HPLC - les technologies Interchim

Transcription

Développement de méthode HPLC
Test de Classification des colonnes HPLC C18 par analyse
en sub-critique d’isomères de caroténoïdes
Ce test a été développé au LETIAM (IUT Orsay), laboratoire du Groupe de Chimie
Analytique de Paris sud.
A partir d’une analyse de pigments caroténoïdes, ce test est capable de distinguer
plus d’une dizaine de groupes de phases stationnaires à polarité de phase inversée,
dont les propriétés sont parfois très différentes.
Il compare les propriétés majeures d’environ 160 colonnes HPLC de silice greffée
C18. Des phases dites "anciennes" (Lichrosorb, Kromasil, Partisil) jusqu’au phases
les plus récentes, dont celles à haute densité de greffage ou à groupements polaires
insérés.
Il détermine en une analyse trois propriétés majeures des phases stationnaires :
• l’hydrophobicité, capacité générale de rétention de la phase qui dépend du taux de
greffage et de la surface spécifique
• la sélectivité stérique liée à son aptitude à séparer des molécules dont la structure
tridimensionnelle est différente (isomères)
• l’accessibilité aux silanols résiduels, notamment pour les produits basiques
Analyses
Contrairement à des approches plus chimiométriques, sa présentation simple au
travers de deux diagrammes successifs (étape 1 et 2), permet de distinguer rapidement
les phases dont le comportement chromatographique va être similaire, et celle pour
lesquelles il est éloigné.
Ce test a été mis au point en chromatographie sub-critique, technique performante et
rapide qui offre un potentiel indispensable à l’élaboration d’un tel test : force éluante
importante du fluide sub-critique modifié (mélange de dioxyde de carbone et de
méthanol), faible viscosité du fluide conduisant à la fois à une dispersion cinétique
moléculaire réduite (pics fins) et à l’utilisation de débits de phase mobile élevés
(analyses rapides). Ces résultats ont été corrélés à ceux obtenus avec des phases
mobiles hydro organiques.
Conditions d’étude
1. injection de 15 microlitres d’un mélange dilué de béta-carotène partiellement
isomérisé, donc comprenant les formes all-trans, 9-cis, 13-cis (isomère cis majoritaire)
et 15-cis, et de zéaxanthine (béta-carotène di-hydroxylé).
B.2
2. la phase mobile est un mélange dioxyde de carbone/méthanol (85/15; v/v), la
température est de 25°C, la contre-pression de sortie de 15 MPa, le débit de 3 ml/min
et la longueur d’onde de détection de 440 nm.
B.2
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Liste des colonnes HPLC C18 étudiées
Biotage
SGE
Agilent Technologies
YMC
ES Industries
Whatman
Whatman
Grace - Alltech
Merck
Varian
Grace - Alltech
Waters
Grace - Vydac
Tosoh Biosciences
Eichrom
Higgins
YMC
Interchim
Colochrom
SGE
Grace - Vydac
Grace - Alltech
SFCC
Tessek
Interchim
Grace - Alltech
Grace - Alltech
ES Industries
Whatman
Thermo separation
Macherey Nagel
Merck
Thermo separation
Waters
Macherey Nagel
Tessek
Waters
Perkin Elmer
Higgins
Waters
GL sciences
Supelco
Nomura
Grace - Jones
Higgins
Thermo separation
Thermo separation
Supelco
Interchim
Phenomenex
Waters
Grace - Jones
Grace - Alltech
Supelco
YMC
Shiseido
Colochrom
Beckman
Restek
Cluzeau
Interchim
Beckman
Waters
Colochrom
SMT
Macherey Nagel
Colochrom
Merck
Merck
Macherey Nagel
Merck
SGE
Waters
Tosoh Biosciences
Grace – Alltech
Merck
Perkin Elmer
Unisphere C18
SGE-250 GL4 P-C18
Zorbax 300 SB C18
Hydrosphere C18
Gamma-bond C18
Partisil ODS1
Zorbax ODS
Partisil ODS3
Econosphere C18
Lichrosorb RP18
ResElut C18
Alphabond C18
microBondapak C18
Vydac 238TP
TSK OD 80-TM
Synchropak C18
Zorbax SB C18
Targa C18
YMC Pack ODS-AQ
Uptisphere HDO
Excelsphere 120 C18-H
Wakosil C18-RS
Vydac 201HS
Platinum C18
Bondasorb C18
Separon C18
Uptisphere NEC
Adsorbosil C18
Econosil C18
Chromegabond C22
Partisil ODS2
Hypersil PAH
Nucleosil 100 C18-PAH
Lichrospher PAH
Hypersil Green-PAH
Spherisorb ODS1
Nucleosil 100 C18
Separon C18 ec
Resolve C18
PE CR C18
HAIsil C18
XTerra MS C18
Inertsil ODS-3
Supelcosil LC-18
Develosil C18
Apex C18
Clipeus C18
Hypersil ODS
Hypersil 100 C18
Supelcosil LC-18S
Uptisphere ODB
Luna C18-2
Delta-Pak C18
Genesis C18
Adsorbosphere HS C18
Supelcosil LC 18-DB
YMC Pack ProC18
Capcell Pak C18
Exelsphere 120 ODS2
Ultrasphere ODS
Allure C18
Satisfaction RP 18-AB
