N° 17210

ORGANISATION AFRICAINE DE LA PROPRIETE INTELLECTUELLE
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51
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Inter. CI. C12Q 1/68
N° 17210
FASCICULE DE BREVET D’INVENTION
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Numéro de dépôt : 1201500086
73
Titulaire(s) :
(PCT/MA13/000005)
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Date de dépôt : 05/04/2013
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Priorité(s) :
Mascir (Moroccan Foundation For Advanced Science,
Research And Innovation),
Rabat Design Center,
Rue Mohamed AI Jazouli,
Madinat AI Irfane,
RABAT 10100 (MA)
MA n° 35213 du 13/09/2012
72
Inventeur(s) :
SEFRIOUI El Hassan (MA)
EL AMRANI Manale (MA)
KOTTWITZ Denise (MA).
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Mandataire : Cabinet ÉKÉMÉ LYSAGHT SARL,
B.P. 6370, YAOUNDE (CM).
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Délivré le : 31/08/2015
45
Publié le : 05.04.2016
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Titre : Sondes et amorces pour la détection du gène BCR-ABL en réaction duplex.
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Abrégé :
La présente invention concerne l'utilisation de nouvelles
sondes, amorces, sets d'amorces, sets de sondes et
amorces en qPCR pour la détection et la quantification de la
translocation BCR-ABL et un gène contrôle en! réaction
simplexe ou multiplexe. En quantifiant le gène BCR-ABL et
le gène contrôle, la qPCR de la présente invention
permettra la détection de la leucémie chronique myéloïde
(LMC), le suivi du traitement ainsi que de la maladie
résiduelle.
Fig. (1a et 1b)
O.A.P.I. – B.P. 887, YAOUNDE (Cameroun) – Tel. (237) 22 20 57 00– Fax: (237) 22 20 57 27– Site web: http:/www.oapi.int – Email: [email protected]
17210
Mascir (Moroccan Foundation For
Advanced Science, Research And
Inrovation)
Sondes et amorces pour la detection du gene BCR-ABL en reaction duplex.
DOMAINE TECHNIQUE
La presente invention conceme rutilisation de nouvelles sondes, amorces, sets d'amorces,
sets de sondes et amorces en qPCR pour la detection et la quantification de la translocation
5
BCR-ABL et un gene contrele en reaction simplexe ou multiplexe.
En quantifiant le gene BCR-ABL et le gene contrele, la qPCR de la presente invention
permettra la detection de la leucemie chronique myeloide (LMC), le suivi du traitement ainsi
que de la maladie residuelle.
10
FIAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
La leucernie myelokle chronique (LMC) est une maladle caracterisee par la presence du
chromosome de Philadelphle qui est le chromosome 22 raccourci sur son bras long par une
translocation t(9 ,22)(q34 ;q11). Cet echange entre les bras longs des chromosomes 9 et 22
15 est constamment present dans les cellules des patients atteint de LMC et il en result° un
gene de fusion appele BCR ABL fonctionnel qui sera transcrit en ARNm chimerique
-
(Shtivelman, 1985. Nature 1985; 315:550-4) qui est traduit en proteines de fusion bcr-abl,
responsable de la LMC.
La translocation BCR-ABL (t (9,22) (q34;q11)) est presente chez 90-95% des patients LMC et
20 20-25% chez les patients de la leucemie lymphoide algue (LLA) (Prist, 1980; Blood 56: 15-22).
La majorite des translocations de la LMC frappe la region du 'major breakpoint cluster
region' (M-bcr) au niveau du gene BCR et resulte en 2 transcrits qui sont b2a2 et b3a2
codant pour une proteine de fusion P210. La detection et la quantification des 2 derniers
transcrits permettront de statuer sur revolution de la LMC. En effet, l'ARNm du gene BCR25 ABL peut etre detecte et quantifle specifiquement et efficacement par la methode RT-PCR
parce que ce gene de fusion est specifique a la LMC et peut etre utilise comme marqueur
permettant d'identifier cette maladie.
Le critere fondamental du diagnostic de la LMC ou LLA est la presence de gene de fusion
30
BCR ABL, qui peut etre mis en evidence par des methodes cytogenetiques actuelles comme
-
celles du caryotype, la FISH (Fluorescent in situe hybridation) ou d'examens hematologiques.
