i. materiel

MATERIEL ET METHODES
99
100
I. MATERIEL
1.1. Réactifs
Tous les réactifs utilisés étaient purs pour analyse et provenaient de Sigma, sauf
spécifié dans le texte. Les solvants étaient d'une grande pureté (pour l'analyse des résidus de
pesticides) et ont été fournis par Merck (Allemagne). Le 14C-[U]-galactose (292 mCi/mmol) a
été acheté chez Nen Life Science, tandis que le CMP-[14C]-acide N-acétyl neuraminique (287
mCi/mmol) provenait de Amersham Pharmacia Biotech. Les standards de gangliosides et de
glycosphingolipides neutres ont été fournis par Matreya. Un extrait de gangliosides de
mélanomes humains a également servi comme standard et a gracieusement été donné par J.
Portoukalian (Faculté de Médecine Lyon Sud, France). Le GM3 et le CMH utilisés pour les
dosages enzymatiques provenaient de Sigma.
Les colonnes de Sephadex G-25 M (PD-10 columns) utilisées pour filtrer les AGEs
étaient de Amersham Pharmacia Biotech, ainsi que les films pour autoradiographie
(Hyperfilms MP) et le flash utilisé pour "pré-flasher" les films. Les solutions de révélation et
de fixation des films provenaient de Kodak. Les plaques HPTLC de gel de silice 60 ont été
fournies par Merck. Les colonnes de silice C18 (Sep-Pak Cartridges Classic) ont été achetées
chez Waters S.A. Les membranes de nitrocellulose utilisées pour le dosage des protéines
étaient de Polylabo.
1.2. Appareils
Le déposeur automatique pour la chromatographie sur couche mince haute performance
(Automatic TLC Sampler III), ainsi que la cuve horizontale utilisée pour les migrations
(Horizontal Developing Chamber 2) ont été fournis par Camag (Suisse).
Le chromatographe en phase gazeuse utilisé pour l'analyse des acides gras (type 6890)
provenait de Hewlett-Packard. La colonne utilisée était une colonne HP-1MS de Interchim.
Ses dimensions étaient de 30 m par 0,25 mm; l'épaisseur de la phase stationnaire était de 0,25
µm. Le spectromètre de masse (type 5973) était un appareil provenant de Agilent
Technologies.
Le chromatographe en phase liquide utilisé pour l'analyse des gangliosides provenait de
Hewlett Packard (série 1100). Il était équipé d'un injecteur manuel, d'une pompe quaternaire,
d'un dégazeur à vide, d'une enceinte à colonne thermostatée et d'un détecteur à barrette de
101
diodes. La colonne était une colonne Hibar RT 250-4, LiChrosorb-NH2 5 µM (Merck,
Allemagne).
L'appareil utilisé pour la PCR quantitative était un Light Cycler de Roche-Diagnostic.
Le scanner utilisé pour l'analyse des autoradiogrammes et des plaques d'HPTLC était le
modèle "GS-700 Imaging Densitometer" de Bio-Rad. Le spectrophotomètre pour le dosage
des protéines était un lecteur de plaques 96 puits iEMS Reader MF de Labsystems. Pour les
mesures de fluorescence (cuves, plaques de 96 puits ou plaques d'HPTLC), un fluorimètre LS
50B (Perkin Elmer) a été utilisé.
II. ANIMAUX
Des rats Wistar mâles blancs de 180-200g ont été fournis par la société IFFA-CREDO.
Ils ont été placés dans une animalerie avec contrôle de l’éclairage (cycle jour/nuit : 12h/12h),
de la température (20-25°C) et de l’hygrométrie (35%). Ils ont reçu un régime constitué de
granulés A04(UAR, France) et d’eau "ab libitum".
Les rétines de mini-porcs, normaux et diabétiques, ont été fournies par LIPHA (ChillyMazarin, France).
2.1. Induction du diabète chez les rats
Un diabète a été induit chez les rats par une injection de streptozotocine, qui détruit les
cellules β du pancréas.