Zorbax Eclipse XDB C18
Uptisphere HSC
Ultrasphere XL ODS
Spherisorb ODB
Colosphere C18
SMT C18
Nucleosil 50 C18
Normasphere ODS2
Superspher 100 RP18
Purospher 100 RP18
Nucleosil 50 C18ec
Lichrospher 100 RP18
Exsil ODS
Spherisorb ODS2
TSK ODS-120T
Brava BDS C18
Chromolith C18
Spheri-5 ODS
e-mail [email protected]
z
Cluzeau
Grace - Alltech
Macherey Nagel
Waters
Grace - Alltech
Merck
Waters
Merck
Thermo separation
Supelco
Thermo separation
Supelco
Merck
GL sciences
Thermo separation
Macherey Nagel
Higgins
Restek
Eka Nobel
Varian
Macherey Nagel
Grace - Vydac
Baker
Grace - Alltech
Grace - Vydac
Grace - Vydac
Grace - Vydac
Baker
Tosoh Biosciences
Tosoh Biosciences
Thermo separation
Merck
Dionex
Interchim
Macherey Nagel
Macherey Nagel
Varian
Waters
Nacalai Tesque
Nacalai Tesque
Nacalai Tesque
Grace - Alltech
Grace - Alltech
Thermo separation
Supelco
Phenomenex
Phenomenex
Grace - Alltech
Grace - Alltech
Grace - Alltech
Grace - Alltech
Cluzeau
Cluzeau
Dionex
Interchim
Macherey Nagel
Macherey Nagel
Phenomenex
Supelco
Supelco
Supelco
Supelco
Thermo separation
Thermo separation
Thermo separation
Waters
Waters
Varian
Varian
Varian
Varian
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Stability ODS2
Adsorbosphere XL C18
Nucleosil 300 C18
Nova-Pak C18
Alltima C18
Purospher 100 RP18e
Symmetry C18
Lichrospher 100 RP18e
Zorbax RX C18
Hypersil BDS C18
Discovery C18
HyPurity C18
Supelcosil LC-18T
Superspher 100 RP18e
Inertsil ODS-2
Hypersil Elite C18
Nucleosil 100 C18-HD
HAIsil C18-HL
Ultra C18
Kromasil C18
Zorbax Extend C18
Omnisphere C18
Nucleosil C18-AB
Vydac 202TP
Baker C18-WP
Prosphere 300 C18
Vydac 218TP
Vydac 218MR
Vydac 201TP
Baker C18-NP
TSK ODS-80TS
TSK ODS-120A
Betabasic C18
Purospher star RP18e
Acclaim C18
Uptisphere TF
Nucleodur 100 C18ec
Nucleodur Gravity C18
Pursuit C18
Atlantis dcC18
Cosmosil C18-MS II
Cosmosil C18-AR II
Cosmosil C18-PAQ
Alltima HP C18 HL
Alltima HP C18
Hypersil Gold
Discovery HS C18
Gemini C18
Synergy Fusion RP
Platinium EPS C18
Alltima HP C18 amide
Prevail amide C18
Prevail C18
Stability BS C23ne
Stability BS C23e
Acclaim Polar Advantage
Zorbax Bonus-RP
Uptisphere PLP
Nautilus C18
Nucleosil Protect C8
Synergy Hydro RP
Suplex PKB
Supelcosil ABZ
Supelcosil ABZ+
Discovery RP amide C16
Aquasil C18
HyPurity C8 Advance
HyPurity Aquastar
Xterra RP 18
Symmetry Shield RP18
Polaris amide C18
Polaris ether C18
Polaris A C18
Polaris B C18
Uptisphere BioP II
Uptisphere BioP I
Uptisphere WOD
Uptisphere WRP
Strategy Pro
Uptisphere Strategy RP
Uptisphere Strategy C18-2
Uptisphere Strategy C18-3
Visit our website : www.interchim.com
Analyses
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
B.3
B.3
Présentation des résultats
La classification se fait en deux étapes successives, l’une validant le groupe
d’appartenance (propriétés de reconnaissance de forme et accessibilité aux sites
polaires), l’autre permettant de prendre en compte dans un groupe donné
l’hydrophobicité de la phase.
Analyses
Etape 1 :
Deux sélectivités sont calculées et portées sur le diagramme de classification :
a) l’une, entre l’isomère 13-cis (forme coudée) et la forme all-trans (forme linéaire) du
béta-carotène est portée en abscisses.
La séparation des isomères cis/trans du béta-carotène est basée sur une
reconnaissance de forme, c’est à dire sur la capacité de la phase stationnaire à
discriminer dans l’espace une molécule linéaire et une molécule coudée, qui
n’établiront pas les mêmes interactions avec la phase stationnaire à cause de leur
géométrie tridimensionnelle.
Les conclusions obtenues à partir de la comparaison des résultats avec d’autres
tests (notamment le test NIST 869) avec des phases stationnaires de structure connue
montrent que pour une sélectivité cis/trans comprise entre 1 et 1,1 la phase est
monomérique (mono couche greffée sur la silice de base) à faible densité de greffage,
de 1,1 à 1,2 la phase est monomérique à haute densité de greffage ou plus rarement
à caractère partiellement polymérique (couches poly moléculaires greffées sur la silice
de base), au delà de 1,2 elle est polymérique à large pores. De manière générale, les
phases polymériques montrent notamment une capacité spéciale pour la séparation
d’hydrocarbures poly-aromatiques (HPA) et des isomères rigides de stéréochimies
différentes.