Cependant, ces methodes manquent surtout d'essais quantitatifs et qualitatifs, elles sont
1
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moms specifiques, utilisent des hybridations complexes ou des isotopes, prennent
enormement de temps (plusieurs jours), peuvent etre invasives (utilisation de la moelle
osseuse), cu plus couteuses. De plus, ces methodes cytogenetiques peuvent detecter
seulement tine celluie LMC sur 500 cellules et donc ne peuvent pas etre utilisees dans le cas
du suivie de traitement de la LMC ni dans le cas de la maladie residuelle qui necessite Line
5
grande sensibilite (detection d'une cellule LMC sur 100000 cellules).
test pour les raisons cities cl-dessus qu'il est preferable de chercher des methodes de
quantification de BCR-ABL avec plus de sensibilite et de fiabilite, de meilleures repetabilite
10
quantitatives et qualitatives, moms coOteuses et pouvant facilement detecter la maladie
residuelle.
Une mothode alternative a l'art anterieur decrit ci-dessus est la PCR quantitative .en temps
reel (qPCR) qui a ete bien decrite auparavant pour ['amplification et la detection de
differents genes dont BCR-ABL (Fossev S et al; Mol Drawl. 2005;9(4):187-93; Gibson et al,
15
1996 Genomic Res 6 :995-1001).
Pour la quantification d'un gene cible, la qPCR utilise en paraliele un gene contrene
'housekeeping gene exprime de maniere ubiquitaire dans toutes les cellules du corps et qui
facilitera la normalisation et la quantification du gene cible. Dans le cas de BCR-ABL,
plusieurs genes contredes ont eta testes comme GAPDH, beta-actine, microglobiline, G6PDH
20
(Glucose-6-Phosphate-Doshydrogenase) (Uilmannov. V, 2003; Folia Biologica (Praha) 49,
211-216 (2003). Plus tard, une etude incluant 38 laboratoires Nord Americains a etudie
certains genes contr8les en parallele pour quantifier BCR-ABL (Tong et al ; 2007; Journal of
molecular Diagnostics, vol 9, N4: p 421-429). Dans tette etude, famplification et la
25 detection de BCR-ABL et les genes contr8les a ete falte avec des sequences nucleotidiques
specifiques tout en utillsant la qPCR en format simplex. Avec cette methode, la sensibilite et
le tout reste raisonnables et meilleurs que fart anterieur.
II est souhaitable d'identifier tine methode de qPCR pour quantifier BCR-ABL qui peut etre
encore plus sensible et plus fiable mats surtout moms couteuse que fart anterieur decrit ci30
dessus.
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EXPOSE DE L'INVENTION
La presente invention preconise rutilisation de nouveaux sets de sondes et d'amorces et
d'un procede de qPCR en reaction simplexe ou multiplexe pour la detection et la
quantification du gene BCR-ABL permettant le diagnostique de la LMC, le suivi de son
traitement ainsi que la maladie residuelle.
5
Le procede de la presente invention (7) ameliore les autres methodes anterieurs citees cidessus et permet a) de gagner en sensibilite en utilisant des nouvelles sondes et amorces de
BCR-ABL et ABL1 plus specifiques et plus sensibles que ceux citees dans ran anterieur b) une
reduction en cout de consommables et en temps de realisation ainsi qu'en fiabilite car
10 ramplification des genes BCR-ABL et de ABL1 se fait simultanement dans le meme puits de
qPCR c) de &teeter, a l'inverse des autres methodes de rart anterieur, les 2 variantes de la
LMC b3a2 et b2a2, etant donne que les sondes et amorces de BCR-ABL de la presente
Invention sont designees de tel maniere a detecter les 2 types de transcrits, cc qui permettra
un gain en temps supplementaire.
15
Scion une caracteristique de l'invention, la quantification des genes cibles se fait par qPCR
en differentes &tapes a) synthese des nouvelles sequences nuclootidique de sondes et
amorces qui vont se fixer specifiquement sur BCR-ABL ou a ABL1 (b) quantification de BCRABL sur le chromosome 22 en obtenant un nombre de copie de gene pour BCR-ABL c)
20 quantification de ABU sur le chromosome 9 en obtenant un nombre de topic de gene pour
ABL1 d) comparaison du nombre de copie de gene BCR-ABL1 a celui de ABL1 en obtenant un
ratio nombre de topic de gene BCR-ABL1 par apport au nombre de cople du gene ABL1
(BCR-ABL/ABL1) e) revolution de ce rapport apt le traitement de la LMC, permet de savoir
si un patient a bien repondu ou non au traitement. Une reduction du rapport BCR-ABL/ABL1
25 apres traitement suggere une reponse positive f) en accordance avec (e), le rapport 6CRABL/ABL1 permet aussi de detecter la maladie residuelle, difficile a detecter avec les
methodes anterieurs, vue leur faible sensibilite de detection.
