listeria monocytogenes

Transcription

CHAPITRE 2.10.14.
LISTERIA MONOCYTOGENES
RÉSUMÉ
La listériose est une des plus importantes maladies transmises par les aliments. Les manifestations
cliniques de la maladie chez l’homme comprennent des signes de septicémie, méningite
(ou éningo-encéphalite) et d’encéphalite, fréquemment précédés de symptômes pseudo-grippaux avec
de la fièvre. Chez la femme enceinte, une infection intra-utérine ou cervicale peut entraîner un
avortement spontané ou une mort fœtale tardive. Listeria monocytogenes a également été associé à
des signes de gastro-entérite accompagnés de fièvre. Bien que la morbidité de la listériose soit
relativement faible, la mortalité de la maladie encéphalitique systémique peut être élevée avec des
valeurs proche de 30 %. Les personnes âgées, les femmes enceintes, les nouveau-nés et les
personnes immunodéprimées sont considérés comme ayant un risque élevé de contracter la maladie.
Une large variété d’espèces animales peut être infectée par L. monocytogenes, mais la listériose
clinique est principalement une maladie des ruminants, avec des cas sporadiques occasionnels chez
d’autres espèces. Les principales manifestations cliniques de la listériose animale sont une encéphalite,
une septicémie et un avortement. La maladie est initialement transmise par l’alimentation des animaux.
Les observations histopathologiques et post mortem varient en fonction des signes cliniques.
Un certain nombre de déterminants moléculaires et cellulaires de la virulence ont été identifiés pour cet
agent pathogène intracellulaire. Bien qu’un polymorphisme au sein des souches de L. monocytogenes
ait été mis en évidence pour certains déterminants de la virulence, cette hétérogénéité ne peut pas être
corrélée au pouvoir du micro-organisme à déclencher la maladie. Par conséquent, toutes les souches
de L. monocytogenes doivent être considérées comme potentiellement pathogènes.
Identification de l’agent pathogène : il existe une variété de méthodes conventionnelles et rapides
pour la détection et l’identification de L. monocytogenes dans les aliments et les prélèvements
d’animaux malades. Les méthodes conventionnelles restent « la référence » pour la comparaison avec
d’autres méthodes. Ces méthodes sont fréquemment très sensibles ; elles utilisent des agents sélectifs
et des étapes d’enrichissement pour réduire la contamination par d’autres micro-organismes et
permettre la multiplication de L. monocytogenes.
Il existe différents niveaux de typage des souches de L. monocytogenes même si cela n’est pas imposé
par la réglementation, ils comprennent le sérotypage, la lysotypie, le typage par électrophorèse des
enzymes multilocus, le typage par électrophorèse des fragments obtenus après restriction enzymatique
de l’ADN (de type conventionnel et par électrophorèse en champ pulsé [PFGE]), le typage basé sur le
séquençage d’acides nucléiques et le typage par amplification au hasard de séquences d’ADN (RAPD,
Random Amplification of Polymorphic DNA).
Épreuves sérologiques : les épreuves sérologiques ne sont habituellement pas utilisées pour le
diagnostic de la listériose. Un certain nombre de formats ont été testés et tous ont été trouvés
largement non fiables, manquant de sensibilité et de spécificité. Des épreuves sérologiques
expérimentales basées sur la détection de l’anti-listériolysine O ont été utilisées dans certaines
investigations épidémiologiques et comme support pour le diagnostic d’infection du système nerveux
central lorsque la culture est négative.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : de
grandes difficultés ont été rencontrées pour le développement d’un vaccin contre L. monocytogenes,
Manuel terrestre de l’OIE 2005
1249
Chapitre 2.10.14. — Listeria monocytogenes
car il s’agit d’un micro-organisme intracellulaire nécessitant l’activation des cellules T lors de la réponse
immunitaire. Des vaccins expérimentaux conférant une protection contre l’infection à
L. monocytogenes, ont été testés sur des animaux de laboratoire selon différentes stratégies telles que
l’immunisation avec un plasmide ADN, l’association de molécules CD40 et de L. monocytogenes
inactivés par la chaleur, l’inoculation de mutants déficients en listériolysine avec la listériolysine
encapsulée dans un liposome et enfin l’immunisation avec un antigène de listeria associé à la molécule
IL-12.
A. INTRODUCTION
Bien que Listeria monocytogenes soit connu comme agent pathogène chez l’animal depuis de nombreuses années,
son rôle en tant qu’agent pathogène transmis par les aliments n’a été reconnu seulement que dans les années
1980, quand des investigations documentées d’épizooties de listériose associées à la contamination d’aliments
commencèrent à apparaître dans la littérature (45). Actuellement, L. monocytogenes est considéré comme l’un des
agents pathogènes les plus importants responsables d’infection transmises par les aliments. Les explications
possibles de l’émergence de la listériose humaine transmise par les aliments comme un des problème majeurs de
santé publique seraient les changements importants dans la production, les process de fabrication et la distribution en
agro-alimentaire, l’utilisation fréquente de la réfrigération comme première étape de conservation des aliments, les
modifications dans les habitudes de consommation de la population, particulièrement orientée vers les produits
pratiques et prêts à être consommés, ainsi que l’augmentation du nombre de personnes considérées comme étant à
haut risque pour développer la maladie (personnes âgées, femmes enceintes, nouveau-nés, immunodéprimés)
(42, 49).
Une large variété d’espèces animales peut être infectée par L. monocytogenes comprenant les mammifères, les
oiseaux, les poissons et les crustacés, bien que l’infection clinique ne se manifeste que chez les ruminants ; les porcs
développent rarement la maladie et les oiseaux sont généralement des porteurs subcliniques du micro-organisme. La
plupart des infections chez l’animal sont subcliniques mais la listériose peut survenir soit de façon sporadique ou
épizootique. En plus de l’impact économique de la listériose chez l’animal, il y existe un lien entre l’animal et son rôle
en tant que source d’infection pour l’homme, soit par contact direct avec des animaux infectés, particulièrement lors
des vêlages et des agnelages, soit après consommation de produits d’origine animale contaminés (54). Quoiqu’il en
soit, l’importance relative de la transmission zoonotique de la maladie chez l’homme n’est pas claire et la
contamination de l’environnement de production des aliments relève apparemment plus d’un problème de santé
publique (41).
L’infection primaire de la listériose humaine peut comprendre des signes de septicémie, méningite
(ou méningo-encéphalite) et d’encéphalite, fréquemment précédés de symptômes pseudo-grippaux avec de la fièvre.
Des manifestations de gastro-entérite avec de la fièvre peuvent aussi survenir. Bien que la morbidité de la listériose
soit relativement faible, la mortalité peut être de l’ordre de 30 %. Chez la femme enceinte, l’infection peut se traduire
par une fausse couche, une mort tardive du fœtus ou un accouchement prématuré (42, 47).
Chez l’animal, les manifestations cliniques de la listériose comprennent une encéphalite, une septicémie et de
l’avortement, particulièrement chez les moutons, les chèvres et les bovins. La forme septicémique est relativement
peu fréquente et survient généralement mais de façon non variable chez le nouveau-né. Elle est marquée par une
perte de l’appétit, de la fièvre et la mort. La forme encéphalitique est parfois nommée la « circling disease » du fait
d’une tendance à tourner dans la même direction. Il s’agit de la manifestation la plus fréquente de la maladie chez les
ruminants. Les signes comprennent une dépression, une anorexie, un port anormal de la tête ou le fait de tourner la
tête d’un seul côté, une paralysie faciale unilatérale, et une kérato-conjonctivite bilatérale. L’avortement en fin de
terme est fréquent (après 7 mois chez les bovins et 12 semaines chez les ovins) (26, 53). Une seule forme clinique de
la listériose survient habituellement chez un groupe particulier d’animaux. L’ophtalmie a également été décrite chez
les moutons (52). Des mammites ont également été associées à l’infection à L. monocytogenes chez les ruminants.