Les phases monomériques peuvent être obtenues par réaction de la silice de base
avec des silanes mono ; di ou trifonctionnels en absence d’eau ; les phase
polymériques sont obtenues avec des silanes trifonctionnels en présence de traces
d’eau.
b) l’autre sélectivité, portée en ordonnées sur le diagramme de classification est
calculée entre le béta-carotène all trans et la zéaxanthine dont la structure est celle du
béta-carotène avec un groupement hydroxyle sur chaque cycle terminal.
Des interactions polaires supplémentaires peuvent ainsi être mises en évidence : les
interactions silanophiles développées entre les hydroxyles de la zéaxanthine et les
silanols résiduels de la phase stationnaire, ou avec d’autres sites polaires de la
phase stationnaire (siloxane pour les phases polyfonctionnelles, amide, urée, etheroxyde, ammonium quaternaire ou carbamate pour les phases à groupement polaire
inséré dites shieldées).
Plus cette valeur de sélectivité augmente, et moins fortes sont ces interactions, donc
moins la phase stationnaire porte de groupements polaires capables d’interagir avec
la zéaxanthine dont la rétention est alors faible. Cette sélectivité varie de 0.3 pour les
phases ayant un groupement polaire inséré, jusqu’à presque 20 pour les phases les
mieux protégées. De 0,3 à 1 l’accessibilité aux sites polaires est importante, de 1 à 5
elle est moyenne, de 5 à 10 elle est faible, au-delà elle est très faible.
Si les multiples traitements d’end-capping (uniques ou combinés) se traduisent
presque toujours par une augmentation de cette sélectivité, montrant bien ainsi le
masquage des silanols résiduels, d’autres phases non end-capped mais à haute
densité de greffage présentent une sélectivité élevée signifiant une accessibilité réduite
aux sites polaires de la phase stationnaire.
B.4
B.4
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Etape 2 :
Pour les phases stationnaires des groupes 4, 5, 7 & 8 ) un deuxième diagramme est
construit en portant en abscisse l’accessibilité silanols et en ordonnée l’hydrophobicité.
Ainsi, cette nouvelle étape permet de classer les colonnes d’un même groupe
(reconnaissance de forme et activité silanols identique) en fonction de leur accessibilité
silanols et de leur hydrophobicité. En d’autres termes, les colonnes d’un même groupe
produiront une séparation de qualité similaire, mais avec des temps d’analyses
différents. La deuxième étape sert donc à déterminer plus finement la durée de l’analyse
et concourt donc au début de l’optimisation de la méthode de mise au point de la
séparation.
Analyses
(Les valeurs d’hydrophobicité ne peuvent pas être présentées sur le même diagramme).
Groupe 4
B.5
B.5
z
Groupe 5
Analyses
Groupe 7
Groupe 8
B.6
B.6
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Application du test aux phases à groupe polaire inséré
et à end-capping polaire
Ces phases permettent soit de travailler sur des produits basiques "groupe polaire
inséré, soit en milieux purement aqueux "end-capping polaire" .
Notons qu’en chromatographie supercritique, l’absence d’eau dans la phase mobile
laisse les groupements polaires insérés (amide, carbamate, sulfonamide) et les endcapping hydrophiles interagir fortement avec le composé portant les groupements
hydroxyles (la zéaxanthine). Ainsi, la force d’interactions de ces groupements avec des
composés hydrophiles peut être évaluée. Une valeur de sélectivité zéaxanthine/bêta
carotène all-trans inférieure à 1 montre une inversion de rétention entre les deux
composés. La zéaxanthine est plus retenue que le bêta-carotène car possédant deux
groupements hydroxyle, elle interagit fortement avec les groupements polaires insérés.
Il semble donc que les interactions développées par les groupements amides soient
plus fortes (inversion de rétention) que celles mise en œuvre pas les groupements
carbamates (pas d’inversion de rétention), qui interagissent eux-mêmes plus fortement
qu’un groupement éther.
Analyses
Rappelons qu’en HPLC hydro-organique, c’est cette interaction avec l’eau qui établit
une barrière hydrophile empêchant les composés basiques d’accéder aux silanols
résiduels. La représentation hydrophobicité/accessibilité silanols (étape 2 de la
classification précédente) regroupe alors les phases en groupes distincts. Les phases
à groupements amides insérés sont positionnées en bas à gauche (groupe A), les
deux phases à carbamates insérés sont dans le groupe B, le groupe C regroupe deux
phases à end-capping hydrophile et la phase sulfonamide, et le groupe D trois phases
Polaris, dont une phase à groupement éther inséré.
Une des grandes différences entre phases à groupements polaires insérés et à
recouvrement hydrophile est la plus faible hydrophobicité des phases à groupements
polaires insérés, alors que l’hydrophobicité des phases à end-capping hydrophile ou
sulfonamide est comparable à celle des phases C18 plus classiques.
Enfin, quelques phases se distinguent encore plus de l’ensemble en possédant des
propriétés particulières parmi lesquels Uptisphere® Strategy™ RP.
B.7
B.7
z
Upti-select Kit
TM
La solution pour un développement de méthode dynamique !
Le test réalisé par E. Lesellier et A.Tchapla du LETIAM a permis d’évaluer, caractériser
et classifier plus de 160 phases stationnaires C18.
Les phases stationnaires Interchim pour l’HPLC ont été développées pour couvrir les
principales zones d’intérêt définies par ce test.