30
Scion une autre caracteristique de l'invention, a) les amorces permettant la detection du
transcrit BCR-MI dans un test echantillon ont des sequences d'oligonucleotides
selectionnees parrni un groupe de : SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, et SEQ ID
3
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NO :4, b) les amorces pour Metter le gene controle ABL1 dans un test echantillon ont des
sequences d'oligonucleotides selectionnees parml un groupe de : SEQ ID NO :5, SEQ ID
NO :6, SEQ ID NO :7, et SEQ ID NO :8.
En accord avec cette invention,
5
a) la sonde pour datecter BCR-ABL dans un test echantillon a une sequence : SEQ ID:
9.
b) la sonde pour detecter ABL1 dans un test echantillon a une sequence SRL ID :10.
En accord aussi avec cette invention, les sets d'amorces pour amplifier BCR-ABL ou ABL1
10
dans un test echantillon inclus
a) au moms pour BCR-ABL une amorce forward ayant une sequence selectionnee
parmi le groupe : SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, et une amorce reverse ayant une sequence
selectionnee parmi SEQ ID NO :3, QEQ ID NO :4
15
b) au moms pour ABL1, une amorce forward ayant une sequence parmi le group :
SEQ ID NO :5, SEQ ID NO : 6 , et une amorce reverse ayant une sequence selectionnee parml
SEQ ID NO :7, SEQ ID NO : 8.
La presente invention preconise aussl une methode pour la detection de BCR-ABL ou ABL1
20
dans un test achantillon. Cette methode est divisee en plusleurs &apes :
a) Pour BCR-ABL, mettre en contact un test echantillon avec au moms une amorce
forward ayant une sequence solectionnee parml SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, et au moms
une amorce reverse selectionnee parmi SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO : 4 dans des conditions
d'amplification specifiques pour generer une sequence cible.
25
b) Pour ABL1, mettre en contact un test echantillon avec au moms une amorce
forward ayant une sequence selectionnee parml SEQ ID NO :5 ou SEQ ID NO: 6, et au moms
une amorce reverse selectionnee parmi SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO : 8 dans des conditions
d'amplification specifiques pour &ter une sequence cible; et c) detecter l'hybridation de
la sequence cible et au moms une sonde pour lndiquer la presence de BCR-ABL ou ABL1 darts
30
un test echantillon. Pour BCR-ABL, la sonde a une sequence SEQ ID NO: 9 et pour ABL1, la
sonde a une sequence SEQ ID NO :10.
4
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En accord avec la methode d'amplification de la presente invention, le gene decrit ci dessus
consiste a mettre le test echantillon clans une reaction d'amplification en presence de
reactifs d'amplification. La reaction d'amplification peut etre au moms une PCR, qPCR ou RTPCR.
5
SeIon cette invention et en accordance avec, au moms une sonde contient une unite
fluorescente (reporter) attach& a la region 5' d'ADN. En plus au moms une sonde peut
contenir une partie quencher a la region 3' D'ADN. La quantification de funite fluorescence
permet la quantification du gene cible (BCR-ABL ou ABU).
10
SeIon une autre caracteristique de l'invention, ramplification de BCR-ABL et ABL1 par la
qPCR de la presente invention peuvent se fake en reaction simplexe ou multiplexe.
15
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure la : Graphique Delta Rn-versus- cycle threshold (Ct) pour BCR-ABL en format
simplexe. La lignee cellulaire leucemique 1(562 subissant une qPCR de la presente invention.
7 concentrations d'ADNc (4pg-25ng) ont ete utilisees.
20
Figure lb : Courbe standard Cycle threshold (Ct)-versus-log quantite ADNc pour BCR-ABL en
format simplexe. La lignee cellulaire leucemique 1(562 subissant une qPCR de la presente
invention. 7 concentrations d'ADNc (4pg-25ng) ont ete utilisees.
25
Figure 2: Courbe standard Cycle threshold (Ct)-versus-log quantite ADNc pour BCR-ABL en
format simplexe. La lignee cellulaire leucemique K562, un echantillon de sang d'un patient
LMC et un autre d'un individu control subissant une qPCR de la presente invention. 9
concentrations d'ADNc (0,16pg-25ng) ont ete utilisees.
30
Figure 3a: Courbe standard Cycle threshold (Ct)-versus-log quantite ADNc pour ABL en
format multiplexe. La lignee cellulaire leucernique K562 subissant une qPCR de la presente
invention. 7 concentrations d'ADNc (20pg-25ng) on ete utilisees. Les courbes des valeurs Ct
5
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des echantilions d'ADNc dans chaque puits du triplicata ainsi que la courbe moyenne sont
montrees.
Figure 3b: Courbe standard Cycle threshold (Ct)-versus-log quantite ADNc pour BCR-ABL en
format multiplexe. La lignee cellulaire leucemique 1(562 subissant une qPCR de la presente
5
invention. 7 concentrations d'ADNc (4pg-25ng) on
ete utilisies.
