entre la surface foliaire projetée et la surface foliaire réelle (= totale) des
rosettes a été appréhendé seulement chez les trois écotypes qui ont été soumis à la
contrainte hydrique (Col-0, Mt-0 et Shahdara).
Le dénombrement des feuilles, le diamètre des rosettes et la surface foliaire projetée
ont été déterminés à partir de photog aphies a al s es à l’aide d’u logi iel d'a al se
d’i age i age J, http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html) (Abramoff et al., 2004).
Pour les trois écotypes (Col-0, Mt-0 et Shahdara) soumis à la contrainte hydrique, la
surface foliaire projetée ainsi déterminée a été comparée avec la surface foliaire réelle des
rosettes. Après avoir été photographiées, les plantes dédiées à cette étude ont été
sacrifiées. Les feuilles de chaque rosette ont été individuellement prélevées, disposées côte
à côte sans recouvrement puis photographiées. De manière identique aux surfaces foliaires
projetées, les surfaces foliaires réelles (= totales) ont ensuite été déterminées à partir des
photog aphies a al s es à l’aide du logiciel « image J ».
La biomasse fraîche des rosettes a été déterminée par pesée au centième de gramme
près immédiatement après le sacrifice des plantes. Les plantes arrosées le soir du jour J-1
ont été sacrifiées le matin du jour J entre 6 h et 7 h GMT. La biomasse sèche a été
déterminée après avoir laissé les rosettes au minimum 24 h dans une étuve thermostatée à
60°C.
87
4.2. Caractérisation des pertes en eau des pots, de la teneur et
du contenu relatif en eau (RWC) des rosettes d’Arabidopsis
thaliana
4.2.1. Caractérisation des pertes en eau des pots
Les pertes en eau des pots au cours du stress hydrique ont été déterminées
directement par pesée et à l’aide d’u hu idi
t e.
La pes e jou ali e des pots au ou s du st ess h d i ue pe
e
eau de l’e se
le du s st
et d’esti e les pe tes
e « substrat / plante ». Cette technique permet donc
d’app he de les pe tes e eau dues à l’ vapot a spi atio qui exprime la somme des
pertes en eau du substrat par évaporation et des pertes en eau de la plante par
transpiration. La quantité d'eau perdue quotidiennement par un pot (plante + substrat) est
calculée par soustraction de la masse dudit pot au jour J à la masse de ce même pot au jour
J-1.
Pa all le e t à la pes e des pots, u suivi de l’hu idit
elative du sol a t effe tu
simultanément sur les mêmes pots à l’aide d’u e so de apa itive de type HMS9000 (SDEC
FRANCE®). La méthode capacitive détermine la teneur en eau volumique du sol, elle est
basée sur la relation entre les propriétés diélectriques du sol et la teneur en eau. Cette
relation est obtenue grâce à un étalonnage (Chanzy et al., 1998).
Afi d’app he de les pe tes en eau exclusivement dues à l’ vapo atio au iveau
du sol, ces deux types de mesure ont également été réalisés sur des pots ’a ueilla t pas de
plantes. Les do
sa ha t u’au
es
olt es ’o t fi ale e t pas t utilis es pou deu
o e t du st ess h d i ue les osettes des
aiso s : (i)
ot pes ouvraient également
et totalement la surface des pots, les pertes en eau dues à la seule évaporation au niveau du
sol devaient être sensiblement identiques pour les 3 écotypes étudiés ; (ii) les pertes en eau
d’u e su fa e de su st at totale e t d ouve te e so t pas e s es efl te
elles d’u e
surface toute ou en partie couverte par une rosette proche du sol qui maintient de facto
entre le sol et la face inférieure des feuilles un « micro-climat » davantage humide.
88
4.2.2. Teneur et contenu relatif en eau des rosettes d’Arabidopsis
thaliana
Pour déterminer la teneur en eau des feuilles, les plantes ont été sacrifiées et la
masse fraîche des rosettes pesée entre 6 h et 7 h GMT. Les rosettes ainsi pesées ont ensuite
été séchées 24 h dans une étuve à 60 °C. Après avoir pesé leur matière sèche, la teneur en
eau des rosettes fraîches a été calculée de la façon suivante :
Teneur en eau (%)
Le contenu relatif en eau (Relative Water Content, RWC) est le paramètre le plus
utilis pou
ua tifie l’ tat h d i ue de la pla te (Tardieu et al., 1993; Bouchabke et al.,
2008; Hummel et al., 2010). Il est calculé de la façon suivante :
RWC (%)
La masse fraîche des rosettes a toujours été déterminée le matin entre 6 h et 7 h
GMT. Les osettes so t e suite aig
es da s des o tes e plies d’eau distill e. Les o tes
fermées sont ensuite placées 24 h minimum à l’o s u it et à 4°C. Le lendemain, alors que
les vacuoles sont réputées être toutes turgescentes, les rosettes sont légèrement essorées
de
a i e à li i e l’eau
siduelle o
o te ue da s les tissus puis pes es pou
déterminer leur masse qualifiée de « pleine turgescence ». Ces rosettes sont ensuite placées
24 h minimum da s u e tuve the
ostat e à
°C ava t d’ t e à ouveau pes es. Cette
dernière pesée permet de déterminer la masse de matière sèche.
89
A.
B.
Figure 18. Photographies de l'appareil de mesure de photosynthèse CIRAS-2 (PP Systems,
Hitchin, UK, A), couplé à une pince universelle (PLC6 (U) Automatic leaf cuvettes,
PP Systems, Hitchin, UK, B). L'appareil est placé en phytotron afin de réaliser des mesures
de photosynthèse en condition de déficit de pression de vapeur (VPD) constant.
4.3. Caractérisation de l’activité photosynthétique foliaire :
mesures d’échanges gazeux et de fluorescence
chlorophyllienne
L’a tivit photos th ti ue foliai e d’Arabidopsis thaliana a t
d’u appa eil de
a a t is e à l’aide
souve t ualifi d’IRGA pour Infra-Red Gaz
Analyser) de type CIRAS-2 (PP Systems, Hitchin, UK) couplé à un module de fluorescence de
type CFM (Chlorophyll Fluorescence Module, PP Systems, Hitchin, UK) (Figure 18.A). Les
esu es se fo t à l’aide d’u e pince de type PLC [Parkinson Leaf Chamber, PLC6(U)
Automatic leaf cuvette, PP Systems, Hitchin, UK] (Figure 18.B) qui intègre une chambre de
esu e i ulai e d’u e su fa e de 2,5 cm², des joints en mousse évitent de trop contraindre
la feuille « pincée » et assu e t l’ ta h it de la uvette (Figure 19). Cette chambre de
mesure est suffisamment petite pour permettre des mesures individuelles de feuilles
atu es
ha tillo
es su les
ot pes d’Arabidopsis thaliana choisis (Figure 19). Peu
d’ tudes photos th ti ues o t t jus u’alo s
alis es su des feuilles i dividuelles, la
majorité de celles effectués sur Arabidopsis thaliana l’a a t t à l’aide d’u e ha
re
accueillant la plante entière.
À partir de l'interface de commande présente sur le CIRAS-2, la concentration en CO2,
la densité de flux de photons, la température de la feuille et l'humidité relative à l'intérieur
de la chambre de mesure peuvent être précisément déterminées. La différence de
concentration de CO2 et d'humidité entre l'entrée et la sortie de la chambre de mesure est
mesurée par l'analyseur à infrarouge (IRGA). De plus la pince est munie d'un capteur à
Infrarouge (IR) pour mesurer la température à l'intérieur de la chambre et d'un capteur de
PAR pour mesurer la densité de flux de photons incidente dans la chambre de mesure. De
ces paramètres mesurés, l'appareil calcul l'assimilation nette de CO2 (AN), le taux de
transpiration (E), la conductance stomatique (gs) ainsi que la concentration interne en CO2
(Ci) d'après le modèle de Farquhar (Farquhar et al., 1980; Caemmerer et Farquhar, 1981;
Farquhar et al., 2001; Sharkey et al., 2007).
90
Figure 19. Photographies de la pince [PLC6 (U) Automatic leaf cuvette, PP Systems, Hitchin,
UK)] avec une feuille d'Arabidopsis thaliana (Col-0) recouvrant la totalité de la surface de
la chambre de mesure.
Figure 20. Schéma simplifié du système de mesure des échanges gazeux qualifié d'ouvert.
À l'inverse d'un système fermé, l'atmosphère à l'intérieur de la chambre de mesure est
renouvelée pendant les mesures. Un flux d'air nouveau passe continuellement à travers la
chambre de mesure afin de maintenir la concentration en CO 2 constante. L'air ambiant
entre dans l'appareil où il est privé dans un premier temps de son CO2 par un piège à CO2
de type "Soda lime" puis de sa vapeur d'eau grâce à un dessiccateur de type "Envirogel".
L'air est ensuite enrichi précisément en CO2 selon la concentration déterminée par
l'opérateur.
4.3.1. Caractérisation des échanges gazeux instantanés
4.3.1.1.Principe
L'appa eil de
esu e d’ ha ges gazeu utilisé est qualifié de système de mesure
ouvert. Dans un système ouvert, l'air qui passe à travers la chambre de mesure contenant la
feuille est continuellement renouvelé pour maintenir à l'intérieur de la chambre une
concentration en CO2 stable. Comme l'atmosphère à l'intérieur de la chambre est
systématiquement renouvelée, les mesures ne sont pas affectées par d'éventuelles fuites et
par les phénomènes d'adsorption et d'absorption par les matériaux du système, à l'inverse
d'un système fermé où la même atmosphère circule en permanence dans la chambre de
mesure.
L'air ambiant entre dans le système et passe dans un premier à travers un
dessiccateur et un piège à CO2, l'air ainsi dépourvu en CO2 peut être enrichi précisément en
CO2 à la concentration déterminée par l'utilisateur à l'aide d'une cartouche de CO2 et d'un
régulateur (Figure 20). L'air circule ensuite à travers 2 circuits différents, dans le premier
circuit l'air passe dans une cellule de référence de l'analyseur à infrarouge afin de mesurer
les paramètres à l'entrée de la chambre de mesure. Dans le second circuit l'air passe dans la
chambre de la pince contenant la feuille avant de revenir dans la cellule de mesure de
l'analyseur de gaz pour déterminer la concentration en CO2 et l'humidité à la sortie de la
chambre de mesure.
L’assi ilatio
l’ai
ette de CO2 est calculée à partir de la différence de concentration en CO2 de
i ula t e t e l’e t e (cellule "référence") et la sortie de la chambre (cellule "chambre
de mesure") :
A = (CO2 entrée - CO2 sortie) X Q
(Q = débit dans la chambre)
91
La mesure de la concentration en CO2 et de l'humidité epose su la apa it
u’o t
presque tous les gaz (à l'exception des gaz monoatomique et diatomique constitués de deux
ato es ide ti ues à a so e de faço sp ifi ue e tai es lo gueu s d’o de o stitutives
des infrarouges proches et lointains. Les lo gueu s d’o de a so
a so
es pa la vapeu d’eau il o vie t do
es pa le CO2 étant aussi
de soust ai e l’a so ptio de la vapeu d’eau
pour pouvoir mesurer efficacement avec justesse la concentration en CO2.
Dans les systèmes de dosage de type IRGA, lorsqu'un faisceau infrarouge d'intensité
(I0) traverse une cellule de longueur (I) remplie d'un mélange gazeux contenant un gaz (G)
absorbant et de concentration moléculaire (C), il possède en sortie une intensité restante I
égale à :
ε
(Selon la loi de Beer-Lambert)
Ɛ = coefficient d'absorption pour une longueur d'onde donnée
L'analyseur utilise deux sources infrarouges placées au centre de deux réflecteurs qui
émettent deux faisceaux identiques : l'un à travers une cellule d'analyse et l'autre à travers
une cellule de référence étanche remplie d'un gaz non absorbant (Figure 20).
92
Tableau 3. Paramètres mesurés par l'appareil de mesure de photosynthèse (CIRAS-2,
PP Systems) permettant le calcul du taux de transpiration (E) de la conductance
stomatique (gs), de l'assimilation nette de CO2 (AN) et de la concentration interne en CO2
(Parkinson et al., 1980; Caemmerer et Farquhar, 1981).
Paramètre
Définition
Unité
Cin
Concentration en CO2 de l'air dans la chambre
µmol.mol-1
Cout
Concentration en CO2 de l'air à la sortie de la chambre
µmol.mol-1
ein
Déficit de pression de vapeur dans la chambre
bar
eleaf
Pression de vapeur saturante à la température de la feuille
bar
eout
Déficit de pression de vapeur à la sortie de la chambre
bar
P
Pression atmosphérique
bar
rb
Résistance de la couche limite à la vapeur d'eau
m².s.mol-1
rs
Résistance stomatique à la vapeur d'eau
m².s.mol-1
W
Débit d'air par unité de surface foliaire
mol.m-2.s-1
Equations utilisées par le CIRAS-2 [(PP Systems, Hitchin, UK) (Parkinson et al., 1980;
Caemmerer et Farquhar, 1981) (Tableau 3)] pour calculer :
Le taux de transpiration (E) :
La conductance stomatique (gs) à partir de la résistance stomatique (Rs) :
L'assimilation nette (AN) :
La concentration interne en CO2 (Ci) :
Avec :
93
Figure 21. Protocole de mesure instantanée des échanges gazeux. Toute prise de mesure
d'échanges gazeux est précédée d'une période d'adaptation de 5 min à l'obscurité puis
après le flash de lumière saturante, d'une période de récupération (5 min) et enfin d'une
période de stabilisation (5 min) afin de permettre l'adaptation des feuilles étudiées aux
conditions fixées à l'intérieur de la pince.
4.3.1.2.Mode opératoire
La conductance stomatique (gs , l’assi ilatio
ette de CO2 (AN), la transpiration (E)
et la concentration interne en CO2 (Ci) ont été mesurées sur des feuilles matures
d’Arabidopsis thaliana qui présentaient toutes des surfaces suffisamment importantes pour
auto ise l’utilisatio de la pi e dot e d’u e ha
e de
esu e de 2,5 cm². Le débit de l'air
circulant à l'intérieur de la chambre est fixé à 200 mL.min -1. La prise de mesure est effectuée
selon le protocole présenté sur la Figure 21. Les mesures sont réalisées après une période de
récupération de 5 min de l'obscurité et du flash lumineux et une période de stabilisation des
échanges gazeux de 5 min. Chaque paramètre déterminé représente la moyenne de 10
prises de mesure réalisées toutes les 10 s.
La lumière et la concentration en CO2 peuve t
odifie l’ouve tu e des stomates et
donc les échanges gazeux. Les fortes concentrations en CO2 induisent la fermeture des
stomates alors que les faibles concentrations activent l'ouverture des stomates (Farquhar et
Sharkey, 1982). La lumière active l'ouverture des stomates mais si l'intensité lumineuse est
trop élevée elle peut induire des phénomènes de photo-inhibition (Kim et al., 2010). Pour
comparer les résultats obtenus sur différents essais, les données instantanées de
photosynthèse ont été mesurées à une concentration en CO2 de 380 ppm qui correspond à
la concentration atmosphérique actuelle (Sage et Coleman, 2001; Pachauri et Reisinger,
2007). Les mesures ont été réalisées à une intensité lumineuse constante de
800 µmol.m-2.s-1, sachant qu'à concentration ambiante en CO2 (380 ppm) la saturation
lumineuse est obtenue pour une densité de flux de photons de 600 µmol.m-2.s-1 (Eckardt et
al., 1997). L'éclairement saturant dépend de l'éclairement reçu par la plante durant sa
période de croissance (Powles et Critchley, 1980), or dans la chambre de culture l'intensité
lumineuse était relativement faible car comprise entre 60 et 100 µmol.m-2.s-1.
94
Figure 22. Protocole expérimental d'acquisition des courbes de réponse au CO 2. Les
mesures débutent avec une concentration en CO2 de référence de 380 ppm
pour
décroitre jusqu'à atteindre 0 ppm
. La concentration en CO2 à l'intérieur de la chambre
est ensuite ramenée à 380 ppm
, avant d'atteindre 1600 ppm
.
Figure 23. Ajustement des courbes AN/Cc selon le modèle de Farquhar (Sharkey et al.,
2007). L'assimilation nette est limitée par les propriétés cinétiques de la Rubisco (Vcmax), la
régénération du RuBP (Jmax) et la vitesse d'utilisation des trioses-phosphate (TPU). Les
points bleus représentent des valeurs obtenues pour Col-0 à 47 JAL.
De plus pour certains génotypes d'Arabidopsis thaliana les premiers phénomènes de
photo-inhibition seraient déjà observés sous un éclairement de 800 µmol.m-2.s-1 (Myriam
Dauzat, Communication Personnelle).
Si la température et la concentration en CO2 peuvent être réglées précisément dans
la chambre de mesure, l'appareil ne peut réguler l'humidité de la chambre au delà de celle
de l'air ambiant où se déroulent les mesures. L'humidité peut être réglée selon un
pourcentage de l'humidité de l'air ambiant. C'est pourquoi, toutes les mesures ont été
effe tu es à l’i t ieu du ph tot o de
a i e à pouvoi t availle ave u d fi it de
pression de vapeur (VPD), qui est fonction de la température et de l'humidité dans la
chambre, constant compris entre 0,8 et 1 KPa. Les résultats ainsi o te us ’e p i e t donc
pas des variations de la conductance stomatique liées à des fluctuations de températures
(Cornic et Ghashghaie, 1991) ou de VPD (Grantz et Zeiger, 1986; Will et Teskey, 1997)
pendant la prise de mesure.
4.3.2. Réponse de l'assimilation nette à l’augmentation de la
concentration interne en CO2
4.3.2.1.Principe
L'évolution de l'assimilation nette en CO2 en réponse à des concentrations
croissantes en CO2 interne (Courbe AN/Ci) est obtenue en mesurant l'assimilation nette à 12
paliers différents de concentration en CO2 à l'intérieur de la chambre de mesure (Figure 22).
L’i te p tatio
des ou es AN/Ci repose sur le modèle de photosynthèse foliaire de
Farquhar (Farquhar et al., 1980), modèle basé sur les propriétés cinétiques de la Rubisco
décrites selon le formalisme de Michaelis-Menten (Farquhar et al., 1980; Caemmerer et
Farquhar, 1981). De plus à partir des courbes AN/Ci, les limitations stomatiques (Ls) et
métaboliques (Lm) sur l'assimilation peuvent être calculées (Jacob et Lawlor, 1991; Lawlor,
2002).
95
Tableau 4. Paramètres utilisés par la méthode d'ajustement proposée par Sharkey et al.
(2007). Ces paramètres permettent d'ajuster à partir des courbes A N/Ci la Vcmax, la Jmax, la
TPU, la Rd et la gm à une température foliaire de 25°C.
Paramètre
Définition
Valeur
O
P essio pa tielle d’O2 dans le mésophylle
21 kPa
Kc (25°C)
Constante de Michaelis de la carboxylation
27,238 Pa
ΔHa Kc)
E e gie d’a tivatio de la a o latio
80,99 Pa
Ko (25°C)
Γ*
Co sta te de Mi haelis de l’o g
atio
Point de compensation de la photorespiration
16,582 kPa
3,743 Pa
La
thode d’ajuste e t utilis e est elle p opos e pa Sharkey et al. (2007).
L’utilisatio de ette
at i e http://www.blackwellpublishing.com/plantsci/pcecalculation/)
permet de déterminer à partir des courbes AN/Ci, la vitesse maximale de carboxylation du
RuBP par la Rubisco (Vcmax , la de sit
a i ale de flu d’ le t o s photos th ti ues Jmax),
la vitesse d'utilisation des trioses-phosphate (TPU), la respiration mitochondriale diurne (Rd)
et la conductance mésophyllienne (gm) ajustées à une température foliaire de 25°C
(Figure 23 et Tableau 4).
Equations permettant d'ajuster le calcul de l'assimilation nette (AN) selon qu'elle soit
limitée par la Rubisco (Vcmax), par la régénération du RuBP (Jmax) ou par la vitesse
d'utilisation des trioses-phosphate (TPU) (Sharkey et al., 2007) :
Avec
96
Calcul des limitations stomatiques et métaboliques à partir des courbes A N/Ci
À partir des courbes AN/Ci certains auteurs ont proposé des calculs pour déterminer
l'importance des limitations stomatiques (Ls) et métaboliques (Lm) sur l'assimilation nette
pendant un déficit hydrique (Jacob et Lawlor, 1991; Lawlor, 2002; Tezara et al., 2002; Tezara
et al., 2003).
Limitation stomatique (Ls) % = [(AN'-AN)/AN'] x 100
Avec AN = assimilation nette à une concentration en CO2 de 380 ppm dans la chambre de
mesure.
Et AN' = assimilation nette à une concentration interne en CO2 de 380 ppm.
Limitation métabolique (Lm) % = [(AT-AS)/AT]x 100
Avec AT, l'assimilation nette des plantes témoins à une concentration interne en CO 2 de
800 ppm.
Et AS, l'assimilation nette des plantes stressées à une concentration interne en CO 2 de
800 ppm.
97
Pour réaliser les courbes AN/Ci, les mesures de l'assimilation nette et de la
concentration interne en CO2 sont réalisées à 12 paliers de concentrations en CO2 différents
(Figure 22). Le premier palier de mesure est caractérisé par une concentration en CO2 dans
la chambre de 380 ppm, les mesures suivantes se font, selon des concentrations
décroissantes en CO2 jusqu'à atteindre 0 ppm, afin de suivre l'assimilation nette de CO2 dans
le sens de l'ouverture des stomates. Après avoir atteint le palier de concentration en CO 2
nulle, les mesures reprennent à 380 ppm est suivent cette fois des concentrations
croissantes en CO2 jusqu'à atteindre 1600 ppm pour le dernier palier (Bernacchi et al., 2002;
Warren et Dreyer, 2006; Flexas et al., 2007; Bagard et al., 2008; Munekage et al., 2008). Si la
concentration en CO2 dans la chambre de mesure change à chaque palier, la densité de flux
de photons est fixée à 800 µmol.m-2.s-1, le débit de l'air à 200 mL.s-1 et le VPD à des valeurs
comprises entre 0,8 et 1 KPa. Un temps de stabilisation de la concentration en CO2 à
l'intérieur de la chambre de 5 min et d'adaptation de la feuille aux nouvelles conditions de
5 min supplémentaires sont nécessaires avant chaque prise de mesure. La prise de mesure
représente la moyenne de 10 enregistrements réalisés toutes les 10 s.
98
Figure 24. Variation de la fluorescence modulée en fonction du temps sur une feuille
intacte après une période d'adaptation à l'obscurité. F0 est le rendement de fluorescence
en présence de lumière modulée de très faible intensité et Fm est obtenu par l'envoi d'un
éclair de longue durée et de forte intensité fermant tous les centres PSII. Sous éclairement,
des éclairs saturants peuvent être appliqués sur la feuille fermant ainsi 100 % des centres
pour déterminer le rendement maximal de fluorescence F'm.
4.3.3. Mesure de la fluorescence chlorophyllienne
4.3.3.1.Principe
La lu i e a so
e pa
l’appa eil photos th ti ue
’est pas totale e t
transformée en énergie photochimique (P) c'est à dire en flux d'électrons à l'intérieur de la
chaîne d'oxydoréduction des thylacoïdes permettant la réduction du NADP+ en NADPH,H+ et
la photophosphorylation, u e pa tie de l’
e gie est e effet pe due/dissip e sous fo
e de
chaleur (H) et de fluorescence (F).
P+H+F=1
À te p atu e o di ai e, l’
esse tielle e t de l’a te
issio
de fluo es e e
e olle t i e du photos st
hlo oph llie
e p ovie t
e II do t le œu est o stitu pa
un dimère de chlorophylles a nommé P680. Le photosystème II existe sous deux états
fluorescents : peu fluo es e t à l’ tat ouve t et fo te e t fluo es e t à l’ tat fe
fluorescence de l’ tat ouve t o espo d à la fai le
les a te
issio li e au t a sfe t d’e ito s da s
es. L’e itatio p ovo u e pa les photo s da s les a te
résonance de pigments e pig e ts, jus u’au e t e
est
ise sous fo
a tio
o
e de
e de haleu et de fluo es e e. Da s l’ tat fe
haleu et de fluo es e e
ale e t t a sfo
u p e ie te ps
ui e de t
es est transmise par
el ; l’e itatio
dans le centre réactionnel du PSII conduit à une réémissio de l’
fo
. La
o t a s ise
, l’a iv e d’u e ito
e gie o utilis e sous
o pte de la
ua tit
d’
e gie
e pa l’a tivit photo hi i ue (Govindje, 1995). La feuille est dans
ai te ue à l’o s u it afi
ue tous les centres soient ouverts, puis elle
est éclairée par une lumière modulée de très faible intensité. La fluorescence augmente
jusqu'au niveau F0 , niveau auquel le rendement de fluorescence est minimal, la fluorescence
ainsi détectée correspond à 100 % de centres ouverts car la probabilité pour un photon de
lumière modulée de trouver des centres fermés est négligeable (Figure 24). Un flash de
lumière saturante est appliqué ensuite sur la feuille pendant 0,5 à 1 seconde. Ce flash a la
capacité de fermer tous les centres du PSII. L’
issio de fluo es e e
esu e attei t so
maximum Fm, avant de diminuer rapidement au niveau F0. La plastoquinone A oxydée
(PQA oxydé) est responsable du caractère ouvert du PSII, elle est qualifiée de composé
extincteur ou « quencheur » de fluorescence.
99
Le quenching o espo d à l’e ti tio
de fluo es e e pa
fluo es e t o se v lo s ue les e t es so t fe
appo t à l’ tat fo te e t
s. L’ lai age de la feuille ave u e
lumière actinique provoque une augmentation apide de l’
issio de fluo es e e suivie
de sa diminution vers une valeur stationnaire Fs, supérieure à F0 du fait de la fe
etu e d’u
certain nombre de centres. Des éclairs saturants peuvent être appliqués sur la feuille
fermant 100 % des centres pour déterminer le rendement maximal de fluorescence sous
lai e e t appel F’m Le ’ sig ifie ue la
esu e a t
d’ lai e e t . La valeu Fm' est toujours inférieur au Fm, ela
alis e pe da t une période
et e
vide e l’e iste e
d’u quenching non-photochimique, NPQ.
La différence de fluorescence Fm- F0 est appelée fluorescence variable, Fv.
Calcul des différents paramètres déterminés par fluorescence :
La mesure de la fluorescence chlorophyllienne peut donner des informations sur la
photo hi ie et la dissipatio
ph
o
es e t e t e
d’
e gie sous fo
e de
haleu , e
effet ces trois
o p titio pou l’utilisatio de l’énergie d'excitation reçue par les
chlorophylles (Maxwell et Johnson, 2000). Cette elatio peut s’
i e:
P+H+F=1
Lo s ue l’i te sit lu i euse aug e te, P di i ue alo s ue H et F augmente, si la plante
est soumise à une lumière saturante, H et F atteignent leur valeur maximale et P devient
nulle :
Hm + Fm + 0 = 1
Hm = 1 - Fm
Le appo t e t e la dissipatio de l’
e gie sous fo
e de haleu ou de
issio de
fluorescence est constant.
100
La photochimie peut donc être quantifiée par la relation suivante :
Estimation du rendement quantique de la photochimie du PSII (Genty et al., 1989), ΦPSII,
sous éclairement
Φ
Chez les pla tes ie adapt es à l’o s u it , la valeu de ΦPSII est comprise entre 0,83
et 0,8. Il existe une forte corrélation entre le ΦPSII et l’effi a it de l’assi ilatio du CO2
(Maxwell et Johnson, 2000).
D te
i atio du flu total d’ le t o s dans la chaîne photosynthétique (JT), à partir du
rendement quantique du PSII
α
JT
Le rendement quantique de la photochimie du PSII est multiplié par la moitié du flux
quantique arrivant sur la feuille,
, e effet l’aut e
oiti
ta t a so
e pa le PSI. Le
tout est multiplié par la fraction de lumière absorbée par la feuille, α, dont la valeur
moyenne observée dans la plupart des cas est de 0,84 pour Col-0 (Niyogi et al., 1998;
Munekage et al., 2008). L'appareil de photosynthèse mesure une valeur d'ETR incomplète
sans unité car le coefficient d'absorption de la feuille n'est pas mesuré par l'appareil.
L'utilisateur se doit de mesurer à part ce coefficient pour pouvoir calculer le flux total
d’ le t o s dans la chaîne photosynthétique (JT).
Détermination du rendement quantique maximum de la réaction de photochimique
du PSII, Fv/Fm
Ce rapport est au maximum de 0,83 chez les plantes supérieures chez lesquelles le
PSII ’a pas su i d’alt atio . La ua tit
a i ale d’ le t o s
ise pa u
e t e du PSII
ayant reçu un exciton est de 0,83 électron (Maxwell et Johnson, 2000).
101
Estimation
de
la
concentration
relative
des
centres
ouverts,
le
quenching
photochimique, qP
Le quenching photochimique est une estimation de la capacité du PSII à atténuer la
fluorescence par la photochimie (qP), en effet cette capacité est liée à la concentration des
e t es ouve ts sus epti les d’a epte l’e itation. À l’o s u it
P est gal à 1, reflétant
ainsi l'ouverture de la totalité des centres réactionnels du PSII.
Estimation du quenching non-photochimique, NPQ
Lo s u’u
lai e e t
o ti u est fou i pe da t u e p iode p olo g e, u
gradient transmembranaire de p oto s s’ ta lit da s les thylacoïdes, entre le lumen et le
stroma. Ce gradient est utilis pou la s th se d’ATP da s le st o a des hlo oplastes. Les
pH as e o t s da s le lu e aug e te t la d pe ditio d’
e gie e ito i ue au iveau
des antennes du PSII sous forme de chaleur, il en résulte une diminution de la capacité à
expulser des électrons par les centres réactionnels du PSII. Le rendement quantique de la
fou itu e d’ le t o s pa la
a tio
photo hi i ue hute (Saccardy et al., 1998). Ce
phénomène se traduit par une extinction de la fluorescence des centres fermés ou ouverts.
102
Figure 25. Protocole de mesure instantanée des échanges gazeux et de la fluorescence
chlorophyllienne. Toute prise de mesure d'échanges gazeux couplée avec des mesures de
fluorescence est effectuée sur des plantes adaptées à l'obscurité. Ces mesures sont
précédées d'une période d'adaptation (5 min) à l'obscurité dans la chambre de mesure.
Après le flash de lumière saturante permettant le calcule du Fv/Fm, une période de
récupération (5 min) et de stabilisation (5 min) assure l'adaptation des feuilles étudiées
aux conditions fixées à l'intérieur de la pince.
La fluorescence chlorophyllienne a été mesurée in vivo au
o e d’u s st
e de
esu e d’ ha ges gazeux couplé à un fluorimètre « Chlorophyll Fluorescence Module »
(CFM, PP Systems, Hitchin, UK). Les mesures de fluorescence sont couplées aux mesures
d’ ha ges gazeu à la lev e Figure 25). Pour cela les plantes étudiées sont adaptées à
l'obscurité sur toute une nuit en plus des 5 min d'adaptation à l'intérieur de la pince. Les
mesures sont réalisées après une période de récupération de 5 min de l'obscurité et du flash
lumineux et une période de stabilisation des échanges gazeux de 5 min. Chaque mesure
représente la moyenne de 10 enregistrements réalisés toutes les 10 s.
103
4.4. Quantification des chlorophylles foliaires totales
4.4.1. Estimation de la teneur relative en chlorophylles exprimée en
unité arbitraire (SPAD)
La teneur relative en chlorophylles totales des feuilles est déterminée de façon non
dest u tive à l’aide d’u chlorophylle-mètre SPAD-502 (Konica-Minolta® Camera Co., Osaka,
Japan). Cet appareil mesure la transmittance des feuilles à deux longueurs d'ondes à l’aide
de deux LED. Une première LED rayonne dans le rouge (650 nm), zone dans laquelle
l’a so a e des hlo oph lles est lev e et o affe t e pa l’a so a e des a ot
seconde LED é et u
a o
es. La
e e t da s l’i f arouge (940 nm), à cette longueur d'onde
l'absorption de la lumière émise est due uniquement aux pigments non chlorophylliens et
aux caractéristiques de la structure foliaire. Après une calibration effectuée « à vide » pour
déterminer une mesure de référence à 100 % de transmission, l'appareil calcule un
indice «SPAD » selon l'équation suivante (Markwell et al., 1995) :
Avec І650 et І940, les intensités lumineuses émises (ou intensités incidentes) par les deux LED à
650 et 940 nm et I'650 et I'940, les intensités transmises (ou intensités sortantes) par la feuille
à ces 2 longueurs d'ondes.
Pour déterminer la teneur moyenne en chlorophylles totales (a et b) d’u e feuille, 4
esu es
pa ties su l’e semble de son limbe ont été effectuées.
4.4.2. Conversion des unités arbitraires (SPAD) en microgramme de
chlorophylles totales par milligrammes de matière fraîche.
Pour pouvoir convertir, chez Arabidopsis thaliana, les unités arbitraires SPAD en µg
de chlorophylles totales par mg de feuille fraîche, une gamme étalon a été élaborée à partir
de 100 feuilles analysées individuellement. Afin de couvrir une gamme de teneurs en
chlorophylles qui soit la plus large possible, des feuilles plus ou moins matures issues de
pla ts d’âges diff e ts o t t a al s es. Ces feuilles ont été échantillonnées sur les 8
écotypes étudiés.
104
La teneur relative moyenne en chlorophylles (exprimée en unité arbitraire SPAD) de
ha ue feuille a da s u p e ie te ps t d te
i
e à l’aide du hlo oph lle-mètre
SPAD-502. La valeur SPAD retenue est une moyenne de 4 mesures
pa ties su l’e se
le
du limbe. La feuille a ensuite été récoltée et pesée. Ses chlorophylles ont été extraites et
quantifiées selon la méthode décrite par Arnon (1949) et Eun-Deok et al. (2009) d’ap s
Mackinney (1941). Le matériel végétal est broyé en présence d’azote li uide da s u
à l’aide d’u pilo . La poud e est e suite mélangée ave
est agité pe da t
L d’a to e à
o tie
%. Le mélange
i à l’o s u it puis e t ifug à 1600 g pendant 15 min à 4°C. Le
surnageant est récupéré et o se v à l’o s u it . Le culot est à nouveau ré-extrait suivant la
procédure décrite ci-dessus et le second surnageant obtenu est rajouté au premier. La
solution de chlorophylles est homogénéisée et son absorbance est déterminée par
spectrophotométrie à 645 et 663 nm.
Les teneurs en chlorophylles a, b et totales sont calculées à l’aide de la fo
ule
établie par Mackinney (1941) :
V : volu e d’e t a tio e
L
W : masse fraîche de l’ ha tillo e g
C : teneur en chlorophylles en mg/g
105
4.5. Analyse de l’expression des gènes par macro-array
4.5.1. Extraction des ARN
Les ARN totaux des feuilles matures des rosettes sont extraits selon la technique de
Kay et al. (1987). Le matériel végétal (
1 g), conservé à -
°C, est
o
da s de l’azote
liquide. Pour chaque échantillon, 2,5 volumes de tampon REB (25 mM TrisHCL ph8, 25 mM
EDTA, 75 mM NaCl, 1 % SDS, 1M β-Mercaptoethanol), un volume de phénol-chloroforme
(v/v) so t ajout s afi d’ li i e les pol sa ha ides et les p ot i es, puis
la g s. Le
mélange est centrifugé à 6000 g pendant 15 min à 4°C. Le surnageant est prélevé puis
transféré dans un tube propre. Un volume de chloroforme équivalent au volume de REB est
ajout au su agea t afi d’ li i e les p ot i es esta tes, le tout est ensuite centrifugé à
6000 g pendant 15 min à 4°C et le surnageant est récupéré. Une première précipitation des
ARN est réalisée en mélangeant le surnageant avec un volume de LiCl (1M) à 4°C toute la
nuit. Après centrifugation (13000 g pendant 30 min à 4°C) le surnageant est retiré et le culot
est repris da s u
volu e d’H2O ultra pure. Une seconde précipitation est réalisée en
ajoutant deu volu es d’ tha ol
° et un volume d’a tate de sodiu
M, pH ,
une
heure à -20°C. Après centrifugation du mélange, 20000 g pendant 5 min à 4°C, le culot est
lav à l’ tha ol
°. Après une dernière centrifugation (20000 g pendant 5 min à 4°C) et
prélèvement du surnageant, le ulot est s h pe da t
i ava t d’ t e esuspe du da s
µL d’eau ult a pu e st ile.
Le dosage des ARN s’effe tue pa spe t o
t ie, l'a so a e est
esu e à
3 longueurs d'ondes : 260, 280 et 320 nm. La concentration en acides nucléiques est
obtenue par la formule :
Concentration (µg/mL) = (A260nm-A320nm) x R x facteur de dilution
Pour une unité de DO, R correspond à 40 µg/mL
L'absorbance à 280 nm permet de déceler La présence d'éventuels contaminants. Le degré
de pureté de chaque échantillon est estimé par le rapport A 260/A280, ce rapport doit être
compris entre 1,8 et 2,1.
106
Tableau 5. Liste complète des sondes et de leur numéro d'accession dans les bases de
données génomiques utilisées pour les macro-arrays. Parmi les 7 familles de transporteurs
de sucres d'Arabidopsis thaliana, seuls les AtSUC (Transporteurs de Saccharose), AtSTP
(Sugar Transport Protein) et AtPLT/AtPMT (transporteur de polyols) sont étudiés. Les
sondes correspondantes aux 2 gènes de ménage sont aussi présentées.
AtSTP
AtSUC
AtPLT/AtPMT
Nom
Locus
Nom
Locus
Nom
Locus
AtSTP1
AT1G11260
AtSUC1
AT1G71880
AtPLT1/AtPMT1
AT2G16120
AtSTP2
AT1G07340
AtSUC2
AT1G22710
AtPLT2/AtPMT2
AT2G16130
AtSTP3
AT5G61520
AtSUC3
AT2G02860
AtPLT3/AtPMT3
AT2G18480
AtSTP4
AT3G19930
AtSUC4
AT1G09960
AtPLT4/AtPMT4
AT2G20780
AtSTP5
AT1G34580
AtSUC5
AT1G71890
AtPLT5/AtPMT5
AT3G18830
AtSTP6
AT3G05960
AtSUC6
AT5G43610
AtPLT6/AtPMT6
AT4G36670
AtSTP7
AT4G02050
AtSUC7
AT1G66570
AtSTP8
AT5G26250
AtSUC8
AT2G14670
AtSTP9
AT1G50310
AtSUC9
AT5G06170
AtSTP10
AT3G19940
AtSTP11
AT5G23270
Gènes de ménage
AtSTP12
AT4G21480
Nom
Locus
AtSTP13
AT5G26340
Actine 11
At3G12110
AtSTP14
AT1G77210
Histone H4
At2G28740
4.5.2. Traitement des ARN à la DNase et purification des ARN totaux
L'ADN génomique contaminant éventuellement extrait en même temps que les ARN
totaux est éliminé en utilisant le kit RNase free DNase selon les instructions fournies par le
fabriquant (Qiagen). Les ARN sont mélangés avec de la DNase I (0,75 U/µL, Qiagen) et 10 µL
de tampon RDD (Qiagen). L'hydrolyse s’effe tue pe da t
i à
°C. Après traitement
par la DNase, le volume des échantillons traités est ramené à 100 µL puis ceux-ci sont
purifiés à l’aide du kit RNeas
RNA lea up kit, Qiagen) selon les recommandations du
fournisseur. Au
µL d’eau e e pte de RNases so t ajoutés 350 µL de tampon RLT et
250 µL d’ tha ol à
° so t additio
s. L’e se
le est
la g puis t a sf
su
i i
colonne RNeasy et centrifugé à 15000 g, pendant 15 sec, à 20°C. Ensuite 500 µL de
tampon RPE sont ajoutés sur la colonne avant une nouvelle centrifugation 15000 g, pendant
15 sec, à 20°C. La même opération est renouvelée mais avec une centrifugation plus longue
(15000 g, pendant 2 min, à 20°C). Les ARN retenus sur la colonne de purification sont élués
ave
µL d’eau ult a pu e st ile.
4.5.3. Vérification de l’intégrité des ARN
L’i t g it des ARN et l’ho og
it des dosages réalisés au spectromètre sont
vérifiées par élect opho se su gel d’aga ose à
%
/v) dans du tampon TAE (Tris-acétate
40 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) avec du b o u e d’ thidiu
BET, 0,5 µg/mL) ajouté au gel afin
de visualiser les ARN sous UV. Les d pôts so t o stitu s d’u
i og a
e d’ARN, d’u
microlitre de tampon de charge (SmartLadder, Eurogentec) et d'eau. Les ARN végétaux non
dégradés montrent un profil caractéristique comprenant 2 bandes correspondant aux ARN
ribosomiques 18S et 25S.
107
4.5.4. Analyse de l’expression par macro-arrays
Des travaux réalisés précédemment au laboratoire ont permis la réalisation d'un filtre
thématique « transporteur de sucre» (macro-array) comportant les fragments d'ADNc
codant les 14 gènes de transporteurs d'hexoses de la famille des AtSTP, dont 8 sont des
fragments de petite taille (courtes séquences d'ADNc) correspondant aux zones les moins
conservées (inspirées des puces microarray CATMA de l'INRA de Versailles), les 9 gènes de
transporteurs de saccharose AtSUC ainsi que 6 gènes de transporteurs de polyols AtPLT
d'Arabidopsis thaliana (Tableau 5). De plus 2 séquences de gènes de ménage, l'histone
(HIS4) (Valerio et al., 2004; Passardi et al., 2007) et l'actine (ACT11) (Becker et al., 2006; Dai
et al., 2007) ont été ajoutés sur la membrane lors de l'analyse des expressions.
4.5.4.1.Production des sondes d'Arabidopsis thaliana
Chaque fragment de gène codant pour un transporteur de sucre chez Arabidopsis
thaliana étudié a été inséré dans des plasmides bactériens pGem®-T Easy (Promega), puis
amplifié et stocké au congélateur à -80°C. Chaque bactérie est mise en culture dans 3 mL de
LB
g de t pto e, g d’e t ait de levures, 5g NaCl, NaOH pH 7,0 et
µL d’a pi illi e pa
mL de LB) puis sont agités à 37°C toute la nuit.
4.5.4.2.Extraction d’ADN plasmidique
Des extractions d’ADN plas idi ue des sou hes E.coli sont réalisées grâce au kit
Miniprep Express (Q-Bioge
à pa ti d’ ,
L de culture de bactéries. Après centrifugation
4000 g, pendant 2 min, les bactéries sont remises en suspension dans 100 µL de solution I
(glucose 50 mM, EDTA 10 mM, Tris HCl pH 8.0 25 mM), puis 200 µL de solution II
(NaOH 10 N, SDS 20 %) sont ajoutés. La solution est homogénéisée par inversion. Enfin
150 µL de solution III (Acétate de sodium 5 M, Acide acétique glacial, pH 4,8-5,8) sont
additionnés au mélange. Après une centrifugation 15000 g, pendant 3 min le surnageant est
transféré dans un tube propre, dans lequel 400 µL de « Miniprep express Matrix »
(Q-Biogen) sont ajoutés. Le mélange est ensuite centrifugé à 15000 g pendant 2 min.
108
Tableau 6. Plan de dépôt des différentes sondes de transporteurs de sucres et de gènes de
ménage déposés sur les membranes de macro-array.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
AtSTP9
AtSUC3
AtPLT5
AtSTP1
AtSTP9
AtSUC3
AtPLT5
AtSTP1
AtSTP9
AtSUC3
AtPLT5
B AtSTP2 AtSTP10 AtSUC4
AtPLT6
AtSTP2 AtSTP10 AtSUC4
AtPLT6
AtPLT6
C AtSTP3 AtSTP11 AtSUC5
Actine
Actine
Actine
A AtSTP1
D AtSTP4 AtSTP12 AtSUC8 Histone
AtSTP4 AtSTP12 AtSUC8 Histone
AtSTP4 AtSTP12 AtSUC8 Histone
E AtSTP5 AtSTP13 AtSUC9
F AtSTP6 AtSTP14 AtPLT1
AtSTP6 AtSTP14 AtPLT1
AtSTP6 AtSTP14 AtPLT1
G AtSTP7
AtSUC1
AtPLT2
AtSTP7
AtSUC1
AtPLT2
AtSTP7
AtSUC1
AtPLT2
H AtSTP8
AtSUC2
AtPLT3 Saumon AtSTP8
AtSUC2
AtPLT3 Saumon AtSTP8
AtSUC2
AtPLT3 Saumon
Le surnageant est retiré et le culot est lavé ensuite à l’ tha ol
%, puis le mélange est
centrifugé 15000 g, pendant 2 min. Le surnageant est retiré et le culot est ensuite séché à
l’ai se et à te p atu e a
ia te. E fi le ulot est e is e suspe sio ave
µL d’eau
ultra pure stérile, et après centrifugation 15000 g, pendant 5 min, l’ADN plas idi ue est
récupéré dans le surnageant.
4.5.4.3.Amplification des fragments d’ADN plasmidique par PCR
Les f ag e ts d’ADN plas idi ues so t a plifiés par PCR. Pour chaque sonde, 1,5 µL
de la solution d'ADN plasmidique est utilisé comme matrice dans un mélange réactionnel de
50 µL contenant le tampon Green Go Taq® Flexi Buffer (5X), du MgCl2 (25 mM), la GoTaq®
DNA polymérase (1,5 U), les dNTP (10 mM), les amorces sens et antisens spécifiques de
chaque fragment (25 µM). Le programme utilisé débute par une étape de dénaturation de
3 min à 95°C suivie de 35 cycles de 30 s à 95°C, 45 s à 56°C et 45 s à 72°C et se termine par
une étape d'extension finale de 3 min à 72°C.
4.5.4.4. Vérification sur gel d’électrophorèse et ajustement de la concentration des
fragments d'ADN
Les produits de PCR so t d pos s su gel d’aga ose
%
/v) dans du tampon TAE
(Tris-acétate 40mM, EDTA 1mM, pH 8,0) avec du BET (0,5 µg/mL) afin de visualiser les ADN
sous UV. La quantité de sonde est ajustée à 50 ng pour les gènes étudiés et à 100 ng pour les
gènes de ménage.
4.5.4.5.Dépôt des sondes d’ADN sur membrane de nylon
Une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham®) est préalablement trempée dans
une solution de SSC 6X (NaCl 1,5M ; citrate de sodium 0,15 M ; pH 7,0) pendant 1 min. Le
d pôt des so des sp ifi ues s’effe tue sous vide à l’aide de l’appa eil BIO-DOT® (BIO-RAD).
La membrane est constituée de 96 dépôts dans lesquels sont déposés 100 µL de sondes
correspondant aux 29 séquences de gènes de transporteurs de sucres étudiés (Tableau 5), à
2 séquences de gènes de ménage (actine 11 et histone H4), et à u puits
se v à l’ADN de
sperme de saumon afin de détecter le bruit de fond dû aux hybridations non spécifiques.
109
Les gènes sont déposés sur chaque membrane en triplicat (Tableau 6). Afin de
visualiser chaque dépôt, 1 µL de bleu de méthylène à 0,04 % (m/v) est additionné. La
dénaturation des sondes déposées sur la membrane est réalisée en baignant la membrane
dans une solution de NaCl 1,5 M ; NaOH 0,5 M ; pendant 2 min. La membrane est ensuite
neutralisée par un passage dans un bain de NaCl 1,5 M ; Tris 0,5 M pendant 5 min. Un
rinçage est réalisé dans du SSC 2X pendant 30 sec avant de fixer les acides nucléiques sur la
membrane par crosslinking (Bio-Link ; BLXE) à 0,120 J/cm², pendant 1 min. La membrane est
ensuite conservée à 4°C dans un sac plastique soudé.
4.5.4.6.Synthèse et marquage radioactif des ADNc
Les ARN totaux extraits des plantes témoins ou stressées sont utilisés comme matrice
à la synthèse des ADNc marqués par rétro transcription. La synthèse des ADNc est réalisée
µg d’ARN ave
en incubant à 70°C pendant 5 min,
µL d’oligo dT16 (100 µM) utilisé
comme amorce. Ensuite la transcriptase inverse M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus ;
16 U/µL) accompagnée de son tampon (Reverse Transcriptase 5X Reaction Buffer, Promega),
d'un mélange de 4 nucléotides non marqués (0,5 mM), et de nucléotides radiomarqués
dCTP33 (10 µCi/µL) sont additionnés au mélange réactionnel et le tout est incubé 2 h à 37°C.
La réaction enzymatique est ensuite stoppée en chauffant le tube à 70°C pendant 15 min,
puis le mélange est conservé dans la glace. Afin de dégrader les ARN restants, 5 µL de
RNase H (7,5 U/µL) sont ajoutés au mélange. La réaction se déroule pendant 30 min à 37°C.
Les sondes marquées sont alors purifiées sur colonne (GE Healthcare Illustra ™ ProbeQuant™)
afin d'éliminer les dCTP33 non intégrés aux ADNc qui pourraient être responsable d'un bruit
de fond important et interférer dans l'analyse des signaux radioactifs. Avant hybridation, les
ADNc marqués sont dénaturés à 100°C pendant 5 min, puis déposés dans de la glace.
4.5.4.7.Hybridation des membranes
La
e
a e est d’a o d p h
id e da s
L de ta po d’h
idatio [NaP
0,25 M ; pH 7,2 ; SDS 7% (m/v) ; EDTA 1 mM ; 1 % BSA (m/v)] pendant 3 h à 65°C, dans des
tu es à h
idatio , sous otatio
adio a u s da s
o ti ue le te. L’h
L de ta po d’h
idatio s’effe tue ave les ADN
idatio pe da t
hà
°C.
110
Plusieurs lavages sont ensuite réalisés. Un premier lavage avec un bain de 15 min
dans du SSC 2X/SDS 0,1% (m/v) et le second lavage par un bain de 15 min dans du SSC 1X/
SDS 0,1% (m/v). La membrane est enfin conditionnée humide, sur papier Whatman ® imbibé
de SSC 2X et enveloppée dans un sac plastique scellé. La membrane est mise en présence
d’u
le
33
a Phospho-I age Mole ula D a i s, USA se si le au a o
e e tβ
is pa
P pendant 48h. Les signaux sont ensuite révélés au Phospho-Imager™ Typhoon Trio et
ua tifi s à l’aide du logi iel I ageQua tTL Health a e
ui d te te auto ati ue e t les
signaux. Chaque membrane représente une condition (témoin ou stress hydrique). Afin de
pallier à d'éventuelles différences de dosage entre les échantillons déposés sur les
différentes membranes, les signaux bruts sont normalisés avec la moyenne des signaux des 2
gènes de ménage présents sur chaque membrane. Les profils d'expression sont déterminés
en calculant le log2 du rapport expression des plantes stressées/expression des plantes
témoins. L'ensemble de ces analyses est facilité par l'élaboration d'un tableur Excel mis en
place au laboratoire.
111
4.6. Quantification
des
sucres
solubles
foliaires
par
Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP)
4.6.1. Extraction de sucres solubles foliaires
Un gramme de matériel foliaire frais est broyé dans de l’azote li uide jus u’à
l’o te tio d’u e fi e poud e à la uelle
L d’u
la ge
tha ol/ hlo ofo
e/eau
(12/5/3, v/v/v) sont ajoutés (Gomez et al., 2002; Gomez et al., 2003). Après agitation, le
mélange est soumis aux ultra-sons pendants 20 secondes. L’ hantillon est ensuite
centrifugé 10 min à 3 000 g. Le surnageant est récupéré et le culot est extrait une nouvelle
fois suivant la procédure décrite ci-dessus. Deux extractions sont suffisantes pour extraire de
façon exhaustive la totalité des sucres solubles o te us da s l’ ha tillo . Les deux
surnageants sont regroupés et additio
s d’u volu e d’eau
surnageant). Après agitatio , l’e t ait est e t ifug
i
à
L d’eau pou
L de
g. L’ piphase aqueuse
(phase la plus claire) est alors récupérée puis évaporée sous vide à 30°C / 10 mbar pendant
une uit à l’aide d’u
vapo ateu de type MiVac (GeneVac, Ipswich, UK).
L’ vapo ât est ep is da s
L d’eau ult a pure pour être ensuite purifié sur colonne
ionique. Les colonnes sont constituées de 3 phases différentes : la première phase est
composée d’u e résine anionique AG1*8 100-200 mesh (BIO-RAD) conditionnée au
préalable avec du Na2CO3 ; la seconde phase contient une résine cationique DOWEX
50W*8 400
mesh
(Sigma-Aldrich®)
et
la
troisième
phase
est
constituée
de
polyvinylpyrrolidone (PVPP). Après purification, les échantillons sont évaporés. L’ vapo ât
est enfin remis en suspension dans 1
L d’eau ult a pure.
112
4.6.2. Analyse des sucres solubles par Chromatographie Liquide Haute
Performance
Les sucres solubles des extraits foliaires ont été séparés et quantifiés par
Chromatographie Liquide Haute Pe fo
a e à l’aide d’u
h o atog aphe de t pe IOTA
refractive index detector 475 (Kontron Instruments®).
Vingt microlitres d’e t ait foliai e so t i je t s su u e olo
e de t pe A i e
HPX-87C, 300 x 7,8 mm, 125-0095 (BIO-RAD). Les sucres solubles sont ensuite
p og essive e t lu s, e
d’eau ult a pu e. Le d
o ditio iso ati ue, à l’aide d’u e phase
it de la phase
o ile est de ,
L. i
-1
o ile o stitu e
et l’a al se du e au total
45 min.
Les sucres sont détectés à l’aide d’un refractomètre différentiel IOTA 2 (Refractive
Index Detector 475, Kontron Instruments®). Les 4 sucres solubles majoritaires (raffinose,
saccharose, glucose et fructose) ont été identifiés par co-chromatographie avec des
solutions aqueuses de sucres témoins issus du commerce (Sigma-Aldrich®).
La quantification de chacun des 4 sucres solubles a été effectuée à partir de 4
gammes étalons analysées dans les mêmes conditions que les extraits foliaires. Pour chaque
sta da d, la ga
e talo a t
o st uite à pa ti de l’a alyse CLHP de 6 solutions de
concentrations croissantes : 1, 2, 5, 10, 100 et 200 mmol. In fine, La surface de chaque signal
chromatographique est exprimée en µmol de sucre par gramme de matière sèche. La masse
de matière sèche a été calculée en soustrayant à chaque biomasse fraîche foliaire la teneur
en eau moyenne de l’écotype déterminée pour le même traitement (témoin ou stressé) au
e jou d’ ha tillo
age.
113
Figure 26. Quantification enzymatique de l'amidon réalisée par dosage
spectrophotométrique du NADH,H+ produit lors de l'oxydation glucose-6-phosphate par
une glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) pour former du 6-phosphogluconate.
La quantité de NADH,H+ est directement proportionnelle à la concentration en glucose.
4.7. Dosage enzymatique de l’amidon
4.7.1. Principe
Le dosage de l’a ido a t effe tu à l’aide d’u e
thode enzymatique (Smith et
Zeeman, 2006; Eun-Deok et al., 2009) dont le principe est précisé dans la Figure 26. Dans un
p e ie te ps l’a ido est h d ol s e glu ose pa u e a
li
loglu osidase. Le glucose ainsi
est e suite phospho l à l’aide d’ATP pa u e he oki ase. Le glucose-6-phosphate
produit est finalement oxydé en 6-phosphogluconate par une glucose-6-phosphate
déhydrogénase (G6PDH) en présence de NAD+. Lo s de ette de i e tape d’o datio ,
une quantité équimolaire de NAD+ est réduite en NADH,H+. Cette quantité de NADH,H+,
directement
proportionnelle
à
. Co
spectrophotométrie à
la
concentration
en
glucose,
est
dosée
par
te e t, ette te h i ue est as e su l’utilisatio du
kit de dosage de l’a ido SA-20 (Sigma-Aldrich®)
4.7.2. Mode opératoire
Un gramme de matériel frais est broyé dans un mortier e p se e d’azote liquide à
l’aide d'u pilo . Le broyât est stocké à -80°C jus u’à a al se. Il est suspendu dans une
solutio d’ tha ol à
% v/v). Le mélange obtenu est incubé pendant 3 min dans un bain-
marie à ébullition. Après centrifugation à 3000 g pendant 10 min à température ambiante, le
surnageant qui contient les sucres solubles est éliminé et le culot qui contient l’a ido est
conservé. Cette tape d’e t a tio
tha oli ue des su es solu les est
fois. À l’issue de es t ois e t a tio s, Le ulot,
e suspe sio da s
L d’eau distill e. Ci
p tée encore deux
put d pou vu de su es solu les, est e is
e ts µL de e
la ge so t finalement
ajoutés dans des tubes scellés qui sont ensuite déposés dans un bain-marie à ébullition
°C pe da t
i afi de g lifie les g ai s d’a ido . Cinq cents µL d’a tate de
sodium (200 mM, pH 5,5) sont ensuite ajoutés à chacun des tubes revenus à température
ambiante. Ce millilitre est mélangé à 1 mL de la solution « Starch Assay Reagent » (SAR, kit
SA-20, Sigma-Aldrich®). Le mélange est ensuite incubé 15 min dans un bain-marie
thermostaté à 60 °C.
114
Une fois revenu à température ambiante, il est centrifugé à 10000 g pendant 5 min.
Enfin, 100 µL de surnageant sont ajoutés à 1 mL de la solution « Glucose Assay Reagent »
(GAR, kit SA-20, Sigma-Aldrich®). Le mélange est incubé pendant 15 min à température
a
ia te. L’a so a e de et
NADH,H+ p oduite lo s de l’ulti e
ha tillo est lue à
a tio e z
afi de dose la ua tité de
ati ue. Elle sera corrigée par les valeurs de
trois types de « blanc » : un « blanc » échantillon ; un « blanc » de solution SAR et un
« blanc » de solution GAR.
4.8. Mise en évidence et localisation in situ de l’amidon
présent dans les feuilles d’Arabidopsis thaliana
4.8.1. Fixation chimique des échantillons foliaires
Les feuilles d'Arabidopsis thaliana sont coupées à l'aide d'une lame de rasoir,
parallèlement à la nervure centrale, en petits fragments de 1 à 2 mm de large et de quelques
millimètres de long. Les échantillons sont ensuite soumis à un léger vide pendant 15 min
puis sont fixés pendant une heure à 4°C dans un mélange constitué de paraformaldéhyde à
2% et de glutaraldéhyde à 0,5 % préparé dans du tampon Sörensen (0,2 M; pH 7,2) (Valtaud
et al., 2009; Fleurat-Lessard et al., 2011).
4.8.2. Post-fixation, déshydratation et inclusion des échantillons
foliaires dans la résine
Les échantillons fixés sont dans un premier temps lavés avec du tampon Sörensen
(0,2 M, pH 7,2) puis, dans un deuxième temps, avec une solution de saccharose (7,5 %, m/v).
les échantillons sont ensuite fixés à l'acide osmique (OsO4, 1 %) pendant 5 min avant d'être
déshydratés par 5 bains successifs d'alcool éthylique (8 min chacun) de degré alcoolique
croissant (20, 50, 70, 95 et 100 %). L'imprégnation des échantillons est
alis e à l’aide de
plusieurs bains : deux bains de 20 min dans un mélange de résine/éthanol 100 % (1:2, v/v) ;
deux bains de 40 min dans un mélange résine/éthanol 100 % (2:1, v/v) ; un bain de 60 min
dans de la résine pure (LRWhite ou Spurr) à température ambiante puis un dernier bain
d’une nuit également dans de la résine pure (LRWhite ou Spurr) mais à 4°C.
115
L'inclusion dans la résine est ensuite pratiquée e p e a t soi d’o ie te les
perpendiculairement au plan de coupe. La polymérisation de la
ha tillo s
si e s’effe tue pe da t
24 h à 60°C pour la résine LRWhite et à 70°C pour la résine Spurr.