Les rats, à jeun depuis la veille, ont été anesthésiés dans une enceinte close, par un
mélange gazeux O2/isoflurane. Ils ont reçu par injection dans une veine du pénis, une dose de
60 mg/kg de streptozotocine préparée extemporanément dans du tampon citrate 10 mM pH
4,5. Les rats contrôle, de poids semblable, ont reçu une injection de tampon citrate
uniquement. L'état diabétique résultant a été contrôlé au bout de 4 mois par pesée des rats et
mesure de la glycémie.
102
2.2. Sacrifice des animaux et prélèvement des rétines
Les rats, normaux ou rendus diabétiques, ont été endormis au CO2, pesés, puis rapidement
décapités. Un échantillon sanguin a été recueilli pour le dosage de la glycémie.
Les yeux des rats ont été énucléés puis disséqués sur glace pour récupérer la rétine: après
élimination de la cornée, du cristallin et de l'humeur vitrée, la rétine a été décollée du globe
oculaire, coupée au niveau du nerf optique, et placée dans du tampon phosphate (PBS) froid.
Les rétines ont été utilisées immédiatement ou conservées dans l'azote liquide dans un
mélange DMEM, 10% diméthylsulfoxyde.
2.3. Purification des microvaisseaux des rétines
Les microvaisseaux des rétines de rats ou de mini-porcs ont été purifiés selon la technique
initialement décrite par Cuthbertson and Mandel (1986) avec quelques modifications. Cette
technique est basée sur la différence de sensibilité au choc osmotique entre les cellules
microvasculaires et les cellules gliales et neuronales.
Mode opératoire
Les rétines ont été placées dans un grand volume d'eau distillée (1 litre) pendant 1 heure à
4°C afin de lyser les cellules neuronales et gliales. Les rétines, d'aspect cotonneux, ont ensuite
été transférées dans une petite boîte de Pétri en verre, contenant 5 ml d'eau et 200µl de DNase
I à 40,000 U/ml. Elles ont alors été délicatement aspirées et reposées dans la boite plusieurs
fois à l'aide d'une pipette pasteur au bout rodé, jusqu'à ce que l'arbre vasculaire apparaisse,
débarrassé de tout autre tissu. Les microvaisseaux ont été rincés plusieurs fois dans des bains
d'eau distillée et la pureté de la préparation a été vérifiée sous microscope.
III. CULTURES CELLULAIRES
3.1. Culture des pericytes rétiniens de bœuf (BRP)
Des yeux de bœuf, fraîchement énucléés, ont été obtenus auprès des abattoirs Cibevial
(Corbas, France) et transportés jusqu’au laboratoire sur de la glace. Les yeux étaient tout
d’abord nettoyés de tout tissu attenant et placés dans du tampon PBS à 4°C. Toutes les
103
manipulations ultérieures ont été effectuées à 4°C et de manière stérile, sous une hotte à flux
laminaire.
Les yeux étaient rapidement plongés dans une solution d’éthanol à 70°C puis rincés dans
du tampon HBSS sans Mg2+ ni Ca2+. Ils étaient ensuite découpés 5 mm postérieur à la cornée.
Le cristallin et l’humeur vitrée étaient évacués à l’aide d’une pince fine. La rétine était
délicatement décollée du globe oculaire, coupée au niveau du nerf optique et placée dans une
boite de Pétri contenant 10 ml de milieu HBSS. Ce milieu, préparé à partir de HBSS sans
Mg2+ ni Ca2+, contenant 10 mM d’HEPES, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de
streptomycine, était oxygéné pendant 10 minutes par un mélange O2/CO2 (95/5, v/v), avant de
recevoir de la BSA à une concentration finale de 0,5 %. Le pH du milieu était ensuite ramené
à 7,4 à l’aide de quelques gouttes de NaOH, en suivant le changement de couleur de la
phénolphtaléine présente dans l'HBSS.
