mise au point d`une technique de quantification des populations

ECOLE
NATIONALE
VETERINAIRE
TOULOUSE
Master 2 Recherche
« Elaboration de la Qualité et Sécurité Alimentaire »
Directrice de stage : Mme Sylvie COMBES
Mémoire bibliographique
MISE AU POINT D’UNE TECHNIQUE DE
QUANTIFICATION DES POPULATIONS
BACTERIENNES ET ARCHAEA DE L’ECOSYSTEME
CAECAL DU LAPIN PAR PCR EN TEMPS REEL
TRAN Ngoc Uyen
Lieu du stage : UMR 1289 INRA – ENSAT - ENVT TANDEM
(Tissus Animaux Nutrition Digestion Ecosystème
Métabolisme)
2008
Table des matières
Page
Résumé
Introduction
1
2
1. Principe de la PCR
2. PCR en temps réel
3
7
2.1. Principe de la PCR en temps réel
2.2. Principes mathématiques de la PCR en temps réel
7
7
2.3. Les stratégies de quantification
2.3.1. Quantification relative
8
9
2.3.2. Quantification absolue par étalonnage avec un
standard
3. Les différentes techniques de PCR en temps réel
3.1. Agents se liant à l’ADN double brin (Lightcycler
assay)
3.2. Hydrolyse de sondes (Taqman assay)
3.3. Balises moléculaires
3.4. Amorces scorpion
4. Avantages de la PCR en temps réel
5. Application de la qPCR en écologie microbienne
6. Application de la qPCR à la quantification des archaea
et des bactéries
Conclusion
Références bibliographiques
10
11
12
14
14
15
Annexe 1 : Balises moléculaires et amorces scorpion
21
9
10
15
17
18
Annexe 2 : Exemple de protocole
22
Annexe 3 : Tableau récapitulatif des différents systèmes de
PCR utilisés pour quantifier les bactéries et les archaea
dans différents écosystèmes
24
Table des illustrations
Figures :
Page
Figure 1 : Schéma de la méthode PCR
5
Figure 2 : Evolution de la quantité d’amplicons en fonction
du nombre de cycles de PCR présentée en échelle linéaire
Figure 3 : Courbe standard en PCR en temps réel
Figure 4 : Modèle graphique de la PCR en temps réel
6
7
8
Figure 5 : Agents se liant à l’ADN double brin (Lightcycler
assay)
10
Figure 6 : Courbe de dissociation
Figure 7 : Hydrolyse de sondes (Taqman assay)
Figure 8 : Balises moléculaires et amorces scorpion
11
12
21
Résumé
Longtemps, l’étude des écosystèmes bactériens s’est limitée à
la
fraction
cultivable
des
micro-organismes
qui
permettait
uniquement d’avoir un suivi qualitatif, voire semi-quantitatif
des populations cultivables présentes. De nouveaux outils
permettent aujourd’hui de franchir de manière efficace l’étape
de
quantification
nécessaire
sans
nécessité
de
culture:
il
s’agit de la technique de PCR (Polymérase Chain Réaction) en
temps réel.
Cette technologie, rapide d’exécution, est basée sur la
détection et la quantification d’un reporter fluorescent dont
l’émission est directement proportionnelle à la quantité
d’amplicons générés pendant la réaction de PCR. La lecture de
la fluorescence par spectrométrie est immédiate et ne demande
aucune manipulation des échantillons au cours de la réaction
PCR. Il existe deux principes majeurs pour la détection
quantitative des produits d’amplification : la première
méthode met en jeu les agents se liant à l’ADN double brin et
la seconde des sondes fluorescentes. Par ailleurs, deux types
de quantifications sont réalisables en PCR quantitative. La
quantification absolue, exprimée en nombres de copies consiste
à mesurer la quantité de copies cible par rapport à des
étalons dont le nombre de copies est connue. L’autre méthode
appelée quantification relative consiste à mettre en relation
le nombre de copie de la cible mesurée par PCR quantitative
avec le nombre de copie d’un autre gène utilisé comme
calibrateur.
L’objectif du stage est de
mettre au point une technique de
quantification des populations bactériennes et
archaea de
l’écosystème caecal du lapin par PCR en temps réel. Dans ce
mémoire bibliographique, les principes, les stratégies de
quantifications et les différentes technologies de détection
des amplicons sont exposés. Enfin, les avantages et les
applications de la qPCR en écologie microbiennes à la
détection des bactéries et des archaea sont décrites.
- 1 -
Introduction
Les
lapins
sont
des
animaux
sensibles
aux
infections
digestives et la pathologie digestive est la cause principale
de pertes économiques dans les élevages cunicoles, tant par la
mortalité induite que par les pertes indirectes (retards de
croissance,
microflore
frais
caecale
de
traitement,
est
un
etc.).