Quand la listériose se manifeste chez le porc, les premiers symptômes incluent une septicémie, avec une encéphalite
moins fréquemment identifiée et, rarement un avortement. Bien que les oiseaux soient habituellement porteurs sains,
des cas sporadiques de listériose ont été rapportés, le plus souvent accompagnés de septicémie et, un peu moins
habituellement, d’une méningo-encéphalite. La listériose aviaire peut être la conséquence d’une infection secondaire
suite à une infection virale ou salmonellique (54).
Les recherches post mortem et histopathologiques de la listériose animale dépendent des formes cliniques. Pour la
forme encéphalitique, le liquide céphalorachidien peut être trouble et les vaisseaux méningés congestionnés. Des
lésions pathologiques prononcées du cerveau sont rares. Parfois, la medulla montrent des zones de ramollissement.
1250
Quoiqu’il en soit, l’histopathologie est caractéristique de la maladie avec des amas de cellules inflammatoires
accompagnés au niveau périvasculaire adjacent de tas de cellules plasmatiques (essentiellement des lymphocytes et
des histiocytes) et de manière occasionnelle de neutrophiles. Les micro-abcès du cerveau sont souvent unilatéraux et
peuvent montrer une liquéfaction du neuropile. La substance médullaire et la protubérance annulaire sont le plus
souvent touchées. Dans la forme septicémique, on peut observer de multiples foyers de nécrose dans le foie et,
moins fréquemment dans la rate. Les avortons des ruminants présentent très peu de lésions macroscopiques,
toutefois, une autolyse peut avoir eu lieu si le fœtus n’a pas été expulsé tout de suite (38, 53).
La listériose animale apparaît de façon prédominante comme une maladie transmise par l’alimentation animale,
l’environnement étant la principale source de contamination de l’alimentation animale. L’ensilage est la cause
principale de listériose transmise par l’alimentation animale (22, 55). La muqueuse intestinale est la principale voie
d’entrée après ingestion orale, dans le cas des listérioses septicémique/abortive. Le temps d’incubation peut être
court, comme un jour par exemple. Bien que la pathogénicité de la listériose encéphalitique soit controversée, il
semblerait que le micro-organisme puisse pénétrer dans les terminaisons nerveuses via des éraflures présentes au
niveau de la muqueuse buccale, des lèvres, des narines, de la conjonctive ou des dents et migrer alors de manière
centripète pour causer une infection du système nerveux central. Une voie alternative d’infection pour cette forme de
listériose pourrait être par voie sanguine. La période d’incubation pour la forme encéphalitique est habituellement de
2 à 3 semaines, et la durée de la maladie est courte : 1 à 4 jours (41).
Listeria monocytogenes est une bactérie Gram positif. Elle est responsable de la plupart des infections chez l’homme,
bien que de rares cas d’infections dues à L. ivanovii and L. seeligeri aient été décrits. Chez l’animal,
L. monocytogenes est responsable de la majorité des infections, mais 10 à 15 % des septicémies à listéria chez le
mouton sont dues à L. ivanovii.
Ainsi, bien que L. monocytogenes ait clairement un potentiel zoonotique, elle est également un contaminant important
de l’environnement ayant un impact sur la santé publique.
Il existe une grande variété de méthodes permettant le typage des souches de L. monocytogenes lors des
investigations épidémiologiques, mais la question fondamentale, qui est de savoir si toutes les souches sont capables
de causer la maladie, reste sans réponse (23, 33, 35, 36).
Plusieurs déterminants moléculaires de la virulence ont été identifiés comme jouant un rôle dans l’infection cellulaire
par L. monocytogenes et la recherche des mécanismes d’action constitue l’un des modèles les plus excitants
d’interaction agent pathogène/hôte au niveau cellulaire et moléculaire. Ces déterminants de la virulence comprennent
entre autres, des internalines, la listériolysine O (LLO), la protéine ActA, 2 phospholipases, 1 métalloprotéase et
1 hydrolase des sels biliaires (16, 19). Bien qu’il existe un polymorphisme au sein des différentes souches pour
certains de ces déterminants de virulence, il n’y a pas de corrélation avec la possibilité ou non de l’organisme à
déclencher la maladie (33).
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
Il existe une grande variété de méthodes conventionnelles et rapides actuellement disponibles pour la détection et
l’identification de L. monocytogenes dans les aliments et à partir des prélèvements d’animaux malades. Les
méthodes bactériologiques conventionnelles sont importantes pour différentes raisons : elles permettent l’isolement
de l’organisme en culture pure, ce qui est nécessaire en terme de réglementation. Elles restent la méthode de
référence vis-à-vis des autres méthodes qui sont comparées et validées par rapport à celles-ci. Ces méthodes sont
fréquemment très sensibles et ne nécessitent pas de matériel sophistiqué et coûteux. Certains inconvénients de ces
types de méthodes sont : des temps d’incubation relativement longs nécessaires à la réalisation du protocole,
plusieurs manipulations, la nécessité de posséder de nombreux produits chimiques, réactifs et milieux différents, la
contamination et la prolifération d’autres micro-organismes masquant la présence de la bactérie, la possibilité de
laisser passer des variants atypiques présents dans l’organisme étudié et la relative subjectivité nécessaire lorsque
l’on doit interpréter la croissance bactérienne sur des boîtes de gélose sélective et différentielle (1).
L’isolement et l’identification de L. monocytogenes dans les aliments, l’environnement ou les prélèvements
vétérinaires nécessitent l’utilisation d’agents sélectifs et de procédures d’enrichissement de façon à limiter les
micro-organismes contaminants à un niveau raisonnable et à permettre ainsi la multiplication de L. monocytogenes à
un niveau suffisant pour assurer la détection de l’organisme. Dans les premiers temps de la bactériologie clinique de
la listériose, un enrichissement à froid était habituellement réalisé à cette fin, exploitant la capacité de l’organisme à
se multiplier aux températures de réfrigération alors que les bactéries de contamination ne peuvent pas se multiplier
dans ces conditions. Cependant, cette procédure nécessite des temps d’incubation très longs, souvent des mois ce
1251
qui est inacceptable pour les investigations actuelles lors d’épizooties d’origine alimentaire ou de cas sporadiques. Il
en est de même pour la mise en place des programmes d’analyse des dangers et d’identification des points critiques
en production agro-alimentaire et dans les sites de transformation. Un nombre de composants sélectifs permettant la
croissance de L. monocytogenes à des températures normales d’incubation ont été ajoutés aux milieux de culture,
permettant de raccourcir ainsi le délai nécessaire à la croissance sélective de l’organisme. Ces composants sélectifs
sont par exemple : cycloheximide, colistine, cefotetan, fosfomycine, lithium chloride, acide nalidixique, acriflavine,
phényléthanol, céftazidime, polymixine B et moxalactam (2, 3, 7, 27, 31, 51).
Le diagnostic bactériologique de la listériose animale comprend traditionnellement l’isolement direct à partir d’un
prélèvement sur une gélose au sang ou un autre milieu enrichi et en parallèle la technique de l’enrichissement à froid,
avec des sous-cultures hebdomadaires pendant 12 semaines (24, 40, 53). L’introduction de procédures alternatives
d’enrichissement et d’agents sélectifs pour l’isolement de L. monocytogenes à partir des aliments et de
l’environnement a ouvert la possibilité d’utiliser ces techniques pour l’analyse bactériologique des échantillons
provenant d’animaux malades.
