Place du diagnostic biologique de l`herpès virose B (cehv1) chez le

Place du diagnostic biologique de l’herpès
virose B (cehv1) chez le macaque dans la
gestion du risque de transmission à
l’homme
E. COUTROT1, M. BLANCHER-SARDOU2, B. MARCHOU3, P-A. APOIL1, J. DUCOS DE LAHITTE4, A. BLANCHER1*
1
Laboratoire d’Immunogénétique Moléculaire, Faculté de Médecine de Rangueil, Bâtiment A2, 133 Route de Narbonne, 31062, Toulouse cedex 4, FRANCE.
Laboratoire d’analyse médicale, 16 Boulevard de Strasbourg, 31000, Toulouse, FRANCE
3 Service des Maladies Infectieuses, CHU de Toulouse Hôpital Purpan, Place du Docteur Baylac, TSA 40031, 31059 Toulouse cedex 9, FRANCE
4 Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, 23, Chemin des Capelles, 31076 Toulouse cedex, FRANCE
2
Auteur chargé de la correspondance : E-mail : [email protected] - Tél : 05 61 32 34 32
RÉSUMÉ
SUMMARY
Le virus de l’herpès virose B du macaque (Cercopithecine Herpes Virus 1,
CeHV1) du genre Simplexvirus (famille des Herpesviridae et sous-famille
Alphaherpesvirinae), endémique chez tous les macaques asiatiques, est le
seul herpès virus de primate pathogène pour l’homme. Bien que peu de cas
d’infection humaine ait été rapportés, la sévérité de la maladie, une méningoencéphalite mortelle en l’absence de traitement, oblige à prendre en compte
le risque que représente cette zoonose. Le portage viral étant le plus souvent
asymptomatique chez les macaques, le diagnostic biologique de cette infection joue un rôle prédominant dans la gestion du risque. Nous confrontons aux
données de la littérature notre expérience pratique de la sérologie anti-herpétique chez les macaques. Par ailleurs nous présentons les résultats de diverses techniques de PCR destinées à mettre en évidence chez les macaques
le génome du CeHV1 dans divers prélèvements muqueux et de tissus nerveux. Le diagnostic biologique de l’infection chez le macaque participe à la
conduite à tenir lors d’accident d’exposition à un macaque.
Place of biological diagnostic of macaque B virus (CeHV1) infection in
handling of the transmission risk to humans.
Mots-clés : Cercopithecine herpes virus 1, zoonose, macaque, herpès virose b, sérologie, pcr.
The macaque herpes B virus (Cercopithecine Herpes Virus 1, CeHV1) of
the Simplexvirus gender (Herpesviridae family and Alphaherpesvirinae subfamily), endemic in all Asiatic macaques is the only primate Simplexvirus pathogenic for humans. Although few cases of human infection have been
reported, the severity of the human disease, a meningo-encephalitis lethal without treatment, leads to take into account the risk of this zoonosis. Because
the virus carriage in macaques is most of the time asymptomatic, the biological diagnostic of the infection plays a predominant role in the risk handling.
We confront here the literature data to our own experience of herpes serology in macaques. Moreover, we present our results of various PCR techniques aimed to evidence the CeHV1 genome in various samples of mucosa
and nervous tissues. Examples of practical handlings are detailed in annexes.
The biological diagnostic of this infection in the macaque participates to the
practical handling in the case of accidental exposition to a macaque.
Keywords : Cercopithecine herpes virus 1, zoonosis, macaque, b virus, serology, pcr.
Introduction
Le virus de l’herpès virose B du macaque (ou Cercopithecine Herpes Virus 1, CeHV1) appartient à la famille Herpesviridae, plus précisément à la sous-famille Alphaherpesvirinae
et au genre Simplexvirus [1]. Ce virus est endémique chez tous
les macaques asiatiques à l’état sauvage [2]. Parmi toutes les
populations de macaques asiatiques seule celle des macaques
crabiers (Macaca fascicularis) de l’île Maurice est réputée
exempte du virus. Cette population est en fait un isolat génétique constitué à partir d’animaux juvéniles originaires de Java
importés par les bateaux marchands portugais au début du
17ème siècle [3]. Par ailleurs tous les individus de la seule
espèce de macaque africaine (le magot ou Macaca sylvanus)
testés jusqu’à présent sont indemnes du virus CeHV1 [résultats non publiés]. Il est très probable que cette espèce africaine, y compris la colonie du rocher de Gibraltar, soit
indemne du virus.
Le CeHV1 est phylogénétiquement très proche d’autres
virus du genre Simplexvirus : les virus herpès simplex 1 et 2
humains (HSV1 et 2) et du chimpanzé (ChHV), le “Simian
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
agent 8” (SA8) des singes verts africains et l’Herpes virus
papio 2 (HVP2) des babouins. Les pathologies cutanéo-muqueuses chez les macaques sont similaires aux maladies humaines dues aux HSV1 et HSV2 [4]. Contrairement aux virus
humains, le CeHV1 n’a pas de tropisme préférentiel pour la
sphère buccale (HSV1) ou génitale (HSV2), les deux territoires étant le plus souvent touchés chez le même animal.
Après une primo-infection souvent asymptomatique le
CeHV1 persiste à vie dans les neurones des racines sensitives
innervant les territoires cutanés et muqueux sièges de l’infection initiale : les ganglions trijumeaux pour la face et les ganglions des racines postérieures lombosacrés pour la sphère
ano-génitale. Comme les HSV1 et 2, le CeHV1 est transporté
de manière rétrograde dans les axones des neurones sensitifs
où il se trouve à l’abri de l’action neutralisante des anticorps
anti-CeHV1 [5]. Dans les neurones, le virus reste latent mais
peut, dans certaines circonstances, reprendre des cycles de réplication aboutissant à la réinfection endogène des muqueuses
buccales et génitales. Ces réinfections endogènes appelées
herpès de sortie sont le plus souvent asymptomatiques. En dehors de certaines circonstances particulières (infection néo-
368
COUTROT (E.) ET COLLABORATEURS
natale, immunodépression virale ou iatrogène) les formes cliniques graves disséminées sont rares. Ces formes disséminées
sont les seules à s’accompagner d’une virémie qui est responsable de la diffusion de l’infection aux poumons, au foie
et à la rate principalement [6]. Comme chez l’homme, les encéphalites herpétiques sont rares et l’on ignore quels sont les
facteurs d’hôte ou du virus qui favorisent la dissémination cérébrale par voie neuronale du virus. En dehors des macaques
asiatiques, de nombreuses espèces de primates sont sensibles
à l’infection (tableau I). En captivité, il sera crucial de proscrire toute promiscuité entre les macaques asiatiques et les
autres espèces de primates.
Le CeHV1 est le seul herpès virus de primate pathogène pour
l’homme [7]. Chez l’homme, contrairement à ce que l’on observe chez les macaques, le virus présente un neurotropisme
marqué et est responsable d’une encéphalomyélite le plus fréquemment mortelle en l’absence de traitement. Pour cette raison,
en Europe le CeHV-1 fait partie du groupe 3 de la classification
des agents biologiques. Aux USA il est même classé dans le
groupe 4 et inclus dans la liste des agents infectieux potentiellement dangereux dans le cadre du bioterrorisme.
