Anaplasmose bovine

SECTION 2.4.
BOVIDAE
CHAPITRE 2.4.1.
ANAPLASMOSE BOVINE
RÉSUMÉ
Définition de la maladie : l’anaplasmose bovine est due à l’infection par Anaplasma marginale.
Une seconde espèce, A. centrale est connue depuis longtemps. Le fait qu’elle représente une
espèce séparée est incertain. Anaplasma marginale est responsable de presque tous les cas de
maladies cliniques. Une troisième espèce, A. phagocytophilum, a été signalée récemment comme
pouvant infecter les bovins. Cependant, l’infection naturelle semble rare et A. phagocytophilum
n’entraîne pas de maladie clinique. Anaplasma marginale est classé dans le genre Anaplasma
appartenant à la famille des Anaplasmataceae et à l’ordre des Rickettsiales.
Description de la maladie : une anémie et un ictère sont des signes caractéristiques de
l’anaplasmose, mais la maladie ne peut être que confirmée par l’identification de l’organisme. Une
fois infecté, le bovin peut rester porteur pendant toute sa vie et l’identification de ces animaux
dépend de la détection des anticorps spécifiques par des épreuves sérologiques, ou de l’ADN
rickettsial en utilisant des techniques d’amplification.
Identification de l’agent pathogène : l’examen microscopique d’étalements de sang ou
d’organes, coloré avec le colorant de Giemsa est la méthode la plus utilisée pour identifier
Anaplasma chez des animaux cliniquement affectés. Dans ces étalements, A. marginale ressemble
à des corps denses, ronds et intra-érythrocytaire, d’un diamètre d’environ 0,3 à 1,0 µm
majoritairement localisés à la périphérie des érythrocytes. Anaplasma centrale est similaire en
apparence, mais la majorité des organismes ne sont pas localisés en bordure des érythrocytes. Il
peut être difficile de différentier A. marginale d’A. centrale sur des frottis colorés notamment lors de
rickettsémies faibles. Des colorants commerciaux donnant des colorations rapides d’Anaplasma
sont disponibles dans certains pays.
Il est important que les étalements soient bien préparés et qu’ils soient exempts d’impuretés. Des
étalements à partir de bovins vivants doivent être préférentiellement préparés à partir de sang pris à
la veine jugulaire ou au niveau d’autres gros vaisseaux. Pour le diagnostic post mortem, les
étalements doivent être préparés à partir d’organes internes (fois, reins, cœur, poumons) et à partir
de sang contenu dans les vaisseaux périphériques, particulièrement si l’état de décomposition est
avancé.
Épreuves sérologiques : une épreuve immuno-enzymatique de compétition (ELISA-c) a révélé
une bonne sensibilité dans la détection des animaux porteurs. Les épreuves d’agglutination sur
carte, d’ELISA indirect, de dot-ELISA et d’immunofluorescence indirecte peuvent aussi être
utilisées. La réaction de fixation du complément (FC) n’est plus considérée comme un test fiable
pour la certification de la maladie dans des animaux individuels en raison d’une sensibilité variable.
Des réactions croisées entre les Anaplasma spp peuvent compliquer l’interprétation des résultats
sérologiques. En général, le ELISA-c a une bonne spécificité avec des réactions croisées bien
connues entre A. marginale et A. centrale.
Les épreuves basées sur les acides nucléiques ont été utilisées expérimentalement et permettent
de détecter la présence d’infection à bas niveau chez des bovins porteurs et dans les tiques
vectrices. Des précautions doivent être prises avec les épreuves basées sur la PCR à des fins de
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Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
diagnostic puisque une réaction nichée est nécessaire pour l’identification des porteurs à bas
niveau et des amplifications non spécifiques peuvent exister.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
des vaccins vivants sont utilisés dans différents pays pour protéger les bovins contre l’infection à
A. marginale. Un vaccin contenant A. centrale vivant est le plus largement utilisé et donne une
protection partielle lors d’une épreuve avec A. marginale virulent.
Le vaccin Anaplasma centrale est fourni sous forme refroidie ou congelée. Le contrôle qualité est
très important comme pour les autres agents véhiculés par le sang, qui peuvent être présent chez
le bovin donneur pouvant contaminer le vaccin et être largement disséminé. Pour cette raison, le
vaccin congelé est recommandé puisque il permet à travers le contrôle qualité post-production, de
limiter les risques de contamination par d’autres agents pathogènes.
Le vaccin Anaplasma centrale n’est pas entièrement sûr. Une recommandation pratique est de
restreindre son utilisation, autant que possible, aux veaux, car l’immunité non spécifique minimisera
le risque de certaines réactions au vaccin qui peuvent nécessiter un traitement à la tétracycline ou
l’imidocarb. L’immunité partielle se développe entre 6 et 8 semaines et dure pendant plusieurs
années après une seule vaccination.
A. INTRODUCTION
Les épisodes d’anaplasmoses bovines sont principalement dus à Anaplasma marginale. Anaplasma centrale est
capable de provoquer à des degrés modérés de l’anémie, mais les épisodes cliniques sur le terrain sont
extrêmement rares. Des appendices associés au corps d’Anaplasma ont été observés dans certains isolats
d’A. marginale (19). Bien que ce parasite ait été nommé A. caudatum, il n’est pas considéré comme une espèce à
part. Une troisième espèce, A. phagocytophilum, a été signalée comme pouvant infecter les bovins. Cependant,
l’infection naturelle est rare et A. phagocytophilum n’entraîne pas de maladie clinique (8, 20).
