Nouveaux tests globaux de l`hémostase: génération de thrombine
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Nouveaux tests globaux de l`hémostase: génération de thrombine
Nouveaux tests globaux de l’hémostase: génération de thrombine, thromboélastogramme, microparticules ARL 16/03/06 Nouveaux tests globaux de l’hémostase • Mesure de la génération de thrombine dans le plasma pauvre en plaquettes (PPP) et le plasma riche en plaquettes (PRP) • Thromboélastogramme: étudie le sang total • Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang Pourquoi des nouveaux tests en hémostase ? • Les tests d’exploration de l’hémostase que nous utilisons ont une performance limitée et un caractère statique. • La thrombomoduline et les autres partenaires du pool vasculaire sont absents de ces tests. • Nous avons besoin de tests plus proches de la réalité physiologique. La réalité physiologique K.G. Mann et al. BCMD 2006 Formation du caillot hémostase primaire (plaquettes) hémostase secondaire (coagulation) CAILLOT hémostase tertiaire (fibrinolyse) Hémostase primaire 1. Adhésion plaquettaire 2. Activation plaquettaire 3. Agrégation plaquettaire Sous-endothélium Lésion de l’endothélium Hémostase secondaire Thrombine Coagulation Fibrinogène Fibrine Sous-endothélium Lésion de l’endothélium Initiation de la coagulation Facteur tissulaire F VIIa Clou plaquettaire primaire FX Prothrombine F Xa TFPI/FXa Fibrinogène Thrombine Fibrine Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) Fibrine liée à la thrombine Amplification de la coagulation Complexe tenase F IXa F VIIIa FIXa FVIIIa Membrane plaquettaire FX F Xa F V et F VIII Complexe prothrombinase F Xa F Va Activation de plus de plaquettes Génération de plus de fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa Prothrombine Antithrombine Thrombine F XIII Voie de la protéine C activation VIII IXa VIIIa X inhibition V P A S P C PC Xa Va prothrombine thrombine thrombomoduline Les complexes procoagulants et anticoagulants vitamine K dépendants et leurs régulateurs K.G. Mann et al. BCMD 2006 Cascade de la coagulation Mesure de la génération de thrombine • initialement développé en 1953 • renouveau important car: automatisation de sa technique et informatisation des résultats • mime les mécanismes de coagulation physiologiques Thrombogram-Thrombinoscope Comparaison avec les tests de coagulation classiques • Les temps de coagulation: -temps ou taux de prothrombine, TP -temps de thromboplastine partielle activée, aPTT sont utilisés en routine pour pour évaluer la coagulation de manière globale • MAIS, ces tests ne mesurent pas la génération de thrombine, car au moment ou la caillot est formé, seulement 3% de la prothrombine est activée La mesure de la génération de thrombine • Méthode de base ancienne et établie dans le domaine de la recherche sur la coagulation, • décrit toutes les phases du processus de génération de thrombine • Thrombogram-Thrombinoscope (Hemker): méthode automatisée utilisant un substrat chromogène (usage d’un Fluoroscan de Thermo®) • CEPENDANT: une standardisation des conditions pré-analytiques et de la méthode est nécessaire avant son introduction en routine La mesure de la génération de thrombine • On peut utiliser du PPP et du PRP • Intérêt dans l’investigation d’une diathèse hémorragique • MAIS AUSSI dans les états hypercoagulables • Utile aussi pour évaluer les troubles de la fonction plaquettaire MAIS les conditions pré-analytiques doivent être standardisées Le vide peut créer une activation des plaquettes et une diminution de la sensibilité à la protéine C activée Changements visibles immédiatement après la prise de sang, variabilité entre les donneurs V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545 Génération de thrombine après activation de la voie du facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes Activation du TAFI* en TAFIa thrombine (nM) 200 * Thrombine Activatable Fibrinolysis Inhibitor Phase de pr o pa ga ti on 100 50 Xa 0 libre VIIa / FT n ti o sa ali u tr ne de a se Ph 150 L’activation du TAFI en TAFIa rend le caillot plus résistant à sa dissolution (fibrinolyse). PROTHROMBINASE TENASE IXa+VIIIa+ PS Formation Formation du du caillot caillot PREMIÈRES TRACES [activation des plaquettes, du FVIII et du FV DE THROMBINE Phase d’initiation 0 (D ’après C. Hemker et K. Mann) 10 temps (min) 20 Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004 Génération de thrombine après activation de la voie du facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes 200 Tmax Cmax thrombine (nM) 150 Valeurs normales Temps de latence Cmax Tmax ETP* 100 ETP 3,5± 1 min 200 ± 30 nM 9 ± 2 min 1500 ± 100 nMxmin Endogenous Thrombin Potential: « Man hours» of thrombin activity (Hemker 1993) 50 Temps de latence 0 + FT (5 pM) 0 (D ’après C. Hemker et K. Mann) Temps correspondant aux TP ou aPTT 10 temps (min) 20 Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004 Déficits en facteurs de la coagulation, déficits plaquettaires Pourquoi des hémorragies ? 