Type d’infection par le CeHV1
Espèce
Infectés naturellement
{
macaques rhésus (Macaca mulatta)
macaques crabiers (Macaca fascicularis)
macaques bruns (Macaca arctoides)
macaques à queue de cochon (Macaca nemestrina)
macaques japonais (Macaca fuscata)
macaques bonnet chinois (Macaca radiata)
macaques de Formose (Macaca cyclopis)
macaques du Tibet (Macaca thibetana)
macaques à queue de lion (Macaca silenus)
macaques de Tonkean (Macaca tonkeana)
Sensibles en captivité
{
cercopithèques de Brazza (Cercopithecus neglectus)
singes rouges (Erythrocebus patas)
colobes à épaules blanches (Colobus abyssinicus)
capucins sajou apelle (Cebus apella)
ouistitis (Callithrix jacchus)
TABLEAU 1 : liste non exhaustive des espèces de primates non humains naturellement infectées par le CeHV1
et celles pour lesquelles il a déjà été décrit des cas de contamination.
Toute la difficulté de la gestion vétérinaire de cette maladie
animale, bénigne pour son hôte naturel le macaque, réside
dans la prévention du risque de transmission du virus à
l’homme. La maladie induite par le CeHV1 chez le macaque
étant le plus souvent pauci-symptomatique voire asymptomatique, le dépistage sérologique systématique chez les macaques de l’infection par ce virus revêt une importance
majeure dans toutes les circonstances où les macaques porteurs du virus sont en contact étroit avec l’homme (c'est-àdire les professionnels travaillant dans des animaleries, zoos,
élevages ou centres de quarantaine). On rappellera que la
quarantaine de cas d’infections humaines rapportés jusqu’à
présent ne concernent que des personnes impliquées professionnellement dans la manipulation des macaques. Aucun cas
de contamination humaine n’a été rapporté dans les populations où les contacts avec les animaux sont pourtant fréquents
(Inde, Japon, Vietnam, Chine…). Ce n’est que tout récemment
que les autorités sanitaires se sont préoccupées du problème
des magots à Gibraltar et des singes rhésus dans les temples
Indiens [8]. Pour les non professionnels (par exemple les visiteurs de zoo) on ne peut qu’insister sur la nécessité dans le
doute de s’abstenir de conduites dangereuses exposant les personnes aux risques de morsure ou griffure. Comme le suggère
l’absence de cas déclarés dans les régions asiatiques où les
populations sont en contact étroit avec les macaques infectés,
le virus est certainement peu infectieux pour l’homme et sa
transmission implique un contact étroit du fait de sa fragilité
dans le milieu extérieur. On ignore si un facteur génétique prédispose certains hôtes humains à l’infection mais il a été
évoqué, mais non démontré, que certaines souches virales
pourraient être plus infectieuses que d’autres pour l’homme.
Les traitements anti-herpès sont efficaces chez l’homme
dans le traitement préventif et curatif de la maladie humaine
(voir plus loin). Il n’existe pas de vaccin ni pour les animaux
ni pour les hommes. La séropositivité chez l’homme vis à vis
des HSV1 ou 2 n’est pas protectrice.
La protection de l’homme passe par la gestion du risque infectieux. Les principaux modes de contamination lors de la
manipulation des animaux sont : les morsures, les griffures, la
contamination d'une plaie par de la salive de macaque, les
blessures avec une aiguille ayant servi à prélever un macaque
contaminé, les éraflures cutanées sur la cage d'un animal
contaminé et la contamination par voie oculaire (salive, fèces) ;
et lors de manipulations au laboratoire : la contamination par
le milieu de culture et les cellules infectées par le CeHV1. Il
faut considérer comme potentiellement infectieux les prélèvements biologiques comme les fèces, la salive, les prélèvements génitaux. La prévention du risque passe par la
limitation de la manipulation d’animaux porteurs du virus au
strict nécessaire avec application de mesures de précaution
particulières (voir tableau II).
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
HERPÈS B DES MACAQUES : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
369
En raison de la bénignité de la maladie animale, tant dans sa
forme primaire que dans ses formes de sortie, et l’existence de
porteurs sains, la détection clinique des animaux porteurs de
virus est peu ou pas efficace. Le dépistage du portage viral
passe donc principalement par le diagnostic biologique. Chez
l’animal, on peut alors soit rechercher directement la présence
du virus, soit rechercher la présence d’anticorps dirigés contre
ce même virus. Nous envisagerons à la lumière de notre expérience personnelle les méthodes utilisées et leurs limites.
Précautions à prendre
Eviter les morsures
et les griffures
Stériliser avant destruction
tout matériel souillé
Eviter l’introduction
d’animaux infectés
dans une colonie
exempte d'infection
par le CeHV1
Surveillance permanente
du statut sérologique
des animaux d’une colonie
Moyens à mettre en œuvre
{
Contention physique voire chimique si cela est possible des animaux
lors de manipulations
Port de gants anti-morsure (Kevlar) et d’un masque adéquat,
de même que de vêtements de travail régulièrement changés et stérilisés.
Les avant-bras devront être spécialement protégés.
{
{
Virus sensible aux ultraviolets, aux acides et aux bases,
à l'hypochlorite de sodium 1% (eau de Javel diluée au 1/10),
à l'éthanol à 70%, au glutaraldéhyde à 2%,
au formaldéhyde et inactivation par la chaleur
(50-60°C pendant 30 minutes)
{
Surveillance du statut sérologique des animaux
avant leur introduction dans la colonie
La surveillance sérologique des animaux d’une colonie
permet l’éviction de tout animal suspect
pour limiter les risques de diffusion du virus
au sein de la colonie
TABLEAU 2 : Mesures de prévention contre le risque de contamination humaine par le CeHV1.
Détection directe du virus CeHV1
La mise en évidence du virus repose soit sur l’isolement
viral soit sur la détection de l’ADN viral par PCR.
LE PRÉLÈVEMENT
Les animaux infectés par le CeHV1 sont porteurs à vie du
virus, mais la détection directe de ce virus n’est pas pour autant aisée car en dehors de l’infection primaire, le virus reste
tapi dans les ganglions des racines sensitives (latence) en dehors des périodes de réinfections endogènes (herpès de sortie)
favorisées par certains facteurs tels que : l’œstrus, le stress, la
gravidité ou l’immunodépression sévère.
Sur l’animal vivant, on prélèvera des échantillons de muqueuse puisque le virus se multiplie de manière efficace dans
les cellules épithéliales des muqueuses. Sur l’animal mort on
pourra aussi prélever les ganglions trigéminés ou bien les ganglions sacrés. Lors de la manipulation de l’animal et de
l’écouvillon, il sera de rigueur d’observer toutes les précautions possibles afin d’éviter une éventuelle contamination humaine par le CeHV1. Le port d’une blouse, de gants, d’un
masque et de lunettes de protection est requis. En cas d’accident lors de la manipulation voir l’annexe 2 pour la conduite
à tenir.
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
Pour prélever des échantillons de cellules muqueuses, on
utilise des écouvillons stériles en coton ou en Dacron. Le prélèvement est réalisé en frottant l’écouvillon sur la muqueuse
apparemment saine à prélever (buccale, vaginale, anale ou du
prépuce) ou sur les lésions (ulcères ou vésicules muqueux ou
conjonctivaux) si elles existent. Une biopsie de peau est aussi
possible en cas de lésions patentes. Dans le but d’un isolement viral, l’écouvillon doit être immédiatement placé dans
un tube contenant 1 à 3 ml de milieu de transport de virus.
Dans le cas d’un échantillon issu d’une biopsie de peau par
exemple, le tissu collecté doit être également placé dans un
milieu de transport de virus adéquat permettant la survie du
virus (par exemple la solution de Earle complétée de 50 µg/ml
de gentamycine et 2% de sérum de veau fœtal) [9]. Par mesure
de précaution il vaudra mieux se mettre en rapport avec le biologiste qui assurera la recherche du virus pour s’assurer auprès
de lui des procédures de prélèvement et de transport. Les
écouvillons peuvent être conservés et transportés au laboratoire entre 2°C et 6°C durant une semaine. Pour des délais de
conservation ou d’acheminement supérieurs, on recommandera de congeler les échantillons à -80°C, ils sont alors stables
pendant au moins six mois.