Anaplasma marginale existe dans certains pays tropicaux et subtropicaux et dans certaines régions aux climats
tempérés. Anaplasma centrale a été décrit à l’origine, en Afrique du Sud. L’organisme a depuis été importé dans
d’autres pays (incluant l’Australie, et certains pays d’Amérique du Sud, d’Asie du Sud Est et du Moyen-Orient)
pour l’utilisation comme vaccin contre A. marginale.
Les espèces d’Anaplasma ont été décrites comme des protozoaires parasites, mais des recherches ont montré
qu’elles n’avaient pas les attributs justifiant cette description. Depuis la dernière grande révision de la taxonomie
en 2001 (9), la Famille Anaplasmataceae (Ordre des Rickettsiales) est maintenant composée de quatre genres,
Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia et Wolbachia. Le genre Aegyptianella est maintenu dans la Famille
Anaplasmataceae comme un genre incertae sedis. Après révision, le genre Anaplasma comprend maintenant
Anaplasma marginale comme espèce-type, A. phagocytophilum (précédemment Ehrlichia phagocytophila),
E. equi et l’agent non classé de l’ehrlichiose granulocytaire humaine, A. platys et A. bovis. Haemobartonella et
Eperythrozoon sont, à l’heure actuelle, considérés comme très apparentés aux mycoplasmes.
Les espèces d’Anaplasma sont transmises soit mécaniquement soit biologiquement par des vecteurs
arthropodes. Des revues basées sur une étude de transmissions expérimentales listent jusqu’à 19 tiques
différentes comme vecteurs d’A. marginale (15, 21). Ce sont : Argas persicus, Ornithodoros lahorensis, Boophilus
annulatus, B. calcaratus, B. decoloratus, B. microplus, Dermacentor albipictus, D. andersoni, D. hunteri,
D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma excavatum, H. rufipes, Ixodes ricinus, I. scapularis, Rhipicephalus bursa,
R. evertsi, R. sanguineus, et R. simus. Les auteurs concluent que pour certains travaux, incluant ceux sur
R. bursa, H. excavatum et O. lahorensis, ne sont pas convaincants et que les tiques identifiées comme
A. persicus étaient probablement A. sanchezi ou A. radiatus. La transmission intrastadiale et transtadiale est le
mode usuel, même dans l’espèce Boophilus qui n’a qu’un hôte. Les tiques mâles peuvent avoir un rôle
particulièrement important comme vecteurs ; ils peuvent être infectés permanents et jouer le rôle de réservoir
d’infection (17). La démonstration expérimentale de la compétence vectorielle n’implique pas nécessairement un
rôle dans la transmission sur le terrain. Cependant, les espèces de Boophilus sont clairement des vecteurs
importants d’anaplasmoses dans les pays comme l’Australie et les pays d’Afrique et certaines espèces de
Dermacentor sont des vecteurs efficaces aux États-Unis d’Amérique (USA).
De nombreux autres arthropodes ont été impliqués comme vecteurs mécaniques particulièrement aux USA. Des
transmissions expérimentales ont été démontrées avec un certain nombre d’espèces de Tabanus (taons) et avec
des moustiques du genre Psorophora (15, 33). L’importance de ces insectes dans la transmission naturelle de
l’anaplasmose n’a jamais été bien documentée, et semble varier de région à région. Anaplasma marginale peut
aussi être transmis pendant la vaccination contre d’autres maladies sauf à utiliser une aiguille neuve et stérile
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Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
pour vacciner chaque animal. Des transmissions similaires par le biais d’instruments chirurgicaux non stérilisés
ont été rapportées.
Les vecteurs biologiques d’A. centrale sont des tiques multi-hôtes en Afrique incluant R. simus. La tique du bétail
(B. microplus) n’a jamais été décrite comme vecteur. Ce point est d’importance quand A. centrale est utilisé
comme vaccin dans des régions infestées par B. microplus.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Les signes cliniques les plus marquants de l’anaplasmoses sont l’anémie et l’ictère, ce dernier apparaissant
tardivement dans le développement de la maladie. Il n’y a pas d’hémoglobinémies ni d’hémoglobinurie ce qui peut
aider dans le diagnostic différentiel entre anaplasmose et babésiose qui sont souvent des maladies enzootiques
dans les mêmes régions. La maladie ne peut être confirmée que par l’identification de l’organisme.
1.
Identification de l’agent pathogène
Les échantillons à partir de bovins vivants sont des étalements de sang à partir de sang collecté sur
anti-coagulant. Les étalements séchés à l’air libre peuvent être conservés correctement à température ambiante
pendant au moins 1 semaine. L’échantillon de sang sur anti-coagulant doit être maintenu et transféré à 4 °C,
jusqu’à ce qu’il arrive au laboratoire en quelques heures. Cet échantillon est utile pour préparer des étalements
frais si ceux qui sont fournis ne sont pas satisfaisants. Par ailleurs, un volume faible de cellules ou d’érythrocytes
peut aider à impliquer Anaplasma quand seulement un petit nombre de parasites sont détectés dans les
étalements, comme c’est souvent le cas dans la phase de rémission de la maladie.
Contrairement à Babesia bovis, Anaplasma ne s’accumule pas dans les capillaires, aussi du sang provenant de la
jugulaire ou d’autres gros vaisseaux est nécessaire. Du fait de la difficulté à distinguer la morphologie
d’Anaplasma, il est essentiel que les étalements soient bien préparés, exempts de matière étrangère comme des
débris qui peuvent désorienter le diagnostic. Les étalements épais utilisés pour le diagnostic de la babésiose ne
sont pas adaptés pour le diagnostic de l’anaplasmose car Anaplasma est difficile à identifier quand il se dissocie
des érythrocytes.