Position des technologies Interchim : Uptisphere® et Uptisphere® Strategy™ dans
le diagramme de classification
Phase stationnaire
Uptisphere HDO
Uptisphere NEC
Uptisphere ODB
Uptisphere HSC
Uptisphere TF
Uptisphere PLP
IUptisphere BioP II
Uptisphere BioP I
Uptisphere WOD
Uptisphere WRP
Strategy Pro
Strategy RP
Strategy C18-2
Strategy C18-3
Groupe
G10
G3
G4
G5
G13
G1
G4
G4
G4
G4
G3
G10
G8
G5
Analyses
N° col
20
27
51
64
116
138
155
156
157
158
159
160
161
162
B.8
Uptisphere C18-ODB (51), C18-HDO (20), C18-NEC (27), C18-HSC (64), C18-TF
(116) ont été réunies au sein de la solution Upti-select Kit™.
Upti-select Kit™ :
•
•
•
•
•
Prédit et détermine la colonne la plus optimale pour la séparation
Elimine l’incertitude quant au choix de la colonne
Etape d’optimisation atteinte plus rapidement
Améliore la gestion de projet
Réduit les coûts de développement
B.8
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Développez votre méthode HPLC en seulement 2 étapes !
Etape 1 :
L’injection sur la colonne remplie avec la phase stationnaire Uptisphere® 5µm ODB de
l’échantillon à analyser et d’un mélange propriétaire de référence (MR) permet de
déterminer :
La rétention d’un pic de référence (PR) de l’échantillon à analyser, les rétentions
des composés du mélange de référence (MR) et de calibrer le système de
calcul
Un facteur de rétention pour le pic de référence (PR) est choisi : K’PR.
Il est introduit dans la table de calcul (fournie) ainsi que les rétentions des composés
du mélange de référence (MR). Cette opération permet de déterminer pour chacune
des colonnes Uptisphere® 5 µm HDO, Uptisphere® 5 µm NEC, Uptisphere® 5 µm HSC
et Uptisphere® 5 µm TF les pourcentages de solvant organique en méthanol et
acétonitrile a fixer dans chaque phase mobile pour atteindre le facteur de rétention K’PR
choisi pour le pic de référence (PR).
Etape 2 :
Les phases mobiles sont préparées en accord avec l’étape 1.
L’échantillon a analyser est injecté sur chacune des quatre colonnes HDO, NEC, HSC
et TF. Pour vérification, on peut également re-injecter l’échantillon sur la colonne ODB.
L’analyse des chromatogrammes permet de sélectionner la colonne la plus pertinente
pour obtenir la séparation recherchée.
On peut ensuite démarrer l’étape d’optimisation.
Différents éléments constituent la solution Upti-select Kit™ :
Analyses
a) la colonne de référence remplie avec la phase stationnaire Uptisphere® 5µm ODB
b) Quatre colonnes de sélectivités "réparties"
Uptisphere® 5 µm HDO
Uptisphere® 5 µm NEC
Uptisphere® 5 µm HSC
Uptisphere® 5 µm TF
(Les cinq colonnes (a + b) sont de dimensions identiques et livrées chacune avec un
kit de connecteurs Quick seal CH953820).
La version pack inclut en plus les éléments suivants :
c) Un mélange propriétaire de référence constitué de 5 sondes permet de calibrer le
système de calcul
d) Un cd-rom contenant notamment la table de calcul au format xls
e) Une documentation conseil
Upti-select Kit™ est disponible dans différentes configurations :
Désignation
Dimensions
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
50 x 1,0 mm
50 x 2,0 mm
150 x 2,0 mm
250 x 2,0 mm
50 x 3,0 mm
150 x 3,0 mm
50 x 4,6 mm
100 x 4,6 mm
150 x 4,6 mm
250 x 4,6 mm
S64060
S57950
T07670
T80410
S64050
T77680
S57930
S64100
S57920
S57900
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Upti-select
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
Kit™
50 x 1,0 mm
50 x 2,0 mm
150 x 2,0 mm
250 x 2,0 mm
50 x 3,0 mm
150 x 3,0 mm
50 x 4,6 mm
100 x 4,6 mm
150 x 4,6 mm
250 x 4,6 mm
BB2280
BB2270
BB2260
BB2250
BB2240
BB2230
BB2210
BB2200
BB2190
BB2140
5 ml
BB2290
Pack
Pack
Pack
Pack
Pack
Pack
Pack
Pack
Pack
Pack
Mélange Propriétaire de référence
Réf.
Upti-select Kit™
Upgrade
(inclus : mélange propriétaire de référence + cd-rom + documentation)
B.9
BB2310
B.9
z
Mise en application de la méthodologie Upti-select-kit™ avec un échantillon
d’agents anti-UV
Etape 1 :
a) L’échantillon d’agents anti-UV composé des produits suivants :
A : 2-Ethylhexyl-2Cyano-3.3-Diphenylacrylate
B : 2-Ethylhexyl-3-[4-Methoxyphenyl]-2-Propenoate
C : 4-t-Butyl-4’-Methoxy-Dibenzoyl-Methane
D : 2-Ethylhexyl Salicylate
est injecté sur la colonne dite de référence Uptisphere 5 µm ODB, 250 x 4,6 mm (51)
dans les conditions suivantes : MeOH-H2O (80/20) - 1 ml/min - 25°C - UV : 238 nm
Analyses
On constate que les pics B et C sont co-élués et que le temps d’analyse est supérieur
à 60 min.