Les courbes des valeurs Ct des echantillons d'ADNc dans chaque puits du triplicata ainsi que
la courbe moyenne sont montrees.
Figure 4a: Courbe standard Cycle threshold (Ct)-versus-log quantlte ADNc pour ABL en
10 format simplexe et multiplexe. La lignee cellulaire leucemique 1(562 subissant une qPCR de
la presente invention. 6 concentrations d'ADNc (20pg-25ng) on kte utilisees. Les courbes
moyennes des valeurs Ct des echantillons d'ADNc du triplicata sont montrees.
15
Figure 4b: Courbe standard Cycle threshold (Ct)-versus-log quantite ADNc pour BCR-ABL en
format simplexe et multiplexe. La lignee cellulaire leucemique 1562 subissant une qPCR de
la presente invention. 7 concentrations d'ADNc (20pg-25ng) sont utilisees. Les courbes
moyennes des valeurs Ct des echantillons d'ADNc
du trIplicata sont montrees.
20
EXPOSE DETAKLE
La presente Invention concerne des sondes, amorces, set d'amorces, set de sondes et
amorces qui peuvent etre utilises pour amplifier, detecter et quantifier le gene BCR-ABL ou
le gene contrele ABL1 dans un echantillon test.
25
La presente invention concerne aussi la methode de detection de BCR-ABL et d'ABL1 dans un
echantillon test en utilisant les sets d'amorces et sondes cites ci-dessus. Les sets d'amorces
et sondes de la presente invention permettent une meilleur sensibilite et specificite pour
detecter BCR-ABL et ABL1.
30
6
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SeIon la presente Invention, l'amplification de BCR-ABL et du gene contr8le ABL1 se fait au
moms en qPCR en format sImplexe cu multiplexe permettant ainsi une meilleure
quantification de BCR-ABL et un gain en temps et en cout.
SeIon une autre caracteristique de l'invention, la quantification plus sensible et plus
5
specifique de BCR-ABL permettra un meilleur suivi du traitement de la LMC ainsi que la
maladie residuelle.
Le mot 'BCR-ABL' ou t(9,22) decrit dans la presente Invention est une translocation entre le
gene ABL1 du chromosome 9 et le breakpoint cluster region (BCR) sur le chromosome 22.
10
La detection et la quantification de BCR-ABL peut supporter le diagnostic clinique LMC, le
suivi de son traitement et le suivl de la maladle residuelle.
15
Le mot 'gene' Were a une sequence d'adde nucleique dans la molecule d'ADN qui occupe
une region precise dans un chromosome et permet de coder les instructions pour la
synthese de l'ARN.
Le mot amplification de gene comme utilise dans cette Invention Were a une ou plusleurs
20 methodes capables de copier un acide nucleique permettant ainsi une augmentation du
nombre de copie d'une sequence d'acide nucleique cible. La sequence amplifiee peut etre
un adde desoxyribonucleotlde (ADN) ou un acide rlbonucleotide (ARN).
Le mot 'oligonucleotide' comme utilise ici est une sequence composee d'ADN ou d'ARN ou
25 leur combinaison avec une longueur qui van de 10 a 70 nucleotides. Les oligonucletides
peuvent etre synthetises avec differentes methodes mais pas limitees a celle de la synthese
5'-3' Ins& sun l'utilisation des groups protegeant beta-ctanoethyl phosphate (Rosenthal et
al, Terahedron Letter 24: 1691, 1983; Galt eta!, Nuc Acids Res 4: 1135, 1977) ou la methode
des phosphochloridites (Matteucci JAM DIEM SOC 103:3185-91, 1981).
30
Le mot 'amorce' represente une sequence d'oligonucleotides qui peut etre synthetisee
chimiquement ou naturellement. L'amorce est le point d'initiation de la synthese d'ADN
7
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dans des conditions optimales de temperature et en presence de tampons, d'enzyme, de
nucleotides et de sequences nucleotidiques complementaires specifiques.
Le mot 'sonde' represente une sequence nucleotidique qui forme une structure hybride avec
une sequence cible dans une molecule d'un echantillon test.
5
Le mot 'transcription inverse' comme utilise dans cette invention Were a une methode
permettant la synthese d'ADN complementaire (ADNc) a partir de molecule d'ARN. L'ADNc
peut etre utilisee dans la methode PCR.