En dépit des progrès réalisés dans l’isolement sélectif L. monocytogenes des aliments, il existe encore de la place
pour l’amélioration dans de nombreux domaines. Aucune procédure ne peut être créditée comme étant suffisamment
sensible pour détecter L. monocytogenes dans tous les types d’aliments (17). De plus, des cellules de
L. monocytogenes stressées et moribondes peuvent être trouvées grâce au processus de réfrigération, chauffage,
acidification et à d’autres types de traitement chimique ou physique. Ces bactéries stressées nécessitent des
conditions de culture particulières de revivification avant de pouvoir être détectées en culture.
a)
Méthodes de culture
Des méthodes conventionnelles d’isolement L. monocytogenes à partir des aliments ont été reconnues dans le
cadre de la règlementation internationale incluant la méthode américaine de la Food and Drug Administration
(FDA) (27), la méthode officielle de l’Association of Official Analytical Chemists (AOAC) (7), la norme ISO 11290
(31, 32), la méthode du département de l’agriculture des États-Unis d’Amérique (USDA) - Services d’inspection
et de sécurité alimentaire (51) et les méthodes de référence françaises (2, 3).
En fonction de la nature de l’échantillon, une méthode particulière peut être plus appropriée qu’une autre. Le
« International Organization for Standardization Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural Food Products,
Subcommittee SC 9, Microbiology », a annoncé que la méthode ISO Standard 11290, parties 1 et 2 (31, 32),
peut être utilisée pour la détection de L. monocytogenes dans une large variété de produits alimentaires et de
produits d’alimentation animale. Bien que ce comité reconnaisse que cette norme puisse ne pas être appropriée
dans certains cas, il recommande que des efforts soient faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque
fois que cela est possible.
Les méthodes FDA et AOAC peuvent être utilisées pour les laits et les produits laitiers. La méthode USDA-FSIS
est recommandée pour les viandes rouges et la volaille (produit cru ou cuit prêt à être consommé), les œufs et
les ovoproduits ainsi que les échantillons d'environnement.
La procédure traditionnelle d'isolement de L. monocytogenes des tissus animaux a été l'étalement direct des
prélèvements sur une gélose au sang de mouton ou un autre milieu de culture riche et l'utilisation concomitante
de la technique d'enrichissement à froid, avec des sous-cultures hebdomadaires jusqu'à 12 semaines
(24, 40, 53). L'isolement de l'organisme par étalement direct est relativement facile si le nombre de bactérie est
important dans un organe habituellement stérile, comme c'est le cas dans la forme septicémique de la maladie.
Mais l'isolement est difficile lorsque l'organisme est présent en faible nombre, comme dans le cas de la forme
encéphalitique ou quand les prélèvements sont fortement contaminés. Une comparaison entre les performances
de l'étalement direct, de l'enrichissement à froid et de la méthode AOAC, a clairement montré la supériorité de
cette dernière par rapport aux 2 autres pour l'isolement de L. monocytogenes dans des prélèvements variés
d’animaux post mortem, à la fois en terme de temps nécessaire à l'isolement et à l'identification de l'organisme
qu’en terme des taux d'isolement (20).
Pour le dénombrement de L. monocytogenes, la méthode de référence ISO Standard 11290, partie 2 (32) est
appliquée ainsi que le protocole optionnel mentionné dans les méthodes FDA et USDA-FSIS (27, 51).
i)
Isolement
Les échantillons destinés à l'analyse doivent être représentatifs de l'aliment, incluant la surface externe et
l'intérieur. Dans le cas de listériose animale, les échantillons seront choisis en fonction des signes cliniques de la
maladie : prélèvements des lésions dans le foie, les reins et/ou la rate, dans le cas de forme septicémique ; dans
le liquide rachidien, la protubérance annulaire et la substance médullaire dans le cas de la forme
1252
encéphalitique ; et le placenta (cotylédons), le contenu fœtal abdominal et/ou les sécrétions utérines dans le cas
d'avortement. Les températures de réfrigération (4°C) doivent être maintenues pour la conservation et
l'acheminement des prélèvements. Si l'échantillon est déjà congelé, il doit être gardé congelé jusqu'à l'analyse.
Tous les milieux de culture préparés seront soumis à un contrôle-qualité et doivent permettre la croissance de
l'organisme recherché à partir d’un inoculum faible. La souche de référence doit être cultivée en parallèle des
échantillons suspectés de façon à s'assurer que les tests fonctionnent correctement.
Ces méthodes conventionnelles de culture comprennent une procédure d'enrichissement basée sur l'utilisation
de milieu de culture liquide contenant des agents sélectifs. La nature des milieux et des agents sélectifs varie
selon la méthode. La méthode FDA (27) et la méthode ISO utilisent toutes les deux une étape de préenrichissement qui permet la revivification des cellules de L. monocytogenes stressées, alors que dans la
méthode USDA-FSIS (51) et la méthode AOAC (7), les échantillons sont directement traités dans le bouillon
d'enrichissement. Dans le cas de la méthode FDA, le pré-enrichissement s'effectue à 30°C pendant 4 h en
bouillon trypticase-soja contenant de l'extrait de levure sans agents sélectifs. Le protocole ISO utilise un
« enrichissement primaire » pendant 24 h à 30°C en présence d'agents sélectifs, mais en demi-concentration
(« bouillon Fraser-demi »). Lorsqu'il s'agit d'échantillons provenant de listériose animale, le volume de tissu
animal disponible pour l'analyse peut ne pas être suffisant par rapport au volume recommandé pour
l'enrichissement des échantillons d'aliments (25 g ou ml). Si c'est le cas, le plus grand volume possible de
prélèvement est utilisé (il faut compter entre 10 et 25 g ou ml) (20).
Les échantillons sont enrichis pendant 24 à 72 h à 30°C, 35°C ou 37°C, selon la méthode. La méthode FDA
utilise du TSB YE contenant de l'acriflavine, de l'acide nalidixique et du cycloheximide. La méthode USDA-FSIS
utilise 2 étapes d'enrichissement : l'enrichissement primaire est fait dans le milieu de l'Université de Vermont
(UVM), contenant de l'acide nalidixique et de l'acriflavine ; l'enrichissement secondaire est effectué en bouillon
Fraser, contenant de l'acide nalidixique, du chlorure de lithium et de l'acriflavine. La norme ISO propose le
bouillon Fraser pour le second enrichissement, contenant les agents sélectifs en concentration entière alors que
l'enrichissement primaire est effectué en bouillon Fraser-demi, comme cela a été dit précédemment. La méthode
AOAC demande un enrichissement sélectif en bouillon trypticase soja contenant de l'acriflavine, de l'acide
nalidixique et du cyclioheximide (« milieu d'enrichissement sélectif »).