élément
clé
Chez
de
le
la
lapin,
la
physiologie
digestive. Elle assure un rôle central dans la digestion de la
partie fibreuse de la ration. Aussi, la diversité (richesse,
et abondance relative des espèces) et la stabilité de
l’écosystème jouent vraisemblablement un rôle déterminant dans
l’apparition des troubles digestifs [12].
Les populations bactériennes et archaea dans leur écosystème
caecal sont très importantes en nombre et en diversité. Les
méthodes culturales de microbiologie ne permettent d’obtenir
qu’une vue biaisée de la diversité de l’écosystème digestif.
Récemment, les techniques de biologie moléculaire basées sur
l’amplification spécifique d’une séquence d’ADN se sont
développées. En écologie microbienne, les méthodes les plus
souvent
utilisées
pour
l’analyse
quantitative
sont
l’hybridation dot-blot, l’hybridation fluorescente in situ
(FISH), le Southern blot, et la PCR en temps réel. Ces
méthodes
permettent
d’obtenir
des
informations
sur
la
proportion de chaque population microbienne au sein de
l’écosystème. En regard de ces techniques, la PCR en temps
réel apporte une plus grande fiabilité, reproductibilité et
permet des analyses à grande échelle étant donné que le
processus complet est automatisé [6].
Dans le but de mettre au point une technique de quantification
des populations bactériennes et
archaea de l’écosystème
caecal du lapin par PCR en temps réel, cette synthèse présente
une description des principes, des avantages
de la PCR en
temps
réel,
des
stratégies
de
quantification
et
des
différentes technologies de détection des amplicons.
- 2 -
1. Principe de la PCR
Depuis la découverte de la Polymérase Chain Réaction par Kary
Mullis en 1986 et qui lui valu le prix Nobel de chimie en
1993, les techniques de PCR sont rapidement apparues comme des
outils indispensables en biologie moléculaire. La technique de
Polymérase Chain Réaction
(PCR) est un moyen rapide, peu
coûteux et simple pour copier des fragments d’ADN spécifiques
à partir de quantités minimes d’un matériel ADN source. C’est
un procédé d’amplification moléculaire qui mime le processus
naturel de synthèse de l’ADN.
La PCR permet d’amplifier des séquences dont la taille est
inférieure à 6 kilobases [4]. Elle est réalisée dans un
mélange
réactionnel
qui
comprend
l’extrait
d’ADN
(ADN
matriciel), la Taq polymérase, les amorces et les quatre
désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) en excès dans une
solution tampon. Les tubes contenant le mélange réactionnel
sont soumis à des cycles de température réitérés plusieurs
dizaines de fois dans le bloc chauffant d’un thermocycleur.
L’appareil permet la programmation de la durée et de la
succession des cycles de paliers de température. Chaque cycle
comprend trois périodes de quelques dizaines de secondes
(Figure 1).
- La dénaturation : 94°C
La première période s’effectue à une température de 94°C, dite
température de dénaturation. À cette température, l’ADN
matriciel, qui sert de matrice au cours de la réplication, est
dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir
à une température supérieure à 80°C et les ADN double-brin se
dénaturent en ADN simple-brin (ADN monocaténaires).
- L’hybridation : 40 – 70°C
La deuxième période s’effectue à une température généralement
comprise entre 40 et 70°C, dite température d’hybridation des
amorces. La diminution de la température permet aux liaisons
hydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de
s’hybrider. La formule de calcul de Tm (température de fusion)
permettant l'hybridation: 4°C X (G+C) + 2°C x (A+T) (amorces
de 14 à 24 bases). La température d'hybridation des amorces
doit être inférieure d’environ 5°C à la Tm calculée.
- 3 -
La taille des amorces est généralement comprise entre 10 et 30
nucléotides afin de garantir une hybridation suffisamment
spécifique sur les séquences d’intérêt de l’ADN matriciel.
Plus les amorces sont riches en cytosines et guanines, plus
leur température d’hybridation peut être élevée
la spécificité de l’hybridation est grande.
et donc plus
- L’élongation : 72°C
La troisième période s’effectue à une température de 72°C,
dite température d’élongation. À 72°C, la Taq polymérase se
lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication
en utilisant les dNTP présents dans le mélange réactionnel.
Les régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi
sélectivement synthétisées.
Figure 1 : Schéma de la méthode PCR [5]
Il s’agit d’une réaction en trois étapes :(i) La dénaturation de l’ADN
double brin en ADN simple brin par la chaleur. (ii) L’hybridation ou
l’hybridation des amorces
température d’hybridation.
par diminution de la température sous leur
(iii) L’élongation des amorces par une ADN
polymérase thermostable.
