ACTION DE LA COLCHICINE LORS DE LA MICROPROPAGATION

25
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1998, 137, 25-36
ACTION DE LA COLCHICINE LORS DE LA
MICROPROPAGATION DU FENOUIL
(FOENICULUM VULGARE MILL.) SUR L’HUILE
ESSENTIELLE DES FRUITS (*)
A. BADOC (1) , Z. AMIMAR (2) , A. LAMARTI (2) ,
G. DEFFIEUX (1)
L’huile essentielle des fruits de 13 clones de Fenouil
doux obtenus par culture d'apex a été analysée. Quatre de ces
clones ont été soumis à la colchicine (1 mg / L dans le milieu
de base).
La colchicine n'induit pas de variation significative de
la teneur ou de la composition de l'huile essentielle des fruits.
Ces derniers sont riches en essence (5,3 - 6,4 - 7,5 g / 100 g de
matière sèche). Le profil des 13 clones est identique. On a
peu d'α -pinène (2,0-2,5 %), de fenchone (1,1-2,1 %),
d'estragole (3,4-3,5 %) et beaucoup d'(E)-anéthole, composé
majoritaire recherché pour son goût anisé.
L'utilisation de la colchicine lors de la micropropagation
par culture d'apex n'apparaît pas comme une voie d'avenir
pour améliorer l'essence des fruits de Fenouil.
(*)
(1)
(2)
Manuscrit reçu le 3 Mars 1998
Laboratoire de Mycologie et Biotechnologie végétale, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, Université Victor Segalen Bordeaux 2, 3, Place de la
Victoire, 33076 Bordeaux Cedex.
Département de Biologie, Faculté des Sciences Mhanach II, BP 2121 Tétouan,
Maroc.
26
INTRODUCTION
La colchicine a été utilisée pour l’amélioration du Fenouil
essentiellement en Inde et en France avec l’espoir d’obtenir des lignées
tétraploïdes. Cet alcaloïde a été appliqué en solution aqueuse (0,1 à 0,5 %) à
des temps d’action divers sur les apex de jeunes plantules [1-5], les graines
[3,4,6], les tiges florales [4] ou plus récemment sur des suspensions cellulaires
de Fenouil [7,8]. La colchicine a aussi été employée conjointement au
gammexane [9-11] ou aux RX [12].
Les résultats obtenus ont été assez décevants : nombre variable de
chromosomes (aneuploïdie, mixoploïdie), stérilité importante du pollen.
Cependant, l’aneusomatisme, fréquent chez le Fenouil [13], n’empêche pas
l’obtention de lignées donnant de bonnes performances agronomiques.
Hunault a obtenu à partir d’une suspension cellulaire ayant subi peu de
repiquages 8 individus tétraploïdes, d’où des clones fertiles, mais présentant
des anomalies florales, un pollen anormal et une faible fructification [8].
Les auteurs ont surtout étudié l’effet de la colchicine sur les caractères
agronomiques (pourcentage de germination, taille, durée de floraison,
pourcentage de fructification, etc.) et génétiques (nombre chromosomique,
nombre de nucléoles, anomalies méiotiques, etc.) et non sur l’huile essentielle
du Fenouil.
D’une manière plus générale, les travaux publiés visant à modifier les
caractéristiques de l’huile essentielle des plantes avec la colchicine sont peu
nombreux. Plusieurs concernent les Lamiacées, comme les genres
Mentha [14-15] et Salvia [16-17] ; des modifications non seulement de la
teneur mais aussi du profil de l’essence semblent envisageables. L’application
de la colchicine sur une Astéracée, Matricaria chamomilla, a conduit à
l’obtention de tétraploïdes présentant une forte teneur en sesquiterpènes,
notamment le chamazulène et l’α-bisabolol [18-21].