Dans le cas d’une recherche de l’ADN viral par PCR,
l’écouvillon sera déshydraté à l’air libre pendant 10 à 15 minutes puis placé dans un emballage stérile et étanche. L’ADN
370
COUTROT (E.) ET COLLABORATEURS
sur l’écouvillon est ainsi stable jusqu’à un mois à température
ambiante et jusqu’à 6 mois à -20°C. Une alternative consiste
à placer l’écouvillon dans un tube contenant un tampon assurant la lyse des cellules, la stérilisation du prélèvement et la
bonne conservation de l’ADN (se référer aux procédures du
laboratoire qui pratiquera la PCR).
L’ISOLEMENT VIRAL IN VITRO
Bien que cette méthode ait joué un rôle déterminant dans la
caractérisation du virus, son application reste limitée à la définition de nouvelles souches variantes du virus. Seuls trois
laboratoires proposent encore cette méthode (cf. annexe 1).
Le CeHV1 se réplique de manière efficace sur des lignées cellulaires (lignée Vero de singe vert, lignée HeLa humaine) ou
sur cultures primaires de cellules de rein de singe vert ou de
rein de lapin. L’effet cytopathogène observé est typique des
herpès virus mais l’identification de l’espèce virale, par un
test de séro-neutralisation virale par des anticorps spécifiques
ou une réaction de PCR spécifique de CeHV1, est indispensable. Avant la banalisation de la PCR et des méthodes d’étude
des séquences nucléotidiques, le test de séro-neutralisation du
virus par des anticorps est demeuré longtemps l’unique outil
permettant l’identification virale. Cependant la spécificité de
la méthode était limitée par la réactivité croisée des anticorps
anti-CeHV1 de macaques avec les virus phylogénétiquement
proches et antigéniquement voisins (HSV1 et 2, SA8 et
HVP2). Désormais, seule l’identification du génome du virus
par PCR spécifique suivie de l’étude de la séquence des fragments amplifiés, permet l’identification de l’espèce virale.
LA PCR
Elle peut être réalisée soit sur l’ADN extrait des prélèvements muqueux soit, comme indiqué dans le paragraphe précédent, après mise en culture du virus contenu dans ces
Laboratoire
Tests disponibles
Dr. Julia Hilliard
B Virus Research and Resource Laboratory
Georgia State University
PO Box 4118
Atlanta, GA 30302-4118 - USA
Tel : (404) 651-0808
E-mail: [email protected]
Dr. David Brown
Enteric, Respiratory, and Neurological Virus Laboratory
Central Public Health Laboratory
61 Colindale Ave.
London NW9 5HT - England
Tel : (44) 208-200-4400
E-mail: [email protected]
VRL Laboratories
7540 Louis Pasteur Drive
San Antonio, Texas 78229 - USA
Tel : (877) 615-7275 - Fax : (877) 615-7771
Site Web : http://www.vrllabs.com/
Culture virale et PCR sur échantillons simiens et humains
Tests sérologiques (dépistage sur CeHV1) sur sérum simien
et humain
Culture et PCR sur échantillons simiens et humains
Tests sérologiques (dépistage sur CeHV1) sur sérum simien
et humain
Culture et PCR sur échantillons simiens uniquement
Tests sérologiques (dépistage sur CeHV1) sur sérum simien
et humain
BioReliance
Simian Diagnostic Laboratory
14920 Broschart Road
Rockville, MD 20850 - USA
Tel : (301) 610-2227 - Fax : (301) 610-2587
E-mail: [email protected]
Site Web : http://www.bioreliance.com/simian.html
Tests sérologiques (dépistage sur CeHV1) sur sérum simien
uniquement
Vet Diagnostics
Tests sérologiques sur échantillons simiens uniquement
Primate Viral Diagnostic
Biomedical Primate Research Centre
Lange Kleiweg 139
2288 GJ Rijswijk
The Netherlands
Phone : +31 (0) 15.284.2855 - Fax : +31 (0) 15.284.3986
email : [email protected]
Tests sérologiques (antigènes extrait de culture de HSV1) sur
échantillons simiens uniquement
Shin Nakamura
Department of Cellular and Molecular Biology
Primate Research Institute - Kyoto University
Inuyama, Aichi 484-8506 - Japan
Tests sérologiques (antigènes de Herpes papio 2) sur échantillons
simiens uniquement et pour l’Asie uniquement
ANNEXE 1 : Laboratoires de référence
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
HERPÈS B DES MACAQUES : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
371
prélèvements. La proche parenté phylogénique du CeHV1
avec les autres Simplexvirus comme le SA8, l’HVP2, mais
aussi les HSV1 et HSV2, a amené les chercheurs à proposer
différentes méthodes de PCR permettant d’amplifier spécifiquement l’ADN du CeHV1. Les séquences des amorces que
nous avons nous même étudiées sont regroupées dans le tableau III.
paires de bases (voir figure 1) et de 148 paires de bases (voir
figure 2), a pu être détecté dans le produit de PCR après électrophorèse sur gel d’agarose 1% et négatives en son absence.
Comme attendu, toutes les réactions de PCR se sont révélées
négatives avec l’ADN extrait des échantillons de Mauriciens
(cette population est indemne du CeVH1) (tableau IVa). Ces
échantillons nous ont servi de contrôles négatifs dans toutes
nos manipulations. En ce qui concerne les écouvillons prélevés chez des animaux séropositifs, on observe que la quasi
Les réactions de PCR “gGS4” et “gC” ont été déclarées positives lorsqu’un fragment amplifié, respectivement de 209
Type de PCR
Amorce
Séquence
Réf.
PCR conventionnelle gGS4
gGS4
gGAS4
CCGCGTACGACTACGAGATCC
GTTCGCGGCCACGATCCA
[10]
[10]
PCR nichée gC
gC_1352_F
gC_1646_R
gC_1410_F
gC_1558_R
CGAGATGGAGTTCGGGAGCGGCGA
GGTCACCTGCTGGCCCACGGGGTC
GTGGAGCTGCAGTGGCTGCT
AGCCGGCAGGTGTACTCGCT
[11]
[11]
[11]
[11]
PCR quantitative gB
RhBVgB_F
RhBVgB_P
RhBVgB_R
GGTGATCGACAAGATCAACGC
TCTGCCGCTCGACGGCAAAGTAC
GCCGTGCTCTCCATGTTGTT
[12]
[12]
[12]
TABLEAU 3 : Séquences des amorces pour la détection spécifique de l’ADN du CeHV1. La liste que nous présentons n’est pas exhaustive. Parmi les différentes réactions de PCR décrites, nous n’avons retenu que les plus sensibles et les plus spécifiques. Nous les
avons testées sur différents prélèvements d’origine simienne prélevés par des vétérinaires.
totalité (23 sur 24) donne un résultat positif par PCR quantitative “gB” (tableau IVa). Sur ces vingt-quatre échantillons,
douze ont été donnés positifs avec les deux techniques de
PCR, PCR conventionnelle “gGS4” et PCR quantitative “gB”
(tableau IVa). Dans tous les cas on observe que le nombre de
copies trouvées dans l’ADN extrait de ces écouvillons (de 0
à 400 copies) est très faible en comparaison avec l’ADN extrait des ganglions trijumeaux du macaque “A” (40000 copies)
(tableau IVb). Il est à noter qu’aucune des réactions de PCR
nichée “gC” réalisées sur l’ADN extraits des différents écouvillons n’a donné de résultat positif, seul l’ADN extrait des
ganglions trijumeaux du macaque “A” a permis l’amplification du fragment d’ADN attendu.