- 4 -
Les conditions réactionnelles :
Les volumes de milieu réactionnel varient entre 25 et 100 µl
[4]. Il existe une
multitude de formules de milieux
réactionnels. Il est toutefois possible de définir une formule
standard
qui convient à
la plupart des réactions de
polymérisation en chaîne. Concentrée 10 fois, sa formule est à
peu près la suivante : 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 ; 15 mM MgCl2,
500 mM KCl. Il est possible de rajouter des détergents (Tween
20, Triton X-100…) ou du glycérol afin d’augmenter les
conditions de stringence qui rendent plus difficile et donc
plus sélective l’hybridation des amorces.
Les
dNTP (desoxyribonucléotides)
fournissent à la fois
l’énergie et les nucléotides nécessaires à la synthèse de
l’ADN lors de la polymérisation en chaîne. Ils sont incorporés
au milieu réactionnel en excès, soit environ 200 µM final.
Selon le volume réactionnel choisi, la concentration en amorce
peut varier entre 20 et 100 pmol par échantillon [4]. La
quantité d’ADN matriciel dans le milieu réactionnel pour
initier la réaction d’amplification peut se réduire à une
copie unique. La quantité maximale ne peut en aucun cas
excéder 2 µg. En général, les quantités utilisées se situent
dans une gamme comprise entre 10 et 500 ng d’ADN matriciel. La
quantité de Taq polymérase par échantillon est généralement
comprise entre 1 et 3 unités.
Le choix de la durée des cycles de température et du nombre de
cycles dépend de la taille de la séquence d’intérêt ainsi que
de la taille et de la complémentarité des amorces. Pour la
dénaturation et l’hybridation des
amorces,
30
secondes
suffisent généralement. Pour l’élongation, une minute est
suffisante pour synthétiser des fragments PCR jusqu’à 2 kb (kb
= kilobase = 1000 pb). Quand des fragments d’ADN plus longs
sont amplifiés, le temps est augmenté d’une minute pour 1000
pb. Le nombre de cycles est inversement proportionnel à
l’abondance en ADN matriciel. Il faut compter 20 à 40 cycles
pour synthétiser une quantité analysable d’ADN (environ 0,1
microgramme).
- 5 -
En fonction du principe présenté en figure 1, on peut, en
théorie, s’attendre, à partir du troisième cycle de la PCR, à
observer un doublement de la quantité d’amplicons (fragment
d’ADN borné par les des amorces choisies) à chaque cycle.
n
Nombre de copies d’amplicons = 2 , n = le nombre de cycles
n
d’amplification, 2 correspond à la formation de deux amplicons
à partir d’un amplicon à chaque cycle.
En réalité, la quantité d’amplicon obtenue à chaque cycle,
n’augmente de manière exponentiellement que pendant un certain
nombre de
cycles,
ensuite,
l’amplification
s’amortie (phase
« linéaire » de la figure 2) en raison de la présence d’un
réactif qui commence à être limitant au sein du mélange
réactionnel. Cet amortissement de l’amplification se termine
par un plateau au cours duquel l’amplification n’a plus lieu
en raison de l’absence complète de l’un des réactifs [22]. La
réaction devient ensuite imprédictible et il est alors
impossible de pouvoir comparer plusieurs échantillons entre
eux sans un biais quantitatif plus ou moins significatif.
Figure 2 : Evolution de la quantité d’amplicons en fonction du
nombre de cycles de PCR présentée en échelle linéaire [22]
- 6 -
2. PCR en temps réel
La PCR en temps réel (ou qPCR pour quantitative PCR) a connu
un essor considérable au cours de ces dernières années, sans
doute en partie en raison de sa simplicité de mise en œuvre,
de son automatisation pour des applications d’analyses à
grande échelle et de la publicité importante qui a été faite
sur sa précision et sa sensibilité [22].
2.1. Principe de la PCR en temps réel
La PCR en temps réel combine l’amplification avec la détection
et la quantification d’un signal fluorescent. La réaction
d'amplification de la séquence ADN cible suit les mêmes étapes
qu'en PCR classique (dénaturation, hybridation, extension).
L’augmentation
du
signal
fluorescent
est
directement
proportionnelle à la quantité d’amplicons générés durant la
réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence
émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la
réaction PCR durant sa phase exponentielle (figure 2). La
première augmentation significative de la quantité d’amplicons
est en corrélation directe avec la quantité initiale de la
matrice cible (template) [8].
2.2. Principes mathématiques de la PCR en temps réel
La PCR est une réaction en chaîne dans laquelle les produits
servent de matrice pour la réaction suivante suivant une
amplification théoriquement quadratique:
N = N0 X 2n, où N0 est le nombre initial de molécules, n le
nombre de cycle et N le nombre de molécules amplifiées.
Cette amplification théorique dépend dans la réalité d’une
efficacité d’amplication E, ou proportion moyenne de molécules
produites à chaque cycle. (E = 2 idéalement et E = 1 si aucune
molécule n’est produite). Expérimentalement, E varie entre
1,78 et 1,97.