Les rétines étaient ensuite débarrassées d’éventuelles cellules pigmentaires contaminantes
et placées par lot de deux dans 10 ml de milieu HBSS propre. Elles étaient découpées à l’aide
de ciseaux en fragments d’environ 2 mm, homogénéisées (Dounce 15 ml, piston A, 7 allerretours) et centrifugées (5 min., 300g). Le culot était repris par 5 ml d’une solution
enzymatique de collagénase-dispase. Cette solution, préparée dans du tampon HBSS sans
Mg2+ ni Ca2+, contenait 1 mg/ml de collagénase-dispase (Boehringer-Mannheim), 10 mM
d’HEPES, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Après 10 minutes
d’oxygénation, le pH était ajusté à 7,4 avant addition de TLCK (147 ng/ml) et de DNase (200
U/ml). La digestion enzymatique s’effectuait à 37°C pendant 20 minutes avec agitation douce.
Les homogénats de rétines étaient resuspendus à la main toutes les 10 minutes.
La suspension était ensuite filtrée sur un filtre de porosité 40 µm. Les fragments de
microvaisseaux retenus sur le filtre étaient récupérés dans 10 ml de milieu HBSS puis
centrifugés (5 min., 300 g). Le culot était repris dans 3 ml de DMEM contenant 10 % de SVF
(Gibco), 2 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Les
fragments de microvaisseaux étaient ensemencés dans une boite de Pétri (6 cm de diamètre)
recouverte d’un film de fibronectine (4 µg/cm2). Les boites de pétri étaient placées à 37°C
dans un incubateur à atmosphère humide contrôlée contenant 5% de CO2. Après 4 heures
d’incubation, le milieu et les débris de microvaisseaux n’ayant pas adhéré à la matrice étaient
éliminés et 3 ml de milieu de culture propre étaient ajoutés. Pour les pericytes, ce milieu était
104
constitué de DMEM contenant 10 % de SVF, 2 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline et
100 µg/ml de streptomycine. Les cellules étaient cultivées dans l’incubateur jusqu’à
confluence, le milieu de culture étant remplacé toutes les 48 heures.
A confluence, le milieu de culture était éliminé et les boites rincées par 2 fois 3 ml de PBS.
Les cellules étaient alors trypsinées pendant environ 5 minutes à 37°C par 1 ml d’une solution
de trypsine à 0,5% contenant 0,2% d’EDTA. Quand les cellules commençaient à se décoller,
la trypsination était arrêtée par 2 ml de PBS contenant 10% de SVF. Les cellules étaient alors
récupérées pour être centrifugées (3 min., 300g). Elles étaient ensuite réensemencées dans un
rapport 1/3 dans des boites recouvertes de fibronectine (4 µg /cm2) et cultivées dans le même
milieu (DMEM/10% SVF) supplémenté avec 10 µM de DHA. Cette supplémentation en
DHA, dans un rapport moléculaire DHA/albumine de 1/10, permettait de restaurer la
composition en acides gras observée dans les microvaisseaux natifs (Lecomte et al., 1996).
3.2. Culture de cellules endothéliales rétiniennes de bœuf (BREC)
Les cellules endothéliales étaient obtenues à partir des microvaisseaux de rétine de bœuf de
la même manière que les pericytes, avec quelques modifications. La digestion enzymatique
par la collagénase/dispase s’effectuait pendant 40 minutes. La suspension était ensuite filtrée
sur des filtres de porosité 70 µm et les fragments de microvaisseaux étaient ensemencés dans
des boites recouvertes d’un film de fibronectine (4 µg/cm2) et de collagène IV (2 µg/cm2). Le
milieu de culture était constitué par du DMEM contenant 15% de sérum humain, 80 µg/ml
d’héparine, 2 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine.
A confluence, les cellules étaient trypsinées à température ambiante par 1 ml d’une
solution de trypsine à 0,05% contenant 0,02% d’EDTA. Lorsque les cellules s’arrondissaient
(1 à 2 minutes), la trypsination était arrêtée par 2 ml de PBS contenant 15% de sérum humain.