Après un enrichissement sélectif, les cultures sont ensuite isolées sur différentes géloses
sélectives/différentielles pour l'isolement de colonies présumées de L. monocytogenes. Toutes les méthodes
utilisent la gélose Oxford, sauf la méthode USDA-FSIS, qui utilise une gélose Oxford de formulation modifiée
(MOX). La gélose Oxford renferme du chlorure de lithium, du cycloheximide, de la colistine, de l'acriflavine, du
cefotan et de la fosfomycine comme agents sélectifs, et les colonies typiques de Listeria sont petites, noires et
entourées d'un halo noir. En plus de la gélose Oxford, la FDA utilise du chlorure/phényléthanol/moxalactam de
lithium (LPM) ou gélose PALCAM et la méthode standard ISO utilise cette dernière qui renferme du chlorure de
lithium, de la polymixine B, de l'acriflavine et du ceftazidime. La gélose MOX utilisée dans la méthode
USDA-FSIS contient du chlorure de lithium, de la colistrine et du moxalactam.
ii)
Identification
Les colonies typiques de Listeria spp. sur les géloses sélectives/différentielles citées sont ensuite sélectionnées
pour une identification de l'espèce, utilisant une batterie de tests. Les tests comprennent la coloration de Gram,
la catalase, la mobilité (à la fois à l’aide d’une préparation humide observée en microscopie à contraste de
phase et par inoculation dans un milieu pour tester la mobilité), l'hémolyse et l'utilisation des sucres. Certains
des protocoles sont adaptés à partir de tests conventionnels ou non conventionnels disponibles
commercialement par exemple : Vitek, API, MICRO-ID, trousse de diagnostic d'immuno-essais de type ELISA et
tests basés sur les acides nucléiques pour aider à l'identification de L. monocytogenes.
Le test de Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP test) est un outil très utile pour aider à identifier l'espèce de
Listeria spp à laquelle appartient l'isolat. Il est utilisé dans les protocoles de l'ISO et de l'AOAC et il est considéré
comme optionnel dans les méthodes FDA et USDA-FSIS. Le test est simple à réaliser et facile à lire. Il consiste
à réaliser un ensemencement de souches de Staphylococcus aureus β-hémolytique (Souche ATCC 49444 ou
25923, Souche NCTC 7428 ou 1803) et Rhodococcus equi (Souche ATCC 6939, Souche NCTC 1621) en un
seul trait en traçant des lignes parallèles, sur une gélose au sang de mouton ou une gélose double couche avec
une très fine couche de gélose au sang. Les ensemencements doivent être suffisamment séparés pour permette
la lecture des souches à tester et des souches témoins qui seront ensemencées perpendiculairement entre les
2 organismes indicateurs, sans qu'elles se touchent (séparées de 1 à 2 mm). Après une incubation de 24 à 48 h
à 35 à 37°C (12 à 18 h si la couche mince de gélose au sang est utilisée), une réaction positive est visible par
une zone de β-hémolyse à l'intersection entre les souches testées et la souche indicatrice.
1253
Tableau 1. Différenciation des espèces de Listeria
Espèces
Hémolyses
Production d’acide
Test CAMP
Rhamnose
Xylose
S. aureus
R. equi
L. monocytogenes
+
+
–
+
–
L. innocua
–
V
–
–
–
L. ivanovii
+
–
+
–
+
L seeligeri
(+)
–
+
(+)
–
L. welshimeri
–
V
+
–
–
L. grayi subsp. Grayi
–
–
–
–
–
L. grayi subsp. Murrayi
–
V
–
–
–
V : variable; (+) : réaction faible ; + : > 90 % réactions positives ; – : pas de réaction.
La sérologie, le typage lysogénique et l'essai de pathogénicité sur la souris immunodéprimée sont considérés
comme des tests optionnels de ces méthodes.
b)
Méthodes d’identification rapides
i)
MICRO-ID Listeria
MICRO-ID Listeria est un système disponible sur le marché (Organon Teknika Corp., 100 Akzo Ave., Durham,
NC 27712, USA) qui a été validé par l’AOAC (méthode 992.18) (4) pour l’identification présomptive de l’espèce
Listeria à partir d‘aliment ou d’échantillons d’environnement. Il permet une alternative aux tests conventionnels
biochimiques des isolats de Listeria spp. selon les méthodes FDA et USDA-FSIS. Il est basé sur le fait que
l’inoculum testé renferme des enzymes qui peuvent être détectées après 24 h à 37°C. La différenciation de
l’espèce Listeria est basée sur un code octal obtenu après addition des valeurs numériques pour chaque groupe
de 3 tests et sur les réactions obtenues par le CAMP test et les caractéristiques d’hémolyse qui sont réalisées
séparément.
ii)
Le système Vitek Automicrobic
Le système Vitek Automicrobic (bioMérieux Vitek, Inc., 595 Anglum Dr., Hazelwood, MO, USA) est un système
automatique d’identification microbiologique qui peut être utilisé pour l’identification présomptive des espèces de
Listeria transmises par les aliments et pour le dépistage des isolats non-Listeria. Il a été validé par l’AOAC
comme méthode 992.19 (5). Le système utilise une chambre d’incubation avec un lecteur optique, une unité de
préparation pour l’inoculation du test et un micro-ordinateur. Des cartes d’identification des bactéries Grampositives (GPI) et des bactéries Gram-negatives (GNI+) contiennent chacun 30 tests biochimiques. Les
modifications sont analysées par le micro-ordinateur qui identifie l’organisme testé au niveau du genre et/ou de
l’espèce. L’identification des espèces Listeria nécessite l’utilisation d’une carte GPI et de 2 réactions sur la carte
GNI+. Néanmoins, pour l’identification de certaines Listeria, l’analyste doit réaliser le CAMP test, l’hémolyse
et/ou les tests de réduction des nitrates comme cela est décrit dans la méthode FDA.
Les organismes placés dans la catégorie « LM » sont identifiés comme L. monocytogenes ou L. innocua ; dans
la catégorie « LI », comme L. ivanovii ou L. seeligeri ; dans la catégorie « LW », comme L. welshimeri ; et dans
la catégorie « LG », comme L. grayi or L. murrayi (une sous-espèce de L. grayi). Les organismes dans la
catégorie « O » sont classés comme des espèces non-Listeria. D’autres tests doivent être réalisés pour identifier
l’espèce au sein de chaque catégorie selon la méthode FDA.
D’autres méthodes commercialement disponibles pour l’identification des espèces Listeria comprennent la
galerie API LISTERIA (bioMérieux), le MICROBACT 12L (Microgen), le système MicroLog (Biolog), le système
d’identification microbiologique Sherlock Microbial Identification System (MIS) (Microbial ID ; basé sur les profils
d’acides gras) et le système Walk/Away (MicroScan).
iii)
Méthodes rapides de détection immunologiques
Un certain nombre de méthodes immunologiques ont été développées pour identifier L. monocytogenes dans
les aliments et les méthodes suivantes disponibles commercialement ont été validées par un ou plusieurs
systèmes de validation reconnus (18, 46).
1254
•
Méthode colorimétrique immuno-enzymatique utilisant un anticorps monoclonal (Listeria-Tek)
Le Listeria-Tek est une méthode officielle de l’AOAC 994.03 (8) et elle est mise en œuvre pour la détection de
Listeria spp. dans les produits laitiers, les produits de la mer et les viandes. Du fait que l’anticorps monoclonal
(AcM) peut donner des réactions croisées avec les autres Listeria spp., le test n’est pas un test de confirmation
de L. monocytogenes.
La trousse de diagnostic est disponible commercialement chez Organon Teknika Corp., 100 Akzo Ave, Durham,
NC 27704, USA.
Les cultures enrichies trouvées positives par cette méthode doivent être isolées sur des milieux sélectifs et les
colonies suspectes sont confirmées biochimiquement pour l’identification de L. monocytogenes selon la
méthode FDA. Un résultat positif est seulement validé si les témoins positifs et négatifs ont donnés des valeurs
d’absorbance correctes.