10
i.e mot 'PCR' (polymerase chain reaction) de la presente invention Were a une methode
dont un echantillon d'ADN ou ADNc est ajoute dans une solution en presence de 2
oligonucleotides amorces (forward et reverse) ; de nucleotides non attaches (exemple les
dNTPs) ; et de l'enzyme ADN polymerase (preferablement la Tag polymerase qui resiste a la
15 chaleur) qui catalyse la formation d'ADN a partir des 2 amorces et dNTPs. La solution est
chauffee a 94-96 C pour denaturer la molecule d'ADN et former 2 brins simples d'ADN. Les
amorces vont ensuite se fixer specifiquement sur l'ADN simple brin permettant ainst a l'ADN
polymerase de catalyser l'attachement des dNTPs aux a morces.
20
Le mot 'RT-PCR' (reverse transcriptase-PCR) de la presente Invention represente une
methode de PCR dont le produit de depart n'est pas directement tin ADN mais un MN
traduit en ADNc apt transcription Inverse.
i.e mot 'qPCR' (quantitative PCR ou real time RT-PCR) cite dans la presente invention Were a
25 une methode de PCR permettant ['etude des prodults de la reaction PCR durant les
premieres &apes d'amplification de l'ADN. La detection des produits de PCR se fait grace a
des sondes marquees a leur extremite 5' par un fluorochrome emetteur (reporter), et a leur
extromite 3' par un fluorochrome suppresseur (quencher) fluorescent ou non, qui inhibe
remission du reporter lorsqu'ils sont a proximite. De ce fait, rintensite du signal de la
30 fluorescence mesuree au cours la reaction d'amplification est proportionnelie au nombre de
produits nouvellement formes (amplicons). La mesure en ADN ou ADNc se fait en
logarithme. Pour determiner la positivite d'une PCR et/ou quantifier tin echantillon par
8
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qPCR, on determine le nombre de cycles a par& duquel le produit PCR est detectable. Le
moment d'apparition de ce signal seuil denomme cycle seuil ou Ct (Cycle Threshold) est
dependant de la quantite de matrice initialement presente dans rechantillon amplifie. Le Ct
calcule est inversement proportionnel au logarithme decimal du nombre de copies Initiates.
5
Parmi les sondes les plus utllisees en qPCR on trouve les sondes TaqMan et molecular
beacons qui utilisent ractivite exonuclease 5 fluorogenique de l'enzyme Taq polymerase
pour mesurer la quantite de la sequence d'ADN dans un echantilion test.
Preferentiellement, dans la presente invention, la qPCR est rails& en utilisant les sondes
10
TaqMan avec un analyseur d'amplification comme ABI PRISM 7900H1 'sequence detection
system' qui est un system de screening qui peut detecter et quantifier des acides nucleiques.
La quantite de BCR-ABL et ABL1 est calculke par le logiclel integre dans le systeme ABI PRISM
79001ff en utilisant la methode de la courbe standard. SeIon une autre caracteristique de la
15
presente invention, le reporteur de la sonde peut etre FAM, JOE, YAKYE (YY) et le quencher
BBQ, BHQ1, ou TAMFtA.
Le mot 'gene contrele' comme utilise dans ou 'housekeeping gene' represente un gene
exprime en general da facon similaire par toutes les celiules d'un organisme. Parmi les genes
20
contrele, on trouve le glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), l'albumine, la
beta-actine, et ABL1.
Le mot simplexe de la presente Invention Were a un essai qui ne se
deroule pas simultanement avec d'autres essais. Dans notre invention, la qPCR en simplexe
25
reflete la detection de nom bre de copies d'un seul gene dans un tube de reaction.
Le mot multiplexe de la presente invention /Were a un essal qui se deroule simultanement
avec au moms un autre essal. La qPCR en multiplexe reflete la detection du nombre de
copies d'au moms 2 genes dans un meme tube de reaction. Par exemple, dans la presente
30
Invention, les 2 genes BCR-ABL et ABL1 sont detect& simultanement par qPCR.
9
17210
Le mot Ichantillon test' comme utilise dans la presente invention Were a un echantilion de
sang, de moelle osseuse, de celluies primaires, lignees cellulaires ou autre tissues et CIO des
cellules LMC ou LLA ou autres cellules leucemiques, exprImant la translocation BCR-ABL,
peuvent resider. l'echantilion test de la presente invention peat Etre d'origine humaine ou
autre animal exprimant le gene MUCOL1 qul peut etre amplifie en utilisant les amorces et
5
sondes de la prosente invention.
La qPCR de la presente invention permet de determiner le nombre de copies du gene BCRABL dans des cellules huma ins en quantifiant le nombre de copies de
BCR-ABL relative a un gene contr8le. Le gene contr8le id est ABL1.
10
L'exemple 1 decrit un protocole utilise dans le test de qPCR de la presente invention. Le
protocole decrit l'etape d'extraction d'ARN, de synthese d'ADNc et de qPCR.