Les cellules étaient décollées par des aller-retours avec la pipette, centrifugées, reprises dans 3
ml de milieu de culture (DMEM/15% sérum humain) contenant 10 µM de DHA, et
réensemencées dans un rapport 1/3 dans des boites recouvertes de gélatine.
105
3.3. Modification des conditions de culture
3.3.1. Incubation avec différents agents
3.3.1.1. Incubation avec des AGEs
Les cellules ont été incubées, pendant le premier et le deuxième passage, avec du milieu de
culture contenant soit 3 µM (concentration finale) d’AGEs méthylglyoxal (milieu AGE), soit
3 µM de "BSA contrôle" (milieu BSA).
Préparation des AGEs methylglyoxal:
Les AGEs méthylglyoxal ont été préparés comme décrit par Westwood et al. (1994) avec
quelques modifications.
Les AGEs méthylglyoxal fortement modifiés ("high") ont été réalisés en incubant de la
BSA à la concentration de 7,2 mg/ml (environ 100 µM) avec 100 mM de méthylglyoxal
pendant 50 h à 37°C. Une solution de BSA à la concentration de 7,2 mg/ml, incubée dans les
mêmes conditions mais sans méthylglyoxal, a été utilisée comme contrôle.
Les AGEs méthylglyoxal faiblement modifiés ("low") ont été préparés en incubant de la
BSA à la concentration de 6,6 mg/ml (environ 100 µM) avec 1 mM de méthylglyoxal pendant
quatre jours à 37°C. Une solution de BSA à la concentration de 6,6 mg/ml, incubée dans les
mêmes conditions mais sans méthylglyoxal, a été utilisée comme contrôle.
Afin d’éliminer le méthylglyoxal n’ayant pas réagi, les solutions d'AGEs et de "BSA
contrôle" ont ensuite été filtrées sur colonnes de Sephadex G-25 M (colonnes PD10,
Amersham Pharmacia Biotech) et éluées par du DMEM selon les indications du fabricant.
3.3.1.2. Incubation avec une forte concentration de glucose
Les cellules ont été incubées pendant le premier et le deuxième passage, avec trois milieux
de culture différents: un milieu de culture contenant 5 mM de glucose (milieu témoin), un
milieu de culture contenant 25 mM de glucose total (milieu glucose), et un milieu de culture
contenant 20 mM de mannitol + 5 mM de glucose (milieu mannitol) (contrôle
hyperosmotique).
106
3.3.1.3. Incubation avec différents antioxydants
Les cellules ont été incubées avec 3 µM d'AGEs ou de "BSA-contrôle" en même temps
que différents antioxydants, pendant le premier et le deuxième passage. Les solutions mères
de 5 mM de N-acétyl-L-cystéine (dans le DMEM), de 20 mM d'acide DL-6,8-thioctique
(acide lipoïque) (dans l'éthanol) et de 10 mM d'ebselen (dans l'éthanol) ont été préparées
extemporanément. Le milieu de culture avec les différents agents a été remplacé toutes les 48
heures.
3.3.1.4. Incubation avec du peroxyde d'hydrogène
Les cellules ont été incubées pendant deux passages avec, soit un milieu de culture
contenant de 5 à 500 µM de peroxyde d'hydrogène (milieu H2O2), soit un milieu de culture
sans peroxyde d’hydrogène (milieu témoin). La solution mère de 8,8 mM de peroxyde
d'hydrogène a été préparée extemporanément dans du DMEM. Les milieux de culture ont été
renouvelés toutes les 48 heures
3.3.2. Cinétique des effets des AGEs
Afin d'étudier la cinétique des effets des AGEs, ceux-ci ont été ajoutés dans le milieu à
différents moments de la culture cellulaire. Un premier groupe de cellules a reçu les AGEs à
partir du premier passage et a ainsi été en contact 15 jours avec les AGEs. Un deuxième
groupe de cellules n’a reçu les AGEs qu’à partir du deuxième passage et a ainsi été en contact
7 jours avec les AGEs. Enfin, trois autres groupes de cellules ont reçu les AGEs
respectivement trois jours, deux jours et un jour avant leur récupération. Le schéma suivant
résume le mode opératoire utilisé:
15 j.