•
Méthode de dépistage colorimétrique immuno-enzymatique utilisant un anticorps polyclonal (TECRA®
Listeria Visual Immunoassay [TLVIA])
Le TLVIA est une méthode officielle de l’AOAC 995.22 (9) et elle est mise en œuvre pour la détection de Listeria
spp. dans les produits laitiers, les produits de la mer et les viandes (sauf la viande hachée crue) et les légumes à
feuilles.
La trousse de diagnostic est disponible commercialement chez TECRA International Pty Ltd, P.O. Box 788,
Willoughby, NSW, Australie.
Les cultures enrichies trouvées positives par cette méthode doivent être isolées sur des milieux sélectifs et les
colonies suspectes identifiées selon les critères spécifiés dans les méthodes de la FDA et de l’USDA.
•
®
Méthode immuno-enzymatique Assurance utilisant un anticorps polyclonal
La méthode immunoenzymatique Assurance® Listeria est une méthode officielle de l’AOAC 996.14 (10) et elle
peut être utilisée pour la détection de Listeria spp., incluant L. monocytogenes, dans les produits laitiers, les
viandes rouges, le porc, les produits de volaille, les fruits, les fruits à coques, les produits de la mer, les pâtes,
les légumes, les fromages, l’alimentation animale, le chocolat et les œufs.
Les lectures au dessus de la valeur seuil sont considérées comme des résultats positifs présomptifs et les
cultures enrichies doivent ensuite être confirmées par les procédures d’isolement et d’identification décrites dans
la méthode FDA.
nd
La trousse de diagnostic est disponible commercialement chez BioControl Systems, Inc., 12822 SE 32
Bellevue, WA 98005, USA.
•
St.,
Test Visual Immunoprecipitate (VIPTM)
Le test VIPTM est une méthode officielle de l’AOAC 997.03 (11). Il peut être utilisé pour la détection de
L. monocytogenes et des autres Listeria spp. dans les produit laitiers, les viandes rouges, le porc, la volaille et
les produits dérivés, les produits de la mer, les fruits, les légumes, les pâtes, le chocolat, les œufs et la farine
animale. Les tests positifs présomptifs doivent être confirmés par les procédures d’isolement et d’identification
décrites par la méthode FDA.
Les unités VIP sont disponibles commercialement chez BioControl Systems, Inc., 12822 SE 32nd St., Bellevue,
WA 98005, USA.
•
Méthode de tri VIDAS LIS
Cette méthode immuno-enzymatique (ELFA) est une méthode officielle de l’AOAC 999.06 (12). Elle a été
validée par l’association française de normalisation (AFNOR) et selon le schéma de l’European Microbiological
Methods Assessment Scheme (EMMAS) (13). Elle est utilisée pour le dépistage des antigènes Listeria spp.
dans des produits laitiers, des légumes, des produits de la mer, des viandes crues et dans la volaille ainsi que
pour les viandes et les volailles en cours de transformation.
1255
Cette méthode immunologique est réalisée avec l’appareil automatisé VIDAS®. L’ordinateur compare les valeurs
à des standards et un rapport d’analyse positif ou négatif est produit. Les résultats positifs doivent être confirmés
par la méthode bactériologique standard selon la méthode FDA.
Le système VIDAS est disponible chez bioMérieux, Inc., 595 Anglum Rd., Hazelwood, MO 63042, USA.
D’autres méthodes immunologiques validées selon des systèmes officiels sont disponibles, elles comprennent le
VIDAS Listeria monocytogenes (LMO) ELISA (bioMérieux), validé par l’ AFNOR ; le « Transia Plate Listeria
ELISA » (Transia, Diffchamb Ltd), validé par l’AFNOR ; le système ELISA automatisé EIAFOSS Listeria
(Foss Electric), validé par l’AOAC Research Institute ; la méthode immunochromatographique REVEAL for
Listeria (Neogen Corporation), validée par l’AOAC Research Institute ; la méthode immunochromatographique
Clearview Listeria Rapid Test (Oxoid), validée par l’AFNOR, EMMAS et l’AOAC Research Institute et le système
Listertest (Vicam), d’immunoséparation magnétique validé par l’AOAC Research Institute (13).
D’autres méthodes disponibles basées sur l’immunologie, comprennent le test ELISA « Transia Plate Listeria
monocytogenes » (Transia, Diffchamb Ltd), les « Dynabeads anti-Listeria » basées sur la séparation
TM
immunmagnétique (Dynal Ltd), le test ELISA « Listeria UniQue ELISA » (TECRA), le test d’agglutination au
latex « Microscreen Listeria » (Microgen BioProducts Ltd), et le test EIA « Listeria Rapid Test » (Oxoid).
iv)
Méthodes basées sur la reconnaissance des acides nucléiques
Un certain nombre de méthodes basées sur la reconnaissance des acides nucléiques ont été développées pour
l’identification de L. monocytogenes dans les aliments. Quelques-unes d’entre elles ont été validées par un ou
plusieurs organismes de validation et sont commercialement disponibles (39).
•
Test GENE-TRAK Listeria
Le test GENE-TRAK Listeria est une méthode colorimétrique d’hybridation de l’ADN pour la détection de
séquences de Listeria, qui a été validée par l’AOAC comme méthode 993.09 (6) utilisée pour les produits
laitiers, les viandes et les produits de la mer. Ce test a aussi été validé par l’AFNOR. Compte tenu des réactions
faussement positives, les échantillons positifs doivent être confirmés par des méthodes bactériologiques de
référence.
Les échantillons trouvés positifs par ce test d’hybridation de l’ADN doivent être confirmés par isolement de la
suspension en solution physiologique tamponnée au phosphate sur une gélose sélective Listeria et les
confirmations biochimiques doivent être poursuivies sur les isolements présomptifs de Listeria comme décrit
dans la méthode FDA.
TM
Le test GENE-TRAK Listeria est commercialement disponible chez GENE-TRAK
Hopkinton, MA 01748, USA.
•
Systems, 94 South Street,
Système BAX®
®
L’USDA-FSIS a adopté le système BAX basé sur l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) (Qualicon)
(50) comme une nouvelle méthode de recherché de L. monocytogenes dans les échantillons enrichis de viandes
et de volaille. Il diminue le temps nécessaire à identifier les échantillons négatifs à 24 h et diminue le nombre de
résultats faux positifs avec une limite de détection inférieure à 1 ufc/g dans 25 g d’échantillon. Tous les
échantillons qui sont présumés positifs pour L. monocytogenes sont ensuite soumis à une confirmation
bactériologique par les méthodes conventionnelles.
•
Test GENE-TRAK test pour Listeria monocytogenes
TM
Le test GENE-TRAK pour L. monocytogenes (GENE-TRAK
d’hybridation validée par l’AFNOR (13).
•
Systems) est une méthode basée sur une sonde
Test de confirmation Gen-Probe (AccuProbe®) Listeria monocytogenes
Le test Gen-Probe (AccuProbe®) Listeria monocytogenes Confirmatory Test (Gen-Probe) est une autre méthode
basée sur une sonde d’hybridation validée par l’AFNOR (13).
1256
•
Méthode AD713
La FDA utilise une méthode AD713 (25) basée sur des sondes correspondant aux gènes codant pour la protéine
d’invasion et pour l’hémolysine (hly) de L. monocytogenes. Cette méthode associe la détection du gène de
l’hémolysine de L. monocytogenes (aussi appelée listeriolysine O) par l’utilisation d’une sonde oligonucléotidique
AD13, avec la détection du gène de la protéine associée à l’invasion par une sonde synthétique, AD07. Les
2 sondes sont utilisées en association (désignée AD713) pou éviter des résultats faux négatifs du fait de
mutation silencieuse dans le gène (modification du nucléotide qui peut modifier la fixation sur la sonde mais ne
change pas la fonction du gène). Les échantillons positifs doivent être confirmés par les procédures
conventionnelles décrites par la méthode FDA.