Le pic D est choisi comme pic de référence.
b) injection du mélange de référence (MR) sur la colonne de référence Uptisphere
5 µm ODB, 250 x 4,6 mm dans les mêmes conditions que précédemment.
B.10
Les temps de rétention du pic de référence D et des composés du mélange (MR) sont
insérés dans la table de calcul.
Le facteur de rétention du pic de référence D est fixé à 8.
Les valeurs des pourcentages de solvant organique en méthanol et acétonitrile a fixer
dans chaque phase mobile pour atteindre le facteur de rétention K’D choisi pour le pic
de référence D sont connues.
Etape 2 :
Les phases mobiles en méthanol et acétonitrile sont préparées en accord avec les
résultats de l’étape 1. L’échantillon à analyser est injecté sur les cinq colonnes suivant
les conditions fixées par la table de calcul pour atteindre le facteur de rétention du pic
de référence D fixé à 8.
B.10
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Chromatogrammes obtenus dans la phase mobile méthanol
Observation :
Les chromatogrammes montrent que le facteur de
rétention sur les cinq colonnes Uptisphere ® est
proche de 8.
Ce résultat valide la méthode de détermination du
log P de (PR) et les équations de transposition
théorique d’une colonne Uptisphere® à une autre.
L’ordre d’élution A, B, C, D est conservé sur les
colonnes HSC, ODB, HDO et NEC. Par contre C
et D sont inversés sur la colonne TF
Le couple B,C est mieux séparé lorsque la colonne
présente une accessibilité silanols importante.
La séparation est obtenue sur Uptisphere® NEC et
TF.
Observation :
Il y a co-élution sur ODB, HDO et NEC.
La séparation est obtenue sur Uptisphere® HSC et
TF. On note des inversion dans l’élution des pics.
Analyses
Chromatogrammes obtenus dans la phase mobile acétonitrile
B.11
Pour répondre à des contraintes de dossier, la
colonne retenue par le client sera l’Uptisphere®
5 µm TF avec une phase mobile méthanol.
La séparation sera optimisée avec un temps
d’analyse de 6,88 min pour le dernier pic et une
résolution de 3,02 pour la paire critique (B,D).
B.11
z
Test LCAP de classification des phases stationnaires
HPLC pour les composés basiques.
1. Préambule
Analyses
Le Laboratoire de Chimie Analytique
Pharmaceutique (LCAP) de la Section des
sciences pharmaceutiques de l’Université de
Genève concentre ses activités sur le
développement de méthodes séparatives. Les
techniques étudiées sont la chromatographie en
phase liquide (HPLC) et l’électrophorèse capillaire
(CE) couplées à tous les types de détection dont
la spectrométrie de masse (MS).
B.12
De nombreux aspects fondamentaux en
chromatographie en phase liquide sont étudiés au
LCAP. Ainsi, les nouvelles phases stationnaires
(supports monolithiques, particules de faibles
diamètres (sub-2 mm), etc.) permettant de résoudre
rapidement et avec de bonnes efficacités des
mélanges simples ou complexes sont
évaluées en termes de performances qualitatives
et quantitatives. L’HPLC à haute température (T >
60°C) est également développée afin d’améliorer
les performances chromatographiques, de réduire
les temps d’analyse et la consommation de
solvants organiques ("chimie verte").
Un autre aspect essentiel en HPLC concerne les
critères de choix de la phase stationnaire. Depuis
1993, le LCAP a développé et proposé des tests
chromatographiques permettant de classifier les
colonnes pour la séparation de composés
basiques. En effet, il est connu que ces derniers
sont souvent difficiles à chromatographier sur des
supports à base de silice greffée, compte tenu des
interactions d’échange d’ions pouvant avoir lieu
dans des conditions de pH conventionnel. Afin de
réduire ces interactions secondaires, de nombreux
fabricants ont proposé à partir de 1989 de nouveaux
supports chromatographiques présentant une
chimie de phase variée Les tests développés au
LCAP, avec un mélange de 7 composés basiques,
présentant des propriétés différentes et
complémentaires, permettent de déterminer
rapidement dans des conditions réelles (mélanges
hydro organique tamponnés à pH 3 et 7) le
comportement de ces supports.
Afin de mieux visualiser les performances des colonnes et de pouvoir les classer par
ordre de ressemblance, des outils chimiométriques tels que l’analyse en composantes
principales (ACP) et la classification ascendante hiérarchique (CAH) ont été utilisées.
Les résultats obtenus permettent de classer les colonnes en fonction de leur pouvoir
de rétention hydrophobe et de leur interaction résiduelle avec les composés basiques.
Les classements obtenus par ces tests sont en complète adéquation avec les tests
généraux reconnus et d’autres tests publiés dans la littérature. En travaillant dans des
conditions réelles de phase mobile et avec des composés de structure proche de
ceux couramment rencontrés dans l’industrie pharmaceutique, ce test permet de situer
plus finement l’intérêt de certaines colonnes dans l’analyse des composés basiques.
Finalement, ce test permet de déterminer les supports chromatographiques présentant
des propriétés similaires et fournissent de précieux renseignements en perspective
des transferts de méthodes analytiques.
2. Test avec des composés basiques
Différentes phases stationnaires provenant de différents fabricants ont été testées à
pH 3 et 7 avec les 7 composés tests.