N = N0 X En
Soit sous forme logarithmique : LogN = logN0 + n · logE
A partir d’une courbe expérimentale du nombre de molécules
amplifiées N en fonction du nombre de cycle, il est possible
d’en déduire la valeur de N0 c'est-à-dire le nombre initial de
molécules. La formule donnant l'efficacité de la PCR en temps
- 7 -
réel
[14]
peut
être
gamme étalon : E% = (10
calculé
lors
(- 1/pente)
de
l’établissement
d’une
– 1) x 100% (Figure 3)
Figure 3 : Exemple de courbe standard en PCR en temps réel
[14]
La pente de la droite de régression lie les logarithmes des quantités d'ADN
(en abscisses) aux valeurs correspondantes de Ct (en ordonnées).
- Cycle seuil (Threshold cycle) :
Les valeurs de fluorescence sont enregistrées au cours de
chaque cycle et représentent la quantité d’amplicons produits
en un point précis dans la réaction. Plus il y a de matrices à
amplifier au départ de la réaction PCR, moins élevé sera le
nombre de cycle requis pour atteindre un point où le signal
d’émission
de
fluorescence
sera
statistiquement
et
significativement plus élevé que le bruit de fond. Ce point
est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra
toujours au cours de la phase exponentielle d’amplification
(Figure 4). Par conséquent, la quantification n’est pas
affectée par l’épuisement d’un des réactifs comme lors de la
phase plateau ce qui explique pourquoi le système en temps
réel est si reproductible. La valeur du Ct peut être traduite
en un résultat quantitatif en la comparant avec les valeurs du
Ct générées avec des matrices de quantification connues.
2.3. Les stratégies de quantification
La quantification des acides nucléiques peut se faire soit de
façon relative par rapport à un gène de référence interne à
- 8 -
l’échantillon, soit de façon absolue après établissement d’une
gamme étalon de la cible.
Figure 4 : Modèle graphique de la PCR en temps réel [8]
L’intensité de la fluorescence à chaque cycle est proportionnelle à la
concentration d’amplicons, le cycle seuil (Ct) représente le nombre de
cycles requis où le signal d’émission de fluorescence est statistiquement
et significativement plus élevé que la ligne de base.
2.3.1. Quantification relative
Un gène de référence présent dans l’échantillon est quantifié
en même temps que le gène étudié, la concentration de ce
dernier étant ensuite normalisé par rapport à celle connue du
gène de référence. Les gènes les plus souvent utilisés comme
références sont des gènes dits « de ménage » dont l’expression
doit être constante tels que l’ARN16S bactérien, rpoB (codant
la sous-unité ß de l’ARN polymérase), gapdh (codant la
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), gst (codant la
glutathion-S-transférase) ou le gène codant l’actine des
eucaryotes.
2.3.2.
standard
Quantification
absolue
par
étalonnage
avec
un
Les cinétiques sont mesurées pour différentes concentrations
de la séquence gène cible. La courbe d’étalonnage permet de
déduire la concentration à partir d’une mesure du Ct.
- 9 -
3.
Les différentes techniques de PCR en temps réel
Plusieurs techniques existent : elles utilisent soit des
molécules se liant à l'ADN, soit des sondes moléculaires
spécifiques de la cible amplifiée. Ces deux types de détection
présentent une sensibilité équivalente,
différence au niveau de la spécificité.
3.1.
assay)
Agents
se
liant
à
l’ADN
mais
double
il
brin
existe
une
(Lightcycler
Le SYBR Green est l’agent le plus fréquemment utilisé. C’est
une
molécule intercalante
de l’ADN double brin qui agit
comme le BET (Bromure d'Ethidium). Il est économique, facile à
utiliser et possède plus de sensibilité que le BET sans
inhiber la réaction d’amplification. Cette molécule émet une
intense fluorescence lorsqu’elle est liée à l’ADN double brin
et aucune fluorescence sous sa forme libre en solution (Figure
5).
Figure 5 : Agents se liant à l’ADN double brin (Lightcycler
assay) [8]. (a) Durant la dénaturation, le SYBR Green I libre exhibe peu
de fluorescence. (b) À la température d’appariement, quelques molécules se
lient au double brin d’ADN naissant résultant en une émission de
fluorescence lors de l’excitation. (c) Durant la phase de polymérisation,
de plus en plus de molécules se lient au brin naissant et l’accroissement
de la fluorescence peut-être suivi en temps réel.
- 10 -
A chaque cycle de PCR, lors de l’élongation, la molécule de
SYBR Green se fixe à l’ADN double brin et fluoresce. Au cours
des cycles, la fluorescence émise augmente proportionnellement
au nombre de copies (Figure 5). Elle est donc directement liée
à la quantité initiale et au nombre de cycle de PCR. Le SYBR
Green est très stable, seulement 6% de son activité est perdue
au bout de 30 cycles de PCR [17].