Afin de nous assurer de la spécificité des réactions, les réactions de PCR conventionnelle “gGS4”, de PCR nichée “gC”
et de PCR quantitative “gB” ont été testées sur de l’ADN viral
extrait de cultures de HSV1 et HSV2. Les deux PCR, l’une
conventionnelle et l’autre nichée, n’ont pas permis d’amplification sur l’ADN de HSV1 ou HSV2. La PCR quantitative
s’est révélée négative avec l’ADN de HSV1 ou HSV2. Dans
le cas de HSV2, les amorces ne permettent pas l’amplification de la séquence cible, et dans le cas de HSV1, il y a bel et
bien amplification mais la sonde spécifique du CeHV1 n’hybride pas les fragments amplifiés à partir de HSV1 (2 mutations ponctuelles au niveau de la séquence cible de la sonde)
(voir figure 3).
FIGURE 1 : Résultats de PCR conventionnelle “gGS4”.
Les réactions de PCR ont été réalisées à partir d’échantillons
d’ADN extraits d’un écouvillonnage buccal chez un macaque
d’origine mauricienne (A) et du ganglion trijumeau du macaque
“A” (B). PM : marqueur de poids moléculaire. Un fragment amplifié de 209 paires de bases a pu être détecté dans le produit de
PCR réalisée à partir d’un échantillon d’ADN extrait du ganglion trijumeau du macaque “A” après électrophorèse sur gel
d’agarose à 1%.
FIGURE 2 : Résultats de PCR nichée “gC”.
Les réactions de PCR ont été réalisées à partir d’échantillons
d’ADN extraits du ganglion trijumeau du macaque “A” (A) et
d’un écouvillonnage buccal chez un macaque d’origine mauricienne (B). PM : marqueur de poids moléculaire. Un fragment
amplifié de 148 paires de bases a pu être détecté dans le produit
de PCR réalisée à partir d’un échantillon d’ADN
extrait du ganglion trijumeau du macaque “A” après électrophorèse sur gel d’agarose à 1%.
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
372
COUTROT (E.) ET COLLABORATEURS
Espèce
Type de prélèvement
Nombre
PCR
“gGS4”
PCR
quantitative
“gB”
Sérologie
M.fascicularis
Ecouvillon muqueux
20
0/20
0/20
-
M.fascicularis
Ecouvillon muqueux
4
3/4
4/4
+
M. tonkeana
Ecouvillon muqueux
20
9/20
19/20
+
PCR quantitative
“gB”
Nombre de copies
par échantillon
Sérologie
Animal
Type de prélèvement
PCR
“gGS4”
Macaque A
Ganglions trijumeaux
+
40000
+
Macaque B
Ganglions trijumeaux
-
23
+
Macaque B
Ganglions sacrés
-
40
+
TABLEAU 4 : Résultats de PCR réalisées sur des prélèvements muqueux et de tissus nerveux.
(a) Des écouvillons buccaux et génitaux ont été prélevés sur dix macaques de Tonkean (Macaca tonkeana) séropositifs pour le
CeHV1, quatorze macaques crabiers (Macaca fascicularis) dont dix séronégatifs d’origine mauricienne et trois originaires des
Philippines et séropositifs pour le CeHV1.
(b) Lors de l’autopsie de deux macaques crabiers séropositifs pour le CeHV1 (le macaque “A” originaire des Philippines et le macaque “B” originaire du Vietnam) nous avons prélevé les ganglions trijumeaux et dans un cas les ganglions des racines sacrées. La
positivité de la réaction PCR conventionnelle “gGS4” a été déclarée devant la présence d’une bande de poids moléculaire attendu
(voir figure 1). Les résultats de la PCR quantitative “gB” sont exprimés en nombre de copies du génome viral présentes dans les
échantillons en rapportant les résultats à une courbe de calibration obtenue avec un plasmide contenant la séquence cible. La limite de détection de la méthode est d’environ deux copies (de plasmide) par réaction.
FIGURE 3 : Résultats de PCR quantitative “gB”.
Les réactions de PCR ont été réalisées à partir du plasmide contenant le fragment d’ADN amplifié par la PCR quantitative (A :
1000 copies par réaction, B : 100 copies par réaction) et à partir
d’échantillons d’ADN extraits de culture virale de HSV2 (C) et
HSV1 (D). PM : marqueur de poids moléculaire.
Il apparaît donc que les réactions de PCR que nous avons
testées sont très spécifiques du CeHV1 et ne donnent aucune
réaction avec le génome des deux HSV humains. Cela permet
d’exclure toute possibilité de réaction de PCR faussement positive par contamination de l’échantillon par les HSV humains
que ce soit lors du prélèvement par écouvillonnage sur l’animal ou lors de la manipulation de l’échantillon au laboratoire
d’analyse.
D’après les résultats obtenus sur les écouvillons prélevés
chez les animaux séropositifs, nous avons pu classé les différentes réactions de PCR par ordre de sensibilité en fonction
des résultats obtenus sur les écouvillons prélevés chez des animaux séropositifs : la PCR quantitative “gB” est la réaction la
plus sensible avec 23 positifs sur 24, suit la PCR conventionnelle “gGS4” avec 12 positifs sur 24 et enfin la PCR nichée
“gC” est la réaction la moins sensible car aucune des réactions réalisée avec les écouvillons prélevés chez des animaux
séropositifs ne s’est révélée positive.
La spécificité de la PCR quantitative est meilleure de part
l’emploi de deux amorces de PCR et d’une sonde contraire-
ment à la PCR conventionnelle dont la spécificité ne repose
que sur celle des deux amorces. Cependant, on peut toujours
conforter l’identification virale par l’étude de la séquence des
fragments amplifiés par PCR conventionnelle. Nous avons
réalisé cette vérification au laboratoire ce qui nous a permis
d’affirmer la nature du virus mis en évidence. Les produits de
PCR obtenus lors des réactions de PCR conventionnelles
gGS4 / gGAS4 et nichée gC_1410_F / gC_1558_ R ont été séquencés, les séquences ainsi obtenues étaient respectivement
identiques à 96% et 100% avec les séquences publiées dans
Genbank.
Détection indirecte du virus CeHV1
Comme tous les virus, le CeHV1 provoque chez le macaque
l’apparition d’une réponse immunitaire humorale caractérisée par l’apparition d’anticorps qui persisteront à des titres
variables chez l’animal et d’une réponse cellulaire (lymphocytes T CD4) qui contiendra l’infection et maintiendra la latence du virus. Le diagnostic sérologique est basé sur la mise
en évidence des anticorps dans le sérum (ou le plasma) des
macaques. Il a été démontré que les anticorps suscités par le
CeHV1 réagissent de façon croisée avec des virus phylogénétiquement proches si bien que les tests de détection utilisent soit le CeHV1 lui même soit des virus moins dangereux
à cultiver mais suffisamment proches pour ne pas nuire à la
sensibilité du dépistage. La recherche des anticorps antiCeHV1 par réactivité croisée ne nuit en rien à la spécificité
du test car les virus utilisés pour la recherche des anticorps,
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HERPÈS B DES MACAQUES : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
373
que ce soient le SA8, le HVP2 ou les HSV humains, n’ont jamais été observés chez les macaques.
Dans la suite de cet article, la spécificité et la sensibilité des
tests seront définies par rapport aux résultats rendus par des laboratoires de références (voir annexe 1).