7 j.
3 j. 2 j. 1 j.
Durée d’incubation
avec les AGEs
Ajout des AGEs
0
Mise en culture
1
Passage en P1
2
3
4
5
6
7
8
9
Passage en P2
10 11 12 13 14 15
Nb de jours de
culture cellulaire
Récupération
des cellules
107
3.3.3. Effets de l'état de confluence des cellules
Afin d'étudier l'effet de l'état de confluence des cellules sur le profil des gangliosides,
quatre groupes de cellules identiques au départ ont été trypsinées, puis récupérées à différents
moments de leur croissance. Les cellules du groupe 1 (voir tableau) sont restées 6 jours au
premier passage, jusqu'à confluence totale, puis 7 jours au deuxième passage, jusqu'à
confluence totale également. Les cellules des groupes 2, 3 et 4 ne sont restées que 3 jours au
premier passage, jusqu'à une confluence d'environ 70%, puis respectivement 3, 7 et 10 jours
au deuxième passage, jusqu'à des états de confluence croissants.
Groupe n°
1
2
3
4
Nombre de jours en P1
6 jours
3 jours
3 jours
3 jours
Nombre de jours en P2
7 jours
3 jours
7 jours
10 jours
3.3.4. Sevrage des cellules
Afin d'étudier l'effet d'une baisse de prolifération sur le profil des glycosphingolipides, une
technique de sevrage des pericytes en SVF a été utilisée. Les pericytes ont été cultivés
pendant le premier et le deuxième passage avec deux milieux de culture différents: un milieu
standard ou milieu témoin, et un milieu standard sans SVF ou milieu de sevrage.
IV. ANALYSE DES GLYCOSPHINGOLIPIDES
4.1. Marquage métabolique des glycosphingolipides des cellules
microvasculaires
Le marquage métabolique des glycosphingolipides des cellules a été effectué avec du
galactose marqué au
14
C. En effet, tous les glycosphingolipides synthétisés à partir du
lactosylcéramide contiennent au moins un résidu galactose. De plus, le galactose subit dans la
cellule une interconversion rapide en glucose, de sorte que les résidus glucose des
glycosphingolipides sont également marqués. Ce marquage, à la différence d’un marquage
spécifique des acides sialiques par la N-acétyl-galactosamine par exemple, permet de
108
visualiser tous les glycosphingolipides, que ce soient les glycosphingolipides neutres ou les
gangliosides.
Mode opératoire
Une fois les cellules à confluence, du 14C-[U]-galactose (292 mCi/mmol) était ajouté dans
le milieu de culture à une concentration finale de 0,5 µCi/ml pendant 16 heures.
4.2. Extraction et séparation des différentes classes lipidiques
4.2.1. Pour les cellules microvasculaires et les microvaisseaux
Seize heures après l'ajout de
14
C-[U]-galactose, les cellules étaient récupérées par
trypsination, rincées avec du PBS et reprises dans 2 ml de chloroforme : méthanol (1:1, v/v).
De même, les microvaisseaux purifiés à partir des rétines étaient homogénéisés dans du PBS à
l'aide d'un Potter de 1 ml (verre/téflon), centrifugés afin d'éliminer le PBS et repris dans 2 ml
de chloroforme : méthanol (1:1, v/v). L'extraction et la séparation des différentes classes
lipidiques ont été réalisées suivant la méthode de Bouchon et al. (1990) avec modifications.
Les tubes étaient vigoureusement vortexés et l'extraction poursuivie pendant une nuit à 4°C.
Ils étaient alors centrifugés (1000 g, 5min.) et le culot était ré-extrait deux fois par 1 ml de
chloroforme : méthanol (1:1, v/v), puis repris dans du SDS 10% pour le dosage ultérieur des
protéines.