Le SYBR Green présente l’avantage d’être applicable à tout
couple d’amorces et de fournir un signal fort, d’autant plus
que la taille des amplicons est importante. Il présente
néanmoins
le
désavantage
de
n’être
pas
spécifique
de
l’amplicon d’intérêt. Si la PCR n’a pas été correctement mise
au point, il est possible que les amorces forment des dimères,
ou bien qu’un amplicon non spécifique soit amplifié en raison
d’une faible spécificité des amorces de PCR. Dans ce cas, le
signal enregistré ne sera plus proportionnel à la quantité
d’amplicons spécifiques produits et les résultats s’avèreront
ininterprétables. Pour vérifier que le bon gène a bien été
amplifié, on étudie la courbe de fusion (Figure 6). En effet,
chaque produit d’ADN double brin synthétisé a une température
de fusion spécifique, définie comme la température à laquelle
la moitié de l’ADN est sous forme de double brin, l’autre
moitié sous forme de simple brin.
Figure 6 : Courbe de dissociation [17]
La courbe de fusion est obtenue en traçant la dérivée première de la
fluorescence en fonction de la température et la température de fusion d’un
double brin correspond à un pic sur cette courbe.
- 11 -
En augmentant progressivement la température dans les tubes de
PCR, les amplicons sont progressivement dénaturés à un faible
niveau jusqu’à de que la température s’approche de la
température de fusion (Tm) de l’amplicon (Figure 6). A ce
moment,
la
dénaturation
des
amplicons
s’accélère
pour
atteindre 50% d’amplicons dénaturés lorsque le Tm est atteint.
La dénaturation complète des amplicons est ensuite atteinte
lorsque la température continue d’augmenter. La dénaturation
de l’amplicon provoque la libération du SYBR Green et
s’accompagne donc d’une diminution de la fluorescence qui peut
être enregistrée. La présence de dimères d’amorces ou
d’amplicons aspécifiques dont le Tm est suffisamment différent
du Tm de l’amplicon d’intérêt peut être détectée grâce à cette
courbe de dissociation via la présence de pics surnuméraires
lors de la représentation de la dérivée négative de la
fluorescence [22].
3.2. Hydrolyse de sondes (Taqman assay)
La méthode de détection à partir de la sonde
est basée sur
l’activité exonucléasique 5’-3’ de la Taq polymérase. La sonde
spécifique est marquée deux fois : un fluorochrome quencher
situé en 3’ et un fluorochrome reporter en 5’.
La sonde Taqman est sélectionnée de manière à ce que sa
température de fusion (Tm) soit au moins de 10°C supérieure à
celle des amorces de PCR. Au cours de la deuxième étape d’un
cycle de PCR (hybridation des amorces), la sonde Taqman va se
fixer de manière spécifique sur sa séquence complémentaire.
Cette fixation sera complète et précèdera toujours la fixation
des amorces en raison du Tm plus élevé de la sonde Taqman et
du fait que l’étape précédente de PCR était à une température
supérieure (94°C) [22].
Au cours de la polymérisation, la Taq polymérase dégrade la
sonde située sur son chemin et libère le reporter du quencher
(Figure 7). Cette méthode est très précise car la fluorescence
associée
au
fluorochrome
reporter
ainsi
mesurée
est
proportionnelle à la quantité de produit généré [5]. La
méthode de TaqMan à l’avantage d’être spécifique de l’ADN
amplifié comparé au SYBER Green qui peut se lie aussi aux
- 12 -
produits non spécifiques de la PCR. Les sondes Taqman sont
cependant plus
chères et se
dégradent plus vite, en
particulier lorsqu’elles sont exposées à la lumière. Il en
résulte une moins bonne répétabilité des PCRs dans le temps
par un effet de dégradation des sondes. Les sondes Taqman sont
également moins sensibles que le SYBR Green car seul un
fluorophore émet un signal à chaque synthèse de deux nouveaux
brins d’ADN [22].
Figure 7 : Hydrolyse de sondes (Taqman assay) [8]
(a) Durant l’étape de dénaturation, la sonde est libre en solution. (b) À
la température d’appariement, la sonde et les amorces s’hybrident à leurs
séquences cibles
l’inhibition de
respectives et la proximité des fluorochromes permet
la fluorescence. La polymérisation débute. (c) La
polymérase déplace et hydrolyse la sonde. Le fluorochrome émetteur est
libéré de l’environnement du suppresseur permettant ainsi l’émission de la
fluorescence.