Les échantillons d’animaux morts peuvent être : des étalements fins (séchés à l’air) de foie, de rein, de cœur, de
poumons et à partir de sang veineux périphérique. Ce dernier est particulièrement recommandé s’il doit y avoir un
délai avant l’examen post mortem. Dans ces circonstances, les contaminations bactériennes des étalements
d’organes font que l’identification d’Anaplasma devient équivoque. Les étalements de cerveaux qui sont utiles
pour le diagnostic de certaines formes de babésioses ne sont pas utilisés pour le diagnostic de l’anaplasmose,
mais peuvent être inclus pour un diagnostic différentiel quand c’est approprié.
Le sang d’organes, plutôt que les tissus d’organes, est requis pour la préparation des étalements, le but étant de
pouvoir examiner des érythrocytes intacts pour évaluer la présence d’Anaplasma. Les étalements de sang à partir
d’organes pourront être conservés à température ambiante pendant plusieurs jours.
Les étalements de sang ou à partir d’organes peuvent être colorés au colorant de Giemsa à 10 % pendant
environ 30 min après fixation dans l’alcool absolu pendant 1 min. Après coloration, les étalements sont rincés 3
ou 4 fois à l’eau du robinet pour enlever le surplus de colorant et sont ensuite séchés à l’air libre. Les conditions
de la coloration de Giemsa varient d’un laboratoire à l’autre. Des colorants disponibles dans le commerce et qui
donnent une coloration rapide des Anaplasma existent dans certains pays1. Les étalements sont examinés sous
huile à immersion à un grossissement de × 700 à × 1 000.
Dans les étalements colorés au Giemsa, Anaplasma marginale apparaît dense, rond et fortement coloré dans les
corps intra-érythrocytaires d’un diamètre d’environ 0,3 à 1 µm. La plupart de ces corps sont localisés sur ou
proche du bord des érythrocytes. Cette caractéristique permet de distinguer A. marginale de A. centrale, puisque
cette dernière a une localisation centrale dans l’érythrocyte. Cependant, la différentiation de ces deux espèces
dans les étalements est parfois difficile, notamment lors de rickettsémies faibles.
Le pourcentage d’érythrocytes infectés varie avec le stade et la sévérité de la maladie. Un maximum de
parasitémie de 50 % peut se produire avec A. marginale. Des infections multiples d’érythrocytes individuels sont
communes pendant la période où la parasitémie est la plus élevée.
1
Les colorants disponibles dans le commerce inclus Camco-Quik et Diff-Quik, Baxter Scientific Products, McGaw Park,
Illinois, USA, et Hema 3 et Hema-Quik, Curtin-Matheson, Houston, Texas, USA.
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Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
L’infection devient visible au microscope entre 2 et 6 semaines suivant la transmission. Pendant la phase clinique,
la parasitémie double approximativement chaque jour jusqu’à environ 10 jours et ensuite diminue à un taux
similaire. Une anémie assez sévère peut persister pendant quelques semaines après que les parasites soient
devenus virtuellement indétectables dans les étalements sanguins. Après avoir récupéré de l’infection initiale, la
plupart des bovins restent infectés de manière latente pour la vie.
Une procédure coûteuse, mais qui peut être justifiée occasionnellement pour confirmer une infection,
particulièrement chez les bovins infectés de manière latente, est l’inoculation du sang de l’animal suspect à un
veau splénectomisé. Une quantité (jusqu’à 500 ml) de sang du donneur (sur anti-coagulent) est inoculée par voie
intraveineuse à un veau splénectomisé, qui est alors testé par l’examen d’étalement sanguin au moins tous les
2 à 3 jours. Si le donneur est infecté, Anaplasma sera observé dans les étalements du veau splénectomisé dans
un délai de 4 semaines mais cette période peut être étendue à 8 semaines.
Des épreuves basées sur la détection des acides nucléiques d’A. marginale chez les bovins porteurs ont été
récemment développées (11-13, 36). La sensibilité des méthodes basées sur l’amplification en chaîne par
polymérase (PCR) a été estimée à 0,0001 % d’érythrocytes infectés, mais à ce niveau seule une proportion des
bovins porteurs serait détectée (11, 12). Une PCR nichée potentiellement spécifique et sensible a récemment été
utilisée pour identifier des bovins porteurs d’A. marginale (36). Cette technique permet d’identifier 30 érythrocytes
infectés par ml de sang, ce qui équivaut à une parasitémie d’approximativement 0,000001 %, bien au-dessous
des plus bas niveaux chez les porteurs. Cependant, la PCR nichée pose des problèmes majeurs de contrôle
qualité pour une utilisation de routine (36). Les laboratoires qui l’utilisent, ont des problèmes de spécificité du fait
d’amplifications non spécifiques. Une étape additionnelle comme l’analyse par des enzymes de restriction,
l’hybridation par Southern blot, ou le séquençage peuvent permettre de confirmer la spécificité du fragment
amplifié par la PCR nichée.
En général, à moins que les animaux aient été traités ou qu’ils soient à une phase très précoce de l’infection
(moins de 14 jours), la sérologie utilisant une méthode immuno-enzymatique de compétition (ELISA-c) ou
l’épreuve d’agglutination sur carte (voir ci-dessous) est la méthode de choix pour détecter les animaux infectés.
2.
Épreuves sérologiques
Les infections à Anaplasma persistent généralement pendant toute la vie de l’animal. Cependant, sauf dans
certains cas de recrudescence, Anaplasma ne peut être aisément détecté dans des étalements sanguins après
l’épisode de parasitémie. Aussi un certain nombre d’épreuves sérologiques ont été développées avec pour but la
détection d’animaux infectés de manière permanente.