4.8.3. Sections semi-fines et ultra-fines
Les blocs d'inclusion sont sectionnés en coupes semi-fines (250 à 400 nm d'épaisseur)
ou en coupes ultra-fines (50 à 70 nm d'épaisseur) à l'aide d'un microtome (EMUC6, Leica). Ils
doivent être précisément orientés de façon à pouvoir offrir des sections transversales de
feuilles contenant une assise de cellules palissadiques, au moins une nervure mineure et un
parenchyme lacuneux.
Les coupes semi-fines sont recueillies sur des lames de verre puis colorées au bleu de
Toluidine (préparé dans du Borax, pH 9) avant d'être observées au microscope photonique
de marque Zeiss Axioplan.
Les coupes ultra-fines sont soigneusement étalées, recueillies sur des grilles de
cuivre, d'or ou de nickel puis stockées dans une armoire étanche. Pour révéler
l’ult ast u tu e des échantillons, les coupes sont contrastées par des sels de métaux lourds
(acétate d'uranyle et it ate de plo
puis o se v es à l'aide d’u microscope électronique
à transmission (Jeol 1010) sous 80 kV.
4.8.4. Localisation des réserves d'amidon
L’a ido est e du visi le pa
olo atio au réactif de Schiff. Des coupes semi-fines
collées à chaud sur des lames poly-lysinées (1 mg/mL) sont hydratées 5 min dans de l'eau
distillée puis mordancées pendant 30 min à 1h par de l'acide périodique à 1 % (m/v) préparé
e te po a
e t ava t d’ t e lavées à l'eau distillée. Elles sont ensuite immergées dans du
réactif de Schiff (Fushine basique à 1 %, HCl à 0,25 M, Na2S2O5 à 4 %) pendant 3 h avant
d’ t e lavées à l’eau distill e et observées au microscope photonique Zeiss Axioplan. Le
a tif de S hiff olo e l’a ido e pou p e et les pa ois pe to-cellulosiques en rose.
116
5. Traitement statistique
Le t aite e t statisti ue des do
es test t, ANOVA, ACP… a t
alis à l'aide du
logiciel XLStat 2011 (Addinsoft).
La comparaison des moyennes des échantillons a été effectuée à l’aide d'un test t de
Student pour échantillons indépendants (Student, 1908) ou d’u e u e a al se de la variance
à un facteur contrôlé (ANOVA). Dans ce dernier cas, lorsque les moyennes sont
significativement différentes (p<0,05), elles sont comparées à l'aide d'un test de Fisher.
Les données quantitatives de caractérisation des 8 écotypes ont été organisées à
l’aide d’u e analyse en composantes principales (ACP). L’ACP est une technique multivariée
neutre et descriptive qui a pour objectif de décrire et d’o ga ise la va ia ilit
o te ue da s
un tableau de données comportant N individus (écotypes) sur lesquelles sont mesurées P
variables quantitatives. Effectuer une ACP consiste à résumer la plus grande partie de la
variabilité de ce tableau, en un nombre plus réduit de variables, qui ne sont autres que des
o
i aiso s li
ai es des va ia les
esu es, de va ia e
a i ale, ue l’o
o
e
composantes principales. Les variances des variables étant très hétérogènes, il a fallu
normer les va ia les afi d’a o de à toutes le
e "poids" da s l’a alyse. La matrice des
corrélations a été établie sur la base des coefficients de Pearson (1896). Le pourcentage
d’i e tie de
ha ue a e e p i e le pouvoi
o posa te p i ipale
ui l’a g
des iptif de la
. Le e le des o
o
i aiso
li
ai e
lations des variables indique,
quant à lui, la corrélation de chacune des variables initiales avec les axes du plan considéré.
117
Résultats
C. Résultats
118
Figure 27. Évolution de la croissance et du développement de 8 écotypes d'Arabidopsis
thaliana, entre le 18ème et le 47ème jour après la levée.
Résultats
1. Caractérisation de la croissance, du développement, de
l'activité
photosynthétique
et
de
l’expression
de
transporteurs de sucres chez 8 écotypes d'Arabidopsis
thaliana
La croissance et le développement de 8 écotypes (An-1, Bl-1, Col-0, Cvi-0, Ge-0, Mt-0,
Oy-0 et Shahdara) ont été étudiés tous les 4 jours depuis le 14ème jour après la levée (JAL)
jus u’au
ème
JAL. Au 47ème JAL, une caractérisation de la biomasse et de l'activité
photosynthétique est effectuée pour chaque écotype. À ce stade de développement les
plantes des 8 écotypes sont toutes dans un état végétatif (aucune hampe florale n'est
visible). Les feuilles matures ont alors une surface suffisamment importante pour que leur
activité photosynthétique puisse être caractérisée individuelle e t à l’aide du CIRAS-2 de
PP S ste s. Ces
esu es d’ ha ges gazeu
effe tu es à l’ helle de la feuille so t
relativement originales dans la mesure où elles sont généralement effectuées sur des
rosettes entières (Donahue et al., 1997; Antony N. Dodd, 2004; Lake, 2004; Tocquin et
Périlleux, 2004; Poulson et al., 2006). Afin de pouvoir choisir objectivement, parmi les 8
écotypes étudiés, les 3 écotypes qui seront finalement soumis à un stress hydrique, la
variabilité de la plupart des paramètres phénotypiques caractérisant les écotypes au
47ème JAL a t o ga is e à l’aide u e
thode statisti ue eut e et des iptive ACP .
1.1. Croissance et développement
1.1.1. Variabilité des morphotypes
Un suivi photographique est réalisé tous les 4 jours, entre le 14 ème et le 47ème jour
après la levée (JAL) des plantes (Figure 27 et 28). Les morphotypes exprimés par les 8
écotypes sont variés et peuvent parfois se distinguer aisément sur la base de critères
simples : nombre de feuilles ; longueur des pétioles ; surface ; forme et découpage du limbe.
119
Figure 28 : Présentation des 8 écotypes caractérisés à 47 jours après leur levée.
Résultats
An-1, originaire de Belgique, présente une rosette compacte avec de nombreuses feuilles et
une surface foliaire totale importante. Les feuilles sont allongées avec des limbes
légèrement courbés, à la bordure dentelée.
Bl-1, originaire d'Italie, présente une rosette clairsemée. Les limbes foliaires, peu dentelés,
sont parfois repliés à leur extrémité.
Col-0, originaire de Pologne, présente une rosette compacte avec un grand nombre de
feuilles et une surface foliaire totale importante. La base des limbes est dentelée.
Cvi-0, Originaire du Cap Vert, présente une rosette très clairsemée caractérisée par une
faible surface foliaire totale et un nombre de feuilles réduit. Le limbe qui présente une forme
d'ogive sans dentelures est rattaché à la base de la rosette par un long pétiole.
Ge-0, originaire de Suisse, présente une rosette composée de nombreuses feuilles et d’u e
surface foliaire totale importante. Les limbes sont plutôt circulaires. Les pétioles sont rouges
et courts.
Mt-0, originaire de Libye, présente une rosette caractérisée par de nombreuses feuilles et
une surface foliaire importante. Les feuilles ont des limbes très dentelés et de longs pétioles.
Oy-0, originaire de Norvège, est un écotype qui développe de nombreuses feuilles et
présente en conséquence une surface foliaire importante. Les feuilles, aux courts pétioles,
ont de longs limbes aux bordures dentelées.
Shahdara, originaire du Tadjikistan, est caractérisé par une rosette compacte avec une
surface foliaire totale importante sans pour autant développer un grand nombre de feuilles.
Les feuilles présentent de longs limbes dentelés à la base et de petits pétioles. Au toucher les
feuilles de Shahdara paraissent plus rigides et moins fragiles que celles des autres écotypes.
La microscopie photonique n'a toutefois pas permis d'associer ce surcroît de rigidité à un
quelconque paramètre observable (épaisseur du limbe, épaisseur des parois cellulaires...).
Cette rigidité pourrait être le reflet d'un contenu relatif en eau légèrement supérieur à la
moyenne.
120
Figure 29. Évolution du nombre de feuilles par rosette de① ① ot pes① d’Arabidopsis
thaliana, déterminé tous les 4 jours entre le 14ème et 42ème jour après la levée du plant. Les
valeurs représentent les moyennes ± écarts-types (n= 40, 20 plantes x 2 essais différents).
Figure 30. Caractérisation du nombre de feuilles par rosette de① ① ot pes① d’Arabidopsis
thaliana échantillonnées au 47ème jour après la levée du plant. Les valeurs représentent
des moyennes ± écarts-types (n= 40, 20 plantes x 2 essais différents). ANOVA (p<0,05) : les
moyennes identifiées par les mêmes lettres ne sont pas statistiquement différentes au
seuil 5 %①d’ap s①le①test①de①Fishe .
Résultats
1.1.2. Évolution du nombre de feuilles constitutives des rosettes
Pour chaque écotype, le dénombrement des feuilles par plante a été effectué, à
partir de photographies, tous les 4 jours depuis le 14ème jour après la levée (JAL, date du
repiquage) jus u’au 42ème JAL. Après cette date, certains écotypes présentent des plantes
qui ont tendance à « buissonner » sur lesquelles le comptage des feuilles devient alors
hasardeux. La Figure 29 présente la moyenne de 2 expérimentations différentes : 40 plantes
(2 x 20) par écotype et par date de mesure ont été étudiées. Cvi-0 se distingue très tôt des
autres écotypes par son nombre réduit de feuilles. À l’oppos , d s le
des plants d'Oy- so t o stitu es d’u
o
ème
JAL, les rosettes
e de feuilles plus i po ta t ue les osettes
des 7 autres écotypes. Dans tous les cas, les faibles écart-t pes t
oig e t d’u e va ia ilit
intra-écotype peu importante.
À 42 JAL, le nombre de feuilles par rosette est statistiquement différent (p<0,001)
entre les écotypes (Figure 30). À ette date, les osettes d’O -0 possèdent un nombre moyen
de feuilles (38 feuilles en moyenne) presque deux fois supérieur à celui des rosettes de Cvi-0
(20 feuilles en moyenne). Les autres écotypes sont caractérisés par un nombre moyen de
feuilles qui varie entre 28 et 33 feuilles.
1.1.3. Évolution du diamètre des rosettes
Le diamètre des rosettes (40 plantes par écotype et par date de mesure) a été
déterminé sur la base de photographies analys es à l’aide d’u logi iel d’a al se d’i ages
(ImageJ).
Du 14ème au 42ème jour après la levée, les diamètres des 8 écotypes sont globalement peu
différents : les premières différences constatées au 22ème JAL e s’a plifie t gu e jus u’au
42ème JAL (Figure 31). U e diff e e d’e vi o
est ot e e t e l' ot pe do t les
rosettes ont en moyenne le diamètre le plus faible (généralement Oy-0) et ceux dont le
diamètre des rosettes est en moyenne le plus important (Bl-1 et Cvi-0).
121
Figure 31. Évolution du diamètre des rosettes de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana,
mesuré tous les 4 jours entre le 14ème et 42ème jour après la levée (JAL) du plant et au
47ème JAL. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 40, 20 plantes x 2
essais différents).
Figure 32. Caractérisation du diamètre des rosettes de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana
échantillonnées au 47ème jour après la levée du plant. Les valeurs représentent des
moyennes ± écarts-types (n= 40, 20 plantes x 2 essais différents). ANOVA (p<0,05) : les
moyennes identifiées par les mêmes lettres ne sont pas statistiquement différentes au
seuil 5 %①d’ap s①le①test①de①Fishe .
Résultats
Au 47ème JAL, une différence significative (p<0,001) entre le diamètre moyen des
rosettes des 8 écotypes est néanmoins observée (Figure 32). Une comparaison multiple de
o e
es,
alis e à l’aide du test LSD de Fishe au seuil α = %,
o t e ue l' ot pe Bl-1,
dont les rosettes ont un diamètre moyen de 12,8 cm, surpasse de peu mais de façon
significative les 7 autres écotypes. Les écotypes Cvi-0, Mt-0 et Shahdara développent des
rosettes dont les diamètres compris entre 11,94 et 12,21 cm sont statistiquement
identiques. Quant aux écotypes Col-0 et Ge-0, ils forment un groupe caractérisé par des
diamètres de rosettes significativement plus petits (en moyenne 10,9 cm pour Col-0 et
10,92 cm pour Ge-0).
122
Figure 33. Évolution de la surface foliaire projetée des rosettes de 8 écotypes
d’Arabidopsis thaliana échantillonnées tous les 4 jours entre le 14ème et 42ème jour après la
levée (JAL) du plant et au 47ème JAL. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types
(n= 40, 20 plantes x 2 essais différents).
Figure 34. Caractérisation de la surface foliaire projetée des rosettes de 8 écotypes
d’Arabidopsis thaliana échantillonnées au 47ème jour après la levée du plant. Les valeurs
représentent des moyennes ± écarts-types (n= 40, 20 plantes x 2 essais différents). ANOVA
(p<0,05) : les moyennes identifiées par les mêmes lettres ne sont pas statistiquement
différentes au seuil 5 %①d’ap s①le①test①de①Fishe .
Résultats
1.1.4. Évolution de la surface foliaire
La détermination de la surface foliaire projetée est fondée sur une technique
d'analyse d'image de rosettes vivantes qui permet de suivre l'évolution des mêmes rosettes
tout au long de leur croissance. En déterminant la surface réellement offerte aux
a o
e e ts lu i eu , ette te h i ue pe
active en photos th se. E
et d’app o he la su fa e foliai e suppos e
eva he, lo s ue la osette p e d de l’âge, la su fa e foliai e
projetée, qui ne comptabilise pas les surfaces foliaires recouvertes, peut ne plus rendre
compte efficacement de la surface foliaire totale qui nécessite alors une analyse destructive
pour pouvoir être déterminée précisément.
L'évolution de la surface foliaire projetée des rosettes des 8 écotypes est caractérisée
par l'analyse des photographies réalisées tous les 4 jours (Figure 33). Au 14ème et au 18ème
jour après la levée (JAL), les surfaces foliaires projetées sont très faibles et identiques entre
les écotypes. À partir du 22ème JAL, l'écotype Cvi-0 commence à se distinguer en développant
une surface foliaire moins importante que celle des autres écotypes. Cette singularité va
s’a e tue au ou s du te ps. À l'inverse, les plants de Mt-0 possèdent en moyenne la plus
grande surface foliaire projetée entre le 34ème et le 42ème JAL. Au 47ème jour après la levée, il
existe une différence très hautement significative entre les surfaces foliaires projetées des 8
écotypes (p<0,001) (Figure 34). Les rosettes des écotypes An-1, Bl-1 et Mt-0 offrent des
surfaces foliaires projetées particulièrement importantes comprises entre 70,38 et
71,31
². L’o d e de g a deu de
es valeu s est comparable aux surfaces foliaires
projetées fournies par la littérature (Granier, Aguirrezabal et al. 2006; Bouchabke, Chang et
al. 2008). Néanmoins, il reste très difficile de comparer précisément nos données avec celles
issues des travaux cités ci-dessus dans la mesure où les plantes échantillonnées avaient des
âges diff e ts et ’ taie t pas ultiv es da s des o ditio s ide ti ues. Ge-0 et Oy-0 sont
quant à eux caractérisés par des surfaces foliaires projetées moyennes statistiquement
homogènes de respectivement 62,01 et 63,82 cm².
123
Figure 35. Comparaison de l'analyse de la surface foliaire grâce à une technique non
destructive par rapport à une technique destructive pour l'écotype Col-0 à 47 jours après la
levée.
Figure 36. Évolution de la surface foliaire totale () et de la surface foliaire projetée ()
de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et Shahdara). Les valeurs représentent
des moyennes écarts-types (n = 10). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
Ces valeurs étant statistiquement inférieures à celle caractérisant Shahdara
(67,26 cm2) qui ne se distingue pas de Bl-1. Si le test de Fischer confirme bien la singularité
de Cvi-0 qui possède une surface foliaire projetée moyenne de 36,23 cm² significativement
plus faible que celle des 7 autres écotypes, il distingue également la faible surface foliaire
moyenne de Col-0 (54,87 cm2) significativement supérieure à celle de Cvi-0 et
significativement inférieure à elle des
aut es
ot pes. Les t avau d’o es et d jà pu li s
confirment la très faible surface foliaire projetée de Cvi-0 comparativement à de nombreux
autres écotypes (Granier, Aguirrezabal et al. 2006; Bouchabke, Chang et al. 2008).
Les surfaces foliaires projetées et les surfaces foliaires totales (= réelles) ont été
déterminées et comparées, entre le 18ème JAL et le 62ème JAL, chez 3 écotypes : deux
écotypes caractérisés par des surfaces foliaires projetées relativement importantes (Mt-0 et
Shahdara) et un écotype dont la surface foliaire projetée est plus faible (Col-0). Dans un
premier temps les plantes sont photographiées puis leur surface foliaire projetée est
calculée. Ces mêmes plantes sont ensuite sacrifiées ; leurs feuilles sont détachées et
d pos es ôte à ôte ava t d’ t e photog aphi es. L’a al se de es i ages pe
ett a de
déterminer la surface foliaire totale (Figure 35).
Pour chacun des trois écotypes étudiés, du 18ème JAL au 42ème JAL, les surfaces
foliaires projetées et totales sont statistiquement équivalentes (Figure 36). À partir du
47ème JAL il existe une différence significative de 23 à 28 % entre les deux valeurs de surface
foliaire. Au 53ème JAL la surface foliaire totale est en moyenne 37 % (p<0,01) plus importante
que celle déterminée par projection pour les écotypes Col-0 et Shahdara et plus importante
de 34 % chez Mt-0. Lors du dernier jour de mesure (63ème JAL), la surface foliaire projetée ne
représente que 47 % de la surface foliaire totale des 3 écotypes étudiés. À cette date, seule
la moitié de la surface foliaire totale peut donc potentiellement assimiler le CO2 en utilisant
l’
e gie lu i euse.
124
A.
B.
Figure 37. Caractérisation de la biomasse fraîche (A) et de la biomasse sèche (B) de 8
ot pes①d’Arabidopsis thaliana échantillonnées au 47ème jour après la levée du plant. Les
valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 20, 10 plantes x 2 essais différents).
ANOVA (p<0,05) : les moyennes identifiées par les mêmes lettres ne sont pas
statistiquement différentes au seuil 5 %①d’ap s①le①test①de①Fishe .
Figure 38. Caractérisation du pourcentage d'eau dans la biomasse fraîche des rosettes de 8
valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 20, 10 feuilles x 2 essais différents).
ANOVA (p<0,05) : les moyennes identifiées par les mêmes lettres ne sont pas
Résultats
1.1.5. Biomasse et teneur en eau à 47 jours après la levée
La biomasse fraîche moyenne des rosettes des 8 écotypes est calculée à partir des
pesées de 20 rosettes (10 rosettes x 2 expérimentations) arrosées au soir du 46 ème JAL et
coupées au niveau du collet le 47ème jour après la levée (Figure 37.A). À cette date, Il existe
des différences significatives de biomasses fraîches entre les écotypes (p < 0,001). Le test de
Fisher révèle que les rosettes de Shahdara ont en moyenne une biomasse fraîche de 2,16 g
significativement plus élevée que les 7 autres écotypes. Les écotypes An-1, Ge-0, Mt-0 et
Oy-0 forment un groupe dont les masses de matière fraîche sont en moyenne
significativement équivalentes et comprises entre 1,74 et 1,83 g. Bl-1 dont la surface foliaire
projetée est parmi les plus importantes ne possède qu'une faible masse de matière fraîche
(1,4 g). Enfin les rosettes de Cvi-0 caractérisées par une petite surface foliaire projetée et un
nombre réduit de feuilles, ont en moyenne une biomasse fraîche de 1,2 g, significativement
plus faible que celles des 7 autres écotypes.
Une fois pesées au matin du 47ème JAL, les rosettes sacrifiées sont ensuite séchées à
l’ tuve ava t d’ t e à ouveau pes es pou d te
i e leu
io asse s he Figure 37.B).
Une analyse de la variance dévoile une différence significative entre les biomasses sèches
moyennes des 8 écotypes (p<0,001). Les rosettes de Shahdara, caractérisées par la biomasse
fraîche moyenne la plus importante, possèdent aussi en moyenne une biomasse sèche
élevée (0,13 g) qui ne se distingue néanmoins pas statistiquement de celle d'Oy-0 (0,14 g) et
de Ge-0 (0,13 g). À l'opposé, Les écotypes Col-0 et Cvi-0 possèdent les biomasses sèches
moyennes les plus faibles : 0,1 g pour Col-0 et 0,07 g pour Cvi-0.
La o
latio e t e les io asses f a hes et s hes ’est pas toujou s elle atte due
car la teneur en eau des rosettes fraîches varie également significativement entre les
écotypes (p<0,001) (Figure 38). Ainsi, au matin du 47ème JAL, les rosettes de Shahdara et de
Cvi-0 sont significativement plus riches en eau (93,5% pour Shahdara et 94 % pour Cvi-0) que
les rosettes des 6 autres écotypes. Avec respectivement et en moyenne 92,11 % et 92,28 %
d’eau, les osettes f a hes des
ot pes Bl-1 et Oy-0 sont celles qui contiennent le moins
d’eau.
125
Figure 39. Gamme de conversion des valeurs "SPAD" obtenues avec le chlorophylle-mètre
en microgrammes de chlorophylles totales (a et b) par milligrammes de matière fraîche.
Chaque point représente la moyenne de 10 mesures au chlorophylle-mètre sur une feuille,
(n= 100). La droite des moindres carrés représente, le mieux possible, dans le nuage de
points la variation de la teneur en chlorophylles avec les valeurs de SPAD.
Figure 40. Caractérisation de la teneur en chlorophylles totales de feuilles matures de 8
valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 60, 3 feuilles x 10 plantes x 2 essais
différents). ANOVA (p<0,05) : les moyennes identifiées par les mêmes lettres ne sont pas
Résultats
1.2. Paramètres photosynthétiques à 47 jours après la levée
Au 47ème jour après la levée, les 8 écotypes étudiés présentent des feuilles matures
dont le limbe a une surface suffisamment importante pour pouvoir être échantillonné
individuellement à l’aide d’u e pi e u ive selle [PLC6 (U) Automatic leaf cuvettes,
PP Systems, Hitchin, UK] ui a ueille u e ha
2,5
e i ulai e de
esu e d’u e su fa e de
². Cette pi e oupl e à l’a al seu de gaz à i f a-rouge CIRAS-2 (PP Systems, Hitchin,
UK) permet de caractériser des paramètres photosynthétiques foliaires fondamentaux dans
des conditions constantes et contrôlées : conductance stomatique, assimilation nette de CO2
et efficacité d'utilisation de l'eau pour réaliser l'assimilation de CO2. Ces paramètres sont
complétés par la quantification des chlorophylles totales foliaires.
1.2.1. Quantification des chlorophylles foliaires totales
La te eu
e
hlo oph lles totales des feuilles est d te
i
e à l’aide d'u
chlorophylle-mètre de type SPAD-502 (KONIKA MINOLTA®). Cette quantification non
destructive permet de multiplier les répétitions. Toutefois, les résultats obtenus sont
exprimés en unités arbitraires « SPAD ». Une gamme étalon permettant de convertir, pour
Arabidopsis thaliana, les unités arbitraires « SPAD » en µg de chlorophylle par mg de matière
fraîche a donc été réalisée à pa ti de
feuilles d’âges diff e ts
ha tillo
s su les
écotypes étudiés (Figure 39). Pour ce faire, la teneur en chlorophylles de chacune des 100
feuilles a da s u p e ie te ps t d te
i
e à l’aide du hlo oph lle-mètre. Les feuilles
ainsi caractérisées ont ensuite été individuellement récoltées et pesées ; leurs chlorophylles
ont finalement été extraites puis dosées selon la méthode développée par Mackinney
(1941). Au moment où cette expérimentation a été entreprise aucune gamme étalon de ce
t pe ’ tait dispo i le da s la litt atu e pou Arabidopsis thaliana. En 2011, Ling et al. ont
pu li des t avau si ilai es à pa ti de l’ tude de Col-0 et de 6 de ses mutants présentant
des o e t atio s e
hlo oph lles
oissa tes. Ces t avau
o t e t u’à l’aide d’u e
fo tio pol o iale d’o d e , les valeu s SPAD peuve t e d e o pte t s effi a e e t
de la teneur en chlorophylles totales des feuilles d’Arabidopsis thaliana exprimée en nmol
par mg de matière fraîche (R2 = 0,9909).
126
Résultats
La valeur très élevée du coefficient de corrélation tient en partie au fait que les auteurs ont
hoisi pou l’e e i e de
ou pa
od lisatio de t availle ave des valeu s
uta t et o pas ave l’e se
le des
o e
es pa
ot pe
esu es i dividuelles. La gamme étalon
présentée Figure 39 a, au contraire du travail précédemment évoqué, été réalisée sur
l’e se
le des do
es foliai es i dividuelles. Que la relation liant la valeur SPAD à la teneur
en chlorophylles (exprimée en µg de chlorophylles totales par mg de matière fraîche) ait été
od lis e à l’aide d’u e fo tio li
ai e ou pol o iale d’o d e , passa t ou pas pa le
point zéro, ne change pas fondamentalement le coefficient de corrélation (R2) qui varie
faiblement entre 0,6944 (pour une fonction linéaire de type : µg.mg = 0,0644.SPAD) et
,
pou u e fo tio pol o iale d’o d e
sa s fo çage du poi t z o de t pe :
µg.mg = 1,4.10-3SPAD2+3,1.10-3SPAD+0,6596). Le peu de différence existant entre les
od lisatio s s’appu a t su des fo tio s li
ai es et polynomiales d’o d e avait d jà t
constaté par Ling et al. (2011). Comme ces auteurs, nous avons choisi finalement de
modéliser nos do
es à l’aide d’u e fo tio
pol o iale d’o d e
de t pe :
µgchlorophylles totales.mg-1 = 0,2.10-4 SPAD2 + 52,7.10-3SPAD.
La teneur moyenne des feuilles en chlorophylles totales a été déterminée pour chaque
écotype à partir de 240 mesures (10 plantes x 3 feuilles X 2 essais, sachant que la teneur
d’u e feuille e p i e elle-même une moyenne de 4 mesures) effectuées au
chlorophylle-mètre. Les données SPAD, ont ensuite été converties en microgrammes de
chlorophylles totales par milligrammes de feuille fraîche (Figure 40).
Au 47ème JAL, il existe des différences significatives de teneurs en chlorophylles
totales entre les écotypes (p<0,001). Le test de Fischer répartit les 8 écotypes en 5 groupes
statistiquement homogènes. L'écotype An-1 est caractérisé par une teneur en chlorophylles
foliaires de 1,56 µg.mg-1 de matière fraîche significativement plus élevée que celle des 7
autres écotypes. Légèrement mais significativement plus faibles, les teneurs moyennes en
chlorophylles totales de Col-0, Ge-0 et Shahdara sont statistiquement équivalentes et
comprises entre 1,39 et 1,4 µg.mg-1. Avec respectivement 1,33 µg.mg-1 et 1,25 µg.mg-1, les
écotypes Bl-1 et Mt-0 possèdent des teneurs en chlorophylles encore plus faibles et
statistiquement différentes entre elles.
127
A.
B.
Figure 41. Caractérisation de la conductance stomatique (A) et de la concentration interne
en CO2 (B) de feuilles① atu es① de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana échantillonnées au
47ème jour après la levée du plant. Concentration en CO 2 : 380 ppm ; PPFD :
800 µmol.m-2.s-1 ; VPD : 0,8-1 KPa. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types
(n= 24, 12 feuilles x 2 essais différents). ANOVA (p<0,05) : les moyennes identifiées par les
mêmes lettres ne sont pas statistiquement différentes au seuil 5 %① d’ap s① le① test① de①
Fisher.
Résultats
Quant à Oy-0 et Cvi- , ils o stitue t le g oupe d’ ot pes do t les feuilles sont les moins
riches en chlorophylles : 1,11 µg.mg-1 pour Oy-0 et 1,09 µg.mg-1 pour Cvi-0 soit -30 % par
rapport à An-1 l’ ot pe le plus i he e
hlo oph lles . Da s tous les as, les o d es de
grandeur des valeurs SPAD et des teneurs en chlorophylles totales
al ul es à l’aide de la
gamme étalon), sont conformes aux données de la littérature (0,9 - 1,6 µg.mg-1) parfois
obtenues sur des accessions différentes des écotypes étudiés ici (Mochizuki et al., 2001;
Kanwischer et al., 2005; Pruzinska et al., 2005; Graf et al., 2010; Ling et al., 2011).
1.2.2. Détermination instantanée des échanges gazeux
La conductance stomatique (gs) rend compte du degré d'ouverture de l'ostiole,
paramètre essentiel pour évaluer les échanges gazeux au niveau du couvert végétal et
notamment l'entrée de CO2 dans les cellules du mésophylle où il sera assimilé sous forme de
glu ides. Le deg
d’ouve tu e des sto ates
odule do
la o e t atio i te e e CO 2 et
les pertes en eau de la plante par transpiration. Les différents paramètres liés aux échanges
gazeu so t d te
i
s au
o e d'u s st
e po tatif de
esu e d’ ha ges gazeu de
type CIRAS-2 (PP SYSTEMS, Hitchin, UK) qui mesure in fine des variations de concentrations
en CO2 et e vapeu d’eau. Cal ul es à pa ti de es
esu es, les valeurs des paramètres
proposés sont des moyennes de 24 données : 4 plantes par écotype x 3 feuilles par plantes
x 2 expérimentations.
Au
47ème
JAL,
la
conductance
stomatique
diffère
de
manière
très
hautement significative (p<0,001) entre les 8 écotypes étudiés (Figure 41.A . L’ ot pe Cvi-0
possède une conductance stomatique beaucoup plus importante (en moyenne
206 mmol.m-2.s-1) que celle des 7 autres écotypes : elle est en moyenne 2 fois plus élevée
que la plus faible conductance moyenne déterminée chez les feuilles de Col-0
(100 mmol.m-2.s-1) et supérieure de 42 % à la 2nde plus forte conductance moyenne
déterminée chez Mt-0 (145 mmol.m-2.s-1). Les 5 autres écotypes ont des conductances
stomatiques dont les moyennes sont comprises entre 102 et 122 mmol. m-2.s-1.
128
Figure 42. Observation au microscope photonique d'une coupe de feuille d'Arabidopsis
thaliana (Col-0) à 50 jours après la levée, après coloration au bleu de Toluidine. Un
stomate est observé ainsi que le trajet du CO2 ambiant (Ca), au travers de la surface de la
feuille (Cs), des espaces intercellulaires (Ci), jusqu'au chloroplaste (Cc). La conductance de
la couche limite (gb), la conductance stomatique (gs) et la conductance du mésophylle (gm)
sont indiquées.
Figure 43. Observation au microscope électronique à transmission d'un parenchyme
assimilateur d'Arabidopsis thaliana (Col-0). Le parcours du CO2 des espaces
intercellulaires (Ci) jusqu'au chloroplaste (Cc) est caractérisé par la conductance des
espaces aériens intercellulaires (gias), la conductance de la paroi cellulaire (gw) et la
conductance à l'intérieur de la cellule en phase liquide (gliq). M : mitochondrie,
P : chloroplaste (Plast), S : amidon (Starch), W : paroi cellulaire (cell Wall).
Cliché : C.Abadie, F.Thibault, J.M. Perrault et P.Fleurat-Lessat.
Résultats
Globalement ces valeurs sont comparables à celles publiées dans la littérature pour des
pla tes d’Arabidopsis thaliana de même âge cultivées en conditions sensiblement
équivalentes : 80 à 120 mmol.m-2.s-1 pou l’ ot pe Col-0 (Flexas, J. et al., 2007; Stepien et
Johnson, 2009) et 110 mmol.m-2.s-1 pou l’ cotype C24 (Schlüter et al., 2003; Flexas, J. et al.,
2007; Stepien et Johnson, 2009).
La concentration interne en CO2 (Ci), également nommée concentration en CO2
inter-cellulaire ou sous-stomatique est notamment liée au degré d'ouverture des stomates
(Figure 42). Ce paramètre n'est pas directement mesuré mais calculé à partir des données de
o du ta e sto ati ue, de t a spi atio
et d’assi ilatio
ette. Les Ci varient
significativement entre les écotypes (p<0,001) epe da t l’a plitude e t e la o e t atio
interne en CO2
i po ta te
o e
e la plus lev e et elle
ue l’a plitude
ui est la plus fai le
’est pas aussi
esu e pou la o du ta e sto atique (gs) : +106 % de
différence de gs entre Col-0 et Cvi-0 et seulement + 18 % de différence de Ci entre Bl-1 et
Cvi-0 (Figure 41.B). Néanmoins, mê e s’il ’est pas possi le d’esti e di e te e t ave
confiance la Ci à partir de la seule gs, il ’est epe da t pas su p e a t de o state , e
situatio
o
o t ai te, ue l’ ot pe Cvi-0 qui exprime la conductance stomatique la plus
élevée est aussi caractérisé par une Ci significativement plus importante (en moyenne
,
pp
Col-0 et Cvi-
ue elle des aut es
e o duit e
ot pes. L’aug e tatio de gs de 106 % constatée entre
d fi itive
u’à u e
l vatio
o e
e de 15 % de la
concentration interne en CO2. Dans tous les cas la variabilité de la concentration interne en
CO2 reste beaucoup moins importante que celle de la conductance stomatique.
Le transfert du CO2 présent dans les espaces intercellulaires jusqu'aux sites de
carboxylation dans les chloroplastes est conditionné par la conductance mésophyllienne
(Figure 42). Plus précisément, le parcours du CO2 des espaces intercellulaires (Ci) jusqu'au
chloroplaste (Cc) est caractérisé par la conductance des espaces aériens intercellulaires (g ias),
la conductance de la paroi cellulaire (gw) et la conductance à l'intérieur de la cellule en phase
liquide (gliq, Figure 43).
129
Figure 44. Caractérisation de l'assimilation nette de CO2 de feuilles matures de 8 écotypes
d’Arabidopsis thaliana échantillonnées au 47ème jour après la levée du plant.
Concentration en CO2 : 380 ppm ; PPFD : 800 µmol.m-2.s-1 ; VPD : 0,8-1 KPa. Les valeurs
représentent des moyennes ± écarts-types (n= 24, 12 feuilles x 2 essais différents). ANOVA
différentes au seuil 5 %①d’ap s①le①test①de①Fishe .
Résultats
L'Assimilation nette de CO2 (AN) est calculée par le CIRAS-2 à partir de la différence
des concentrations en CO2 mesurées à l'entrée et à la sortie de la chambre de mesure. Une
différence très hautement significative (p<0,001) d'assimilation nette de CO2 est observée
entre les 8 écotypes (Figure 44). Le test de Fisher met en évidence un groupe homogène
composé des écotypes Bl-1, Cvi-0, Ge-0 et Mt-0 qui présentent des valeurs moyennes d'AN
comprises entre 6,24 et 6,83 µmolCO2.m-2.s-1 particulièrement élevées. À l’opposé,
l'assimilation nette moyenne de Col-0 (5,17 µmolCO2.m-2.s-1) est significativement plus faible
que celle des autres écotypes.
E
o e
e
% i f ieu e à l’An la plus importante détectée chez Mt-0
(6,83 µmol.m-2.s-1 , l’AN de Col-0 mesurée est conforme à celle décrite dans la littérature
(déterminée sur des feuilles individuelles) qui peut varier de 3 à 7,5 µmol CO2.m-2.s-1 en
fonction des conditions de culture et de mesure (Schlüter et al., 2003; Lake, 2004; Flexas, J.
et al., 2007; Munekage et al., 2008). Les valeu s d’AN déterminées à partir de la rosette
entière de Col-0 (la chambre de mesure accueille dans ce cas la plante entière) sont
généralement un peu supérieures à celles obtenues sur des feuilles individuelles (à l’aide
d’u e ha
e u ive selle de ,
2
) et varient de 5 à 9 µmolCO2.m-2.s-1. Ces assimilations
ettes l g e e t sup ieu es s’e pli ue t v aise
des osettes
ha tillo
es, l’usage de la pi e ta t
la le e t pa la plus g a de jeu esse
se v à des feuilles matures proches
de la sénescence ou déjà faiblement sénescentes. La faible assimilation nette de Col-0
pourrait expliquer sa Ci relativement élevée malgré une gs particulièrement faible.
L'écotype Cvi-0, caractérisé par la conductance stomatique et la concentration
interne en CO2 les plus élevées, a également une assimilation nette moyenne de CO2 parmi
les plus importantes. Cette assimilation nette moyenne de CO2 ne se distingue
statistiquement pas de celle de Ge-0 qui a pourtant une conductance significativement plus
faible de 45 % et une Ci inférieure de 14 %. Les relations entre gs, Ci et AN sont donc
complexes dans la mesure où elles sont conjointement régulées par les conditions
environnementales et par le métabolisme.
130
Figure 45. Caractérisation de la transpiration foliaire (mmolH2O.m-2.s-1) de feuilles matures
de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana échantillonnées au 47ème jour après la levée du plant.
Concentration en CO2 : 380 ppm ; PPFD : 800 µmol.m-2.s-1 ; VPD : 0,8-1 KPa. Les valeurs
représentent des moyennes ± écarts-types (n= 24, 12 feuilles x 2 essais différents). ANOVA
différentes au seuil 5 %①d’ap s①le①test①de Fisher.
Résultats
Pa ailleu s, d’aut es fa teu s o p is e
o pte, o
e la
sista e du
soph lle à la
diffusion du CO2 (1/gm), peuvent expliquer certaines déviances dans les relations existant
entre les grandeurs évoquées ci-dessus (Flexas et al., 2008). L’i t g atio da s les
od les
de la conductance mésophyllienne au CO2, connue pour être une fonction de la structure
a ato i ue foliai e voi e
e de l’a o da e e a uapo i es
e
a ai es, pou ait, e
donnant accès à la concentration en CO2 dans le chloroplaste, participer à une meilleure
définition du lien entre gs et AN (Uehlein et al., 2003; Hanba et al., 2004; Flexas et al., 2006;
Flexas et al., 2007; Pons et al., 2009).
1.2.3. Caractérisation de la transpiration et de l’efficience de
l'utilisation de l'eau
Le taux de transpiration (E) estime l'ensemble des pertes en eau de la feuille dues aux
transpirations stomatique et cuticulaire. Il existe une différence très hautement significative
du taux transpiration entre les écotypes (p<0,001) (Figure 45). Cvi-0 a un taux moyen de
transpiration de 1,57 mmolH2O.m-2.s-1 qui est significativement le plus élevé des 8 écotypes.
Mt-0 présente aussi un taux de transpiration important qui est en moyenne de
1,26 mmolH2O.m-2.s-1. Un groupe homogène, composé des écotypes An-1, Bl-1, Ge-0 et Oy-0,
se distingue avec des transpirations, statistiquement équivalentes, qui varient de 1,06 à
1,15 mmol.m-2.s-1. Enfin, Col-0 et Shahdara, caractérisés par un taux de transpiration
respectivement de 0,88 et 0,81 mmolH2O.m-2.s-1, o t des pe tes e
vapeu
d’eau
significativement moins importantes que celles des 6 autres écotypes.
Logiquement, les taux de transpiration apparaissent bien corrélés à la conductance
stomatique. Ainsi, l'écotype Cvi-0 se distingue par des valeurs moyennes de E et de gs qui
sont les plus élevées des 8 écotypes. À l’inverse, Col-0 et Shahdara qui ont un taux de
transpiration qui est en moyenne 48 % plus faible que celui de Cvi-0 sont caractérisés par
des valeurs moyennes de conductance stomatique parmi les plus faibles.
131
A.
B.
Figure 46. Caractérisation de l'efficience d'utilisation de l'eau calculée par le rapport
assimilation nette/conductance stomatique (A) et assimilation nette/transpiration (B) de
feuilles① atu es①de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana échantillonnées au 47ème jour après
la levée du plant. Concentration en CO2 : 380 ppm ; PPFD : 800 µmol.m-2.s-1 ;
VPD : 0,8-1 KPa. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 24, 12 feuilles
x 2 essais différents). ANOVA (p<0,05) : les moyennes identifiées par les mêmes lettres ne
sont pas statistiquement différentes au seuil 5 %①d’ap s①le①test①de①Fishe .
Résultats
Il e iste deu faço s d’app he de l’effi ie e ou effi a it d’utilisatio de l’eau au iveau
de la feuille : Medrano et al. (2009) calculent le rapport entre assimilation nette de CO2 et
conductance stomatique (AN/gs) alors que Swarthout et al. (2009) calculent le rapport entre
assimilation nette de CO2 et le taux de transpiration (AN/E).
La conductance stomatique (gs) ne peut refléter que les pertes en eau dues à la
transpiration stomatique alors que le taux de transpiration (E) estime les pertes en eau
totales dues aux transpirations stomatiques et cuticulaires. La conductance stomatique (g s)
et ses variations en fonction des conditions environnementales sont en partie
génétiquement fixées et donc régulées par la plante lorsque le VPD qui caractérise
l’at osph e ’est i t op fai le i t op lev pou l’esp e o e
e.
Le taux de transpiration (E) approche cette même composante et y ajoute la
transpiration cuticulaire qui, en supposant que la cuticule foliaire soit sta le d’u
l’aut e, appa a t alo s dava tage sou ise au pa a
t es e vi o
ot pe à
e e tau da s la
esu e
où elle ne peut pas être aussi directement régulée. Dans une atmosphère caractérisée par
u VPD
o e , la pe te d’eau pa voie sto ati ue est la ge e t
ajo itai e e vi o
%
sur la perte en eau cuticulaire (environ 10 %) (Hopkins, 2003).
Au 47ème jour après la levée, des différences significatives (p<0,001) du rapport AN/gs sont
relevées entre les écotypes (Figure 46.A . Ave des valeu s d’AN/gs comprises entre 0,057 et
0,062 µmol.m-2.s-1/mmol.m-2.s-1, les écotypes An-1, Bl-1, Col-0, Ge-0 et Shahdara utilisent
effi a e e t l’eau pou assimiler le CO2. À l'opposé, Cvi-0 se singularise par une efficience
d'utilisation de l'eau moyenne significativement plus faible de 44 % (0,033 µmol.m-2.s-1/
mmol.m-2.s-1 pa appo t à l’AN/gs le plus élevé qui caractérise Bl-1.
À cette même date et de manière prévisible, il existe également des différences
significatives du rapport AN/E entre les écotypes (p<0,001) (Figure 46.B). Shahdara possède
la meilleure efficience d'utilisation de l'eau (7,29 µmol.m-2.s-1/mmol.m-2.s-1).
132
Résultats
Avec des valeurs d'AN/E qui fluctuent entre 5,84 et 5,93 µmol.m-2.s-1/mmol.m-2.s-1, les
écotypes Bl-1, Col-0 et Ge-
so t a a t is s pa u e effi ie e d’utilisatio
de l’eau
moyenne significativement plus faible que celle de Shahdara et significativement plus élevée
que celle des 4 autres écotypes. À l'opposé, Cvi-
p se te u e valeu d’AN/E de
4,29 µmol.m-2.s-1/mmol.m-2.s-1 particulièrement faible et inférieure de 41 % à celle de
Shahdara.
Ces résultats confirment notamment la singularité de Cvi-0 caractérisé par des
rapports AN/gs et AN/E statistiquement plus bas que ceux des 8 autres écotypes. Ge-0 qui est
caractérisé par une assimilation nette élevée et statistiquement équivalente à celle de Cvi-0,
possède cependant l'une des plus faibles conductances stomatiques et a par conséquent l'un
des rapports AN/gs les plus élevés. Shahdara est défini par une assimilation nette de CO2
élevée (même si elle reste significativement inférieure à celle de Cvi-0) et le taux moyen de
transpiration le plus faible. Logiquement, ce dernier écotype est donc caractérisé par le
rapport AN/E le plus i po ta t. M
e si les g oupes ho og
es d’ ot pes d te t s pa le
test de Fisher sont quelque peu différents en fonction du rapport étudié (A N/gs ou AN/E), les
informations fournies par ces deux indicateurs sont sans surprise et globalement très
p o hes. Da s la suite de ette tude, l’utilisatio du appo t A N/E qui intègre les pertes
totales e vapeu d’eau pa t a spi atio
sto ati ue et uti ulai e se a p f
e à elle du
rapport AN/gs.
133
Figure 47. Expression relative des gènes des transporteurs de disaccharides (AtSUC, A) et
des transporteurs de monosaccharides de la famille des AtSTP (B), dans les feuilles
matures des écotypes Bl-1, Col-0, Cvi-0, Ge-0, Mt-0, Oy-0 et Shahdara, à 56 jours après la
levée. Les valeurs représentent la moyenne écart type de l'expression relative des gènes
normalisée par la moyenne de l'expression de 2 gènes de ménage (actine 11 et histone H4)
à partir de 2 expérimentations différentes et de 3 réplicats techniques par
expérimentation. Les points rouges indiquent une expression relative supérieure à la
moyenne des expressions de l'ensemble des gènes de transporteurs de sucres pour chaque
écotype.
Résultats
1.3. Expression de gènes de quelques transporteurs de sucres
L'analyse de l'expression de gènes de transporteurs de sucres a été réalisée par
macro-array à partir d'ARN extraits de feuilles matures issues de 7 écotypes et
échantillonnées au 56ème jour après la levée : Bl-1, Col-0, Cvi-0, Ge-0, Mt-0, Oy-0 et
Shahdara. L’ ot pe A -
’a pas t a al s . Pou
ha ue
ot pe, les valeu s d’e p essio
relative présentées constituent une moyenne de 2 valeurs issues de deux expérimentations
culturales totalement distinctes. L'expression relative des différents transporteurs de sucres
est normalisée à partir de la moyenne de l'expression relative de 2 gènes de ménage
(Actine 11 et Histone H4) présents sur chaque membrane. Compte tenu du faible nombre de
répétitions et de la sensibilité de détection de la méthode, il peut être parfois difficile : (i) de
statue su la
alit de l’e p essio ta t les sig au po t s pa les
pa fois fai les voi e i e ista ts à l’œil
e
a es de
lo so t
ais d te t s pa le logi iel d’a al se d’i age et
donc difficilement extractibles du « bruit de fond » ; (ii) au vu de certains écarts-types, de
d te te ave
o fia e d’ ve tuelles diff e es d’e p essio e t e les
des données présentées ci-ap s so t do
pas ét v ifi es à l’aide d’u e
ot pes. Ce tai es
à o sid e ave p ude e ta t u’elles ’o t
thode ua titative de t pe PCR e te ps
el.
La Figure 47.A présente l'expression relative des gènes de transporteurs de
disaccharides (DST) regroupés au sein de la famille AtSUC. Les gènes AtSUC1 et AtSUC2 sont
les plus exprimés, en conditions de culture non contrainte, dans les feuilles matures des
7
ot pes tudi s. L’e p essio d’AtSUC2, dont le transporteur possède une activité de
transport de saccharose considérée comme majeure dans le chargement et le déchargement
du phlo
e, a d jà t d te t e da s les feuilles jeu es et
atu es d’Arabidopsis thaliana
(Sauer et Stolz, 1994; Truernit et Sauer, 1995; Gottwald et al., 2000). L’e p essio d’AtSUC1,
transporteur surtout associé aux fonctions de déchargement de saccharose dans les organes
puits (Stadler et al., 1999; Bock et al., 2006; Sivitz et al., 2008) a aussi été révélée dans les
feuilles jeunes et matures d’Arabidopsis thaliana (Sauer et Stolz, 1994). Il est
particulièrement difficile, au vu des écarts-t pes, de d te te ave
diff e es d’e p essio e t e les
o fia e d’ ve tuelles
ot pes.
134
Résultats
Toutefois, il semble que les feuilles de Ge-0 expriment beaucoup plus fortement AtSUC1 que
celles des autres écotypes. Eu égard aux différentes réserves évoquées précédemment, il est
aussi d li at de o
e te ave p
isio et dis e e e t les
gènes AtSUC3, AtSUC4, AtSUC5, AtSUC678 et AtSUC9. Il se
l’o igi e de spots peu i te ses
le
sultats d’e p essio des
a
oi s u’AtSUC5, à
ais pa faite e t visi les, soit t s fai le e t e p i
les feuilles. La litt atu e o fi
e e
sultat da s la
esu e où l’e p essio
da s
de e
transporteur de saccha ose a d’o es et d jà t d te t e da s les g ai es, les a i es et les
feuilles (Baud et al., 2005 ; Mainson, Lemoine et Pourtau, Communication Personnelle).
Baud et al. (2005) font même remarquer que son expression foliaire reste faible.
Les niveaux d'expression relative des transporteurs de monosaccharides de la famille
STP sont présentés dans la Figure 47.B. Avec toutes les réserves déjà énoncées, seuls 3
(AtSTP3, AtSTP7 et AtSTP13) des 14 transporteurs recherchés seraient principalement
exprimés dans les feuilles matures des 7 écotypes étudiés. AtSTP3, connu pour être exprimé
p i ipale e t da s les feuilles de l’ ot pe C
d’Arabidopsis thaliana, est un transporteur
de nombreux monosaccharides (Büttner, 2010). AtSTP13 également présent dans les feuilles
d’Arabidopsis thaliana, a souve t t asso i à u e e o ilisatio d’he oses ota
e t au
cours du processus de sénescence (Nørholm et al., 2006). Le transporteur AtSTP7 est le
moins caractérisé des trois même si récemment une fonction de transporteur de galactose
lui a été attribuée (Laloi, Communication Personnelle). Observé dans les racines et les
g ai es e
d veloppe e t d’Arabidopsis thaliana (Büttner, 2010), la littérature ne
mentionne pas encore sa présence dans les feuilles bien que sa faible expression ait été
rapportée dans une banque de microarray (Genevestigator) et détectée à de nombreuses
reprises au sein du laboratoi e. Bie
u’ils g
e t de t s fai les sig au , les g
es oda t
AtSTP4 et AtSTP14 semblent eux aussi exprimés dans les feuilles matures des différents
écotypes étudiés. AtSTP4 est un transporteur typique des organes puits (racines, fleurs) dont
l’e pression reste faible dans les feuilles (Truernit et al., 1996). AtSTP14, vraisemblablement
impliqué dans le recyclage du galactose pariétal, est principalement exprimé dans les feuilles
(Poschet et al., 2010).
135
Figure 48. Expression relative de gènes de transporteurs de polyols AtPLT/AtPMT, dans les
feuilles matures des écotypes Bl-1, Col-0, Cvi-0, Ge-0, Mt-0, Oy-0 et Shahdara, à 56 jours
après la levée. Les valeurs représentent la moyenne écart type de l'expression relative
des gènes normalisée par la moyenne de l'expression de 2 gènes de ménage (actine11 et
histone H4) à partir de 2 expérimentations différentes et de 3 réplicats techniques par
membrane. Les points rouges indiquent une expression relative supérieure à la moyenne
des expressions de l'ensemble des gènes de transporteurs de sucres pour chaque écotype.
Résultats
Chez Arabidopsis thaliana, les transporteurs membranaires de polyols appartiennent
à la famille AtPLT encore nommée AtPMT. L'expression de 6 gènes de transporteurs de
pol ols a t
e he h e da s les feuilles
atu es des
ot pes d’Arabidopsis thaliana
étudiés. Les gènes AtPLT5 et AtPLT6 sont les gènes de transporteurs de polyols les plus
fortement exprimés dans les feuilles matures de tous les écotypes (Figure 48). AtPLT5 est un
transporteur polyvalent de polyols et de divers monosaccharides aussi bien identifié dans les
organes puits que dans les feuilles (Klepek et al., 2005; Reinders et al., 2005). AtPLT6,
présent lui aussi dans les feuilles matures et les organes puits (Genevestigator
e oe t
a a t is d’u poi t de vue fo tio
’a pas
el.
136
Tableau 7. Matrice de corrélation de Pearson (n) des variables mesurés sur 8 écotypes à 47
jours après la levée. Les valeurs en gras sont significativement différentes de 0 (p<0,05).
TLA : surface foliaire totale (Total Leaf Area)
Figure 49. Histogramme des valeurs propres (A), cercle des corrélations des variables (B) et
répartition des écotypes sur le plan factoriel (F1 et F2, C).
Résultats
1.4. Organisation de la diversité phénotypique des 8 écotypes
au 47ème jour après la levée
Une analyse multidimensionnelle neutre descriptive de type ACP été effectuée sur
l’e se
le des do
es elatives au
ot pes à l’e eptio des e p essio s de g
es
codant les transporteurs de sucres. Cette analyse a deux objectifs principaux : (i) la
recherche de corrélations éventuelles entre les 12 paramètres qui caractérisent au 47 ème
ot pes tudi s ; ii l’ide tifi atio des ph
jour après la levée des
ot pes les plus
originaux qui seront soumis à un déficit hydrique.
La matrice de corrélation des variables (Tableau 7) permet de mettre en relief les
corrélations significatives et positives entre la conductance stomatique (g s), la
transpiration (E), la concentration interne en CO2 (Ci) et le pourcentage d'eau dans la
biomasse fraîche des rosettes. Ces variables (gs, E, Ci et teneur en eau de la biomasse fraîche)
sont significativement et négativement corrélées avec l'efficacité de l'utilisation de l'eau
(AN/gs) et la teneur en chlorophylles des feuilles qui sont significativement et positivement
corrélées entre elles (r² = 0,819). La biomasse fraîche et la biomasse sèche sont aussi
significativement positivement corrélées (r² = 0,87). Sans surprise, la biomasse sèche est
o
l e à la su fa e foliai e p ojet e
² = ,
. Rappelo s u’à ette date, la su fa e
foliaire réelle est, au moins pour les écotypes les plus riches en feuilles, supérieure de 23 % à
28 % à la surface foliaire projetée.
Le diagramme des valeurs propres (Figure 49.A) montre que la combinaison linéaire
de va ia les ui g
e l’a e
est pa ti uli e e t pe fo
a te pou d
i e la va ia ilit
contenue dans le tableau de données constitué de 8 lignes-écotypes et de 12 colonnesvariables toutes plus ou
oi s o
l es e t e elles. E effet, l’a e fa to iel
su e à lui
seul 55,63 % de la variabilité contenue dans le jeu de données. Un tel pourcentage trahit de
très évidentes et fortes corrélations entre les variables mesurées et ou calculées. Ces
corrélations peuvent exprimer un fonctionnement physiologique particulier et/ou le fait que
le calcul de certaines de ces variables est effectué à partir de données sources communes.
137
Résultats
L’a e fa to iel
’e t ait ue
, 7 % de l’i e tie guère plus que le N°3 (11,81 %) et
le N°4 (11,30 %). Les axes 2, 3 et 4 ne contribuent donc que faiblement à la structuration du
pla fa to iel des i dividus. Co pte te u du peu d’ a t u’il e iste e t e les valeu s p op es
ui leu so t asso i es, il ’ a o je tive e t pas de aiso i p ieuse de s’i t esse plutôt
au pla fa to iel F /F
u’au pla s F /F et F /F : les combinaisons linéaires génératrices
des axes 2, 3 et 4 étant non corrélées entre elles chacun de ces axes est porteur
d’i fo
atio s ouvelles. L’e se
le de es pla s fa to iels a a t t
tudi , seul le pla
factoriel F1/F2 qui résume à lui seul 68,4 % de la variabilité sera finalement présenté ici.
La répartition des 8 écotypes sur le plan factoriel (Figure 49.C) est expliquée par le
cercle des corrélations des variables (Figure 49.B). Une varia le o t i ue d’auta t plus à
l’i e tie du pla
fa to iel o sid
p oje tio ou o
latio su l’u et/ou l’aut e des a es approchant alors la valeur 1.
L’a e
u’elle est p o he de la p iph ie du e le, sa
e p i e p i ipale e t la si gula it de Cvi-0 très fortement liée à des
paramètres hydriques : forte conductance stomatique (gs), fort taux de transpiration (E) et
pourcentage d'eau dans la biomasse fraîche important. Mt-0 a tendance à se distinguer des
autres par son assimilation nette de CO2 et par le diamètre de sa rosette. La position de
Shahdara est fortement déterminée par les données de biomasses (fraîche et sèche), la
surface foliaire projetée et l'effi ie e ou effi a it
d’utilisatio de l’eau al ul e su la
base du taux de transpiration (AN/E). Les écotypes An-1 et Col-0 sont surtout caractérisés par
une forte teneur en chlorophylles couplée à une bonne efficience d'utilisation de l'eau
calculée sur la base de la seule conductance stomatique (AN/gs). Enfin les écotypes Bl-1, Ge-0
et Oy-0 qui occupent le centre de la carte factorielle F1/F2, expriment des phénotypes
intermédiaires peu marqués caractérisés principalement par des valeurs moyennes des
paramètres mesurés.
L’o je tif de la deu i
e pa tie de cette étude est de soumettre 3 écotypes aux
caractéristiques différentes à une contrainte hydrique. Parmi les 8 écotypes étudiés, Col-0,
Cvi-0, Mt-0, An- et Shahda a,
v l s pa l’ACP, appa aisse t de facto comme de bons
candidats. L'écotype Cvi-0, très particulier notamment vis-à-vis de sa gestio de l’eau, au ait
t le a didat id al pou ette tude. Il ’a epe da t pas pu t e ete u.
138
Résultats
En effet, des cultures préliminaires ont démontré que cet écotype, au cycle de
développement plutôt court, fleurissait très rapidement après le 47 ème JAL. Le fait que son
métabolisme évolue de végétatif à reproductif pendant la période de contrainte hydrique
au ait e du l’e ploitatio de sa
po se au st ess d li ate pa appo t au autres écotypes
qui restent dans un état végétatif.
In fine, les écotypes Shahdara, Mt-0 et Col-0 seront choisis pour être soumis à un
st ess h d i ue de
jou s ui s’i stalle a p og essive e t pa a
t d’a osage au soi du
46ème JAL. Shahdara occupe en effet une position particulière sur le plan factoriel F1/F2. Sans
être aussi original que Cvi-0, Mt-0 est aussi caractérisé par une conductance stomatique et
un taux de transpiration plus élevés que la moyenne. L'écotype Col-0 parmi les plus étudiés,
a finalement été préféré à An- pou se vi d’ ot pe de
f e e.
139
Figure 50. Suivie de la morphologie des écotypes Mt-0, Col-0 et Shahdara contraints à une
période de 12 jours de déficit hydrique suivi d'une période de 4 jours de réhydratation.
Résultats
2. Effet d'un déficit hydrique sur la photosynthèse et le
phénotype glucidique de 3 écotypes d'Arabidopsis thaliana.
Cette étude a été menée sur les 3 écotypes précédemment choisis : Col-0, Mt-0 et
Shahdara. Au 47ème jour après la levée, les feuilles matures présentent des limbes aux
su fa es suffisa
s st
e t i po ta tes pou pouvoi
e po tatif de
t e a al s s i dividuelle e t à l’aide d’u
esu e d’ ha ges gazeu CIRAS-2 (PP Systems, Hitchin, UK). Cette date
a donc été choisie pour débuter l'expérimentation de stress hydrique. Toutes les plantes
reçoivent un dernier arrosage au soir du 46ème JAL. Au matin du 47ème JAL les plantes sont
séparées en deux lots : un lot de plantes « témoins » et un lot de plantes « stressées ». La
période dite de stress s'étend du 47ème (J0 du stress) au 59ème JAL (J+12, 12ème jour de stress).
La forte humidité qui règne dans la chambre de culture pendant la nuit (environ 90 %)
pe
et au d fi it h d i ue de s’i stalle p og essive e t et durablement. Le soir du dernier
jour de stress hydrique (59ème JAL), les plantes sont réhydratées et un dernier point de
mesure est effectué 4 jours plus tard afin d'observer leur récupération après la période de
déficit hydrique. Chez les plantes stressées, cette dernière série de mesures après
réhydratation a été effectuée sur des feuilles différentes de celles étudiées pendant toute la
durée du stress hydrique : es de i es taie t e effet t op s
d’u e uel o
es e tes pou fai e l’o jet
ue a al se. Chez les plantes témoins, les mêmes feuilles identifiées ont été
a al s es pe da t toute l’e p i e tatio .