Fabricant
Colonne
Chaîne
Greffage
Agilent
Agilent
CIL - Cluzeau
Dionex
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Merck
Merck
Phenomenex
Supelco
Supelco
Waters
Waters
Zorbax Extend
Eclipse XDB
Stability BS C23
Acclaim
Uptisphere ODB
Uptisphere TF
Uptisphere HDO
Uptisphere HSC
Uptisphere NEC
Nautilus
Nucleosil HD
Nucléodur
Nucleosil AB
Nucléodur Pyramid
Performance
SpeedRod
Luna
Discovery RP amide
Supelcosil ABZ+
XTerra
Symmetry Shield
C18
C18
C16
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C16
C16
C18
C18
bidentate
Haute densité
Polaire
End-capped
polyfonctionnel
End-capped
End-capped
Non- end-capped
Polaire
Haute densité
Ultra pure
Polaire end-capped
Monolithe
Monolithe
Haute densité
Polaire
Polaire
Polaire Hybride
Polaire
Les valeurs de rétention, d’efficacité et d’asymétrie ont été déterminées et les supports
ont été "classés" selon leur ressemblance à l’aide des outils chimiométriques adaptés
(ACP et CAH). L’analyse en composantes principales permet, dans un espace à 2
dimensions de visualiser les phases présentant une forte activité silanol résiduelle à
pH 7.
La classification ascendante hiérarchique permet de former des groupes de phases
stationnaires présentant les mêmes comportements chromatographiques en tenant
compte de l’information "non visible" dans la représentation simplifiée de l’ACP.
B.12
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
Code
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
CHA : classification ascendante hiérarchique
Colonne
Chaîne
Greffage
Fabricant
Zorbax
Discovery RP Amide
Nautilus
Supelcosil ABZ+
Stability BS C23
Performance
SpeedRod
Xterra
Nucleosil HD
Eclipse XDB
Luna
Nucleodur
Acclaim
Nucléosil AB
Nucléodur Pyramid
Symmetry Shield
Uptisphere ODB
Uptisphere TF
Uptisphere HDO
Uptisphere HSC
Uptisphere NEC
C18
C16
C18
C16
C16
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
c18
Bidentate
Polar
Polar
Polar
Polar
Monolith
Monolith
Polar (Hybrid)
High density
High density
High density
C18 (ultra pure)
C18
C18
C18 endcapping Hydr
Polar
C18 endcapping
C18 endcapping polyf.
C18 endcapping
C18 endcapping
C18 no endcapping
Agilent
Supelco
Macherey Nagel
Supelco
CIL-Cluzeau
Merck
Merck
Waters
Macherey Nagel
Agilent
Phenomenex
Macherey Nagel
Dionex
Macherey Nagel
Macherey Nagel
Waters
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Interchim
Propriétés hydrophobes
Activité des silanols
Analyses
B.13
B.13
z
Optimisation de méthode HPLC
Optimisation de la séparation en HPLC par couplage de
colonnes
Préambule
Le développement d’une méthode HPLC peut se décomposer en deux parties
essentielles : le choix de la phase stationnaire et l’optimisation des dimensions de la
colonne et des conditions analytiques.
La méthodologie proposée par l'Upti-Select kit se révèle une excellente réponse au
choix de la phase stationnaire.
Une fois cette étape aboutie, faut-il modifier la phase mobile, la température ou bien
jouer sur les dimensions de la colonne et les paramètres de la phase stationnaire
pour optimiser de manière la plus pertinente la séparation ?
Le concept Rodéo, en révolutionnant certaines idées préconçues, vous propose une
approche originale de l’optimisation de méthode HPLC.
Modulo-cart Quick seal 250 mm
Rodeo 5 x 50 mm
Y a t-il une différence de résultats entre une colonne de 250 mm et
5 colonnes couplées de 50 mm ?
Rodeo UP5HDO (5 x 50) x 4,6 mm
Analyses
Quick seal UP5HDO 250 x 4,6 mm
Choix de la phase stationnaire
Notre philosophie de développement pour
déterminer la phase stationnaire optimale peut
être hiérarchisée en 4 étapes :
1. Le mélange à analyser contient principalement
des composés basiques : kit de 3 colonnes
composés basiques
2. Test sur la colonne générique Uptisphere
Strategy 5 µm C18-2, 250 x 4,6 mm [ACN-H20
(70/30) et (30/70)]
B.14
ACN/H2O 85/15
1mL/min
T° : 23C
Pesticides :
DDOH,
Endosulfane,
Heptachlor,
ppDDT,
44DDMU,
op DDT, Aldrin.
Colonne
to
k’
P
As
N
Rs
250 mm
5 x 50 mm
2,35
2,4
6,88
6,8
61
63
1,17
0,99
21148
22574
8,58
8,56
Quick seal UP5TF 250 x 2,1 mm
Rodeo UP5TF (5 x 50) x 2,1 mm
ACN/H2O 70/30
0,2mL/min T° : 23C
Test interne :
Uracil, toluene,
naphtalene.
3. Mise en place de la méthodologie Upti-Select
Kit
4. Autres sélectivités
La technologie Modulo-cart Quick seal est
fabriqué sur des centrales d’usinage de dernière
génération garantissant une précision sans
équivalent.