Les phases organiques étaient rassemblées et évaporées à sec sous un flux d'azote. Le
résidu était repris dans 3 ml de chloroforme : méthanol (1:1, v/v), auxquels était ajouté 1 ml
de PBS 1 mM (mélange final: chloroforme : méthanol : PBS 1mM (10:10:7, v/v/v)). Les
tubes étaient vortexés et les phases séparées par centrifugation (500 g, 5min.). La phase
inférieure était ré-extraite deux fois par 2 ml de méthanol : PBS 1 mM (1:1, v/v).
Les trois phases supérieures, contenant les gangliosides, étaient rassemblées et évaporées
sous flux d'azote jusqu'à un volume de 2 ml. Du PBS concentré était ajouté afin d'obtenir une
concentration finale de PBS de 10 mM. Les gangliosides étaient alors déposés sur une
colonne de silice C18, équilibrée dans du méthanol et rincée avec un mélange méthanol : PBS
10 mM (1:1, v/v). Tous les composants polaires, tels que les sels, les sucres, etc, étaient
éliminés par 15 ml d'eau. Les gangliosides étaient ensuite élués par 6ml de méthanol et 4 ml
de chloroforme : méthanol (2:1, v/v).
109
La phase inférieure, contenant les autres classes lipidiques, dont les glycosphingolipides
neutres, était neutres, était évaporée à sec et reprise dans du chloroforme : méthanol (2:1,
v/v).
Culture des cellules pendant deux passages avec différents agents
A confluence, marquage des cellules au 14C-galactose
(0,5 µCi/ml) pendant 16 heures
Récupération des cellules partrypsination
Extraction lipidique au chloroforme : méthanol (1:1, v/v)
Séparation des différentes classes lipidiques par partition dans un
mélange chloroforme : méthanol :PBS 1 mM (10:10:7, v/v/v)
Phase inférieure
(contient les lipides neutres, les
phospholipides et les glycosphingolipides
neutres)
Phase supérieure
(contient les gangliosides)
Purification sur colonne de silice C18
Dépôt sur HPTLC
Migration dans un mélange
chloroforme : méthanol : eau
(65:25:4 ,v/v/v)
Révélation par autoradiographie
ou par colorimétrie
(orcinol/H2SO4)
Dépôt sur HPTLC
Migration dans un mélange
chloroforme : méthanol : CaCl2
0,2 % (55:45:10 ,v/v/v)
Révélation par autoradiographie ou
par colorimétrie
(résorcinol/HCl)
Figure 34: Schéma d'extraction, de séparation et d'analyse des glycosphingolipides des
cellules microvasculaires.
110
4.2.2. Pour les rétines
Les rétines constituaient un matériel de départ plus abondant et donc plus "sale" que les
cellules. Une autre méthode d’isolation des glycosphingolipides a été utilisée, moins rapide
mais permettant une meilleure purification. De plus, cette méthode (Dreyfus et al., 1997) a
déjà été utilisée pour la purification des glycosphingolipides de rétines.
Les rétines étaient rassemblées par groupe de quatre et reprises dans 500 µl d'eau distillée.
Elles étaient ensuite homogénéisées au Potter de 1 ml (verre/téflon) jusqu'à dispersion
complète. Un volume de 75 µl était prélevé pour le dosage ultérieur des protéines. A
l'homogénat, étaient ajoutés 75 µl d'eau, 2,5 ml de méthanol et 2,5 ml de chloroforme. Après
vortex des tubes, l'extraction lipidique était poursuivie pendant une nuit à 4°C. Trois
extractions successives étaient ensuite effectuées sur le culot obtenu après centrifugation
(1000 g, 5min.), avec les mélanges de solvants suivants: 3 ml de chloroforme : méthanol : eau
(5:5:1, v/v/v), 3 ml de chloroforme : méthanol (1:2, v/v) et 3 ml de chloroforme : méthanol :
eau (48:35 10, v/v/v).