Trois notions sont essentielles pour juger de l’efficacité
diagnostique d’un test biologique : le seuil de positivité, la
sensibilité et la spécificité. Le seuil de positivité est la valeur
au dessus de laquelle le biologiste affirme la présence d’anticorps. La spécificité et la sensibilité du test sont définies par
comparaison des résultats avec ceux obtenus avec une technique diagnostique réputée de référence. Dans le cas du
CeHV1, la seule vraie référence est l’état porteur ou non du
virus par l’animal. Seule la recherche du virus dans le tissu
nerveux des animaux permet ce diagnostic de certitude. Dans
la pratique, cependant, on ne peut se référer qu’à une autre
technique sérologique. On doit alors parler de comparaison
de performance de deux tests. Cette performance dépend des
caractéristiques techniques du test et du seuil de positivité que
le biologiste fixe dans son laboratoire. En effet, sensibilité et
spécificité varient de façon inverse en fonction du seuil ce qui
conduit le biologiste à trouver le meilleur compromis (voir figure 4). Enfin la reproductibilité du test utilisé conditionne
l’invariance du seuil au cours du temps et donc la qualité des
conclusions du biologiste. En effet il n’est pas possible d’établir un seuil lors de chaque manipulation. La standardisation
des résultats au cours du temps est donc cruciale pour la validité du test.
Bien que la technique de Western blot soit la technique de
référence pour l’identification des anticorps, elle est peu pratiquée en première intention. Le Western Blot est la première
technique qui a permis de distinguer avec certitude les sérums
contenant des anticorps spécifiques du CeHV1 de ceux contenant des anticorps spécifiques d’autres Simplexvirus proches
de ce dernier. Ce problème de spécificité se pose cependant rarement pour les sérums de macaque.
Dans le Western blot, des antigènes provenant de cellules infectées et non infectées par le CeHV1 sont soumis à une migration par électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel
de polyacrylamide avant d’être transférés sur membrane de nitrocellulose. Chaque membrane est mise en contact avec les sérums à tester et révélés par des anticorps anti-immunoglobulines
humaines marquées. Cette technique est relativement lourde à
mettre en œuvre, ne permet pas une automatisation importante
de la technique et n’est pas la technique la plus sensible.
LES TESTS ELISA
La méthode ELISA est à l’heure actuelle la méthode la plus
rapide et la plus utilisée pour le diagnostic sérologique du
FIGURE 4 : Diagrammes de ROC du test ELISA Cobas Core II.
Les valeurs de la sensibilité et de la spécificité du test Cobas Core II sont représentées simultanément pour toutes les valeurs possibles du seuil de positivité entre 0 et 100 en prenant pour référence le statut sérologique des 328 animaux délivré par un laboratoire de référence. En considérant comme variable la valeur seuil (S) on peut calculer les valeurs Se et Sp en fonction de (S). La
représentation des valeurs Se et Sp en fonction de (S) (diagramme de ROC) permet de déterminer la valeur seuil donnant le meilleur compromis entre la sensibilité et la spécificité.
Au regard de la figure 4, il apparaît qu’il existe deux valeurs seuil singulières : la première qui donne 100% de sensibilité, la seconde qui donne 100% de spécificité. La zone grisée correspond à une zone d’incertitude de diagnostic sérologique entre le 100%
de sensibilité et 100% de spécificité.
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
374
CeHV1. Cette méthode est également facile à mettre en œuvre
et très sensible.
D'une manière générale, la méthode ELISA pour le diagnostic sérologique du CeHV1 suit le principe suivant :
- adsorption sur une plaque ou une bille des antigènes viraux, incubation des sérums de macaque à tester et fixation des anticorps spécifiques du CeHV1 sur les
antigènes présents.
- les anticorps de macaque fixés sur les antigènes viraux
sont ensuite détectés par un immuno-conjugué ou de la
protéine A couplée à un enzyme. Les immunoglobulines
(Ig) de macaque étant très proches sur le plan de leur
structure des Ig humaines, il n’y a pas d’inconvénient à
utiliser comme immuno-conjugué des anti-immunoglobulines humaines couplées à une enzyme.
- révélation de la fixation des anticorps de macaque sur les
antigènes par adjonction du substrat de l'enzyme puis
quantification de la réaction enzymatique.
Le test ELISA est la méthode la plus sensible mais ne permet pas de différencier les sérums contenant des anticorps
spécifiques du CeHV1 de ceux contenant des anticorps spécifiques d’autres Simplexvirus. Ce test n’est donc pas très
adapté au diagnostic sérologique chez l’homme qui possèdent
le plus souvent des anticorps anti-HSV1 (incidence sérologique chez l’adulte 80%) et moins fréquemment des anticorps
anti-HSV2 (incidence sérologique chez l’adulte 20%), mais
convient parfaitement au diagnostic sérologique chez le macaque qui est réfractaire à l’infection par les virus humains
HSV1 et HSV2. De ce point de vue l’utilisation de tests
ELISA basés sur des antigènes extraits de virus herpès
proches de CeHV1 (SA8, Herpes papio virus 2 et HSV) pour
tester les sérums de macaques se sont avérés tout à fait satisfaisants pourvu que le test donne des performances égales à
celle de l’ELISA basé sur l’utilisation d’antigènes du virus
CeHV1 [13,14].
LES ANTIGÈNES UTILISABLES POUR LA RECHERCHE
DES ANTICORPS ANTI-CEHV1 CHEZ LES MACAQUES.
La production d’extraits antigéniques issus de cultures cellulaires du CeHV1 pour leur utilisation dans le Western Blot
ou l’ELISA est bien entendu la meilleure solution afin de préparer un test de qualité. Cependant les risques sanitaires et la
nécessité d’utiliser un laboratoire P3, qui accompagnent la
culture de ce virus ont amené de nombreux virologistes à tester des extraits antigéniques provenant d’autres Simplexvirus
proches du CeHV1.
L’utilisation d’un test ELISA basé sur le SA8 a été testée
comme alternative à l’utilisation du CeHV1. Lors de cette
étude 100 sérums de macaques crabiers ont été testés par deux
tests ELISA vis-à-vis de l'herpès virose B. Un test ELISA fut
produit à partir d’extraits antigéniques issus de culture de
CeHV1 et un second à partir d’extraits antigéniques issus de
culture de SA8. En comparant les résultats obtenus dans ces
deux tests ELISA, les auteurs ont obtenus une sensibilité de
100% et une spécificité de 89% [13]. Ces données indiquent
donc que la détection des anticorps dirigés contre le CeHV1
COUTROT (E.) ET COLLABORATEURS
pourrait être détectés de manière efficace par un test ELISA
basé sur des antigènes issus de SA8. L’utilisation de SA8 serait bien entendu moins risquée d’un point de vue sanitaire.
OHSAWA et al [14], ont mené une étude sérologique sur
349 animaux de sept espèces de macaques différentes. Les sérums de ces animaux ont été testés par trois tests ELISA visà-vis de l'herpès virose B. Un premier test ELISA fut produit
à partir d’extraits antigéniques issus de culture de CeHV1, un
deuxième à partir d’extraits antigéniques issus de culture de
HSV1 et un troisième à partir d’extraits antigéniques issus de
culture de HVP2 (Herpes papio virus 2). Les auteurs prirent
comme référence les résultats obtenus avec le test ELISA basé
sur des antigènes de CeHV1 et classèrent les résultats des animaux comme positifs, négatifs ou douteux. Les auteurs ont
ainsi pu déterminer que la sensibilité du test HSV1 était de
96% et celle du test HVP2 de 98% par rapport au test ELISA
basé sur le CeHV-1. La spécificité de ces deux tests était respectivement de 93% et 96% [14].
On peut donc voir ici que les tests ELISA basés sur les antigènes de SA8, de HSV1 ou de HVP2 permettent d’obtenir d’excellentes performances en comparaison avec un test ELISA
basé sur le CeHV1. Ces résultats sont d’autant plus intéressants
que le SA8, les HSV et le HVP2 sont des virus présentant une
sécurité de manipulation beaucoup plus grande que le CeHV1.
