Biotoxines marines

Biotoxines marines
Application des techniques LC et LC-MS dans le laboratoire des biotoxines
marines
Les toxines marines ont d’importantes conséquences pour l’économie et la santé publique. De vastes programmes de monitoring sont dès lors requis. Plusieurs groupes de toxines marines ont été décrites, les plus connues
étant :
• les amnesic shellfish poisoning toxines (ASP), dont le principal représentant est l’acide domoïque
• les diarrhetic shellfish poisoning toxines (DSP) qui comptent plusieurs sous-groupes comme le groupe
de l’acide okadaïque (OA et des dinophysitoxines : DTX1, DTX2 et DTX3), les pecténotoxines (PTXs: PTX1 et
PTX2), les azaspiracides (AZAs : AZA1, AZA2, et AZA3) et les yessotoxines (YTXs : YTX, 45-OH-YTX, homo-YTX et
45OH homo-YTX). Les deux derniers sont considérés comme des groupes séparés étant donné que les AZAs
sont très toxiques et que les YTX ne produisent pas de troubles gastro-intestinaux.
• les paralytic shellfish poisoning toxines (PSP): le groupe des saxitoxines (STX).
Bien qu’on soit en présence d’un fort besoin international de meilleures méthodes de détermination de ces
toxines, de nouvelles méthodes validées officielles ne sont pas encore disponibles. Il y a une série de méthodes
de référence qui ont été décrites dans les règlements de l’UE pour la détermination des biotoxines marines dans
les coquillages (Règlement (CE) n° 2074.2005, Règlement (CE) n° 1664/2006, Règlement (CE) n° 1244/2007). Ces
méthodes comprennent un essai biologique sur souris (MBA) pour les STX et les toxines lipophiles, un essai
biologique sur rats (RBA) pour les toxines lipophiles, une méthode de chromatographie en phase liquide à haute
pression (HPLC) pour les toxines STX et l’acide domoïque, et des méthodes basées sur les anticorps (ELISA) pour le
screening de l’acide domoïque. Selon les rapports, seuls les essais biologiques pour l’analyse des toxines lipophiles
n’ont encore jamais été soumis à une procédure de validation par un essai interlaboratoires. Les autres méthodes
ont été validées et standardisées par l’AOAC-international (Association of Official Analytical Chemists). Ces méthodes AOAC offrent de nombreux avantages et sont utilisées pour déterminer le respect des prescriptions officielles,
pour contrôler et traiter la qualité, pour poser des exigences et pour évaluer le respect des conditions fixées dans
les missions et pour soutenir la recherche scientifique. Il y a aussi d’autres possibilités de standardiser une méthode, comme la procédure CEN en Europe.
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L’impact d’une méthode AOAC a un caractère international. On peut citer comme exemple une méthode alternative pour les toxines PSP officielles (OMA 2005, 06). Dès que cette méthode eut été étudiée et approuvée par la
Marine and Freshwater Toxines Task Force et le bureau des méthodes officielles (OMB) de l’AOAC, plusieurs formations, directives UE et revues du Codex Alimentarius ont suivi. Un affinement et une extension de la méthode fut
immédiatement la priorité dans les différents centres d’expertise et laboratoires légaux aux USA. Depuis l’année
dernière, le LNR du Royaume Uni a une version affinée et automatisée de cette méthode (avec une oxydation de
colonne pré-LC) pour les toxines du groupe PSP. Ceci permet d’avoir une meilleure disponibilité de méthodes plus
rapides et plus sensibles, et de réduire l’utilisation d’animaux expérimentaux.
Actuellement, l’extension de la méthode HPLC-FLD (chromatographie en phase liquide à haute pression avec
détection par fluorescence) pour les toxines PSP est, à côté du remplacement du MBA pour la détermination des
toxines lipophiles, l’un des principaux sujets pour le Community Reference Laboratory (EURL). La présentation
de la méthode dite de Lawrence, telle que publiée dans l’AOAC Official Method 2005.06 pour la détermination
des toxines PSP par HPLC, est évaluée quant à des normes plus disponibles et pour lesquelles la méthode n’a pas
d’abord été validée. Cette méthode est applicable pour la détermination de la saxitoxine (STX), de la néosaxitoxine (NEO), des gonyautoxines 2 et 3 (GTX 2, 3; ensemble), des gonyautoxines 1 et 4 (GTX 1, 4; ensemble), de la
décarbamoyl Saxitoxine (dcSTX), B-1, C-1 et C-2 ensemble, et C-3 et C-4 (ensemble) dans les coquillages (moules,
coques, huîtres et coquilles Saint-Jacques). Récemment, la performance analytique de methode a été évaluée
pour les autres toxines telles que dcNEO, dcGTX 2,3 et GTX6 in either collaborative studies or single laboratory
validations. Le LNR-BE a validé la méthode et il est impliqué en permanence dans les activités organisées par le
EURL pour les biotoxines marines.
Tant les laboratoires nationaux de référence que les laboratoires de
contrôle officiels sont obligés d’utiliser les méthodes de référence
pour leurs programmes de contrôle. La méthode la plus utilisée pour
la détection de biotoxines marines lipophiles dans les coquillages est
le MBA. On propose actuellement de la remplacer par une méthode
chimique. Le MBA comprend l’injection d’un extrait de coquillage
dans la cavité abdominale de souris. La mort de la souris indique la
présence de toxines marines. Toutefois, l’Autorité européenne de Sécurité alimentaire (EFSA) a fait remarquer que
le MBA s’avérait ne pas être suffisamment apte à protéger mieux et plus précocement les consommateurs. C’est
pourquoi la Commission européenne a décidé en 2009 qu’une méthode plus spécifique était nécessaire. Actuellement, on s’intéresse en Europe à la recherche interlaboratoires et à la validation de la détection de toxines marines
lipophiles dans les coquillages par chromatographie en phase liquide associée à la spectrométrie de masse (LCMS). Ce test doit finalement détecter simultanément plus de dix toxines lipophiles (acide okadaïque, DTXs, AZAs,
PTXs et YTXs), avec des limites de détection inférieures à 40 mg/kg. C’est à dire quatre fois inférieures aux limites
actuelles.
En Belgique, le Laboratoire national de référence (LNR) pour le contrôle des biotoxines marines a également collaboré étroitement avec le laboratoire de référence européen (EURL-LNR) pour le développement d’une méthode
chimique d’analyse des toxines lipophiles en alternative à l’essai biologique sur souris. Grâce aux efforts du LNR, la
méthode a été validée en 2009. Cette méthode utilise une technologie de séparation UPLC, ce qui permet d’obtenir un temps d’analyse plus court et une meilleure identification des toxines. Dans l’intervalle, l’AFSSA (Agence
Française de Sécurité sanitaire des Aliments) a réagi positivement en voulant utiliser cette méthode dans des
programmes de monitoring et de contrôle. L’AFSSA voulait ainsi anticiper rapidement et vivement les conséquences possibles de la toxicité atypique depuis 2005. Le MBA aurait en effet donné de nombreux résultats faussement
positifs. Or, les résultats positifs avec l’essai biologique sur souris n’ont pas été confirmés par la méthode chimique.
Dans les développements ultérieurs de la détection des toxines connues et émergentes, la Commission européenne travaille aux aspects pratiques du remplacement du MBA par des méthodes chimiques. La méthode du
MBA ne pourra plus être utilisée que pendant la “phase de transition”. Cette phase dépend des besoins des différents LNR à se pourvoir en matériel et en personnel.
Mirjana Andjelkovic (ISP, 1050 Bruxelles)
[email protected]
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