Les quatre extraits lipidiques étaient combinés et la phase organique résultante était
évaporée sous flux d'azote. Le résidu était repris dans 500 µl de chloroforme. La séparation
des différentes classes était effectuée par chromatographie sur une colonne de gel de silice 60
(diamètre 0,6 cm, hauteur 2,5 cm) équilibrée dans du chloroforme. Les différentes classes
lipidiques étaient éluées successivement de la colonne avec différents mélanges de solvants:
-
lipides neutres: 12 ml de chloroforme
-
phospholipides, sphingolipides et glycosphingolipides neutres: 1,5 ml de
chloroforme : méthanol : acétone: acide acétique : eau (52:8:8:18:4, par volume) puis 8
ml de chloroforme : méthanol (4:1, v/v)
-
gangliosides: 2,5 ml de chloroforme : méthanol (2:3, v/v), 2,5 ml de chloroforme :
méthanol : eau (65:25:4, v/v/v), 2,5 ml de chloroforme : méthanol : eau (60:35:8,
v/v/v), 2,5 ml de chloroforme : méthanol : eau (48:35:10, v/v/v).
La fraction contenant les glycosphingolipides neutres et les phospholipides était évaporée à
sec sous flux d'azote et lavée de la manière suivante:
-
ajout de 0,8 ml d'eau + 2 ml de méthanol + 1 ml de chloroforme. Vortex et attente 1
heure à température ambiante;
111
-
addition de 1 ml de chloroforme + 1ml de KCl 0,88% dans l'eau pour séparer les
phases. La phase supérieure était éliminée après centrifugation (1000g, 10 min.);
-
lavage de la phase inférieure trois fois avec 1 ml de la phase supérieure de Folch:
chloroforme: méthanol : KCl 0,88% (3:48:47, v/v/v).
La phase supérieure était ensuite soumise à une méthanolyse alcaline afin d'éliminer les
phospholipides. Après évaporation du solvant, l'échantillon était incubé avec 0,6 ml de KOH
(0,3 M dans méthanol) pendant une heure à 37°C. La solution était ensuite neutralisée par
quelques gouttes d'HCl 3 N en utilisant la phénolphtaléine (1 mg/ml) comme indicateur
coloré, et 1,5 ml de chloroforme + 0,5 ml de KCl 0,88% étaient ajoutés. La phase supérieure
était éliminée après centrifugation (1000g, 10 min.) et la phase inférieure lavée trois fois avec
1 ml de la phase supérieure de Folch.
Pour éliminer les esters méthyliques d'acides gras résultant de la méthanolyse alcaline des
phospholipides, une chromatographie sur colonne de gel de silice 60 était de nouveau
effectuée (diamètre 0,6 cm, hauteur 2,5 cm). Les esters méthyliques d'acides gras étaient élués
par 12 ml de chloroforme. Les sphingolipides et glycosphingolipides neutres étaient récupérés
après élution de la colonne par: 1,5 ml de chloroforme : méthanol : acétone : acide acétique :
eau (52:8:8:18:4, par volume), 4 ml de chloroforme : méthanol (4:1, v/v) et 4 ml de
chloroforme : méthanol (2:3, v/v). La fraction récupérée était ensuite évaporée à sec et lavée
une nouvelle fois comme indiquée ci-dessus.
4.3. Analyse par chromatographie sur couche mince haute performance
(HPTLC)
4.3.1. Migration
Les échantillons étaient repris dans 50 µl de chloroforme : méthanol (2:1, v/v) et déposés
sur des plaques d'HPTLC (gel de silice 60, épaisseur 0,2 mm, dimensions 10 x 10 cm, support
plaque en verre) à l'aide d'un déposeur automatique. Des standards de gangliosides ou de
glycosphingolipides neutres étaient également déposés à coté des échantillons. Les migrations
s'effectuaient ensuite dans une cuve horizontale.
Pour les gangliosides, la migration s'effectuait dans du chloroforme : méthanol: CaCl2
0,2% (55:45:10, v/v/v). Pour séparer les différents glycosphingolipides neutres, un mélange
chloroforme : méthanol : eau (65:25:4, v/v/v) était utilisé.