*
*
*
27
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Matériel végétal
Treize clones issus d’un Fenouil doux long de Provence (Foeniculum
vulgare Mill. subsp. vulgare var. dulce (Mill.) Batt. & Trab.) riche et
productif ont été obtenus par culture d’apex caulinaire [22-23] par feu le
Professeur Paupardin et son équipe pour le compte des Laboratoires Pernod
Ricard.
Le milieu de base est celui de Murashige et Skoog [24] additionné de
glucose (3 %) et de substances de croissance (auxines, benzylaminopurine).
Les clones 1000 et 1001 ont été enracinés en absence d’acide indolbutyrique
(AIB) contrairement aux clones 1002 à 1008. Les clones 1009 à 1012 ont été
cultivés sur le milieu de base enrichi avec de la colchicine (1mg / L).
Les plants ont été transférés dans un substrat composé de tourbe blonde
et de vermiculite (1:1) et repiqués 5 mois plus tard en pleine terre début juin.
Les fruits ont été récoltés fin août et stockés au sec à température ambiante
pendant 4 ans.
On a séparé les fruits les moins mûrs un peu verts des fruits mûrs, de
couleur bien brune.
Extraction
Les analyses sont effectuées sur environ 0,25 g de diakènes mûrs.
L’extraction a lieu par du pentane bidistillé par broyages successifs dans un
mortier à température ambiante. Les surnageants sont récupérés à l’aide d’une
pipette pasteur. Après filtration un volume exact d’une solution d’étalon
interne, l’oenanthate d’éthyle, est ajouté.
Le poids de matière sèche est établi à partir du résidu d’extraction : ce
dernier est récupéré dans une boîte de Petri placée dans une étuve à 60°C
jusqu’à poids constant.
Chromatographie en phase gazeuse
L'extraction est immédiatement
chromatographie en phase gazeuse.
suivie
d'une
analyse
par
28
Les conditions opératoires sont les suivantes : chromatographe Girdel
série 30, colonne en acier de 2 m (1,9 mm diamètre interne, carbowax 20M
10% sur chromosorb WAW 80-100 mesh), H2 (2,2 bars), air synthétique
(O 2 : N2 20 : 80, 1,0 bar), N2 (0,5 bar à 60°C), programmation de
température (2°C/mn de 60 jusqu'à 200°C, maintenus constants 30 mn),
injecteur et détecteur à ionisation de flamme à 250°C, 3 µl injectés,
enregistreur Sefram Servotrace (5 mm / mn), intégrateur ICAP 50 Delsi.
Identification des pics
Mis à part l’anisacétone, les pics ont été identifiés par coinjection avec
des substances témoins. Il a été tenu compte des coefficients de réponse
vis-à-vis du détecteur [25].
RÉSULTATS
Caractéristiques des fruits
Les diakènes sont pratiquement tous non divisés et non courbés ; on a
moins de 1 % d’akènes et moins de 3 % de fruits tordus.
Le pourcentage de fruits bruns des clones 1000-1001 est
significativement inférieur à celui des clones 1002-1008 et 1009-1012
(Tableau I).
Le poids de 500 diakènes verts varie de 3,45 à 4,85 g et celui de 500
diakènes mûrs de 2,7 à 4,75 g. Les diakènes verts sont toujours plus lourds
que les bruns, mais leurs poids ne sont pas pour autant fortement corrélés
(r = 0,55). Leur rapport varie de 1,02 (clone 1000) à 1,59 (clone 1006).
Les diakènes des clones 1000-1001 sont significativement moins légers
que ceux des clones 1002-1008. Le clone 1000 présente les fruits les plus
lourds.