200 N P ha se de pr o p agati on thrombine (nM) n ti o isa bi l s ta de a se Ph 150 100 50 caillot N. initiation hémophiles def. plaquettaires 0 caillot lâche (déficits) FT (10(10-25pM) 0 10 temps (min) 20 Effet des contraceptifs oraux sur la génération de thrombine K.G. Mann et al. BCMD 2006 Influence d’un inhibiteur du facteur Xa sur la génération de thrombine K.G. Mann et al. BCMD 2006 Phénotype d’un déficit constitutionnel en antithrombine CONTROL Déficit en antithrombine V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545 Phénotype d’un déficit constitutionnel en protéine C CONTROL Déficit en protéine C Thromboéleastogramme (Haemoscope®) Thromboélastogramme (1) • Développé en 1948 • Utilisé comme outil de recherche depuis • Plus récemment: guide pour décider de l’administration des transfusions durant la transplantation hépatique et la chirurgie cardiaque Thromboélastogramme (2) • donne une impression globale de la coagulation, • nous fournit des données sur le caillot après le début de la formation de fibrine, • reflète l’interaction entre les plaquettes, la cascade de la coagulation et la fibrinolyse, • mesure aussi la fermeté du caillot, • TEG standard et TEG modifié par une héparinase (inactive l’héparine). Thromboéleastogramme Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang Que sont les microparticules du sang ? • Observées pour la première fois dans le sang en 1967 par P. Wolf : « poussière de plaquettes » • 1988-1991: génération des microparticules durant l’activation plaquettaire (P.S. Sims et S.J. Shattil) • Ces microparticules plaquettaires sont procoagulantes: lient le facteur Va et soutiennent l’activité prothrombinase ainsi que la liaison du facteur VIII Depuis, des centaines d’études ont été publiées sur les microparticules du sang… • La plupart du temps, les microparticules sont mesurées par cytométrie de flux • Même si la plupart des microparticules sont issues des plaquettes sanguines, certaines dérivent des cellules endothéliales, des leucocytes, des cellules musculaires lisses ou des érythrocytes, par exemple • Leur distribution et leur nombre peut varier dans le sang en fonction des conditions physiologiques et pathologiques Les microparticules procoagulantes • Dérivées des plaquettes, des cellules endothéliales et des leucocytes • Les microparticules plaquettaires riches en phosphatidylsérine fournissent une surface procoagulante pour la génération de thrombine • Les microparticules endothéliales pourraient être associées à certains états hypercoagulables • Peuvent aussi être issues des cellules tumorales Facteur tissulaire circulant (contenu dans les microparticules) N. Mackman, BCMD 2006 Définition d’une microparticule du sang et limite des méthodes de mesure habituelles • diamètre < 1 µm (200-800 nm) • vu sa taille, elle se confond avec le bruit de fond électronique lorsqu’elle est comptée par cytométrie de flux • La cytométrie de flux par la méthode du « light scattering » ne peut pas déterminer la taille d’une particule quand la taille de cette particule est du même ordre de grandeur que la longueur d’onde du laser utilisé (488 nm) Mesure des microparticules sanguines dans le cancer avancé: cytométrie de flux avec impédance • Cytomètre de flux: NPE Systems Quanta • Utilise l’impédance pour mesurer la taille de la microparticule • Marquage des particules avec un anticorps antifacteur tissulaire, de façon à quantifier les microparticules procoagulantes • Échantillons de plasma de sujets normaux et de patients avec un cancer de stade avancé. Etude préliminaire • Microparticules positives pour le facteur tissulaire: présentes dans 1/3 patients avec un cancer avancé • Nombre: 11’000 – 1’600’000 particules par microlitre • Taille: 332 - 501 nm • Rôle probable de ces microparticules dans les complications thromboemboliques du cancer B. Furie et al., BCMD 2006