2.1. Gestion de l'eau au cours du stress hydrique.
Les écotypes Mt-0, Col-0 et Shahdara ont été soumis à un stress hydrique. Durant
cette période de sécheresse, les plantes témoins et stressées ont été photographiées tous
les 3 jours (Figure 50). L'aspect de la rosette de Mt-0 est atteint par la contrainte hydrique
entre le 3ème et le 6ème jour après le dernier arrosage. Au 6ème jour après le début du stress,
les feuilles de Mt-0 ont perdu leur rigidité mais présentent un limbe qui conserve néanmoins
sa ouleu d’o igi e.
140
Résultats
Cette pe te de igidit
e d o pte de l’ tat plus ou
p e ie s sig es de l'effet du
a
oi s plas ol s des va uoles. Les
ue d’eau su les osettes des
ot pes Col-0 et Shahdara
apparaissent entre le 6ème et le 9ème jour sans arrosage. Au 9ème jour après le dernier
arrosage, les feuilles constitutives des rosettes de ces 2 écotypes ont perdu en partie leur
rigidité. À cette même date, Col-0 montre quelques feuilles jaunies et altérées par la
contrainte hydrique. Au 12ème jour sans arrosage les écotypes sont différemment marqués
par le déficit hydrique. Mt-0 est le plus affecté par le manque d'eau : certaines feuilles ont
te da e à s’e oule
su
elles-mêmes, de nombreuses feuilles sont complètement
desséchées et d'autres rougissantes semblent témoigner d'une accumulation d'anthocyanes.
Col-0 a tendance à montrer les mêmes symptômes que Mt-0 mais à un stade moins avancé.
Shahdara s'avère être l'écotype le moins altéré par la période de sécheresse : si quelques
feuilles ont jauni, de nombreuses autres feuilles demeurent aussi vertes que celles des
plantes témoins. L'ensemble de ces feuilles conservent encore à J+12 une rigidité que les
autres n'ont déjà plus.
Quat e jou s ap s l’ tape de
h d atatio , les pla ts de Col-0 et de Shahdara
réhydratés montrent des rosettes aux feuilles à nouveau rigides dont les surfaces foliaires
sont assez proches de celles qui caractérisent les plantes témoins. Chez ces deux écotypes, la
plupart des feuilles atteintes par la période de stress hydrique ont recouvré un aspect assez
proche de celui considéré comme « normal ». Mt-0 ne présente, après réhydratation qu'une
faible surface foliaire comparée à celle des plantes témoins : de nombreuses feuilles trop
altérées par le déficit hydrique n'ont pas pu récupérer leu aspe t d’o igi e.
141
Figure 51. Évolution du contenu relatif en eau des rosettes entières (RWC) mesuré chez des
feuilles matures témoins () et stressées ( ①de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana (Mt-0,
Col-0 et Shahdara) lors d'une première expérimentation (A) et d'une seconde
expérimentation (B).①S’agissa t①des①pla tes①sous① o t ai te①h d i ue,①la①p e i e① esu e①
a été effectuée après arrosage au 47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont
été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les
plantes stressées ont été réhydratées après la mesure effectuée à J+12 et une dernière
mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles, après 4 jours de réhydratation (J+16). Les
plantes témoins ont été régulièrement et convenablement hydratées. Les valeurs
représentent des moyennes ± écarts-types (n= 10). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et
***p<0,001.
Résultats
2.1.1. Évolution du contenu relatif en eau des rosettes et de la
transpiration foliaire
Pendant les périodes de stress et de réhydratation, le contenu relatif en eau (ou
RWC pour Relative Water Content) des rosettes témoins et des rosettes stressées est
déterminé tous les 3 jours à la même heure (entre 6h et 7h GMT) pour les 3 écotypes. La
Figure 51 montre l'évolution du RWC pour chacun des 3 écotypes. Pendant toute la période
de stress (du 47ème JAL au 59ème JAL) le RWC des plantes témoins des 3 écotypes reste stable
et varie en moyenne de 89 à 92 % (Figure 51.A). Ces valeurs témoignent de la parfaite
hydratation des cellules dont les vacuoles sont entre 89 % et 92 % de leur maximum de
turgescence.
Les plantes soumises au stress ont un RWC qui reste stable quelques jours avant de
chuter irrémédiablement jusqu'au dernier jour de stress (J+12). Le RWC diminue légèrement
mais significativement pour Col-0 (-2 %, p=0,0104) et (-1,26 %, p=0,019) pour Mt-0 dès le
3ème jour de stress. Le RWC des rosettes de Mt-0 chute fortement, -56,36 % par rapport au
témoin (p<0,001) entre le 6ème et le 9ème jour de stress, alors que durant la même période il
ne baisse que de 11,72 % dans les rosettes de Col-0 (p<0,001). À l'inverse de Mt-0 et de
Col-0, le RWC de Shahdara reste stable jusqu'au 6ème jour de stress, une baisse très
hautement significative de 6,75 % (p<0,001) est observée seulement lors du 9ème jour de
stress. Au dernier jour de stress (J+12), le RWC des écotypes Mt-0 et Col-0 chute très
lourdement respectivement de 64,7 % et de 61,8 % (p<0,001) alors que le RWC de Shahdara
ne baisse que de 34 % (p<0,001).
En résumé, le RWC de l'écotype Mt-0 décroche de manière très importante 3 jours
avant (J+6) celui des deux autres écotypes. Les plants de Mt-0 ont donc manqué plus
lo gte ps d’eau ue les pla ts de Col-0 et Shahdara. Au 9ème jour de stress, Col-0 et
Shahdara affichent donc des profils de réponse similaires et clairement différents de celui de
Mt-0 : faible chute de RWC chez Col-0 et Shahdara et très forte chute de RWC chez Mt-0.
142
Résultats
Au 12ème jour après le début du stress, alors que le RWC de Mt-0 est au plus bas, les rosettes
de Shahdara semblent davantage hydratées que celles de Col- . Ce
sultat
’est pas
surprenant dans la mesure où en situation non contrainte Shahdara est caractérisé par une
effi ie e d’utilisatio
de l’eau AN/E) significativement supérieure aux autres écotypes
(Figure 46.B).
Globalement moins stressées que celles des 2 autres écotypes, les rosettes de
Shahdara récupèrent, 4 jours après la phase de réhydratation, des contenus relatifs en eau
statistiquement identiques à ceux des plantes témoins (p=0,068). Davantage affectés par le
a
ue d’eau, les pla ts
h d at s de Col-0 présentent quant à eux des RWC légèrement
mais significativement inférieurs de 5 % à ceux des témoins (p<0,001). Quant aux rosettes de
Mt- affe t s t s tôt et de
a i e i po ta te pa le
a
ue d’eau, elles pei e t à
recouvrer, après réhydratation, des valeurs de RWC proches de celles des témoins (-14 %,
p<0,001).
Les résultats issus de ces trois essais réalisés en partie de manière décalée dans le
temps (pour pouvoir effectuer toutes les analyses aux dates choisies) corroborent très
largement ceux issus de trois autres essais réalisés dans des conditions culturales et
environnementales réputées identiques (Figure 51.B). Des profils de réponse au stress
hydrique globalement identiques à ceux précédemment décrits sont enregistrés pour
chacun des écotypes : Mt-0 reste caractérisé par un décrochage précoce du RWC, une
déshydratation globale plus importante des rosettes et une capacité de récupération du
RWC après réhydratation inférieure à celle de Col-0 et de Shahdara qui montrent des profils
de réponse au stress encore plus similaires que ceux évoqués précédemment. En effet, au
plus fort du stress (J+12), contrairement à ce qui avait été précédemment observé, les
rosettes de Col-0 et de Shahdara sont à peu près hydratées de manière équivalente. Dans
tous les cas, au cours de ces trois essais, sa s
u’il soit possi le de l’e pli ue
raisonnablement, le stress hydrique subi par chacun des 3 écotypes semble moins important
que celui qui a caractérisé les 3 autres essais précédemment discutés. Il en ressort une
version « atténuée » des effets et des
po ses
ui e pli ue
ota
e t
u’ap s
réhydratation, les rosettes stressées de Col-0 et de Shahdara récupèrent des RWC
statistiquement identiques à ceux des rosettes témoins.
143
Figure 52. Évolution du taux de transpiration (E) mesuré chez des feuilles matures témoins
() et stressées ( ① de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et Shahdara).
S’agissa t①des①pla tes①sous① o t ai te①h d i ue,①la①p e i e① esu e①a① t ①effe tu e①ap s①
arrosage au 47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3 (J+3),
6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été
réhydratées après la mesure effectuée à J+12 et une dernière mesure a été réalisée, sur de
nouvelles feuilles, après 4 jours de réhydratation (J+16). Les plantes témoins ont été
régulièrement et convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ±
écarts-types (n= 12, 4 plantes x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01
et ***p<0,001.
Résultats
Le taux de transpiration (E) est déterminé, au moyen du CIRAS-2 (PP Systems,
Hitchin, UK), tous les 3 jours durant la période de stress sur 3 feuilles par plante et 4 plantes
par traitement (témoin et stressé) pour chaque écotype (Figure 52). Il traduit la somme des
pertes en eau due aux transpirations stomatique et cuticulaire. Au 47 ème jour après la levée,
en situation hydrique non contrainte, Mt-0 a en moyenne un taux de transpiration
significativement plus élevé que ceux de Col-0 et de Shahdara (p<001). Ce résultat confirme
donc celui issu des essais visant à caractériser les 8 écotypes (1ère partie des résultats). Tout
au long de l'expérimentation de stress hydrique, le taux de transpiration des plantes témoins
fluctue faiblement avec parfois une tendance légère à la baisse.
Chez les plantes stressées, le taux de transpiration foliaire baisse au fur et à mesure
ue la s he esse s’i te sifie. Cette aisse t aduit u e fe
eture progressive des stomates.
Chez Mt-0 une diminution très hautement significative de 34,18 % (p<0,001) de la
transpiration est constatée dès le 6ème jour de stress, soit 3 jours avant celle mesurée chez
les 2 autres écotypes. Au 9ème jour de stress, le taux de transpiration diminue très
significativement de 52 % et 32,15 % (p<0,001) chez respectivement Col-0 et Shahdara. À
cette date, le taux de transpiration de Mt-0 a continué de chuter pour atteindre une valeur
de 0,14 mmol.m-2.s-1 (-87,5 % par rapport au témoin, p<0,001). Après 12 jours de stress
hydrique, E affiche une baisse très hautement significative pour les 3 écotypes par rapport à
leurs témoins respectifs : -95,5 % (p<0,001) pour Mt-0 ; -76,2 % (p<0,001) pour Col-0 et
-4,47 % (p<0,001) pour Shahdara.
Après réhydratation, seul Col-0 récupère un taux transpiration statistiquement
équivalent à celui des plantes témoins. Les plantes réhydratées des écotypes Mt-0 et
Shahdara conservent quant à elles un taux de transpiration significativement inférieur de
respectivement 54 % et 25 % (p<0,001) à celui des plantes témoins de même âge. Ces
sultats t aduise t v aise
la le e t la diffi ult
u’o t ces plantes à récupérer une
conductance stomatique normale.
Le déficit hydrique induit chez Mt-0 une baisse significative du taux de transpiration
entre 3 et 6 jours après le début du stress (observée à J+6 mais pas à J+3), soit environ
3 jours avant celle observée pour les écotypes Col-0 et Shahdara (observée à J+9).
144
Figure 53. Évolution des pertes en eau journalières mesurées chez des plantes stressées de
① ot pes① d’Arabidopsis thaliana [Mt-0 (), Col-0 () et Shahdara ()].① S’agissa t① des①
plantes sous contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée après arrosage au
47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9
(J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les plantes témoins ont été
écarts-types (n= 10). ANOVA (p<0,05) : les moyennes identifiées par les mêmes lettres ne
sont pas statistiquement différentes au seuil 5 %①d’ap s①le①test①de①Fishe .
Résultats
Pour chaque écotype, cette diminution importante du taux de transpiration des feuilles
(supérieure à 30 %) est au départ associée à une réduction modeste du RWC des rosettes ; la
chute brutale du RWC intervenant finalement durant les trois jours suivants.
Compte tenu de la périodicité des mesures, il est très difficile de positionner avec
e titude la fe
etu e sto ati ue et/ou so i du tio ava t ou ap s l’appa itio d’u e
l g e di i utio de RWC. Da s tous les as, il est peu p o a le u’u RWC d’e vi o
%
puisse provoquer une fermeture de type « mécanique » des stomates. La fermeture
stomatique observée exprimerait donc davantage une réponse à un signal dont le lien avec
le RWC reste à préciser.
2.1.2. Évolution de la réserve en eau du sol
Pour chacun des 3 écotypes étudiés, l'évolution de la ressource en eau du sol
accueillant les plantes soumises à la contrainte hydrique est suivie quotidiennement durant
toute la période de stress au moyen de deux techniques : i d te
i atio des
asses d’eau
perdues par le système « plante/substrat » au moyen de pesées successives et régulières ;
(ii d te
i atio de l’hu idit
elative du sol au
o e d’u hu idi
t e.
La masse d'eau perdue du jour est déterminée par différence entre la pesée de la
veille (J-1) et la pesée du jour (J). Lors des 5 premiers jours de stress, les pots de Mt-0 ont, à
l’e eptio
du
ème
jour, perdu significativement plus d'eau que ceux de Col-0 et de
Shahdara (Figure 53). Au 6ème jour de stress, la masse d'eau perdue par les pots de Mt-0
chute en moyenne de moitié par rapport au premier jour de stress alors que celle de
Shahdara reste stable jusqu'au 7ème jour de stress. Au 8ème jour de stress les pertes en eau
des écotypes Col-0 et Shahdara baissent respectivement de 43,5 et de 58,54 % par rapport à
celles observées au premier jour de stress.
L'humidité relative du sol est mesurée quotidiennement dans les pots soumis au
stress préalablement pesés et dans leurs homologues témoins (Figure 54.A). Au premier jour
de stress l'humidité relative du sol des 3 écotypes ne présente aucune différence
significative (p=0,272). Au 2ème jou de st ess le su st at des pots de l’ ot pe Shahda a est
caractérisé par une humidité relative en moyenne significativement supérieure de 13 % à
celle mesurée dans les pots de Mt-0 (p<0,001).
145
Figure 54. Évolution de l'humidité relative du substrat mesurée dans les pots des plantes
témoins et st ess es① de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana [Mt-0 (), Col-0 () et
Shahdara ()] lors de la première expérimentation (A) et d'une seconde expérimentation
(B).① S’agissa t① des① pla tes① sous① o t ai te① h d i ue,① la① p e i e① esu e① a① t ① effe tu e①
après arrosage au 47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3
(J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont
été réhydratées après la mesure effectuée à J+12 et une dernière mesure a été réalisée,
sur de nouvelles feuilles, après 4 jours de réhydratation (J+16). Les plantes témoins ont été
écarts-types (n= 10).
Résultats
À l’e eptio du
ème
jour de stress, du 2ème au 12ème jour de stress l'humidité relative
moyenne des pots de Shahdara demeure toujours significativement (à l'exception du J+10)
plus élevée que celle des pots Mt-0 qui reste toujours inférieure à celle de Col-0. En résumé,
pendant toute la période de stress hydrique, l'humidité relative du substrat qui accueille les
plants de Mt-0 reste toujours inférieure à celle des 2 autres écotypes ; l’hu idit
elative
des pots de Col-0 étant quant à elle toujours comprise entre celles de Mt-0 et de Shahdara.
Les hu idit s elatives
esu es da s le ad e d’u e se o de e p i e tatio de st ess
hydrique (Figure 54.B) confirment les tendances décrites ci-dessus (Figure 54.A).
Jusqu'au 6ème jour de stress, Mt-0 parvient à maintenir son RWC en compensant des
pertes en eau élevées par une importante et suffisante consommation de l'eau présente
dans le sol. Entre le 6ème et 9ème jour, son RWC chute significativement car la réserve en eau
disponible du sol est devenue trop faible pour permettre de compenser les faibles pertes en
eau observées à ce stade du stress hydrique. Le substrat utilisé au cours de ces
expérimentations est un mélange constitué de terreau et de vermiculite non calibrée sur
le uel il ’a pas t possi le de d te
g a deu s o
ues pou
fl t isse e t pe
i e ave u e p
isio a epta le les diff e tes
a a t ise l’ tat h d i ue d’u sol
se ve utile e eau, poi t de
a e t… . E supposant que les pertes en eau par évaporation (substrat +
plante) sont sensiblement équivalentes pour les 3 écotypes, on admet que les différences de
pertes en eau observées entre les écotypes traduisent essentiellement une variabilité de
transpiration. Autrement dit, les différences de pertes en eau journalières des pots
esu es pa pes es esti e t
ajo itai e e t l’i te sit de la t a spi atio . Le suivi
journalier de la quantité d'eau perdue par les pots peut donc permettre de préciser
l’ volutio du taux de transpiration de Mt-0 entre le 3ème et le 6ème jour de stress (Figure 52).
La chute importante du taux de transpiration de cet écotype aurait vraisemblablement lieu
entre le 5ème et 6ème jour de la période de sécheresse. Une humidité relative du substrat
utilisé pour cet essai, comprise entre 17 et 22 %, pourrait constituer, dans nos conditions
culturales, un signal responsable de la fermeture des stomates qui interviendrait avant la
chute du RWC ; u e hu idit
elative du su st at e o e plus fai le, de l’o d e de 14 à 18 %,
serait quant à elle corrélée avec une forte chute de RWC.
146
Figure 55. Évolution de la teneur en chlorophylles a et b mesurée chez des feuilles matures
témoins () et stressées ( ① de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et
Shahda a .① S’agissa t① des① pla tes① sous① o t ai te① h d i ue,① la① p e i e① esu e① a① t ①
effectuée après arrosage au 47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été
effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les plantes
stressées ont été réhydratées après la mesure effectuée à J+12 et une dernière mesure a
été réalisée, sur de nouvelles feuilles, après 4 jours de réhydratation (J+16). Les plantes
témoins ont été régulièrement et convenablement hydratées. Les valeurs représentent des
moyennes ± écarts-types (n= 28, 7 plantes x 4 feuilles par plante). Test de Student :
*p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
2.2. Effet d’un déficit hydrique sur la photosynthèse
2.2.1. Effet d’un déficit hydrique sur la teneur en chlorophylles
foliaires totales
L'évolution de la teneur en chlorophylles totales foliaires des écotypes Mt-0, Col-0 et
Shahdara est mesurée au moyen d'un chlorophylle-mètre SPAD-502 (KONIKA MINOLTA) au
cours de la période de stress hydrique (tous les 3 jours) et après 4 jours de réhydratation.
Au 47ème jour après la levée, la teneur en chlorophylles foliaires de Col-0 et de
Shahdara est significativement (p<0,001) plus élevée que celle de Mt-0 (Figure 55). Ce
résultat est conforme à celui acquis dans le cadre des autres essais visant à caractériser le
phénotype des écotypes (Figure 40). Tout au long de la période de stress, la teneur en
chlorophylles totales foliaires des plantes témoins demeure, pour chaque écotype,
sensiblement stable. La teneur en chlorophylles totales des feuilles stressées reste
équivalente à celle des feuilles témoins durant les 6 premiers jours de stress pour Mt-0 et
Col-0 et durant les 9 premiers jours de stress pour Shahdara. Des teneurs en chlorophylles
t s sup ieu es à elles jus u’alo s o se v es o t t
esu es lo s du
ème
et du 12ème jour
de stress pour Mt-0 et Col-0 et lors du 12ème jour de stress pour Shahdara. Ces teneurs,
v aise
pa a
la le e t a t fa tuelles, ’o t pas t p se t es da s la Figure 55. Le suivi de ce
t e epose e effet su l’utilisatio d’u
hlo ophylle-mètre qui effectue une mesure
sur une certaine surface foliaire. Au cours du stress hydrique, les feuilles des 3 écotypes se
contractent, s'enroulent et voient leur surface diminuer. La plasmolyse cellulaire a donc
tendance à faire diminuer la surface foliaire et à faire augmenter le nombre de cellules et
donc le nombre de chloroplastes par unité de surface. Cette augmentation de densité
hlo oplasti ue o duit v aise
la le e t à l’aug e tatio de la te eu e
hlo oph lles
observée. Cette hypothèse a été vérifiée expérimentalement : une même feuille
déshydratée puis réhydratée voit sa teneur en chlorophylles totales diminuer
spectaculairement en quelques heures seulement (données non présentées). Cette
hypothèse peut également expliquer, 4 jours après l’ tape de
h d atatio , la diff e e de
comportement entre Mt- d’u e pa t et Col- et Shahda a d’aut e pa t.
147
Résultats
En effet, après réhydratation, les écotypes Col-0 et Shahdara récupèrent une teneur
en chlorophylles foliaires équivalente à celle des plantes témoins. Ce résultat montre que les
nouvelles feuilles échantillonnées pour ce dernier point de mesure ont totalement conservé
leur capacité à se réhydrater normalement. La teneur en chlorophylles totales des feuilles de
Mt-0 est quant à elle très significativement plus importante que celle des plantes témoins
(p<0,001). Plutôt u’u e aug e tatio de la ios th se de chlorophylles, cette observation
t aduit plutôt la diffi ult , plusieu s fois vo u e, u’o t les pla ts de Mt-0 à récupérer et
donc à se réhydrater convenablement après les 12 jours de stress. Rappelons, que leur RWC
reste après réhydratation significativement inférieur (p<0,001) à celui des rosettes témoins
du même âge.
148
Figure 56. Évolution de la conductance stomatique (A), de la concentration interne en CO 2
B ①et①de①l’assi ilatio ① ette①de①CO2 (C) mesurées chez des feuilles matures témoins () et
stressées ( ① de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col- ① et① Shahda a .① S’agissa t①
des plantes sous contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée après arrosage
au 47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9
(J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été réhydratées
après la mesure effectuée à J+12 et une dernière mesure a été réalisée, sur de nouvelles
feuilles, après 4 jours de réhydratation (J+16). Les plantes témoins ont été régulièrement
et convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types
(n= 12, 4 plantes x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et
***p<0,001.
Résultats
2.2.2. Effet d’un déficit hydrique sur les échanges gazeux instantanés et
quelques paramètres dérivés
Effet d’u d fi it h d i ue su la o du ta e sto ati ue gs)
L'évolution de la conductance stomatique (gs) des trois écotypes soumis à la période
de sécheresse est suivie à l'aide du CIRAS 2 (PP Systems, Hitchin, UK). Elle est calculée à
partir de la mesure de l'absorbance de la vapeur d'eau dans les infrarouges. Les valeurs
présentées sont des moyennes de mesures effectuées sur 3 feuilles par plante et 4 plantes
par traitement et par écotype (Figure 56.A).
À 47 jours après la levée, Mt-0 est caractérisé par une conductance stomatique
significativement plus élevée (p<0,001) que celles de Col-0 et de Shahdara (Figure 56.A). Ces
sultats
o o oe t
eu
a uis da s le
ad e d’u e aut e s ie e p i e tale
(Figure 41.A). Globalement, pour chacun des trois écotypes, la conductance stomatique des
feuilles t
oi s
ha tillo
es
guli e e t pe da t toute la du e de l’e p i e tatio
(16 jours = 12 jours de stress + 4 jours de réhydratation) reste relativement constante dans
le temps. Seule la gs des feuilles témoins de Shahdara tend à décliner entre le 12 ème et 16ème
jour de l'expérimentation traduisant peut-être un effet sénescence.
La conductance stomatique (gs) des plantes soumises à la contrainte hydrique baisse
progressivement au fur et à mesure que la sécheresse s'installe. La gs est calculée à partir du
taux de transpiration (E). Il ’est do
pas su p e a t de o state
ue, pou
ha u des
écotypes, le profil de réponse de la gs au stress hydrique est similaire à celui du taux de
transpiration précédemment discuté. Ainsi, la gs moyenne des feuilles de Mt-0 reste
équivalente aux valeurs témoins seulement pendant les 3 premiers jours de stress ; elle
chute ensuite rapidement de 130 à 11,5 mmolH2O.m-2.s-1 en 6 jours (- 92 % par rapport au
témoin non stressé, p<0,001 à J+9) avec une baisse de 47 % déjà très significative au 6ème
jour de stress (p<0,001) par rapport à la gs des plantes témoins.
149
Résultats
Une diminution significative de la conductance stomatique est observée chez Col-0 (-61 %,
p<0,001) et Shahdara (-43 %, p<0,001) au 9ème jour de stress, soit 3 jours après Mt-0. Entre
le 6ème et le 12ème jour (dernier jour) de stress, la gs des plantes de Col-0 stressées décroît de
89 à 17,4 mmolH2O.m-2.s-1 (-83 % par rapport au témoin non stressé, p<0,001) alors que la gs
de Shahdara décroît de 95,2 à 20,57 mmolH2O.m-2.s-1 (-84 % par rapport au témoin non
stressé, p<0,001).
Après une période de réhydratation de 4 jours, les feuilles nouvellement
échantillonnées de Col-0 sont les seules à recouvrer une conductance stomatique
statistiquement semblable à celle des plantes témoins. Les gs moyennes des feuilles
réhydratées (et également nouvellement échantillonnées) des écotypes Shahdara et Mt-0
restent très significativement plus faibles que leurs homologues témoins : -91 % (p<0,001)
pour Mt-0 et -32,5 % (p<0,001) pour Shahdara. La faible récupération des plants de Mt-0
’est pas su p e a te au ega d de leu ph
ot pe pa ti uli e e t affe t pa le st ess
hydrique.
Effet d’u d fi it h d i ue su la o e t atio i te e e CO2 (Ci)
La concentration interne en CO2 (Ci) traduit un équilibre entre l'ouverture des
stomates et la consommation du CO2 des cellules du mésophylle. Cette valeur n'est pas
directement mesurée mais calculée à partir des valeurs de conductance stomatique, de
transpiration et d'assimilation nette (Caemmerer et Farquhar, 1981). Peu de données de Ci
ont été publiées. En situation non contrainte, Flexas et al. (2007) évoquent une
concentration interne en CO2 dans les feuilles matures de Col-0 de 311,4 ppm sensiblement
supérieure à celle mesurée ici au 47ème JAL (266 ppm). Cette diff e e peut s’e pli ue e
partie par une conductance stomatique inférieure en moyenne de 30 mmol.m-2.s-1 à celle
mesurée par Flexas et al. (2007). Au 47ème JAL, Mt-0 est caractérisé par une concentration
interne en CO2 moyenne plus élevée (p>0,05) que celles de Col-0 et Shahdara (Figure 56.B).
La concentration interne en CO2 des feuilles témoins a tendance à augmenter légèrement au
ou s du te ps. Cette te da e à l’aug e tatio peut
la conductance stomatique (gs sa s aug e tatio
soit d’u e di i utio de l’assi ilatio
sulte soit d’u e aug e tatio de
o o ita te de l’assi ilatio
ette AN),
ette, soit des deu .
150
Résultats
La o du ta e sto ati ue ’aug e ta t pas Figure 56.A , il se
Figure 56.C,
ue
l’assi ilatio
ette.
le, o
e l’i di ue la
ette te da e à l’aug e tation de Ci traduise une diminution de
Au cours de la contrainte hydrique, un profil de réponse en 3 temps est observé pour
chacun des 3 écotypes, comme rapporté dans la littérature (Brodribb, 1996; Flexas et
Medrano, 2002; Lawlor et Cornic, 2002). Durant les premiers jours de stress la Ci reste stable
et équivalente à celle des témoins avant, dans un deuxième temps, de diminuer
significativement pour enfin, dans un troisième temps, augmenter à nouveau
sig ifi ative e t jus u’à la fin du stress hydrique. Pour Mt-0 la chute de Ci (J+6) suivie de
son augmentation (J+9) est observée 3 jours avant celle constatée chez Col-0 et Shahdara.
Au 6ème jour de stress, une diminution très hautement significative de 13 % (p<0,001) de Ci
est observée chez les feuilles stressées de Mt-0 comparativement à la Ci des feuilles témoins.
Au 9ème jour de stress hydrique, Col-0 et Shahdara subissent à leur tour une diminution
significative de leur Ci de respectivement 21 % (p<0,001) et 11 % (p=0,02). À cette même
date (J+9), la Ci de Mt-0 augmente de manière très hautement significative de 30 % (p<0,001
par rapport à la Ci témoin). Au 12ème et dernier jour de stress, des augmentations très
hautement significatives de Ci de 33 % (p<0,001), de 25 % (p<0,001) et de 18 % (p<0,001)
sont notées pour, respectivement, les écotypes Mt-0, Col-0 et Shahdara par rapport à leurs
homologues témoins. Lors de la période de sécheresse, la chute de Ci observée pour chaque
écotype est corrélée avec la fermeture partielle des stomates et peut donc en conséquence
s’e pli ue pa u e di i utio des appo ts e CO2 dans les cellules du mésophylle. Trois
jours plus tard, l'augmentation de Ci traduirait un ralentissement de l'activité carboxylase de
la Rubisco due à différentes limitations non-diffusives (Flexas et Medrano, 2002).
Après réhydratation, les feuilles stressées des écotypes Col-0 et Shahdara récupèrent
des valeurs de Ci équivalentes à celles déterminées pour les atmosphères internes foliaires
témoins. Les plantes réhydratées de l'écotype Mt-0 ne recouvrent que 82,3 % (p<0,001) des
concentrations internes en CO2 déterminées chez les témoins. Cette diminution significative
de 17,7 % du Ci traduit vraise
la le e t l’i apa it
u’o t es pla tes à et ouve u e
conductance stomatique comparable à celle des témoins.
151
Résultats
Effet d’u d fi it h d i ue su l’assi ilatio
ette de CO2 (AN)
L'assimilation nette de CO2 (AN) est déterminée directement en calculant la
différence de concentration en CO2 à l'entrée et à la sortie de la chambre de mesure. Au
47ème JAL, il existe une différence significative (p<0,001) d'AN entre les 3 écotypes : comme
précédemment constaté (Figure 44), Mt-0 a en moyenne l'AN la plus élevée
(6,71 µmolCO2.m-2.s-1) (Figure 56.C). De manière assez générale, l'AN des plantes témoins a
tendance à diminuer au cours du temps traduisant peut-être un vieillissement des feuilles
et/ou un effet délétère des prises répétées de mesures. Cet effet est particulièrement visible
chez les feuilles témoins de Mt- do t l’AN diminue de 57 % pendant les 16 jours (période de
h d atatio
o p ise
u’a du
l’e p ie e.
Globalement, l'assimilation nette de CO2 des 3 écotypes baisse au fur et à mesure
que le déficit hydrique s'installe. Comme attendu, les effets apparaissent précocement chez
Mt-0. Ainsi, dès le 6ème jour de stress, cet écotype subit une baisse très significative d'A N de
18 % (p<0,01) par rapport à celle des témoins. L'AN des feuilles stressées de Mt-0 chute entre
le 3ème et le 6ème jour de stress de 6,14 à 4,5 µmol CO2.m-2.s-1. À partir du 9ème jou jus u’au
dernier jour de stress, l’AN de Mt-0 est soit totalement inhibée soit masquée par un
dégagement de CO2 issu des échanges respiratoires et/ou photorespiratoires. La diminution
d'AN pour Col-0 et Shahdara n'est observée qu'au 9ème jour de stress. Pour Col-0 cette baisse
est très hautement significative (-33 %, p<0,001) et hautement significative pour Shahdara
(-17 %, p=0,003). Entre le 6ème et le 9ème jour de stress, l'AN diminue de 4,91 à
3,17 µmolCO2.m-2.s-1 pour Col-0 et de 5,26 à 3,85 µmolCO2.m-2.s-1 pour Shahdara. Entre le 9ème
et le 12ème jour de stress, les feuilles de Col-0 et de Shahdara perdent totalement leur
capacité à fixer plus de CO2 pa photos th se u’elles ’e li
e t pa
espi atio et/ou
photorespiration (photosynthèse nette nulle). En résumé, la diminution d'assimilation nette
de CO2 est dans un premier temps corrélée à la baisse de la conductance stomatique qui
induit une chute de la concentration interne en CO2. Trois jours après, l'inhibition complète
de l’assi ilatio
ette, o s utive à la hute
utale de la o du tance stomatique,
explique la forte remontée de la concentration interne en CO2.
152
Figure 57. Évolution du rapport assimilation nette/transpiration (AN/E) mesuré chez des
feuilles matures témoins () et stressées () de 3 écotypes d’Arabidopsis thaliana (Mt-0,
Col- ①et①Shahda a .①S’agissa t①des①pla tes①sous① o t ai te①h d i ue,①la①p e i e① esu e①a①
été effectuée après arrosage au 47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont
été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les
plantes stressées ont été réhydratées après la mesure effectuée à J+12 et une dernière
mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles, après 4 jours de réhydratation (J+16). Les
plantes témoins ont été régulièrement et convenablement hydratées. Les valeurs
représentent des moyennes ± écarts-types (n= 12, 4 plantes x 3 feuilles par plante). Test de
Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
L’a se e d’assi ilatio
ette de CO2 constatée à partir du 9ème jour chez Mt-0 et au
12ème jour chez Col-0 et Shahdara, malgré des Ci supérieurs aux témoins, tend à démontrer
ue l’a êt de la carboxylation est issu d’u e li itatio
ta oli ue do
ava t
indépendante de la concentration en CO2 interne des feuilles (Flexas et Medrano, 2002;
Lawlor, 2002; Lawlor et Cornic, 2002; Flexas et al., 2004b; Flexas, J. et al., 2004).
Après 4 jours de réhydratation, seul Col-0 récupère une AN statistiquement
équivalente à celle des plantes témoins. L'AN des écotypes Mt-0 et Shahdara reste très
significativement plus faible que celle mesurée chez les témoins : -31 % (p<0,001) pour Mt-0
et -19 % pour Shahdara (p=0,005).
Effet d'un déficit hydrique sur l'efficience d'utilisation de l'eau (AN/E)
Le rapport assimilation nette/transpiration (AN/E) rend compte de l'efficience
d'utilisation de l'eau. Il est calculé à partir du flux de CO2 entrant dans la feuille et du flux
total de vapeur d'eau sortant de cette même feuille. Ce rapport diminue avec le temps pour
les plantes témoins des 3 écotypes (Figure 57). Au début de la période de stress la valeur de
ce rapport reste semblable à celle qui caractérise les plantes témoins. Dans un second
te ps, l’aug e tatio de e appo t t
oig e d’u e
eilleure efficience de l'utilisation de
l'eau ui s’e pli ue pa u e assi ilatio
ette e o e i po ta te
e si elle di i ue u
peu comparativement au témoin) malgré la relative fermeture des stomates. E d’aut es
termes, la fermeture stomatique observée réduit dava tage la t a spi atio
p
alise l’assi ilatio
u’elle
e
ette de CO2. À ce moment du déficit hydrique, il est probable que la
carboxylation du ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP), maintenue malgré une fermeture
stomatique significative, consomme la concentration interne en CO2 restante. Dans un
troisième temps, en fin de stress hydrique, la chute du rapport A N/E traduit une baisse de
l'assimilation nette reliée en partie à la fermeture des stomates et à l'installation de
limitations métaboliques plus ou moins directement liées à ladite fermeture (Flexas et al.,
2006b; Galmés et al., 2007). Ce profil de réponse à la contrainte hydrique est observé chez
les 3 écotypes et débute, comme attendu, 3 jours plus tôt chez Mt- . Quoi u’il e soit, la
plus forte augmentation de l’effi ie e de l’utilisatio de l’eau a été détectée chez Col-0 :
+40 % à J+9 (p<0,001).
153
Résultats
Cette aug e tatio
’est ue de
% p<0,001) chez Mt-0 et de 24 % (p<0,004) chez
Shahdara. Les valeurs négatives du rapport AN/E observées chez Mt-0 à J+9 et J+12
i di ue t,
u’à es deu dates, les
ha ges gazeu
espi atoi es so t sup ieu s au
échanges gazeux photosynthétiques de même nature mais de sens inverse. Autrement dit, le
signe moins traduit un dégagement net de CO2.
Après réhydratation, les feuilles nouvellement échantillonnées de Col-0 et Shahdara
récupèrent des valeurs d'AN/E similaires à celles des plantes témoins alors que ce même
rapport est significativement (p<0,001) supérieur au témoin dans le cas de Mt-0, traduisant
ainsi la faible capacité de ses plantes à recouvrer une conductance stomatique normale.
154
Figure 58. Évolution de la respiration nocturne mesurée chez des feuilles matures témoins
() et stressées () de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et Shahdara).
S’agissa t①des①pla tes①sous① o t ai te①h d i ue,①la①p e i e① esu e①a① t ①effe tu e①ap s①
arrosage au 47ème jour après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3 (J+3),
6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été
réhydratées après la mesure effectuée à J+12 et une dernière mesure a été réalisée, sur de
nouvelles feuilles, après 4 jours de réhydratation (J+16). Les plantes témoins ont été
régulièrement et convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes
± écarts-types (n= 12, 4 plantes x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01
et ***p<0,001.
Résultats
Effet du déficit hydrique sur la respiration nocturne (Rn)
La respiration mitochondriale nocturne (Rn) est mesurée in vivo après une adaptation
à l'obscurité d'une nuit suivie d'u e p iode d’a li atatio de
i à l’o scurité dans la
chambre de mesure. Au 47ème jour après la levée, les respirations nocturnes des 3 écotypes
sont statistiquement semblables (p>0,05) et comprises entre 0,54 et 0,58 µmolCO2.m-2.s-1
(Figure 58). Pendant la durée de l'expérimentation, la respiration nocturne des feuilles
témoins des 3 écotypes fluctue entre 0,26 et 0,61 µmolCO2.m-2.s-1. Ces valeurs sont un peu
plus faibles que celles rencontrées dans la littérature qui sont comprises entre 0,75 et
1,34 µmolCO2.m-2.s-1 (Donahue et al., 1997; Hummel et al., 2010; Vasseur et al., 2011).
Pendant les 6 premiers jours de stress pour Mt-0, et pendant les 9 premiers jours de stress
pour Col-0 et Shahdara, la respiration nocturne reste statistiquement équivalente à celle
mesurée chez les feuilles témoins même si une tendance non significative à la baisse est
observée à partir du 3ème jour de stress chez Shahdara. Au 9ème jour de stress, une
augmentation très significative de la Rn de 76 % (p<0,001) est mesurée dans les feuilles de
Mt-0. Trois jours plus tard (J+12), cette hausse très significative de la R n est également
observée chez Col-0 (x 2,2 comparativement aux feuilles témoins, p<0,001) et chez Shahdara
(x 3,2 comparativement aux feuilles témoins, p<0,001). Flexas et al. (2005) ont montré que la
Rn de six plantes méditerranéennes exprime une réponse biphasique à la sécheresse : elle
hute ave le RWC jus u’à e ue elui-ci atteigne environ 60 % puis elle augmente ensuite
lorsque le RWC chute au-delà de 50 %. Pour Arabidopsis thaliana, certains auteurs ont
observé durant un déficit hydrique modéré à sévère une augmentation de la respiration
nocturne ; au u e hute ’a t d te t e da s le as d’u d fi it h d i ue
od
(Hummel
et al., 2010). Il faut toutefois mentionner que ces travaux ne fournissent pas le RWC des
rosettes analysées. Cette augmentation de la respiration associée aux faibles RWC traduirait
alors une stimulation du métabolisme et de la production d'ATP nécessaires à
l’e le he e t des
a is es d’a li atatio au st ess (Slot et al., 2008). Les résultats
présentés ici ne montrent aucune baisse significative de la Rn. Compte tenu des profils
d’ volutio du RWC au ou s du stress (Figure 51), il ’est pas e lu ue le pas de
esu e ait
e p h d’o se ve ette aisse.
155
Résultats
En revanche, une augmentation significative de la Rn est bel et bien détectée chez Col-0
(J+12), Shahdara (J+12) et Mt-0 (J+9) pour des RWC moyens respectivement de 33 %, 60 % et
51 %. Chez Mt-0 cette augmentation de respiration nocturne est transitoire : présente à J+9
mais absente à J+12. La relation entre la Rn et le RWC ’est pou ta t pas toujou s aussi
simplement vérifiée : il existe une augmentation significative de la Rn de Col-0 à J+12 pour un
RWC
o e de
% alo s ue ette sti ulatio
’est plus o se v e hez Mt-0 à J+12 pour
un RWC moyen de 31 %. Ce retour de la Rn à une valeur équivalente à celle des plantes
témoins a déjà été observé chez Nicotiana tabacum (Begcy et al., 2011). À cette date (J+12),
Mt-0, qui a vu chuter son RWC avant Col-0, a donc subi pendant plus longtemps les effets
liés à un faible RWC. La durée du stress subi par la plante participerait donc dans la relation
liant la Rn et le RWC.
156
Figure 59. Évolution de la réponse de l'assimilation nette de CO2 à la variation de la
concentration interne en CO2 mesurée chez des feuilles matures témoins () et stressées
( ①de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col- ①et①Shahda a .①S’agissa t①des①pla tes①
sous contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée au 48ème jour après la levée
(J+1). Les mesures suivantes ont été effectuées 4 (J+4), 7 (J+7), 10 (J+10) et 13 (J+13) jours
après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été réhydratées après la mesure
effectuée à J+13 et une dernière mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles, après 4
jours de réhydratation (J+17). Les plantes témoins ont été régulièrement et
convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 6 à
J+1, ensuite n= 3).
Résultats
2.2.3. Effet d’un déficit hydrique sur la réponse de l’assimilation nette
à l’augmentation de la concentration interne en CO2 et sur quelques
paramètres photosynthétiques dérivés des courbes AN/Ci
Effet d’u st ess h d i ue su l’allu e g
ale des ou es AN/Ci
La réponse de l'assimilation nette de CO2 (AN) à la variation de la concentration
interne en CO2 (Ci) est déterminée sur une feuille mature par plante et sur 3 plantes par
écotype et par traitement. Au 47ème jour après la levée (J0), les données représentent la
moyenne de 6 courbes (3 plantes du lot témoin et 3 plantes du lot stressé rigoureusement
uivale tes e te
e d’h d atatio à elles du lot t
oi . À partir de J+3 et pour chaque
nouvelle date de mesure, les résultats expriment, pour chaque écotype et chaque
traitement, la moyenne de 3 courbes. Peu d'études ont été réalisées dans ces conditions sur
des feuilles i dividuelles d’Arabidopsis thaliana. La
po se de l’assi ilatio
ette de CO2
(AN) à la variation de la concentration interne en CO2 (Ci) des 3 écotypes (Mt-0, Col-0 et
Shahda a est
tudi e pe da t la p iode de st ess h d i ue et ap s l’ tape de
réhydratation (Figure 59). Au 47ème JAL (J0), les courbes AN/Ci des trois écotypes, établies en
situatio
put e o
o t ai te, so t peu diff e tes
e si les
po ses de l’A N à
l’aug e tatio de CO2 mesurées chez Col-0 et Shahdara semblent plus proches entre elles
u’elles e le so t de elles
esu es hez Mt-0.
Les faibles écarts-types associés à chaque point moyen des courbes, notamment
celles relatives à Col-0 et Shahdara, traduisent de très faibles variabilités inter-foliaire et
inter-individuelle qui expriment une forte fixation des caractéristiques photosynthétiques.
L’allu e et les a a t isti ues g
ales de la ou e AN/Ci de Col-0 sont très proches de
celles décrites pour des feuilles matures par Flexas et al. 2007 qui note également
l’appa itio
a i u
d’u
plateau pou u e Ci d’e vi o
à e plateau d’e vi o
µ ol.
pp
et u e valeu d’assi ilatio
-2 -1
.s également très proche de celle présentée
ici : 12,31 µmol.m-2.s-1 à J0 (Figure 59 . Du a t les
jou s d’e p i e tatio , les pe tes
i itiales et la valeu d’AN maximum (correspondant au plateau des courbes A N/Ci) des
plantes témoins des 3 écotypes ont légèrement diminué avec le temps.
157
Résultats
Cette modification des caractéristiques photosynthétiques rend vraisemblablement compte
d’u
p o essus de s
es e e
ui de su
o t peut
t e plus ou
oi s a
l
artificiellement par la manipulation des feuilles qui peut générer des traumatismes lors de
leu i stallatio /d si stallatio da s la ha
u’u e e positio
e de
esu e. Il ’est pas e lu o plus
p t e des feuilles tous les jou s pe da t u peu plus de deu heu es
à une PPFD de 800 µmol.m-2.s-1 très supérieure à celle auquel elles sont soumis au quotidien
(60-100 µmol.m-2.s-1)
puisse
i dui e
u
vieillisse e t
p
atu
de
l’appa eil
photosynthétique en général et des systèmes photorécepteurs en particulier.
Au fur et à
esu e ue le st ess h d i ue s'i stalle, la
po se de l’assi ilatio
ette
(AN) à la variation de la concentration interne en CO2 (Ci) est progressivement altérée. Le
déficit hydrique affecte les courbes AN/Ci de Mt-0 entre le 4ème et le 7ème jour de stress alors
que celles de Col-0 et de Shahdara sont réellement et clairement atteintes trois jours plus
tard (entre le 7ème jour et le 10ème jour) et dans une moindre mesure (comparativement à
Mt-0 à J+7). Toutefois, à J+3 et J+6 pour Col-0 et à J+6 pour Shahdara, il est déjà possible
d’o se ve
ue le plateau des ou es est attei t, hez les feuilles st ess es, pou des
valeu s d’AN très légèrement inférieures à celles des feuilles témoins. Compte tenu de la
précision des mesures et des faibles écarts-types, cette observation pourrait peut-être
t
oig e d’u tout p e ie et l ge effet du d fi it h d i ue plutôt ue d’u a t fa t li à
l’ ha tillo
age. Quoi u’il e soit, à J+ et J+
, les ou es A N/Ci de Shahdara souffrent
moins du déficit hydrique que celles des deux autres écotypes. Ainsi, après 9 jours sans
arrosage, le plateau des courbes des plantes stressées de Shahdara reste assez proche de
celui des plantes témoins, seule la concentration interne maximale possible en CO 2 a
clairement diminué (1 000 ppm dans les feuilles stressées au lieu de 1 400 ppm dans les
feuilles témoins). Au 12ème jour de stress, Shahdara est l'écotype qui résiste le mieux à la
période de sécheresse : son AN maximale est encore de 4,29 µmol.m-2.s-1 alors que celle des
écotypes Col-0 et Mt-0 est, respectivement, de 1,58 et de 0,84 µmol.m-2.s-1. En fin de stress,
le d fi it h d i ue a attei t de
a i e diff e te suiva t l’ ot pe la apa it des pla tes à
maintenir des concentrations internes en CO2 stables et importantes en présence de
concentrations élevées en CO2 dans la chambre de mesure.
158
Résultats
À tit e d’e e ple, à J+
, Mt-0 contrairement à Col-0 éprouve de grandes difficultés à
maintenir dans la feuille des concentrations en CO2 stables (écarts-types horizontaux très
importants, Figure 59) pour une concentration en CO2 fixée dans la chambre. Lors des
derniers jours de stress les concentrations saturantes en CO2 présentes dans la feuille ne
permettent pas de recouvrer une valeu d’assi ilatio
ette o pa a le au t
oi s ie
que les limitations diffusives soient théoriquement levées. Ce résultat démontre une fois
e o e u’à u
o e t do
, au ou s de la p iode de st ess, les li itatio s diffusives
(=limitations de la diffusion du CO2 depuis l’at osph e jus u’à l’i t ieu du hlo oplaste
e peuve t e pli ue à elles seules la di i utio de l’assi ilatio
ette.
Après réhydratation, seul l'écotype Shahdara recouvre des courbes AN/Ci identiques à
celles déterminées chez les plantes témoins. Mt-0 récupère une AN maximale proche de celle
des témoins mais ne parvient pas à retrouver les niveaux de Ci attendus malgré l'application
dans la chambre de mesure de concentrations saturantes en CO2 identiques. Enfin, les
plantes réhydratées de l'écotype Col-0, présentent des valeurs moyennes d'AN plus faibles
que celles des plantes témoins même si elles parviennent à récupérer des Ci proches de ceux
qui caractérisent les témoins. Il semble donc que le fonctionnement des nouvelles feuilles
échantillonnées puisse être encore à ce stade soumis à des limitations métaboliques nondiffusives résiduelles.
Co t ai e e t au
esu es d’ ha ges gazeu i sta ta
s, l’a al se des ou es
AN/Ci individuelles permet d'établir, en dehors de toutes limitations de CO2 et de lumière, un
certain nombre de paramètres physiologiques optimaux et théoriques tels que la vitesse
maximale de carboxylation du RuBP (Vcmax), la densité maximale du flux d'électrons
photosynthétiques (Jmax) et la vitesse d'utilisation des trioses-phosphate (TPU) (Sharkey et
al., 2007). Pour pouvoir rendre compte de ces paramètres les courbes AN/Ci obtenues sont
analysées selon le modèle de photosynthèse foliaire de Farquhar et al. (1980).
159
A.
B.
C.
Figure 60. Évolution de la vitesse maximale de carboxylation du RuBP par la Rubisco (A), la
densité maximale du flux d'électrons photosynthétiques (B) et la vitesse d'utilisation des
trioses-phosphate (C) mesurées chez des feuilles matures témoins () et stressées () de
① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col- ① et① Shahda a .① S’agissa t① des① pla tes① sous①
contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée au 48ème jour après la levée (J+1).
Les mesures suivantes ont été effectuées 4 (J+4), 7 (J+7), 10 (J+10) et 13 (J+13) jours après
ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été réhydratées après la mesure effectuée à
J+13 et une dernière mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles, après 4 jours de
réhydratation (J+17). Les plantes témoins ont été régulièrement et convenablement
hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 12, 4 plantes
x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
Ce modèle est basé sur les propriétés cinétiques de la Rubisco décrites selon le formalisme
de Michaelis-Menten (Farquhar et al., 1980; Caemmerer et Farquhar, 1981). La méthode
d’ajuste e t de es pa a
t es est elle p opos e pa Sha ke et al. (2007) et repose sur
l'utilisation d'une matrice publiée en ligne (http://www.blackwellpublishing.com/plantsci/pc
ecalculation/) ; les valeurs de Vcmax, Jmax et TPU sont ajustées à une température foliaire de
25°C.
Effet d’u d fi it h d i ue su la vitesse de a o latio
a i ale de la Rubisco (Vcmax)
La vitesse maximale de carboxylation (Vcmax) représente l'activité maximale de la
Rubisco en conditions optimales. Au 47 ème jour après la levée (J0), les valeurs de Vcmax
présentées sont, pour chaque écotype, une moyenne des 6 Vcmax calculées individuellement
à partir de chacune des 6 courbes AN/Ci (Figure 60.A). À cette date les feuilles de Mt-0, Col-0
et Shahdara sont caractérisées respectivement par des Vcmax moyennes de 28,92 ± 4,15,
28,73 ± 3 et 29,2 ± 6,04 µmol.m-2.s-1 qui ne sont pas statistiquement différentes entre elles
(p=0,34). Ces Vcmax sont inférieures à celles rapportées dans la littérature qui peuvent varier
pour Col-0 de 34 ± 1,7 (erreur standard) µmol.m-2.s-1 (Flexas, J. et al., 2007) à 48,62
7,5
(erreur standard) µmol.m-2.s-1 (Fuentes et al., 2011). Trois principaux facteurs sont connus
pour avoir un effet direct sur les valeurs de Vcmax : les conditions lumineuses sous lesquelles
les plantes ont été cultivées (Niinemets et al., 1998; Piel et al., 2002), la température de
feuille ui a u e i ide e di e te su l’a tivit e z
ati ue de la Rubisco (Dreyer et al.,
2001; Bunce, 2008) et l’âge des feuilles et/ou de la pla te (Kositsup et al., 2010). Sachant
que les mesures de Vcmax ont été ajustées à 25°C conformément à ce qui est généralement
d
it da s la litt atu e, la elative fai lesse des valeu s p se t es i i pou ait s’e pli ue
pa l’âge ava
e des feuilles
ha tillo
es et pa les o ditio s lu i euses. E effet, les
plantes ont été acclimatées à une photopériode et à une PPFD assez différentes de celles
décrites par Flexas et al. (2007) qui cultivent les plants de Col-0 sous une photopériode de
12 h et non de 8 h avec une PPFD de 250 µmol.m-2.s-1 en moyenne plus de deux fois
supérieure à celle utilisée dans cette expérimentation.
160
Résultats
Au cours du temps, les valeurs de Vcmax des plantes témoins sont stables. En
revanche, la Vcmax baisse relativement rapidement en réponse à un épisode de sécheresse.
Une chute significative de la Vcmax de Mt-0 (-43,92 % par rapport aux feuilles témoins,
p=0,029), est observée dès le 7ème jour de stress et 3 jours plus tard (J+10) pour les écotypes
Col-0 (65,55 %, p=0,011) et Shahdara (-36,24 %, p=0,012). En réponse à la sécheresse, la
Vcmax de Mt-0 est affectée plus rapidement que celle des deux autres cotypes. À J+10, la Vcmax
de Shahdara, réduite seulement de 36,24 %, est celle qui résiste le mieux au manque d'eau.
Après
réhydratation
seule
la
Vcmax
de
Shahdara
retrouve
des
niveaux
significativement comparables à ceux des témoins, la Vcmax des plantes réhydratées de Mt-0
et Col-0 reste en moyenne significativement inférieure de 50,6 % (p=0,024) et de 42,86 %
(p=0,01) à celle de leurs témoins respectifs. Ces faibles capacités de recouvrement peuvent
avoir diverses origines parmi lesquelles une concentration foliaire en Rubisco qui pourrait
être moindre dans des feuilles qui se sont en partie développées dans des conditions où
l’a
s à l’eau tait li it .
161
Résultats
Effet d’u d fi it h d i ue su la de sit
a i ale de flu d' le t o s photos th ti ues
(Jmax)
La densité maximale de flux d'électrons photosynthétiques (Jmax) est estimée en
absence de limitations de CO2 et de lumière (Sharkey et al., 2007). L'évolution de la densité
maximale de flux d'électrons photosynthétiques (Jmax) est présentée sur la Figure 60.B. Avant
le début du stress (47ème JAL = J0), l'écotype Col-0 est caractérisé par un Jmax moyen de
64,34 µmol.m-2.s-1 très proche de celui d'ores et déjà publié dans la littérature :
73,14 µmol.m-2.s-1 (Fuentes et al., 2011). En situation hydrique non contrainte, les écotypes
Col-0, Mt-0 et Shahdara, sont caractérisés respectivement par des Jmax de 64,34, 57,46 et
64,97 µmol.m-2.s-1 qui ne sont pas statistiquement différents (p=0,742). Globalement, la Jmax
décline au fur et à mesure que le déficit hydrique s'installe. Comme attendu, la date à
la uelle ette
aisse peut t e o se v e
’est pas la
e pou les
ot pes. U e
diminution hautement significative de 37,03 % (p=0,005) est observée chez Mt-0 dès le
7ème jour de stress alors que chez Col-0 une baisse non significative de 21,24 % est notée
3 jours plus tard. L'écotype Shahdara ne voit quant à lui décroître, très significativement, son
Jmax de 66,72 % (p<0,01) que lors du dernier jour de stress. Au 13ème jour de stress les
3 écotypes ont des Jmax très bas et très significativement plus faibles que leurs témoins : les
Jmax de Mt-0 et de Col-0 chutent respectivement pour atteindre 8,12 et 7,22 µmol.m-2.s-1
alors que celui de Shahdara reste plus élevé à 19,18 µmol.m-2.s-1. Pendant les 9 premiers
jours de stress, les Jmax de Col-0 et de Shahdara paraissent moins affectés par le manque
d’eau ue les Vcmax. Chez Mt- , l’i ve se est o se v : Jmax paraît davantage affectée que la
Vcmax en réponse au déficit hydrique. La plus g a de se si ilit de l’ETR tau de t a sfe t des
électrons dans le cadre des limitations imposées : 380 ppm CO2 avec une PPFD de
800 µmol.m-2.s-1) de Mt-0 au déficit hydrique, par rapport aux deux autres écotypes
(Figure 62), consolide cette dernière observation. Alors que les plantes réhydratées des
écotypes Mt-0 et Shahdara retrouvent des valeurs de Jmax statistiquement comparables aux
plantes témoins, les plantes réhydratées de l'écotype Col-0 ne recouvrent en moyenne que
76 % (p<0,05) des valeurs de Jmax calculées pour les feuilles témoins.
162
Résultats
Effet d’u st ess h d i ue su la vitesse d’utilisatio des trioses-phosphate (TPU)
La vitesse d'utilisation des trioses-phosphate (TPU) indique la capacité de la feuille à
utiliser et à transporter les produits de la photosynthèse (Sharkey et al., 2007). Lorsque la
photosynthèse
est
limitée
par
la
TPU,
l'assimilatio
ette
’aug e te
plus
(Sharkey et al., 2007) ou diminue (Sharkey, 1985; Sage, 1990) en réponse aux concentrations
croissantes en CO2. Dans tous les cas, il est très difficile, en analysant les courbes AN/Ci, de
distinguer la limitation liée à la TPU de celle liée à la régénération du RuBP
(Hikosaka et al., 2006)
e s’il est o
u
e t ad is ue le d
ut de la phase plateau
exprimerait un déficit en RuBP alors que la fin du plateau (obtenue pour des C i encore
supérieurs) traduirait une diminution de la TPU (Sharkey et al., 2007). La limitation par la
TPU reste néanmoins rarement observée à partir des courbes AN/Ci même si celles-ci font
appel à des Ci particulièrement élevés (Long et Bernacchi, 2003). Des travaux visant à étudier
les effets de la te p atu e su la photos th se
d’attei d e i di e te e t et de
o t e t u’il est
a
oi s possi le
a i e plus o igi ale ette li itatio e asso ia t u e
concentration en CO2 normale à une faible température de feuille (Labate et Leegood, 1988;
Harley et al., 1992). La difficulté à imposer aux plantes des conditions de mesure permettant
l'o se vatio
e tai e d’u e li itatio d’assi ilatio
ette pa la TPU fait ue e pa a
te
est rarement présenté (Hikosaka et al., 2006; Bunce, 2008). Certains auteurs publient
néanmoins des valeurs de TPU sans pour autant présenter les courbes AN/Ci qui ont permis
leur calcul et ne discutent pas de la réalité de cette limitation (Munekage et al., 2008).
D’aut es auteu s, he he t à
di ilise la
alit de ette li itatio de
a i e i di e te
en assurant un suivi du flux total d'électrons (JT) en réponse de la concentration interne en
CO2 (Ci) (Pons, 2012).
163
Figure 61. Évolution de la réponse de la densité du flux total d'électrons (JT) à la variation
de la concentration interne en CO2 (Ci) mesurée chez des feuilles matures témoins () et
des plantes sous contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée au 48ème jour
après la levée (J+1). Les mesures suivantes ont été effectuées 4 (J+4), 7 (J+7), 10 (J+10) et
13 (J+13) jours après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été réhydratées après
la mesure effectuée à J+13 et une dernière mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles,
après 4 jours de réhydratation (J+17). Les plantes témoins ont été régulièrement et
convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 6 à
J+1, ensuite n= 3).
Résultats
En réponse à des concentrations croissantes de Ci : (i) si JT augmente alors l'AN est limitée par
la Rubisco ; (ii) si JT reste stable l'AN est limitée par la régénération du RuBP et enfin (iii) si JT
chute l'AN est limitée par la TPU (Long et Bernacchi, 2003). Les courbes AN/Ci ont donc été
alis es da s des o ditio s e p i e tales adaptatio à l’o s u it
pe
etta t le al ul
de JT. L'évolution du JT en fonction des concentrations croissantes en CO2 interne (Ci) est
présentée dans la Figure 61. À l’e eptio du de ie jou de
esu e J+
, le JT des feuilles
témoins des trois écotypes a tendance à diminuer pour les plus fortes valeurs C i. Chez les
plantes stressées la baisse du JT pour les Ci les plus élevés est observée une seule fois au
4ème jour après le début du stress (J+4). Logiquement, pour des niveaux de stress supérieurs
(J+7, J+10 et J+13) les plantes ne sont plus dans les conditions où l’assi ilatio
ette peut
être limitée par la TPU.