S’il n’apparaît pas d’inconvénient à l’utilisation des HSV
pour le dépistage des anticorps anti-CeHV1 chez le macaque,
il existe par contre que des avantages à utiliser des trousses
commercialisées pour le diagnostic humain. Ces kits ELISA
présentent en effet l’avantage d’être validés, certifiés et extrêmement reproductibles par rapport aux trousses produites
à façon dans les laboratoires de biologie. Ils permettent enfin
de s’affranchir totalement de toute manipulation de virus pour
la préparation d’extraits antigéniques.
Nous avons testé les performances d’une trousse commercialisée pour le dépistage et la quantification des IgG
humaines anti-HSV1 et anti-HSV2 : le kit COBAS CORE
Anti-HSV-I/II EIA® de Roche Diagnostic GmbH (D-68298
Mannheim). Ce test est un dosage d’anticorps immunoenzymatique indirect en phase solide sur bille de polystyrène revêtue d'antigènes. Le test est pris en charge par un automate
(Cobas Core II) qui assure le pipetage des échantillons et
toutes les étapes d’incubation, de lavage de la bille et de lecture de la réaction. Ce test révèle la fixation des anticorps par
des anti-IgG humaines produits chez la chèvre. Ces réactifs
donnent d’excellents résultats avec les IgG de macaque.
La sensibilité et la spécificité du test ont été évaluées par
rapport aux résultats sérologiques obtenus sur les mêmes sérums par différents laboratoires de référence. Au total, nous
avons ainsi étudié dans ce test la réactivité de 328 sérums de
macaque de statut sérologique connu.
L’analyse des résultats des tests sérologiques herpès réalisés chez le macaque démontre que le test ELISA Cobas Core
II commercialisé pour le dépistage des anticorps anti-HSV
chez l’homme, permet une détection efficace des anticorps
anti-CeHV1 dans les sérums de macaque. Nous avons déterminé la sensibilité et la spécificité de ce en se référant aux résultats sérologiques rendus par différents laboratoires de
référence (Figure 4 et tableau V). Nous avons retenu deux vaRevue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
HERPÈS B DES MACAQUES : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
375
leurs seuil l’une basse (6,7) correspondant à la plus haute valeur seuil donnant 100% de sensibilité et l’une haute (12,9)
correspondant à la plus basse valeur seuil donnant 100% de
spécificité. La zone comprise entre ces deux valeurs correspond à la zone d’incertitude dans laquelle on ne peut pas déterminer avec certitude le statut sérologique de l’animal. Tous
les résultats situés dans cet intervalle sont rendus douteux. Au
dessus du seuil haut (12,9) les résultats sont rendus positifs, au
dessous du seuil bas (6,7) les résultats sont rendus négatifs. Il
est important de noter que la zone d’incertitude est réduite.
De ce fait la fréquence des résultats rendus douteux ne dépasse pas 2% sur les 1728 sérums que nous avons testés au
total.
le seuil du test réalisé avec le virus SA8 n’a pas été optimisé
par étude du diagramme de ROC. Les auteurs ont privilégié la
sensibilité aux dépens de la spécificité. Si l’on compare avec
le test Cobas core II, il faudrait prendre le seuil le plus haut qui
donne 100% de sensibilité. Pour cette valeur seuil, la spécificité du test Cobas core II est de 97,2%. Les performances du
test Cobas core II sont donc nettement supérieures à celles du
test SA8. En théorie, les résultats obtenus avec les virus HVP
2 ou SA8 pourraient être meilleurs que les résultats obtenus
avec les virus humains HSV1 et HSV2. En effet ces virus animaux sont plus proches du CeHV1 que les virus herpès simplex humains. Cependant notre expérience avec cette trousse
commerciale utilisant des extraits antigéniques totaux de
HSV1 et 2 démontre que ces tests ont des performances comparables voire supérieures.
La sensibilité de ce test est proche de celles rapportées par
différents auteurs qui ont mis au point des tests ELISA non
commerciaux utilisant des antigènes issus des virus HSV1
(~95%), HVP2 (~98%) ou SA8 (~100%) [13, 14]. La spécificité de ce test est par contre bien supérieure à celles rapportées par ces mêmes auteurs : respectivement 93%, 96% et 89%
pour les tests HSV1, HVP2 et SA8 [13, 14]. Il est à noter que
Par rapport aux tests préparés par les laboratoires de référence, les trousses commerciales présentent de nombreux
avantages. Elles répondent aux normes en vigueur en terme de
sécurité pour leurs utilisateurs et chaque nouveau lot produit
par le fabricant de ces trousses est validé par ses soins et ca-
Seuil
Sensibilité
Spécificité
Faux positif
Faux négatif
Bas=6,7
100%
97,2%
17%
0%
Haut=12,9
97,4%
100%
0%
0,3%
TABLEAU 5 : Performances du test Cobas Core II pour la sérologie herpès chez le macaque pour les deux valeurs seuils.
libré par rapport aux lots précédents ce qui assure une très
grande reproductibilité au cours du temps comme nous avons
pu le démontrer dans notre expérience.
Toujours pour des raisons de sécurité, il a été produit des
glycoprotéines recombinantes du CeHV1 et testé leur potentiel diagnostic. Les glycoprotéines B, C, E et G ont ainsi été
produites par des cellules d’insecte (Sf-9) grâce à système
d'expression utilisant un baculovirus et la glycoprotéine D a
été produite par des cellules de hamster (CHO). L’efficacité
diagnostic des tests utilisant ces protéines recombinantes a été
réalisée sur 40 sérums de macaques décrétés négatifs et 75 sérums de macaques décrétés séropositifs pour le CeHV1 par
identification par un test ELISA utilisant des extraits antigéniques complets de CeHV1 et par Western Blot. La sensibilité
des tests utilisant comme antigènes cibles des protéines recombinantes gB, gC, gD et gG étaient respectivement de
100%, 97%, 88% et 80% par rapport à la méthode référence
précédemment citée. La spécificité des tests utilisant des protéines recombinantes gB, gC et gD était de 100% et celle du
test utilisant la glycoprotéine recombinante gG était de 97%.
En revanche la spécificité et la sensibilité du test utilisant la
glycoprotéine recombinante gE étaient faibles. Des sérums
humains HSV1 et HSV2 positifs ont réagit avec les glycoprotéines recombinantes gB et gD mais pas avec la gG.
Cela indique donc que les tests utilisant les glycoprotéines
B, C, D, et G ont un potentiel diagnostique élevé pour le sérodiagnostic de l’infection par le CeHV1 chez les macaques,
tandis que la glycoprotéine G peut être un antigène valable
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
pour la discrimination entre les anticorps induits par le
CeHV1 et ceux induits par d’autres alphaherpèsvirus étroitement liés comme HSV1 et 2 chez l’homme [15].
PROBLÈMES POSÉS PAR LA SÉROLOGIE :
Le diagnostic de l’infection par le CeHV1 chez les macaques par l’intermédiaire d’un test sérologique peut parfois
poser problème. Quelle que soit la méthode mise en œuvre
pour la recherche des anticorps, le résultat ne reflète pas directement la présence du virus chez un animal. Il existe des résultats faussement positifs ou faussement négatifs.
LES SÉROLOGIES FAUSSEMENT NÉGATIVES.
Plusieurs cas de résultats sérologiques faussement négatifs
ont été rapportés.
Cas 1 : il a été rapporté le cas d’une femelle macaque crabier qui a développé, à la suite d’une césarienne, une infection
disséminée sévère à CeHV1. Le sérum de cet animal prélevé
le jour de sa mort et 3 ans avant sa mort était négatif pour les
anticorps dirigés contre le CeHV1 (tests sérologiques réalisés
au VRL “Virus Reference Laboratory” à San Antonio, Texas,
USA). Le CeHV1 a pourtant pu être isolé dans le sérum du
singe récolté le jour de sa mort [6].