15
L'exemple 2 montre la performance de la qPCR de la presente invention pour detecter le
gene BCR-ABL dans la fignee leucemique (LMC) humaine K562, dans le sang d'un patient
LMC alnsl que dans le sang d'un individu control.
20
La performance de la qPCR de la presente Invention est suivant les normes IVD
intemationales (R2>0,95, slope entre -3,0 et 3,9 et efficacite proche de 100) avec des
courbes standards (quantite d'ADNc de K562-vs-valeurs Ct) a efficacite de 100,02 et 100,44
et un R2 de 0,993 et 0,998 respectivement pour Figure 1b et Figure 2. La courbe
d'amplification cycle-vs-Delta Rn (Figure la) montre aussi une parfaite allure. Le patient
25 LMC positif pour BCR-ABL par la methode FISH est bien confirme pour sa positivite dans la
presente invention avec un Ct=32,5 (cercle, Figure 2) alors que l'Individu control est negatif
pour BCR-ABL avec un Ct=40 (triangle, Figure 2).
30
L'exemple 3 montre la qPCR de la presente invention en format simplexe ou multiplexe
permet latietectIon separee ou simultanee de BCR-ABL et ABL1 avec une grande precision.
La lignee LMCK562 positive pour BCR-MI a ete utilisee.
10
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Les courbes standards (quantite d'ADNc de K562-vs-valeurs Ct) de la qPCR en format
multiplexe pour ABL1 et BCR-ABL (Figures 3a & 3b) montrent des resultats suivant les
normes internationales IVD (Efficacite = 92-101%, slope entre -3 et 3,9, et R2 = 0,99). Aussi
une superposition parfaite des courbes des valeurs Ct pour ABL1et BCR-ABL et cela en
5
reaction simplexe et multiplexe a
ete aussi observe° (Figures 4a & 4b).
EXPERIENCES
I0
Exemple 1: Protocole de qPCR de la oresente invention pour la detection de
BCR-ABL et ABL1
L'extraction de YARN cellulaire se fait avec RNeasy mini kit Qiagen suivant les
15
recommandatIons du fournisseur Qiagen (Qiagen Inc). La quake du test est dependante de
la quake de YARN Initiale. De ce fait, II est purifie sur electrophorese en gel d'agarose ou sur
Bioanalyzer (Agilant) avant Yanalyse.
L'ADNc est obtenue a pantr d'ARN total extralt d'echantillon test. La synthese d'ADNc est
realisee a l'aide du Thermocycleur (Applied Biosystems) en utilisant le kit RNA to cDNA
20
Reverse Transcription sulvant les recommandatIons du foumisseur Applied Biosystems.
Le mastermix de la reaction qPCR contient les amorces et la sonde de BCR-ABL et les
amorces et la sonde d'ABL1, est ajoute ASO ADNc pour un volume final de 251.11.
25
Pour la reaction en simplexe, seulement la sonde et les amorces pour BCR-ABL ou ABL1 sont
utilises dans different puits de qPCR alors que pour la reaction en multiplexe, les sondes et
les amorces pour BCR-ABL et ABL1 sont utilises simultanement dans le meme puits de qPCR.
Le cycle thermal de la qPCR est fait dans les conditions sulvantes : Otape 1 a 95C pendant 20
30
secondes; &ape 2 (cycle de SO) a 95C pendant 1 seconde ; et une etape 3 a 60°C pendant
30 secondes.
11
▪
17210
Pour la courbe standard de la qPCR, des series de 7-9 dilutions d'ADNc sont utilisees. Les
concentrations sont 0,16 pg, 4pg, 20pg, 100pg, 500pg, 2,5ng, 12,5ng, et 25ng. Pour cette
courbe standard, tine valeur R2>0,95 est accept& par contre une valeur R240,95% est
refusee et la qPCR dolt etre repetee.