D’autres méthodes commercialement disponibles basées sur la reconnaissance des acides nucléiques
®
comprennent le test PCR Foodproof Listeria monocytogenes (Biotecon Diagnostics) et le test PCR
TM
PROBELIA (L. monocytogenes) (Sanofi Diagnostics). L’application de la PCR en temps réel a aussi été
développée en tant que méthode quantitative de détection spécifique pour L. monocytogenes, (28) et a montré
un bon potentiel pour l’analyse en routine. Le tableau 2 résume certains des systèmes commercialement
disponibles pour la détection rapide de Listeria et la confirmation.
Tableau 2. Systèmes commerciaux pour le dépistage rapide de Listeria et la confirmation1
Temps
approx. du
test
Fabricant
Utilisation
principale
Test
Niveau d’identification
Principe
MICRO-ID Listeria
L. monocytogenes/innocua
complex
Réaction
enzymatique
24 h
Organon
Teknika
Confirmation
Vitek System
complex
Tests Biochimiques
24 h
bioMérieux
Confirmation
API Listeria
L. monocytogenes
Tests Biochimiques
24 h
bioMérieux
Confirmation
MicroLog System
L. monocytogenes
Substances source
de carbone
4 ou 24 h
Biolog
Confirmation
MICROBACT 12L
L. monocytogenes
Utilisation de
carbohydrate et du
test de micro
hémolyse
4-6 ou 24 h
Microgen
Confirmation
Sherlock Microbial
Identification System
(MIS)
complex
Basé sur les acides
gras
90 min
Microbial ID
Confirmation
Gen-Probe
(AccuProbe)
L. monocytogenes
Sonde nucléique
d’hybridation
30 min
Gen Probe
Confirmation
Microscreen
Listeria spp.
Agglutination Latex
1 min
Microgen
BioProducts
Confirmation
Listeria Tek
Listeria spp.
ELISA
50 h
Organon
Teknika
Dépistage
TECRA Listeria
Visual Immunoassay
(TLVIA)
Listeria spp.
ELISA
50 h
TECRA
Dépistage
Assurance Listeria
EIA
Listeria spp.
ELISA
50 h
BioControl
Systems
Dépistage
1 : Adapté et développé de la réf. 13
2 : Lorsqu’il est utilisé pour la confirmation, le temps indiqué pour le test ne comprend pas l’enrichissement et
l’isolement sur gélose
1257
Tableau 2 suite. Systèmes commerciaux pour le dépistage rapide de Listeria et la confirmation1
Temps
approx. du
test
Fabricant
Utilisation
principale
Test
Niveau d’identification
Principe
VIP Listeria
Listeria spp.
Immunochromatographie
2 min (postenrichissement)
BioControl
Systems
Dépistage
VIDAS Listeria (LIS)
Listeria spp.
ELISA
50 h
BioMérieux
Dépistage
VIDAS Listeria
monocytogenes
(LMO)
L. monocytogenes
ELISA
50 h
bioMérieux
Dépistage
Foodproof Listeria
monocytogenes
L. monocytogenes
PCR
48 h
Biotecon
Diagnostics
Dépistage
Transia Plate
Listeria
Listeria spp.
ELISA
50 h
Diffchamb
Dépistage
Transia Plate
Listeria
monocytogenes
L. monocytogenes
ELISA
50 h
Diffchamb
Dépistage
Dynabeads antiListeria
Listeria spp.
Séparation
Immunomagnétique
48-72 h
Dynal
Dépistage
EIAFOSS Listeria
Listeria spp.
ELISA automatisé
48 h
Foss Electric
Dépistage
Gene Trak Listeria
Assay
Listeria spp.
Essai d’hybridation
des acides
nucléiques
50 h
Gene Trak
Dépistage
Gene Trak test for L.
monocytogenes
L. monocytogenes
Essai d’hybridation
des acides
nucléiques
50 h
Gene Trak
Dépistage
REVEAL for Listeria
Listeria spp.
43 h
Neogen
Dépistage
Clearview Listeria
(Oxoid Listeria
Rapid Test)
Listeria spp.
43 h
Oxoid
Dépistage
BAX for screening L.
monocytogenes
L. monocytogenes
PCR
48 h
Qualicon
Dépistage
BAX for screening
Listeria Genus
Listeria spp.
PCR
48 h
Qualicon
Dépistage
PROBELIA
L. monocytogenes
PCR
48 h
Sanofi
Diagnostics
Pasteur
Dépistage
Listeria UniQue
Listeria spp.
ELISA
32 h
TECRA
Dépistage
Listertest
Listeria spp.
Séparation
immunomagnétique
24-48 h
Vicam
Dépistage
SwabCheck System
Listeria spp.
ELISA
24 h
Biopath
Dépistage
1 : Adapté et développé de la réf. 13
2 : Lorsqu’il est utilisé pour la confirmation, le temps indiqué pour le test ne comprend pas l’enrichissement et
l’isolement sur gélose
1258
v)
Typage
L’identification règlementaire de L. monocytogenes ne nécessite pas le typage spécifique des isolats.
Néanmoins, les schémas de typage peuvent être utiles pour les investigations lors d’épizooties, le suivi dans
l’environnement et la surveillance en santé publique.
Listeria monocytogenes peut être caractérisée par un certain nombre d’approches différentes comprenant le
sérotypage, la lysotypie, l’électrophorèse des enzyme multilocus (MEE), l’analyse de restriction enzymatique de
l’ADN (soit en utilisant des enzymes à haute fréquence de coupure et une électrophorèse conventionnelle pour
séparer les fragments, soit en utilisant les enzymes à sites de coupure rares et l’électrophorèse en champ pulsé
[PFGE] pour séparer les fragments), le typage basé sur le séquençage d’acides nucléiques et l’amplification au
hasard de séquences d’ADN, (RAPD, Random Amplification of Polymorphic DNA).
Compte tenu de la nécessité de disposer de réactifs spécifiques, des procédures d’assurance-qualité et de
certains équipements sophistiqués, il est recommandé de soumettre les isolats pour sérotypage à des centres
de référence appropriés. Une liste des centres internationaux et des méthodes de typage réalisées est
mentionnée en réf. 14 (pp. 258-259).
•
Sérotypage
Les souches de Listeria sont dotées de 13 sérotypes différents basés sur la combinaison de leurs antigènes
somatiques (O) et flagellaires (H). Bien que tous soient considérés comme potentiellement pathogènes, la
plupart des isolats cliniques (>95 %) appartiennent à 3 sérotypes, 1/2a, 1/2b, et 4b. Comparé à d’autres
méthodes de typage, le sérotypage a un pouvoir de discrimination faible, mais peut apporter une information de
valeur pour distinguer les isolats non impliqués dans une épizootie. Les isolats des aliments et de
l’environnement sont souvent non typables avec les sérums de référence.
•
Lysotypie
Le typage par les bactériophages est une technique ayant un bon pouvoir de discrimination et qui peut être
utilisée pour typer un grand nombre d’isolats. Néanmoins, les sets de phages disponibles actuellement ne sont
pas capables de typer une grande proportion de souches (20 à 51 % dans le cas de set de lysotypie
international). Du fait des exigences de standardisation rigoureuse et de la nature biologique des réactifs, cette
technique est réalisée uniquement dans les laboratoires spécialisés de référence nationaux et internationaux et
est sujette à des variabilités biologiques et expérimentales importantes. En dépit de ces problèmes, la lysotypie
reste la méthode la plus pratiquée et adaptée lors d’épizooties importantes (23).