Une caractéristique du diagnostic sérologique de l’anaplasmose est qu’il est hautement variable en termes de
sensibilité et de spécificité. Cela est dû en partie à l’évaluation inadaptée des épreuves qui utilisent un certain
nombre d’animaux positifs et négatifs. La capacité de plusieurs tests à détecter des infections connues, de
longues durées a rarement été évaluée. Exceptions faites pour la technique d’ELISA-c (voir ci-dessous) qui a été
validée en utilisant des animaux vrais positifs et négatifs, définis par PCR nichée (36), et l’épreuve d’agglutination
sur carte pour laquelle la sensibilité et la spécificité ont été évaluées par comparaison avec l’ELISA-C (24). Aussi,
bien que la plupart des épreuves décrites dans cette partie soient utiles pour l’obtention de données
épidémiologiques, faut-il les utiliser avec précaution pour certifier d’une maladie. Les deux techniques, l’ELISA-c
et l’agglutination sur carte, sont décrites ci-dessous.
Il faut noter qu’il y a beaucoup de réactions croisées entre A. marginale et A. centrale dans les épreuves
sérologiques. Bien que l’espèce infectante puisse être parfois identifiée en utilisant des antigènes de l’espèce
homologue ou hétérologue, des résultats équivoques sont souvent obtenus.
a)
Méthode immuno-enzymatique de compétition
Un test ELISA-c utilisant un antigène recombiné appelé rMSP5 et l’anticorps monoclonal spécifique
anti-MSP5 s’est révélée sensible et spécifique pour la détection d’animaux infectés par Anaplasma (18, 27,
35, 37). Toutes les souches d’Anaplasma marginale testées, A. ovis et A. centrale, expriment l’antigène
MSP5 et induisent des anticorps contre l’épitope immunodominant reconnu par l’anticorps monoclonal antiMSP5. Une étude récente laisse penser que les anticorps de bovins expérimentalement infectés par
A. phagocytophilum se révéleraient positifs avec l’ELISA-c (8). Cependant, dans une autre étude, aucune
réaction croisée n’a été constatée et l’AcM utilisé dans le test ne réagissait pas avec le MSP5
d’A. phagocytophilum (35). Des travaux complémentaires sont nécessaires pour clarifier la situation.
L’épreuve a montré une spécificité de 100 % en utilisant 261 sérums négatifs provenant d’une région non
enzootique. Elle permet la détection des bovins infectés dès 16 jours après l’inoculation expérimentale par
piqûre de tiques ou par injection de sang, elle détecte des bovins qui ont été infectés 6 ans plus tôt (18). En
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Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
détectant des bovins infectés de manière persistante, provenant d’une région d’enzootie pour l’anaplasmose
et définis comme des vrais positifs ou négatifs par les épreuves de PCR nichée, l’ELISA-c a une sensibilité
de 96 % et une spécificité de 95 % (36). Une étude indépendante utilisant un ELISA indirect (ELISA-i) valide
l’utilisation de rMSP5 comme un antigène pour le diagnostic (32). Cependant, les premières études
suggèrent que dans son format actuel, l’épreuve indirecte est moins sensible que l’épreuve d’ELISA-c (32).
Les résultats du test ELISA-c sont disponibles en moins de 2,5 h. Un kit de diagnostic commercialement
disponible contient les instructions d’utilisation. En général le test est conduit comme décrit ci-dessous.
•
Réactifs du kit de diagnostic
Une microplaque de 96-puits fixée avec l’antigène rMSP5,
Une plaque de 96-puits fixée pour l’absorption/transfert du sérum pour réduire le bruit de fond,
100 × l’anticorps monoclonal et le conjugué couplé à la peroxydase,
Solution de lavage 10× et du tampon de dilution pour le conjugué prêt à l’emploi,
Substrat et solution stop prêt à l’emploi,
Témoins positif et négatif.
•
Protocole
i)
Ajouter 70 µl du sérum non dilué à la plaque fixée pour l’absorption/transfert et incuber à température
ambiante pendant 30 min ;
ii)
Transférer 50 µl par puits de sérum absorbé à la plaque fixée avec l’antigène rMSP5 et incuber à
température ambiante pendant 60 min ;
iii)
Eliminer le sérum et laver la plaque 2 fois avec la solution de lavage diluée ;
iv)
Ajouter 50 µl/puits de l’anticorps monoclonal dilué et conjugué à la peroxydase à la plaque à laquelle à
été fixée le rMSP5. Incuber à température ambiante pendant 20 min ;
v)
Éliminer l’anticorps monoclonal dilué et conjugué à la peroxydase et laver la plaque 4 fois avec la
solution de lavage diluée ;
vi)
Ajouter 50 µl/puits de la solution substrat, couvrir la plaque avec une feuille et incuber 20 min à
température ambiante ;
vii)
Ajouter 50 µl/puits de solution stop à la solution substrat déjà dans les puits et tapoter le bord de la
plaque pour mélanger doucement le mélange ;
viii) Lire les plaques dans un lecteur à 620 nm.
•
Validation
La moyenne de la densité optique (DO) du témoin négatif doit varier de 0,40 à 2,1. Le pourcentage
d’inhibition du témoin positif doit être supérieur ou égal à 30 %.