Finalement, le calcul de la TPU a été entrepris pour 3 raisons : (i) les courbes vérifient
une des deux conditions proposées par Sharkey (1985) qui pose u’à pa ti d'u e e tai e
concentration en CO2 l'AN atteigne un plateau et ne réponde plus à la hausse de C i [à
l'exception toutefois d'une légère augmentation lorsque la plus forte concentration en CO2
(1600 ppm) est imposée dans la chambre de mesure] ; (ii) une légère diminution du JT a
parfois été observée sur les courbes JT/Ci pour les concentrations en CO2 les plus élevées ;
iii l’i t odu tio
du calcul de la TPU dans la matrice d'ajustement des courbes AN/Ci
n'affecte pas la détermination de Vcmax et de Jmax (Sun et al., 2011).
Au 47ème jour après la levée (J0), il n'existe aucune différence significative (p=0,263)
de la TPU entre les 3 écotypes. Les feuilles de Shahdara montrent une TPU moyenne de
5,21 µmol.m-2.s-1 alors que celles de Mt-0 et de Col-0 sont caractérisées par des TPU
respectivement de 4,39 et 5,08 µmol.m-2.s-1 (Figure 60.C). Ces valeurs sont comparables à
celles rencontrées dans la littérature pour l'écotype Col-0 : 6,7 µmol.m-2.s-1 pour de jeunes
feuilles après 4 semaines de culture (Flexas et al., 2007) et 5,02 µmol.m-2.s-1 pour des plantes
âgées de 6 semaines (Fuentes et al., 2011). Pa ailleu s, il a d’o es et d jà t d
o t , hez
Arabidopsis thaliana, que les valeurs de TPU peuvent dépendre des conditions lumineuses
auxquelles la plante a été soumise au cours de sa croissance. Ainsi, un éclairement de
50 µmol.m-2.s-1 induit chez les écotypes Cvi-0 et Hel-1 une TPU plus faible que celle qui
caractérise des plantes cultivées à 300 µmol.m-2.s-1 (Pons, 2012).
164
Résultats
Au cours du temps, la TPU des plantes témoins a tendance à diminuer légèrement et de
manière comparable chez les 3 écotypes : -21 % pour Mt-0 à J+17 par rapport à J0, -14 %
pour Col-0 et -17 % pour Shahdara. Cette diminution est vraisemblablement à rapprocher
d’u ralentissement du métabolisme lié à la progression de la sénescence.
Le profil de réponse de la TPU à la contrainte hydrique est, pour chaque écotype,
globalement similaire à celui de la Jmax confirmant ainsi la difficulté de distinguer la limitation
liée à TPU de celle liée à la régénération du RuBP (Hikosaka et al., 2006). La TPU de Mt-0
décroît très significativement de 42,22 % (p=0,004) dès le 7ème jour de stress. Pour Col-0 une
baisse non significative de 27,66 % (p=0,078) est enregistrée 3 jours plus tard, alors qu'à
cette même date la TPU décroît significativement de 20,25 % (p=0,042) dans les feuilles
stressées de Shahdara. Au dernier jour de stress (J+13), une chute hautement significative
par rapport aux témoins est notée pour les 3 écotypes. À cette date, les valeurs de la TPU
sont en moyenne de 0,78 µmol.m-2.s-1 pour Mt-0, de 0,84 µmol.m-2.s-1 pour Col-0 et de
1,65 µmol.m-2.s-1 pour Shahdara.
Après réhydratation les feuilles de Mt-0 et de Shahdara récupèrent des valeurs de
TPU statistiquement semblables aux valeurs des plantes témoins alors que la TPU des
plantes réhydratées de l'écotype Col-0 demeure significativement plus faible (-24 %,
p=0,034) que celle qui caractérise à cette même date les feuilles témoins.
165
Figure 62. Évolution du rendement quantique maximum du PSII (Fv/Fm, A), du rendement
quantique du PSII (ΦPSII, B) et de la①de sit ①du①flu ①total①d’ le t o s (JT, C) mesurés chez
des feuilles matures témoins () et stressées () de 3 ot pes① d’Arabidopsis thaliana
(Mt-0, Col- ① et① Shahda a .① S’agissa t① des① pla tes① sous① o t ai te① h d i ue,① la① p e i e①
mesure a été effectuée après arrosage au 47 ème jour après la levée (J0). Les mesures
suivantes ont été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours après ce dernier
arrosage. Les plantes stressées ont été réhydratées après la mesure effectuée à J+12 et
une dernière mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles, après 4 jours de
réhydratation (J+16). Les plantes témoins ont été régulièrement et convenablement
hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 12, 4 plantes
x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
2.2.4. Effet
d’un
déficit
hydrique
sur
quelques
paramètres
photosynthétiques dérivés de la fluorescence chlorophyllienne
Effet du stress hydrique sur le rendement quantique maximal du photosystème II (Fv/Fm)
Le rendement quantique maximum de la réaction photochimique au niveau du
photosystème II (PSII) est évalué par le rapport Fv/Fm. Une chute de Fv/Fm traduit
l'inactivation voire la destruction des photosystèmes II ou plus globalement une altération
non réversible de la chaîne photosynthétique du transport des électrons (Adams III et al.,
2006). En conditions optimales (47ème JAL = J0), les valeurs moyennes de Fv/Fm déterminées
chez les 3 écotypes (0,81 pour MT-0 et Col-0, 0,82 pour Shahdara) sont proches de 0,8,
valeur moyenne établie (Giraud et al., 2008; Stepien et Johnson, 2009) pou l’ ot pe Col-0.
Dans tous les cas, lorsque le photos st
e II ’est pas alt
le Fv/Fm moyen des plantes
supérieures est sensiblement égal au maximum à 0,83 (Farineau et Morot-Gaudry, 2007). Le
Fv/Fm des plantes témoins reste stable tout au long de l'expérimentation. Cette stabilité
i di ue ue les feuilles t
oi s,
jou s ap s le d
ut de l’e p i e tatio , ne sont pas
dans un état de sénescence avancée. En effet, (Pourtau et al., 2004; Wingler et al., 2004)
montrent que la chute du Fv/Fm constitue un excellent marqueur de sénescence.
Sans surprise, en réponse au déficit hydrique la diminution de F v/Fm qui traduit des
altérations structurales lourdes est observée tardivement : à J+9 pour Mt-0 et à J+12 pour
Col-0 et Shahdara. Au 12ème jour de stress, le Fv/Fm de Mt-0 chute de manière spectaculaire à
0,41 (-50 % par rapport aux témoins, p<0,001), alors que les Fv/Fm de Col-0 et de Shahdara
diminuent significativement et respectivement de -2 % (p=0,03) et de -4 % (p=0,012) par
rapport à ceux de leurs témoins respectifs.
Les valeurs de Fv/Fm obtenues après réhydratation ne reflètent pas la récupération
des feuilles étudiées pendant le stress : ces feuilles étaient en effet trop sénescentes pour
pouvoir être à nouveau échantillonnées après réhydratation et servir de support à toutes les
analyses effectuées.
166
Résultats
Le Fv/Fm est un paramètre atteint ta dive e t ui pa e u’il peut t adui e u e alt atio
st u tu ale do
du a le des s st
o t ai e e t à d’aut es pa a
es d’a so ptio
t es,
t e e ouv
d’
e gie lu i euse,
hez u e feuille
e peut pas,
atu e do t le
ta olis e ’est pas o ie t vers la croissance (Adams III et al., 2006). Autrement dit,
chercher une éventuelle récupération de Fv/Fm chez des feuilles matures de Mt-0 dont la
structure photosynthétique est atteinte (Fv/Fm à J+12 = 0,41) serait vain. Les mesures de
Fv/Fm effe tu es su les
ot pes ap s
h d atatio l’ont donc été sur de nouvelles
feuilles. Ces mesures traduisent donc par certains aspects la récupération de la plante et
plus pa ti uli e e t l’ tat de fo tio
alit du PSII et de la ha e de t a spo teurs
d’ le t o s de ouvelles feuilles ui se so t e pa tie d velopp es pe da t la p iode de
contrainte hydrique. Les 3 écotypes montrent, après réhydratation, des niveaux de F v/Fm
équivalents à ceux qui caractérisent les témoins.
Effet du stress hydrique sur le rendement quantique de la réaction photochimique du PSII
(ΦPSII et su la de sit du flu total d’ le t o s JT)
Le rendement quantique de la réaction photochimique du PSII (ΦPSII) représente le
rapport entre le flux de photons absorbé par le photosystème II et le flux d'électrons issu de
l'activité de ce même photosystème. Il permet donc de déterminer, dans nos conditions de
mesure (380 ppm de CO2 et PPFD de 800 µmol.m-2.s-1 , la f a tio de l’
e gie a so
e ui
est réellement utilisée par la photochimie. Il peut donc rendre assez bien compte de la
production de NADPH,H+ d’u e pa t et de « l’effi a it glo ale » de la photos th se d’aut e
part.
167
Résultats
Au 47ème jour après la levée, l'écotype Mt-0 possède un ΦPSII de 0,18,
significativement (p<0,05) plus élevé que celui des écotypes Col-0 et Shahdara qui ont
respectivement des ΦPSII statistiquement différents (p=0,023) de 0,15 et de 0,16
(Figure 62.B . De l’o d e de ,
e appo t est glo ale e t plus de deu fois i f ieu à elui
attendu (0,5) pour une plante supérieure cultivée sous un éclairement moyen (30 % de
l’i te sit solai e (Genty et al., 1989). Pou des pla ts d’Arabidopsis thaliana soumis à une
photopériode de 12 h et à une PPFD de 250 à 300 µmol.m-2.s-1, cette valeur varie entre 0,5
et 0,55 (Donahue et al., 1997; Poulson et al., 2006). Il est néanmoins difficile de comparer
es valeu s à elles p se t es i i a d’u e pa t les pla tes ’o t pas t
e vi o
ultiv es da s des
e e ts o pa a les et d’aut e pa t l’âge des pla tes et des feuilles
’est pas toujou s lai e e t p
is . Quoi u’il e
ha tillo
es
soit, le ΦPSII des plantes témoins
diminue avec le temps (Figure 62.B). Cette diminution traduit vraisemblablement un début
de sénescence (Pourtau et al., 2004; Radochová et Tichá, 2008) ui ’est toutefois pas t s
marqué dans la mesure où ces mêmes feuilles conservent des Fv/Fm stables (Figure 62.A).
168
Résultats
Le taux de transport des électrons (ETR) estime, dans les conditions de mesure
choisies autrement dit dans le cadre des limitations imposées (380 ppm CO2 avec une PPFD
de 800 µmol.m-2.s-1), le flux maximum d'électrons dans la chaîne photosynthétique foliaire.
Ce pa a
t e ui pe
et do
réducteur (NADPH,H+ peut pe
d’esti e la p odu tio
ett e
a i u
th o i ue de pouvoi
gale e t d’app o he la photos th se
ette
théoriquement possible (dans les conditions de CO2 et de lumière imposées) en prenant en
o pte seule e t le flu d’ le t o s. La valeu d’ETR fou ie pa le CIRAS-2 est une
grandeur brute sans dimension qui peut être utilisée pour calculer la densité de flux total
d’ le t ons (JT) exprimée en µmol.m-2.s-1. Le calcul de cet indicateur, qui décrit la capacité
photosynthétique globale in vivo, est réalisé de la façon suivante :
ΦPSII : Rendement quantique du PSII déterminé par fluorescence.
α : Coefficient d'absorption foliaire ui va ie e fo tio de l’esp e v g tale (Bauerle et al.,
2004). Celui utilisé ici pour les 3 écotypes (α = 0, 84) a été déterminé chez Col-0 (Niyogi et al.,
1998; Munekage et al., 2008). En utilisant un seul même coefficient α,
i pli ite e t l’h poth se ue e oeffi ie t est le
’est pas
e pou les
ous faiso s
ot pes tudi s et u’il
odifi pa le d fi it h d i ue.
Q : Flux quantique de photons (Q) arrivant sur la feuille exprimé en µmol.m-2.s-1. Ce flux
quantique étant considéré comme également absorbé entre les deux photosystèmes, seule
la moitié de la lumière reçue par la feuille (Q x ) est donc effectivement considérée comme
absorbée par le PSII (Maxwell et Johnson, 2000). Nous faisons donc ici implicitement
l’h poth se
photos st
ue la
pa titio
es ’est pas
de l’a so ptio
d’
e gie lu i euse e t e les deu
odifi e pa la o t ainte hydrique.
169
Résultats
Au 47ème jour après la levée, les feuilles convenablement hydratées de Mt-0 sont
caractérisées par un JT moyen de 52,01 µmol.m-2.s-1 significativement plus élevé (p<0,001)
que celui de Shahdara (47,01 µmol.m-2.s-1) lui même significativement plus important
(p=0,015) que celui de Col-0 (43,91 µmol.m-2.s-1, Figure 62.C). Ces valeurs de JT déterminées
chez des feuilles non stressées s'approchent de elle pu li e pou l’ ot pe C
e vi o
50 µmol.m-2.s-1) lev da s des o ditio s d’ lai e e t se si le ent équivalentes aux
nôtres (Schlüter et al., 2003). Ces mêmes auteurs démontrent que les valeurs de JT sont
in fine fo te e t d pe da tes des o ditio s d’ lai e e t au uelles so t sou ises les
plantes durant leur développement.
JT étant calculé à partir de ΦPSII et de constantes, les profils de réponse au stress de
ces deux indicateurs sont donc rigoureusement identiques. Au cours de la période de déficit
hydrique le ΦPSII et JT diminuent conjointement et significativement pour Mt-0 dès le
6ème jour (-7 %, p=0,036) et au 12ème jour pour Col-0 (-41 %, p<0,001) et Shahdara (-46 %,
p<0,001). Après réhydratation, les plantes stressées des trois écotypes montrent des valeurs
de ΦPSII et d'ETR équivalentes à celles des plantes témoins.
170
Figure 63. Évolution du différentiel entre l'AN théorique maximale et l'AN effectivement
mesurée (JT/4-AN) calculé à partir de feuilles matures témoins () et stressées () de 3
ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col- ① et① Shahda a .① S’agissa t① des① pla tes① sous①
contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée après arrosage au 47 ème jour
après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12
(J+12) jours après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été réhydratées après la
mesure effectuée à J+12 et une dernière mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles,
convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 12,
4 plantes x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
Effet du stress hydrique sur le différentiel entre la photosynthèse nette théorique estimée à
partir de JT et l’assi ilatio
ette AN) mesurée
En supposant que 4 électrons doivent être transportés dans la chaîne
photosynthétique pour permettre la fixation d'une molécule de CO2 (2 électrons sont
essai es à la
du tio d’u NADP+ en NADPH,H+ et 2 NADPH,H+ sont nécessaires à la
du tio d’u CO2 soit 4 électrons au total pour réduire un CO2), il est donc possible en
divisant le JT p
de
e t al ul pa
d’esti e la
du tio et do
l’assi ilatio
théoriquement possible de CO2 (Valentini, Epron et al. 1995; Massacci et al. 2007). Exprimée
alors en µmolCO2.m-2.s-1 cette assimilation théorique maximale (dans les conditions imposées
de mesure), qui estime finalement la photosynthèse nette théoriquement possible, pourra
alors être o pa e à l’assi ilatio
ette effe tive e t
esu e AN) (Streb et al., 2005;
Priault et al., 2006; Massacci et al., 2008).
Le diff e tiel d’assi ilatio t adui a in fine u solde positif d’ le t o s o utilis s à
réduire le CO2 et donc théoriquement disponibles pour servir de pouvoir réducteur dans
d’aut es p o essus
ta oli ues : photorespiration, réduction des nitrates, réaction de
Mehle … (Flexas et al., 1999; Lawlor et Cornic, 2002). En conditions spécifiques de stress, cet
excès de pouvoir réducteur pourrait être un acteur essentiel dans la gestion du stress
oxydatif (Osmond et al., 1997).
Globalement, le différentiel (JT/4)-AN des plantes témoins des 3 écotypes diminue au
ou s du te ps aut e e t dit au fu et à
esu e ue le vieillisse e t foliai e s’i stalle
(Figure 63). Sachant que les deux termes du différentiel décroissent individuellement, il
appa a t do
apide e t
ue l’esti atio
ette th o i ue JT/4) diminue plus
ue l’assi ilation nette mesurée (AN) laissant à penser que les systèmes
photos th ti ues d’a so ptio d’
p
de l’assi ilatio
e gie lu i euse et de t a sfe t des le t o s so t plus
o e e t et dava tage attei ts pa le vieillisse e t ellulai e ue d’aut es aspe ts du
métabolisme photosynthétique (Flexas et al., 2007).
171
Résultats
Le différentiel (JT/4)-AN augmente au cours du stress hydrique pour les 3 écotypes :
cette augmentation est notée au 9ème jour de stress pour Mt-0 (+36 %, p<0,01) et au
12ème jour de stress pour Col-0 (+37 %, p<0,01) et Shahdara (+26 %, p=0,315, non
significative). Chez Mt-0, une chute brutale et hautement significative de 51 % de (JT/4)-AN
est observée au 12ème jour de stress. L'augmentation du différentiel (JT/4)-AN durant la
période de sécheresse révèle principalement l'inhibition de l'assimilation nette,
précédemment observée (Figure 56.C). La situation de Mt-0 au 9ème jou de st ess ’est
toutefois pas totalement comparable à celle de Col-0 et Shahdara au 12ème jour de stress.
Pour Col-0 et Shahdara, le faible écart constaté entre plantes témoins et stressées à J+12
o pa ative e t à l’ a t o se v pou Mt-0 à J+9), s’e pli ue en définitive par un JT/4 qui
est i f ieu à e u’il tait au
ème
jour pour Mt-0. Dans tous les cas à J+9 pour Mt-0 et à
J+12 pour Col- et Shahda a, o pte te u de l’a se e d’assi ilatio
ette, le diff e tiel
(JT/4)-AN t aduit u flu d’ lectrons potentiellement disponible pour des réactions autres
que photosynthétiques. La chute de (JT/4)-AN observée dans les feuilles de Mt-0 après 12
jou s de st ess ’est e
ie su p e a te : elle o espo d à u e di i utio de la essou e
en électrons dans la chaîne photosynthétique liée à la dégradation des photosystèmes
relevée à cette même date (Figure 62.A).
172
Figure 64. Évolution du quenching photochimique (qP, A) et du quenching
non-photochimique (NPQ, B) mesurés chez des feuilles matures témoins () et stressées
( ①de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col- ①et①Shahda a .①S’agissa t①des①pla tes①
sous contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée après arrosage au 47 ème jour
après la levée (J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12
convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 12,
4 plantes x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
Enfin, après réhydratation, tous les écotypes recouvrent des valeurs de (JT/4)-AN en
moyenne supérieures à celles des plantes témoins : +16 % (p=0,22) pour Shahdara, +22 %
(p<0,01) pour Mt-0 et +26 % (p<0,01) pour Col-0. Cette hausse du différentiel (JT/4)-AN
s’e pli ue pa u e
eilleu e
up atio du (JT) que de l'AN. Les feuilles nouvellement
échantillonnées (qui se sont développées en partie pendant la période de déficit hydrique)
up e t, su u e
ase de al ul p e a t e
o pte le seul flu d’ le t o s, u e
photosynthèse nette théorique identique à celle des témoins (Figure 62.C). Le fait que
l’assi ilatio
ette
esu e e soit pas totale e t e ouv e doit do
s’e pli ue pa des
limitations autres que celles directement li es au flu d’ le t o s.
Effet du stress hydrique sur le quenching photosynthétique (qP), le quenching non
photosynthétique (NPQ)
L'énergie lumineuse absorbée par les photosystèmes peut être transformée en
énergie chimique (photochimie) mais aussi dissipée sous forme de chaleur et de
fluorescence (Maxwell et Johnson, 2000). Le quenching dit photochimique (qP) exprime la
f a tio
de l’e ti tio
lu i euse pou pe
de fluo es e e li e à la photo hi ie utilisatio
ett e la
essio
d’u
le t o . Pa e
u’il d
de l’
e gie
it fi ale e t la
proportion de centres réactionnels photochimiques ouverts, cet indicateur donne une idée
de l’e go ge e t de la ha e photos th ti ue de t a sfe t des le t o s et peut le as
h a t pe
ett e d’e pli ue e pa tie une diminution du rendement quantique du PSII
(Sperdouli et Moustakas, 2012). À l’oppos , le diff e tiel -qP, parfois utilisé, peut rendre
o pte de la p opo tio de plasto ui o es A ui so t à l’ tat
duit.
En début d'expérience (47ème JAL), l'écotype Mt-0 a un qP de 0,38 significativement
supérieur (p<0,001) à celui de Shahdara (0,33) lui même significativement plus élevé
(p<0,001) que celui de Col-0 (0,29) (Figure 64.A). Le qP des plantes témoins a tendance à
diminuer légèrement en fonction du temps. Six jours après le dernier arrosage (J+6), les
feuilles de Mt-0 présentent une diminution très significative du qP de 6 % (p<0,01). Cette
chute se poursuit jusqu'au dernier jour de stress pour atteindre 91 % (p<0,01).
173
Figure 65. Rapport entre les valeurs de quenching photochimique (qP) et les valeurs
respectives d'assimilation net de CO2 (AN) calculé pour des feuilles matures témoins () et
(n= 12, 4 plantes x 3 feuilles par plante). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et
***p<0,001.
Résultats
Les qP moyens des feuilles stressées de Col-0 et de Shahdara sont atteints plus
tardivement par le stress hydrique : ils chutent respectivement à J+12 de 36 et de 40 %
(p<0,01) par rapport aux valeurs moyennes des feuilles témoins.
La relation entre qP et AN (Figure 65)
l’assi ilatio
ette
’est pas o ligatoi e e t
o te
o
lai e e t
l e à u e
ue l’i hi itio
de
hute du quenching
photosynthétique. En réponse à une certaine intensité de stress hydrique, les 3 écotypes
sont susceptibles de conserver une valeur de qP non nulle associée à une assimilation nette
totalement inhibée. Mt-0 qui a subi plus longuement les contraintes liées au man ue d’eau
(comme en atteste son RWC qui chute avant celui de Col-0 et de Shahdara) offre une
situatio suppl
e tai e i
dite de st ess e t
e où l’i hi itio de l’assi ilatio
ette est
couplée avec une chute de qP. Durant la première phase de stress, la photos th se ’est
do
pas li it e pa la photo hi ie telle u’elle peut t e app he d e pa le ais du qP.
Après réhydratation les 3 écotypes récupèrent des valeurs de qP similaires à celles
des témoins.
Le rendement quantique du PSII (ΦPSII), la de sit du flu total d’ le t o s JT) et le
quenching photochimique (qP), sont des indicateurs fortement liés les uns aux autres (le
calcul du JT utilise celui du ΦPSII qui utilise lui-même le calcul du qP et du Fv/Fm) qui offrent
donc logiquement des p ofils d’ volutio si ilai es e
po se au d fi it h d i ue. U e
diminution significative de ces paramètres est toujours observée pour Mt-0 dès le 6ème jour
de stress et au 12ème jour pour Col-0 et Shahdara. Chez les plantes témoins, ces paramètres
qui ont tendance à diminuer avec le temps, traduisent vraisemblablement un léger effet
s
es e e sa s u’il soit possi le de disti gue la pa t eve a t au p o essus atu el de
vieillisse e t des photos st
es de elle li e à l’utilisatio de flashs de lu i es saturantes
pour obtenir ces données de fluorescence, même si par précaution un temps de 3 jours
entre chaque mesure a été respecté.
174
Résultats
Une augmentation du quenching non-photochimique (NPQ) peut rendre compte de
3 mécanismes susceptibles de limiter la fourniture d'excitons au centre réactionnel du PSII :
i la dissipatio de l'
e gie d’e itatio sous fo
e de haleu au iveau des a te
es du
PSII (qE) ; (ii) la diminution de la taille de l'antenne externe du PSII (consécutivement à la
migration de trimères LHCII phosphorylés vers les antennes du PS1) (qT) ; (iii) l'installation de
processus de photo-inhibition réversibles indépendant des 2 précédemment cités et non
associés à une altération structurale du PSII (qI). Au contraire une diminution du NPQ traduit
un processus de photo-inhibition non réversible associé à l'altération structurale du PSII
(Niyogi et al., 1998; Maxwell et Johnson, 2000).
Au 47ème jour après la levée, les feuilles témoins des 3 écotypes présentent des
valeurs de NPQ significativement différentes les unes des autres (p<0,001) : 1,82 pour
Shahdara, 1,77 pour Mt-0 et 1,55 pour Col-0 (Figure 64.B). Ces valeurs sont conformes à
celles décrites pour Col-0 qui varient entre 0,6 et 1,75 (Niyogi et al., 1998; Woo et al., 2008;
Stepien et Johnson, 2009; Sperdouli et Moustakas, 2012). Le NPQ des plantes témoins qui a
tendance à augmenter très légèrement au cours du temps (en moyenne de +9 % pour Col-0
à +17 % pour Shahdara entre J0 et J+16) pourrait alors compenser une photochimie
progressivement di i u e pa l’i stallatio du vieillissement.
Globalement deux situations sont observées en réponse à la contrainte hydrique : les
valeurs moyennes de NPQ déterminées chez Mt- et Shahda a di i ue t alo s u’à l’i ve se
celles de Col-0 augmentent. Plus précisément, le NPQ de Mt-0 chute brutalement de 80 %
(p<0,001) entre J+9 et J+
Shahda a
agit de
de ie jou de st ess alo s u’il ’ tait pas affe t aupa ava t.
a i e ide ti ue
e si la di i utio de
% o stat e à J+
’est
pas significative (p=0,282 . Le NPQ de l’ ot pe Col-0 croît quant à lui de 12 % à J+9 (p<0,01)
avant de retrouver une valeur conforme au témoin à J+12. Ces résultats laissent à
penser que : (i) en fonction de son intensité, le stress hydrique peut induire une
augmentation (déficit hydrique modéré) ou une diminution du NPQ (déficit hydrique
sévère) ; (ii) le NPQ a tendance à répondre modestement au déficit hydrique (exception faite
de la forte chute enregistrée pour Mt-0 à J+12).
175
Résultats
Ces hypothèses sont confortées par les données de la littérature. Effectivement, Peeva et
Co i
’ont observé, en réponse à un déficit hydrique, aucune augmentation de NPQ
chez Haberlea rhodopensis ; seule une chute importante de NPQ a été mise en évidence en
fin de stress pour des RWC extrêmes inférieurs à 20 %. Chez Arabidopsis thaliana, la réponse
du NPQ au d fi it h d i ue se
le effe tive e t d pe d e de l’i te sit du st ess : le NPQ
augmente brièvement et modestement lorsque le stress est modéré (RWC voisin de 75 %)
avant de chuter sévèrement lorsque le déficit hydrique devient trop important (RWC
inférieur à 60 %) (Woo et al., 2008; Sperdouli et Moustakas, 2012). Une augmentation de
NPQ a été détectée seulement chez Col-0. Cette augmentation correspond à une hausse de
qE et/ou de qT et/ou d'autres processus de photo-inhibition réversibles (qI). Les fluctuations
de ce paramètre en réponse au stress pouvant être très rapides (Woo et al., 2008), il est
possible que la périodicit de os
esu es ait e p h l’o se vatio de e ph
o
e hez
les deux autres écotypes. En fin de stress (J+12) la forte chute de NPQ qui traduit
l'installation de phénomènes de photo-inhibition irréversibles (vraisemblablement liés à une
altération structurale des PSII) est logiquement observée chez l’ ot pe ui a le plus souffe t
du manque d'eau (Mt-0). Il aurait peut- t e t
essai e de laisse s’i stalle dava tage le
stress pour pouvoir mesurer cette chute chez Col-0 et Shahdara.
Après réhydratation les écotypes Col-0 et Mt-0 récupèrent des valeurs de NPQ
statistiquement équivalentes à celles déterminées chez les témoins. Le NPQ des plantes
réhydratées de Shahdara est en moyenne légèrement mais significativement plus élevé
(+ 8,5 %, p=0,007) que celui des plantes témoins.
176
Figure 66. Évolution de la biomasse sèche mesurée chez des feuilles matures témoins ()
et stressées ( ①de① ① ot pes①d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col- ①et①Shahda a .①S’agissa t①
(n= 10). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
2.3. Effet d’un déficit hydrique sur quelques aspects du
métabolisme carboné
2.3.1. Évolution de la biomasse sèche en réponse à un déficit hydrique
Les biomasses sèches de 10 rosettes par écotype et par traitement (témoin et
stressé) sont déterminées tous les 3 jours pendant la période de stress hydrique et une
de i e fois jou s ap s l’ tape de
h d atatio . Au
ème
jour après la levée, la biomasse
sèche moyenne des rosettes de Shahdara est significativement plus élevée (0,123 g,
p<0,001) que celle de Mt-0 (0,101 g) et de Col-0 (0,09 g) qui ne sont pas statistiquement
diff e tes. Ce
sultat o fi
e elui p
de
e t ta li su d’aut es essais Figure 37.B).
La biomasse sèche des rosettes témoins des 3 écotypes augmente linéairement (R 2 = 0,98
pour chacune des 3 régressions linéaires) au cours du temps (Figure 66). Les vitesses de
croissance des 3 écotypes entre J+0 et J+16 sont significativement différentes (p<0,001), la
pente de la régression linéaire de Mt-0 (0,0171) est significativement plus importante que
celle de Shahdara (0,0125), elle même significativement supérieure à celle de Col-0 (0,0142).
La vitesse de croissance des rosettes soumises au déficit hydrique est sensiblement
comparable à celle des témoins pendant les 9 premiers jours de stress pour Mt-0 et Col-0 et
pendant les 6 premiers jours de stress pour Shahdara. Elle ralentit ensuite en 3 jours. Entre
J+9 et J+12, les rosettes stressées de Shahdara retrouvent une vitesse de croissance
identique à celle des témoins. À J+12 les rosettes stressées de Mt-0 et de Col-0 ont en
moyenne des biomasses sèches inférieures de respectivement 24 % (p<0,001) et 23 %
(p<0,001) à celles des rosettes témoins. La biomasse sèche des rosettes stressées de
Shahdara est quant à elle réduite en moyenne de 29 % (p<0,001) à J+9 et de 31 % (p<0,001)
à J+12.
Après 4 jours de réhydratation (J+16), la biomasse sèche de Shahdara reste plus
faible en moyenne de 26 % (p< ,
, alo s ue elle de l’ ot pe Col-0 se rapproche des
témoins (-11 %, p=0,012). Les rosettes sèches stressées de Mt-0 ont à cette date une masse
très inférieure à celle des témoins (-44 %, p<0,001). Ce dernier résultat confirme la grande
diffi ult
u’o t les pla ts de Mt-0 à récupérer après la période de stress hydrique.
177
Figure 67. Évolution de la teneur en amidon foliaire mesurée chez des feuilles matures
témoins () et stressées ( ① de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et
Shahda a .① S’agissa t① des① pla tes① sous contrainte hydrique, la première mesure a été
moyennes ± écarts-types (n= 5). Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
2.3.2. Effet du déficit hydrique sur la teneur en amidon foliaire
La teneur en amidon foliaire a été estimée par une méthode enzymatique à partir de
feuilles matures récoltées systématiquement à la même heure en fin de photopériode tous
les jou s pe da t la p iode de st ess h d i ue et u e de i e fois jou s ap s l’ tape de
réhydratation (Figure 67). Cinq plantes par écotype et par traitement ont été
échantillonnées.
Au 47ème jour après la levée, les feuilles de Mt-0, caractérisées par une conductance
stomatique (gs) et une assimilation nette (AN) significativement supérieures à celles des deux
autres écotypes, accumulent plus d'amidon (28,46 mg.g-1.MS-1, p<0,05) que Col-0 et
Shahdara (respectivement 17,29 et 15,54 mg.g-1.MS-1). Exprimée sur une base de matière
fraîche, La teneur moyenne en amidon des feuilles de Col-0 devient 1,82 mg.g-1.MF-1. Cette
teneur est environ deux fois moins importante que celles rapportées dans la littérature pour
des feuilles de Col-
ha tillo
es ap s
heu es d’ lai e e t et p lev es su des
plantes cultivées sous une photopériode de 16h (Caspar et al., 1991; Zhang et al., 2005;
Smith et Zeeman, 2006). Cet
a t ’est pas su p e a t dans la mesure où les plantes
étudiées ici ont été soumises à une photopériode deux fois moins importante (8h) et à une
PPFD elle aussi environ deux fois plus faible que celle utilisée par Caspar et al. (1991) et
Zhang et al. (2005).
Quoi u’il e soit, les différences de teneurs, constatées entre les 3 écotypes, sont
confirmées par l'observation au microscope photonique de coupes de feuilles colorées au
réactif de Shiff (Figure 68 . Ces oupes
o t e t e effet lai e e t ue l’ ot pe Mt-0 très
riche en amidon se distingue de Col-0 et de Shahdara qui accumulent dans leurs feuilles des
ua tit s d’a ido plus fai les et se si le e t
uivale tes. Cet amidon est accumulé sous
la forme de gros grains intra-chloroplastiques (Figure 69).
178
Figure 68. Observation au microscope photonique de coupes de feuilles de plantes
témoins de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et Shahdara) à 50 JAL, après
coloration au réactif de Shiff. L'amidon est coloré en rouge et les parois des cellules en
rose. BS : Bundle Sheath, LE : Lower Epidermis, PP : Palisade Parenchyma, PH : Phloem, SP :
Spongi Palisade, UP : Upper Epidermis, X : xylem.
Résultats
Pe da t les
jou s d’e p i e tatio , la te eu e a ido des feuilles t
oi s de
Mt-0 et de Col-0 a tendance à rester stable même si à certaines dates des pics transitoires
d’a u ulatio appa aisse t : à J+12 pour Mt-0 ; à J+6 et J+15 pour Col-0. Au contraire, la
teneur en amidon des feuilles témoins de Shahdara croît linéairement pendant les premiers
jou s de l’e p i e tatio ava t de se stabiliser à J+9 : de 15,54 mg.g-1.MS-1 en moyenne à
J0 elle atteint ainsi 39,63 mg.g-1.MS-1 à J+9.
Au fur et à mesure que le stress hydrique s'installe la teneur en amidon des feuilles
des t ois
ot pes di i ue. Da s u p e ie te ps, ette di i utio d’a u ulatio peut
traduire un ralentissement de la biosynthèse et/ou une augmentation de la consommation
au ou s de la p iode de s he esse. Da s u deu i
e te ps, lo s u’elle est a o pag
d’u e hute de l’assi ilatio
efl te l’i te sit de la o so
ette, ette di i utio
e
atio .
Dans tous les cas, les réserves en amidon contenues dans les feuilles des 3 écotypes sont
presque épuisées en fin de stress. Ainsi, à J+12 les feuilles de Mt-0, Col-0 et Shahdara ont
perdu respectivement et comparativement à leurs témoins, 92 % (p<0,001), 84 % (p<0,001)
et 80 % (p<0,001) de leurs réserves en amidon.
Après réhydratation, les feuilles accumulent à nouveau des glucides sous la forme
d’a ido . Ces
se ves foliai es atteig e t e
o e
e 10,86 mg.g-1.MS-1 chez Mt-0,
22,34 mg.g-1.MS-1 chez Col-0 et 27,73 mg.g-1.MS-1 chez Shahdara. Ces réserves demeurent
significativement inférieures à celles dosées, à la même date, dans les feuilles des plantes
témoins.
179
S
Figure 69. Observation au microscope électronique à transmission de chloroplastes
d'Arabidopsis thaliana (Col-0). M : Mitochondrie, P : Chloroplaste (Plast), S : Amidon
(Starch). Cliché : C.Abadie, F.Thibault et P.Fleurat-Lessat.
Figure 70. Chromatogramme d'un extrait synthétique constitué d'une fraction d'extraits
foliaires des écotypes Mt-0, Col-0 et Shahdara, obtenu par Chromatographie Liquide Haute
Performance (CLHP). Colonne Aminex HPX-87C 300 x 7,8 mm ; 125-0095, (BIO-RAD) et
détection avec un refractomètre différentiel IOTA2 (Refractive Index Detector 475,
Kontron Instruments).
Résultats
2.3.3. Effet du déficit hydrique sur la teneur en sucres solubles foliaires
Les teneurs en sucres solubles des feuilles matures des écotypes Mt-0, Col-0 et
Shahdara sont déterminées par chromatographie liquide haute performance (CLHP). La
détection des sucres est effectuée par réfractométrie. Les analyses ont été réalisées sur les
ha tillo s foliai es gale e t utilis s pou le dosage de l’a ido .
L’a al se CLHP d’u e t ait s th ti ue o stitu d'e t aits foliai es de Mt-0, Col-0 et
Shahdara révèle 5 pics dont 4 (numérotés de 1 à 4, Figure 70) correspondent à des sucres
solubles qui ont pu être identifiés grâce à des co-chromatographies réalisées en présence de
standards commerciaux. Ces analyses montrent que les pics 1, 2, 3 et 4 correspondent
respectivement au raffinose, saccharose, glucose et fructose. Ces 4 sucres, classiquement
extraits en quantité significative des feuilles d'Arabidopsis thaliana (Schlüter et al., 2003;
Rohde et al., 2004; Antonio et al., 2007), ont donc été régulièrement quantifiés pendant la
période de stress hydrique et une dernière fois 4 jours après la réhydratation (Figure 71). Le
altose, p oduit d’h d ol se de l’a ido issu de l’a tivit de l’α-amylase (Smith et al., 2005),
a da s os o ditio s d’a al se u te ps de
pou pouvoi e
te tio t op p o he de elui du sa ha ose
t e lai e e t disti gu . La p se e, hez uel ues e t aits, d’u l ge
épaulement au niveau de la partie descendante du pic 2 témoigne parfois de sa présence. La
très grande majorité des extraits présente un pic 2 parfaitement symétrique sans
épaulement avec un temps de rétention qui correspond, sans ambiguïté, au saccharose.
180
Tableau 8. Teneurs moyennes des principaux sucres solubles foliaires ± écarts types (en
µmol.g-1.MS-1) pour les écotypes Col-0, Mt-0 et Shahdara, à 47 jours après la levée. ANOVA
diff e tes①au①seuil① ①%①d’ap s①le①test①de①Fishe . Les pourcentages représentent la part de
chaque sucre en fonction de la totalité des 4 principaux sucres dosés (saccharose, glucose,
fructose et raffinose).
Ecotypes
Col-0
Mt-0
-1
-1
µmol.g .MS
A
%
-1
-1
µmol.g .MS
B
Shahdara
%
µmol.g-1.MS-1
B
%
Saccharose
10,59 ± 0,83
11,23
8,9 ± 0,21
12
8,11 ± 0,06
8,26
Glucose
A
53,91 ± 0,58
57,2
B
42,74 ± 0,53
57,56
A
53,03 ± 0,12
54,03
Fructose
25,96B ± 0,75
27,54
19,05C ± 0,13
25,65
34,75A ± 0,27
35,4
Raffinose
3,79A ± 0,29
4,02
3,56A ± 0,15
4,8
2,25A ± 0,08
2,3
Résultats
À 47 JAL, les feuilles de Mt-0, Col-0 et Shahdara présentent une distribution stable de
leurs principaux métabolites (Tableau 8). Pour ces 3 écotypes le glucose est le principal sucre
présent dans les feuilles ; sa teneur représente entre 53 et 57,5 % de la teneur totale en
sucre. Le fructose est l'un des sucres les plus présent dans les feuilles des 3 écotypes et
représente entre 25,65 et 35,4 % de la teneur en sucre totale. Lorsque les teneurs en glucose
et fructoses sont rapportées à une masse de matière fraîche, elles sont très proches de
celles publiées dans la littérature (Rohde et al., 2004; Antonio et al., 2007).
Le saccharose qui est le principal sucre transporté à longue distance a une teneur comprise
entre 8,26 et 12 % ; les teneurs en saccharose rapportées à la matière fraîche sont
comparables avec celles rencontrées dans la littérature (Schlüter et al., 2003; Rohde et al.,
2004; Antonio et al., 2007).
La teneur en raffinose ne représente qu'entre 2,3 % et 4,8 % de la teneur en sucres solubles
totales ; ces faibles valeurs ont été observées chez Arabidopsis thaliana et plus
particulièrement pour Col-0 (Antonio et al., 2007).
181
Figure 71. Évolution de la teneur en saccharose (A), glucose (B), fructose (C) et raffinose (D)
mesurées chez des feuilles matures témoins () et stressées () de 3 écotypes
d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col- ① et① Shahda a .① S’agissa t① des① plantes sous contrainte
hydrique, la première mesure a été effectuée après arrosage au 47 ème jour après la levée
(J0). Les mesures suivantes ont été effectuées 3 (J+3), 6 (J+6), 9 (J+9) et 12 (J+12) jours
après ce dernier arrosage. Les plantes stressées ont été réhydratées après la mesure
effectuée à J+12 et une dernière mesure a été réalisée, sur de nouvelles feuilles, après
4 jours de réhydratation (J+16). Les plantes témoins ont été régulièrement et
convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes ± écarts-types (n= 5).
Test de Student : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001.
Résultats
Entre le 12ème jour et le 16ème jou d’e p i e tatio , les te eu s e su es solu les
des feuilles témoins de Mt-0 ont tendance à diminuer alors que celles de Col-0 et de
Shahdara ont au contraire tendance à augmenter au cours de la même période (Figure 71).
Lo s u’il e iste,
e su
o t ta dif d’a u ulatio
e p i e peut-être un début de
remobilisation des ressources carbonées liée à la sénescence. De manière très générale,
même si elles expriment la tendance décrite ci-dessus, les teneurs en saccharose des feuilles
témoins des 3 écotypes restent relativement stables au cours du temps au contraire des
te eu s e
affi ose ui peuve t pa fois
hez les pla ts t
o t e d’i po ta tes va iatio s. Quoi u’il e soit,
oi s, les p i ipales te da es
v l es pa l’a al se de l’a ido so t
confortées pa l’a al se des su es solu les : i pou Mt-0 une relative stabilité des teneurs
en glucides (solubles et insolubles) est observée entre J0 et J+12 puis une tendance à la
di i utio de l’a u ulatio e t e J+
e t e J et J+
et J+ 6 est relevée ; (ii) pour Col-0 relative stabilité
puis u e te da e à l’aug e tatio de l’a u ulatio des glu ides entre
J+12 et J+16 ; (iii) pour Shahdara une tendance ette à l’aug e tatio de l’a u ulatio des
glu ides tout au lo g de l’e p i e tatio . E
su
, Shahda a se
le t e a a t is pa
u p ofil d’a u ulatio glu idi ue assez diff e t de elui des deu aut es
Ainsi en réponse au déficit hyd i ue, les p ofils d’a u ulatio
ot pes.
glu idi ues
volue t
différemment entre les écotypes.
Chez Mt- , à J+
t
u e aug e tatio
de l’a u ulatio
o pa ative e t au
oi s de tous les su es solu les dos s est o se v e. L’aug e tatio la plus i po ta te
concerne le raffinose (x 3,44 par rapport au témoin) connu par ailleurs pour être
impliqué dans la signalisation du stress hydrique (Teruaki Taji, 2002). À partir de J+9, la
teneur en saccharose des feuilles stressées augmente de façon spectaculaire (x 5,42 à J+12
par rapport au témoin). Cette aug e tatio
corrélée à la o so
atio d’a ido
d’a u ulatio
est pa ticulièrement bien
Figure 67). Lors du dernier jour de stress (J+12), seule
la teneur en saccharose des feuilles stressées est en moyenne supérieure à celle des
témoins, les autres sucres solubles étant moins accumulés dans les feuilles stressées que
dans les feuilles témoins.
182
Figure 72. Évolution du rapport
, calculé chez des feuilles matures
témoins () et stressées () de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et
Shahdara). S’agissa t① des① pla tes① sous① o t ai te① h d i ue,① la① p e i e① esu e① a① t ①
moyennes ± écarts-types (n= 5).
Résultats
L’aug e tatio
des te eu s e
su es solu les o se v e à J+
hez Mt-0, est
retrouvée à J+6 chez Shahdara avec également chez cet écotype une augmentation
particulièrement importante du raffinose (x 5,87 par rapport au témoin). Cette soudaine
élévation est manifestement transitoire. Ainsi à J+9, la teneur en raffinose est redevenue
statistiquement identique à celle des feuilles témoins. Ce retour à une situation normale
’est pas aussi
a u
hez Mt-0 bien que la tendance soit également présente. Même si
elle est moins spectaculaire que celle observée chez Mt-0, une augmentation de la teneur en
saccharose est également observée à J+12 (x 2,4 par rapport au témoin), alors que, comme
chez Mt-0, les autres sucres solubles sont moins accumulés dans les feuilles stressées que
dans les feuilles témoins.
La réponse de Col-0 au déficit hydrique se différencie de celle de Mt-0 et de Shahdara
principalement au niveau du raffinose. En effet, contrairement à Mt-0 et Shahdara, aucun
pi d’a u ulatio
de affi ose
’est d te t da s les feuilles st ess es de Col-0. Une
augmentation significative de la teneur des 3 autres sucres solubles (saccharose, glucose,
fructose) est néanmoins observée, comme chez Shahdara, à J+9. De manière identique aux
deux autres écotypes, le saccharose est le seul sucre soluble dont la teneur augmente en
moyenne en fin de stress à J+12 (x 2 par rapport au témoin), les autres sucres étant à cette
date moins accumulés dans les feuilles stressées.
Après réhydratation, les teneurs en sucres solubles des feuilles issues des plants
stressées de Mt-0 sont en moyenne toujours supérieures à celles dosées dans les feuilles
témoins. À l’i ve se, les te eu s e su es solu les des feuilles issues des pla ts st ess s de
Col-0 et Shahdara sont soit inférieures soit équivalentes à celles détectées chez les témoins.
Le rapport entre la teneur en saccharose et la somme des teneurs de ses deux
o o
es o stitutifs glu ose et f u tose est u i di ateu
ui t aduit l’a u ulatio de
saccharose aux dépens de sa consommation et/ou de son exportation. Co
e l’i di ue la
Figure 72, ce rapport est chez les feuilles témoins des trois écotypes relativement stable au
cours du temps. En réponse au déficit hydrique, il augmente de manière spectaculaire entre
le 6ème jour et le 12ème jour après le début du stress chez Mt-0 et, de manière un peu moins
importante, entre le 9ème et le 12ème jour chez Col-0 et Shahdara. Cette augmentation traduit
u e fo te a u ulatio du sa ha ose ui ’est i o so
i e po t .
183
Figure 73. Expression de gènes codant 9 transporteurs de sucres par macro-array après 9
jours de stress (J+9).①Pou ① ha ue①g e,①l’e p essio ①da s①les①feuilles①des①pla tes①st ess es①
(SH) et témoins (T) des écotypes Mt-0, Col-0 et Shahdara est normalisée par la moyenne de
l’e p essio ① des① ① g es① de①
age① Actine 11 et Histone H4). Puis le rapport SH/T est
calculé et exprimé comme fonction du log2. Les valeurs présentes au dessus des
histogrammes sont soit 1,5 et reflètent l'induction de l'expression du gène ou soit -1,5
et traduisent alors une répression de l'expression du gène.
Résultats
2.3.4. Effet d’un déficit hydrique sur l’expression de gènes codant
quelques transporteurs de sucres
L'expression des gènes codant 9 transporteurs de sucres foliaires exprimés chez les 3
ot pes tudi s est esti
e, à l’aide d’u e te h i ue de
a o-array, après 9 jours de
stress (Figure 73). À cette date (J+9), les 3 écotypes sont atteints différemment par la
contrainte hydrique sans être pour autant en phase ultime de stress. Les profils d'expression
sont déterminés en calculant pour chaque gène le log2 du rapport entre l'expression
d te
Pou
i
e hez les pla tes st ess es et elle a a t isa t l’
ha ue
ot pe, l’ tude de l’e p essio des g
uivale t t
es des pla tes t
oi
log 2 S/T).
oi s et des pla tes
stressées a été réalisée sur des membranes de macro-array différentes. Afin de pouvoir
comparer les niveaux d'expression entre les deux traitements, l'expression moyenne de
chaque transporteur de sucre est normalisée avec la moyenne de l'expression de 2 gènes de
ménage (Actine 11 et Histone H4) déposés sur chaque membrane. Un gène est considéré
comme induit pour une valeur d'expression seuil de log2 (S/T)
valeur de log2 (S/T)
-1,5 (Medici, 2011) ; l’e p essio ou la
1,5 et réprimé pour une
p essio e p i e do
respectivement une variation au minimum 3 fois supérieure ou 3 fois inférieure au témoin.
L'expression du gène AtSUC2, t s e p i
da s les feuilles d’Arabidopsis thaliana en
conditions non contraintes (Figure 47.A), qui code un transporteur de saccharose réputé
majeur dans le chargement / déchargement du phloème (Srivastava et al., 2008) ne semble
pas significativement affectée par les 9 jours de stress même si une tendance à la
surexpression peut être observée chez les 3 écotypes. À l’i ve se, AtSUC aut e t a spo teu
de saccharose lui aussi fortement exprimé en conditions non contraintes, est réprimé par la
contrainte hydrique chez les 3 écotypes. AtSUC1 est généralement associé aux fonctions de
déchargement de saccharose dans les organes puits (Stadler et al., 1999; Sivitz et al., 2008).
Sa répression en réponse au déficit hydrique a été confirmée à de nombreuses reprises au
sein du Laboratoire (Minson, Lemoine et Pourtau, Communication Personnelle). L'expression
d’AtSUC1 est o
ue pou
te
gul e
gative e t pa la p se e o joi te d’u e fo te
concentration en saccharose et du facteur de transcription ABI5 dépendant lui-même de
l’aug e tatio de la o e t atio e ABA (Hoth et al., 2010).
184
Résultats
Le ale tisse e t de l’a tivit puits o
u
e t vo u e
po se à u d fi it h d i ue
(Moore et al., 1999; Paul et Foyer, 2001) pourrait alors expliquer cette répression à
o ditio
u’il se t aduise pa u e aug e tatio
de la te eu e
sa ha ose. Si ette
augmentation de teneur est bien observée dans les feuilles stressées de Mt-0 à J+9, elle est
inexistante à cette même date chez les écotypes Col-0 et Shahdara qui présentent pourtant
eu aussi u e
p essio de l’e p essio d’AtSUC1. AtSUC5, très modestement exprimé dans
les feuilles saines par rapport à AtSUC1 et AtSUC2, (Figure 47.A), est lui aussi réprimé par la
sécheresse chez les 3 écotypes. Les gènes codant AtPLT5 et AtPLT6, deux transporteurs
membranaires de polyols majoritairement exprimés dans les feuilles témoins des trois
écotypes, sont eux aussi réprimés par le déficit hydrique.
Le gène codant AtSTP13, transporteur de monosaccharides majoritairement exprimé
da s les feuilles o
o t ai tes, e se
le pas affe t pa le
a
ue d’eau. E
eva he,
l’e pression des gènes AtSTP3 et AtSTP14 est induite par le déficit hydrique uniquement
chez Col-0. En situation non contrainte ces deux gènes sont plus faiblement exprimés que ne
l’est AtSTP
Figure 47.B). Plus généralement, aucune surexpression considérée comme
significative (log2 (S/T)
1,5) de gènes codant des transporteurs de sucres
o osa ha ides, disa ha ides et pol ols
’a t observée dans les feuilles stressées de
Mt-0 et de Shahdara. Une surexpression des gènes AtSTP13, AtSUC2 et AtSTP7 mesurée
dans des feuilles de Col-0 en état de déficit hydrique a régulièrement été observée au sein
du Laboratoire (Minson, Lemoine et Pourtau, Communication Personnelle). Le gène AtSTP13
code un transporteur de glucose qui est par ailleurs connu pour être induit pendant un
stress abiotique (Craigon et al., 2004). M
e si elles
’appa aisse t pas i i
o
e
significatives au sens où le « log2 (S/T) » qui les caractérise reste inférieur à 1,5, des
tendances à la surexpression de ces 3 gènes ont néanmoins été observées dans les feuilles
stressées de Col-0 (Figure 73).
Quoi u’il e soit, il de eu e t s diffi ile de app o he
g
i ue des te eu s e
su es foliai es o e
es do
s ta t il est v ai
es d’e p essio
u’u e va iatio
de
l’e p essio d’un gène de transport peut être quelquefois totalement indépendante de
l’a tivit glo ale de t a spo t suppo t e pa la p ot i e u’il ode.
185
Discussion
D. Discussion
186
Discussion
1. Caractérisation des écotypes
1.1. Croissance et développement
Parmi les 8 écotypes étudiés, Cvi-0 se distingue très tôt (dès le 14ème jour après la
levée, JAL) des autres par son nombre réduit de feuilles (Figure 29) et à partir du 22ème JAL
par une surface foliaire systématiquement moins importante que celle des autres écotypes
(Figure 33). À l’oppos , d s le
ème
JAL, les rosettes d'Oy- so t o stitu es d’u
o
e de
feuilles plus important que celui des 7 autres écotypes. À 47 JAL, ces mêmes rosettes
possèdent un nombre moyen de feuilles (37,8) presque deux fois supérieur à celui des
rosettes de Cvi-0 (19,75). Ce nombre important de feuilles lié à une biomasse sèche élevée
(0,142 g) (Figure 37.B) est néanmoins associé à une surface foliaire photosynthétique
p ojet e
² pa
i les plus fai les ui t
oig e d’u i po ta t e ouv e e t e t e les
feuilles. L'écotype Mt-0 se différencie lui aussi à partir du 30ème jusqu'au 42ème JAL par un
nombre de feuilles moins élevé que celui d'Oy-0 mais toutefois plus important que celui des
6 autres écotypes. Il présente en outre la plus grande surface foliaire projetée entre le 34 ème
et le 42ème JAL. Avant le 34ème JAL il est très difficile de noter des différences de surface
foliaire projetée entre les écotypes, à l'exception de Cvi-0 dont la petite surface foliaire se
distingue rapidement. Le suivi du diamètre moyen des rosettes n'a pas permis de mettre en
évidence de différences appréciables entre les 8 écotypes du 14ème au 42ème (Figure 31). Les
premières différences constatées au 22ème JAL e s’a plifie t gu e jus u’au
diff e e d’e vi o
est ot e e t e l' ot pe do t les osettes o t e
ème
JAL. Une
o e
e le
diamètre le plus faible (généralement Oy-0) et ceux dont le diamètre des rosettes est en
moyenne le plus important (Bl-1 et Cvi-0). À 47 JAL et malgré une surface foliaire très faible
(38,36 cm²), les rosettes de Cvi-0 présentent un diamètre moyen relativement important
(12,21 cm) qui peut s'expliquer par des feuilles à longs pétioles. À cette même date, les
écotypes Col-0 et Ge-0 présentent les plus petites rosettes (diamètres respectifs de 11,09 et
10,99 cm) associées à des surfaces foliaires projetées et des valeurs de biomasse (fraîche et
sèche) parmi les plus basses.
187
Discussion
Au 47ème JAL les rosettes des écotypes An-1, Bl-1 et Mt-0 offrent des surfaces foliaires
projetées particulièrement importantes comprises entre 70,38 et 71,31 cm². Pour An-1 et
Mt-0, ces surfaces foliaires sont corrélées à des biomasses (fraîches et sèches) élevées alors
que pour Bl-1 cette surface foliaire projetée s'accompagne d'une biomasse fraîche très faible
(1,4 g) qui pourrait s'expliquer par une teneur en eau moins importante (Figure 38). À 47 JAL
les rosettes de Shahdara ont en moyenne une biomasse fraîche de 2,16 g significativement
plus élevée que celle des 7 autres écotypes et associée à une surface foliaire élevée bien que
statistiquement plus faible que celle d'An-1 et de Mt-0. La biomasse fraîche importante des
rosettes de Shahdara peut être expliquée par une teneur importante en eau. Avec une
io asse s he statisti ue e t o pa a le à elle de Shahda a, l’ ot pe O -0 offre une
biomasse fraîche (1,83 g) significativement plus faible liée à une teneur en eau des rosettes
plus faible (92,28 % au lieu de 93,67 % d'eau chez Shahdara).
1.2. Paramètres
photosynthétiques
et
transporteurs
de
sucres
Les teneurs moyennes en chlorophylles totales foliaires varient de 1,09 pour Cvi-0 à
1,56 µg.mg-1.MF-1 pour An-1 (Figure 40). Les feuilles d'An-1, Col-0, Ge-0 et Shahdara sont
particulièrement riches en chlorophylles contrairement aux feuilles de Cvi-0 et Oy-0. Il
’e iste pas de
o
latio
positive e t e fo tes te eu s e
hlo oph lles et fo tes
conductances stomatiques.
Les feuilles matures des écotypes An-1, Bl-1, Ge-0, Oy-0 et Shahdara ont des
conductances stomatiques (gs) moyennes qui varient entre 102,7 et 121,9 mmolH2O.m-2.s-1
(Figure 41.A). Les gs les plus importantes ont été enregistrées chez les feuilles de Mt-0
(144,9 mmolH2O.m-2.s-1) et de Cvi-0 (206 mmolH2O.m-2.s-1). Col-0 est quant à lui caractérisé par
la plus faible conductance stomatique (100,5 mmolH2O.m-2.s-1). La variabilité de la
transpiration (E) (Figure 45) et de la concentration interne en CO2 (Ci) (Figure 41.B) reflète
elle de la o du ta e sto ati ue. Il se
le toutefois u’u e fo te C i ne soit pas toujours
associée à une assimilation nette (AN) élevée (Figure 44).
188
Discussion
Quatre (Bl-1, Cvi-0, Ge-0 et Mt-0) des 8 écotypes étudiés présentent une AN particulièrement
importante comprise entre 6,24 et 6,83 µmolCO2.m-2.s-1. Ces AN peuvent être associées soit à
une faible (Cvi-0) soit à une forte (Ge-0, Mt-0, Bl-
effi ie e d’utilisatio de l’eau AN/E). À
l'opposé Oy-0 et Col-0 se singularisent par une AN réduite. Cohérente avec les faibles valeurs
de gs et de Ci pour Col-0, cette faible AN est enregistrée malgré une Ci élevée chez Oy-0.
Les fortes valeurs d'AN mesurées chez des écotypes présentant des différences
importantes de gs et de Ci confirment que d'autres paramètres (photochimie, activité de la
Ru is o… peuvent influencer le rendement de l'assimilation de CO2.
Parmi les 8 écotypes étudiés, Cvi-0 est vraisemblablement le plus original. Il est
caractérisé à 47 JAL par une forte AN (6,74 µmolCO2.m-2.s-1) liée à la gs
(206,06 mmolH2O.m-2.s-1) la plus élevée des 8 écotypes. Cette importante gs assure aux
feuilles de Cvi-0 la plus forte Ci (306,23 ppm). La forte AN pourrait compenser un nombre
réduit de feuilles et permettre ainsi de répondre à la demande des organes puits. L'écotype
Ge-0, caractérisé lui aussi par une AN élevée (6,77 µmol.m-2.s-1) et statistiquement
équivalente à celle de Cvi-0, présente contrairement à cet écotype une gs significativement
plus faible (114,15 mmol.m-2.s-1) et la Ci la plus basse (263,46 ppm) des 8 écotypes. Ge-0
possède donc une meilleur efficience d'utilisation de l'eau (AN/E = 5,84) que Cvi-0
(AN/E = 4,29). En présence de concentrations en CO2 ambiantes ou élevées, Cvi-0 est
caractérisé par une assimilation plus élevée que celle de Col-0 (Li et al., 2008). L’i apa it
de Cvi- à fe
e apide e t ses sto ates au ou s d’u st ess e pli ue ait sa se si ilit à
l’ozo e et au pathog
es (Rao et Davis, 1999; Brosche et al., 2010; Perchepied et al., 2010).