•
Electrophorèse des enzymes Multilocus (MEE)
Cette technique s’appuie sur les différences des séquences d’acides nucléiques qui entraînent des mobilités
électrophorétiques différentes d’enzymes métaboliques choisies, dans un gel d’amidon, et peut être appliquée
au typage de souches apparentées. Néanmoins le MEE apporte seulement une discrimination modérée lorsqu’il
est utilisé pour des investigations épidémiologiques impliquant L. monocytogenes. Certaines souches peuvent
avoir perdu leur activité enzymatique et par conséquent la technique peut devenir compliquée. Du fait de sa
nature, les résultats inter-laboratoires sont très variables (23).
•
Analyse de la restriction des endonucléases de l’ADN chromosomal
L’analyse de la restriction des endonucléases de l’ADN chromosomique (REA) est une méthode utile pour le
typage de L. monocytogenes. Du fait que ces enzymes sont très spécifiques dans la reconnaissance des
séquences nucléotidiques, les fragments résultant de la digestion de l’ADN, de différentes tailles et mobilités
électrophorétiques, reflètent les différences génomiques à l’origine de profils spécifiques parmi les autres
souches autrement apparentées. Compte tenu de la spécificité des endonucléases de restriction, la méthode est
hautement reproductible. Parmi les endonucléases de restriction testées dans l’étude multicentrique de l’OMS
(Organisation mondiale de la santé), HaeIII, HhaI and CfoI sont les plus intéressantes (23). Néanmoins, du fait
d’un grand nombre de sites de reconnaissance enzymatique sur le génome bactérien, des profils complexes
peuvent survenir parfois, avec des bandes qui se chevauchent ou faiblement résolues qui sont difficiles à
interpréter. La technique par conséquent est inadaptée pour la comparaison d’un grand nombre de profils de
souches ou pour la construction de bases de données évolutives (23).
En associant le REA avec l’hybridation Southern, avec une sonde chromosomique marquée, seuls les fragments
de restriction particuliers associés au loci chromosomiques correspondants seront détectés, ce qui réduit
significativement le nombre de fragments d’ADN à analyser. Cette technique est appelée analyse du
1259
polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Quand des sondes ribosomales ARN/ADN
sont utilisées, seuls les fragments particuliers associés aux loci chromosomiques pour l’ARN sont détectés.
Cette technique est appelée ribotypage et a été largement utilisée pour le typage de L. monocytogenes,
principalement avec l’utilisation de l’endonucléase de restriction EcoRI. Cependant, cette technique a été
trouvée moins discriminante que la lysotypie, le REA ou le MEE. Qualicon a conçu un système automatique de
ribotypage, le « RiboPrinter », qui réalise les analyses et conserve les profils de ribotype des bactéries dont
Listeria.
Quand les endonucléases de restriction à faible fréquence de coupure, sont utilisées pour la digestion de l’ADN
chromosomique brut, tels que ApaI, SmaI, NotI and AscI, de très grands fragments sont obtenus. Du fait de leur
taille, ces grands fragments ne peuvent pas être séparés selon les conditions conventionnelles par
électrophorèse en gel d’agarose. Cependant, en changeant périodiquement l’orientation du champ électrique
dans le gel, par pulsation, les grands fragments peuvent migrer à travers la matrice d’agarose et sont séparés
selon leur différence de taille. Cette technique est appelée électrophorèse en champ pulsé (PFGE) et a
révolutionné la séparation précise des fragments d’ADN de plus de 40 kb. PFGE a été utilisée pour le typage de
L. monocytogenes et la méthode a montré une très bonne discrimination et reproductibilité. La PFGE est
particulièrement utile pour le typage des isolats de sérotype 4b, qui ne sont pas typés de façon satisfaisante par
la plupart des autres méthodes. Les principaux inconvénients de la méthode sont le temps nécessaire pour
réaliser l’analyse (2 à 3 jours), les grandes quantités d’enzymes de restriction nécessaires et coûteuses ainsi
que la nécessité de disposer d’un appareillage coûteux spécialisé (23). Le CDC (Centers for Disease Control
and Prevention) des États-Unis d’Amérique a établi un réseau de laboratoires de santé publique et d’analyses
alimentaires PulseNet, qui réalise en routine le typage de bactéries pathogènes transmises par les aliments par
PFGE. Les Laboratoires PulseNet utilisent des protocoles hautement standardisés et peuvent rapidement
comparer les profils PFGE des différentes localisations via Internet. Listeria monocytogenes a été ajouté à
PulseNet en 1999 (49).
•
Typage basé sur la séquence des acides nucléiques
Bien que des données sur l’analyse des séquences de gènes pour le typage des souches de L. monocytogenes
existent, la détermination des variations alléliques de multiples gènes a récemment été introduite comme une
méthodologie de typage de ce micro-organisme très prometteuse. Cette approche a été identifiée pour une
poignée d’autres micro-organismes et est connue sous le nom de MLST (Multi Locus Sequence Typing) (48).
L’amplification directe et le séquençage (15, 44), de même que l’approche alternative qui cible les modifications
génétiques directement sur un support de puces à ADN (43) ont toutes les deux été utilisées avec une bonne
discrimination entre les souches analysées. Comme le MLST est basé sur les séquences nucléotidiques, il est
hautement discriminant et apporte des résultats non ambigus.
De courtes séquences répétitives sont fréquemment trouvées chez les bactéries et au sein des parties
palindromiques, connues aussi sous le nom de repetitive extragenic palindromes (REP). Elles sont les plus
représentatives des séquences répétitives chez les bactéries. Ces REP sont présent chez L. monocytogenes et
une PCR basée sur les séquences de ces entités (rep-PCR) a permis avec succès de déterminer les sous-types
des souches de cette bactérie. Les 4 principaux groupes de la souche identifiés par cette méthode
correspondent aux lieux d’origine de leur isolement (34).
•
Amplification au hasard de l’ADN polymorphique
Si des amorces sélectionnées arbitrairement sont utilisées pour la PCR en conditions de faible stringence, avec
comme cible l’ADN chromosomique de L. monocytogenes, les profils des amplimères obtenus sont utiles pour le
typage des souches. La RAPD est une méthode alternative à la lysotypie hautement discriminante. Cependant
en dépit de sa relative simplicité et de son pouvoir discriminant, son principal obstacle est la faible
reproductibilité des profils. Les conditions de faible stringence pour l’appariement des amorces entraînent une
polymérisation avec une efficacité variable, et par conséquent les quantités d’ADN produit peuvent être variables
parmi les différents amplimères pour un isolat donné, ce qui fait que l’interprétation des profils RAPD est difficile.
La technique nécessite des données de standardisation et de cohérence pour obtenir des résultats
exploitables (23).
A partir des résultats de l’étude multicentrique du centre de l’OMS pour le typage de L. monocytogenes (21), qui
compare plusieurs méthodes de typage différentes sur un panel d’isolats bien défini, le sérotypage, la lysotypie,
le REA, le PFGE et le RAPD ont été sélectionnés pour une standardisation en Phase II. Cette action devrait
aboutir à la sélection d’un panel de méthodes standardisées pour le typage de L. monocytogenes (23).
1260
2.