• Efficacité supérieure d’ ~15% par rapport aux
autres systèmes
• Réelle connexion à serrage manuel (sans
insert ni bague supplémentaire)
• Le couple PEEK dopé carbone sur inox
garantit une longue durée de vie
Colonne
to
k’
P
As
N
Rs
250 mm
5 x 50 mm
2,44
2,47
1,12
1,13
92
107
1,18
1,2
15875
16200
3,7
3,9
Résultats
Les études que nous avons menées montrent que pour une même phase stationnaire
et conditions analytiques :
•
•
B.14
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
les pressions (P), efficacités (N), asymétries (As), résolutions (Rs) et facteur de
rétention (k’) sont extrêmement similaires entre un Modulo-cart Quick seal de
250 mm de longueur et 5 Modulo-cart Quick seal de 50 mm couplés entre eux.
les résultat obtenus ci dessus se vérifient pour les diamètres internes que nous
avons évalués : 4,6 mm, 4,0 mm, 3,0 mm et 2,1 mm.
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Optimisation de la résolution en fonction de la longueur
de colonnes
Dans la majorité des cas le choix de la phase stationnaire est déterminé à partir de
colonnes de longueur 250 mm et de taille de particules de 5 µm.
L’optimisation à pour but principal tout en conservant une résolution suffisante de la
paire critique de gagner en temps d’analyse, en temps de cycle de rinçage, d’avoir
une phase mobile la plus simple et compatible avec l’environnement.
Pour satisfaire à cet objectif la réduction de la longueur de la colonne d’analyse est
un des paramètres important à travailler avec bien sûr la réduction de la taille de
particules.
exemple d’une réduction du temps d’analyse tout en conservant une résolution
suffisante des pics les moins bien séparés.
Tr
As
N
Rs
DDOH
Endosulfane
Heptachlor
ppDDT
44DDMU
op DDT
Aldrin
4,87
9,11
12,32
12,91
13,55
14,85
18,74
1,08
1,01
1,01
0,99
1
0,99
0,99
23050
22608
23561
23692
24027
22455
22574
0
22,93
11,39
1,81
1,84
3,5
8,68
nom
Tr
As
N
DDOH
Endosulfane
Heptachlor
ppDDT
44DDMU
op DDT
Aldrin
3,85
7,23
9,78
10,27
10,8
11,84
14,95
1,09
1,03
1,02
1
1,02
1
1
17499
18122
17585
17624
18611
17732
17986
Analyses
nom
Rs
0
20,43
10
1,62
1,7
3,08
7,76
B.15
nom
Tr
As
N
DDOH
Endosulfane
Heptachlor
ppDDT
44DDMU
op DDT
Aldrin
2,8
5,23
7,06
7,39
7,76
8,52
10,77
1,08
1,02
1,04
1,01
1,01
1,01
0,99
12906
13392
13824
15796
13864
13345
13398
Rs
0
17,44
8,69
1,37
1,48
2,73
6,75
Dans cet exemple, en diminuant la longueur de la colonne de 40%, on a réduit le
temps d’analyse de 42,5% en conservant une résolution suffisante pour la séparation
des paires critiques.
z
B.15
Phase mobile vs Longueur de colonne : un choix évident ?
1. Système d’origine
Rodeo UP5HDO 50 x 4,6 mm – phase mobile : ACN /H2O (95/5)
Analyses
2. Evolution de la séparation après modification de la phase mobile ACN/H2O (75/25)
nom
Tr
As
N
DDOH
Endosulfane
Heptachlor
44DDMU
op DDT
Aldrin
1,29
3,06
4,58
5,19
5,79
7,33
1,07
1,04
1,04
0,94
1,01
1
4509
4929
4728
3899
4699
4764
Rs
0
14,05
6,91
2,04
1,8
4,03
3. Evolution de la séparation après modification de la longueur du Rodeo
(3 x 50) x 4,6 mm et conservation des conditions analytique d’origine ACN/H2O (95/5)
B.16
nom
Tr
As
N
DDOH
Endosulfane
Heptachlor
44DDMU
op DDT
Aldrin
1,29
3,06
4,58
5,19
5,79
7,33
1,07
1,04
1,04
0,94
1,01
1
4509
4929
4728
3899
4699
4764
Rs
0
14,05
6,91
2,04
1,8
4,03
Cette exemple met en évidence que l’augmentation de la longueur de la colonne a
conduit, comparativement au choix de l’optimisation par la phase mobile, à une
meilleure résolution pour un temps d’analyse réduit.
Cette stratégie peut s’avérer très payante notamment lorsque les conditions de phases
mobiles sont très encadrées par le dossier ou fixées strictement.
Le concept Rodeo permet en quelques
injections seulement de trouver le meilleur
compromis pour la séparation en
répondant positivement aux besoins
essentiels de l’analyste :
Gain de temps d’analyse
Gain de temps de cycle de rinçage
Phase mobile simple et compatible
environnement
B.16
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
Désignation
Dimensions
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
RODEO
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
z
Strategy 5 C18-2
Uptisphere 5 ODB
Uptisphere 5 HDO
Uptisphere 5 NEC
Uptisphere 5 HSC
Uptisphere 5 TF
Strategy 5 C18-2
Uptisphere 5 ODB
Uptisphere 5 HDO
Uptisphere 5 NEC
Uptisphere 5 HSC
Uptisphere 5 TF
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
4,6
4,6
4,6
4,6
4,6
4,6
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
z
Réf.
mm
mm
mm
mm
mm
mm
mm
mm
mm
mm
mm
mm
US1740
BZ9130
BZ9150
BZ9170
BZ9210
BZ9190
US1750
BZ9140
BZ9160
BZ9180
BZ9220
BZ9200
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Optimisation des paramètres d’une analyse HPLC
Une fois le choix de la phase stationnaire, et donc de la colonne HPLC, effectué, il est
nécessaire de jouer avec les paramètres de la phase mobile, le pH et la température
pour développer une méthode analytique optimisée et robuste.