3.3. Balises moléculaires
Une balise moléculaire est une sonde d’hybridation d’ADN en
forme d’épingle à cheveux. En dessous de la température
d’hybridation la molécule se trouve en position fermée, le
quencher se trouve proche du reporter et aucune fluorescence
n’est détectée. Si la balise moléculaire s’associe au produit
de PCR ou est détruit, le quencher est éloigné du reporter et
- 13 -
la fluorescence peut être mesurée (Annexe 1). Ce type de sonde
augmente grandement la spécificité de l’hybridation [8]. La
spécificité de cette technologie est telle qu’elle permet de
détecter les différences de séquences au nucléotide près, ce
qui
peut être
technologies de
parfois
difficile à
réaliser avec
sondes linéaires. Elle constitue donc
les
une
technologie efficace pour la détection et le criblage à grande
échelle des SNPs (single nucleotide polymorphisms) [5]. La
principale difficulté de
crucial de la boucle.
ces sondes réside
Cette sonde ADN
dans le design
n’émet de la
fluorescence qu’en présence de nombreuses copies amplifiées de
l’ADN cible qui vont provoquer la déformation de sa structure.
3.4. Amorces scorpion
Les
amorces
scorpion
représentent
une
variante
de
la
technologie des balises moléculaires. Les fluorochromes et la
sonde (partie balise moléculaire) sont intégrés à même
l’amplicon de façon irréversible durant l’amplification par
PCR (Annexe 1). Le design d’une amorce/sonde scorpion est
pratiquement similaire à celui des balises moléculaires. La
région amorce du scorpion permet d’intégrer la balise
moléculaire dans le nouvel amplicon pendant la réaction de
PCR. La boucle de l’épingle à cheveux est dessinée dans le but
de permettre
l’hybridation de la sonde à sa séquence
complémentaire cible située sur l’amplicon. Cette hybridation
force l’épingle à cheveux à changer de conformation permettant
ainsi l’émission de fluorescence. La technologie amorce/sonde
scorpion est généralement plus efficace que les technologies
Taqman et balises moléculaires, particulièrement dans un
programme de PCR possédant des cycles très courts [8].
4.
Avantages de la PCR en temps réel
La PCR traditionnelle est seulement semi quantitative, elle ne
peut pas être considérée comme une analyse quantitative et
ses résultats sont habituellement exprimés en termes de
positivité / négativité. Une évaluation semi-quantitative est
possible sur la base de l'aspect de positivité (faible/forte)
de bande électrophorétique, mais cette approche est fortement
subjective et la sensibilité est très basse. La PCR en temps
- 14 -
réel est une variante de la PCR standard. La méthode s'appelle
« la PCR en temps réel » car l'ADN amplifié peut être détecté
au cours du procédé PCR, en temps réel, plutôt qu'à la fin du
procédé. Cela permet une mesure plus fiable et plus précise de
l'acide nucléique. La réaction PCR en temps réel se déroule
automatiquement sans intervention de l'opérateur, permettant
d'accroître la productivité et
d'erreur humaine pour donner
de réduire la possibilité
des résultats fiables et
reproductibles.
5.
Application de la qPCR en écologie microbienne
La communauté microbienne est définie par un groupe de microorganismes occupant un même écosystème ayant des activités et
des fonctions éventuellement différentes les uns des autres.
Les techniques de microbiologie classique conduisent à une
vision partielle des communautés microbiennes d’un écosystème
en favorisant la vision « cultivable » du monde microbien par
opposition à la vision « totale » donnée par les outils
moléculaires.
La PCR quantitative a déjà été utilisé dans l’analyse
quantitative de
la communauté bactérienne du tractus
intestinal
[24].
Cette
technique
permet
d’obtenir
des
informations
sur
la
proportion
de
chaque
population
microbienne au sein de l’écosystème intestinal. En outre, elle
permet également de suivre l’expression de gènes cibles
présent en faible quantité dans l’écosystème. Cette technique
est aussi utilisée pour mettre en évidence de mutations
ponctuelles (homo/hétérozygotie, résistance aux antibiotiques
dans des gènes) à l’aide de sondes Taqman très spécifiques ou
l’interprétation des courbes de fusion, par exemple.
6. Application de la qPCR à la quantification d’archaea et des
bactéries totales
Le système intestinal et la microflore qui y siège constituent
un écosystème très complexe qui joue un rôle très important en
santé animale à de nombreux niveaux. L’efficacité, la
stabilité et la pérennité du fonctionnement de ce système
dépend de la diversité microbienne présente. La PCR en temps
- 15 -
réel
permet
de
faire
des
analyses
quantitatives
afin
d’approfondir les connaissances sur la diversité archaea et
bactérienne du tractus digestif et ainsi identifier de
nouveaux isolats. Le principe de quantification des bactéries
et des archaea est basé sur l’utilisation du gène codant pour
l’ARN16S. En effet, ce gène présente l’avantage d’être
ubiquitaire, contient à la fois des zones très conservées au
cours de l’évolution et variables. Il est en outre présent en
quantité importante. Un exemple de protocole de détection de
l’ADN 16S total bactérien et archaea mis au point par Suzuki
et al (2000) et Takai et Horikoshi (2000) respectivement, est
présenté en annexe. Un tableau récapitulatif des amorces et
des sondes utilisées dans différents écosystèmes est également
présenté en annexe. L’ensemble de ces données servira à
l’établissement d’un protocole de qPCR lors de la partie
pratique de ce stage.