Cas 2 : un macaque à queue de cochon (Macaca nemestrina) nouveau-né a présenté sept jours après sa naissance une
conjonctivite de l’œil droit et des lésions périorbitaires. Ces lé-
376
sions se sont aggravées en l’espace de trois jours et sont accompagnées de multiples lésions vésiculo-ulcératives sévères
de la face et de la tête. L’animal présenta également une méningo-encéphalomyélite focale. Le CeHV1 a été isolé à partir d’écouvillonnages réalisés au niveau des lésions cutanées,
du foie et de la rate. Le sérum obtenu au moment de la mort
de l’animal était négatif pour les anticorps anti-CeHV1 et la
mère présenta une sérologie faiblement positive et constante
au cours du temps vis-à-vis du CeHV1 [16].
Cas 3 : en janvier 1993, une femelle macaque rhésus (Macaca mulatta) de 8 mois est isolée du reste de sa colonie en
raison d’une conjonctivite bilatérale avec atteinte cornéenne.
Des ulcères ont été détectés sur la jonction cutanéo-muqueuse
de la lèvre inférieure et la langue. Il est découvert une méningo-encéphalomyélite similaire au précédent cas. Le
CeHV1 a été isolé à partir de la conjonctive, de la langue et de
la rate. Le sérum obtenu au moment de la mort de l’animal
était négatif pour les anticorps anti-CeHV1 [16].
Il apparaît donc à la lumière de ces cas que des macaques
peuvent être infectés par le CeHV1 bien que l’on soit incapable de détecter des anticorps sériques chez ces animaux. La sérologie ne permet donc pas, y compris grâce aux méthodes
les plus sensibles comme l’ELISA, de détecter l’ensemble des
animaux infectés par le CeHV1. La séroprévalence dans une
population de macaques est donc différente de la prévalence
de l’infection réelle par le CeHV1.
En dehors de ces cas, l’immunodépression peut diminuer
l’efficacité de la réponse humorale et donner lieu à des faux
négatifs. Les animaux immunodéprimés peuvent parfois devenir négatifs à la sérologie alors qu’ils étaient séropositifs
avant l’immunodépression tout en demeurant infectés par le
virus, mais surtout des animaux séronégatifs immunodéprimés peuvent développer une infection par le CeHV1 sans produire aucun anticorps vis-à-vis du virus et ainsi rester
séronégatifs malgré l’infection.
Cas 4 : Au cours d’une étude sur une drogue immunosuppressive, trois macaques crabiers recevant une forte dose ont
développé des ulcères oraux et/ou linguaux plus ou moins
marqués, des vésicules dans la cavité orale, sur la langue et/ou
les lèvres après 12 à 13 semaines de traitement. Un de ces animaux développa un jetage nasal et des difficultés respiratoires.
Le CeHV1 a pu être isolé des lésions par culture virale. Les
analyses sérologiques par méthodes ELISA menées chez les
trois animaux atteints donnèrent des résultats négatifs deux
semaines avant le début de l’étude ; puis après l’apparition
des lésions deux animaux restèrent encore séronégatifs et un
présenta une légère séroconversion vis-à-vis du CeHV1 [17].
Cas 5 : Au cours d’une étude rétrospective sur les résultats
sérologiques de macaques rhésus utilisés pour des essais d’allogreffe rénale, six animaux ayant subit une irradiation totale
lymphoïde qui étaient séropositifs au début de l’étude sont devenus séronégatifs vis-à-vis du CeHV1. Ces animaux étaient
bien entendu toujours porteurs du virus [18].
LES SÉROLOGIES FAUSSEMENT POSITIVES
Faux positifs par réactivité croisée
Il peut également se poser le problème de résultats fausse-
COUTROT (E.) ET COLLABORATEURS
ment positifs. De tels résultats peuvent apparaître en raison
de réactivité croisée qu’il existe entre les anticorps produits
en réponse à des virus antigéniquement proches. Toutefois
cette remarque ne s’applique pas à l’exemple des macaques
d’origine asiatique car ces animaux ne peuvent être infectés
par le SA8 ou le HVP2 en l’absence de contact avec des animaux d’origine africaine. Par ailleurs il a souvent été évoqué
la possibilité d’une infection des macaques par les HSV humains. Une recherche bibliographie exhaustive ne nous a pas
permis de retrouver de preuve que les macaques puissent être
infectés par les virus humains. Au contraire le macaque est le
plus souvent défini comme une espèce naturellement résistante à l’infection par ces virus.
Il apparaît donc qu’un résultat séropositif pour le CeHV1
chez une espèce autre que le macaque doit être pris avec précaution, éventuellement vérifié par Western Blot, mais surtout
confirmé par la recherche du CeHV1 chez cet animal, soit par
isolement viral, soit par recherche du génome du virus par
PCR. Par contre un résultat positif chez un macaque d’origine
asiatique a très probablement pour origine une infection par le
CeHV1 et non par un autre virus phylogénétiquement proche.
La fausse positivité par réactivité vis à vis d’antigènes cellulaires
Les tests sérologiques nécessitent l’emploi d’antigènes viraux. Or ces antigènes viraux ne peuvent être produits qu’à
partir de culture cellulaire. Pour utiliser ces antigènes viraux,
il est nécessaire de les extraire. Les antigènes viraux ainsi obtenus sont donc généralement contaminés par des antigènes
provenant des cellules utilisées pour la culture. Il peut arriver
que les animaux, essentiellement dans le cas de maladies autoimmunes, présentent des anticorps capables de reconnaître les
antigènes contaminants d’origine cellulaire. Dans ce cas le
test sérologique pourra être faussement positif.
Une méthode permettant de s’affranchir de ce problème a
été mise au point par NAKAMURA [communication personnelle]. Elle consiste à diluer les sérums à tester dans un extrait antigénique des cellules identiques à celles utilisées pour
préparer l’antigène viral mais indemnes de toute infection virale. De cette manière la fixation des auto-anticorps naturels
ou des anticorps naturels anti-espèces (dans le cas de la méthode employée, il s’agit d’anticorps naturels anti-cellule
Vero) sur les antigènes cellulaires adsorbés sur la plaque est
inhibée par compétition avec les antigènes cellulaires solubles apportés en excès.
Dans notre expérience nous avons été confrontés à de multiples cas de discordance entre experts pour un même sérum,
ainsi nous avons eu à déplorer de fortes discordances pour six
sérums sur les vingt-deux testés par au moins deux laboratoires de référence différents (voir tableau VI). On peut alors
déplorer le manque de transparence de certains de ces laboratoires de référence comme VetDiagnostics et l’absence de validation officielle des tests réalisés dans ces laboratoires de
référence. En particulier une validation des différents laboratoires entre eux à partir d’une banque commune de sérums de
macaque serait par exemple souhaitable et limiterait sans
doute les discordances entre les résultats rendus par les
experts. Cela serait bénéfique pour la qualité des résultats renRevue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
HERPÈS B DES MACAQUES : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
377
dus par les laboratoires de référence qu’une telle standardisation soit mise en place un jour.
de la maladie humaine est de deux jours à cinq semaines [1].
En raison du tropisme du virus pour les cellules épithéliales de
l’épiderme et des muqueuses, c’est à ce niveau que le virus se
développera en premier lieu chez l’homme où il peut être responsable d’une maladie locale pouvant évoluer vers l’apparition des vésicules herpétiques. Il faut éviter que la personne
présentant des vésicules ne diffuse le virus à son entourage. La
dangerosité du virus repose sur son tropisme pour le système
nerveux central. Par transport axonal rétrograde au niveau des
voies sensitives innervant le chancre d’inoculation, le virus
gagne le système nerveux central où il induit une méningoencéphalite spontanément mortelle chez l’homme. La symptomatologie de la maladie humaine s’accompagne d’un
syndrome pseudogrippal, et sur le plan neurologique débute
par des paresthésies et fourmillements locaux parfois associés
Conduite à tenir en cas de suspicion de transmission d’un macaque à l’homme (voir tableau VII).