5
Exempts 2- La performance de l'essai qPCR pour Metter BCR-ML dons la lianee leucemique
1(562 et dons tin echantillon de sang de patient LMC cu du contrale saln
Les sequences des amorces et de la sonde BCR-ABL utilisees en Figures la
Amorce Forward : 5' Tccgctgaccatcaataagg 3' (SEQ ID W 1)
Amorce reverse : Vaccctgaggctcaaagtcag 3' (SEQ ID W 4)
Sonde : 5 R-cccttcagcggccagtagca-Q 3' (SEQ ID W. 9)
10
Pour la sonde : R= FAM et Q=BBQ
Les sequences des amorces et de la sonde BCR-ABL utilisees en Figure lb
▪
Amorce Forward : 5' Actccagactgtccacagca 3' (SEQ ID W 2)
Amorce reverse : 5'accctgaggctcaaagtcag 3' (SEQ ID W 4)
15
Sonde : 5' R-acttcagcggccagtagca-Q 3' (SEQ ID W. 9)
Pour la sonde :R= YY et Q=BHQ1
Les sequences des amorces de la sonde BCR-ABL utilisees en Figure 2
20
Amorce Forward : 5' Actccagactgtccacagca 3' (SEQ ID W 2)
▪
Amorce reverse : S'accctgaggctcaaagtcag 3' (SEQ ID W 4)
▪
Sonde : 5' R-cccttcagcggccagtagca-Q 3' (SEQ ID W 9)
Pour la sonde : R= Wet Q=BHQ1
25
Exemple 3 La performance de l'essal OCR pour Metter BCR-ABL en format simplexe et
duplexe en utilisant la lianee leucemique 1(562 positive pour BCR-ABL
Les sequences des amorces et de la sonde ABL1 utilisees en Figures 3a & 4a
30
▪
Amorce Forward : 5' ctgaccaactcgtgtgtgaa 3' (SEQ ID Ne 5)
▪
Amorce reverse : 5' ccctgaggctcaaagtcaga 3' (SEQ ID W 7)
•
Sonde : 5' R-cccttcagcggccagtagca-Q 3' (SEQ ID W 10)
Pour la sonde : R= JOE et Q=BBQ
12
17210
les sequences des amorces et de la sonde BCR-ABL utilisees en Figures 3b & 4b
Amorce Forward : STccgctgaccatcaataagg 3' (SEQ ID N' 1)
Amorce reverse : Waccctgaggctcaaagtcag 3' (SEQ ID N' 4)
- Sonde : S' R-cccttcagcggccagtagca-Q 3' (SEQ ID N' 9)
5
Pour la sonde : R= FAM et t1=13HQ1
UM DES SEQUENCES NUCLEO11DIQUES
SEQ ID N' 1: F-BCR-ABL
Longueur : 20
Tccgctgaccatcaataagg (F3)
10
SEQ ID N' 2: F- BCR-ABL
Longueur : 20
Actccagactgtccacagca (F4)
15
SEQ ID N' 3: R- BCR-ABL
Longueur : 20
Ccctgaggctcaaagtcaga (R1)
SEQ ID N' 4: R- BCR-ABL
Longueur : 20
Accctgaggctcaaagtcag (R2)
20
SEQ ID NO'S: F-ABL1
Gtggccagtggagataacac (F1)
SEQ ID N' 6: F-ABL1
Longueur : 31
Tggagataacactctaagcataactaaaggt (F2)
25
SEQ ID N' 7: R-ABL1
Longueur : 20
Tgttgactggcgtgatgtag (R1)
SEQ ID N'S: R-ABL1
Longueur: 21
Gatgtagttgcttgggaccca (R2)
30
SEQ ID N'9 :5- BCR-ABL
Longueur : 20
Cccttcagcggccagtagca (P1)
13
17210
SEQ ID WI 10 :S-ABL1
Longueur : 20
Aaatggccaaggctgggtcc (P1)
amorce forward
R = amorce reverse
S = sonde
F tr.
5
10
15
20
25
30
14
17210
RevendlcatIons :
1. Une methode pour la detection des genes BCR-ABL (responsable de la LMC) et ABL1
dans un echantIllon test bathe sur l'utilisation de la PCR en temps reel, caracterlsee
en ce que la methode comprend les &apes suivantes :
5
a) Extraction de l'ARN a partir d'un echantillon test
b) Test de purete et de la quantite de l'ARN par electrophorese, nanodrop ou
par bioanalyseur
c) Synthese de l'ADN complementalre (ADNc) a partIr de l'ARN total extrait de
l'echantillon test
10
d) Melange d'ADNc avec un Mastermix comprenant, pour la detection
specifique et slmultarthe en multiplex des deux genes BCR-ABL et ABL1, une
comblnaison d'amorces constituee :
(i) d'une amorce «forward» ayant des sequences selectionnees parmi le .