- 16 -
Conclusion
La méthode PCR en temps réel combine l’amplification PCR et la
détection
de
la
fluorescence.
Il
s’agit
d’une
détection
sensible et spécifique, une quantification facile et précise.
En particulier, aucune manipulation post PCR par « détection à
l’intérieur d’un tube » n’est nécessaire.
Le principe de la quantification repose sur le fait que le
nombre
de
copies
de
la
séquence
est
directement
lié
à
la
quantité initiale, au nombre de cycle et au rendement de la
PCR. Deux méthodes permettent de détecter les amplicons lors
de la PCR en temps réel. Le marquage non spécifique utilise
comme fluorochrome le SybrGreen qui se lie spécifiquement à
l’ADN bicaténaire. L’avantage de cette méthode est son faible
coût. Le désavantage de ce processus est son manque de
spécificité dû
au
fait que le fluorochrome se
liera
indifféremment aux produits de PCR spécifiques et non
spécifiques. Une autre méthode est d’utiliser une détection
spécifique du produit de PCR recherché.
Ce type de sonde
augmente grandement la spécificité de l’hybridation. Cette
technique est de plus en plus populaire dans différents
domaines de recherche, notamment dans l’analyse quantitative
du microbiote intestinal car elle permet d’obtenir des
informations
sur
la
proportion
de
chaque
population
microbienne afin d’approfondir les connaissances sur la
diversité microbienne du tractus digestif.
En conclusion, la PCR en temps réel nous semble très
performante
pour
la
quantification
des
populations
bactériennes et archaea de l’écosystème caecal du lapin.
- 17 -
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- 20 -
ANNEXE 1 :
Figure 8 : Balises moléculaires et amorces scorpion
A: Balises moléculaires [8]
(a) Durant l’étape de dénaturation, la balise moléculaire est sous forme
relaxée et libre en solution mais la proximité des fluorochromes permet
l’inhibition
de
la
fluorescence.
(b)
Lorsque
la
sonde
s’hybride
à
sa
séquence cible, le fluorochrome émetteur est suffisamment éloigné de son
suppresseur pour permettre l’émission de fluorescence. (c) À l’étape de
polymérisation,
la
balise
moléculaire
retourne
en
solution
sous
forme
d’épingle à cheveux.
B: Amorces scorpion
(a) Durant l’étape de dénaturation, la balise moléculaire est sous forme
relaxée et libre en solution mais la proximité des fluorochromes permet
l’inhibition
de
la
fluorescence.
(b)
L’amorce
scorpion
se
fixe
à
sa
séquence complémentaire cible. (c) Polymérisation du brin complémentaire.
(d)
Dénaturation
complémentaire
de
des
brins
d’ADN.
(e)
la
partie
balise
moléculaire
permettant l’émission de fluorescence.
- 21 -
Hybridation
à
sa
de
la
séquence
séquence
cible
ANNEXE 2 : Exemple de protocole :
- Système de détection de l’ADN 16S total bactérien
Suzuki et al. (2000) a décrit un système de PCR quantitative
qui permet de quantifier les gènes ribosomiques 16S totaux
afin de quantifier la flore bactérienne totale dans des
échantillons inconnus et de suivre les proportions relatives
de certain groupes microbiens d’intérêts quantifiés avec les
autres systèmes de détection. Ce système se compose de deux
amorces (W102 et W105) ainsi que d’une sonde Taqman
W101
(Tableau 1), permettant l’amplification d’un fragment de 104pb.
Un exemple des
volumes ainsi que des concentrations finales
en réactifs pour la réaction de PCR quantitative sont ceux
utilisés par Rousselon et al (2004) et sont reportés dans le
tableau 2.
Séquences et position des
détection des ADNr 16S :
Oligos
sonde
W105
système
de
5’-GGWTACCTTGTTACGACTT-3’
Amorce sens, position 1369 à 1386
Amorce antisens, position 1473 à 1492
5’-(6-Fam)CTTGTACACACCGCCCGTC (Tamra)-3’ Sonde, position 1389 à 1407
a : la sonde est de type Taqman. Les positions sont
16S
du
Position
5’-CGGTGAATACGTTCYCGG-3’
a
et
Séquence
W102
W101
amorces
données d’après l’ADNr
d’E.coli
Réactif pour la PCR en temps réel du système de détection des
ADNr 16S :
Réactifs
Concentration finale (nM)
Volume par puit (µL)
Master mix (enzyme + tampon + dNTP)
Eau milliQ (ultrapure)
n.a.
n.a.
15
5,4
Amorce sens W102
Amorce antisens W105
756
500
1,2
1,2
Sonde Taqman W101
Matrice (ADN)
250
n.a.