•
Interprétation des résultats
Le pourcentage d’inhibition est calculé comme suit :
100
–
DO de l’échantillon × 100
=
% d’inhibition
Moyenne de la DO du témoin négatif
Les échantillons dont le pourcentage est inférieur à 30 % sont négatifs. Les échantillons dont le
pourcentage est supérieur ou égal à 30 % sont positifs.
La spécificité de l’ELISA-c avec l’antigène MSP5 peut être améliorée en utilisant un seuil plus élevé pour le
pourcentage d’inhibition (5). Cependant les conséquences de ce changement sur la sensibilité n’ont pas été
évaluées.
b)
Épreuve d’agglutination sur carte
Les avantages de l’épreuve d’agglutination sur carte (CAT) sont la sensibilité aussi bien en laboratoire que
sur le terrain et la rapidité : cette épreuve donne un résultat en quelques minutes. Les réactions non
spécifiques peuvent poser problèmes et la subjectivité dans l’interprétation des résultats peut entraîner une
variabilité dans l’interprétation du test. En outre, l’antigène CAT qui est une suspension de particules de
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Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
A. marginale, peut se révéler difficile à préparer et varier d’un lot à l’autre ou d’un laboratoire à l’autre. Des
veaux splénectomisés sont infectés par voie intraveineuse avec du sang contenant des érythrocytes infectés
par Anaplasma. Quand la parasitémie excède 50 %, les animaux sont saignés, les érythrocytes infectés sont
lavés, lysés et les fantômes des érythrocytes ainsi que les particules d’Anaplasma sont culottés. Les culots
sont soumis à un traitement aux ultra-sons, lavés et resuspendus dans une solution colorante pour produire
la suspension d’antigène.
Le protocole légèrement modifiée par rapport à celui décrit à l’origine (1, 2) est le suivant :
i)
s’assurer que tous les composants sont à température constante entre 25 et 26 °C (cette température
constante est critique pour l’épreuve) ;
ii)
sur chaque cercle de la carte test (une plaque en plastique transparente ou une plaque de glace
marquée avec des cercles de 18 mm de diamètre), placer les uns à coté des autres mais sans les faire
se toucher, 10 µl de bovine serum factors (BSF), 10 µl de sérum test et 5 µl d’antigène2 CAT. Les
témoins négatifs et faiblement positifs doivent être testés sur cette carte ;
Le sérum BSF est sélectionné d’un animal avec un haut niveau connu de conglutinine. Si le niveau de
conglutinine est inconnu, du sérum frais provenant d’un animal sain, connu pour être exempt
d’Anaplasma peut être utilisé. La race Jersey est souvent appropriée. Le BSF doit être conservé à
-70 °C par petits aliquots, une fraction aliquote fraîche étant utilisée chaque fois que l’épreuve est
réalisée. L’inclusion du BSF augmente la sensibilité de l’épreuve ;
c)
iii)
bien mélanger. Après avoir mélangé chaque test, essuyer avec du papier propre pour éviter les
contaminations croisées ;
iv)
placer la carte dans une chambre humide sur un plateau agitant (100 à 110 tr/min) pendant 7 min ;
v)
lire immédiatement. Des agrégats caractéristiques de l’antigène (graduée de +1 à +3) sont considérés
comme un résultat positif. L’épreuve est considérée comme négative en l’absence de ces agrégats.
Test de fixation du complément
La réaction de fixation du complément (FC) a été largement utilisée pendant des années. Cependant sa
sensibilité est variable (de 20 à 60 %) vraisemblablement en raison des différences dans les techniques de
préparation de l’antigène et de sa faible reproductibilité. En outre, il a été démontré que la FC ne pouvait pas
détecter un pourcentage élevé d’animaux porteurs (5). Il n’est pas non plus certain que la FC puisse détecter
avant les autres tests les anticorps chez les animaux en phase aiguë (6, 24). Aussi le test de fixation du
complément n’est-il plus recommandé comme une épreuve fiable pour détecter les animaux infectés.
d)
Autres méthodes ELISA
Méthode immuno-enzymatique indirecte - un test ELISA indirect (i-ELISA) basée sur l’utilisation d’un
antigène de globule rouge sanguin normal (antigène négatif) et d’un antigène provenant de globules rouges
sanguins infectés par A. marginale (antigène positif) s’est révélée fiable pour détecter des sérums infectés
par A. Marginale (10). Bien que plus lourde que les épreuves utilisant un seul antigène, cette épreuve
permet d’éliminer les sérums qui ont de hauts niveaux d’activité non spécifique du fait de la présence
d’iso-anticorps contre les composants des globules rouges. L’épreuve a identifié correctement tous les 100
sérums connus pour être positifs et collectés à partir de bovins, jusqu’à 3 ans après l’infection, alors que 3 %
des sérums négatifs, 2 % de sérums anti-Babesia bovis et 4 % anti-B. bigemina ont donné des faux positifs.
Méthode immuno-enzymatique par dépôt - une épreuve immuno-enzymatique par dépôt (dot-ELISA) a été
décrit. Comparé au test i-ELISA, le dot-ELISA a l’avantage d’être rapide, bon marché et facile à réaliser. La
sensibilité du dot-ELISA a été évaluée à 93 % et sa spécificité à 96 % (25).
e)
Épreuve d’immunofluorescence indirecte
Du fait du nombre limité d’épreuves d’immunofluorescence indirecte (IFI) qui peuvent être réalisées chaque
jour par un opérateur, d’autres épreuves sérologiques sont généralement préférées aux épreuves IFI.