Épreuves sérologiques
Les épreuves sérologiques ne sont pas traditionnellement utilisées pour le diagnostic de la listériose. Elles sont
majoritairement peu fiables, manquant de sensibilité et de spécificité. Un certain nombre de support incluant l’ELISA,
la fixation du complément, et la microagglutination ont montré peu de succès dans le diagnostic de la listériose
humaine bactériologiquement confirmée, même en l’absence d’immunosuppression. Des réactions croisées
considérables avec les déterminants antigéniques d’autres organismes Gram-positif ont été observés. D’autre part,
L. monocytogenes est un organisme ubiquitaire et l’exposition régulière des animaux et des hommes à ce
micro-organisme est très fréquente. Beaucoup d’individus sains sont porteurs au niveau intestinal (2 à 6 %) et une
prévalence d’anticorps anti-L. monocytogenes dans le sérum a été retrouvée jusqu’à 53 % chez l’homme. Les taux de
portage pour l’animal sont similaires à ceux des humains, avec des différences en fonction de l’espèce et un taux un
peu plus élevé durant la saison de stabulation comparé à celui des animaux au patûrage (29, 30).
La découverte de l’hémolysine, de L. monocytogenes, la listeriolysine O (LLO), comme facteur majeur de virulence et
qui peut stimuler la réponse en anticorps a récemment redonné de l’intérêt dans la possibilité d’utiliser les épreuves
sérologiques pour le diagnostic de la listériose, particulièrement au niveau du système nerveux central, à partir de
sang stérile et de liquide céphalorachidien, et pour la listériose périnatale. Un test ELISA indirect basé sur la détection
des anti-LLO a été utilisé pour le diagnostic expérimental de la listériose chez le mouton (37). Cependant, la LLO est
antigéniquement apparentée à un certain nombre de cytolysines, incluant la streptolysine O (SLO) de Streptococcus
pyogenes, la pneumolysine de S. pneumoniae et la perfringolysine de Clostridium perfringens. Des problèmes de
réactions croisées des anticorps anti-LLO avec ces cytolysines, particulièrement la SLO et la pneumolysine, ont gêné
le développement de tests basés sur la détection des anticorps anti-LLO sérologiquement fiables. De plus, des
anticorps anti-LLO ont été retrouvés dans une certaine proportion chez des individus sains et des maladies infectés
par d’autres bactéries, champignons ou virus (27 %, tous ensemble), bien que ce soit à des titres plus faibles que
ceux des patient atteints de listériose. L’absorption du sérum à tester avec des SLO est efficace seulement en partie
pour éliminer les réactions croisées. Ces essais expérimentaux ont été utilisés dans certaines investigations
épidémiologiques et comme support pour le diagnostic d’infections du système nerveux central à culture négative.
Des formes recombinantes de la LLO ont été explorées comme alternatives à la LLO sauvage comme antigène pour
le diagnostic dans les tests de Western blot. Ceci est actuellement un secteur en développement et nous devrons
attendre le développement d’épreuves sérologiques validées et fiables pour le diagnostic de la listériose.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES
À USAGE DIAGNOSTIQUE
Il a été montré qu’il était très difficile de développer des vaccins efficaces contre L. monocytogenes qui en tant
qu’organisme intracellulaire nécessite des cellules effectrices de type T pour une réponse immunitaire efficace. Des
vaccins expérimentaux sont en train d’être explorés en animalerie pour apporter une protection contre l’infection à
L. monocytogenes par différentes approches, mais ces vaccins ne sont pas près d’être disponibles pour utilisation
chez l’homme et chez l’animal d’élevage. Ces approches expérimentales comprennent l’immunisation avec des
plasmides ADN, des molécules CD 40 avec des L. monocytogenes tuées par la chaleur, l’inoculation de mutants
déficients en LLO sous forme de liposome de LLO encapsulés et l’immunisation par des antigènes de listéria et la
fraction IL-12.
Les L. monocytogenes génétiquement modifiées sont aussi considérées comme des vecteurs de vaccins efficaces
pour l’expression, la sécrétion et la distribution intracellulaire d’antigènes étrangers pour l’induction d’une réponse
immune potentielle contre les antigènes viraux et les cellules tumorales.
Quoiqu’il en soit, le moyen le plus facile et pratique de réduire le risque de listériose chez l’homme se trouve dans les
mesures de régime et de préparation des aliments qui ne réduit pas seulement le risque de contracter la listériose,
mais contribue aussi à la prévention des autres infections habituelles transmises par les aliments telles que celles
causées par Escherichia coli O157:H7, Salmonella et Campylobacter. Ces mesures préventives comprennent la
cuisson soigneuse des produits crus d’origine animale, la séparation des produits non cuits des légumes, des
aliments de cuisine et des produits prêts à être consommés, le lavage soigneux des légumes avant de les
consommer, le lavage des mains, des couteaux et des planches à découper après avoir manipulé des produits non
cuits, et l’élimination du lait non pasteurisé ou des produits dérivés. Les personnes immunodéprimées, les femmes
enceintes et les autres groupes à risque pour la listériose doivent éliminer les aliments qui ont été
épidémiologiquement liés à la maladie, par exemple, les fromages à pâte molle et le pâté. Ces individus doivent aussi
éviter les produits prêts à être consommés, à moins qu’ils aient été chauffés à la vapeur avant d’être consommés.
1261
L’industrie agro-alimentaire et les agences de santé publique jouent un rôle de pivot dans la prévention de la listériose
transmise par les aliments en développant et en mettant en place des programmes efficaces d’HACCP pour réduire la
présence de L. monocytogenes à tous les points critiques de la chaîne de production et de distribution (de la fourche
à la fourchette).
De même, le manque de vaccins bien définis et testés pour l’utilisation animale, signifie que le contrôle de la listériose
chez l’animal est plus réalisable par prévention des conditions environnementales qui favorisent son apparition. Il y a
un lien bien établi entre les ensilages destinés aux animaux et la listériose et, du fait que L. monocytogenes est
largement disséminée dans la nature, entre les animaux et les oiseaux jouant le rôle de porteurs sains, la
contamination des ensilages et des aliments du bétail est inévitable. Par conséquent, l’effort doit être placé sur la
réduction des risques de multiplication de l’organisme qui apparaît plus fréquemment à des valeurs de
pH supérieures à 5, notamment là où une fermentation inefficace est survenue et où il y a en même temps croissance
de moisissures. Tous les efforts doivent être mis sur la production d’ensilages de bonne qualité, avec de l’herbe
fraîchement coupée et une concentration minimale de souillure et de fèces. Le meilleur ensilage pour l’alimentation
animale doit être sélectionné, spécialement pour les moutons, en rejetant l’ensilage présentant des signes évidents
de moisissures et cela sur une surface de l’ordre de quelques centimètres autour du point contaminé. Les surplus de
l’ensilage devront être éliminés (38).
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.
ANDREWS W. (2002). Current State of Conventional Microbiological Methodology for the Examination of Food. In:
Workshop 102–15. Microorganisms in Foods: Now What? American Society for Microbiology, Washington, DC,
USA.
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AFNOR (1997). Norme Française NF V 08-055. Microbiologie des aliments. Recherche de Listeria
monocytogenes. Méthode de Routine. Paris, France.
3.
ASSOCIATION FRANÇAISE DE NORMALISATION (AFNOR) (2000). Normalisation Française XP V 08-062. Microbiologie
des aliments. Méthode de dénombrement de Listeria monocytogenes. Méthode de Routine. Paris, France.
4.
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5.
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GNI+). Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. In: Official Methods of Analysis of AOAC
INTERNATIONAL, Volume I, Agricultural Chemicals; Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC
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