L’homme peut accidentellement se contaminer au contact
des macaques porteurs du virus. L’homme se contamine principalement par griffure ou morsure, même superficielles. Ont
également été décrits des cas de contamination par voie muqueuse, oculaire (conjonctive) ou cutanée (plaies même superficielles) par des projections de fluides contaminants
(urine, salive, larmes, menstrues...) ou de fèces. L’incubation
Résultats des laboratoires de référence
Notre étude
Animal
BioReliance
Vet
Diagnostics
Virus
Reference
Laboratory
B virus
Resource
Laboratory
Cobas
Core II
PCR
1
Négatif
Positif
nt
nt
Négatif
nt
2
Négatif
Positif
nt
nt
Négatif
nt
3
Négatif
Positif
nt
nt
Douteux
Positif
4
nt
Positif
Négatif
nt
Douteux
nt
5
nt
Négatif
nt
Positif
(titre <1:5000)
Positif
nt
6
nt
Négatif
nt
Positif
(titre <1:5000)
Positif
nt
TABLEAU 6 : Récapitulatif des résultats discordants rendus par les laboratoires de référence et comparaison avec les résultats obtenus
avec les tests ELISA Cobas Core II. Les résultats rendus par le laboratoire “B virus Resource Laboratory” ont été confirmés par
un Western Blot CeHV-1. Les résultats du test ELISA Cobas Core II sont rendus en fonction de deux valeurs seuils optimisées par
le diagramme de ROC (négatif <6,7 ; douteux entre 6,7 et 12,9 ; positif >12,9). Pour l’animal 3 qui a été euthanasié, nous avons
obtenu des prélèvements de muqueuse génitale par écouvillonnage à partir desquels nous avons extrait l’ADN. Les réactions de
PCR “gGS4” et “gB” se sont avérées positives. (nt : non testé)
à des parésies. Le syndrome méningo-encéphalitique d’évolution rapide, débute entre trois jours et trois semaines après
les premiers signes cliniques, et évolue vers le décès du patient. Jusqu’à présent 30 cas mortels ont été rapportés.
Le diagnostic de portage viral chez le macaque impliqué
dans la suspicion de contamination humaine ne repose pas
tant sur la clinique, étant donné la grande fréquence des porteurs sains, que sur la biologie. Dans ce contexte la sérologie,
si elle est positive, ne permet pas d’affirmer que le macaque
était contagieux au moment de l’exposition. En effet en période de latence virale, seuls les ganglions des racines sensitives sont infectés par le virus. La PCR, si elle positive au
niveau des muqueuses de l’animal, permet d’affirmer que ce
dernier était infectieux. Une séronégativité de l’animal ne garantit jamais l’absence de portage viral (période muette précédent la séroconversion, déficit immunitaire sévère). Malgré
sa grande sensibilité, la PCR peut être prise en défaut du fait
des difficultés l’échantillonnage biologique chez un macaque
asymptomatique.
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
Conclusion
Quelque soit la méthode utilisée pour dépister les anticorps
anti-CeHV1, il ne faudra jamais oublier que certains animaux
porteur du virus peuvent demeurer séronégatif et faire courir
un risque aux personnes qui entrent en contact avec eux [6,
16-18]. On retiendra donc que la séropositivité doit inciter à
la prudence mais que la séronégativité ne doit en aucun cas
être prise comme une garantie d’absence de risque.
Lorsqu’un sérum donne un résultat compris dans la zone
douteuse, il est inutile de tester à nouveau le même sérum,
surtout si, comme dans le cas présent, le test utilisé est très
reproductible, il conviendra plutôt de réaliser un second examen sur un autre échantillon de sérum prélevé au moins à
quinze jours d’intervalle par rapport au précédent. Les résultats obtenus avec les deux sérums testés le même jour seront
comparés afin de rechercher une éventuelle séroconversion
chez cet animal. Jusqu’à ce jour, nous avons observé une fréquence d’environ 2% de résultats douteux.
378
La détection directe du virus par PCR à partir d’ADN extrait
d’écouvillonnages muqueux est une méthode de dépistage envisageable chez le macaque. Cette méthode est cependant déconseillée en routine en raison de son manque de sensibilité
évident quant on connaît la biologie du virus qui n’est excrété
au niveau muqueux que de manière intermittente.
COUTROT (E.) ET COLLABORATEURS
La PCR peut parfois permettre d’obtenir un diagnostic de
certitude quant à l’infection d’un animal par le CeHV1 en cas
de sérologie douteuse (cf. animal dont est issu le sérum 3 du
tableau VI). Toutefois le dépistage par PCR de l’infection par
le CeHV1 chez le macaque n’est pas conseillé en routine car
un résultat négatif par PCR à partir d’un écouvillon muqueux
Revue Méd. Vét., 2007, 158, 7, 367-379
HERPÈS B DES MACAQUES : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
379
ne permet d’aboutir à aucune conclusion. L’absence de virus
dans un prélèvement muqueux ne garantit donc en aucun cas
l’absence d’infection par le CeHV1 chez le macaque prélevé.
Le seul diagnostic de quasi certitude en ce qui concerne l’absence d’infection d’un animal par le CeHV1 ne peut être obtenu que par PCR en employant de l’ADN extrait des
ganglions trijumeaux et sacrés de l’animal. Ce résultat ne peut
donc pas être obtenu du vivant de l’animal.
2. - WEIGLER B. J. : Biology of B virus in macaque and human hosts : a
review. Clin. Infect. Dis., 1992, 14, 2, 555-567
Dans tous les cas il faudra retenir que la sérologie reste une
méthode de choix pour le dépistage du portage viral du
CeHV1. Cependant il s’agit d’une méthode indirecte de diagnostic. Cette méthode ne permet en aucun cas un diagnostic de
certitude quant à l’infection ou non d’un animal par le
CeHV1, quelque soit le laboratoire de référence qui a pratiqué
le test. La seule méthode de diagnostic de certitude disponible actuellement reste l’euthanasie de l’animal en cause suivie de la recherche par PCR de la présence du génome du
virus dans les ganglions trijumeaux et lombo-sacrés de l’animal.
Remerciements
Nous tenons à remercier tout particulièrement Eric André
(société Bioprim®) pour son aide précieuse et son soutien sans
faille. Nous tenons à manifester notre gratitude pour les nombreux vétérinaires qui nous ont confié des sérums et des prélèvements muqueux provenant de macaques dont le statut
sérologique vis-à-vis du CeHV1 avait été établi par des laboratoires de référence. Nous remercions également le Docteur
Catherine Mengelle (Laboratoire de Virologie du CHU de
Toulouse), le Docteur Cheick Coulibaly (Paul Ehrlich Institute, Allemagne), le Docteur Shin Nakamura (Institut de primatologie de Inuyama, Japon), les Docteurs Friedrich Raulf et
Marc Bigaud (Novartis Pharma AG, Transplantation Research, Bâle, Suisse) pour les précieux renseignements et matériels qu’ils nous ont offerts. Les travaux ont été réalisés avec
les fonds recueillis par le Laboratoire d’Immunogénétique
Moléculaire de l’Université Paul Sabatier (contrat du Ministère de la recherche EA3034). Nous tenons enfin à remercier
pour leur précieux concours les techniciennes du Laboratoire
d’immunogénétique Moléculaire et celles du Laboratoire du
Docteur Blancher-Sardou.
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