Ce problème de régulation aurait pour origine une accumulation importante de malate, de
K+ et de Cl- dans les cellules de garde (Monda et al., 2011). Originaire des îles Cap Vert se
situant proche de l'équateur, Cvi-0 est un écotype qui a évolué dans un isolement total et
dans un environnement aride caractérisé par de fortes intensités lumineuses (Lobin, 1983).
La p se e
hez
et
ot pe d’u e Cu/) -SOD chloroplastique particulière pourrait
contribuer à une résistance accrue au stress photo-oxydatif (Abarca et al., 2001).
189
Discussion
La faible teneur en chlorophylle (1,09 µg.mg-1.MS-1) des feuilles de Cvi-0 (comparativement
aux 7 autres écotypes) pourrait être une adaptation aux forts éclairements qui permettrait
de réduire l'énergie capturée au niveau des antennes des photosystèmes et de limiter ainsi
la production de ROS liée à un excès d'énergie lumineuse.
Au 56ème JAL, l’e p essio
elative des g
es oda t les p i ipau t a spo teu s de
saccharose (famille des AtSUC) (Figure 47.A , d’he oses fa ille des AtSTP) (Figure 47.B) et
de polyols (famille des AtPLT) (Figure 48) a été caractérisée dans 7 (Bl-1, Cvi-0, Col-0, Ge-0,
Mt-0, Oy-0 et Shahdara) des 8 écotypes étudiés. En conditions non contraintes, les mêmes
g
es so t e p i
g
es va ie peu d’u
s da s les feuilles de tous les
ot pes. Le iveau d’e p essio de es
ot pe à l’aut e. Seule l'e p essio d’AtSUC1 semble plus élevée chez
l'écotype Ge- . Cette o se vatio
este toutefois à o fi
e à l’aide d’u e
thode
quantitative de type PCR en temps réel.
1.3. Présentation des écotypes Col-0, Mt-0 et Shahdara
Parmi les 8 écotypes, Col-0, Cvi-0, Mt-0, An-1 et Shahdara sont les plus singuliers
vis-à-vis des critères que nous avons étudiés (Figure 49). L'écotype Cvi-0, très particulier,
notamment par sa gestio de l’eau, ’a epe da t pas pu t e ete u a il fleu it t s
rapidement après le 47ème JAL. L'écotype Col-0 a été préféré à An-1 (dont il est proche) car il
est très souvent utilisé comme écotype de référence. Finalement, les écotypes Shahdara,
Mt-0 et Col-0 ont été choisis pour être soumis à un période de déficit hydrique.
1.3.1. L’écotype Mt-0
Sans être aussi original que Cvi-0, Mt-0 est caractérisé à 47 JAL par une assimilation
nette (6,83 µmolCO2.m-2.s-1), une conductance stomatique (144,94 mmolH2O.m-2.s-1) et un
taux de transpiration (1,26 mmolH2O.m-2.s-1) élevés. La concentration interne en CO2 est forte
pp
et l’effi ie e d'utilisatio de l'eau AN/E = 5,46) faible. Les feuilles matures de
Mt-0 sont plus pauvres en chlorophylles (1,25 µg.mg-1MF-1) que celles de Shahdara et de
Col-0.
190
Discussion
Elles présentent en revanche une de sit du flu total d’ le t o s (JT = 52,01 µmol.m-2.s-1),
un rendement quantique du PSII (ΦPSII = 0,18) et un quenching photochimique (qP = 0,38)
supérieurs à ceux des deux autres écotypes. La vitesse maximale de carboxylation
(Vcmax = 28,92 µmol.m-2.s-1), la densité maximale du flux d'électrons photosynthétiques
(Jmax =
57,46
µmol.m-2.s-1)
et
la
vitesse
d'utilisation
des
trioses-phosphate
(TPU = 4,39 µmol.m-2.s-1) calculées à partir des courbes AN/Ci sont en revanche comparables
à celles des deux autres écotypes.
À 47 JAL, les feuilles de Mt-0, comparativement à celles des deux autres écotypes,
sont
particulièrement
riches
en
amidon
(28,46
mg.g-1.MS-1),
en
saccharose
(10,6 µmol.g-1.MS-1) et en glucose (53,91 µmol.g-1.MS-1). À la différence de Cvi-0, la biomasse
fraîche (1,74 g), le nombre de feuilles (32,9 à 42 JAL) et la surface foliaire (71,31 cm²) de
Mt-0 sont importants.
1.3.2. L'écotype Col-0
Col-0 est caractérisé par une faible gs (100,53 mmolH2O.m-2.s-1) qui s'accompagne
d'une Ci de 265,32 ppm particulièrement basse et d'une AN limitée (5,17 µmolCO2.m-2.s-1). Ces
paramètres lui confèrent une efficience d'utilisation de l'eau parmi les plus importantes
(AN/E = 5,86). L’AN réduite de cet écotype est liée à la faible gs. En effet, les courbes AN/Ci ont
permis de calculer des valeurs de Vcmax (28,73 µmol.m-2.s-1), de Jmax (64,34 µmol.m-2.s-1) et de
TPU (5,08 µmol.m-2.s-1) statistiquement équivalentes à celles de Mt-0 et de Shahdara. Les
feuilles de Col-0 possèdent une teneur en chlorophylles totales élevée (1,4 µg.mg-1MF). En
revanche, elles présentent des paramètres photochimiques moins performants que ceux des
deux autres écotypes : ΦPSII = 0,15, JT = 43,91 µmol.m-2.s-1 et qP = 0,29.
Les teneurs foliaires en fructose (19,05 µmol.g-1.MS-1) et en amidon (17,29 mg.-1.M-1)
sont faibles tout comme les biomasses fraîche (1,54 g) et sèche (0,094 g). Le nombre de
feuilles par rosette (29,92 feuilles à 42 JAL) et la surface foliaire projetée (55,94 cm²) sont
également modestes.
191
Discussion
1.3.3. L'écotype Shahdara
Shahdara est caractérisé par une AN moyenne (5,9 µmolCO2.m-2.s-1) accompagnée
d'une gs (121 mmolH2O.m-2.s-1) et d'une Ci (269,68 ppm) plutôt faibles. Aussi riche en
chlorophylles (1,39 µg.mg-1MF-1) que Col-0, cet écotype possède une efficience d'utilisation
particulièrement élevée (AN/E = 7,29). Le rendement quantique maximum du PSII (calculé à
partir du rapport Fv/Fm) est statistiquement plus important (0,825) que celui de Mt-0 (0,812)
et de Col-0 (0,816). Shahdara a des valeurs de ΦPSII (0,16), JT (47,01 µmol.m-2.s-1) et qP
(0,32) intermédiaires entre Mt-0 et Col-0. L'analyse des courbes AN/Ci à 47 JAL, révèle des
valeurs de Vcmax (29,2 µmol.m-2.s-1), Jmax (64,97 µmol.m-2.s-1) et TPU (5,21 µmol.m-2.s-1)
statistiquement identiques à celles de Mt-0 et de Col-0 même si elles pourraient sembler a
priori plus élevées.
À 47 JAL les feuilles de Shahdara contiennent de faibles réserves en amidon
(15,54 mg.g-1.MS-1) mais sont riches en glucose (53 µmol.g-1.MS-1) et en fructose
(34,75 µmol.g-1.MS-1). L'AN moyenne de Shahdara associée à une efficience d'utilisation de
l'eau importante est corrélée à 47 JAL avec des biomasses fraîche (2,16 g) et sèche (0,137 g)
plus importantes que celles de Mt-0 et de Shahdara. Si le nombre de feuilles est restreint
(29,77 feuilles à 42 JAL), la surface foliaire projetée est importante (67,26 cm²).
192
Discussion
2. Effet
d’un
déficit
hydrique
sur
la
croissance,
la
photosynthèse et l’accumulation glucidique des écotypes
Mt-0, Col-0 et Shahdara
2.1. Biomasse sèche et croissance
Au 47ème JAL J , les feuilles de l’ ot pe Mt-0, caractérisées par une AN et une gs
lev es, sto ke t de g a des
ua tit s de su es sous la fo
e d’a ido
Figure 67).
Pendant les 9 premiers jours de la contrainte hydrique (J0 à J+9), la biomasse sèche foliaire
o ti ue d’aug e te de
gs, l’AN et les
a i e o pa a le à elle des t
se ves e a ido se
ai tie
e t. E
oi s Figure 66). De J0 à J+3 la
eva he de J+ à J+ , alo s ue l’AN
décline, les réserves en amidon disparaissent progressivement. Entre J+9 et J+12, les
rosettes de Mt- d so
ais d pou vues d’a ido o t u e AN nulle et ne sont donc plus en
capacité de maintenir une vitesse de croissance normale. À J+12, la biomasse sèche des
rosettes stressées est donc inférieure à celle des témoins. Après réhydratation, Mt-0, très
affaibli par le stress hydrique, conserve une biomasse sèche très inférieure aux témoins.
Au 47ème JAL, les rosettes de Shahdara sont caractérisées par une forte biomasse
(supérieure aux deux autres écotypes) et une vitesse de croissance moyenne
(0,0125 g.jour-1). Du a t l’e p i e tatio de st ess h d i ue, la te eu e a ido des
osettes t
oi s
o t p og essive e t et de
a i e i po ta te jus u’à J+ ava t de se
stabiliser entre J+9 et J+12. À ce stade de développement et en dehors de toute contrainte,
cet écotype semble caractérisé par un métabolisme fortement orienté vers le stockage
d’a ido . Pendant les 6 premiers jours de déficit hydrique, l'assimilation nette, la teneur en
amidon et la vitesse de croissance des plantes stressées sont globalement équivalentes à
celles des témoins. Entre J+6 et J+9, l'AN chute légèrement mais de façon significative. Cette
baisse est manifestement suffisante pour induire une diminution des réserves en amidon et
pour provoquer un ralentissement de la croissance : à J+9 la biomasse des rosettes soumis
au déficit hydrique est en effet inférieure à celle des plantes témoins. Entre J+9 et J+12,
Shahdara retrouve, malgré une assimilation nette totalement inhibée, une vitesse de
croissance comparable au témoin qui est liée à un épuisement progressif de sa réserve en
amidon.
193
Tableau 9. Présentation des principaux résultats caractérisant l'effet du déficit hydrique
chez Mt-0, Col-0 et Shahdara, (Vcmax et Jmax mesurées à J+4, J+7, J+10, J+13 et J+17).
RWC
AN
gs
Ci
Mt-0
Vcmax
Jmax
Fv/Fm
JT
J+3
J+6
J+9
J+12
J+16
90,77% (*)
84,46% (**)
51,1% (***)
31,75% (***)
76,35% (***)
13%
gs
Col-0
Ci
Vcmax
Jmax
Fv/Fm
JT
gs
Shahdara
Ci
Vcmax
Jmax
Fv/Fm
JT
100% (***)
30,71% (***)
33,61%(***)
17,62%(***)
82,9%(**)
23,2%
47,07%(***)
92,23%(***)
90,89%(***)
6,86%
43,92%(*)
66,7%(**)
99,3%(**)
1%
13,36%(***)
29,57%(***)
0,83
37,03%(**)
81,39%(**)
4,18%
6,8%(*)
30,76%(**)
0,09%
12,84%
0,15%
5,97%
X 1,63
X 1,69 (**)
29,58(***)
88,28% (**)
0,07%
7,99%
3,35%
12,6%
54,81(***)
88,12% (**)
83,8% (***)
20,59
21,24
87,8%(**)
5,48%
0,79%
8,09%
7,35%
38%
61,24%(***)
65,55%(**)
0,46%
11,35%
0,81%
1,92%
7,44%
7,48
76,25%(***)
42,86%(**)
2,02%(*)
0,54%
40,73%(***)
24,04%(*)
4,94%
40,77(***)
92,98%
13,45%
7%
31%
38,42(***)
87,11% (***)
10,65%
42,86%(***)
83,73%(***)
1,02
36,24%(*)
93,06%(**)
11,37%
3,42%(*)
0,23%
0,58%
0,04%
2,67%
1,55%
1,39%
(Jt/4)-AN
0,52%
Saccharose
9%
Raffinose
Amidon
29,36(*)
90,75(***)
33,34% (***)
25,92%(***)
3,56%(*)
0,13%
23,34%(***)
X3,35(*)
20,87%(***)
1,77%
3%
50,74%(***)
X 5,23(***)
2,21%
4,39%
10,73%
36%(***)
X 5,42(***)
X 1,98 (**)
79,37(***)
79,18% (***)
78,82%(***)
99,35%(***)
0,3%
3,15%
50,6%(*)
48,13%(***)
33,33%(***)
14,93%
68,2%(***)
2,01%(**)
8,69%
20,96%
(Jt/4)-AN
2,33%
Saccharose
11%
Raffinose
Amidon
26,78(*)
RWC
92,39%
AN
100% (***)
1,5%
(Jt/4)-AN
4,25%
Saccharose X4,45 (***)
Raffinose X3,44 (***)
Amidon
RWC
87,41% (*)
AN
18,3 % (***)
0,52
2,28%
56%(*)
X5,87(***)
11,54%
17,08%(**)
11,17%(**)
13,45%()
0,15%
37,42%(***)
X 2 (**)
17,55%(**)
48% (**)
84,27(***)
60,55% (***)
20,84(**)
91,24%
96,6%(***)
19,18%(**)
18,39%(***)
4,33%
66,72%(**)
31,65%(**)
1,98%
8,3%
46,03%(***)
25,8%
X2,4 (*)
16,54%
48%
45,82(***)
80,53(***)
31,39(***)
0,82%
10,95%
0,72%
Discussion
Pendant les 9 premiers jours de stress, les rosettes de Col-0 conservent une vitesse de
croissance sensiblement équivalente à celle des témoins. À J+3 et à J+6, les réserves en
a ido so t i f ieu es à elles des t
oi s alo s ue l’assi ilatio
ette ’est pas encore
significativement affectée par le déficit hydrique. Il doit donc exister au niveau de la plante
une demande en sucres supérieure à celle nécessaire au soutien de la seule croissance. Entre
J+
et J+
, l’AN s’a
ule, les
se ves e
a ido
dispa aisse t et l’a u ulatio
de
biomasse foliaire ralentit.
2.2. Contenu relatif en eau (RWC), transpiration et utilisation
de la ressource en eau
L'aspect des rosettes de Mt-0 est modifié par le déficit hydrique entre le 3ème et le
6ème jour de stress (Figure 50). Pendant cette période, certaines feuilles commencent à
perdre de leur turgescence. Cette perte de rigidité qui rend compte de l'état plus ou moins
plasmolysé des cellules apparaît lorsque le RWC moyen des rosettes diminue de 91 à 84 %
(Figure 51). Les rosettes des écotypes Col-0 et Shahdara sont marquées plus tardivement par
le déficit hydrique entre le 6ème et le 9ème jour. Durant ces 3 jours, le RWC moyen des
rosettes diminue de 88 à 79 % pour Col-0 et de 93 à 87 % pour Shahdara (Tableau 9). Le
RWC des rosettes de Mt-0 est affecté 3 jours avant celui des deux autres écotypes. À la fin
de la période de 12 jours de stress hydrique, Mt-0 a donc subi une période de déficit
hydrique plus longue comparativement aux deux autres écotypes. Au dernier jour de stress
(12ème jour de stress, J+12) les écotypes sont marqués différemment par la contrainte
hydrique. Mt-0 caractérisé par un RWC moyen de 32 % est l'écotype le plus affecté par la
contrainte hydrique : certaines feuilles s'enroulent sur elles-mêmes (Astegiano et Pilatti,
2003), d’aut es so t
o pl te e t dess h es, d'aut es e o e p se te t u
rougissement qui traduit très certainement une accumulation d'anthocyanes. En effet,
l’a u ulatio d’a tho a es da s les va uoles e
po se au st ess h d i ue à d jà t
constatée chez Arabidopsis thaliana (Jung, 2004). Ces polyphénols participeraient à la
diminution du potentiel osmotique des feuilles qui contribuerait à une diminution de la
conductance stomatique (Choinski et Johnson, 1993).
194
Discussion
De manière générale, les polyphénols protègent également les plantes des radiations UV et
piègent les ROS générés par un stress photo-oxydatif (Shirley, 1996; Harborne et Williams,
2000). Avec un RWC moyen de 33 %, les rosettes de Col-0 ont tendance à montrer les
mêmes symptômes mais à des degrés moindres : la chute de RWC est apparue tardivement
et
utale e t de so te ue es osettes o t
a
u d’eau
oi s lo gte ps ue celles de
Mt-0. Si Mt-0 est l'écotype qui, clairement, a le moins bien supporté une suspension
d’a osage de
jou s et do
la s he esse, Shahda a s'av e t e l' ot pe ui a le
ieu
supporté cette période en maintenant plus longtemps un RWC élevé : en fin de stress (J+12)
ses rosettes sont encore caractérisées par un RWC de 60 % et par de nombreuses feuilles
parfaitement vertes sans signes de sénescence (Figure 50).
Le contenu relatif en eau des rosettes exprime un équilibre entre deux processus : la
régulation des pertes en eau au niveau des feuilles par transpiration (stomatique et
uti ulai e et les apa it s d’a so ptio de l'eau da s la
se ve utile du sol.
Ainsi, au 47ème jou ap s la lev e J , l’ ot pe Mt-0 est caractérisé par un taux de
transpiration (E, Figure 52) statistiquement plus élevé que celui de Col-0 et Shahdara. En
o s
ue e, o
e l’i di ue l’ volutio de la
se ve en eau du sol (Figure 53), lors des 5
premiers jours de stress, Mt-0 assèche progressivement son substrat de manière
significativement plus importante que ne le font les deux autres écotypes. Ces pertes en eau
i po ta tes s’e pli ue t pa u e o du ta e sto ati ue lev e ui s'a o pag e d'u e
assimilation nette (AN) (Figure 56.C) plus élevée (+24 % et +13 % par rapport respectivement
à Col-0 et Shahdara) mais pénalise le rapport AN/E (Figure 57)
ui t aduit l’effi ie e
d'utilisation de l'eau (-7 % et -33 % par rapport respectivement à Col-0 et Shahdara). Mt-0
maintient un RWC foliaire équivalent à celui des plantes témoins jusqu'au 6 ème jour de stress
en compensant des pertes en eau importantes par une absorption importante de l'eau de la
réserve utile du sol. Entre le 6ème et 9ème jour de stress, le RWC chute significativement car la
réserve en eau disponible dans le sol est devenue trop faible pour couvrir les besoins du
plant. En supposant que les pertes en eau du sol par évaporation soient sensiblement
équivalentes pour les 3 écotypes, les différences de pertes en eau journalières des pots
traduisent principalement une variabilité de transpiration.
195
Discussion
La transpiration (E) (Figure 52) diminue précocement chez Mt-0 entre le 3ème et le
6ème jour (-32 %) et plus tardivement entre le 6ème et le 9ème jour chez Col-0 et Shahdara
(respectivement, -48 % et -29 %). Un suivi journalie de l’ volutio des
se ves e eau du
sol (Figure 53 et Figure 54) précise que cette baisse a vraisemblablement lieu entre le 5ème et
le 6ème jour chez Mt-0, entre le 7ème et le 9ème jour chez Col-0 et entre le 7ème et le 8ème jour
chez Shahdara. Cette diminution de E traduit principalement la fermeture des stomates et la
diminution de la conductance stomatique (gS . Les pe tes d’eau vapeu pa voie uti ulai e
sont considérées comme restreintes (Steudle, 2002). Lo s u’elles sont observées pour la
première fois (J+6 pour Mt-0 et J+9 pour Col-0 et Shahdara), ces réductions du taux de
transpiration et de la conductance stomatique sont encore associées à des RWC élevés :
84 % pour Mt-0, 79 % pour Col-0 et 87 % pour Shahdara. Au cours des trois jours qui suivent
ette p e i e o se vatio , les RWC s’effo d e t du fait des pe tes e eau foliai es ui e
peuve t plus t e o pe s es pa l’a so ptio de l'eau p se te da s le sol.
Compte tenu de la périodicité de nos mesures, il est très difficile de positionner avec
e titude la fe
etu e sto ati ue et/ou so i du tio ava t ou ap s l’appa itio d’u e
légère diminution du RWC des rosettes. En réponse à un stress hydrique, il a déjà été
d
o t
u’u e hute de gs d’e vi o
% puisse intervenir chez Arabidopsis thaliana sans
que le RWC des rosettes (qui reste à 90 %) ne soit affecté (Poulson et al., 2006). Quoi u’il e
soit il est peu p o a le u’u RWC p o he de 80 % puisse provoquer la fermeture des
stomates. Un signal racinaire précoce, de type ABA, perçu par les cellules de garde et
i te ve a t ava t u e d sh d atatio des pa ties a ie
es se ait à l’o igi e de la fe
etu e
stomatique (Wilkinson et Davies, 2002). En effet, une humidité résiduelle du substrat
comprise entre 17 et 22 % est, dans nos conditions culturales, toujours corrélée à une chute
importante de la conductance stomatique (comprise entre 18 % et 61 %) qui intervient
toujours avant une chute importante du RWC (compris entre 6,5 % et 12 %). Au-delà, une
humidité du su st at de l’o d e de 14 à 18 %, est corrélée à une forte chute de RWC et à
l'apparition de symptômes de déshydratation.
196
Discussion
Au ou s d’u
pisode de s he esse, la s th se d'a ide a s issi ue ABA est
stimulée dans les racines et dans les feuilles (Tardieu et al., 1996; Zhang et Outlaw, 2001;
Gutschick et Simonneau, 2002). Cette augmentation de la concentration en ABA est corrélée
à une fermeture stomatique (Davies et Zhang, 1991; Tardieu et al., 1993; Zhang et Outlaw,
2001). Cepe da t, l’ABA a i ai e
e se ait peut-être pas le signal à longue distance
impliqué dans la fermeture stomatique. En effet, des constructions de tomates obtenues par
g effe de pa ties a ie
es su des a i es de
uta ts i apa les de s th tise de l’ABA
répondent à un déficit hydrique du sol en fermant leurs stomates (Holbrook et al., 2002). Le
stress hydrique pourrait induire une augmentation du pH de la sève xylémienne (Wilkinson,
1999) défavorable à la fo
de l’ABA
l
ie
e p oto
e et pe
a te de l’ABA ; de telle sorte que la plupart
ui a ive da s la feuille se ait
ajo itai e e t di ig ve s l’ pide
e et
les cellules de garde où il activerait la fermeture des stomates sans pour autant qu'une réelle
augmentation de la concentration en ABA foliaire soit constatée (Wilkinson et al., 1998;
Wilkinson et Davies, 2002; Chaves et al., 2009). Ainsi, chez Arabidopsis thaliana, comme chez
les espèces cultivées, une synergie entre les signaux hydrauliques racinaires et la
redistri utio de l’ABA foliai e pa ait suffisante pour induire une fermeture stomatique
(Christmann et al., 2007). Un signal hydraulique provenant des racines pourrait être perçu au
niveau des feuilles et une modification du pH de la sève xylémienne conduirait à une
redistribution de l'ABA foliaire.
L’aug e tatio de la te eur en sucres solubles (saccharose, glucose et fructose) des
feuilles systématiquement observée 3 jours avant une chute de la conductance stomatique
pourrait aussi induire des variations de gradients de potentiel hydrique à même de
provoquer une so tie d’eau des va uoles des cellules de garde par osmose (Wilkinson et
Davies, 2002). Cette hypothèse est à considérer avec prudence dans la mesure où nous ne
poss do s pas d’i fo
atio
o e a t la lo alisatio et la
pa titio des su es dos s. Le
mécanisme de chargement apoplastique du saccharose dans le phloème pourrait également
contribuer à la fermeture des stomates, car il consomme des protons présents dans
l'apoplaste, il participe à l'augmentation du pH qui en favorisant la forme ionisée non
pe
a te de l’ABA, i duit pa
o s
ue t so t a spo t jus u’au
ellules de ga de.
197
Discussion
Cet effet du saccharose sur la fermeture des stomates ne serait observé que pour les
espèces qui chargent le saccharose dans le phloème via la voie apoplastique comme
Arabidopsis thaliana (Lu et al., 1997).
Les fortes concentrations internes en CO2 (Ci) observées chez Mt-0 à J+9 et J+12 et
chez Col-0 et Shahdara à J+12 pourraient contribuer à maintenir les stomates fermés (i) en
i duisa t l’ouve tu e de a au a io i ues va uolai es (Patonnier et al., 1999 ; Hedrich et
Marten, 1993) et (ii) en favorisant une augmentation transitoire de la concentration en Ca2+
tosoli ue des ellules de ga de ui e t a e l’i hi itio des po pes à p oto s, l’efflu des
ions K+ et Cl- va uolai es et la fuite de es io s ve s l’apoplaste pa des a au à K + voltage
dépendants et des canaux anioniques spécifiques (Vavasseur et Raghavendra, 2005; Kim et
al., 2010). Par ailleurs, dans les cellules de garde des feuilles d'Arabidopsis thaliana, il a aussi
été démontré que l'ABA stimule une accumulation d'H2O2 (en activant initialement une
protéine kinase, OST1, qui activerait à son tour une NADPH oxydase) qui induirait une
fermeture des stomates via une augmentation de la concentration en calcium cytosolique
(Pei et al., 2000; Mustilli et al., 2002). Sachant que chez Triticum aestivum une diminution de
la t a spi atio a t
o
l e à u e a u ulatio d’H2O2 li e à l’i stallatio d’u st ess
oxydatif (Luna et al., 2005), il est possi le
u’au ou s de
ot e e p i e tatio
e
phénomène ait contribué au maintien de la fermeture stomatique.
Les augmentations de teneurs en raffinose que nous avons parfois constatées
notamment chez Mt-0 et Shahdara pourraient aussi permettre de limiter les effets de la
déshydratation. En effet, des mutants sur-exprimant des gènes codant pour une galactinol
synthase et produisant des quantités importantes de galactinol et de raffinose, ont montré
une diminution de leur transpiration foliaire et une résistance accrue à la sécheresse
(Teruaki Taji, 2002).
198
Discussion
Au soir du dernier jour de stress (J+12), les plantes sont réhydratées. Après 4 jours,
de nouvelles mesures sont réalisées afin d'observer le recouvrement des écotypes après la
période de contrainte hydrique. Les feuilles de Mt-0 ayant été trop altérées par le stress
pour être à nouveau échantillonnées après la période de récupération, il a été décidé
d’effe tue les
esu es i dividuelles su de ouvelles feuilles. Les
sultats o te us ap s
réhydratation ne reflètent donc pas un recouvrement des feuilles stressées et analysées
pendant la contrainte hydrique mais plutôt la récupération globale des rosettes et des
feuilles qui se sont développées après celles analysées au cours du stress.
Les plantes réhydratées des écotypes Col-0 et Shahdara sont caractérisées par des
RWC moyens de respectivement 88 et 91 % statistiquement identiques aux témoins. Elles
présentent par ailleurs des rosettes aux feuilles à nouveau rigides et dont les surfaces
foliaires totales apparaissent, visuellement, assez proches de celles des plantes témoins. En
eva he, les osettes de l’ ot pe Mt-0 semblent avoir une capacité à se réhydrater moins
i po ta te puis ue leu RWC e e o te u’à
% alo s ue elui des osettes témoins est
de 88,4 %. Les plants réhydratés offrent une surface foliaire totale qui, visuellement,
apparaît nettement plus faible que celle des témoins. Ces observations pouvaient être
attendues dans la mesure où Mt- est l’ ot pe ui a le plus souffert du déficit hydrique et
ui p se tait ava t l’ tape de
h d atatio
des osettes o stitu es de
o
euses
feuilles desséchées ou fortement sénescentes.
199
Discussion
2.3. Effet
du
déficit
hydrique
sur
la
photosynthèse
d’Arabidopsis thaliana
2.3.1. Limitations stomatiques et métaboliques
En réponse à la contrainte hydrique, une baisse de la conductance stomatique (g s)
(Figure 56.A) est observée chez Mt-0 six jours après le dernier arrosage (J+6, -47 %) soit
3 jours avant celle constatée chez les écotypes Col-0 (J+9, -61 %) et Shahdara (J+9, -42 %).
Cette baisse significative de la gs est, à ces dates, toujours corrélée à une diminution de la
concentration interne en CO2 (Ci) (Figure 56.B) et de l'assimilation nette (AN) (Figure 56.C) :
-18 % pour Mt-0, -33 % pour Col-0 et -42 % pour Shahdara. Durant les premières phases du
stress la gs di i ue dava tage ue l’AN (Tuzet et al., 2003; Rouhi et al., 2007).
Au 6ème jour (J+6) après le dernier arrosage pour Mt-0 et au 9ème jour pour Col-0 et
Shahdara, l'augmentation significative de l'efficience d'utilisation de l'eau (Figure 57), qui
exprime le rapport entre les flux de CO2 entrant dans la feuille et les flux de vapeur d'eau
sortant de la feuille (AN/E), augmente systématiquement à mesure que la conductance
stomatique diminue. Cette augmentation témoigne d'une meilleure efficience de l'utilisation
de l'eau pour fixer le CO2 et s'explique par une assimilation nette encore importante malgré
la relative fermeture des stomates. Dans un premier temps, la fermeture des stomates
induit donc une forte baisse de la transpiration sans pour autant pénaliser aussi fortement
l'assimilation nette. Cette assimilation nette se maintient temporairement grâce à la
consommation du CO2 restant dans les feuilles qui se traduit in fine par une chute du Ci
corrélée avec l'augmentation du rapport AN/E (Renou et al., 1990; Gimenez et al., 1992;
Lawlor, 1995).
Les valeurs de Ci calculées à pa ti des
esu es d’ ha ges gazeu peuve t t e
biaisées par la fermeture hétérogène des stomates à l’ helle de uel ues
al., 1999) et la p se e d’u e t a spi atio
uti ulai e o
2
(Tezara et
ulle (Lawlor et Cornic, 2002;
Flexas et al., 2006). Les e eu s possi les d’esti atio de la Ci associées à la fermeture
hétérogène des stomates sont ici limités par le fait que la presque totalité du limbe foliaire
est placée dans la chambre de mesure du CIRAS-2.
200
Discussion
Pa ailleu s, ous faiso s l’h poth se o
e d’aut es (Tezara et al., 1999) que dans nos
conditions de culture et de mesure, la pe te d’eau vapeu pa voie uti ulai e de eu e
négligeable (Steudle, 2002).
Cette faible diminution d’assi ilatio
ette de CO2 observée en début de stress
hydrique pour des valeurs de RWC comprises entre 79 et 87 % est liée à une limitation de la
diffusion du CO2 atmosphérique jusqu'aux sites de carboxylation à l'intérieur des
chloroplastes. Cette limitation précoce est due à la fermeture des stomates qui vise à
prévenir la déshydratation foliaire. La conductance stomatique est responsable de la
diffusion du CO2 atmosphérique au travers des stomates dans la chambre sous-stomatique
alors que la conductance du mésophylle est composite et caractérise les résistances au
transfert du CO2 présent dans les espaces intercellulaires jusqu'aux sites de carboxylation
dans le stroma des chloroplastes (Lawlor, 2002; Medrano et al., 2002).
La limitation stomatique est chronologiquement la première et la plus importante
limitation de l'AN lors de la mise en place du déficit hydrique (Meyer et Genty, 1999). Elle
interviendrait majoritairement en conditions de stress modéré au champ ou plus
généralement pour des RWC compris entre 70 et 90 % (Chaves et al., 2002; Chaves et al.,
2003) comme ceux présentés ici : 84 % pour Col-0 à J+6, 79 % et 87 % pour respectivement
Col-0 et Shahdara à J+9. Diverses expériences ont permis de mettre en évidence
l'importance de la limitation stomatique pendant le stress hydrique. En forçant l'ouverture
des stomates de feuilles de Phaseolus vulgaris L. durant une période de sécheresse (RWC de
70 %) par abaissement de la température foliaire de 23°C à 14°C, Cornic et Ghashghaie
(1991) ont mesuré sur les plantes stressées, aux stomates désormais ouverts, des valeurs
d'AN ide ti ues à elles des pla tes t
oi s. D’aut es auteu s, e
eti a t l'épiderme de
feuilles de Ramonda mykoni (Ramonde des Pyrénées) soumises à une contrainte hydrique
(gamme de RWC comprise entre 100 et 50 %) ont permis au CO2 de diffuser librement dans
les espaces intercellulaires et aux feuilles stressées désormais dépourvues d'épiderme de
retrouver des valeurs d'AN équivalentes aux témoins (Schwab et al., 1989).
201
Discussion
D’aut es tudes o t
o t
ue du a t u st ess h d i ue
od
il ’ avait pas de
diff e es e t e l’AN mesurée chez des feuilles témoins et celle mesurée chez des feuilles
stressées à condition que la mesure ait été réalisée avec des concentrations en CO 2
susceptibles de restaurer un Ci équivalent à la concentration en CO2 normale et ambiante
(Cornic et al., 1989; Quick et al., 1992; Tourneux et Peltier, 1995; Cornic et Fresneau, 2002;
Lawlor et Cornic, 2002). De manière plus surprenante, Cornic et Fresneau (2002) recouvrent
des AN maximales chez des plantes (appartenant à trois espèces différentes) présentant un
gradient de déficit hydrique en ajoutant seulement 10 % de CO2 supplémentaire à la
concentration ambiante. Ces travaux tendent à montrer que les effets des limitations
diffusives p
o es su la photos th se so t
ve si les lo s u’o appli ue au feuilles
stressées une concentration de CO2 adéquate qui permet de maintenir un Ci proche de celui
des témoins. Par ailleurs, ces observations confirment que durant les premières phases du
d fi it h d i ue, la fe
etu e des sto ates est l’ l
e t d te
i a t de la li itatio de
l'AN. Cepe da t, ave des app o hes e p i e tales si ilai es, d’aut es auteurs, qui ont
soumis des feuilles d'Helianthus annuus en déficit hydrique à de fortes concentrations en
CO2,
’o t pas
ussi à
up e
l’AN maximale (mesurée par une technique
polarographique) déterminée chez les feuilles témoins (Tang et al., 2002). Enfin, des études,
as es su l’a al se des ou es AN/Ci, semblent confirmer ce dernier résultat dans le sens
où elles ne sont pas aussi catégoriques sur la possibilité de récupérer totalement
l’assi ilatio
ette
a i ale
o p is pou des d fi its h d i ues jug s
od
s (Tezara et
al., 1999; Tezara et al., 2011).
Nos do
es ’o t pas permis de caractériser le stade de sécheresse modérée où la
photosynthèse est limitée exclusivement par la diffusion du CO2. Les premières diminutions
l g es
ais sig ifi atives d’assi ilatio
ette Figure 56.C) ont été observées à J+6 chez
Mt-0 (-18 %, p<0,001) et à J+9 chez Col-0 (-33 %, p<0,001) et Shahdara (-17 % p<0,01).
L’a al se des ou es AN/Ci (Figure 59) effectuées un jour plus tard (J+7 pour Mt-0 et J+10
pour Col-0 et Shahdara) montrent clairement, au moins pour Mt-0 et pour Col-0, que
l’appli atio d’u e o e t atio satu a te e CO2 (Ci) de 1600 ppm, ne permet pas de
ta li , hez les feuilles st ess es, des valeu s
a i ales d’AN comparables à celles des
feuilles témoins.
202
Discussion
Dans ces deux cas, les limitations photosynthétiques ne sont donc déjà plus exclusivement
diffusives mais aussi métaboliques comme en attestent par ailleurs les diminutions
significatives de la vitesse maximale de carboxylation de la Rubisco (Vcmax) (Figure 60.A). Le
cas de Shahdara est un peu particulier dans la mesure où, dans ces conditions de forte
concentration en CO2, les feuilles stressées sont capables de récupérer presque totalement
une AN maximale comparable à celle des témoins tout en présentant une légère mais
significative, baisse de la Vcmax. Ce
sultat ’est pas su p e a t puis u’à J+ , l’assi ilatio
nette de Shahdara était peu et moins atteinte que celle des deux autres écotypes. À J+10, les
li itatio s
ta oli ues se
le t do
oi s i stall es hez Shahda a u’elles e le so t à
J+7 chez Mt-0 et à J+10 chez Col-0. À ce stade de sécheresse, on peut envisager que la faible
li itatio d’assi ilatio
ette
esu e -17 %, p<0,01) chez Shahdara avec 380 ppm de CO2
est p o a le e t esse tielle e t d’o igi e diffusive. Quoi
u’il e
soit,
os do
es
semblent montrer que chez Arabidopsis thaliana, les limitations métaboliques interviennent
très rapidement pour des valeurs de RWC qui sont encore relativement élevées. Pour des
raisons techniques, les courbes AN/Ci ont été effectuées un jour après les mesures
d’ ha ges gazeu . Les RWC des plants au moment où les courbes ont été effectuées, sont
do
plus fai les ue eu
esu es la veille au
mesurées avec 380 ppm de CO2 o t t
u lie p
o e t où les aisses d’assi ilatio
o stat es. Il se
is e t e l’i stallatio des li itatio s
le do
ettes
d li at de te te d’ ta li
ta oli ues et le RWC sa ha t ota
e t
que les RWC diminuent ensuite très rapidement en 3 jours : celui de Mt-0 évolue de 84 %
(J+6) à 51 % (J+9), celui de Col-0 de 79 % (J+9) à 33 % (J+12) et celui de Shahdara de 87 %
J+
à
% J+
. Il ’e de eu e pas
oi s p o a le u’à J+ pour Mt-0 et à J+10 pour
col-0 et Shahdara, les RWC soient relativement proches de ceux décrits, par certains auteurs,
pour être associés aux limitations exclusivement diffusives (Chaves et al., 2002; Chaves et al.,
2003). Cette o se vatio se
le d’auta t plus pe ti e te hez Shahda a. Des al uls fo d s
sur les courbes AN/Ci et visant à faire la part des limitations stomatiques et métaboliques ont
été proposées (Jacob et Lawlor, 1991; Lawlor, 2002; Tezara et al., 2002; Tezara et al., 2003).
Le calcul basé sur des valeurs de Ci pe
et d’ide tifie les seules li itatio s sto ati ues de
toutes les autres limitations métaboliques et mésophylliennes.
203
Tableau 10. Évolution des limitations relatives stomatiques (Ls) et métaboliques (Lm)
calculées à partir des courbes AN/Ci mesurées chez des feuilles matures témoins et
st ess es① de① ① ot pes① d’Arabidopsis thaliana (Mt-0, Col-0 et Shahda a .① S’agissa t① des①
plantes sous contrainte hydrique, la première mesure a été effectuée au 48ème jour après
la levée (J+1). Les mesures suivantes ont été effectuées 4 (J+4), 7 (J+7), 10 (J+10) et 13
convenablement hydratées. Les valeurs représentent des moyennes (n= 3).
Mt-0
Col-0
Shahdara
J+4
J+7
J+10
J+13
J+17
Ls
18 %
21,86 %
70,00 %
100,00 %
36,25 %
Lm
0,35 %
35,50 %
87 %
89,90 %
3,11 %
Ls
24,38 %
21,14 %
26,93 %
100 %
45,71 %
Lm
8,43 %
6,83 %
17,45 %
91,15 %
22,43 %
Ls
22,83 %
13,29 %
24,58 %
34,25 %
24,34 %
Lm
0%
5,36 %
5,88 %
63,80 %
0%
Discussion
Afin de pouvoir différencier ces dernières limitations, il aurait fallu réaliser des courbes de
type AN/Cc où Cc exprime la concentration en CO2 chloroplastique. Ce calcul de limitations
appli u à os do
es, o fi
e l’i stallatio p
o e de li itatio s
soph llie
es et
métaboliques) autres que stomatiques (Tableau 10). Ainsi à J+7 pour Mt-0 les limitations
stomatiques (Ls) et mésophylliennes/métaboliques (Lm) sont respectivement de 21,86 % et
35,5 %. Pour Col-0 à J+10, elles sont de 26,93 % et 17,45 % et pour Shahdara, à cette même
date, elles sont de 24,58 % et 5,88 %. Comme attendu, les limitations métaboliques existent
chez Shahdara même si elles sont particulièrement faibles. En fin de stress (J+13), ces
limitations métaboliques ont augmenté logiquement, non sans respecter les particularités
de chaque écotype : 89,9 % pour Mt-0, 91,15 % pour Col-0 et 63,8 % pour Shahdara. Quoi
u’il e soit au
o e t où la p e i e di i utio sig ifi ative d’AN est constatée chez
chacun des 3 écotypes, elle résulte à la fois des limitations stomatiques et mésophylliennes
ou métaboliques. Les limitations métaboliques apparaissent progressivement après les
li itatio s sto ati ues de telle so te
u’u e o
i aiso
de es deu li itatio s est
observée lorsque le stress hydrique s’i te sifie : la disponibilité de la ressource de CO2 n'est
alors plus la seule condition limitant la photosynthèse (Ort et al., 1994; Flexas et Medrano,
2002). Ces limitations métaboliques, qui affectent la photochimie et le métabolisme
photos th ti ue peuve t
ota
e t
sulte
d’u e a
l ation du processus de
sénescence.
La conductance mésophyllienne est caractérisée par une double résistance au trajet
du CO2 : résistance en phase gazeuse dans les espaces intercellulaires et résistance en phase
liquide à travers les membranes des cellules et des chloroplastes (Pons et al., 2009). La
conductance mésophyllienne, beaucoup plus faible que la conductance stomatique, est donc
fo tio de la st u tu e a ato i ue foliai e voi e
e de l’a o da e des aquaporines
membranaires (Uehlein et al., 2003; Hanba et al., 2004; Flexas et al., 2006; Flexas et al.,
2007; Pons et al., 2009). Elle participerait grandement aux limitations diffusives et pourrait
avoir un rôle important dans la chute des rendements photosynthétiques en réponse à des
périodes de sécheresse (Niinemets et al., 2009).
204
Discussion
Seuls les résultats de conductance stomatique ont été présentés ici. Des valeurs de
conductance mésophyllienne ont néanmoins été calculées (en prenant en compte C c, Ci et
AN) à partir de l’ajuste e t des ou es de
3 courbes par
ot pe et pa t aite e t ’a pas pe
et pe ti e tes pe
fai le
ha tillo
po se AN/Ci (Sharkey et al,
is d’o te i des do
. L’a al se de
es de g m fiables
etta t d’ ta li u e te da e sû e en réponse au stress hydrique. Le
age ’est sa s doute pas la seule aiso à e o stat. E effet, da s u e
revue récente dédiée à la comparaison des différentes techniques permettant
d'appréhender la gm, Pons et al. (2009) déconseillent fortement de déterminer la gm à l'aide
des courbes AN/Ci car son calcul repose sur une estimation de la valeur moyenne du point de
compensation pour le CO2 (Γ*) en absence de toute respiration mitochondriale de jour. Afin
de déterminer la gm ave p
isio
es auteu s e o
a de t d’u e pa t de
esu e le
point de compensation pour le CO2 et la espi atio diu e et d’aut e pa t de coupler les
do
es o te ues pa les
esu es d’ ha ges gazeu à des
L'utilisatio d'u e te h i ue de
esu es de fluo es e e.
as e su l’utilisatio du 13C peut
également apporter des valeurs de gm fiables (Pons et al., 2009).
Dans tous les cas, il a été démontré que la conductance mésophyllienne diminuait
sous l’effet du st ess h d i ue aussi ie pa a
t d’a osage (Lawlor et Cornic, 2002; Flexas
et al., 2004; Grassi et Magnani, 2005) que par usage du polyéthylène glycol (Warren et al.,
2004). Cette réponse pourrait être aussi rapide et réversible que celle de la conductance
stomatique (Ethier et Livingston, 2004; Flexas et al., 2008). Tout comme la conductance
stomatique, la conductance mésophyllienne évolue en fonction de la concentration en CO2
(Centritto et al., 2003), de l'intensité lumineuse (Gorton et al., 2003), de la température
(Bernacchi et al., 2002; Gorton et al., 2003; Warren et Dreyer, 2006) et du déficit de pression
de vapeur (Bongi et Loreto, 1989; Flexas et al., 2008). De plus, la gm diminue aussi en
réponse à un traitement à l'ABA (Flexas et al., 2006b). Au vu de ces observations, l'évolution
de la conductance du mésophylle durant une période de déficit hydrique et sa participation
aux limitations diffusives est de première importance. De plus la détermination de la gm
pourrait, en donnant accès à la concentration en CO2 dans le chloroplaste, participer à une
meilleure définition du lien entre gs et AN (Niinemets et al., 2009).
205
Discussion
Si la chute de la conductance stomatique se maintient jusqu'au dernier jour de stress
(J+12), une hausse significative (par rapport aux feuilles témoins) de la C i est enregistrée
3 jours après que sa première baisse ait été constatée. Cette hausse détectée à J+9 chez
Mt-0 (+29 %, p<0,001 ) perdure à J+12 (+33 %, p<0,001 ). Chez les deux autres écotypes, elle
’est d te t e u’u e fois à J+
(dernier jour de stress) : +26 % (p<0,001) pour Col-0 et
+18 % (p<0,001) pour Shahdara. Les limitations métaboliques (87 % à J+10 pour Mt-0, 91 %
et 63 % à J+13 pour respectivement Col-0 et Shahdara) peuvent expliquer que l’assi ilatio
nette est inhibée alors que la concentration intercellulaire en CO2 augmente,
toujou s possi le d’o je te
e s’il est
ue la Ci est une concentration calculée (et non directement
mesurée) (Terashima, 1992; Boyer et al., 1997) et qui surestime probablement la
concentration en CO2
elle à l’i t ieu
des
ellules du pa e h
e assi ilateu .
L’aug e tatio de Ci observée pourrait alors s’expliquer par une inhibition de l'assimilation
nette indépendante cette fois-ci de la disponibilité en CO2 mais due à ces limitations
métaboliques (Brodribb, 1996; Lawlor, 2002; Lawlor et Cornic, 2002; Medrano et al., 2002).
Cette hypothèse est logiquement soute ue pa l’a al se des ou es AN/Ci qui montrent
u’à es
es dates J+10 pour Mt-0 et J+13 pour Col-0 et Shahdara) l’appli atio de
concentrations croissantes et saturantes en CO2 ne permet pas de restaurer des
assimilations nettes maximales proches de celles mesurées chez les plantes témoins.
Si ces limitations diffusives réversibles par de fortes concentrations en CO2 sont le
plus souvent observées pour des valeurs de RWC comprises entre 75 et 90 %, il est
généralement admis que pour un contenu relatif en eau inférieur à 75 % la baisse d'AN ne
peut plus être totalement levée par des concentrations en CO2 saturantes (Lawlor et Cornic,
2002; Cornic et Massacci, 2004). C’est effe tive e t e ue ous o se vo s à J+
pou
Mt-0 et à J+13 pour Col-0 et Shahdara. Si une pression partielle de 1600 ppm de CO2 dans
l’ai
’a p es ue pas d’i ide e su les AN maximales des feuilles stressées de Mt-0 et de
Col-0 qui restent très faibles (par rapport aux témoins) et presque identiques à celles
mesurées (chez ces mêmes feuilles stressées) pour une concentration en CO2 de 380 ppm,
elle pe
et
a
oi s d’aug e te se si le e t l’AN maximale des feuilles stressées de
Shahdara (Figure 59).
206
Discussion
Shahdara est donc l'écotype qui supporte le mieux la période de sécheresse et retarde ainsi
l’i stallatio des li itatio s
ta oli ues : son AN maximale au dernier jour de stress est de
4,29 µmolCO2.m-2.s-1 (pour un RWC de 60 % déterminé le jour p
maximale de Col-
’est ue de ,
de t alo s ue l’AN
µ ol CO2.m-2.s-1 (pour un RWC de 33 % déterminé le
jour précédent) et celui de Mt-0 de 0,84 µmol CO2.m-2.s-1 (pour un RWC de 32 % déterminé le
jour précédent).
2.3.2. Effet du déficit hydrique sur la carboxylation
En fonctio de l’ ot pe o sid
, l’assi ilatio
ette de CO2 autrement dit la
fixation du CO2 sur le ribulose 1,5 bisphosphate (RuBP) est plus ou moins rapidement
pénalisée au cours de la période de stress hydrique (J+6 pour Mt-0 et J+9 pour Col-0 et
Shahdara). L'étude des courbes AN/Ci pe
et d’esti e , à pa ti d’u
od le, la vitesse
maximale de carboxylation du RuBP par la Rubisco (Vcmax) (Figure 60.A). La vitesse maximale
de carboxylation de la Rubisco exprime une activité maximale de carboxylation en conditions
de lumière saturante et de concentration en CO2 non limitante et correspond à la pente de
la droite liant AN à Ci. Elle traduit le potentiel de fixation de la Rubisco présente dans les
feuilles. Pendant le stress hydrique, les diminutions de Vcmax observées montrent que
l'activité de la Rubisco des 3 écotypes a été atteinte par la sécheresse. Ainsi, la Vcmax de Mt-0
d
o t sig ifi ative e t d’e vi o
% e t e J+ et J+ et de
% e t e J+ et J+
pou
devenir presque nulle à J+13 (-99 %). La chute de la Vcmax de Col-0 survient plus tardivement
entre J+7 et J+10 (-66 %) et se pou suit jus u’à J+
-94 %). Quant à la Vcmax de Shahdara,
elle décroît plus modestement entre J+7 et J+10 (-
% pou elle aussi s’effo d e à J+
(-93 %). Pour chacun des 3 écotypes étudiés la première baisse de la Vcmax est
systématiquement corrélée à une chute significative de la gs et par conséquent à celle de la
Ci. Les limitations diffusives stomatiques en début de stress pourraient induire une chute de
la concentration en CO2 chloroplastique qui serait responsable de la chute de la Vcmax,
comme cela a déjà été observé chez diverses espèces méditerranéennes (Galmés et al.,
2007), chez Glycine max et Nicotiana tabacum (Flexas et al., 2006).
207
Discussion
Cette baisse de l'activité maximale de la Rubisco pourrait être la conséquence : (i) d'une
diminution de l'état d'activation de l'enzyme par la Rubisco activase (Cheng et al., 2002;
Lawlor et Cornic, 2002; Parry et al., 2002; Zhou et al., 2007), (ii) de la fixation d'un inhibiteur
sur les sites catalytiques (Parry et al., 1993; Parry et al., 2002) et/ou (iii) d'un changement de
sa conformation (Parry et al., 2002). La teneur en Rubisco, enzyme très abondante dans le
stroma, est généralement peu affectée par les stress hydriques qu'ils soient modérés ou
sévères (Medrano et al., 1997; Tezara et al., 1999; Medrano et al., 2002). Néanmoins, à
terme, un ralentissement de l'activité puits conduisant à une accumulation de glucose et/ou
de saccharose dans les organes sources pourrait être à l'origine d'une répression de
l’e p essio des g
es oda t pou la grande sous-unité (LSU) et la petite sous-unité (SSU)
de la Rubisco (Reinbothe et al., 1991; Cheng et al., 1992; Krapp et al., 1993; Sage, 1994;
Moore et al., 1999). Logiquement, les nouvelles feuilles échantillonnées après 4 jours de
réhydratation recouvrent des valeurs de Vcmax identiques à celles des témoins.
2.3.3. Effet d'un déficit hydrique sur la photochimie
Une atteinte des photosystèmes, de la capacité à utiliser l'énergie lumineuse et/ou
de la ha e de t a spo teu s d’ le t o s pou ait, du a t u e p iode de d fi it h d i ue,
t e à l'o igi e d’u p o essus de photo-inhibition de la photosynthèse. L'installation de ce
processus durant la période de sécheresse participerait aux limitations métaboliques en
réduisant la production de NADPH,H+, d'ATP et en réduisant (voire inhibant), de ce fait, la
régénération du RuBP au niveau du cycle de Calvin (Dejana Pankovic et Plesnicar, 1999;
Tezara et al., 1999; Medrano et al., 2002; Flexas et al., 2004b).
208
Discussion
Le rendement quantique maximum du photosystème II est mesuré par le
rapport Fv/Fm ap s u e p iode d’o s u it d’au
oi s
i utes. E l’a se e de st ess,
ce rapport proche, de 0,83, est relativement stable chez les plantes supérieures (Maxwell et
Johnson, 2000). Sa réduction traduit une inactivation ou une destruction des
photosystèmes II (Adams III, Zarter et al. 2006). Le quenching non-photochimique (NPQ) est
quant à lui un descripteur complexe. En théorie, une hausse importante du NPQ devrait être
couplée à une baisse du quenching photochimique (qP) qui exprime la fraction de la
fluorescence liée à la photochimie. Si une augmentation du NPQ peut traduire une
dissipatio d’
e gie d’e itatio sous la fo
di i utio de la taille de l’a te
e de haleu au iveau du PSII
E et/ou u e
e e te e du PSII à la suite de la phospho latio des
trimères LHCII qui migrent ensuite ve s les a te
es du PSI
T et/ou d’aut es processus de
photo-inhibition réversibles (qI), une diminution de ce paramètre est réputée traduire un
processus de photo-i hi itio
o
ve si le à l’o s u it asso i à l’alt atio st u tu ale
du PSII (Niyogi et al., 1998; Maxwell et Johnson, 2000).
Une augmentation du NPQ est souvent interprétée comme une diminution de la
fluorescence des centres réactionnels des PSII en partie liée à l'activation du cycle des
xanthophylles qui a pour rôle de dissiper sous forme de chaleur l'énergie d’e itatio perçue
par les chlorophylles lorsque celle-ci n'est plus utilisée pour la photochimie (Peeva et Cornic,
2009). Ce type de quenching, qualifié de quenching énergétique (qE), est en effet réputé
majoritaire dans la réponse du NPQ car sa mise en place semble particulièrement rapide
(Müller et al., 2001). Ce quenching énergétique pourrait être augmenté par une
amplification du flux cyclique des électrons. Ce transfert cyclique des électrons, indépendant
du PSII, aurait pour rôle d'ajuster le ratio de production ATP/NADPH,H+ dans les
chloroplastes afin de répondre à la demande des réactions de régénération du RuBP au
niveau du cycle de Calvin (Kramer et Evans, 2011). Souvent présenté comme
particulièrement actif dans des conditions où la raréfaction du CO2 est associée à une
luminosité toujours importante (autrement dit lorsque le rapport NADPH,H +/NADP+ a
te da e à aug e te , e
a is e pou ait do
logi ue e t s’i te sifie au ou s du
stress hydrique.
209
Discussion
Effectivement, durant une période de déficit hydrique, une augmentation du transport
cyclique des électrons a été observée chez Hordeum vulgare (Golding et al., 2004) et chez
Citrullus latanus (+34 %) (Kohzuma et al., 2009). À l’i ve se, d’aut es e p ie es de st ess
hydrique menées sur des plants de Spinacea oleracea ont mis en évidence une chute de
oiti de la de sit du flu total d’ le t o s JT) pour des RWC de 40 %, sans pour autant
révéler une augmentation significative du transfert cyclique des électrons (Jia et al., 2008).
L’i po ta e du
ôle du t a sfe t
li ue des
le t o s da s les p o essus de
photo-protection a notamment été démontrée en réponse à un stress lumineux (Munekage
et al., 2008; Takahashi et al., 2009). Lo s u’elle est p se te, l’aug e tatio du transport
cyclique des électrons permettrait le maintien d’u gradient de protons trans-thylakoïdien
suffisant qui pourrait participer aux mécanismes de photo-protection en autorisant le cycle
des xanthophylles et donc en augmentant le quenching énergétique (qE) (Endo et al., 2006;
Kramer et Evans, 2011; Murchie et Niyogi, 2011).
Au quenching énergétique (qE) peut s'ajouter le quenching lié à la diminution de la
taille de l’a te
e du PSII
T
ui appa ait plus le te e t et ui se ait de
oi d e a pleu
(Walters et Horton, 1991). Cette diminution de la taille de l'antenne a pour conséquence une
diminution de l'émission de fluorescence du PSII liée à une capacité de capture des photons
moindre. À l'inverse, l'enrichissement de l'antenne associée au PSI en trimères de LHCII
augmente l'énergie photonique disponible au niveau de ce photosystème. Ceci a comme
conséquence une augmentation du flux acyclique des électrons qui pourrait participer à la
photo-protection des photosystèmes (Allen, 2003). À l'inverse de qE et de qT, le quenching
lié à l'installation de la photo-inhibition qI a été peu étudié. Ce paramètre serait caractérisé
par la mise en place de mécanismes : (i) de photo-protection et/ou de photo-inhibition
réversibles après une longue période de récupération à l'obscurité qui participent à
l'augmentation de NPQ lors d'un déficit hydrique modéré et (ii) de photo-inhibitions
irréversibles liées à l'altération du PSII et responsables de la chute de NPQ en réponse à un
déficit hydrique sévère (Müller et al., 2001). Une augmentation de la fluorescence minimale
(F0) accompagnée d'une baisse de la fluorescence maximale (Fm) de plantes adaptées à
l'obscurité traduit l'installation de mécanismes de photo-inhibition alors qu'une baisse de F0
est liée à la mise en place de mécanismes de photo-protection tels que ceux qui
caractérisent qE (Gilmore et al., 1996).
210
Discussion
La valeur de NPQ mesurée ne permet pas en l'état d'identifier la part respective de qE, qT et
de qI. Cependant, le qE a la particularité d'être rapidement réversible à l'obscurité alors que
le qT qui correspond au retour des LHCII au niveau du PSII prend plus de temps (de l'ordre de
quelques minutes). Durant un stress hydrique modéré les effets liés au qI peuvent être
récupérés suivant une échelle de temps plus longue, de l'ordre de l'heure, mais lorsque le
déficit hydrique s'intensifie qI reflète alors des mécanismes de photo-inhibition irréversibles.
Des mesures de fluorescence réalisées après des périodes de récupération à l'obscurité de
durées variables auraient permis de mettre en évidence la part respective de qE, qT et qI
dans les différentes valeurs de NPQ (Stepien et Johnson, 2009). Certains auteurs ont même
proposé des calculs différents de certains paramètres obtenus par fluorescence (comme le
P,
PSII et NPQ) afin de déterminer 2 nouveaux paramètres liés au NPQ : le rendement
ua ti ue de dissipatio de l'
quantique de la dissipatio d'
e gie pa
gulatio s a tives des PSII
e gie du PSII o
gul
NO)
NPQ)
et le rendement
(Kramer et al., 2004; Sperdouli
et Moustakas, 2012).
Le rendement quantique maximal (Fv/Fm) du PSII des écotypes Col-0 et Shahdara
(Figure 62.A) reste à peu près stable (entre 0,82 et 0,8) pendant les 9 premiers jours de
stress hydrique pour décliner ensuite modestement mais significativement entre J+9 et J+12
(-2,02 % pour Col-0 et -3,42 % pour Shahdara à J+12). Les photosystèmes II de ces deux
ot pes o t do
peu souffe t de l’ pisode de s he esse. N a
oi s, o pte te u de la
stabilité de ce paramètre, les faibles diminutions enregistrées à J+12 traduisent
vraisemblablement
une
elle
i a tivatio
et/ou
d’u
d
ut
d’alt atio
des
photosystèmes II. En général, en réponse à un stress long de type stress hydrique, une chute
importante du Fv/Fm est réputée non récupérable car classiquement associée à une
dégradation structurale des photosystèmes II (Oquist et al., 1992; Aro et al., 1993; Giardi
et al., 1996; Adams III et al., 2006). Ce début d’i a tivatio li à l'alt atio ou non des PSII,
constaté chez Col- et Shahda a à J+
, ’est toutefois pas e o e asso i à u e di i utio
significative du quenching non-photochimique (NPQ) même si une tendance apparaît
notamment chez Shahdara.