1,2
1
Volume final de la réaction
25•L
n.a. non applicable
- 22 -
- Système de détection des archaea
Un système, mis au point par
Takai et Horikoshi
(2000) a
permis de quantifier tous les micro-organismes appartenant au
domaine des archaea. Le système permet l’amplification d’un
fragment de 476 pb. Les séquences des amorces (W178 et W179)
et de la sonde Taqman (W177) sont listées dans le tableau 3
et les conditions de la réaction de PCR sont reportées dans le
tableau 4.
Séquences et position des amorces et
sonde du système de
détection des archaea :
Oligos
Séquence
W178
Position
5’-GYGCASCAGKCGMGAAW-3’
W179
Amorce sens, position 349 à 365
5’-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3’
Amorce antisens, position 806 à 825
a
W177 5’-(6-Fam)TGYCAGCCGCCGCGGTAAHACCVGC(Tamra)-3’Sonde, position 516 à 540
a : la sonde est de type Taqman. Les positions sont données d’après l’ADNr
16S d’E.coli
Réactif pour la PCR en temps réel du système de détection des
archaea :
Réactifs
Concentration finale (nM)
Volume par puit (•L)
Master mix (enzyme + tampon + dNTP)
n.a.
15
Eau milliQ (ultrapure)
Amorce sens W178
n.a.
800
5,7
1,1
Amorce antisens W179
Sonde Taqman W177
800
200
1,23
1
Matrice (ADN)
n.a.
1
Volume final de la réaction
25•L
n.a. non applicable
- 23 -
ANNEXE 3 :
Tableau récapitulatif des différents systèmes de PCR utilisés
pour quantifier les bactéries et les archaea dans de
différents écosystèmes
Auteur
Ecosystème
Cible
Techni
que
Suzuki
(2000)
environnem
ent
ADNr 16S
Bactérie
TaqMan
Séquence d’amorce
Bactérie :
BACT1
f. CGGTGAATACGTTCYCGG
Archaea
Rousselon
(2004)
Tajima
(2001)
Stephan
(2004)
intestin
rumen
intestin
ADNr 16S
Bactérie
ADN r16S
Fibrobacter
Taqman
SYBR
Green
CGCCCGTC
f. CGGTGAATACGTTCYCGG
r. GGWTACCTTGTTACGACTT
CTTGTACACAC
CGCCCGTC
Archaea :
f. CGGTGAATACGTCCCTGC
CTTGTACACAC
r. AGGAGGTGATCCRGCCGCA
CGCCCGTC
f. w97 5VGCAAGTCGAAGCACTTTA
w100 5V6FAM-
r. w98 5VGCAGGTTACCCACGCGTTAC
CGCCACTCAGT
CACAAA
Fibrobacter succinogenes
f. GGTATGGGATGAGCTTGC
r. GCCTGCCCCTGAACTATC
Ruminococcus flavefaciens
flavefaciens
f. GGACGATAATGACGGTACTT
r. GCAATC(CT)GAACTGGGACAAT
Taqman
f. (position: 8- 27)
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
ACTGAGACACG
GTCCA
r. (position: 1522- 41)
AAGGAGGTGATCCANCCRCA
(position :
321–337)
Furet
lait
ADNr 16S
SYBR
La1 (position: 205–224)
(2004)
fermenté
L. acidophilus
Green
GATCGCATGATCAGCTTATA
La2 (position: 328–309)
Firmesse
(2007)
intestin
ADNr 16S
Bactérie
SYBR
Green
AGTCTCTCAACTCGGCTATG
Efs 03
CTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGACGT
Efs 04
GGACAACGCTTGCCACCTA
Shinkai
(2007)
rumen
ADNr 16S
F. succinogens
Groupe 2
F. succinogens
Groupe 3
SYBR
Green
CTTGTACACAC
r. AAGGAGGTGATCCRGCCGCA
BACT2
succinogenes
Ruminococcus
ADNr 16S
Bactérie
Séquence de
sonde
F. succinogenes Groupe 2
f. CCCCTGYTCGGGAATA
r. CCAGTTCGGACTGCAGGT
F. succinogenes Group 3
f. AGGAGCGTGGCTTCCC
r. CCAAGAGGTGCAGTCCGA
- 24 -
Ken
(2000)
environnem
ADNr 16S
ent
Bactérie
Archaea
Taqman
Bactérie :
Bac349F
Bac516F
AGGCAGCAGTDRGGAAT
Bac806R
TGCCAGCAGCC
GCGGTAATACR
GGACTACYVGGGTATCTAAT
Archaea :
DAG
Arch349F
GYGCASCAGKCGMGAAW
Arch516F
TGYCAGCCGCC
Arch806R
GGACTACVSGGGTATCTAAT
GCGGTAAHACC
VGC
f : Amorce sens
r : Amorce antisens
- 25 -