L’épreuve d’IFI est réalisée comme celle décrite pour la babésiose bovine dans le chapitre 2.4.2., excepté
que du sang infecté par A. marginaIe est utilisé pour la préparation des étalements. Un grave problème avec
cette épreuve est la fluorescence non spécifique. De l’antigène fabriqué à partir de sang collecté dès qu’une
parasitémie adéquate (5 à 10 %) est obtenue, convient mieux à l’épreuve. La fluorescence non spécifique
due aux anticorps adhérant aux érythrocytes infectés peut être réduite en lavant les érythrocytes dans un
tampon contenant de la glycine acide avant la préparation des étalements (26). Les érythrocytes infectés
2
660
L’épreuve conduite aux USA et au Mexique utilise des volumes plus importants de réactifs: antigène (15 µl), sérum
(30 µl), et bovine serum factor (30 µl) ; et le temps de réaction est de 4 min (voir l’étape iv)
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Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
sont alors lavés 2 fois dans du tampon glycine 0,1 M (pH 3,0, centrifugés à 1 000 g pendant 15 min à 4 °C)
et ensuite 1 fois dans du PBS pH 7,4.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Plusieurs méthodes d’immunisation ont été utilisées pour protéger les bovins contre l’anaplasmose dans les pays
où la maladie est enzootique, mais aucune n’est parfaite (22). Une synthèse sur les vaccins et les antigènes de
A. marginale a été récemment publiée (16). L’utilisation de l’agent le moins pathogène, A. centrale, qui donne des
réactions croisées avec A. marginale est la méthode la plus acceptée, bien que pas utilisée en Amérique du Nord.
Une autre méthode implique l’utilisation d’une souche de A. marginale atténuée par des passages sur des hôtes
non bovins, comme les daims ou les moutons (34).
Dans cette section, la production de vaccin vivant à partir de A. centrale est décrite. Elle implique l’infection d’un
veau splénectomisé réceptif et l’utilisation de son sang comme vaccin. Les étapes détaillées de la procédure de
production sont décrites dans la littérature scientifique et nous invitons les lecteurs à s’y référer s’ils souhaitent
plus de détails sur les procédures mentionnées ci-après (3, 7, 29).
Des lignes directrices pour la fabrication des vaccins à usage vétérinaire sont données dans le Chapitre 1.1.8.,
« Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les lignes directrices données ci-dessous et dans le
Chapitre 1.1.8. sont volontairement de nature générale et peuvent être complétées par des exigences nationales
et régionales.
Le vaccin contre Anaplasma centrale peut être obtenu sous sa forme congelée ou réfrigérée selon la demande, le
réseau de transport et la disponibilité d’azote liquide ou de carboglace. Le vaccin congelé est recommandé par la
plupart des instances, puisqu’il permet le contrôle-qualité de chaque lot après production. Il est toutefois plus cher
à produire et plus difficile à transporter que le vaccin réfrigéré. Le risque de contamination fait du contrôle postproduction une étape essentielle dont le coût peut être prohibitif.
1.
Gestion des semences
a)
Caractéristiques de la semence
Anaplasma centrale a été isolé en 1911 en Afrique du Sud et a été utilisé comme vaccin en Amérique du
Sud, en Australie, en Afrique, au Moyen Orient et en Asie du Sud Est. Il offre une protection partielle mais
adéquate dans des régions où les souches de terrain sont de virulence modérée (par ex. l’Australie)
(4). Dans les régions tropicales humides où A. marginale est un parasite très virulent, la protection due à
A. centrale peut ne pas être adéquate pour prévenir la maladie chez certains animaux.
Anaplasma centrale cause généralement des infections bénignes, spécialement si les veaux ont moins de
9 mois. Des réactions graves après la vaccination ont été rapportées quand des bovins adultes sont
inoculés.
b)
Préparation et stockage
Le matériel infectieux est directement conservé sous forme de stabilisats de sang infecté dans l’azote liquide
ou dans de la carboglace. Le DMSO (dimethyl sulphoxide) et la polyvinyl-pyrrolidone M.W. 40 000 (3) sont
les cryo-conservateurs recommandés. Ils permettent l’administration intraveineuse après décongélation du
stabilisat. Un compte-rendu détaillé de la technique de congélation utilisant le DMSO est donné ailleurs (23),
mais brièvement, le sang est collecté, réfrigéré à 4 °C et le cryo-conservateur réfrigéré est ajouté (DMSO
4 M dans du PBS) doucement en remuant à un ratio final sang/cryo-conservateur de 1:1 avec une
concentration finale de DMSO de 2 M. La totalité de la procédure est effectuée dans un bain de glace et le
sang dilué est réparti dans des récipients adéquats (ex. cryotubes de 5 ml), puis congelé aussi vite que
possible dans l’azote liquide.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
La qualité d’un isolat de A. centrale en tant que vaccin peut être déterminée en inoculant des bovins
sensibles, en évaluant les réactions subséquentes à l’inoculation puis en infectant les animaux et les
contrôles avec une souche virulente locale de A. marginale. La sécurité et l’efficacité peuvent être jugées en
suivant la parasitémie dans des étalements sanguins colorés et en évaluant la dépression du volume des
cellules des bovins inoculés pendant la vaccination et la ré-infection. La pureté de l’isolat peut être
déterminée en testant des sérums de bovins utilisés dans le test de sécurité vis-à-vis des contaminants qui
pourraient être présents (3, 30).
Manuel terrestre de l’OIE 2008
661
Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
2.
Méthode de fabrication
a)
Production du vaccin congelé
Le produit congelé (5 à 10 ml) est décongelé par immersion des tubes dans un bain-marie préchauffé à
40 °C. Le matériel décongelé est conservé dans la glace et utilisé dès que possible (dans les 30 min) pour
infecter un veau sensible, splénectomisé par inoculation intraveineuse.