211
Discussion
Chez Col-0, une augmentation significative du NPQ est détectée à J+9 (Figure 65.B). Elle
pou ait s’e pli ue pa u
ale tisse e t du t a sfe t des
le t o s Figure 60.B et
Figure 62.C) qui est effectivement observable mais non significatif : diminution légère de JT
et de Jmax. Ce ralentissement induirait une activation du cycle des xanthophylles permettant
de régénérer, à partir de la violaxanthine et de la zéaxanthine, la xanthophylle considérée
comme la plus active en photo-protection afin de réduire les possibilités de formation de
ROS (Foyer et al., 1990; Lawlor et Cornic, 2002). Les xanthophylles ne sont pas les seuls
quencheurs énergétiques possibles : des mutants dépourvus de xanthophylles peuvent
présenter un quenching énergétique. Chez ces mutants, des études spectroscopiques ont
permis de mettre en évidence des microagrégats de chlorophylle a, connus pour être de
puissants quencheurs, dans certaines régions de l'antenne (Horton et al., 1996). Cette
hausse significative de NPQ constatée chez Col-0 à J+9 persiste mais de manière moins
intense à J+12 : la tendance est donc bien à la diminution du NPQ. Chez Shahdara, une
te da e o sig ifi ative à la hausse du NPQ est e egist e à J+ et J+ alo s u’u e
légère baisse non significative du NPQ est observée à J+12. Toutes ces données convergent
o t e t u’à J+
et
les p e i es alt atio s du PSII, à la li ite du d te ta le, se
apparaître dans les feuilles stressées de ces deux écotypes. Chez Mt- u d
le t
ut d’alt atio
similaire des PSII a été enregistré 3 jours plus tôt à J+9 (-2,01 % de Fv/Fm) (Figure 62.A). Ce
sultat ’est pas su p e a t da s la
esu e où les p i ipau effets du d fi it h d i ue o t
toujours été détectés plus précocement chez cet écotype. Entre J+9 et J+12, le Fv/Fm de Mt-0
chute brutalement de 48,13 %. Cette importante altération des photosystèmes II (mesurée à
J+
a
s’e pli ue pa u
ta olis e pa ti ulie
ui pla e et
ot pe e
situatio
de
ue d’eau plus p cocement et plus longuement que les 2 autres écotypes. Elle est
logiquement confortée par un effondrement de la valeur de NPQ. Cette chute observée lors
du dernier jour de stress est donc à mettre en relation avec une forte diminution des
processus de dissipation de l'énergie sous forme de chaleur (chute ou absence de qE). Il n'y a
logiquement presque plus d'énergie excitonique à dissiper au niveau des antennes
collectrices car les photosystèmes II sont très majoritairement dégradés. Cette photoinhibition poussée à son paroxysme pourrait permettre de limiter le stress oxydatif en
limitant la formation de nouvelles espèces réactives de l'oxygène qui pourraient être
responsables de dégâts cellulaires encore plus conséquents (Adams III et al., 2006).
212
Discussion
À ce stade (Fv/Fm = 0,41, -48,13 % la valeu de la de sit de flu total d’ le t o s JT)
(Figure 62.C), quasi- ulle, i di ue u’il ’y a presque plus (voire plus du tout) de transferts
d’ le t o s i iti s à pa ti du PSII. La p odu tio
oupl e de pouvoi
du teu et d’ATP est
donc fortement ou totalement inhibée. Même si elle était en capacité de le faire, la Rubisco
de Mt-0 ne peut donc vraisemblablement plus assurer les réactions de carboxylation et/ou
d'o g
atio
du RuBP. L’ tude de la phase so
e a
o t
ue le p o essus de
carboxylation était déjà inhibé depuis quelques jours. À J+12, il semble donc que Mt-0 ne
soit plus en capa it d’assu e la photo espi atio . Il ’a donc pas davantage la possibilité de
fournir le pouvoir réducteur nécessaire aux processus de détoxication des ROS (Apel et Hirt,
2004). Ce manque de systèmes antioxydants fonctionnels va alors permettre une
accélération de la progression des dommages affectant les thylacoïdes. En résumé, cet
effo d e e t de NPQ t aduit do
o fi
u e aug e tatio du I o
ve si le à l’o s u it et
e l’e iste e de p o essus de photo-i hi itio asso i s à l’alt atio st u tu ale du
PSII.
Au u des t ois
ot pes tudi s ’a lai e e t
o t , pe da t le stress hydrique,
dans un premier temps une augmentation du NPQ (pour un déficit hydrique modéré) suivi,
da s u deu i
e te ps, d’u e di i utio de NPQ pou u d fi it h d i ue s v e . Suite
à un stress hydrique, ce type de réponse biphasique a pourtant déjà été observée chez
Arabidopsis thaliana pour des RWC voisins de 75 % (hausse du NPQ) et inférieurs à 60 %
(baisse du NPQ), à l’aide de techniques (imagerie par fluorescence mesurée sur plante
entière ou sur feuille) très différentes de celles utilisées dans ce travail (Woo et al., 2008;
Sperdouli et Moustakas, 2012). Woo et al. (2008) qui proposent néanmoins une expérience
de st ess h d i ue p o he de elle p se t e i i,
o t e t ue l’a plitude de va iatio du
NPQ, la date à laquelle apparaît son augmentation et le temps qui sépare cette
augmentation de la chute varient en fonction des écotypes (Col-0, Landsberg et C24). Ils
notent que le temps de séparation entre la hausse et la chute du NPQ est généralement de 3
jours pour Col-0 et moins de 3 jours pour les deux autres écotypes (Landsberg et C24). Un
suivi quotidien (et non tous les 3 jours) de la fluorescence aurait peut-être permis de mettre
en évidence cette réponse biphasique au moins chez Mt-0. Pour Col-0 et Shahdara il aurait
fallu coupler ce pas journalier de mesure avec une poursuite du stress qui aurait peut-être
pe
is d’i dui e u e hute sig ifi ative et i po ta te de NPQ.
213
Discussion
Toutefois, l’a u ulatio de
esu es de fluorescence réalisées quotidiennement, sur les
mêmes feuilles issues de plants cultivées sous de faibles PPFD, et nécessitant des flashs de
lumière saturante accompagnés de forts éclairements risquerait, à terme, d’e do
age les
photosystèmes et de participer à leur dégradation. Woo et al. (2008) enregistrent une
augmentation maximum de NPQ de 25 % chez Col-0 qui est un peu plus élevée que celle que
ous
esu o s +
% sa ha t ue la p iodi it de os
d’o se ve le pi
el de e pa a
esu es ’a peut-être pas permis
t e. Sperdouli et Moustakas (2012) qui publient des
valeurs de NPQ témoins pour Col-0 inférieures de moitié aux nôtres et à celles mesurées par
, appo te t u e aug e tatio
Woo et al.
a i u
d’e vi o
,
%. À notre
connaissance, ces travaux sont les seuls qui font état de mesures de NPQ chez Arabidopsis
thaliana en réponse à un stress hydrique. Ils confirment que les augmentations de NPQ ne
sont, pour ce type de stress et pour cette espèce, pas spectaculaires et dans tous les cas,
oi s spe ta ulai es u’ils e pou aie t l’ t e e
po se à u st ess lumineux (Niyogi et
al., 1998; Stepien et Johnson, 2009; Sperdouli et Moustakas, 2012). Une forte intensité de
l'éclairement durant le développement des plantes favo ise l’aug e tatio de la taille des
antennes des photosystèmes (Farineau et Morot-Gaudry, 2007) et a tendance à retarder les
processus de photo-inhibition (Powles et Critchley, 1980). Les plantes utilisées dans notre
expérimentation ont été cultivées sous des PPFD peu élevées (60 et 100 µmol.m-2.s-1) qui
pourraient expliquer que les valeurs de fluorescence mesurées sont toujours restées
relativement faibles tous écotypes et traitements confondus. Pour espérer détecter des
différentiels de NPQ plus importants en réponse au stress hydrique, il conviendrait peut-être
de cultiver les plantes sous des PPFD plus élevées. U e alte ative pou ait t e d’effe tue
les mesures sous une PPFD supérieure à celle utilisée (800 µmol.m-2.s-1). Cette PPFD
is ue ait
a
d’i dui e des ph
oi s, o pte te u de l’ lai e e t au uel les pla tes o t t a li at es,
o
es de photo-inhibition.
214
Discussion
Chez Col-0 et Shahdara, en réponse au stress hydrique, des baisses significatives du
rendement quantique du photosystème II (ΦPS2, Figure 62.B), de la densité de flux total
d’ le t o s (JT, Figure 62.C) et du quenching photochimique (qP, Figure 64.A) sont détectées
e
e te ps ue l’i stallatio du p o essus de photo-inhibition traduit par la chute du
Fv/Fm (J+12). Chez Mt-0, ces 3 paramètres commencent à décliner faiblement mais
significativement 6 jours après le dernier arrosage (J+6) au moment ou apparaît une baisse
sig ifi ative d’AN, soit 3 jours avant la chute du Fv/Fm (enregistrée à J+9). Ces données (et
leu
o fi
i
ti ue d’appa itio
o te ues à l’aide des
es pa les valeu s de de sit
de flu
esu es de fluo es e e foliai e so t
a i al d’ le t o s Jmax, Figure 60.B)
al ul es à pa ti de l’ajuste e t des ou es AN/Ci effe tu es su d’aut es pla tes u jou
après les mesures de fluorescence : les Jmax de Col-0 et de Shahdara sont réduits
significativement seulement à J+13 (-88 % pour Col-0 et -67 % pour Shahdara) alors que la
première diminution significative de la Jmax de Mt-0 (-37 %) est détectée à J+7. La diminution
de l’e se
le de es pa a
t es, ui peuve t
sulte de p o essus de photo-inhibtion
d’o igines diverses peut, suivant le cas, être une cause ou une conséquence de la diminution
du Fv/Fm. Chez Mt-0 à J+ , le flu d’ le t o s issu du PSII est ralenti : les valeurs de qP, JT
(obtenues par les mesures de fluorescence) et Jmax o te ues pa des
esu es d’ ha ges
gazeux) baissent significativement. La diminution du flux total d'électrons est corrélée à la
p e i e aisse d’AN et de Vcmax. Ce ale tisse e t ’est toutefois a o pag
aug e tatio de NPQ i d’u e aisse de Fv/Fm. Da s e as p
inactivation ou une dégradation des photos st
is, e ’est do
es, telle u’elle est
i d’u e
pas u e
esu e pa le Fv/Fm,
qui peut expliquer ce ralentissement même si à des dates ultérieures un début de
dégradation des photosystèmes accélérera le phénomène. En fin de stress hydrique, les
chutes de qP, JT et Jmax s’e pli ue aie t esse tielle e t pa la hute du Fv/Fm.
Se si les à l’ hauffe e t
e
a ai e et au ROS, les hlo oph lles so t des
marqueurs souvent précoces de sénescence naturelle ou accélérée par le stress (Heckathorn
et al., 1997; Jung, 2004; Munne-Bosch et Penuelas, 2004). Une chute de leur teneur est donc
souvent associée à une variation durable de NPQ (hausse et baisse) et à une chute du F v/Fm.
Une baisse des teneurs en chlorophylles a été observée visuellement sur certaines feuilles de
Mt-0 et de Col-0 à J+9 et J+12 et sur certaines feuilles de Shahdara à J+12 (Figure 50).
215
Discussion
Ces o se vatio s ’o t toutefois pas pu t e ua tifi es pou des p o l
es te h i ues
précédemment évoquées (feuilles aux cellules trop plasmolysées pour pouvoir être
esu es sa s iais à l’aide du hlo oph lle-mètre, Figure 55). À J+12, le jaunissement était
assez hétérogène chez Shahdara : seules les feuilles les plus basses autrement dit les plus
âgées avaient considérablement jauni par comparaison avec les feuilles témoins. Ce
jaunissement traduit une dégradation des chlorophylles et vraisemblablement une
accélération de la sénescence. Si le même phénomène a été repéré chez Mt-0 et Col-0 à J+9
et à J+12, il était moins facilement identifiable car parfois en partie masqué par un
rougissement foliaire. Ce rougissement localisé principalement autour et le long des
nervures (principale et secondaires) observable sur la face supérieure du limbe a tendance à
olo e l’i t gralité de la face inférieure du limbe. Chez Mt-0, ce rougissement, déjà bien
installé à J+9, a particulièrement augmenté entre J+9 et J+12. Chez Col-0, il est apparu
franchement entre J+9 et J+12. Il est toujours resté absent de Shahdara qui, à J+12, est
moins atteint par le stress hydrique : le RWC des rosettes de Shahdara est de 60 % alors que
celui des rosettes de Col-0 et de Mt- est d’e vi o
%. Cohérent avec nos autres
des ipteu s de l’ tat de la phase lai e, e ougisse e t e p i e e tai e e t une
a u ulatio d’a tho a es ui pou ait t e u e
a tio de d fe se d le h e par les
d so d es o datifs li s à l’i stallatio du st ess (Shirley, 1996; Harborne et Williams, 2000).
Les chutes importantes de Fv/Fm et de NPQ sont observées très tardivement sur des
osettes ui appa aisse t pa ti uli e e t affe t es pa le
soutie
e t l’id e selo
la uelle le e de e t
a
ua ti ue
ue d’eau. Ces o se vatio s
a i u
du PSII
o
e
d’ailleu s l'i t g alit de la ha e de t a spo teu s d’ le t o s seraient particulièrement
résistants aux déficits hydriques même sévères et ne seraient atteints que très tardivement
durant les phases ultimes du stress (Cornic, 2000; Cornic et Fresneau, 2002; Cornic et
Massacci, 2004). Logiquement, les Fv/Fm des nouvelles feuilles échantillonnées à J+16 qui se
sont développées en partie pendant la phase de stress et en partie après réhydratation,
pendant la période de 4 jours de récupération, possèdent des photosystèmes II non
dégradés caractérisés par des valeurs de Fv/Fm identiques à celles déterminées chez les
feuilles témoins.
216
Discussion
Origines possi les de l’alt atio des photosystèmes
Il est généralement admis que l'incapacité ou la difficulté des photosystèmes à se
décharger de leur « énergie électronique », consécutivement à un engorgement des chaînes
de t a spo teu s d’ le t o s, e ge d e u e aug e tatio de la p odu tio de ROS ui
conduit à un stress oxydatif à l'origine des dégâts sur les photosystèmes et par conséquent
d’une chute du Fv/Fm (Halliwell, 1991; Mittler, 2002; Apel et Hirt, 2004). L’effet des ROS su
les photosystèmes est avéré. À tit e d’e e ple, il a t d
o t
ue la structure de la
protéine D1 des PSII et les produits du gène psaB qui forment une des deux grandes sousunités des centres réactionnels du PSI sont clairement altérés par les ROS (Miyao et al.,
1995; Sonoike, 1996). Les altérations oxydatives des photosystèmes conduisent logiquement
à un arrêt de la production chloroplastique en NADPH,H+ et en ATP qui pourrait donc inhiber
à terme si les p o essus ’o t pas t i hi
l’assi ilatio
RuBP
s déjà pa d’aut es li itatio s
ta oli ues
ette de CO2 et la photorespiration en empêchant la régénération du substrat
essai e au a tivit s de a o latio et d’o g
atio de la Rubisco (Vassey et
Sharkey, 1989; Gimenez et al., 1992; Gunasekera et Berkowitz, 1993; Tezara et al., 1999;
Flexas, 2000). Les enzymes du cycle de Calvin ne sont pas non plus épargnées par les ROS,
notamment celles qui contiennent des groupements sulfhydrile (-SH) connus pour être
facilement oxydables par H2O2 et OH• (Shacter, 2000). Effectivement, ces enzymes voient
alors leur activité inhibée par les ROS qui ont la capacité de réoxyder les groupements -SH
initialement réduits par la thiorédoxine. C’est ai si que certaines enzymes comme
la fructose
1,6-bisphosphatase,
la
sédoheptulose
1,7-bisphosphatase,
la
3-phosphoglycéraldéhyde déshydrogénase et la ribulose 5P-kinase, activées par la
thiorédoxine, sont particulièrement sensibles au ROS (Schürmann et Jacquot, 2000). Par
ailleu s de o
eu t avau d
o t e t ue la st u tu e, la te eu et l’a tivit de la
Rubisco sont également altérées par les ROS (Ishida et al., 1998; Kanoun et al., 2002; Leitao
et al., 2008). Un échauffement des thylacoïdes suite à une augmentation importante du
quenching énergétique pourrait également participer à la dégradation des photosystèmes en
g
al et des pig e ts olle teu s d’
e gie photo i ue e pa ti ulie (Alkhatib et Paulsen,
1989; Havaux, 1993).
217
Discussion
La forte dégradation des photosystèmes II des feuilles de Mt-0 constatée après
12 jours de stress hydrique (chute du Fv/Fm de 48 %) et amorcée à J+9 pourrait donc
logi ue e t s’e pli ue pa les effets d’u e p odu tio a
ue de ROS. L’a
t p og essif du
t a sfe t d’ le t o s e t e J+ et J+12, exprimé par des diminutions de JT, Jmax et qP, induit
l’i stallatio
p og essive
d’u e
fo te
du tio
des
photos th ti ues favo a le d’u e pa t à u e dissipatio
photochimique à l’o igi e d’u
hauffe e t
e
t a spo teu s
d’
d’ le t o s
e gie sous fo
e non-
a ai e, et d’aut e pa t à u e p odu tio
accrue de ROS (notamment si les produits de la réaction de Mehler ne sont pas éradiqués
par les systèmes antioxydants chloroplastiques). Ces deux phénomènes conduisent à un
stress oxydatif qui pourrait êt e à l’o igi e de l’alt atio st u tu ale des photos st
es et
de divers constituants de la membrane photosynthétique.
À la production de ROS, pourrait peut- t e s’ajoute l’effet de l’aug e tatio de la
concentration en saccharose foliaire. Chez Mt-0, les teneurs de tous les sucres solubles
dosés (raffinose, fructose, glucose et saccharose) augmentent significativement à J+3
(Figure 71). Pendant la période de stress hydrique, la teneur en saccharose des feuilles
stressées de Mt(Mt-
a u ule
o t de faço spe ta ulai e et o
eau oup plus d’a ido
l e ave la o so
da s es feuilles sai es
atio d’a ido
ue les deu aut es
écotypes, Figure 67) : environ 5 fois plus de saccharose à J+9 et à J+12. Il a été montré que
des traitements de glucose et de saccharose appliqués à des plantes normalement irriguées
ont pour effet d'inhiber l'expression de certains gènes comme psbA ou d’aut es
ui
participent à l'accumulation de la protéine D1 (Pego et al., 2000; Sulmon et al., 2004).
L'accumulation de saccharose observée en réponse au déficit hydrique pourrait donc inhiber
l'expression de gènes participant à la stabilité, à la protection et à la structure des
photosystèmes. En effet, les protéines appartenant à la famille des PsbS sont connues pour
participer en synergie avec la zéaxanthine au quenching non-photochimique (composante qE
du NPQ) permettant, en condition de stress hydrique, la protection des photosystèmes en
désactivant les molécules de chlorophylles excitées par dissipation de leur énergie sous
forme de chaleur (Havaux et Niyogi, 1999; Müller et al., 2001; Nilkens et al., 2010). La forte
chute de Fv/Fm, constatée chez les feuilles de Mt-0 entre J+9 et J+12, pourrait donc résulter
d’u e d g adatio o dative des PSII a
l
e pa u e i hi itio de l’e p essio de e tai s
gènes impliqués dans sa synthèse.
218
Discussion
En participant à leur manière à la diminution du rapport biosynthèse/dégradation, les sucres
pourraient contribuer à cette phase ultime de photo-protection visant à lutter contre la
production de ROS et plus généralement à minimiser les conséquences du stress oxydatif sur
les cellules (Couée et al., 2006).
Phase claire ou phase sombre ? Qui li ite la photos th se d’A a idopsis thaliana en
réponse à un stress hydrique ?
Le ale tisse e t voi e l’a
d’assi ilatio
t de la carboxylation du RuBP, traduit par les données
ette et de Vcmax, ’est pas o ligatoi e e t asso i à u a
d’ le t o s o
e le
t du t a sfe t
o t e t les valeu s de JT, de Jmax et de qP. Il favoriserait néanmoins le
maintien des photosystèmes dans un état fortement réduit comme le montrent : (i)
di e te e t l’aug e tatio de la p opo tio des e t es
a tio
els fe
s t aduite pa
une baisse du quenching photochimique (qP et ii i di e te e t, l’ volutio du diff e tiel
entre la p odu tio
l’assi ilatio
pote tielle d’ le t o s et
eu
effe tive e t
o so
s pa
ette JT/4-AN).
Une chute de qP décrit finalement une diminution du nombre de centres
réactionnels photochimiques II ouverts et par conséquent une proportion importante de
e t es e go g s
ai te us à l’ tat
duit a i apa les de
plastoquinones A. La relation entre qP et AN (Figure 65)
de l’AN ’est pas o ligatoi e e t o
de leu s le t o s au
o t e lai e e t ue l’i hi itio
l e à u e hute du qP. En effet, en réponse à un
déficit hydrique modéré, les 3 écotypes sont susceptibles de conserver des valeurs de qP
non nulles, légèrement inférieures aux valeurs témoins, associées à des assimilations nettes
totalement inhibées. Mt-
ui a su i plus lo gue e t les o t ai tes li es au
a
ue d’eau
offre une situation supplémentaire inédite de stress plus s v e où l’i hi itio
l’assi ilatio
de
ette est oupl e ave u e hute de P et u e hute i po ta te de F v/Fm qui
témoignent donc de la destruction des photosystèmes II. Les situations caractérisées par une
hute i po ta te d’AN associée à une faible diminution de qP témoignent quant à elles d’u
flu d’ le t o s p es ue o
al o duisa t à u e s th se de NADPH,H+ et d’ATP utilis s
vraisemblablement par des puits alternatifs.
219
Discussion
Entre J+6 et J+9 pour Mt-0 et entre J+9 et J+12 pour Col-0 et Shahdara, le ralentissement
puis l’a
t de l’assi ilatio de CO2 ’i duise t u’u e l g e sur réduction de la chaîne
photosynthétique qui laisse à penser
ue le pouvoi
du teu et l’ATP so t utilis s à
d’autres fonctions et/ou que les électrons sont transférés à une molécule puits autre que le
NADP+. Si ette situatio d’a se e d’assi ilatio
ette pe du e, alo s u e h pe -réduction
de la chaîne de transporteurs va apparaître et va mener au stress oxydatif.
Ces o se vatio s so t o fi
es pa l’ tude de l’i di e « JT/4-AN » qui reflète le
différentiel entre l'assimilation théorique maximale (la photosynthèse nette théoriquement
possible calculée à partir du flux total d'électrons mesurés, JT) et l’assi ilatio
ette
effectivement mesurée (AN) (Streb et al., 2005; Priault et al., 2006; Massacci et al., 2008).
Une augmentation significative du JT/4-AN est observée entre J+6 et J+9 chez Mt-0 et entre
J+9 et J+12 chez Col-0 (Figure 63). Chez Shahdara une légère hausse non significative a été
notée entre J+9 à J+12. Ces hausses révèlent u solde positif d’ le t o s o utilis s à
réduire le CO2 et donc théoriquement disponibles, en dehors de toute compétition avec l'AN
(qui à cette date n'en consomme plus), pour produire du pouvoir réducteur utilisable pour
d’aut es p o essus
ta oli ues o
e la photo espi atio , la
du tio des it ates…
(Flexas, J. et al., 1999; Lawlor et Cornic, 2002). La chute significative du JT/4-AN enregistrée à
J+12 chez Mt-0 témoigne de l’arrêt du transfert d'électrons consécutif à la dégradation des
photosystèmes II (chute importante du Fv/Fm).
L’alt atio
o dative ou pa
hauffe e t des o stitua ts des thylacoïdes en
général et des photosystèmes en particulier pourrait do
de fixation du CO2. Da s les faits, os do
es
avoi u effet
gatif su l’a tivit
o t e t u’il est peu p o a le que ces
dysfonctionnements de la phase claire soient responsables du ralentissement de la phase
so
e voi e
e o t i ue t à l’e t ete i . E effet, les pa a
t es d
iva t la viva it
et l’i t g it de la phase photo hi i ue o t te da e à hute t s tardivement à un
moment où la fixation du CO2 (AN) est déjà très faible ou inexistante. La participation des
processus de photo-i hi itio
pa
ai tie des PS à l’ tat
duit ou pa d g adatio des PS
aux limitations métaboliques pourraient donc intervenir en toute fin de stress.
220
Discussion
En réponse au stress hydrique, après les limitations diffusives, ce serait donc bien des
limitations métaboliques installées au niveau de la phase sombre qui pénaliseraient
prioritairement et précocement l’assi ilatio du CO2.
I po ta e des puits alte atifs d’ le t o s da s la photo-protection
La diminution du rapport Fv/Fm reflète l'installation durable de phénomènes de
photo-inhibition vraisemblablement liés à une altération des photosystèmes qui auraient
subi des photo-dommages induits par le ralentissement puis l'arrêt du transfert des
électrons (Adams III et al., 2006). L’appa itio de es photo-dommages témoigne alors du
dépassement des mécanismes classiques de photo-p ote tio
ui ’a ive t plus à e digue
les conséquences de la saturation des chaînes de transporteurs. Théoriquement, ce
ralentissement ou cet arrêt du transfert photosynthétique des électrons serait dû
conjointement à un ralentissement de la phase sombre de la photosynthèse (autrement dit
de la fixation de CO2 ui se t aduit pa u e hute de l’AN qui, suivant le type de limitation,
peut être accompagnée ou o d’u e di i utio de la Vcmax) qui ne parviendrait plus à
g
e suffisa
e t d’a epteu s d’ le t o s NADP+) et à une saturation, ou une
i apa it , des puits alte atifs d’ le t o s à o so
e la totalit du su plus le t o i ue
non utilisé pour la fixation du CO2. Pe da t toute la p e i e phase du st ess, ava t u’u e
chute importante du Fv/Fm e soit o stat e, ous avo s
d’ le t o s photos th ti ues sup ieu au
o t
u’il
a avait ie u flu
esoi s de l’assi ilatio du CO 2. Durant cette
période de stress encore modérée, les électrons ont peut-être servi à alimenter des puits
ualifi s d’alte atifs.
Pa puits alte atif d’ le t o s, o
a tio
ui pe
et de o so
ainsi une hyper- du tio
e u su
de la
e te d i i tout p o essus ph siologi ue ou
o t d’ le t o s photos th ti ues et d’ vite
ha e de t a spo teu s d’ le t o s favo a le à la
production de ROS qui, si elles dépassent les capacités de détoxication cellulaire, sont
sus epti les d’i dui e des alt atio s st u tu ales des thylacoïdes et des chaînes de
t a spo teu s d’ le t o s
u’ils
o tie
e t. Ces puits alternatifs de consommation
d'électrons permettraient d'éviter un ralentissement ou un arrêt du transfert des électrons
dans la chaîne photosynthétique en conservant des centres réactionnels ouverts qui
éviteraient l'installation de la photo-inhibition (Osmond et al., 1997).
221
Discussion
La photorespiration et les réactions de Mehler constituent les puits alte atifs d’électrons les
plus souvent cités en réponse au stress hydrique (Lawlor et Cornic, 2002; Cruz de Carvalho,
2008).
L’o aloa tate pou ait aussi se vi
de puits. E
effet, lorsque le rapport
NADPH,H+/NADP+ devient important dans le chloroplaste du fait d'un ralentissement
conjoint de l'assimilation nette et de la photorespiration, la malate déshydrogénase alors
activée peut utiliser le surplus de NADPH,H+ pou
dui e l’o aloa tate e
alate ui
pourra ensuite quitter le chloroplaste via un transporteur pour être ré-oxydé dans le cytosol,
les peroxysomes et les mitochondries (Siedow et Umbach, 1995; Lawlor et Cornic, 2002;
Raghavendra et Padmasree, 2003; Scheibe et al., 2005). En conditions normales, la réduction
des nitrates utilise entre 5 et 20 % du flu d’ le t o s issu de la ha e photos th ti ue
sous forme de NADPH,H+ (utilisé par la nitrate réductase, NR) et de ferrédoxine réduite
[utilisée par la nitrite réductase, (NiR), la glutamine synthase (GS), et la glutamate synthase,
(GOGAT)] (Xu et al., 2012). En réponse à un stress hydrique, la réduction des nitrates ne
constituerait toutefois pas u puits alte atif d’ le t o s dans la mesure où l'activité de la
nitrate réductase décline au fur et à mesure que le déficit hydrique s'accentue (Larsson et
al., 1989; Foyer et al., 1998; Fresneau et al., 2007; Hummel et al., 2010).
Il est parfois avancé que le ralentissement du cycle de Calvin imputable à la baisse de
fixation du CO2 (traduite pa la hute d’AN) puisse être compensé en partie, au moins en
d
ut de st ess h d i ue, pa u e aug e tatio de l’a tivit photo espi atoi e (Osmond et
al., 1997; Noctor et al., 2002). En condition de déficit hydrique, la fermeture des stomates
entraîne une diminution de l'approvisionnement en CO2 qui favorise alors l’o g
atio du
RuBP à pa ti de l’O2 disponible dans les cellules du mésophylle. Cette réaction catalysée par
la Rubisco produit in fine une molécule de 2-phosphoglycolate et une molécule de
3-phosphoglycérate qui pourra intégrer le cycle de Calvin. Source importante de glycine et
de sérine, le cycle photorespiratoire permet par ailleurs de réinvestir les ¾ du carbone de
deux glycolates sans grande utilité dans le cycle de Calvin. Il pourrait donc permettre à ce
dernier de fonctionner un peu, indépendamment de la fixation du CO2.
222
Discussion
Issu d’u e i pe fe tio fo tio
de eu e pas
p o i it
oi s u’e
des
elle de la Ru is o ou poss da t u e
o so
elle utilit , il ’e
a t de l’O2 (donc en faisant baisser sa concentration à
ha es de t a spo teu s , de l’ATP et du pouvoi
du teu , le
le
photorespiratoire participe à la prévention de la formation des ROS et plus généralement à
la p ve tio de l’alt atio des th la oïdes. La photorespiration consomme du pouvoir
du teu
p i ipale e t pa
le
iais du
le de Calvi
u’elle app ovisio
e e
3-phosphoglycérate et aussi parce que le glyoxylate produit dans le peroxysome peut faire
retour dans le chloroplaste où il sera réduit par une glyoxylate réductase à NADPH,H + pour
former du glycolate (Wingler et al., 2000). La o so
atio d’ATP a lieu elle aussi au iveau
du cycle de Calvin et au moment où le glycérate en provenance du peroxysome est
phosphorylé dans le chloroplaste en 3-phosphoglycérate. Cette consommation de pouvoir
réducteur pourrait ainsi éviter une hyper-réduction des t a spo teu s d’ le t o s tout
o
e la o so
atio d’ATP pou ait pe
ett e d’ vite u e surcharge du gradient de
protons : deux phénomènes pouvant engendrer une altération des thylacoïdes (Ogren,
1984). La photorespiration pou ait do
elative e t o sta t
alg
pe
ett e de
u e hute de l’assi ilatio
o se ve u
flu
d’ le t o s
ette (Biehler et Fock, 1996;
Osmond et al., 1997; Wingler et al., 2000; Cornic et Fresneau, 2002; Lawlor et Cornic, 2002).
Les activités des enzymes impliquées dans la photorespiration ne semblent néanmoins pas
toutes répondre de façon identique au stress hydrique. En début de stress hydrique lorsque
l'assimilation nette est limitée notamment par la fermeture des stomates et par conséquent
par la disponibilité en CO2, les activités de certaines enzymes du cycle photorespiratoire
comme la sérine hydroxyméthyltransférase (SHMT), la glycine décarboxylase (GDC) et la
glutamine synthétase (GS) ne sont pas modifiées (Wingler et al., 2000) alors que les activités
d’aut es e z
es, o
e l’h d o p uvate
du tase (Wingler et al., 2000) et la glycolate
oxydase (Mittler et Zilinskas, 1994; Rizhsky et al., 2004), augmentent. Une augmentation du
rapport photorespiration/assimilation nette accompagne souvent la chute du contenu relatif
en eau des feuilles et la baisse de la concentration interne en CO2 (Lawlor, 1976; Gerbaud et
André, 1980; Wingler et al., 2000).
223
Discussion
Une augmentation en valeur absolue de la photorespiration n'est pas toujours observée
(Lawlor et Fock, 1977; Biehler et Fock, 1996) même si, dans certains cas, une intensification
du
le est i di e te e t o se v e pa u su
o t d’a u ulatio de gl i e (Wingler et
al., 1999). Toujours en réponse à la contrainte hydrique, une augmentation de la
consommation d’O2 a été observée chez Lycopersicon esculentum (Haupt-Herting et Fock,
2000) et Vitis vinifera (Flexas et al., 1999) sa s u’il soit pou auta t possi le d’ide tifie la
part de cette surconsommation, qui relève de la photorespiration, de celle qui reviendrait à
une augmentation du nombre de réactions de Mehler (Radmer et Kok, 1976).
E
su
, l’e se
le de
es do
es d
o te
ue si l’a tivit
du
le
photo espi atoi e ’est pas toujou s i te sifi e pa le st ess, elle doit t e elativement
i se si le ou
oi s se si le ue l’AN aux déficits hydriques modérés. En revanche, lorsque
le stress hydrique devient plus sévère, l'assimilation de CO2 et la photorespiration peuvent
être toutes deux progressivement inhibées par des limitations métaboliques liées à un
d faut de
g
atio du RuBP issu de l’i hi itio de e tai es
a tio s e z
ati ues du
cycle de Calvin, la Rubisco, la sedoheptulose-1,7-bisphophatase (SBPase) et la fructose-1,6bisphosphatase (FBPase) (Boag et Portis, 1984; Sharkey et Seemann, 1989; SanchezRodriguez et al., 1999; Wingler et al., 2000; Seki et al., 2002).
L’id e selo la uelle e d
ut de st ess h d i ue la photo espi ation participerait à la
photo-protection en évitant une hyper-réduction de la chaîne de t a spo teu s d’ le t o s
’est pas u a i e e t pa tag e. Lo s u’ils i hi e t a tifi ielle e t la photo espi atio pa
de faibles concentrations en O2 durant un stress hydrique et à de fortes intensités
lumineuses, Brestic et al. (1995) ’o se ve t pas de dégradation accrue des PSII (le Fv/Fm
reste stable) et concluent que la photorespiration n'est pas indispensable aux processus de
photo-protection luttant contre l'installation de la photo-inhibition durant le stress hydrique.
Les valeurs de photorespiratio
ue ous avo s d te
i
es ’o t fi ale e t pas
été présentées. Ces valeurs ont été déterminées à partir des valeurs de respiration diurne
(Rd) et de certaines valeurs de fluorescence (Sharkey et al., 2007).
224
Discussion
Contrairement à la respiration nocturne qui est mesurée in vivo à l’o s u it , la respiration
mitochondriale diurne (Rd est d iv e de l’ajuste e t des ou es AN/Ci (Sharkey, Bernacchi
et al. 2007) selon le modèle de Farquhar (Farquhar et al., 1980; Caemmerer et Farquhar,
1981; Sharkey et al., 2007). Chez les feuilles témoins comme chez les feuilles stressées, de
manière surprenante et contre toute attente, les valeurs de Rd ainsi déterminées se sont
avérées très supérieures à celles de la respiration nocturne (Rn o te ues su d’aut es
feuilles à l’aide d’u
ha tillo
age plus i po ta t (Lawlor et Cornic, 2002; Flexas et al.,
2005; Bagard, 2008). Ces valeurs de respiration diurne sont par ailleurs cohérentes avec
celles fournies par la littérature. Les valeurs de photorespiration dérivées en partie des
valeurs de Rd étaient donc difficilement exploitables. À
ote
epe da t
u’u e hute
brutale et attendue de la photorespiration était observée chez Mt-0 à J+12. Le calcul de cet
effondrement respiratoire exprime alors surtout la chute brutale du Fv/Fm à cette même
date.
L'observation d'une augmentation de la consommation en O2 a o pag
e d’u e
diminution de la photorespiration (déterminée par l'évolution de la concentration en
glycolate) durant le stress hydrique, suggère chez Triticum aestivum une augmentation des
a tio s de Mehle
ui assu e t la
Fock, 1996). Si la fe
do i e
du tio
o o le t o i ue de l’O 2 en O2•- (Biehler et
duite o stitue le do
eu d’ le t o s id al, d’aut es
molécules réduites ont un potentiel redox suffisamment négatif pour pouvoir elles aussi
de u
le t o à la
ol ule de dio g
e. L’id e d’asso ie du a t u st ess h d i ue
une surconsommation d’O2 à une augmentation des réactions de Mehle a t d’aut es fois
évoquée (Smirnoff, 1993) notamment chez Helianthus annuus (Sgherri et al., 1996),
Lycopersicon esculentum (Haupt-Herting et Fock, 2000) et Vitis vinifera (Flexas et al., 1999).
Doit-on considérer les réactions de Mehler comme des réactions-puits ayant des fonctions
de photo-protection (en participant au désengorgement des chaînes de transporteurs
d’ le t o s ou o
e des s st
es p o-o da ts à l’o igi e de la p odu tio de ROS
impliquées dans la destruction des photosystèmes ?
225
Discussion
Si l’aug e tatio
des
a tio s de Mehle
est
oupl e ave
des aug e tatio s
séquentielles concomitantes et suffisantes des activités des superoxyde dismutases (SOD)
présentes dans le stroma, des catalases et du cycle de l'ascorbate-glutathion (aussi appelé
cycle Asada-Halliwell-Foyer) qui consomme lui-même du pouvoir réducteur (Noctor et Foyer,
1998), alors oui, les réactions de Melher peuvent êtres considérées comme des puits
alte atifs d’ le t o s. E
eva he si l’a tivit des s st
es e z
ati ues i pliqués dans la
d to i atio de l’O2•- et de l’H2O2 sont insuffisants, alors les réactions de Mehler doivent
être
classées
parmi
les
systèmes
pro-oxydants
défavorables
à
la
machinerie
photosynthétique.
Sans pour autant le démontrer complètement, plusieurs résultats suggèrent que la
a tio
de Mehle pou ait le as
h a t o stitue u
puits alte atif d’ le t o s
participant à un maintien tardif de leur transfert pendant le stress hydrique. En effet, en
po se à la s he esse, il a t
o t
ue l’a tivité totale des superoxyde dismutases
(SOD), métalloenzymes ui atal se t la dis utatio d’O2•- en O2 et H2O2 augmente chez
Arabidopsis thaliana (Jung, 2004), Coffea canephora (Pinheiro et al., 2004), Triticum
monococcum (Badiani et al., 1990), Phaseolus acutifolius (Turkan et al., 2005), Olea
europaea (Sofo et al., 2005), Pisum sativum (Mittler et Zilinskas, 1994) et Oryza sativa
(Sharma et Dubey, 2005). Des baisses d'activité de la SOD, observées chez des plants de
Phaseolus acutifolius soumis à un stress hydrique, ont même été expliquées par une baisse
de la production d’a io s adi alai es superoxydes issus des réactions de Mehler sachant
que cette diminution était constatée chez des plantes conservant une légère ouverture des
stomates accompagnée d'une faible assimilation nette (Turkan et al., 2005). Par ailleurs, des
plantes transgéniques sur-exprimant des gènes codant des SOD ont montré une tolérance
accrue aux stress oxydatifs (McKersie et al., 1996; Alscher et al., 2002; Wang et al., 2005).
L'H2O2 produit par la SOD est réduit en H2O par l'ascorbate peroxydase (APX) dont l'activité,
comme celle de la glutathion réductase (GR), augmente également durant une période de
sécheresse suggérant par là-même une stimulation de la régénération enzymatique du
pool d’as o ate et do
u e sti ulatio toute e ti e du
le de l'as o ate-glutathion
(Mittler et Zilinskas, 1994; Keles et Oncel, 2002; van Heerden et Kruger, 2002; Ratnayaka et
al., 2003; Jung, 2004; Pinheiro et al., 2004; Sharma et Dubey, 2005; Turkan et al., 2005).
226
Discussion
Une diminution des activités de ces deux enzymes a toutefois été observée pendant un
stress hydrique qualifié de sévère. Cette diminution pourrait refléter une réduction de la
production de NADPH,H+ et une diminution de substrats comme l'ascorbate et le glutathion
duit o s utive e t à l’appa itio de d gâts cellulaires importants associés aux phases
les plus avancées du stress (Iturbe-Ormaetxe et al., 1998).
2.4. Effet du déficit hydrique sur l’accumulation et le
transport des sucres
Le d fi it h d i ue i duit u e aug e tatio de l’a u ulatio de sa ha ose, forme
privilégiée de transport des sucres chez les plantes, dans les feuilles des 3 écotypes
d’Arabidopsis thaliana (Figure 71.A). En fin de période de stress hydrique, cette
augmentation est significative et spectaculaire notamment dans les feuilles matures de
Mt-0 : à J+9 et à J+12 cette teneur est plus de
gale e t e toute fi de st ess à J+
fois sup ieu e à elle des t
oi s. C’est
, u’il est possi le d’o se ve la plus i po ta te
augmentation de teneur en saccharose dans les feuilles stressées de Col-0 (1,88 fois
supérieure à celle des témoins) et de Shahdara (2,4 fois supérieure à celle des témoins). Ces
hausses de te eu s e
sa ha ose, toujou s a o pag
es d’u e hausse du appo t
saccharose/hexoses (Figure 72), sont parfaitement corrélées à une consommation
i po ta te de l’a ido
Figure 67). Avant ces augmentations spectaculaires, des élévations
des teneurs moyennes en sucres solubles (saccharose, glucose, fructose et raffinose) ont été
détectées à J+3 chez Mt- et à J+
hez Shahda a, ie de o pa a le ’a a t t o se v
chez Col-0. Ces sucres, qui pourraient agir comme osmoprotecteurs, ont très souvent été
o
l s à l’i stallatio du st ess hydrique (Chaves et Oliveira, 2004). Les hexoses pourraient
aussi participer aux voies de signalisation dépendantes des hexokinases, métabolisme
dépendante et saccharose spécifique (Xiao et al., 2000). Par ailleurs, une accumulation de
raffinose pourrait être impliquée dans des phénomènes de photo-protection des
membranes thylakoïdales (Santarius, 1973; Santarius et Milde, 1977). L’e p essio
transpo teu s d’he oses AtSTP et AtSTP
des
a t sig ifi ative e t i duite pa le d fi it
hydrique uniquement chez Col-0 (Figure 73).
227
Discussion
Cette i du tio
’a pas pu t e o
l e si ple e t ave u e uel o
d’a u ulatio de su es solu les de et
souve t o sid
s o
ot pe. Les pol ols, o
ue va iatio du p ofil
e le
a
itol, so t
e des os op ote teu s ui e s’a u ula t favo ise t la tolérance
au stress hydrique (Shen et al., 1997). Les e p essio s d’AtPLT
et AtPLT , les deu
principaux transporteurs de polyols exprimés dans les feuilles Arabidopsis thaliana
(Figure 48), sont significativement réprimées par le déficit hydrique chez les 3 écotypes. Ne
disposa t pas de
esu es d’a tivit s de es t a spo teu s, i de dosage des pol ols, il est
très difficile d’att i ue
ette
p essio à u e sta ilisatio /i
o ilisatio foliai e possi le
de ces osmolytes.
U e a u ulatio de sa ha ose da s les feuilles peut s’e pli ue pa u e aisse de
sa consommation dans les organes sources liée au ralentissement de l'expansion cellulaire
(Westgate et Peterson, 1993), une baisse de l'activité des invertases (Shinozaki et
Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Harb et al., 2010; Hummel et al., 2010), une consommation des
réserves en amidon (Rizhsky et al., 2004) et/ou une baisse de son transport à longue
distance parfois liée à un ralentissement de l'activité puits (Moore et al., 1999; Paul et Foyer,
2001).
Da s ot e as, la d g adatio de l’a ido
o t i ue t s e tai e e t au hausses
de teneurs en saccharose enregistrées. Cette hypothèse semble confirmée par la littérature.
Harb et al. (2010) montrent chez Col-0 que les expressions de 2 gènes codant une α et une β
amylase (deux enzymes qui participent à la dégradation de l'amidon) sont induites par le
d fi it h d i ue et s’a o pagnent d'une disparition des réserves en amidon dans les
feuilles. Rizhsky et al. (2004), quant à eux concluent que l'induction de ces mêmes gènes, en
réponse à un stress hydrique combiné à un stress thermique à 38°C, pourrait contribuer à
l'augmentation de 23 % de la teneur en saccharose. Cette accumulation pourrait même être
soute ue pa u
ale tisse e t de l’a tivit de e tai es i ve tases a ides o stat toujou s
chez Col- lo s d’u st ess h d i ue s v e (Hummel et al., 2010).
Un ralentissement du transport à longue distance pourrait aussi participer à
l'augmentation de la teneur en saccharose mesurée dans les feuilles des plantes stressées.
228
Discussion
Les principaux transporteurs de saccharose exprimés dans les feuilles matures des écotypes
Mt-0, Col-0 et Shahdara sont AtSUC1 et AtSUC2 (Figure 47). Après 9 jours de stress,
l'expression d’AtSUC1 est réprimée chez Mt-0, Col-0 et Shahdara (Figure 73). Cette
répression n'est pas surprenante dans la mesure où l'expression de ce gène est connue pour
te
gul e
gative e t pa
la p se e
o joi te d’u e fo te
o e t atio
e
saccharose et d'un facteur de transcription (ABI5) dépendant lui-même d'une augmentation
de la concentration en ABA (Hoth et al., 2010). Parce que son expression est fortement
régulée par le déficit hydrique, AtSUC1 pourrait avoir un rôle, qui reste à déterminer, dans la
réponse des plantes à la sécheresse. Faiblement exprimé, AtSUC5, comme AtSUC1, est lui
aussi
pi
pa le
a
ue d’eau hez les
ot pes. Le g
e AtSUC2 code quant à lui un
transporteur de saccharose qui semblerait avoir une activité majeure dans le chargement du
phloème (Gottwald et al., 2000). Après 9 jours de déficit hydrique, l’e p essio d’AtSUC2
mesurée dans les feuilles stressées des 3 écotypes est faible et globalement comparable à
celle quantifiée dans les feuilles témoins. La seule expression d'AtSUC2 ne permet donc pas
d’e pli ue l’a u ulatio de sa ha ose da s les feuilles pa u possi le ale tisse e t de
son chargement dans le phloème.
Le t a spo t a tif i di e t du sa ha ose depuis l’apoplaste da s le phlo
e fait
appel à un système de co-transport associé au fonctionnement d’H+/ATPases, de type AHA3
chez Arabidopsis thaliana, situées sur la membrane plasmique des cellules compagnes
(Truernit et Sauer, 1995). Ce chargement est aussi dépendant de la disponibilité en
saccharose et de la concentration en Ca2+ qui participerait à la régulation de l'activité des
H+/ATPases. U e di i utio de la dispo i ilit e ATP et/ou u e aisse d’activité de ces
ATPases, en réponse au stress hydrique, pourrait aussi aboutir, indépendamment de la
densité des transporteurs, à une baisse du chargement du saccharose dans le phloème et à
son accumulation dans les feuilles. Lors d'un déficit hydrique, une carence en ATP a déjà été
relevée chez Helianthus annuus (Tezara et al., 1999). Par ailleurs, une augmentation de la
concentration en Ca2+ est réputée induire l'inhibition des H+/ATPases présentes au niveau
des membranes plasmiques des cellules de garde et des cellules du mésophylle des feuilles
de Vicia faba (Kinoshita et al., 1995).
229
Discussion
Une réponse à un déficit hydrique faisant intervenir une augmentation de la concentration
en Ca2+ dans le cytosol à l'origine de la chute d'activité des H+/ATPases qui induirait in fine la
fermeture des stomates a déjà été proposée par Netting (2000). Des déformations
cellulaires, induites par la déshydratation et perçues au niveau des cellules foliaires, seraient
à l'origine d'un stress mécanique entrainant l'ouverture de canaux à Ca2+ sensibles à la
pression. L'ouverture de ces canaux serait responsable d'une augmentation de la
concentration en Ca2+ dans le cytosol des cellules qui induirait la phosphorylation et ainsi
l'inhibition des H+/ATPases présentes au niveau des membranes plasmiques (Netting, 2000).
Si la suraccumulation de saccharose observée lors d'une période de stress hydrique
peut être liée à une faible densité membranaire des transporteurs de sucres, à un
ale tisse e t du
a is e de t a spo t li à u e aisse d’a tivit des H+/ATPases), elle
peut également favoriser la diminution de l'activité de la saccharose phosphate synthase
(SPS) (Vassey et Sharkey, 1989; Sugden et al., 1999; Lawlor et Cornic, 2002; Flexas, J. et al.,
2004; Hummel et al., 2010). La baisse d'activité de la SPS pourrait inhiber la photosynthèse
en limitant la disponibilité en phosphate inorganique (P i) à l'intérieur des chloroplastes. En
effet, l'accumulation de composés phosphates dans le cytosol, consécutive à la baisse
d'activité de la SPS, immobiliserait une quantité importante de phosphate. Cette
i
o ilisatio , à l’o igi e d’u e aisse de la teneur en Pi libre cytoplasmique, contribuerait
à ralentir la sortie des trioses-phosphate du chloroplaste sachant que le transporteur
responsable de leur sortie est un antiport qui échange stoechiométriquement un triose
phosphate du stroma contre un Pi du cytoplasme (Flugge et Heldt, 1984). De plus,
l'expression du gène codant ce transporteur de trioses-phosphate serait inhibé par un
traitement au saccharose (0,3 M) chez de jeunes plants de Nicotiana tabacum (Knight et
Gray, 1994). L'accumulation des trioses-phosphate et la pénurie en phosphate inorganique à
l'intérieur du chloroplaste pourraient avoir à leur tour une répercussion sur la synthèse
d'ATP qui nécessite une forte concentration en phosphate inorganique. La vitesse
d’utilisatio
des t ioses-phosphate (TPU) pourrait donner quelques indications sur la
limitation photosynthétique liée à cette accumulation.
230
Discussion
Si nos résultats montrent bien une baisse de la TPU en fin de stress hydrique (notamment à
J+10 et J+13 pour les 3 écotypes) (Figure 60.C , il ’est epe da t pas e tai
po se t aduise u e
ue e p ofil de
elle di i utio de l’e po tatio des trioses-phosphate étant donné
u’il est si ilai e à elui du Jmax. En effet, pour les forts niveaux de stress (notamment J+10
et J+
, les pla tes e pa aisse t plus t e da s les o ditio s où l’assi ilatio
ette peut
être limitée par la TPU (aucune baisse de JT n'était plus observée pour les Ci élevées)
(Figure 61). Quoi u’il e soit, si ette li itatio de la photos th se li e à l'a u ulatio de
trioses-phosphate est théoriquement possible notamment dans le cas de plantes cultivées à
des concentrations en CO2 saturantes (Paul et Foyer, 2001), il est peu probable d'observer
cette situation en réponse au stress hydrique. Dans tous les cas, même présente, elle
n'aurait que très peu d'influence sur l'assimilation nette car intervenant après l'installation
de limitations diffusives et d'autres limitations métaboliques importantes.
231
Conclusion et perspectives
Le premier objectif de ce travail était de caractériser la croissance et le
développement de 8 écotypes d'Arabidopsis thaliana originaires de zones géographiques
variées, afin de sélectionner 3 écotypes (Col-0, Mt-0 et Shahdara), qui ont été ensuite soumis
à une période de déficit hydrique. Cette caractérisation effectuée tout au long de la
croissance des plantes, a révélé des morphotypes très marqués entre les 8 écotypes,
accompagnés par des différences notables au niveau de certains paramètres mesurés
comme le nombre de feuilles et la surface foliaire projetée. Au 47ème jour après la levée, les
8 écotypes ont présenté des différences significatives en termes de teneur en chlorophylles
totales, de transpiration (E), de conductance stomatique (gs), de concentration interne en
CO2 (Ci), d'assimilation nette (AN) de CO2, de biomasse aérienne et de teneur en eau.
L'analyse en composantes principales de ces différents paramètres a mis en évidence les
écotypes Col-0, Cvi-0, An-1 et Shahdara. L'écotype Cvi-0, originaire des Iles Cap Vert se
singularise par une gestion de l'eau atypique. Cet écotype est effectivement caractérisé par
une conductance stomatique élevée accompagnée logiquement d'une assimilation nette
importante, mais présente la plus faible efficience d'utilisation de l'eau. Cvi-0 n'a pu être
retenu pour l'expérience de stress hydrique car cet essai était réalisé tardivement par
rapport à son cycle reproduction, la floraison aurait eu lieu pendant la période de
sécheresse. L'utilisation d'une chambre de mesure suffisamment grande pour contenir la
plante entière ou d'une pince adaptée aux petites feuilles d'Arabidopsis thaliana,
permettrait de soumettre, plus précocement, cet écotype à un déficit hydrique et d'étudier
ainsi son comportement face à ce genre de contrainte. Au vu des nombreuses différences
observées entre ces 8 écotypes, une étude de grande ampleur pourrait être envisagée, sur
un nombre plus conséquent d'écotypes et pourrait révéler des comportements différents de
ceux rencontrés dans cette étude.
232
Le second objectif était de suivre les écotypes Col-0, Mt-0 et Shahdara tout au long
d'une période de déficit hydrique. Mt-0 qui est caractérisé par une conductance stomatique
(gs), une transpiration (E), une assimilation nette (A N) et une teneur en amidon foliaire
supérieure aux deux autres écotypes, présente u e fai le effi ie e d’utilisatio de l’eau
pou
alise l’assi ilatio du CO2 (AN/E). En réponse au déficit hydrique, les rosettes de cet
écotype parviennent néanmoins à maintenir un contenu relatif en eau (RWC) comparable à
celui des rosettes témoins pendant les 6 premiers jours de stress (J+6) en compensant une
transpiration conséquente par une consommation racinaire importante de la réserve utile en
eau du sol. Mt-0 a donc asséché plus rapidement son substrat par rapport aux deux autres
écotypes. Ainsi, une chute de la conductance stomatique est observée chez Mt-0 six jours
après le dernier arrosage (J+6), soit trois jours avant celle constatée chez les deux autres
écotypes (J+9). Ces baisses significatives de conductance stomatique sont dans un premier
temps toujours associées à une diminution de la concentration interne en CO 2 du
mésophylle (Ci) et de l'assimilation nette (AN).
L’a al se de ou es AN/Ci montre clairement que l’appli atio d’u e o e t atio
saturante en CO2 ne permet pas chez des feuilles stressées, à J+7 pour Mt-0 et à J+10 pour
Col-0, de e ouv e des valeu s d’assi ilatio
ette o pa a les à elles des feuilles
témoins Pour ces deux écotypes, les limitations photosynthétiques ne sont déjà plus
exclusivement diffusives mais aussi de nature métaboliques comme en atteste par ailleurs la
diminution significative de la vitesse maximale de carboxylation de la Rubisco (Vcmax). Trois
jours après l'apparition des premières diminutions de la gs, une hausse de la concentration
intercellulaire en CO2 (Ci
o t e d fi itive e t ue e ’est pas la dispo i ilit e CO2 qui
limite alors l’assi ilatio
ette
ais bel et bien le métabolisme. Toutefois, si la limitation
stomatique a bien été définie, l'étude des courbes AN/Ci n'a pas permis de différencier les
limitations liées à la conductance mésophyllienne des limitations purement métaboliques.
Des mesures d'échanges gazeux en présence d'isotopes stables du carbone (ex :
13
C)
autoriseraient le calcule de la conductance mésophyllienne (gm). À partir des valeurs de gm, il
serait alors possible de calculer la concentration en CO2 dans les chloroplastes (Cc), dont les
fluctuations influencent les réactions de carboxylation assurées par la Rubisco et certaines
voies de signalisation.
233
De plus l'analyse de courbes AN/Cc permettrait de différencier précisément les limitations
diffusives, caractérisées par la conductance stomatique et mésophyllienne, des limitations
purement métaboliques.
En ce qui concerne les limitations métaboliques, Shahdara semble être l’ ot pe le
moins affecté par la sécheresse. Effectivement, à J+9, il est encore capable de récupérer une
assimilation nette comparable à celle des témoins malgré une diminution légère mais
significative de sa Vcmax. Ces données de Vcmax obtenues par les courbes AN/Ci pourraient être
confirmées par des mesures de l'activité enzymatique de la Rubisco. Le ralentissement de la
carboxylation du ribulose 1,5- isphosphate, t aduite pa les do
de Vcmax, ’est ja ais asso i à u a
es d’assi ilatio
t du t a sfe t des le t o s o
e le
ette et
o t e t les
valeurs des différents descripteurs de la phase photochimique (JT, Jmax, qP) qui diminuent
modestement. Les p e i es li itatio s
ta oli ues ui s’i stalle t apide e t ap s les
limitations diffusives sont donc imputables à la phase sombre de la photosynthèse et non à
la phase claire. Des mesures quotidiennes sur les plantes stressées permettraient peut être
de mieux comprendre les modalités d'installation des processus de photo-inhibition
aboutissant à terme à l'altération des photosystèmes. Dans ce sens, un suivi de la
photorespiration durant le déficit hydrique en mesurant par exemple l'activité de la
glycolate oxydase, permettrait de voir si la photorespiration, en tant que puits alternatif
d'électrons participe au maintien d'un transfert d'électrons au sein de la chaîne de transport
photosynthétique.
En fin de stress (J+12), les rosettes de Mt-0, qui ont subi les effets de la sécheresse
plus longtemps que les 2 autres écotypes (Mt-0 a en effet asséché son substrat plus
rapidement que les 2 autres écotypes), sont les plus affectées par le déficit hydrique bien
que leur contenu relatif en eau soit sensiblement équivalent à celui des rosettes de Col-0.
Effectivement, à J+12 (dernier jour de stress), Mt-0 est le seul écotype qui montre une
a se e d’assi ilatio
ette oupl e à des hutes i po ta tes et conjointes du quenching
photochimique (qP) et du Fv/Fm ui t
oig e t d’u e alt atio
ajeu e et i
ve si le des
photosystèmes II.
234
À cette même date (J+12), les photosystèmes II et le flux total d’ le t o s photos th ti ue
(JT) des écotypes Col-0 et Shahdara sont moins atteints par la sécheresse (faibles diminutions
du Fv/Fm et du qP et réduction moindre du JT par rapport à Mt-0). Shahdara dont les rosettes
so t a a t is es pa u
o te u elatif e eau sup ieu , est lai e e t l’ ot pe ui a le
mieux toléré la contrainte hydrique.
Au cours du stress hydrique, les réserves en amidon foliaire des 3 écotypes,
initialement inégales, ont été progressivement et totalement consommées. Les cinétiques
d’a u ulatio de l’a ido da s les osettes t
st ess es so t diff e tes d’u
oi s et de o so
atio da s les osettes
ot pe à l’aut e. Da s tous les as, la fo te des réserves en
amidon ont toujours conduit en fin de stress à une accumulation de saccharose dans les
feuilles. Afin de mieux comprendre l'effet du déficit hydrique sur le transport des sucres à
longue distance, des mesures de l'activité de certains transporteurs de saccharose comme
AtSUC2 pourraient être entrepris. Des expériences d'assimilation du
14
CO2 au niveau des
feuilles couplées au comptage de la radioactivité dans les différents organes et des
autoradiographies permettraient également de mesurer l'activité du transport des sucres.
De plus, des dosages de l'amidon et des sucres solubles effectués sur les racines,
apporteraient des informations sur l'effet du déficit hydrique sur la répartition des réserves
carbonées à l'échelle de la plante entière. L'effet d'un déficit hydrique sur les racines de
plants d'Arabidopsis thaliana cultivés en hydroponie fait actuellement l'objet d'une thèse
menée au Laboratoire par Dany Mainson.