15 group de sequences [SEQ ID N' 1 , SEQ ID N' 21 , d'une amorce «reverse«
selectIonnie parmi le group de sequences [SEQ ID N' 3, SEQ ID N' 4] et la
sonde de detection SEQ ID N' 9 et,
(ii) d'une amorce «forward» ayant des sequences selectionnees parmi le
group de sequences (SEQ ID N' 5 , SEQ ID N' 61, d'une amorce .reverse»
selectionnee parmI le group de sequences [SEQ ID N' 7, SEQ ID N' 8] et la
20
sonde de detection SEQ ID N' 10,
pour un volume final d'au moms 250.
e) Application du cycle thermal de la qPCR
f)
Mesure de l'amplification du gene
25
2. Methode selon la revendication 1, ob deux amorces pour amplifier le gene BCR-ABL
dans un echantillon test sont constituees d'une amorce forward ayant une sequence
selectionnee parrni le groupe de sequences : SEQ ID N' 1, SEQ ID N' 2, et une amorce
reverse selectlonnee parml le groupe de sequences :SEQ ID N' 3, SEQ ID N'4,
30
3. Mithode selon la revendication 1, oa une sonde pour la detection du gene BCR-ABL
dans un echantIllon test, a une sequence SEQ ID N'9.
15
17210
4. Methode selon la revendication 1, ob deux amorces pour amplifier le gene ABL1 dans
on echantillon test sont constituees d'une amorce forward ayant une sequence
selectionnee parml le groupe de sequences : SEQ ID IT 5, SEQ ID W 6, et une amorce
reverse selectionnee parmi le groupe de sequences :SEQ ID W 7, SEQ ID NT.
5
5. Mdthode selon la revendication 1, oi) une sonde pour la detection du gene ABL1
dans un echantillon test, a une sequence SEQ ID W10.
10
6. Methode selon les revendications 1 a 5, °is Les sondes pour detecter
BCR-ABL ou ABL1 en qPCR sont attachees a des entites fluorescentes (reporters) et
non fluorescentes (quenchers). Le reporteur peut etre FAM,10E ou YY cu similaires,
attache a l'extromite 5' et le quencher peut etre BBQ, BHQ1, ou TAMFtA ou similaires
attache a l'extremite 3'.
15
7. Methode selon les revendications 1 5 6, of.' la detection des genes BCR-ABL et ABL1
dans un echantillon test est effectuee de facon separee (Simplexe) ou simultanee
(Multiplexe) dans un meme puits de qPCR.
8. Methode selon les revendications 1 a 7, ou les sondes et amorces du gene permet la
20
detection simukanee des 2 transcrits de BCR-ABL, a savoir b2a3 et b3a2.
9. Methode selon les revendications 1 a 8, ob l'utilisation de ladite methode comprend
au moms une des techniques PCR, PCR en temps reel (qPCR) ou transcriptase reverse
PCR (RT-PCR).
25
10. Nouvelle application de la methode des revendications precedentes caracterlsee en
ce qu'elle permet le diagnostique et le sulvi de traitement de la LMC et de la maladie
residuelle.
30
16
17210
1/4
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Tweet MI= Slow J308Y-Inter:38M2 02. 0397 E1111:112.791
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r11
17210
2/4
Standard Curve
t.1 : 1 1. I
•••
t 211 CCC
ICI XI
Ouantly
Tercet Mbcr F4P1R2 Slow -3.311Y-hter: 38254 o 2- 0.993 FM 100.445
Figure 2
34 -
EfficacIte ABL1 en multiplexe
32 30 § 28 S
26 y = -3,292x + 36,57
24 -
•
Cu
•
CU
—Linialre (Ctmean)
20
1
CT1
X Ctrnean
R2 = 0,999
Eff9“101,26
22 -
0
•
3
2
log amount
Figure 3a
4
5
•
17210
3/4
36
Mb:ache BCR-ABL en multiplexe
34 32 -
26 -
y • 3,539x + 36,32
Ws 0,998
Eff96=92%
-
24 22 -
1
Ctl
•
Ct2
•
CU
X CtMean
—Uniaire (CtMean)
20
0
•
•
3
2
4.
5
log amount
Figure 3b
36 -
Courbes des valeurs Ct ABU en simplexe & multiplexe
34 32
30
g 28
-*-ABL1Simplex
26
-X- ABU. duplex
24
22
20
1
2
3
log amount
Figure 4a
4
5
P.
a
17210
4/4
36 -
Courbe des valeurs Ct SCR-ABL (Mbcr) en simplexe & multiplexe
34 32 30 E 28 -
2
0 26
--A-- Mbcr Simplex
—X— Mbcr Duplex
24
2220
18
1
2
3
4
5
log amount
1••■•
Figure 4b
17210
Abrage :
La presente invention concerne l'utilisation de nouvelles sondes, amorces, sets d'amorces,
sets de sondes et amorces en qPCR pour la detection et la quantification de la translocation
BCR-ABL et un gene controle en reaction simplexe ou multiplexe.
En quantifiant le gene BCR-ABL et le gene control°, la qPCR de la presente invention
5
permettra la detection de la leucemie chronique myeloide (LMC), le suivi du traitement ainsi
que de la maladic residuelle.
\-1
17210
planche de l'abrege
MP-M:40141
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