La parasitémie du veau donneur est contrôlée chaque jour par examen sur des étalements sanguins et le
sang est collecté pour la production de vaccin quand une parasitémie convenable est atteinte. Une
parasitémie de 1 × 108/ml (approximativement 2 % de parasitémie) est le minimum requis pour la production
de vaccin. Si une parasitémie convenable n’est pas atteinte, un passage supplémentaire par inoculation de
100 à 200 ml de sang à un second veau splénectomisé peut être nécessaire.
Le sang du donneur est collecté par cannulation à la jugulaire ou à la carotide avec de l’héparine comme
anti-coagulent (5 Unités Internationales [UI] d’héparine/ml de sang).
Au laboratoire, le sang parasité est mélangé avec un volume de glycérol 3 M dans du PBS supplémenté
avec 5 mM de glucose à 37 °C (concentration finale de glycérol 1,5 M). Le mélange est équilibré à
37 °C pendant 30 min et distribué dans des tubes adéquats (tubes à congélation de 5 ml). Les tubes sont
refroidis 10 °C/min dans la phase gazeuse de l’azote liquide et quand ils sont congelés, ils sont stockés
dans la phase liquide (3).
Du DMSO peut être utilisé comme cryo-conservateur à la place du glycérol. La procédure est la même que
celle décrite pour la préparation du stabilisat (23, 28).
Si le vaccin glycérolé doit être dilué, le diluant utilisé est du PBS contenant 1,5 M de glycérol et 5 mM de
glucose (14). Le vaccin dans du DMSO doit être dilué dans une solution contenant la même concentration
de DMSO (31).
b)
Production de vaccin réfrigéré
Le matériel infectieux pour le vaccin réfrigéré est préparé de la même manière que pour le vaccin congelé,
mais il doit être utilisé dès que possible après collecte. Le sang infectieux peut être dilué pour avoir
1 × 107 parasites par dose de vaccin. Un diluant adéquat est le sérum de bœuf stérile à 10 % dans une
solution de glucose tamponnée contenant par litre : NaCI (7,00 g), MgCI2.6H2O (0,34 g), glucose (1,00 g),
Na2HPO4 (2,52 g), KH2PO4 (0,90 g), et NaHCO3 (0,52 g).
Si le diluant n’est pas disponible, l’acide citrate dextrose (20 % v/v) ou du phosphate dextrose citrate
(20 % v/v) doit être utilisé comme anti-coagulant pour fournir le glucose nécessaire à la survie des
organismes.
c)
Utilisation du vaccin
Dans le cas du vaccin congelé, les tubes doivent être décongelés par immersion dans un bain-marie
préchauffé entre 37 °C et 40 °C et le contenu doit être mélangé avec un diluant adéquat pour avoir la dilution
requise. Si le vaccin est glycérolé, il doit être conservé au froid et utilisé dans les 8 h (3). Si le DMSO est le
cryo-conservateur, le vaccin doit être conservé dans la glace et utilisé dans les 15 à 30 min (28). Le vaccin
est le plus souvent administré par voie sous-cutanée.
Le vaccin réfrigéré doit être conservé au froid et utilisé dans les 4 à 7 jours suivant sa préparation.
La souche de A. centrale utilisée dans les vaccins est de virulence réduite, mais n’est pas totalement sans
danger. De ce fait, une recommandation pratique est de limiter l’utilisation du vaccin à des veaux, pour
lesquels une immunité non spécifique diminuera le risque de la réaction au vaccin. Quand des animaux plus
vieux sont vaccinés, il existe un risque de réactions graves. Ces réactions sont très rares mais les
reproducteurs précieux ou les femelles gestantes réclament une attention particulière et doivent être sous
observation quotidienne pendant 3 semaines après la vaccination. Les animaux cliniquement malades
doivent être traités à l’oxytétracycline ou l’imidocarb à des doses recommandées par le fabricant.
L’immunité protectrice se développe généralement entre 6 et 8 semaines et dure généralement plusieurs
années.
Les vaccins contre l’anaplasmose et la babésiose sont souvent utilisés en même temps, mais il n’est pas
conseillé d’utiliser d’autres vaccins en même temps (3).
662
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
3.
Contrôles en cours de fabrication
a)
Source et maintien des donneurs de vaccin
Une source de veaux exempts d’infections naturelles d’Anaplasma ou d’autres maladies transmises par les
tiques doit être identifiée. Si une source adéquate n’est pas disponible, il peut être nécessaire de croiser des
veaux dans des conditions où l’absence de tiques est contrôlée, spécialement dans le but de la production
d’un vaccin.
Les veaux doivent être maintenus dans des conditions empêchant l’exposition à des maladies infectieuses
et à des tiques ou des insectes piqueurs. En absence de telles conditions, le risque de contaminations avec
des agents de maladies infectieuses présents dans le pays doit être estimé, et le bénéfice de la production
locale du vaccin évalué vis-à-vis des conséquences possibles de diffusion de la maladie (3).
b)
Chirurgie
Les veaux donneurs doivent être splénectomisés pour permettre la production maximale de vaccin. Cela est
effectué sous anesthésie générale chez de jeunes veaux.
c)
Criblage des donneurs avant inoculation
Les veaux donneurs doivent être examinés pour tous les agents infectieux transmis par le sang présents
dans le pays producteur du vaccin, parmi lesquels Babesia, Anaplasma, Cowdria, Theileria et Trypanosoma.
Cela peut être effectué par examen de routine d’étalement sanguin après splénectomie et par sérologie.