La connaissance accrue des différents processus limitant les rendements
photosynthétiques et l'identification précise de l'apparition des limitations métaboliques
irréversibles, comme l'altération des photosystèmes II, pourraient permettre d'établir des
programmes d'irrigation ajustés conjointement à la disponibilité de la ressource hydrique et
à la juste demande de la plante. Enfin la production de lignées recombinantes (RILs)
présentant des combinaisons génétiques avantageuses des écotypes parentaux pourrait être
envisagée.
235
À l'image d'Arabidopsis thaliana de nombreuses espèces à intérêt agronomique
présentent également une biodiversité importante. Une caractérisation accrue d'écotypes
d'espèces utilisées en agriculture représenterait une solution alternative à l'utilisation de
plantes génétiquement modifiées.
Enfin, les prévisions climatiques confirment bel et bien que les plantes devront faire
face dans l'avenir à une diminution de la ressource en eau, toutefois cette contrainte
hydrique sera accompagnée d'une élévation progressive de la concentration atmosphérique
en CO2. Or de fortes concentrations en CO2 sont connues pour induire la fermeture des
stomates. Ainsi des plantes soumises conjointement à un déficit hydrique et à des
concentrations élevées en CO2 présenteraient, une résistance accrue à la contrainte
hydrique en limitant leurs pertes en eau par transpiration. Il sera alors intéressant
d'observer comment l'activité photosynthétique et le transport à longue distance des sucres
seront modifiés par ce type de stress hydrique. Cette problématique fera l'objet d'une thèse
à venir au sein du Laboratoire.
236
Références bibliographiques
237
Abarca D, Roldan M, Martin M, Sabater B. 2001. Arabidopsis thaliana ecotype Cvi shows an
increased tolerance to photo-oxidative stress and contains a new chloroplastic
copper/zinc superoxide dismutase isoenzyme. Journal of Experimental Botany 52.
Abramoff MD, Magelhaes PJ, Ram SJ. 2004. Image processing with imagej. Biophotonics
International 11: 36-42.
Adams III WW, Zarter CR, Mueh KE, Amiard V, Demmig-Adams B 2006. Energy dissipation
and photoinhibition: A continuum of photoprotection. In: B. Demmig-Adams, W. W.
Adams, A. K. Mattoo, J. Amesz, J. Barber, R. E. Blankenship, N. Murata, W. L. OgrenD.
R. Ort eds. Photoprotection, photoinhibition, gene regulation, and environment:
Springer Netherlands, 49-64.
Al-Shehbaz IA, O'Kane SL. 2002. Taxonomy and phylogeny of Arabidopsis (Brassicaceae). The
Arabidopsis Book: e0001.
Alkhatib K, Paulsen GM. 1989. Enhancement of thermal-injury to photosynthesis in wheat
plants and thylakoids by high light-intensity. Plant Physiology 90.
Allan AC, Fricker MD, Ward JL, Beale MH, Trewavas AJ. 1994. Two transduction pathways
mediate rapid effects of abscisic-acid in Commelina guard-cells. Plant Cell 6.
Allen JF. 2003. State transitions--a question of balance. Science 299: 1530-1532.
Alonso-Blanco C, Koornneef M. 2000. Naturally occurring variation in Arabidopsis: An
underexploited resource for plant genetics. Trends in Plant Science 5: 22-29.
Alscher RG, Erturk N, Heath LS. 2002. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling
oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany 53.
Antonio C, Larson T, Gilday A, Graham I, Bergström E, Thomas-Oates J. 2007. Quantification
of sugars and sugar phosphates in Arabidopsis thaliana tissues using porous graphitic
carbon liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Journal of
Chromatography A 1172: 170-178.
Antony N. Dodd KP, Alex A. R. Webb,. 2004. Independent circadian regulation of
assimilation and stomatal conductance in the ztl-1 mutant of Arabidopsis. New
Phytologist 162: 63-70.
Apel K, Hirt H. 2004. Reactive oxygen species: Metabolism, oxidative stress, and signal
transduction. Annual Review of Plant Biology 55: 373-399.
Arnon DI. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta
vulgaris. Plant Physiol 24: 1-15.
Aro EM, McCaffery S, Anderson JM. 1993. Photoinhibition and D1 protein-degradation in
peas acclimated to different growth irradiances. Plant Physiology 103.
Asada K. 1999. The water-water cycle in chloroplasts: Scavenging of active oxygens and
dissipation of excess photons. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology 50.
Asada K. 2000. The water-water cycle as alternative photon and electron sinks. Philosophical
Transactions of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences 355.
Astegiano ED, Pilatti RA 2003. Foliar expansion of Sorghum in response to short and sudden
periods of water stress.In: Agronomia Tropical. 73-86.
238
Badiani M, Debiasi MG, Colognola M, Artemi F. 1990. Catalase, peroxidase and superoxidedismutase activities in seedlings submitted to increasing water deficit. Agrochimica
34.
Bagard M. 2008. Impact de l'ozone sur les processus photosynthétiques et photorespiratoires
du peuplier (Populus x canascens [aiton] sm.) au cours du développement foliaire
aspects écophysiologiques et cellulaires. Nancy-Université.
Bagard M, Thiec DL, Delacote E, Hasenfratz-Sauder M-P, Banvoy J, Gérard J, Dizengremel P,
Jolivet Y. 2008. Ozone-induced changes in photosynthesis and photorespiration of
hybrid Poplar in relation to the developmental stage of the leaves. Physiologia
Plantarum 134: 559-574.
Barker L, Kuhn C, Weise A, Schulz A, Gebhardt C, Hirner B, Hellmann H, Schulze W, Ward
JM, Frommer WB. 2000. SUT2, a putative sucrose sensor in sieve elements. Plant Cell
12: 1153-1164.
Bartholomew DM, Bartley GE, Scolnik PA. 1991. Abscisic-acid control of rbcS and cab
transcription in tomato leaves. Plant Physiology 96: 291-296.
Baud S, Wuilleme S, Lemoine R, Kronenberger J, Caboche M, Lepiniec L, Rochat C. 2005.
The AtSUC5 sucrose transporter specifically expressed in the endosperm is involved
in early seed development in Arabidopsis. Plant J 43: 824-836.
Bauerle WL, Weston DJ, Bowden JD, Dudley JB, Toler JE. 2004. Leaf absorptance of
photosynthetically active radiation in relation to chlorophyll meter estimates among
woody plant species. Scientia Horticulturae 101: 169-178.
Becker B, Holtgrefe S, Jung S, Wunrau C, Kandlbinder A, Baier M, Dietz KJ, Backhausen JE,
Scheibe R. 2006. Influence of the photoperiod on redox regulation and stress
responses in Arabidopsis thaliana L. (heynh.) plants under long- and short-day
conditions. Planta 224: 380-393.
Begcy K, Mariano ED, Mattiello L, Nunes AV, Mazzafera P, Maia IG, Menossi M. 2011. An
Arabidopsis mitochondrial uncoupling protein confers tolerance to drought and salt
stress in transgenic tobacco plants. Plos One 6.
Ben-Shem A, Frolow F, Nelson N. 2003. Crystal structure of plant photosystem I. Nature
426: 630-635.
Bennoun P. 2002. The present model for chlororespiration. Photosynthesis Research 73.
Benson AA, Calvin M. 1950. Carbon dioxide fixation by green plants. Annual Review of Plant
Physiology and Plant Molecular Biology 1: 25-42.
Bernacchi CJ, Portis AR, Nakano H, von Caemmerer S, Long SP. 2002. Temperature response
of mesophyll conductance. Implications for the determination of Rubisco enzyme
kinetics and for limitations to photosynthesis in vivo. Plant Physiol. 130: 1992-1998.
Bianchi G, Gamba A, Murelli C, Salamini F, Bartels D. 1991. Novel carbohydrate-metabolism
in the resurrection plant Craterostigma-plantagineum. Plant Journal 1: 355-359.
Biehler K, Fock H. 1996. Evidence for the contribution of the Mehler-peroxidase reaction in
dissipating excess electrons in drought-stressed wheat. Plant Physiol. 112: 265-272.
Blouin M, Lavelle P, Laffray D. 2007. Drought stress in rice (Oryza sativa L.) is enhanced in
the presence of the compacting earthworm millsonia anomala. Environmental and
Experimental Botany 60: 352-359.
Boag S, Portis AR. 1984. Inhibited light activation of fructose and sedoheptulose
bisphosphatase in spinach-chloroplasts exposed to osmotic-stress. Planta 160.
239
Boccalandro HE, Rugnone ML, Moreno JE, Ploschuk EL, Serna L, Yanovsky MJ, Casal JJ.
2009. Phytochrome B enhances photosynthesis at the expense of water-use
efficiency in Arabidopsis. Plant Physiology 150.
Bock KW, Honys D, Ward JM, Padmanaban S, Nawrocki EP, Hirschi KD, Twell D, Sze H.
2006. Integrating membrane transport with male gametophyte development and
function through transcriptomics. Plant Physiol 140: 1151-1168.
Bongi G, Loreto F. 1989. Gas-exchange properties of salt-stressed olive (Olea-europea L.)
leaves. Plant Physiology 90: 1408-1416.
Bota J, Medrano H, Flexas J. 2004. Is photosynthesis limited by decreased Rubisco activity
and RuBP content under progressive water stress ? New Phytologist 162: 671-681.
Bottcher B, Graber P. 2000. The structure of the H+-ATP synthase from chloroplasts and its
subcomplexes as revealed by electron microscopy. Biochimica Et Biophysica ActaBioenergetics 1458.
Bouchabke O, Chang F, Simon M, Voisin R, Pelletier G, Durand-Tardif M. 2008. Natural
variation in Arabidopsis thaliana as a tool for highlighting differential drought
responses. PLoS ONE 3: e1705.
Boyer JS. 1970. Leaf enlargement and metabolic rates in corn, soybean, and sunflower at
various leaf water potentials. Plant Physiol. 46: 233-235.
Boyer JS, Wong SC, Farquhar GD. 1997. CO2 and water vapor exchange across leaf cuticle
(epidermis) at various water potentials. Plant Physiology 114: 185-191.
Boyer PD. 1997. The ATP synthase - a splendid molecular machine. Annual Review of
Biochemistry 66.
Brestic M, Cornic G, Freyer MJ, Baker NR. 1995. Does photorespiration protect the
photosynthetic apparatus in french bean leaves from photoinhibition during drought
stress? Planta 196: 450-457.
Briggs WR, Christie JM. 2002. Phototropins 1 and 2: Versatile plant blue-light receptors.
Trends in Plant Science 7: 204-210.
Bright J, Desikan R, Hancock JT, Weir IS, Neill SJ. 2006. ABA-induced no generation and
stomatal closure in Arabidopsis are dependent on H2O2 synthesis. Plant Journal 45:
113-122.
Brodribb T. 1996. Dynamics of changing intercellular CO2 concentration (Ci) during drought
and determination of minimum functional Ci. Plant Physiology 111: 179-185.
Brosche M, Merilo E, Mayer F, Pechter P, Puzorjova I, Brader G, Kangasjarvi J, Kollist H.
2010. Natural variation in ozone sensitivity among Arabidopsis thaliana accessions
and its relation to stomatal conductance. Plant Cell and Environment 33.
Bunce JA. 2008. Acclimation of photosynthesis to temperature in Arabidopsis thaliana and
Brassica oleracea. Photosynthetica 46: 517-524.
Büttner M. 2007. The monosaccharide transporter(-like) gene family in Arabidopsis. FEBS
Letters.Plant Transporters and Channels 581: 2318-2324.
Büttner M. 2010. The Arabidopsis sugar transporter (AtSTP) family: An update. Plant Biology
12: 35-41.
Büttner ET, K. Baier, J. Scholz-Starke, M. Sontheim, C. Lauterbach, V. A. R. Huss, N. Sauer,.
2000. AtSTP3, a green leaf-specific, low affinity monosaccharide-symporter of
Arabidopsis thaliana. Plant, Cell et Environment 23: 175-184.
Büttner M, Sauer N. 2000. Monosaccharide transporters in plants: Structure, function and
physiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1465: 263-274.
240
Caemmerer S, Farquhar GD, eds. 1981. Some relationships between the biochemistry of
photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta.
Carpenter JF, Crowe LM, Crowe JH. 1987. Stabilization of phosphofructokinase with sugars
during freeze-drying - characterization of enhanced protection in the presence of
divalent-cations. Biochimica Et Biophysica Acta 923: 109-115.
Caspar T, Huber SC, Somerville C. 1985. Alterations in growth, photosynthesis, and
respiration in a starchless mutant of Arabidopsis thaliana (L) deficient in chloroplast
phosphoglucomutase activity. Plant Physiology 79.
Caspar T, Lin TP, Kakefuda G, Benbow L, Preiss J, Somerville C. 1991. Mutants of
Arabidopsis with altered regulation of starch degradation. Plant Physiology 95:
1181-1188.
Centritto M, Loreto F, Chartzoulakis K. 2003. The use of low [CO2] to estimate diffusional
and non-diffusional limitations of photosynthetic capacity of salt-stressed olive
saplings. Plant, Cell et Environment 26: 585-594.
Chalker-Scott L. 1999. Environmental significance of anthocyanins in plant stress responses.
Photochemistry and Photobiology 70.
Chandran D, Reinders A, Ward JM. 2003. Substrate specificity of the Arabidopsis thaliana
sucrose transporter AtSUC2. J Biol Chem 278: 44320-44325.
Chanzy A, Chadoeuf J, Gaudu JC, Mohrath D, Richard G, Bruckler L. 1998. Soil moisture
monitoring at the field scale using automatic capacitance probes. European Journal of
Soil Science 49: 637-648.
Chaves M, Davies B. 2010. Drought effects and water use efficiency: Improving crop
production in dry environments. Functional Plant Biology 37: iii-vi.
Chaves MM, Flexas J, Pinheiro C. 2009. Photosynthesis under drought and salt stress:
Regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany 103: 551-560.
Chaves MM, Maroco J, Pereira J. 2003. Understanding plant responses to drought — from
genes to the whole plant. Functional Plant Biology 30: 239-264.
Chaves MM, Oliveira MM. 2004. Mechanisms underlying plant resilience to water deficits:
Prospects for water-saving agriculture. Journal of Experimental Botany 55: 23652384.
Chaves MM, Pereira JS, Maroco J, Rodrigues ML, Ricard CPP, Osorio ML, Carvalho I, Faria T,
Pinheiro C. 2002. How plants cope with water stress in the field ? Photosynthesis and
growth. Annals of Botany 89: 907-916.
Chen THH, Murata N. 2002. Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic
engineering of betaines and other compatible solutes. Current Opinion in Plant
Biology 5.
Cheng CL, Acedo GN, Cristinsin M, Conkling MA. 1992. Sucrose mimics the light induction of
Arabidopsis nitrate reductase gene transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 18611864.
Cheng W-H, Endo A, Zhou L, Penney J, Chen H-C, Arroyo A, Leon P, Nambara E, Asami T,
Seo M, Koshiba T, Sheen J. 2002. A unique short-chain dehydrogenase/reductase in
Arabidopsis glucose signaling and abscisic acid biosynthesis and functions. The Plant
Cell Online.
Chiou T-J, Bush DR. 1998. Sucrose is a signal molecule in assimilate partitioning. Proceedings
of the National Academy of Sciences 95: 4784-4788.
Choinski JS, Johnson JM. 1993. Changes in photosynthesis and water status of developing
leaves of Brachystegia-spiciformis Benth. Tree Physiology 13.
241
Christmann A, Weiler EW, Steudle E, Grill E. 2007. A hydraulic signal in root-to-shoot
signalling of water shortage. The Plant Journal 52: 167-174.
Cochard H. 2002. A technique for measuring xylem hydraulic conductance under high
negative pressures. Plant Cell and Environment 25.
Comstock J, Mencuccini M. 1998. Control of stomatal conductance by leaf water potential in
Hymenoclea salsola (T. et G.), a desert subshrub. Plant Cell and Environment 21.
Cornic G. 2000. Drought stress inhibits photosynthesis by decreasing stomatal aperture - not
by affecting ATP synthesis. Trends in Plant Science 5: 187-188.
Cornic G, Fresneau C. 2002. Photosynthetic carbon reduction and carbon oxidation cycles
are the main electron sinks for photosystem II activity during a mild drought. Annals
of Botany 89: 887-894.
Cornic G, Ghashghaie J. 1991. Effect of temperature on net CO2 assimilation and
photosystem II quantum yield of electron transfer of french bean (Phaseolus
vulgaris L.) leaves during drought stress. Planta 185: 255-260.
Cornic G, Gouallec JL, Briantais JM, Hodges M. 1989. Effect of dehydration and high light on
photosynthesis of two C3 plants (Phaseolus vulgaris L. And Elatostema repens (Lour.)
Hall f.). Planta 177: 84-90.
Cornic G, Massacci A 2004. Leaf photosynthesis under drought stress. Photosynthesis and
the environment, 347-366.
Couée I, Sulmon C, Gouesbet G, El Amrani A. 2006. Involvement of soluble sugars in reactive
oxygen species balance and responses to oxidative stress in plants. Journal of
Craigon D, James N, Okyere J, Higgins J, Jotham J, May S. 2004. Nascarrays: A repository for
microarray data generated by NASC's transcriptomics service. Nucleic Acids Res 32:
D575-577.
Cramer GR, Ergul A, Grimplet J, Tillett RL, Tattersall EAR, Bohlman MC, Vincent D,
Sonderegger J, Evans J, Osborne C, Quilici D, Schlauch KA, Schooley DA, Cushman
JC. 2007. Water and salinity stress in grapevines: Early and late changes in transcript
and metabolite profiles. Functional et Integrative Genomics 7.
Crowe JH, Crowe LM, Jackson SA. 1983. Preservation of structural and functional-activity in
lyophilized sarcoplasmic-reticulum. Archives of Biochemistry and Biophysics 220:
477-484.
Crowe JH, Hoekstra FA, Crowe LM. 1992. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology 54:
579-599.
Cruz de Carvalho MH. 2008. Drought stress and reactive oxygen species: Production,
scavenging and signaling. Plant Signal Behav 3: 156-165.
Cruz de Carvalho MH, Laffray D, Louguet P. 1998. Comparison of the physiological
responses of Phaseolus vulgaris and Vigna unguiculata cultivars when submitted to
drought conditions. Environmental and Experimental Botany 40: 197-207.
Cutler AJ, Krochko JE. 1999. Formation and breakdown of ABA. Trends in Plant Science 4.
Dai X, Xu Y, Ma Q, Xu W, Wang T, Xue Y, Chong K. 2007. Overexpression of an R1R2R3 MYB
gene, OsMYB3R-2, increases tolerance to freezing, drought, and salt stress in
transgenic Arabidopsis. Plant Physiology 143: 1739-1751.
242
Davies WJ, Zhang J. 1991. Root signals and the regulation of growth and development of
plants in drying soil. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology
42: 55-76.
Dejana Pankovic ZS, Slavko Kevresan and Marijana Plesnicar. 1999. Acclimation to
long-term water deficit in the leaves of two sunflower hybrids: Photosynthesis,
electron transport and carbon metabolism. Journal of Experimental Botany 50: 127138.
Delauney AJ, Verma DPS. 1993. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants. The Plant
Journal 4: 215-223.
DellaPenna D, Pogson BJ. 2006. Vitamin synthesis in plants: Tocopherols and carotenoids.
Annual Review of Plant Biology 57.
Dijkwel PP, Kock P, Bezemer R, Weisbeek PJ, Smeekens S. 1996. Sucrose represses the
developmentally controlled transient activation of the plastocyanin gene in
Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Physiology 110: 455-463.
Dinant S. 2008. Phloème, transport interorgane et signalisation à longue distance. Comptes
Rendus Biologies 331: 334-346.
Dinant S, Lemoine R. 2010. The phloem pathway: New issues and old debates. Comptes
Rendus Biologies 333: 307-319.
Donahue RA, Poulson ME, Edwards GE. 1997. A method for measuring whole plant
photosynthesis in Arabidopsis thaliana. Photosynthesis Research 52: 263-269.
Dreyer E, Le Roux X, Montpied P, Daudet FA, Masson F. 2001. Temperature response of leaf
photosynthetic capacity in seedlings from seven temperate tree species. Tree
Physiology 21.
During H. 2003. Stomatal and mesophyll conductances control CO2 transfer to chloroplasts
in leaves of grapevine (Vitis vinifera L.). Vitis 42.
Eckardt NA, Snyder GW, Portis AR, Ogren WL. 1997. Growth and photosynthesis under high
and low irradiance of Arabidopsis thaliana antisense mutants with reduced
ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activase content. Plant Physiology
113: 575-586.
Elster RC. 1995. Physiologische und molekulare charakterisierung des saccharose
stoffwechsels der trockentoleranten wiederauferstehungspflanze craterostigma
plantagineum hochst: Unter besonderer berücksichtigung des enzyms saccharose
synthase(ec: 2.4.1.13): Universität zu Köln.
Endler A, Meyer S, Schelbert S, Schneider T, Weschke W, Peters SW, Keller F, Baginsky S,
Martinoia E, Schmidt UG. 2006. Identification of a vacuolar sucrose transporter in
barley and Arabidopsis mesophyll cells by a tonoplast proteomic approach. Plant
Physiol 141: 196-207.
Endo A, Sawada Y, Takahashi H, Okamoto M, Ikegami K, Koiwai H, Seo M, Toyomasu T,
Mitsuhashi W, Shinozaki K, Nakazono M, Kamiya Y, Koshiba T, Nambara E. 2008.
Drought induction of Arabidopsis 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase occurs in
vascular parenchyma cells. Plant Physiology 147: 1984-1993.
Endo T, Asada K, Demmig-Adams B, Adams WW, Mattoo AK 2006. Photosystem I and
photoprotection: Cyclic electron flow and water-water cycle photoprotection,
photoinhibition, gene regulation, and environment. In: G. Govindjee ed.: Springer
Netherlands, 205-221.
Endo T, Shikanai T, Takabayashi A, Asada K, Sato F. 1999. The role of chloroplastic NAD(P)H
dehydrogenase in photoprotection. Febs Letters 457.
243
Ethier GJ, Livingston NJ. 2004. On the need to incorporate sensitivity to CO2 transfer
conductance into the Farquhar-von Caemmerer-Berry leaf photosynthesis model.
Plant, Cell et Environment 27: 137-153.
Eun-Deok K, Z. Jeffrey C, Zhongfu N. 2009. Chlorophyll and starch assays. Science protocol.
Fabre N, Reiter IM, Becuwe-Linka N, Genty B, Rumeau D. 2007. Characterization and
e p essio a al sis of ge es e odi g α a d β a o i a h d ases i Arabidopsis.
Plant, Cell et Environment 30: 617-629.
Farineau J, Morot-Gaudry J-F. 2007. La photosynthèse. Processus physiques, moléculaires et
physiologiques: Springer Netherlands.
Farquhar GD, Caemmerer S, Berry JA. 1980. A biochemical model of photosynthetic CO2
assimilation in leaves of C3 species. Planta 149: 78-90.
Farquhar GD, Sharkey TD. 1982. Stomatal conductance and photosynthesis. Annual Review
of Plant Physiology 33: 317-345.
Farquhar GD, von Caemmerer S, Berry JA. 2001. Models of photosynthesis. Plant Physiol.
125: 42-45.
Fiscus EL, Booker FL. 2002. Growth of Arabidopsis flavonoid mutant is challenged by
radiation longer than the UV-B band. Environmental and Experimental Botany 48.
Fleurat-Lessard P, Dédaldéchamp F, Thibault F, Béré E, Roblin G. 2011. Antifungal effects of
iron sulfate on grapevine fungal pathogens. Scientia Horticulturae 130: 517-523.
Flexas J. 2000. Regulation of the photosynthetic processes in response to drought in leaves
of Vitis vinifera L., University of the Balearic Islands, Spain.
Flexas J, Badger M, Chow WS, Medrano Hl, Osmond CB. 1999. Analysis of the relative
increase in photosynthetic O2 uptake when photosynthesis in grapevine leaves is
inhibited following low night temperatures and/or water stress. Plant Physiology 121:
675-684.
Flexas J, Bota J, Cifre J, Mariano Escalona J, Galmés J, Guliass J, Lefi E-K, Florinda MartinezCanellas S, Teresa Moreno M, Ribas-Carbo M, Riera D, Sampol B, Medrano H.
2004a. Understanding down-regulation of photosynthesis under water stress: Future
prospects and searching for physiological tools for irrigation management. Annals of
Applied Biology 144: 273-283.
Flexas J, Bota J, Galmés J, Medrano H, Ribas-Carbó M. 2006a. Keeping a positive carbon
balance under adverse conditions: Responses of photosynthesis and respiration to
water stress. Physiologia Plantarum 127: 343-352.
Flexas J, Bota J, Loreto F, Cornic G, Sharkey TD. 2004b. Diffusive and metabolic limitations
to photosynthesis under drought and salinity in C3 plants. Plant Biology 6: 269-279.
Flexas J, Diaz-Espejo A, Galmes J, Kaldenhoff R, Medrano H, Ribas-Carbo M. 2007. Rapid
variations of mesophyll conductance in response to changes in CO2 concentration
around leaves. Plant Cell and Environment 30: 1284-1298.
Flexas J, Escalona JM, Medrano H. 1999. Water stress induces different levels of
photosynthesis and electron transport rate regulation in grapevines. Plant, Cell et
Environment 22: 39-48.
Flexas J, Galmes J, Ribas-Carbo M, Medrano Hl, Lambers H 2005. The effects of water stress
on plant respiration. Springer Netherlands, 85-94.
Flexas J, Medrano H. 2002. Drought-inhibition of photosynthesis in C3 plants: Stomatal and
non-stomatal limitations revisited. Ann Bot 89: 183-189.
Flexas J, Ortuno MF, Ribas-Carbo M, Diaz-Espejo A, Florez-Sarasa ID, Medrano H. 2007.
Mesophyll conductance to CO2 in Arabidopsis thaliana. New Phytol 175: 501-511.
244
Flexas J, Ribas-Carbó M, Bota J, Galmés J, Henkle M, Martínez-Cañellas S, Medrano H.
2006. Decreased Rubisco activity during water stress is not induced by decreased
relative water content but related to conditions of low stomatal conductance and
chloroplast CO2 concentration. New Phytologist 172: 73-82.
Flexas J, Ribas-Carbô M, Diaz-Espejo A, Galmés J, Medrano H. 2008. Mesophyll
conductance to CO2: Current knowledge and future prospects. Plant, Cell et
Flexas J, Ribas-Carbo M, Hanson DT, Bota J, Otto B, Cifre J, McDowell N, Medrano H,
Kaldenhoff R. 2006b. Tobacco aquaporin NTAQP1 is involved in mesophyll
conductance to CO2 in vivo. Plant Journal 48: 427-439.
Flugge UI, Heldt HW. 1984. The phosphate-triose phosphate-phosphoglycerate translocator
of the chloroplast. Trends in Biochemical Sciences 9.
Fotopoulos V, Gilbert MJ, Pittman JK, Marvier AC, Buchanan AJ, Sauer N, Hall JL, Williams
LE. 2003. The monosaccharide transporter gene, AtSTP4, and the cell-wall invertase,
Atβfruct1, are induced in Arabidopsis during infection with the fungal biotroph
Erysiphe cichoracearum. Plant Physiol 132: 821-829.
Fox TC, Geiger DR. 1986. Osmotic response of sugar-beet source leaves at CO2
compensation point. Plant Physiology 80.
Foyer C, Furbank R, Harbinson J, Horton P. 1990. The mechanisms contributing to
photosynthetic control of electron transport by carbon assimilation in leaves.
Photosynthesis Research 25: 83-100.
Foyer CH, Valadier MH, Migge A, Becker TW. 1998. Drought-induced effects on nitrate
reductase activity and mRNA and on the coordination of nitrogen and carbon
metabolism in maize leaves. Plant Physiology 117.
Frank HA, Cogdell RJ. 1996. Carotenoids in photosynthesis. Photochemistry and
Photobiology 63: 257-264.
Frechilla S, Zhu JX, Talbott LD, Zeiger E. 1999. Stomata from npq1, a zeaxanthin-less
Arabidopsis mutant, lack a specific response to blue light. Plant and Cell Physiology
40: 949-954.
Fresneau C, Ghashghaie J, Cornic G. 2007. Drought effect on nitrate reductase and
sucrose-phosphate synthase activities in wheat (Triticum durum L.): Role of leaf
internal CO2. Journal of Experimental Botany 58: 2983-2992.
Frommer WB, Sonnewald U. 1995. Molecular analysis of carbon partitioning in solanaceous
species. Journal of Experimental Botany 46.
Fryer MJ. 1992. The antioxidant effects of thylakoid vitamin E α-tocopherol). Plant, Cell et
Fu JM, Huang BR. 2001. Involvement of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation
of two cool-season grasses to localized drought stress. Environmental and
Experimental Botany 45.
Fuentes D, Meneses M, Nunes-Nesi A, Araujo WL, Tapia R, Gomez I, Holuigue L, Gutierrez
RA, Fernie AR, Jordana X. 2011. A deficiency in the flavoprotein of Arabidopsis
mitochondrial complex II results in elevated photosynthesis and better growth in
nitrogen-limiting conditions. Plant Physiology 157: 1114-1127.
Galmes J, Abadia A, Medrano H, Flexas J. 2007. Photosynthesis and photoprotection
responses to water stress in the wild-extinct plant lysimachia minoricensis.
Environmental and Experimental Botany 60.
245
Galmés J, Medrano H, Flexas J. 2007. Photosynthetic limitations in response to water stress
and recovery in mediterranean plants with different growth forms. New Phytologist
175: 81-93.
Galmés J, Ribas-Carbó M, Medrano H, Flexas J. 2011. Rubisco activity in mediterranean
species is regulated by the chloroplastic CO2 concentration under water stress.
Journal of Experimental Botany 62: 653-665.
Geigenberger P, Reimholz R, Geiger M, Merlo L, Canale V, Stitt M. 1997. Regulation of
sucrose and starch metabolism in potato tubers in response to short-term water
deficit. Planta 201.
Genty B, Briantais J-M, Baker NR. 1989. The relationship between the quantum yield of
photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 990: 87-92.
Gerbaud A, André M. 1980. Effect of CO2, O2, and light on photosynthesis and
photorespiration in wheat. Plant Physiology 66: 1032-1036.
Gia di①MT,①Co a①②,①Geike ①B,①Kuče a①T,①Masojídek①J,①Mattoo①②K.①
. Long-term drought
stress induces structural and functional reorganization of photosystem II. Planta 199:
118-125.
Gillon JS, Yakir D. 2000. Internal conductance to CO2 diffusion and C18OO discrimination in
C3 leaves. Plant Physiology 123: 201-214.
Gilmore AM, Hazlett TL, Debrunner PG, Govindjee. 1996. Comparative time-resolved
photosystem II chlorophyll a fluorescence analyses reveal distinctive differences
between photoinhibitory reaction center damage and xanthophyll cycle-dependent
energy dissipation. Photochemistry and Photobiology 64.
Gimenez C, Mitchell VJ, Lawlor DW. 1992. Regulation of photosynthetic rate of two
sunflower hybrids under water stress. Plant Physiol. 98: 516-524.
Giraud E, Ho LHM, Clifton R, Carroll A, Estavillo G, Tan Y-F, Howell KA, Ivanova A, Pogson
BJ, Millar AH, Whelan J. 2008. The absence of ALTERNATIVE OXIDASE1a in
Arabidopsis results in acute sensitivity to combined light and drought stress. Plant
Physiology 147: 595-610.
Gobert A, Isayenkov S, Voelker C, Czempinski K, Maathuis FJM. 2007. The two-pore channel
TPK1 gene encodes the vacuolar K+ conductance and plays a role in K+ homeostasis.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104.
Golding AJ, Finazzi G, Johnson GN. 2004. Reduction of the thylakoid electron transport chain
by stromal reductants—evidence for activation of cyclic electron transport upon dark
adaptation or under drought. Planta 220: 356-363.
Goldschmidt EE, Huber SC. 1992. Regulation of photosynthesis by end-product accumulation
in leaves of plants storing starch, sucrose, and hexose sugars. Plant Physiology 99:
1443-1448.
Gomez L, Rubio E, Augé M. 2002. A new procedure for extraction and measurement of
soluble sugars in ligneous plants. Journal of the Science of Food and Agriculture 82:
360-369.
Gomez L, Rubio E, Lescourret F. 2003. Critical study of a procedure for the assay of starch in
ligneous plants. Journal of the Science of Food and Agriculture 83: 1114-1123.
Gorton HL, Herbert SK, Vogelmann TC. 2003. Photoacoustic analysis indicates that
chloroplast movement does not alter liquid-phase CO2 diffusion in leaves of Alocasia
brisbanensis. Plant Physiology 132: 1529-1539.
246
Gottwald JR, Krysan PJ, Young JC, Evert RF, Sussman MR. 2000. Genetic evidence for the in
planta role of phloem-specific plasma membrane sucrose transporters. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 97:
13979-13984.
Gould KS, McKelvie J, Markham KR. 2002. Do anthocyanins function as antioxidants in
leaves ? Imaging of H2O2 in red and green leaves after mechanical injury. Plant, Cell et
Govindje e. 1995. Sixty-three years since Kautsky: Chlorophyll a fluorescence. Functional
Plant Biology 22: 131-160.
Gowing DJG, Davies WJ, Jones HG. 1990. A positive root-sourced signal as an indicator of
soil drying in apple, Malus x domestica-Borkh. Journal of Experimental Botany 41.
Grabov A, Leung J, Giraudat J, Blatt MR. 1997. Alteration of anion channel kinetics in
wild-type and abi1-1 transgenic Nicotiana benthamiana guard cells by abscisic acid.
Plant Journal 12.
Graf A, Schlereth A, Stitt M, Smith AM. 2010. Circadian control of carbohydrate availability
for growth in Arabidopsis plants at night. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 107: 9458-9463.
Grantz DA, Zeiger E. 1986. Stomatal responses to light and leaf-air water-vapor pressure
difference show similar kinetics in sugarcane and soybean. Plant Physiology 81:
865-868.
Grassi G, Magnani F. 2005. Stomatal, mesophyll conductance and biochemical limitations to
photosynthesis as affected by drought and leaf ontogeny in ash and oak trees. Plant,
Cell et Environment 28: 834-849.
Gunasekera D, Berkowitz GA. 1993. Use of transgenic plants with ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase/oxygenase antisense DNA to evaluate the rate limitation of
photosynthesis under water stress. Plant Physiol. 103: 629-635.
Guo FO, Young J, Crawford NM. 2003. The nitrate transporter AtNRT1.1 (CHL1) functions in
stomatal opening and contributes to drought susceptibility in Arabidopsis. Plant Cell
15: 107-117.
Gutschick VP, Simonneau T. 2002. Modelling stomatal conductance of field-grown
sunflower under varying soil water content and leaf environment: Comparison of
three models of stomatal response to leaf environment and coupling with an abscisic
acid-based model of stomatal response to soil drying. Plant, Cell et Environment
25: 1423-1434.
Hafke JB, Hafke Y, Smith JAC, Luttge U, Thiel G. 2003. Vacuolar malate uptake is mediated
by an anion-selective inward rectifier. Plant Journal 35.
Halliwell B. 1991. Oxygen radicals: Their formation in plant tissues and their role in herbicide
damage. Herbcicides and photosynthesis. In Herbicides, Baker.N.R., Percival M.P. Eds.
Elsevier Science Publishers BV,: 87-97.
Halliwell B. 2006. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme
of aerobic life. Plant Physiology 141: 312-322.
Hanba YT, Shibasaka M, Hayashi Y, Hayakawa T, Kasamo K, Terashima I, Katsuhara M.
2004. Overexpression of the barley aquaporin HvPIP2;1 increases internal CO2
conductance and CO2 assimillation in the leaves of transgenic rice plants. Plant and
Cell Physiology 45: 521-529.
Hanstein SM, Felle HH. 2002. CO2-triggered chloride release from guard cells in intact fava
bean leaves. Kinetics of the onset of stomatal closure. Plant Physiology 130.
247
Harb A, Krishnan A, Ambavaram MMR, Pereira A. 2010. Molecular and physiological
analysis of drought stress in Arabidopsis reveals early responses leading to
acclimation in plant growth. Plant Physiology 154.
Harborne JB, Williams CA. 2000. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry
55: 481-504.
Hare PD, Cress WA, Van Staden J. 1998. Dissecting the roles of osmolyte accumulation
during stress. Plant, Cell et Environment 21: 535-553.
Haritatos E, Ayre BG, Turgeon R. 2000. Identification of phloem involved in assimilate
loading in leaves by the activity of the galactinol synthase promoter. Plant Physiology
123: 929-938.
Harley PC, Thomas RB, Reynolds JF, Strain BR. 1992. Modelling photosynthesis of cotton
grown in elevated CO2. Plant, Cell et Environment 15: 271-282.
Hashimoto M, Negi J, Young J, Israelsson M, Schroeder JI, Iba K. 2006. Arabidopsis HT1
kinase controls stomatal movements in response to CO2. Nature Cell Biology 8.
Haupt-Herting S, Fock HP. 2000. Exchange of oxygen and its role in energy dissipation during
drought stress in tomato plants. Physiologia Plantarum 110: 489-495.
Havaux M. 1993. Characterization of thermal-damage to the photosynthetic
electron-transport system in potato leaves. Plant Science 94.
Havaux M. 1998. Carotenoids as membrane stabilizers in chloroplasts. Trends in Plant
Science 3: 147-151.
Havaux M, Eymery Fo, Porfirova S, Rey P, Dörmann P. 2005. Vitamin E protects against
photoinhibition and photooxidative stress in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell
Online 17: 3451-3469.
Havaux M, Niyogi KK. 1999. The violaxanthin cycle protects plants from photooxidative
damage by more than one mechanism. Proceedings of the National Academy of
Sciences 96: 8762-8767.
Heckathorn SA, DeLucia EH, Zielinski RE. 1997. The contribution of drought-related
decreases in foliar nitrogen concentration to decreases in photosynthetic capacity
during and after drought in prairie grasses. Physiologia Plantarum 101.
Hedrich R, Marten I. 1993. Malate-induced feedback-regulation of plasma-membrane anion
channels could provide a CO2 sensor to guard-cells. Embo Journal 12.
Hedrich R, Neimanis S, Savchenko G, Felle HH, Kaiser WM, Heber U. 2001. Changes in
apoplastic pH and membrane potential in leaves in relation to stomatal responses to
CO2, malate, abscisic acid or interruption of water supply. Planta 213.
Hernandez I, Alegre L, Munne-Bosch S. 2004. Drought-induced changes in flavonoids and
other low molecular weight antioxidants in Cistus clusii grown under mediterranean
field conditions. Tree Physiology 24.
Hetherington AM, Woodward FI. 2003. The role of stomata in sensing and driving
environmental change. Nature 424.
Hikosaka K, Ishikawa K, Borjigidai A, Muller O, Onoda Y. 2006. Temperature acclimation of
photosynthesis: Mechanisms involved in the changes in temperature dependence of
photosynthetic rate. Journal of Experimental Botany 57: 291-302.
Hincha DK, Hagemann M. 2004. Stabilization of model membranes during drying by
compatible solutes involved in the stress tolerance of plants and microorganisms.
Biochemical Journal 383.
Hoffmann MH. 2002. Biogeography of Arabidopsis thaliana (L.) heynh. (Brassicaceae).
Journal of Biogeography 29: 125-134.
248
Hofmann J, Hess PH, Szakasits D, Bloechl A, Wieczorek K, Daxboeck-Horvath S, Bohlmann
H, van Bel AJE, Grundler FMW. 2009. Diversity and activity of sugar transporters in
nematode-induced root syncytia. Journal of Experimental Botany 60.
Hoganson CW, Babcock GT. 1997. A metalloradical mechanism for the generation of oxygen
from water in photosynthesis. Science 277.
Holbrook NM, Shashidhar VR, James RA, Munns R. 2002. Stomatal control in tomato with
ABA‐defi ie t oots: Respo se of g afted pla ts to soil d i g. Journal of
Holl CF, Heynhold G. 1842. Flora von sachsen. Dresden: Verlag von Justus Naumann.
Hopkins WG. 2003. Physiologie végétale. Edition De Boeck Université.
Horton P, Ruban A. 2005. Molecular design of the photosystem II light-harvesting antenna:
Photosynthesis and photoprotection. Journal of Experimental Botany 56: 365-373.
Horton P, Ruban AV, Walters RG. 1996. Regulation of light harvesting in green plants.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47: 655-684.
Hossain ABS, Sears RG, Cox TS, Paulsen GM. 1990. Desiccation tolerance and its relationship
to assimilate partitioning in winter-wheat. Crop Science 30.
Hosy E, Vavasseur A, Mouline K, Dreyer I, Gaymard F, Poree F, Boucherez J, Lebaudy A,
Bouchez D, Very AA, Simonneau T, Thibaud JB, Sentenac H. 2003. The Arabidopsis
outward K+ channel GORK is involved in regulation of stomatal movements and plant
transpiration (vol 100, pg 5549, 2003). Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 100.
Hoth S, Niedermeier M, Feuerstein A, Hornig J, Sauer N. 2010. An ABA-responsive element
in the AtSUC1 promoter is involved in the regulation of AtSUC1 expression. Planta
232: 911-923.
Hu H, Boisson-Dernier A, Israelsson-Nordstroem M, Boehmer M, Xue S, Ries A, Godoski J,
Kuhn JM, Schroeder JI. 2010. Carbonic anhydrases are upstream regulators of
CO2-controlled stomatal movements in guard cells. Nature Cell Biology 12.
Hummel I, Pantin F, Sulpice R, Piques M, Rolland G, Dauzat M, Christophe A, Pervent M,
Bouteille M, Stitt M, Gibon Y, Muller B. 2010. Arabidopsis plants acclimate to water
deficit at low cost through changes of carbon usage: An integrated perspective using
growth, metabolite, enzyme, and gene expression analysis. Plant Physiology
154: 357-372.
Ibanez H, Ballester A, Munoz R, Quiles MJ. 2010. Chlororespiration and tolerance to
drought, heat and high illumination. Journal of Plant Physiology 167: 732-738.
Igamberdiev AU, Bykova NV, Lea PJ, Gardeström P. 2001. The role of photorespiration in
redox and energy balance of photosynthetic plant cells: A study with a barley mutant
deficient in glycine decarboxylase. Physiologia Plantarum 111: 427-438.
Iino M, Ogawa T, Zeiger E. 1985. Kinetic-properties of the blue-light response of stomata.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82:
8019-8023.
Imlau A, Truernit E, Sauer N. 1999. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green
fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink
tissues. Plant Cell 11: 309-322.
Ingram J, Bartels D. 1996. The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annual
Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47.
249
Inoue S, Ejima K, Iwai E, Hayashi H, Appel J, Tyystjärvi E, Murata N, Nishiyama Y. 2011.
P ote tio
[α]-tocopherol of the repair of photosystem II during photoinhibition in
Synechocystis sp. Pcc 6803. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1807:
236-241.
Iordachescu M, Imai R. 2008. Trehalose biosynthesis in response to abiotic stresses. Journal
of Integrative Plant Biology 50.
Isbell HS, Frush HL, Martin ET. 1973. Reactions of carbohydrates with hydroperoxides.
Part 1. Oxidation of aldoses with sodium peroxide. Carbohydrate Research 26:
287-295.
Ishida H, Shimizu S, Makino A, Mae T. 1998. Light-dependent fragmentation of the large
subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in chloroplasts isolated
from wheat leaves. Planta 204: 305-309.
Israelsson M, Siegel RS, Young J, Hashimoto M, Iba K, Schroeder JI. 2006. Guard cell ABA
and CO2 signaling network updates and Ca2+ sensor priming hypothesis. Current
Opinion in Plant Biology 9.
Iturbe-Ormaetxe Ia, Escuredo PR, Arrese-Igor C, Becana M. 1998. Oxidative damage in pea
plants exposed to water deficit or paraquat. Plant Physiology 116: 173-181.
Jacob J, Lawlor DW. 1991. Stomatal and mesophyll limitations of photosynthesis in
phosphate deficient sunflower, maize and wheat plants. Journal of Experimental
Botany 42: 1003-1011.
Jang JC, Sheen J. 1997. Sugar sensing in higher plants. Trends in Plant Science 2: 208-214.
Jeannette E, Rona JP, Bardat F, Cornel D, Sotta B, Miginiac E. 1999. Induction of RAB18 gene
expression and activation of K+ outward rectifying channels depend on an
extracellular perception of ABA in Arabidopsis thaliana suspension cells. Plant Journal
18.
Jeong YC, Nakamura J, Upton PB, Swenberg JA. 2005. Pyrimido [1,2-a] -purin-10(3H)-one,
m1G, is less prone to artifact than base oxidation. Nucleic Acids Research 33:
6426-6434.
Jia H, Oguchi R, Hope A, Barber J, Chow W. 2008. Differential effects of severe water stress
on linear and cyclic electron fluxes through photosystem I in spinach leaf discs in
CO2-enriched air. Planta 228: 803-812.
Jiang F, Hartung W. 2008. Long-distance signalling of abscisic acid (ABA): The factors
regulating the intensity of the ABA signal. Journal of Experimental Botany 59: 37-43.
Johnson GN. 2005. Cyclic electron transport in C3 plants: Fact or artefact ? Journal of
Joliot P. 2003. Period-four oscillations of the flash-induced oxygen formation in
photosynthesis. Photosynthesis Research 76: 65-72.
Juergensen K, Scholz-Starke J, Sauer N, Hess P, van Bel AJ, Grundler FM. 2003. The
companion cell-specific Arabidopsis disaccharide carrier AtSUC2 is expressed in
nematode-induced syncytia. Plant Physiol 131: 61-69.
Jung S. 2004. Variation in antioxidant metabolism of young and mature leaves of Arabidopsis
thaliana subjected to drought. Plant Science 166: 459-466.
Junge W. 1999. ATP synthase and other motor proteins. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 96.
Kaldenhoff R, Fischer M. 2006. Aquaporins in plants. Acta Physiologica 187: 169-176.
Kameli A, Lösel DM. 1993. Carbohydrates and water status in wheat plants under water
stress. New Phytologist 125: 609-614.
250
Kamiya N, Shen JR. 2003. Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II from
Thermosynechococcus vulcanus at 3.7-angstrom resolution. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 100.
Kanechi M, Yamada J, Inagaki N, Maekawa S. 1998. Non-stomatal inhibition of
photosynthesis associated with partitioning of the recent assimilates into starch and
sucrose in sunflower leaves under water stress. Journal of the Japanese Society for
Horticultural Science 67: 190-197.
Kanoun M, Goulas P, Basseres A, Biolley JP. 2002. Ozone-induced oxidation of Rubisco:
From an ELISA quantification of carbonyls to putative pathways leading to oxidizing
mechanisms. Functional Plant Biology 29.
Kanwischer M, Porfirova S, Bergmuller E, Dormann P. 2005. Alterations in tocopherol
cyclase activity in transgenic and mutant plants of Arabidopsis affect tocopherol
content, tocopherol composition, and oxidative stress. Plant Physiology 137:
713-723.
Karakas B, OziasAkins P, Stushnoff C, Suefferheld M, Rieger M. 1997. Salinity and drought
tolerance of mannitol-accumulating transgenic tobacco. Plant Cell and Environment
20.
Karlsson PE. 1986. Blue-light regulation of stomata in wheat seedlings. II. Action spectrum
and search for action dichroism. Physiologia Plantarum 66: 207-210.
KAY R, CHAN A, DALY M, MCPHERSON J. 1987. Duplication of CaMV 35S promoter
sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science 236: 1299-1302.
Keles Y, Oncel I. 2002. Response of antioxidative defence system to temperature and water
stress combinations in wheat seedlings. Plant Science 163.
Keller F, Ludlow MM. 1993. Carbohydrate metabolism in drought-stressed leaves of
pigeonpea (Cajanus cajan). Journal of Experimental Botany 44: 1351-1359.
Kempa S, Krasensky J, Dal Santo S, Kopka J, Jonak C. 2008. A central role of abscisic acid in
stress-regulated carbohydrate metabolism. PLoS ONE 3.
Kim T-H, Böhmer M, Hu H, Nishimura N, Schroeder JI. 2010. Guard cell signal transduction
network: Advances in understanding abscisic acid, CO2, and Ca2+ signaling. Annual
Review of Plant Biology 61: 561-591.
Kinoshita T, Doi M, Suetsugu N, Kagawa T, Wada M, Shimazaki K. 2001. PHOT1 and PHOT2
mediate blue light regulation of stomatal opening. Nature 414: 656-660.
Kinoshita T, Emi T, Tominaga M, Sakamoto K, Shigenaga A, Doi M, Shimazaki K. 2003.
Blue-light- and phosphorylation-dependent binding of a 14-3-3 protein to
phototropins in stomatal guard cells of broad bean. Plant Physiology 133: 1453-1463.
Kinoshita T, Nishimura M, Shimazaki K. 1995. Cytosolic concentration of Ca2+ regulates the
plasma membrane H+-ATPase in guard cells of fava bean. The Plant Cell Online 7:
1333-1342.
Kinoshita T, Shimazaki K. 1999. Blue light activates the plasma membrane H+-ATPase by
phosphorylation of the C-terminus in stomatal guard cells. Embo Journal 18:
5548-5558.
Kinoshita T, Shimazaki K. 2002. Biochemical evidence for the requirement of 14-3-3 protein
binding in activation of the guard-cell plasma membrane H+-ATPase by blue light.
Plant and Cell Physiology 43: 1359-1365.
251
Klein M, Perfus-Barbeoch L, Frelet A, Gaedeke N, Reinhardt D, Mueller-Roeber B,
Martinoia E, Forestier C. 2003. The plant multidrug resistance ABC transporter
ATMRP5 is involved in guard cell hormonal signalling and water use. Plant Journal 33.
Klepek Y-S, Volke M, Konrad KR, Wippel K, Hoth S, Hedrich R, Sauer N. 2010. Arabidopsis
thaliana polyol/monosaccharide transporters 1 and 2: Fructose and xylitol/H+
symporters in pollen and young xylem cells. Journal of Experimental Botany 61 :
537-550.
Klepek YS, Geiger D, Stadler R, Klebl F, Landouar-Arsivaud L, Lemoine R, Hedrich R, Sauer
N. 2005. Arabidopsis polyol transporter 5, a new member of the monosaccharide
transporter-like superfamily, mediates H+-symport of numerous substrates, including
myo-inositol, glycerol, and ribose. Plant Cell 17: 204-218.
Kliebenstein DJ, Monde RA, Last RL. 1998. Superoxide dismutase in Arabidopsis : An eclectic
enzyme family with disparate regulation and protein localization. Plant Physiol 118 :
637-650.
Knight JS, Gray JC. 1994. Expression of genes encoding the tobacco chloroplast phosphate
translocator is not light-regulated and is repressed by sucrose. Molecular and General
Genetics MGG 242: 586-594.
Koch KE. 1996. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant
Kohzuma K, Cruz JA, Akashi K, Hoshiyasu S, Munekage YN, Yokota A, Kramer DM. 2009.
The long-term responses of the photosynthetic proton circuit to drought. Plant Cell
and Environment 32.
Koornneef M, Alonso-Blanco C, Vreugdenhil D. 2004. Naturally occurring genetic variation
in Arabidopsis thaliana. Annual Review of Plant Biology 55: 141-172.
Koornneef M, Reuling G, Karssen CM. 1984. The isolation and characterization of
abscisic-acid insensitive mutants of Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum 61:
377-383.
Kositsup B, Kasemsap P, Thanisawanyangkura S, Chairungsee N, Satakhun D,
Teerawatanasuk K, Ameglio T, Thaler P. 2010. Effect of leaf age and position on
light-saturated CO2 assimilation rate, photosynthetic capacity, and stomatal
conductance in rubber trees. Photosynthetica 48.
Kovermann P, Meyer S, Hoertensteiner S, Picco C, Scholz-Starke J, Ravera S, Lee Y,
Martinoia E. 2007. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the
ALMT family. Plant Journal 52.
Krah NM, Logan BA. 2010. Loss of psbs expression reduces vegetative growth, reproductive
output, and light-limited, but not light-saturated, photosynthesis in Arabidopsis
thaliana (Brassicaceae) grown in temperate light environments. American Journal of
Botany 97: 644-649.
Kramer D, Johnson G, Kiirats O, Edwards G. 2004. New fluorescence parameters for the
determination of QA redox state and excitation energy fluxes. Photosynthesis
Research 79: 209-218.
Kramer DM, Evans JR. 2011. The importance of energy balance in improving photosynthetic
productivity. Plant Physiology 155: 70-78.
Krapp A, Hofmann B, Schäfer C, Stitt M. 1993. Regulation of the expression of rbcS and
other photosynthetic genes by carbohydrates: A mechanism for the sink regulation of
photosynthesis ? The Plant Journal 3: 817-828.
252
Kuhlbrandt W, Wang DN, Fujiyoshi Y. 1994. Atomic model of plant light-harvesting complex
by electron crystallography. Nature 367: 614-621.
Kurisu G, Zhang HM, Smith JL, Cramer WA. 2003. Structure of the cytochrome b(6)f complex
of oxygenic photosynthesis: Tuning the cavity. Science 302.
Kushiro T, Okamoto M, Nakabayashi K, Yamagishi K, Kitamura S, Asami T, Hirai N, Koshiba
T, Kamiya Y, Nambara E. 2004. The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes
ABA 8 '-hydroxylases: Key enzymes in ABA catabolism. Embo Journal 23: 1647-1656.
Labate CA, Leegood RC. 1988. Limitation of photosynthesis by changes in temperature
factors affecting the response of carbon-dioxide assimilation to temperature in
barley leaves. Planta 173: 519-527.
Laisk A, Eichelmann H, Oja V, Rasulov B, Padu E, Bichele I, Pettai H, Kull O. 2005.
Adjustment of leaf photosynthesis to shade in a natural canopy: Rate parameters.
Plant Cell and Environment 28.
Lake. 2004. Gas exchange: New challenges with Arabidopsis. New Phytologist 162: 1-3.
Lake JA, Woodward FI, Quick WP. 2002. Long-distance CO2 signalling in plants. Journal of
Lalonde S, Boles E, Hellmann H, Barker L, Patrick JW, Frommer WB, Ward JM. 1999. The
dual function of sugar carriers: Transport and sugar sensing. The Plant Cell Online 11:
707-726.
Lalonde S, Tegeder M, Throne-Holst M, Frommer WB, Patrick JW. 2003. Phloem loading
and unloading of sugars and amino acids. Plant, Cell et Environment 26: 37-56.
Lalonde S, Wipf D, Frommer WB. 2004. Transport mechanisms for organic forms of carbon
and nitrogen between source and sink. Annual Review of Plant Biology 55: 341-372.
Larsson M, Larsson CM, Whitford PN, Clarkson DT. 1989. Influence of osmotic-stress on
nitrate reductase-activity in wheat (Triticum-aestivum L.) and the role of
abscisic-acid. Journal of Experimental Botany 40.
Lawlor D 1995. The effects of water deficit on photosynthesis. In: O. B. S. Publishers ed.
Environment and plant metabolism, 129–160.
Lawlor DW. 1976. Water stress-induced changes in photosynthesis, photorespiration,
respiration and CO2 compensation concentration of wheat. Photosynthetica 10:
378-387.
Lawlor DW. 2002. Limitation to photosynthesis in water-stressed leaves: Stomata vs.
Metabolism and the role of ATP. Ann Bot 89: 871-885.
Lawlor DW, Cornic G. 2002. Photosynthetic carbon assimilation and associated metabolism
in relation to water deficits in higher plants. Plant, Cell et Environment 25: 275-294.
Lawlor DW, Fock H. 1977. Photosynthetic assimilation of 14CO2 by waterstressed sunflower
leaves at two O2 concentrations and the specific activity of products. Journal of
Lebaudy A, Vavasseur A, Hosy E, Dreyer I, Leonhardt N, Thibaud J-B, Very A-A, Simonneau
T, Sentenac H. 2008. Plant adaptation to fluctuating environment and biomass
production are strongly dependent on guard cell potassium channels. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 105.
Lebaudy A, Véry A-A, Sentenac H. 2007. K+ channel activity in plants: Genes, regulations and
functions. FEBS Letters 581: 2357-2366.
Lee KH, Piao HL, Kim HY, Choi SM, Jiang F, Hartung W, Hwang I, Kwak JM, Lee IJ. 2006.
Activation of glucosidase via stress-induced polymerization rapidly increases active
pools of abscisic acid. Cell 126: 1109-1120.
253
Lee M, Choi Y, Burla B, Kim Y-Y, Jeon B, Maeshima M, Yoo J-Y, Martinoia E, Lee Y. 2008.
The ABC transporter AtABCB14 is a malate importer and modulates stomatal
response to CO2. Nature Cell Biology 10.
Leitao L, Dizengremel P, Biolley J-P. 2008. Foliar CO2 fixation in bean (Phaseolus vulgaris L.)
submitted to elevated ozone: Distinct changes in Rubisco and PePc activities in
relation to pigment content. Ecotoxicology and Environmental Safety 69.
Lejay L, Wirth J, Pervent M, Cross JM-F, Tillard P, Gojon A. 2008. Oxidative pentose
phosphate pathway-dependent sugar sensing as a mechanism for regulation of root
ion transporters by photosynthesis. Plant Physiology 146.
Lempe J, Balasubramanian S, Sureshkumar S, Singh A, Schmid M, Weigel D. 2005. Diversity
of flowering responses in wild Arabidopsis thaliana strains. Plos Genetics 1: 109-118.
LeonKloosterziel KM, Gil MA, Ruijs GJ, Jacobsen SE, Olszewski NE, Schwartz SH, Zeevaart
JAD, Koornneef M. 1996. Isolation and characterization of abscisic acid-deficient
Arabidopsis mutants at two new loci. Plant Journal 10.
Li J, Ou-Lee TM, Raba R, Amundson RG, Last RL. 1993. Arabidopsis flavonoid mutants are
hypersensitive to UV-B irradiation. The Plant Cell Online 5: 171-179.
Li P, Ainsworth EA, Leakey ADB, Ulanov A, Lozovaya V, Ort DR, Bohnert HJ. 2008.
Arabidopsis transcript and metabolite profiles: Ecotype-specific responses to open-air
elevated CO2. Plant Cell and Environment 31.
Li W, Zhang C, Lu Q, Wen X, Lu C. 2011. The combined effect of salt stress and heat shock on
proteome profiling in Suaeda salsa. Journal of Plant Physiology 168.
Li X-P, Bjorkman O, Shih C, Grossman AR, Rosenquist M, Jansson S, Niyogi KK. 2000. A
pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting.
Nature 403: 391-395.
Li X-P, Gilmore AM, Caffarri S, Bassi R, Golan T, Kramer D, Niyogi KK. 2004. Regulation of
photosynthetic light harvesting involves intrathylakoid lumen pH sensing by the PsbS
protein. Journal of Biological Chemistry 279: 22866-22874.
Li X-P, Müller-Moulé P, Gilmore AM, Niyogi KK. 2002. PsbS-dependent enhancement of
feedback de-excitation protects photosystem II from photoinhibition. Proceedings of
the National Academy of Sciences 99: 15222-15227.
Ling Q, Huang W, Jarvis P. 2011. Use of a spad-502 meter to measure leaf chlorophyll
concentration in Arabidopsis thaliana. Photosynthesis Research 107: 209-214.
Liu F, Jensen CR, Andersen MN. 2004. Drought stress effect on carbohydrate concentration
in soybean leaves and pods during early reproductive development: Its implication in
altering pod set. Field Crops Research 86: 1-13.
Lo Bianco R, Rieger M, Sung SJS. 2000. Effect of drought on sorbitol and sucrose metabolism
in sinks and sources of peach. Physiologia Plantarum 108.
Lobin W 1983. The occurrence of Arabidopsis thaliana in the Cape Verde Islands. In:
Arabidopsis Information Service. 119-123.