Au préalable il faut bien sûr s’assurer que l’ensemble du système HPLC a été validé
pour le type d’application que l’on souhaite réaliser. De façon simple, il faut notamment
faire la chasse aux volumes morts liés aux tubulures, connexions, vérifier le volume de
la cellule de détection, le volume de la boucle d’injection et adapter les temps de
réponse du détecteur.
Lors de la présentation de la méthodologie Upti-select kit™ nous avons discuté le cas
de la séparation d’agents anti-UV. La colonne HPLC retenue était une Uptisphere® TF.
Le temps de rétention du dernier pic était de 24 min et une résolution de 1,35 pour la
paire critique (B,D).
Analyses
Comment est on passé de cette séparation à
celle optimisée avec un temps d’analyse de
6,88 min pour le dernier pic C et une résolution
de 3,02 pour la paire critique (B,D) ?
Variation du pourcentage de méthanol dans la phase mobile
B.17
Variation de la température
B.17
z
Osiris,
Logiciel d’optimisation des conditions d’analyse HPLC
Osiris est un logiciel destiné à l’optimisation des conditions d’analyses en
chromatographie liquide. Il permet de sélectionner le mode d’élution isocratique ou
gradient puis d’optimiser les conditions d’élution (composition de la phase mobile,
température, pH) et ainsi de créer de nouvelles méthodes HPLC robustes à partir de
quelques analyses préliminaires.
La version 4.0 du logiciel offre une toute nouvelle interface très conviviale avec notamment
un assistant capable de guider pas à pas l’utilisateur au cours du processus
d’optimisation.
Expérimenter
Osiris est capable d’effectuer différents types d’optimisation :

Composition de la phase mobile (isocratique, binaire, ternaire ou quaternaire,
gradient linéaire et multilinéaires), pH ou température.
Optimisation multidimensionnelle : composition isocratique (binaire ou ternaire) /
température, composition isocratique binaire/pH, gradient/température, gradient/
pH
Optimiser
Analyses
Osiris améliore les performances de vos méthodes existantes en prenant en compte
des critères fondamentaux. Vous pouvez fixer vos propres critères d’exigences en
terme de qualité de séparation (résolution), de temps d’analyse et/ou de robustesse
sur les conditions d’analyse.
De plus Osiris vous offre la possibilité de réaliser des optimisations ciblées sur certains
solutés du mélange à séparer.
Valider
Osiris est un outil précieux pour la validation et le transfert de vos méthodes HPLC car
il tient compte de la robustesse des conditions d’analyse et du volume de délais de
votre système chromatographique. Vous pourrez aussi étudier l’effet du changement
des propriétés physiques de la colonne. Grâce à sa table des simulations, Osiris
enregistre et compare les chromatogrammes obtenus pour différentes conditions.
B.18
Désignation
Réf
Logiciel d’optimisation HPLC, OSIRIS
CC9260
B.18
Tel 33 (0)4 70 03 88 55
z
Hot line 33 (0)4 70 03 73 09
z
Fax 33 (0)4 70 03 82 60
Développement et validation de méthode HPLC
Autres kits Uptisphere®
Développement de méthodes HPLC
Construisez vous même votre propre kit.
Ce kit est constitué de trois colonnes HPLC dont la granulométrie des phases
stationnaires et les dimensions (longueur et diamètre interne) sont définies par la
référence. Il vous reste à choisir parmi l’ensemble des phases stationnaires Uptisphere
et Uptisphere Strategy les trois sélectivités qui vous conviennent.
(à préciser sur votre bon de commande)
Désignation
Kit
Kit
Kit
Kit
Kit
Kit
développement
développement
développement
développement
développement
développement
Dimension
méthode
méthode
méthode
méthode
méthode
méthode
3
5
3
5
3
5
µm
µm
µm
µm
µm
µm
150
250
150
250
150
250
x
x
x
x
x
x
4,6
4,6
3,0
3,0
2,0
2,0
Réf.
mm
mm
mm
mm
mm
mm
DEV031546
DEV052546
DEV031530
DEV052530
DEV031520
DEV052520
Validation de méthodes HPLC
Construisez vous même votre propre kit.
Ce kit est constitué de trois colonnes HPLC de même dimensions remplies avec la
phase stationnaire Uptisphere ou Uptisphere Strategy que vous aurez choisi (à préciser
sur votre bon de commande). Chaque colonne est fabriquée avec un lot de phase
différent.
Kit validation méthode
Kit validation méthode
Dimension
3 µm
5 µm
Réf.
150 x 4,6 mm
250 x 4,6 mm
VAL031546
VAL052546
Analyses
Désignation
Transposition de méthode analytique à préparative
Ce kit est constitué de la colonne préparative que vous souhaitez et d’une colonne
analytique de même longueur et de diamètre interne 4,6 mm remplie avec le même lot
de phase que votre colonne préparative.
Ce kit est créé sur demande, contactez nous :
04 70 03 73 09 ou [email protected]
B.19
B.19
z