Tout veau ayant des signes d’infections naturelles devra être éliminé. L’absence d’autres agents infectieux
doit également être confirmée. Il s’agit des agents de la leucose bovine enzootique, de la maladie des
muqueuses, de la rhinotrachéite infectieuse bovine, de la fièvre des trois jours, de la maladie d’Akabane, de
la bluetongue, de la fièvre aphteuse et de la peste bovine. Les protocoles dépendent des maladies
présentes dans le pays et de la disponibilité des tests, mais ils doivent comporter au moins, des épreuves
sérologiques sur des paires de sérums et dans certains cas, l’isolement du virus, la détection des antigènes
ou de l’ARN/ADN (3, 28, 30).
d)
Suivi de la parasitémie après inoculation
Il est nécessaire de déterminer les concentrations de parasites dans le sang collecté pour la vaccination. La
concentration parasitaire peut être établie à partir du comptage des érythrocytes et de la parasitémie
(pourcentage des érythrocytes infectés).
e)
Collecte de sang pour la vaccination
Tout le matériel doit être stérilisé avant utilisation (par autoclavage). Une fois que la parasitémie requise est
atteinte, le sang est collecté sur de l’héparine dans des conditions d’asepsie stricte. Il est préférable de
donner un sédatif au veau avant prélèvement et d’utiliser un circuit fermé de collecte.
On peut prélever jusqu’à 3 litres de sang hautement infecté à partir d’un veau de 6 mois. Si le veau doit
rester en vie, il est indiqué de transfuser l’animal avec la même quantité de sang provenant d’un donneur
adéquat. Autrement, le veau doit être tué immédiatement après la collecte de sang.
f)
Distribution du vaccin
Toutes les procédures doivent être réalisées dans un environnement adéquat, comme par exemple une
hotte à flux laminaire, en manipulant stérilement. L’utilisation d’un mélangeur magnétique ou mécanique
assurera un bon mélange du sang et de son diluant pendant la phase de distribution.
4.
Contrôle des lots
L’efficacité, la sécurité et la stérilité des lots de vaccin ne peuvent être déterminées dans le cas de vaccins
réfrigérés, et les recommandations pour le vaccin congelé dépendent du pays impliqué. Ce qui suit concerne les
recommandations pour la production de vaccin congelé en Australie.
a)
Stérilité et absence de contaminants
Des tests de stérilité normalisés sont utilisés pour chaque lot de vaccin et de diluant (voir Chapitre
1.1.9., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques »).
L’absence de contaminants est confirmée en réalisant des tests sérologique appropriés sur le bovin
donneur, en inoculant des lymphocytes du donneur à des moutons qui sont alors suivis pour mettre en
évidence une infection virale, et en inoculant des bovins et en détectant par des épreuves sérologiques la
Manuel terrestre de l’OIE 2008
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Chapitre 2.4.1. — Anaplasmose bovine
présence d’agents infectieux qui peuvent contaminer potentiellement le vaccin. Les bovins inoculés pendant
le test d’activité (voir section C.4.c) peuvent également servir pour ce test. Selon le pays d’origine du vaccin,
les agents recherchés sont ceux de la leucose bovine enzootique, la rhinotrachéite bovine infectieuse, la
maladie des muqueuses, la fièvre des trois jours, la maladie d’Akabane, le virus Aino, la bluetongue, le virus
parainfluenza, la fièvre aphteuse, la dermatose nodulaire contagieuse, la rage, la fièvre de la Vallée du Rift,
la peste bovine, la péripneumonie contagieuse bovine, la maladie de Jembrana, la cowdriose, les espèces
pathogènes de Theileria et Trypanosoma spp., Brucella abortus, Coxiella et Leptospira (3, 28, 30).
b)
Innocuité
Les réactions au vaccin des bovins inoculés dans le test d’activité (voir Section C.4.c.) sont suivies en
mesurant la parasitémie et la diminution du volume sanguin. Seuls les lots avec des niveaux de pouvoir
pathogène égaux ou inférieurs à une norme prédéterminée sont utilisés.
c)
Activité
Le vaccin est décongelé et dilué au 1/50 avec un diluant adéquat (3). Le vaccin dilué est incubé pendant 8 h
à 4 °C et 5 bovins sont inoculés par voie sous-cutanée avec des doses de 2 ml. Les bovins inoculés sont
suivis pour évaluer l’infection par examens d’étalement de sang. Tous les bovins doivent être infectés pour
un lot pour que ce lot soit accepté. Un lot infectieux au 1/50 est recommandé pour l’utilisation au 1/5 avec un
diluant isotonique.
d)
Durée de l’immunité
Une immunité partielle mais de longue durée résulte d’une seule inoculation. Il n’y a aucune preuve d’un
effet accru dû à la répétition de la vaccination.
e)
Stabilité
Le vaccin peut être conservé pendant 5 ans quand il y est stocké dans de l’azote liquide. Une fois
décongelé, il perd rapidement son efficacité. Un vaccin décongelé ne peut être recongelé.
f)
Agents de conservation
Aucun agent de conservation n’est ajouté. De la pénicilline (500 000 UI/litre) et de la streptomycine
(370 000 µg/litre) sont ajoutées au vaccin au moment de sa distribution.
g)
Précautions d'emploi et mise en garde
Le vaccin est non infectieux pour les hommes. Quand le produit est conservé dans de l’azote liquide, les
précautions d’usage sont celles concernant le stockage, le transport, la manipulation de produits hautement
congelés.
5.
Contrôles du produit fini
a)
Innocuité
Voir Section C.4.b.
b)
Activité
Voir Section C.4.c.
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