Logan B A, Terry S G, Niyogi K K. 2008. Arabidopsis genotypes with differing levels of PsbS
expression differ in photosystem II quantum yield, xanthophyll cycle pool size, and
aboveground growth. International Journal of Plant Sciences 169: 597-604.
Loggini B, Scartazza A, Brugnoli E, Navari-Izzo F. 1999. Antioxidative defense system,
pigment composition, and photosynthetic efficiency in two wheat cultivars subjected
to drought. Plant Physiology 119.
254
Long SP, Bernacchi CJ. 2003. Gas exchange measurements, what can they tell us about the
underlying limitations to photosynthesis ? Procedures and sources of error. J. Exp.
Bot. 54: 2393-2401.
Loreto F, Centritto M, Chartzoulakis K. 2003. Photosynthetic limitations in olive cultivars
with different sensitivity to salt stress. Plant Cell and Environment 26.
Lu C, Zhang J. 1998. Effects of water stress on photosynthesis, chlorophyll fluorescence and
photoinhibition in wheat plants. Functional Plant Biology 25: 883-892.
Lu P, Outlaw WH, Smith BG, Freed GA. 1997. A new mechanism for the regulation of
stomatal aperture size in intact leaves - accumulation of mesophyll-derived sucrose
in the guard-cell wall of Vicia faba. Plant Physiology 114.
Luna CM, Pastori GM, Driscoll S, Groten K, Bernard S, Foyer CH. 2005. Drought controls on
H2O2 accumulation, catalase (CAT) activity and cat gene expression in wheat. Journal
of Experimental Botany 56.
Ma Y, Szostkiewicz I, Korte A, Moes D, Yang Y, Christmann A, Grill E. 2009. Regulators of
PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science 324.
Mackinney G. 1941. Absorption of light by chlorophyll solutions. Journal of Biological
Chemistry 140: 315-322.
MacRobbie EAC. 1998. Signal transduction and ion channels in guard cells. Philosophical
Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences 353:
1475-1488.
Majumdar S, Ghosh S, Glick BR, Dumbroff EB. 1991. Activities of chlorophyllase,
phosphoenolpyruvate carboxylase and ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase in the
primary leaves of soybean during senescence and drought. Physiologia Plantarum 81.
Marin E, Nussaume L, Quesada A, Gonneau M, Sotta B, Hugueney P, Frey A, MarionPoll A.
1996. Molecular identification of zeaxanthin epoxidase of Nicotiana plumbaginifolia,
a gene involved in abscisic acid biosynthesis and corresponding to the ABA locus of
Arabidopsis thaliana. Embo Journal 15.
Markwell J, Osterman J, Mitchell J. 1995. Calibration of the Minolta SPAD-502 leaf
chlorophyll meter. Photosynthesis Research 46: 467-472.
Martin T, Hellmann H, Schmidt R, Willmitzer L, Frommer WB. 1997. Identification of
mutants in metabolically regulated gene expression. The Plant Journal 11: 53-62.
Massacci A, Nabiev SM, Pietrosanti L, Nematov SK, Chernikova TN, Thor K, Leipner J. 2008.
Response of the photosynthetic apparatus of cotton (Gossypium hirsutum) to the
onset of drought stress under field conditions studied by gas-exchange analysis and
chlorophyll fluorescence imaging. Plant Physiology and Biochemistry 46: 189-195.
Maxwell K, Johnson GN. 2000. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51:
659-668.
McKay JK, Richards JH, Nemali KS, Sen S, Mitchell-Olds T, Boles S, Stahl EA, Wayne T,
Juenger TE. 2008. Genetics of drought adaptation in Arabidopsis thaliana. QTL
analysis of a new mapping population, Kas-1 x Tsu-1. Evolution 62: 3014-3026.
McKersie BD, Bowley SR, Harjanto E, Leprince O. 1996. Water-deficit tolerance and field
performance of transgenic Alfalfa overexpressing superoxide dismutase. Plant
Physiology 111.
Medici A. 2011. Les gènes de transporteurs de sucres dans la réponse au déficit hydrique et
le rôle des protéines ASR da s la gulatio de l’e p essio du g e du transporteur
d’he oses VVHT1 chez la vigne (Vitis vinifera). Université de Poitiers.
255
Medrano H, Escalona JM, Bota J, Flexas J. 2002. Regulation of photosynthesis of C3 plants in
response to progressive drought: Stomatal conductance as a reference parameter.
Annals of Botany 89: 895-905.
Medrano H, Parry MAJ, Socias X, Lawlor DW. 1997. Long term water stress inactivates
Rubisco in subterranean clover. Annals of Applied Biology 131: 491-501.
Messinger SM, Buckley TN, Mott KA. 2006. Evidence for involvement of photosynthetic
processes in the stomatal response to CO2. Plant Physiology 140: 771-778.
Meyer S, Genty B. 1999. Heterogeneous inhibition of photosynthesis over the leaf surface of
Rosa rubiginosa L. During water stress and abscisic acid treatment: Induction of a
metabolic component by limitation of CO2 diffusion. Planta 210: 126-131.
Meyer S, Lauterbach C, Niedermeier M, Barth I, Sjolund RD, Sauer N. 2004. Wounding
enhances expression of AtSUC3, a sucrose transporter from Arabidopsis sieve
elements and sink tissues. Plant Physiol 134: 684-693.
Meyer S, Melzer M, Truernit E, Hummer C, Besenbeck R, Stadler R, Sauer N. 2000. AtSUC3,
a gene encoding a new Arabidopsis sucrose transporter, is expressed in cells adjacent
to the vascular tissue and in a carpel cell layer. Plant J 24: 869-882.
Milla MAR, Maurer A, Huete AR, Gustafson JP. 2003. Glutathione peroxidase genes in
Arabidopsis are ubiquitous and regulated by abiotic stresses through diverse
signaling pathways. Plant Journal 36: 602-615.
Mitchell P. 1966. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation.
Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 41.
Mittler R. 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci 7:
405-410.
Mittler R, Zilinskas BA. 1994. Regulation of pea cytosolic ascorbate peroxidase and other
antioxidant enzymes during the progression of drought stress and following recovery
from drought. Plant Journal 5: 397-405.
Miyao M, Ikeuchi M, Yamamoto N, Ono T. 1995. Specific degradation of the D1 protein of
photosystem II by treatment with hydrogen peroxide in darkness: Implications for
the mechanism of degradation of the D1 protein under illumination. Biochemistry 34:
10019-10026.
Mochizuki N, Brusslan JA, Larkin R, Nagatani A, Chory J. 2001. Arabidopsis genomes
uncoupled 5 (GUN5) mutant reveals the involvement of Mg-Chelatase H subunit in
plastid-to-nucleus signal transduction. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 98: 2053-2058.
Moller IM, Jensen PE, Hansson A. 2007. Oxidative modifications to cellular components in
plants. Annual Review of Plant Biology 58: 459-481.
Monda K, Negi J, Iio A, Kusumi K, Kojima M, Hashimoto M, Sakakibara H, Iba K. 2011.
Environmental regulation of stomatal response in the Arabidopsis Cvi-0 ecotype.
Planta 234: 555-563.
Moore BD, Cheng SH, Sims D, Seemann JR. 1999. The biochemical and molecular basis for
photosynthetic acclimation to elevated atmospheric CO2. Plant, Cell et Environment
22: 567-582.
Moran JF, Becana M, Iturbe-Ormaetxe I, Frechilla S, Klucas RV, Aparicio-Tejo P. 1994.
Drought induces oxidative stress in pea plants. Planta 194: 346-352.
Morgan JM. 1984. Osmoregulation and water stress in higher plants. Annual Review of Plant
256
Morison JIL, Gallouët E, Lawson T, Cornic G, Herbin R, Baker NR. 2005. Lateral diffusion of
CO2 in leaves is not sufficient to support photosynthesis. Plant Physiology 139:
254-266.
Mott KA, Sibbernsen ED, Shope JC. 2008. The role of the mesophyll in stomatal responses to
light and CO2. Plant Cell and Environment 31.
Mueller MJ. 2004. Archetype signals in plants: The phytoprostanes. Current Opinion in Plant
Biology 7: 441-448.
Müller P, Li X-P, Niyogi KK. 2001. Non-photochemical quenching. A response to excess light
energy. Plant Physiology 125: 1558-1566.
Munekage YN, Genty B, Peltier G. 2008. Effect of PGR5 impairment on photosynthesis and
growth in Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology 49: 1688-1698.
Munne-Bosch S. 2005. The role of alpha-tocopherol in plant stress tolerance. Journal of
Plant Physiology 162.
Munne-Bosch S, Jubany-Mari T, Alegre L. 2003. Enhanced photo- and antioxidative
protection, and hydrogen peroxide accumulation in drought-stressed Cistus clusii and
Cistus albidus plants. Tree Physiology 23.
Munne-Bosch S, Penuelas J. 2004. Drought-induced oxidative stress in strawberry tree
(Arbutus unedo L.) growing in mediterranean field conditions. Plant Science 166.
Murchie EH, Niyogi KK. 2011. Manipulation of photoprotection to improve plant
photosynthesis. Plant Physiology 155: 86-92.
Mustilli AC, Merlot S, Vavasseur A, Fenzi F, Giraudat J. 2002. Arabidopsis OST1 protein
kinase mediates the regulation of stomatal aperture by abscisic acid and acts
upstream of reactive oxygen species production. Plant Cell 14.
Nakano R, Ishida H, Makino A, Mae T. 2006. In vivo fragmentation of the large subunit of
ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase by reactive oxygen species in an intact leaf of
cucumber under chilling-light conditions. Plant and Cell Physiology 47: 270-276.
Nambara E, Marion-Poll A 2005. Abscisic acid biosynthesis and catabolism. Annual review of
plant biology. Palo Alto: Annual Reviews, 165-185.
Negi J, Matsuda O, Nagasawa T, Oba Y, Takahashi H, Kawai-Yamada M, Uchimiya H,
Hashimoto M, Iba K. 2008. CO2 regulator SLAC1 and its homologues are essential for
anion homeostasis in plant cells. Nature 452.
Netting AG. 2000. PH, abscisic acid and the integration of metabolism in plants under
stressed and non•stressed conditions: Cellular responses to stress and their
implication for plant water relations. Journal of Experimental Botany 51: 147-158.
Niinemets U, Kull O, Tenhunen JD. 1998. An analysis of light effects on foliar morphology,
physiology, and light interception in temperate deciduous woody species of
contrasting shade tolerance. Tree Physiology 18: 681-696.
Niinemets U, Diaz-Espejo A, Flexas J, Galmes J, Warren CR. 2009. Role of mesophyll
diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the
field. Journal of Experimental Botany 60: 2249-2270.
Nilkens M, Kress E, Lambrev P, Miloslavina Y, Müller M, Holzwarth AR, Jahns P. 2010.
Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of
non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under
steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)
Bioenergetics 1797: 466-475.
Niyogi KK. 1999. Photoprotection revisited: Genetic and molecular approaches. Annual
Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50.
257
Niyogi KK, Grossman AR, Bjorkman O. 1998. Arabidopsis mutants define a central role for
the xanthophyll cycle in the regulation of photosynthetic energy conversion. Plant
Cell 10: 1121-1134.
Niyogi KK, Li X-P, Rosenberg V, Jung H-S. 2005. Is PsbS the site of non-photochemical
quenching in photosynthesis ? Journal of Experimental Botany 56: 375-382.
Noctor G, Arisi ACM, Jouanin L, Foyer CH. 1999. Photorespiratory glycine enhances
glutathione accumulation in both the chloroplastic and cytosolic compartments.
Journal of Experimental Botany 50: 1157-1167.
Noctor G, Foyer CH. 1998. Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49.
Noctor G, Veljovic-•Jovanic S, Driscoll S, Novitskaya L, Foyer CH. 2002. Drought and
oxidative load in the leaves of C3 plants: A predominant role for photorespiration ?
Noiraud N, Maurousset L, Lemoine R. 2001. Transport of polyols in higher plants. Plant
Physiology and Biochemistry 39: 717-728.
Nordborg M, Bergelson J. 1999. The effect of seed and rosette cold treatment on
germination and flowering time in some Arabidopsis thaliana (Brassicaceae)
ecotypes. American Journal of Botany 86: 470-475.
Nørholm MHH, Nour-Eldin HH, Brodersen P, Mundy J, Halkier BA. 2006. Expression of the
Arabidopsis high-affinity hexose transporter STP13 correlates with programmed cell
death. FEBS Letters 580: 2381-2387.
O'Kane SL, Al-Shehbaz IA. 2003. Phylogenetic position and generic limits of Arabidopsis
(Brassicaceae) based on sequences of nuclear ribosomal DNA. Annals of the Missouri
Botanical Garden 90: 603-612.
Ocheretina O, Haferkamp I, Tellioglu H, Scheibe R. 2000. Light-modulated NADP-malate
dehydrogenases from mossfern and green algae: Insights into evolution of the
enzyme's regulation. Gene 258: 147-154.
Ogren WL. 1984. Photorespiration - pathways, regulation, and modification. Annual Review
of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 35.
Okada K, Ikeuchi M, Yamamoto N, Ono TA, Miyao M. 1996. Selective and specific cleavage
of the D1 and D2 proteins of photosystem II by exposure to singlet oxygen: Factors
responsible for the susceptibility to cleavage of the proteins. Biochimica Et Biophysica
Acta-Bioenergetics 1274: 73-79.
Okamoto M, Tanaka Y, Abrams SR, Kamiya Y, Seki M, Nambara E. 2009. High humidity
induces abscisic acid 8 '-hydroxylase in stomata and vasculature to regulate local and
systemic abscisic acid responses in Arabidopsis. Plant Physiology 149: 825-834.
Okamura M, Feher G, Blankenship R, Madigan M, Bauer C 2004. Proton-coupled electron
transfer reactions of QB ; in reaction centers from photosynthetic bacteria anoxygenic
photosynthetic bacteria. Springer Netherlands, 577-593.
Okegawa Y, Kagawa Y, Kobayashi Y, Shikanai T. 2008. Characterization of factors affecting
the activity of photosystem I cyclic electron transport in chloroplasts. Plant and Cell
Physiology 49.
Olsen RL, Pratt RB, Gump P, Kemper A, Tallman G. 2002. Red light activates a
chloroplast-dependent ion uptake mechanism for stomatal opening under reduced
CO2 concentrations in Vicia spp. New Phytologist 153: 497-508.
Oquist G, Chow WS, Anderson JM. 1992. Photoinhibition of photosynthesis represents a
mechanism for the long-term regulation of photosystem-II. Planta 186.
258
Ort D, Oxborough K, Wise R 1994. Depressions of photosynthesis in crops with water
deficits.In N. R. B. J. R. Bowyer. Photoinhibition of Photosynthesis: Bios Scientific
Publishers, Oxford. 315–329.
Osmond B, Badger M, Maxwell K, Björkman O, Leegood R. 1997. Too many photons:
Photorespiration, photoinhibition and photooxidation. Trends in Plant Science 2:
119-121.
Pachauri RK, Reisinger A 2007. Giec, 2007 : Bilan 2007 des changements climatiques.
Contribution des groupes de travail I, II et III au quatrième rapport d’ valuatio du
g oupe d’e pe ts i te gouve e e tal su l’ volutio du li at.I . Ge ve, Suisse.
103 pages.
Pandey S, Nelson DC, Assmann SM. 2009. Two novel GPCR-type G proteins are abscisic acid
receptors in Arabidopsis. Cell 136: 136-148.
Pandey S, Zhang W, Assmann SM. 2007. Roles of ion channels and transporters in guard cell
signal transduction. Febs Letters 581.
Park H, Kreunen SS, Cuttriss AJ, DellaPenna D, Pogson BJ. 2002. Identification of the
carotenoid isomerase provides insight into carotenoid biosynthesis, prolamellar body
formation, and photomorphogenesis. Plant Cell 14: 321-332.
Park S-Y, Fung P, Nishimura N, Jensen DR, Fujii H, Zhao Y, Lumba S, Santiago J, Rodrigues A,
Chow T-fF, Alfred SE, Bonetta D, Finkelstein R, Provart NJ, Desveaux D, Rodriguez
PL, McCourt P, Zhu J-K, Schroeder JI, Volkman BF, Cutler SR. 2009. Abscisic acid
inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of start proteins.
Science 324: 1068-1071.
Parkinson KJ, Day W, Leach JE. 1980. A portable system for measuring the photosynthesis
and transpiration of graminaceous leaves. Journal of Experimental Botany 31:
1441-1453.
Parry MAJ, Andralojc PJ, Khan S, Lea PJ, Keys AJ. 2002. Rubisco activity: Effects of drought
stress. Annals of Botany 89: 833-839.
Parry MAJ, Delgado E, Vadell J, Keys AJ, Lawlor DW, Medrano H. 1993. Water-stress and
the diurnal activity of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase in field-grown Nicotiana
tabacum genotypes selected for survival at low CO2 concentrations. Plant Physiology
and Biochemistry 31: 113-120.
Passardi F, Dobias J, Valerio L, Guimil S, Penel C, Dunand C. 2007. Morphological and
physiological traits of three major Arabidopsis thaliana accessions. Journal of Plant
Patonnier MP, Peltier JP, Marigo G. 1999. Drought-induced increase in xylem malate and
mannitol concentrations and closure of Fraxinus excelsior L. stomata. Journal of
Patrick JW. 1990. Sieve element unloading - cellular pathway, mechanism and control.
Physiologia Plantarum 78.
Patrick JW. 1997. Phloem unloading: Sieve element unloading and post-sieve element
transport. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48.
Paul MJ, Foyer CH. 2001. Sink regulation of photosynthesis. Journal of Experimental Botany
52: 1383-1400.
Pedron J, Brault M, Nake C, Miginiac E. 1998. Detection of abscisic-acid-binding proteins in
the microsomal protein fraction of Arabidopsis thaliana with abscisic-acid-protein
conjugates used as affinity probes. European Journal of Biochemistry 252: 385-390.
259
Peeva V, Cornic G. 2009. Leaf photosynthesis of Haberlea rhodopensis before and during
drought. Environmental and Experimental Botany 65: 310-318.
Pego JV, Kortstee AJ, Huijser C, Smeekens SCM. 2000. Photosynthesis, sugars and the
regulation of gene expression. Journal of Experimental Botany 51: 407-416.
Pei ZM, Kuchitsu K, Ward JM, Schwarz M, Schroeder JI. 1997. Differential abscisic acid
regulation of guard cell slow anion channels in Arabidopsis wild-type and abi1 and
abi2 mutants. Plant Cell 9.
Pei ZM, Murata Y, Benning G, Thomine S, Klusener B, Allen GJ, Grill E, Schroeder JI. 2000.
Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in
guard cells. Nature 406: 731-734.
Peiter E, Maathuis FJM, Mills LN, Knight H, Pelloux J, Hetherington AM, Sanders D. 2005.
The vacuolar Ca2+-activated channel TPC1 regulates germination and stomatal
movement. Nature 434.
Pelleschi S, Rocher JP, Prioul JL. 1997. Effect of water restriction on carbohydrate
metabolism and photosynthesis in mature maize leaves. Plant Cell and Environment
20.
Peltier G, Cournac L. 2002. Chlororespiration. Annual Review of Plant Biology 53: 523-550.
Perchepied L, Balague C, Riou C, Claudel-Renard C, Riviere N, Grezes-Besset B, Roby D.
2010. Nitric oxide participates in the complex interplay of defense-related signaling
pathways controlling disease resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Arabidopsis
thaliana. Molecular Plant-Microbe Interactions 23.
Piel C, Frak E, Le Roux X, Genty B. 2002. Effect of local irradiance on CO2 transfer
conductance of mesophyll in walnut. Journal of Experimental Botany 53.
Pierce J, Lorimer GH, Reddy GS. 1986. Kinetic mechanism of ribulosebisphosphate
carboxylase - evidence for an ordered, sequential reaction. Biochemistry 25.
Pietta P-G 2000. Flavonoids as antioxidants.In: Journal of natural products. 1035-1042.
Pilon-Smits E, Ebskamp M, Paul MJ, Jeuken M, Weisbeek PJ, Smeekens S. 1995. Improved
performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress. Plant
Pinheiro HA, DaMatta FM, Chaves ARM, Fontes EPB, Loureiro ME. 2004. Drought tolerance
in relation to protection against oxidative stress in clones of Coffea canephora
subjected to long-term drought. Plant Science 167.
Pogson B, McDonald KA, Truong M, Britton G, DellaPenna D. 1996. Arabidopsis carotenoid
mutants demonstrate that lutein is not essential for photosynthesis in higher plants.
Plant Cell 8: 1627-1639.
Pons T. 2012. Interaction of temperature and irradiance effects on photosynthetic
acclimation in two accessions of Arabidopsis thaliana. Photosynthesis Research: 1-13.
Pons TL, Flexas J, von Caemmerer S, Evans JR, Genty B, Ribas-Carbo M, Brugnoli E. 2009.
Estimating mesophyll conductance to CO2: Methodology, potential errors, and
recommendations. Journal of Experimental Botany 60: 2217-2234.
Portis AR. 1992. Regulation of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activity.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43: 415-437.
Portis AR. 1995. The regulation of Rubisco by Rubisco activase. Journal of Experimental
Botany 46: 1285-1291.
Portis AR, Jr., Li C, Wang D, Salvucci ME. 2008. Regulation of Rubisco activase and its
interaction with Rubisco. Journal of Experimental Botany 59.
260
Poschet G, Hannich B, Büttner M. 2010. Identification and characterization of AtSTP14, a
novel galactose transporter from Arabidopsis. Plant Cell Physiol 51: 1571-1580.
Poulson ME, Boeger MR, Donahue RA. 2006. Response of photosynthesis to high light and
drought for Arabidopsis thaliana grown under a UV-B enhanced light regime.
Photosynth Res 90: 79-90.
Pourtau N, Mares M, Purdy S, Quentin N, Ruel A, Wingler A. 2004. Interactions of abscisic
acid and sugar signalling in the regulation of leaf senescence. Planta 219.
Powles SB, Critchley C. 1980. Effect of light-intensity during growth on photoinhibition of
intact attached bean leaflets. Plant Physiology 65: 1181-1187.
Priault P, Fresneau C, Noctor G, De Paepe R, Cornic G, Streb P. 2006. The mitochondrial
CMSII mutation of Nicotiana sylvestris impairs adjustment of photosynthetic carbon
assimilation to higher growth irradiance. Journal of Experimental Botany 57: 20752085.
Price GD, Voncaemmerer S, Evans JR, Yu JW, Lloyd J, Oja V, Kell P, Harrison K, Gallagher A,
Badger MR. 1994. Specific reduction of chloroplast carbonic-anhydrase activity by
antisense RNA in transgenic tobacco plants has a minor effect on photosynthetic CO2
assimilation. Planta 193.
Pruzinska A, Tanner G, Aubry S, Anders I, Moser S, Muller T, Ongania KH, Krautler B, Youn
JY, Liljegren SJ, Hortensteiner S. 2005. Chlorophyll breakdown in senescent
Arabidopsis leaves. Characterization of chlorophyll catabolites and of chlorophyll
catabolic enzymes involved in the degreening reaction. Plant Physiology 139: 52-63.
Qin Y, Leydon AR, Manziello A, Pandey R, Mount D, Denic S, Vasic B, Johnson MA,
Palanivelu R. 2009. Penetration of the stigma and style elicits a novel transcriptome
in pollen tubes, pointing to genes critical for growth in a pistil. Plos Genetics 5.
Quick P, Neuhaus H 1997. The regulation and control of photosynthetic carbon assimilation.
A molecular approach to primary metabolism in higher plants, 41-62.
Quick P, Siegl G, Neuhaus E, Feil R, Stitt M. 1989. Short-term water-stress leads to a
stimulation of sucrose synthesis by activating sucrose-phosphate synthase. Planta
177.
Quick WP, Chaves MM, Wendler R, David M, Rodrigues ML, Passaharinho JA, Pereira JS,
Adcock MD, Leegood RC, Stitt M. 1992. The effect of water stress on photosynthetic
carbon metabolism in four species grown under field conditions. Plant, Cell and
Radmer RJ, Kok B. 1976. Photoreduction of O2 primes and replaces CO2 assimilation. Plant
Physiol 58: 336-340.
Radochová B, Tichá I. 2008. Excess irradiance causes early symptoms of senescence during
leaf expansion in photoautotrophically in vitro grown tobacco plants. Photosynthetica
46: 471-475.
Raghavendra AS, Padmasree K. 2003. Beneficial interactions of mitochondrial metabolism
with photosynthetic carbon assimilation. Trends in Plant Science 8: 546-553.
Rao MV, Davis KR. 1999. Ozone-induced cell death occurs via two distinct mechanisms in
Arabidopsis: The role of salicylic acid. Plant Journal 17.
Raschke K, Shabahang M, Wolf R. 2003. The slow and the quick anion conductance in whole
guard cells: Their voltage-dependent alternation, and the modulation of their
activities by abscisic acid and CO2. Planta 217.
261
Ratnayaka HH, Molin WT, Sterling TM. 2003. Physiological and antioxidant responses of
cotton and spurred anoda under interference and mild drought. Journal of
Reinbothe S, Reinbothe C, Parthier B. 1991. Glucose repression of chloroplast development
in Euglena-gracilis. Plant Physiology and Biochemistry 29: 297-307.
Reinders A, Panshyshyn JA, Ward JM. 2005. Analysis of transport activity of Arabidopsis
sugar alcohol permease homolog AtPLT5. J Biol Chem 280: 1594-1602.
Renou J-L, Gerbaud A, Just D, André M. 1990. Differing substomatal and chloroplastic CO2
concentrations in water-stressed wheat. Planta 182: 415-419.
Rizhsky L, Liang HJ, Mittler R. 2002. The combined effect of drought stress and heat shock
on gene expression in tobacco. Plant Physiology 130.
Rizhsky L, Liang HJ, Shuman J, Shulaev V, Davletova S, Mittler R. 2004. When defense
pathways collide. The response of Arabidopsis to a combination of drought and heat
stress. Plant Physiology 134: 1683-1696.
Roelfsema MRG, Hedrich R. 2005. In the light of stomatal opening: New insights into 'the
watergate'. New Phytologist 167.
Rohde P, Hincha DK, Heyer AG. 2004. Heterosis in the freezing tolerance of crosses between
two Arabidopsis thaliana accessions (Columbia-0 and C24) that show differences in
non-acclimated and acclimated freezing tolerance. The Plant Journal 38: 790-799.
Roitsch T. 1999. Source-sink regulation by sugar and stress. Current Opinion in Plant Biology
2: 198-206.
Rolland F, Baena-Gonzalez E, Sheen J. 2006. Sugar sensing and signaling in plants:
Conserved and novel mechanisms. Annual Review of Plant Biology 57: 675-709.
Rook F, Gerrits N, Kortstee A, van Kampen M, Borrias M, Weisbeek P, Smeekens S. 1998.
Sucrose-specific signalling represses translation of the Arabidopsis ATB2 BZIP
transcription factor gene. Plant Journal 15.
Rook F, Hadingham SA, Li Y, Bevan MW. 2006. Sugar and ABA response pathways and the
control of gene expression. Plant, Cell et Environment 29: 426-434.
Rouhi V, Samson R, Lemeur R, Van Damme P. 2007. Photosynthetic gas exchange
characteristics in three different almond species during drought stress and
subsequent recovery. Environmental and Experimental Botany 59: 117-129.
Saccardy K, Pineau B, Roche O, Cornic G. 1998. Photochemical efficiency of photosystem II
and xanthophyll cycle components in Zea mays leaves exposed to water stress and
high light. Photosynthesis Research 56: 57-66.
Sack L, Holbrook NM. 2006. Leaf hydraulics. Annual Review of Plant Biology 57: 361-381.
Sage R. 1994. Acclimation of photosynthesis to increasing atmospheric CO2: The gas
exchange perspective. Photosynthesis Research 39: 351-368.
Sage RF. 1990. A model describing the regulation of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase,
electron transport, and triose phosphate use in response to light intensity and CO2 in
C3 plants. Plant Physiology 94: 1728-1734.
Sage RF, Coleman JR. 2001. Effects of low atmospheric CO2 on plants: More than a thing of
the past. Trends in Plant Science 6: 18-24.
Saliendra NZ, Sperry JS, Comstock JP. 1995. Influence of leaf water status on stomatal
response to humidity, hydraulic conductance, and soil drought in Betula-occidentalis.
Planta 196.
262
Sanchez-Casas P, Klessig DF. 1994. A salicylic acid-binding activity and a salicylic
acid-inhibitable catalase activity are present in a variety of plant species. Plant
Physiology 106: 1675-1679.
Sanchez-Rodriguez J, Perez P, Martinez-Carrasco R. 1999. Photosynthesis, carbohydrate
levels and chlorophyll fluorescence-estimated intercellular CO2 in water-stressed
Casuarina equisetifolia Forst. et Forst. Plant Cell and Environment 22.
Sanchez-Rodriguez J, MartinezCarrasco R, Perez P. 1997. Photosynthetic electron transport
and carbon-reduction-cycle enzyme activities under long-term drought stress in
Casuarina equisetifolia Forst. et Forst. Photosynthesis Research 52.
Santarius KA. 1973. The protective effect of sugars on chloroplast membranes during
temperature and water stress and its relationship to frost, desiccation and heat
resistance. Planta 113: 105-114.
Santarius KA, Milde H. 1977. Sugar compartmentation in frost-hardy and partially
dehardened cabbage leaf cells. Planta 136: 163-166.
Sauer N. 2007. Molecular physiology of higher plant sucrose transporters. FEBS Letters Plant
Transporters and Channels 581: 2309-2317.
Sauer N, Friedlander K, Graml-Wicke U. 1990. Primary structure, genomic organization and
heterologous expression of a glucose transporter from Arabidopsis thaliana. Embo J
9: 3045-3050.
Sauer N, Ludwig A, Knoblauch A, Rothe P, Gahrtz M, Klebl F. 2004. AtSUC8 and AtSUC9
encode functional sucrose transporters, but the closely related AtSUC6 and AtSUC7
genes encode aberrant proteins in different Arabidopsis ecotypes. The Plant Journal
40: 120-130.
Sauer N, Stolz J. 1994. SUC1 and SUC2: Two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana
expression and characterization in bakers-yeast and identification of the
histidine-tagged protein. Plant Journal 6: 67-77.
Sawhney V, Singh DP. 2002. Effect of chemical desiccation at the post-anthesis stage on
some physiological and biochemical changes in the flag leaf of contrasting wheat
genotypes. Field Crops Research 77.
Scheibe R. 1991. Redox-modulation of chloroplast enzymes - a common principle for
individual control. Plant Physiology 96: 1-3.
Scheibe R, Backhausen JE, Emmerlich V, Holtgrefe S. 2005. Strategies to maintain redox
homeostasis during photosynthesis under changing conditions. Journal of
Scheller HV, Haldrup A. 2005. Photoinhibition of photosystem I. Planta 221: 5-8.
Schlüter U, Muschak M, Berger D, Altmann T. 2003. Photosynthetic performance of an
Arabidopsis mutant with elevated stomatal density (sdd1-1) under different light
regimes. Journal of Experimental Botany 54: 867-874.
Schneider S, Hulpke S, Schulz A, Yaron I, Höll J, Imlau A, Schmitt B, Batz S, Wolf S, Hedrich
R, Sauer N. 2011. Vacuoles release sucrose via tonoplast-localised SUC4-type
transporters. Plant Biology: no-no.
Schneidereit A, Scholz-Starke J, Buttner M. 2003. Functional characterization and
expression analyses of the glucose-specific AtSTP9 monosaccharide transporter in
pollen of Arabidopsis. Plant Physiol 133: 182-190.
Schneidereit A, Scholz-Starke J, Sauer N, Büttner M. 2005. AtSTP11, a pollen tube-specific
monosaccharide transporter in Arabidopsis. Planta 221: 48-55.
263
Scholz-Starke J, Buttner M, Sauer N. 2003. AtSTP6, a new pollen-specific H+-monosaccharide
symporter from Arabidopsis. Plant Physiol 131: 70-77.
Schroeder JI, Hagiwara S. 1989. Cytosolic calcium regulates ion channels in the
plasma-membrane of Vicia faba guard-cells. Nature 338.
Schulz A. 1995. Plasmodesmal widening accompanies the short-term increase in symplasmic
phloem unloading in pea root-tips under osmotic-stress. Protoplasma 188: 22-37.
Schürmann P, Jacquot J-P. 2000. Plant thioredoxin systems revisited. Annual Review of Plant
Schwab KB, Schreiber U, Heber U. 1989. Response of photosynthesis and respiration of
resurrection plants to desiccation and rehydration. Planta 177: 217-227.
Scott P. 2000. Resurrection plants and the secrets of eternal leaf. Annals of Botany 85:
159-166.
Seki M, Ishida J, Narusaka M, Fujita M, Nanjo T, Umezawa T, Kamiya A, Nakajima M, Enju
A, Sakurai T, Satou M, Akiyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Carninci P, Kawai J,
Hayashizaki Y, Shinozaki K. 2002. Monitoring the expression pattern of around 7,000
Arabidopsis genes under ABA treatments using a full-length cDNA microarray.
Functional et Integrative Genomics 2: 282-291.
Sgherri CLM, Pinzincp C, Navari-Izzo F. 1996. Sunflower seedlings subjected to increasing
stress by water deficit: Changes in O2− production Aated to the composition of
thylakoid membranes. Physiologia Plantarum 96: 446-452.
Shacter E. 2000. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples.
Drug Metabolism Reviews 32: 307-326.
Sharkey TD. 1985. O2-insensitive photosynthesis in C3 plants. Plant Physiology 78: 71-75.
Sharkey TD, Bernacchi CJ, Farquhar GD, Singsaas EL. 2007. Fitting photosynthetic carbon
dioxide response curves for C3 leaves. Plant, Cell et Environment 30: 1035-1040.
Sharkey TD, Seemann JR. 1989. Mild water-stress effects on carbon-reduction-cycle
intermediates, ribulose bisphosphate carboxylase activity, and spatial homogeneity
of photosynthesis in intact leaves. Plant Physiology 89: 1060-1065.
Sharkey TD, Vassey TL, Vanderveer PJ, Vierstra RD. 1991. Carbon metabolism enzymes and
photosynthesis in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) having excess
phytochrome. Planta 185.
Sharma P, Dubey RS. 2005. Drought induces oxidative stress and enhances the activities of
antioxidant enzymes in growing rice seedlings. Plant Growth Regulation 46.
Shen B, Jensen RG, Bohnert HJ. 1997. Increased resistance to oxidative stress in transgenic
plants by targeting mannitol biosynthesis to chloroplasts. Plant Physiology 113: 11771183.
Sherrard ME, Maherali H. 2006. The adaptive significance of drought escape in Avena
barbata, an annual grass. Evolution 60: 2478-2489.
Sherson SM, Alford HL, Forbes SM, Wallace G, Smith SM. 2003. Roles of cell-wall invertases
and monosaccharide transporters in the growth and development of Arabidopsis. J
Exp Bot 54: 525-531.
Sherwin HW, Farrant JM. 1998. Protection mechanisms against excess light in the
resurrection plants Craterostigma wilmsii and Xerophyta viscosa. Plant Growth
Regulation 24.
Shimazaki K, Doi M, Assmann SM, Kinoshita T 2007. Light regulation of stomatal movement.
Annual review of plant biology. Palo Alto: Annual Reviews, 219-247.
264
Shimazaki K, Iino M, Zeiger E. 1986. Blue light-dependent proton extrusion by guard-cell
protoplasts of Vicia faba. Nature 319.
Shindo C, Aranzana MJ, Lister C, Baxter C, Nicholls C, Nordborg M, Dean C. 2005. Role of
FRIGIDA and FLOWERING LOCUS C in determining variation in flowering time of
Arabidopsis. Plant Physiology 138: 1163-1173.
Shindo C, Bernasconi G, Hardtke CS. 2007. Natural genetic variation in Arabidopsis: Tools,
traits and prospects for evolutionary ecology. Annals of Botany 99: 1043-1054.
Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2007. Gene networks involved in drought stress
response and tolerance. Journal of Experimental Botany 58: 221-227.
Shirley BW. 1996. Flavonoid biosynthesis: new functions for an old pathway. Trends in Plant
Science 1: 377-382.
Siedow JN, Umbach AL. 1995. Plant mitochondrial electron transfer and molecular biology.
Plant Cell 7: 821-831.
Siegel RS, Xue S, Murata Y, Yang Y, Nishimura N, Wang A, Schroeder JI. 2009. Calcium
elevation-dependent and attenuated resting calcium-dependent abscisic acid
induction of stomatal closure and abscisic acid-induced enhancement of calcium
sensitivities of S-type anion and inward-rectifying K+ channels in Arabidopsis guard
cells. Plant Journal 59.
Sies H. 1997. Oxidative stress: Oxidants and antioxidants. Experimental Physiology 82:
291-295.
Silva P, Thompson E, Bailey S, Kruse O, Mullineaux CW, Robinson C, Mann NH, Nixon PJ.
2003. FtsH is involved in the early stages of repair of photosystem II in Synechocystis
sp PCC 6803. Plant Cell 15: 2152-2164.
Sivitz AB, Reinders A, Johnson ME, Krentz AD, Grof CPL, Perroux JM, Ward JM. 2007.
Arabidopsis sucrose transporter AtSUC9. High-affinity transport activity, intragenic
control of expression, and early flowering mutant phenotype. Plant Physiology 143:
188-198.
Sivitz AB, Reinders A, Ward JM. 2008. Arabidopsis sucrose transporter AtSUC1 is important
for pollen germination and sucrose-induced anthocyanin accumulation. Plant Physiol
147: 92-100.
Slot M, Zaragoza-Castells J, Atkin OK. 2008. Transient shade and drought have divergent
impacts on the temperature sensitivity of dark respiration in leaves of Geum
urbanum. Functional Plant Biology 35: 1135-1146.
Smeekens S, Rook F. 1997. Sugar sensing and sugar-mediated signal transduction in plants.
Smirnoff N. 1993. The role of active oxygen in the response of plants to water deficit and
desiccation. New Phytologist 125: 27-58.
Smirnoff N, Cumbes QJ. 1989. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes.
Phytochemistry 28: 1057-1060.
Smith AM, Denyer K, Martin C. 1997. The synthesis of the starch granule. Annual Review of
Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48: 67-87.
Smith AM, Zeeman SC. 2006. Quantification of starch in plant tissues. Nat. Protocols 1:
1342-1345.
Smith AM, Zeeman SC, Smith SM. 2005. Starch degradation. Annual Review of Plant Biology
56: 73-98.
Smith JAC, Milburn JA. 1980. Phloem turgor and the regulation of sucrose loading in
Ricinus-communis L. Planta 148.
265
Sofo A, Dichio B, Xiloyannis C, Masia A. 2005. Antioxidant defences in Olive trees during
drought stress: Changes in activity of some antioxidant enzymes. Functional Plant
Biology 32.
Solfanelli C, Poggi A, Loreti E, Alpi A, Perata P. 2006. Sucrose-specific induction of the
anthocyanin biosynthetic pathway in Arabidopsis. Plant Physiol 140: 637-646.
Sonnewald U. 1997. Modulation of sucrose metabolism. A molecular Approach to Primary
Metabolism in Higher Plants Foyer C.H,Quick P.: 63-79.
Sonoike K. 1996. Degradation of psaB gene product, the reaction center subunit of
photosystem I, is caused during photoinhibition of photosystem I: Possible
involvement of active oxygen species. Plant Science 115: 157-164.
Sperdouli I, Moustakas M. 2012. Differential response of photosystem II photochemistry in
young and mature leaves of Arabidopsis thaliana to the onset of drought stress. Acta
Physiologiae Plantarum 34: 1267-1276.
Sperdouli I, Moustakas M. 2012. Spatio-temporal heterogeneity in Arabidopsis thaliana
leaves under drought stress. Plant Biology 14: 118-128.
Sperry JS, Hacke UG, Oren R, Comstock JP. 2002. Water deficits and hydraulic limits to leaf
water supply. Plant Cell and Environment 25.
Srivastava AC, Ganesan S, Ismail IO, Ayre BG. 2008. Functional characterization of the
Arabidopsis AtSUC2 sucrose/H+ symporter by tissue-specific complementation
reveals an essential role in phloem loading but not in long-distance transport. Plant
Physiol 148: 200-211.
Stadler R, Buttner M, Ache P, Hedrich R, Ivashikina N, Melzer M, Shearson SM, Smith SM,
Sauer N. 2003. Diurnal and light-regulated expression of AtSTP1 in guard cells of
Arabidopsis. Plant Physiol 133: 528-537.
Stadler R, Truernit E, Gahrtz M, Sauer N. 1999. The AtSUC1 sucrose carrier may represent
the osmotic driving force for anther dehiscence and pollen tube growth in
Arabidopsis. Plant J 19: 269-278.
Stepien P, Johnson GN. 2009. Contrasting responses of photosynthesis to salt stress in the
glycophyte Arabidopsis and the halophyte Thellungiella: Role of the plastid terminal
oxidase as an alternative electron sink. Plant Physiology 149: 1154-1165.
Steudle E. 2002. Transport of water in plants. Environment Control in Biology 40: 29-37.
Stinchcombe JR, Weinig C, Ungerer M, Olsen KM, Mays C, Halldorsdottir SS, Purugganan
MD, Schmitt J. 2004. A latitudinal cline in flowering time in Arabidopsis thaliana
modulated by the flowering time gene FRIGIDA. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 101: 4712-4717.
Streb P, Josse EM, Gallouet E, Baptist F, Kuntz M, Cornic G. 2005. Evidence for alternative
electron sinks to photosynthetic carbon assimilation in the high mountain plant
species Ranunculus glacialis. Plant Cell and Environment 28: 1123-1135.
Stroebel D, Choquet Y, Popot JL, Picot D. 2003. An atypical haem in the cytochrome b(6)f
complex. Nature 426.
Student. 1908. The probable error of a correlation coefficient. Biometrika 6: 1-25.
Sugden C, Donaghy PG, Halford NG, Hardie DG. 1999. Two SNF1-related protein kinases
from spinach leaf phosphorylate and inactivate 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme a reductase, nitrate reductase, and sucrose phosphate synthase in vitro.
266
Suh SJ, Wang Y-F, Frelet A, Leonhardt N, Klein M, Forestier C, Mueller-Roeber B, Cho MH,
Martinoia E, Schroeder JI. 2007. The ATP binding cassette transporter ATMRP5
modulates anion and calcium channel activities in Arabidopsis guard cells. Journal of
Biological Chemistry 282.
Sulmon C, Gouesbet G, Couée I, Amrani AE. 2004. Sugar-induced tolerance to atrazine in
Arabidopsis seedlings: Interacting effects of atrazine and soluble sugars on psbA
mRNA and D1 protein levels. Plant Science 167: 913-923.
Sun J, Zhang J, Larue CT, Huber SC. 2011. Decrease in leaf sucrose synthesis leads to
increased leaf starch turnover and decreased RuBP regeneration-limited
photosynthesis but not Rubisco-limited photosynthesis in Arabidopsis null mutants of
SPSA1. Plant, Cell et Environment 34: 592-604.
Sung FJM, Krieg DR. 1979. Relative sensitivity of photosynthetic assimilation and
translocation of C-14 to water-stress. Plant Physiology 64.
Takahashi S, Milward SE, Fan D-Y, Chow WS, Badger MR. 2009. How does cyclic electron
flow alleviate photoinhibition in Arabidopsis ? Plant Physiology 149.
Tan BC, Joseph LM, Deng WT, Liu LJ, Li QB, Cline K, McCarty DR. 2003. Molecular
characterization of the Arabidopsis 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family.
Plant Journal 35: 44-56.
Tang A-C, Kawamitsu Y, Kanechi M, Boyer JS. 2002. Photosynthetic oxygen evolution at low
water potential in leaf discs lacking an epidermis. Ann Bot 89: 861-870.
Tardieu F, Lafarge T, Simonneau T. 1996. Stomatal control by fed or endogenous xylem ABA
in sunflower: Interpretation of correlations between leaf water potential and
stomatal conductance in anisohydric species. Plant, Cell et Environment 19: 75-84.
Tardieu F, Simonneau T. 1998. Variability among species of stomatal control under
fluctuating soil water status and evaporative demand: Modelling isohydric and
anisohydric behaviours. J. Exp. Bot. 49: 419-432.
Tardieu F, Zhang J, Gowing DJG. 1993. Stomatal control by both [ABA] in the xylem sap and
leaf water status: A test of a model for draughted or ABA-fed field-grown maize.
Plant, Cell and Environment 16: 413-420.
Telfer A, Dhami S, Bishop SM, Phillips D, Barber J. 1994. Beta-carotene quenches singlet
oxygen formed by isolated photosystem-II reaction centers. Biochemistry 33:
14469-14474.
Terashima I. 1992. Anatomy of non-uniform leaf photosynthesis. Photosynthesis Research
31: 195-212-212.
Terashima I, Ono K. 2002. Effects of HgCl2 on CO2 dependence of leaf photosynthesis:
Evidence indicating involvement of aquaporins in CO2 diffusion across the plasma
membrane. Plant and Cell Physiology 43.
Teruaki Taji CO, Satoshi Iuchi, Motoaki Seki, Mie Kasuga, Masatomo Kobayashi, Kazuko
Yamaguchi-Shinozaki, Kazuo Shinozaki,. 2002. Important roles of drought- and coldinducible genes for galactinol synthase in stress tolerance in Arabidopsis thaliana.
The Plant Journal 29: 417-426.
Tezara W, Colombo R, Coronel I, Marin O. 2011. Water relations and photosynthetic
capacity of two species of Calotropis in a tropical semi-arid ecosystem. Annals of
Botany 107.
Tezara W, Martinev D, Rengifo E, Herrera A. 2003. Photosynthetic responses of the tropical
spiny shrub Lycium nodosum (Solanaceae) to drought, soil salinity and saline spray.
267
Tezara W, Mitchell V, Driscoll SP, Lawlor DW. 2002. Effects of water deficit and its
interaction with CO2 supply on the biochemistry and physiology of photosynthesis in
sunflower. J. Exp. Bot. 53: 1781-1791.
Tezara W, Mitchell VJ, Driscoll SD, Lawlor DW. 1999. Water stress inhibits plant
photosynthesis by decreasing coupling factor and ATP. 401: 914-917.
Thimmanaik S, Kumar SG, Kumari GJ, Suryanarayana N, Sudhakar C. 2002. Photosynthesis
and the enzymes of photosynthetic carbon reduction cycle in mulberry during water
stress and recovery. Photosynthetica 40.
Tholen D, Boom C, Noguchi K, Terashima I. 2007. The effects of chloroplast movement on
CO2 transfer conductance in Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology 48.
Tholen D, Boom C, Noguchi K, Ueda S, Katase T, Terashima I. 2008. The chloroplast
avoidance response decreases internal conductance to CO2 diffusion in Arabidopsis
thaliana leaves. Plant Cell and Environment 31.
Timpa JD, Burke JJ, Quisenberry JE, Wendt CW. 1986. Effects of water-stress on the
organic-acid and carbohydrate compositions of cotton plants. Plant Physiology 82.
Tocquin P, Périlleux C. 2004. Design of a versatile device for measuring whole plant gas
exchanges in Arabidopsis thaliana. New Phytologist 162: 223-229.
Tournaire C, Croux S, Maurette M-T, Beck I, Hocquaux M, Braun AM, Oliveros E. 1993.
Antioxidant activity of flavonoids: Efficiency of singlet oxygen (1Δg) quenching. Journal
of Photochemistry and Photobiology B: Biology 19: 205-215.
Tourneux C, Peltier G. 1995. Effect of water deficit on photosynthetic oxygen exchange
measured using 18O2 and mass spectrometry in Solanum tuberosum L. leaf discs.
Planta 195: 570-577.
Truernit E, Sauer N. 1995. The promoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+
s po te ge e di e ts e p essio of β-glucuronidase to the phloem: Evidence for
phloem loading and unloading by SUC2. Planta 196: 564-570.
Truernit E, Schmid J, Epple P, Illig J, Sauer N. 1996. The sink-specific and stress-regulated
Arabidopsis AtSTP4 gene: Enhanced expression of a gene encoding a monosaccharide
transporter by wounding, elicitors, and pathogen challenge. Plant Cell 8: 2169-2182.
Truernit E, Stadler R, Baier K, Sauer N. 1999. A male gametophyte-specific monosaccharide
transporter in Arabidopsis. Plant J 17: 191-201.
Tsai H-L, Lue W-L, Lu K-J, Hsieh M-H, Wang S-M, Chen J. 2009. Starch synthesis in
Arabidopsis is achieved by spatial cotranscription of core starch metabolism genes.
Turgeon R, Beebe DU. 1991. The evidence for symplastic phloem loading. Plant Physiol 96:
349-354.
Turkan I, Bor M, Ozdemir F, Koca H. 2005. Differential responses of lipid peroxidation and
antioxidants in the leaves of drought-tolerant P.acutifolius Gray and droughtsensitive P.vulgaris L. Subjected to polyethylene glycol mediated water stress. Plant
Science 168.
Tuteja N, Singh MB, Misra MK, Bhalla PL, Tuteja R. 2001. Molecular mechanisms of DNA
damage and repair: Progress in plants. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular
Biology 36: 337-397.
Tuzet A, Perrier A, Leuning R. 2003. A coupled model of stomatal conductance,
photosynthesis and transpiration. Plant, Cell et Environment 26: 1097-1116.
268
Uehlein N, Lovisolo C, Siefritz F, Kaldenhoff R. 2003. The tobacco aquaporin NTAQP1 is a
membrane CO2 pore with physiological functions. Nature 425: 734-737.
Vahisalu T, Kollist H, Wang Y-F, Nishimura N, Chan W-Y, Valerio G, Lamminmaki A, Brosche
M, Moldau H, Desikan R, Schroeder JI, Kangasjarvi J. 2008. SLAC1 is required for
plant guard cell S-type anion channel function in stomatal signalling. Nature 452.
Valerio L, De Meyer M, Penel C, Dunand C. 2004. Expression analysis of the Arabidopsis
peroxidase multigenic family. Phytochemistry 65: 1331-1342.
Valtaud C, Larignon P, Roblin G, Fleurat-Lessard P 2009. Developmental and ultrastructural
features of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum in
relation to xylem degradation in Esca disease of the grapevine.In: Plant Pathol. 37-51.
Van Bel AJE. 2003. The phloem, a miracle of ingenuity. Plant, Cell et Environment 26:
125-149.
van Heerden PDR, Kruger GHJ. 2002. Separately and simultaneously induced dark chilling
and drought stress effects on photosynthesis, proline accumulation and antioxidant
metabolism in soybean. Journal of Plant Physiology 159.
Vander Zwan C, Brodie SA, Campanella JJ. 2000. The intraspecific phylogenetics of
Arabidopsis thaliana in worldwide populations. Systematic Botany 25: 47-59.
Vasseur F, Pantin F, Vile D. 2011. Changes in light intensity reveal a major role for carbon
balance in Arabidopsis responses to high temperature. Plant Cell and Environment
34: 1563-1576.
Vassey TL, Sharkey TD. 1989. Mild water stress of Phaseolus vulgaris plants leads to reduced
starch synthesis and extractable sucrose phosphate synthase activity. Plant Physiol
89: 1066-1070.
Vavasseur A, Raghavendra AS. 2005. Guard cell metabolism and CO2 sensing. New
Phytologist 165: 665-682.
Vu JCV, Gesch RW, Allen LH, Boote KJ, Bowes G. 1999. CO2 enrichment delays a rapid,
drought-induced decrease in Rubisco small subunit transcript abundance. Journal of
Plant Physiology 155: 139-142.
Walters RG, Horton P. 1991. Resolution of components of nonphotochemical chlorophyll
fluorescence quenching in barley leaves. Photosynthesis Research 27: 121-133.
Wang FZ, Wang QB, Kwon SY, Kwak SS, Su WA. 2005. Enhanced drought tolerance of
transgenic rice plants expressing a pea manganese superoxide dismutase. Journal of
Wang Y, Zhang W-Z, Song L-F, Zou J-J, Su Z, Wu W-H. 2008. Transcriptome analyses show
changes in gene expression to accompany pollen germination and tube growth in
Arabidopsis. Plant Physiology 148.
Warren C, Dreyer E. 2006. Temperature response of photosynthesis and internal
conductance to CO2: Results from two independent approaches. J. Exp. Bot. 57:
3057-3067.
Warren CR. 2008. Does growth temperature affect the temperature responses of
photosynthesis and internal conductance to CO2 ? A test with Eucalyptus regnans.
Tree Physiology 28.
Warren CR, Law M, Matyssek R, Tausz M. 2007. Internal conductance to CO2 transfer of
adult Fagus sylvatica: Variation between sun and shade leaves and due to free-air
ozone fumigation. Environmental and Experimental Botany 59: 130-138.
269
Warren CR, Livingston NJ, Turpin DH. 2004. Water stress decreases the transfer
conductance of douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) seedlings. Tree Physiology 24:
971-979.
Watanabe S, Kojima K, Ide Y, Sasaki S. 2000. Effects of saline and osmotic stress on proline
and sugar accumulation in Populus euphratica in vitro. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 63.
Webber A, Nie G-Y, Long S. 1994. Acclimation of photosynthetic proteins to rising
atmospheric CO2. Photosynthesis Research 39: 413-425.
Weise A, Barker L, Kuhn C, Lalonde S, Buschmann H, Frommer WB, Ward JM. 2000. A new
subfamily of sucrose transporters, SUT4, with low affinity/high capacity localized in
enucleate sieve elements of plants. Plant Cell 12: 1345-1355.
Westgate ME, Peterson CM. 1993. Flower and pod development in water-deficient
soybeans (Glycine-max L merr). Journal of Experimental Botany 44.
Widodo W, Vu JCV, Boote KJ, Baker JT, Allen LH. 2003. Elevated growth CO2 delays drought
stress and accelerates recovery of rice leaf photosynthesis. Environmental and
Wilkinson S. 1999. PH as a stress signal. Plant Growth Regulation 29: 87-99.
Wilkinson S, Corlett JE, Oger L, Davies WJ. 1998. Effects of xylem pH on transpiration from
wild-type and flacca tomato leaves. Plant Physiology 117: 703-709.
Wilkinson S, Davies WJ. 2002. ABA-based chemical signalling: The co-ordination of
responses to stress in plants. Plant, Cell et Environment 25: 195-210.
Will RE, Teskey RO. 1997. Effect of irradiance and vapour pressure deficit on stomatal
response to CO2 enrichment of four tree species. Journal of Experimental Botany 48:
2095-2102.
Wille AC, Lucas WJ. 1984. Ultrastructural and histochemical-studies on guard-cells. Planta
160.
Williams J, Bulman MP, Neill SJ. 1994. Wilt-induced ABA biosynthesis, gene-expression and
down- regulation of rbcS messenger-RNA levels in Arabidopsis thaliana. Physiologia
Plantarum 91: 177-182.
Wingler A, Lea PJ, Quick WP, Leegood RC. 2000. Photorespiration: Metabolic pathways and
their role in stress protection. Philosophical Transactions of the Royal Society
B-Biological Sciences 355: 1517-1529.
Wingler A, Marès M, Pourtau N. 2004. Spatial patterns and metabolic regulation of
photosynthetic parameters during leaf senescence. New Phytologist 161: 781-789.
Wingler A, Quick WP, Bungard RA, Bailey KJ, Lea PJ, Leegood RC. 1999. The role of
photorespiration during drought stress: An analysis utilizing barley mutants with
reduced activities of photorespiratory enzymes. Plant, Cell et Environment 22:
361-373.
Wiseman H, Halliwell B. 1996. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species:
Role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal 313:
17-29.
Woo N, Badger M, Pogson B. 2008. A rapid, non-invasive procedure for quantitative
assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods 4: 27.
270
Xiao W, Sheen J, Jang J-C. 2000. The role of hexokinase in plant sugar signal transduction
and growth and development. Plant Molecular Biology 44: 451-461.
Xu G, Fan X, Miller AJ. 2012. Plant nitrogen assimilation and use efficiency. Annual review of
plant biology 63.
Xue G-P, McIntyre CL, Glassop D, Shorter R. 2008. Use of expression analysis to dissect
alterations in carbohydrate metabolism in wheat leaves during drought stress. Plant
Molecular Biology 67.
Yamada K, Kanai M, Osakabe Y, Ohiraki H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2011.
Monosaccharide absorption activity of Arabidopsis roots depends on expression
profiles of transporter genes under high salinity conditions. Journal of Biological
Chemistry 286: 43577-43586.
Yamori W, Noguchi K, Hanba YT, Terashima I. 2006. Effects of internal conductance on the
temperature dependence of the photosynthetic rate in spinach leaves from
contrasting growth temperatures. Plant and Cell Physiology 47.
Yang Y, He F, Yu L, Chen X, Lei J, Ji J. 2007. Influence of drought on oxidative stress and
flavonoid production in cell suspension culture of Glycyrrhiza inflata batal. Zeitschrift
Fur Naturforschung Section C-a Journal of Biosciences 62.
Yordanov I, Velikova V, Tsonev T. 2000. Plant responses to drought, acclimation, and stress
tolerance. Photosynthetica 38: 171-186.
Young JJ, Mehta S, Israelsson M, Godoski J, Grill E, Schroeder JI. 2006. CO2 signaling in
guard cells: Calcium sensitivity response modulation, a Ca2+-independent phase, and
CO2 insensitivity of the gca2 mutant. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 103.
Zeeman SC, Ap Rees T. 1999. Changes in carbohydrate metabolism and assimilate export in
starch-excess mutants of Arabidopsis. Plant Cell and Environment 22.
Zeiger E. 1983. The biology of stomatal guard-cells. Annual Review of Plant Physiology and
Plant Molecular Biology 34: 441-475.
Zeiger E, Assmann SM, Meidner H. 1983. The photobiology of Paphiopedilum
stomata-opening under blue but not red-light. Photochemistry and Photobiology 38:
627-630.
Zeiger E, Talbott LD, Frechilla S, Srivastava A, Zhu JX. 2002. The guard cell chloroplast: A
perspective for the twenty-first century. New Phytologist 153: 415-424.
Zhang J, Davies WJ. 1990. Changes in the concentration of ABA in xylem sap as a function of
changing soil-water status can account for changes in leaf conductance and growth.
Plant Cell and Environment 13.
Zhang JX, Kirkham MB. 1996. Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum
seedlings. New Phytologist 132.
Zhang SQ, Outlaw WH. 2001. Abscisic acid introduced into the transpiration stream
accumulates in the guard-cell apoplast and causes stomatal closure. Plant, Cell et
Zhang X, Myers AM, James MG. 2005. Mutations affecting starch synthase III in Arabidopsis
alter leaf starch structure and increase the rate of starch synthesis. Plant Physiol 138:
663-674.
Zhang X, Wang HB, Takemiya A, Song CP, Kinoshita T, Shimazaki KI. 2004. Inhibition of blue
light-dependent H+ pumping by abscisic acid through hydrogen peroxide-induced
dephosphorylation of the plasma membrane H+-ATPase in guard cell protoplasts.
Plant Physiology 136: 4150-4158.
271
Zhou Y, Lam HM, Zhang J. 2007. Inhibition of photosynthesis and energy dissipation induced
by water and high light stresses in rice. Journal of Experimental Botany.
Zouni A, Witt HT, Kern J, Fromme P, Krauss N, Saenger W, Orth P. 2001. Crystal structure of
photosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 angstrom resolution. Nature
409.
272

Consulter le texte intégral de la thèse

Transcription

Documents pareils

La Vendée, un département soumis au stress hydrique

Notice biographique Repères biographiques communs Nom

Offre détaillée

Télécharger le résumé - Les Rencontres du Végétal

Stewartia monadelpha jeune plant pot 1.5 l

Plantes et accessoires - Salon Habitation de Québec

NaissaNce d`UNe variété de pomme 1/1 de la fleur à l`étal

ROBERT PLANT wm i \ I *fîî?MH LOUIS BERTIGNAC SENSATION

Bon de commande - Les Rocailles du Val