29
Tableau I :
Poids et teneur en essence des diakènes
de 13 clones de Fenouil doux
clones 1000 - 1001 : enracinement sans AIB
clones 1002 - 1008 : enracinement avec AIB
clones 1009 - 1012 : milieu de base avec colchicine
La teneur en essence des fruits mûrs est rapportée à 500 diakènes, 100 g
de matière sèche (MS) ou fraîche (MF)
Clones
% de
fruits
Poids
de 500 diakènes
Teneur en essence
mg / 500 g / 100 g g / 100 g
diakènes
MS
MF
bruns
bruns
verts
bruns
1000
48
4,85
4,75
235
5,9
4,9
1001
79
4,7
3,7
195
6,7
5,2
x 1000-1001
64
4,8
4,2
215
6,3
5,1
1002
83
3,65
3,5
160
6,1
4,9
1003
87
4,3
3,55
180
6,5
5,1
1004
92
4,45
3,3
175
6,7
5,4
1005
76
3,95
2,95
175
5,3
4,4
1006
95
4,3
2,7
145
5,9
4,8
1007
85
4,4
3,5
175
5,7
4,7
1008
87
4,4
3,55
185
6,7
5,5
x 1002-1008
86
4,2
3,3
170
6,1
5,0
x 1000-1008
81
4,35
3,5
180
6,2
5,0
1009
91
4,6
4,05
220
7,2
5,8
1010
96
4,45
3,5
190
5,6
4,6
1011
95
4,8
3,85
220
7,0
5,6
1012
92
3,45
3,35
210
7,5
5,9
x 1009-1012
94
4,35
3,7
210
6,8
5,5
x 1000-1012
85
4,35
3,55
190
6,4
5,1
30
Teneur en essence
Les 13 clones renferment de 5,3 à 7,5 g d’essence par 100 g de matière
sèche (Tableau I). Une relation semble exister entre le poids des diakènes
bruns et leur richesse en essence (r=0,82). Néanmoins, le clone 1012 a une
teneur en essence supérieure à celle du clone 1002 malgré des fruits plus
légers.
Rapportée au nombre de diakènes, la teneur en essence (Tableau I) des
clones 1009-1008 est significativement inférieure à celle des clones
1001-1002 et 1009-1012. On a 170 mg par 500 diakènes bruns contre 215 et
210 mg respectivement. Mais les différences sont non significatives quand la
teneur est rapportée au poids de matière sèche ou fraîche.
Composition de l’huile essentielle
L’essence est caractérisée par un pourcentage élevé d’(E)-anéthole,
nettement supérieur à celui de son isomère l’estragole (Figures 1 et 2,
Tableau II). On a moins de 0,1 % de (Z)-anéthole.
α -pinène
camphène
β-pinène
sabinène
α-phellandrène
myrcène
limonène
O
C H 3O
β-phellandrène
γ-terpinène
p-cymène
estragole
fenchone
CHO
CH 3O
(Z)-anéthole
CH 3O
(E)-anéthole
CH 3O
anisaldéhyde
C H 3O
O
anisacétone
Fig. 1 : Formules développées de quelques constituants de l’huile
essentielle des fruits de Fenouil doux
31
Les échantillons présentent tous des composés d’oxydation (notamment
l’anisaldéhyde, l’anisacétone) dus au stockage et formés aux dépens de
l’(E)–anéthole [26]. Ils présentent entre eux une forte corrélation (r>0,94) et
sont inversement proportionnels à l’(E)-anéthole (r<-0,96). Ils sont
importants pour le clone 1002.
On a peu d’α–pinène (2,0-2,5 %), de limonène + β-phellandrène
(1,8-2,3 %) et de fenchone (1,1-2,1 %). On observe de plus des traces de
camphène (0,1 %) et de β-pinène, du sabinène (0,3-0,4 %), du myrcène et de
l’α–phellandrène (0,3-0,4 %), du γ-terpinène (0,2-0,3 %) et du p-cymène
(0,1-0,2 %).
Fig. 2 : Chromatogramme du clone 1012.
L’étalon interne est l’oenanthate d’éthyle.
DISCUSSION
La variété dulce présente habituellement des fruits peu riches en
essence et un rapport α-pinène / limonène inférieur à 0,4 [25, 27].
32
Tableau II :
Profil de l’huile essentielle des diakènes mûrs de 13 clones de
Fenouil doux
Le milieu de base des clones 1009-1012 a été additionné de colchicine.
Les % tiennent compte des coefficients Ki de réponse vis-à-vis du
détecteur.
clones
1000
2,3
0,3
0,4
2,0
0,2
0,1
1,6
3,4
84,3
4,8
1001
2,2
0,4
0,4
2,2
0,3
0,2
1,4
3,4
82,3
6,7
1002
2,3
0,4
0,4
2,3
0,2
0,2
2,1
3,5
75,9
12,4
1003
2,5
0,4
0,4
2,2
0,2
0,2
2,1
3,5
80,6
7,5
1004
2,3
0,3
0,4
2
0,2
0,2
1,4
3,4
83,6
6,0
1005
2,4
0,3
0,4
2,1
0,2
0,1
1,6
3,5
82,1
6,9
1006
2,2
0,4
0,4
2,3
0,2
0,1
1,7
3,5
83,2
5,4
1007
2,5
0,4
0,4
2,1
0,2
0,1
1,7
3,5
81,3
7,3
1008
2,2
0,3
0,3
1,8
0,2
0,1
1,5
3,4
85,6
4,2
x
2,3
0,4
0,4
2,1
0,2
0,1
1,7
3,5
82,1
6,8
1009
2,3
0,4
0,4
2,0
0,2
0,1
1,4
3,5
82,1
7,0
1010
2,1
0,3
0,4
2,1
0,2
0,1
1,1
3,4
84,3
5,4
1011
2,3
0,3
0,4
2,0
0,2
0,1
1,8
3,5
82,3
6,5
1012
2,0
0,3
0,3
2,0
0,2
0,1
1,1
3,5
83,6
6,3
x
2,2
0,3
0,4
2,0
0,2
0,1
1,4
3,5
83,1
6,3
x total
2,3
0,3
0,4
2,1
0,2
0,1
1,6
3,5
82,4
6,6
33
La richesse en essence des 13 clones s’explique facilement par
l’amélioration du Fenouil doux de départ. Le rapport α-pinène / limonène +
β-phellandrène, de 0,95 - 1,09 - 1,18 est relativement élevé. Les 13 clones de
Fenouil doux présentent des profils intermédiaires entre les chémodèmes
(E)-anéthole des variétés dulce et vulgare [27]. Le fort pourcentage
d’(E)-anéthole et la faible teneur en fenchone sont encore la marque d’une
sélection de la population de départ.
La présence importante de composés d’oxydation de l’(E)-anéthole
s’explique par un stockage de longue durée.
L’absence de différence significative entre les clones de Fenouil doux
contraste avec les modifications génétiques importantes décrites dans la
littérature. L’utilisation de la colchicine en culture d’apex n’apparaît pas
comme une voie d’avenir pour améliorer l’essence des Fenouils.
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36
ABSTRACT
Action of colchicine in the micropropagation of fennel
(Foeniculum vulgare Mill.) on the essential oil of fruits
The essential oil of fruits of 13 clones of sweet Fennel obtained by
micropropagation through multiple shoots has been analysed. Four of these
clones have been submitted to colchicine (1 mg / L in the basal medium).
Colchicine does not induce a significant variation of the content or the
composition of oil. Fruits are riche in essential oil (5,3 - 6,4 - 7,5 g / 100 g
of dried matter). The profile of the 13 clones is identical. There is few
α-pinene (2,0-2,5 %), fenchone (1,1-2,1 %), estragole (3,4-3,5 %), and a lot
of (E)-anethole, main compound searched for its anise fragrance.
The use of colchicine in axillary budding micropropagation does not
appear to be a promising way to improve the essential oil of fennel fruits.
Key-words : colchicine, essential oil of fruits, fennel, Foeniculum vulgare.
__________