112
4.3.2. Révélation
4.3.2.1. Autoradiographie
Les glycosphingolipides marqués au 14C étaient révélés par autoradiographie. Les plaques
d'HPTLC étaient placées en contact avec un film autoradiographique, auparavant "pré-flashé"
afin que l'impression du film par les photons soit proportionnelle à la radioactivité émise. Le
film était placé à -70°C pendant 6 jours pour les gangliosides et 3 jours pour les
glycosphingolipides neutres. Il était ensuite révélé et fixé en chambre noire, avant d'être rincé
et séché.
4.3.2.2.Révélation colorimétrique
Les glycosphingolipides, marqués ou non, peuvent être également révélés par colorimétrie.
Le résorcinol, en présence de Cu2+, possède en effet la particularité de colorer spécifiquement
les acides sialiques en bleu-violet, tandis que les autres sucres sont coloré en brun
(SvennerholmL, 1957). L’orcinol, quant à lui, colore tous les sucres en brun, et l’azure A
colore les composés sulfatés en bleu foncé.
Mode opératoire :
Les gangliosides étaient colorés par vaporisation de la plaque d'HPTLC avec un mélange
résorcinol/HCl/Cu2+ (10 ml de résorcinol à 1,5% (w/v dans de l'eau), 0,15 ml de sulfate de
cuivre, 15 ml d'acide chlorhydrique concentré et 25 ml d'eau) (Schnaar and Needham, 1994).
Celle-ci était ensuite couverte par une plaque en verre et chauffée à 125°C pendant 20
minutes. Les gangliosides, ainsi que tous les composés contenant au moins un acide sialique,
apparaissaient en bleu-violet sur fond blanc.
Les glycosphingolipides neutres étaient révélés par une vaporisation avec un mélange
orcinol/H2SO4 (0,5g d'orcinol dans 100 ml d'acide sulfurique 3 M + 100 ml d'éthanol), avant
d'être chauffés à 125°C pendant 5 minutes (Schnaar and Needham, 1994). Les
glycosphingolipides neutres, ainsi que tous les composés comportant au moins un sucre,
apparaissaient en brun sur fond blanc.
Enfin, les glycolipides sulfatés ont été révélés par vaporisation de la plaque d’HPTLC avec
une solution d’azure A à 2% (w/v) dans de l’acide sulfurique 1 mM, jusqu’à ce que la plaque
apparaisse uniformément sombre. Celle-ci a ensuite été immergée dans un mélange acide
113
sulfurique 40 mM/méthanol (3 :1, v/v) et laissée pendant environ 1 heure sous agitation
jusqu’à ce que le fond soit décoloré. Les glycolipides sulfatés sont alors apparu en bleu foncé
sur un fond bleu pâle.
4.3.2.3. Révélation fluorimétrique
Cette méthode utilise la propriété du 5-hydroxy-1-tétralone (HOT) de fluorescer en
présence de résidus glucose ou galactose, présents dans tous les glycosphingolipides.
Mode opératoire :
Les glycosphingolipides présents sur la plaque d'HPTLC ont été détectés par vaporisation
d'une solution de 5-hydroxy-1-tétralone (HOT) 0,1% dans de l'acide sulfurique à 80%
(Watanabe and Mizuta, 1995). La plaque a ensuite été chauffée à 120°C pendant 10 min.
L'intensité de fluorescence des bandes a été mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de
470 nm et une longueur d'onde d'émission de 530 nm.
4.3.2.4. Révélation immunologique
La révélation immunologique de tous les glycosphingolipides peut également s'effectuer à
l'aide du kit "DIG glycan detection" de Roche Diagnostic (Kniep and Muhlradt, 1990). Le
principe de cette révélation repose sur l'oxydation en aldéhydes des groupements hydroxyls
adjacents des carbohydrates des glycosphingolipides par un traitement au periodate. La
digoxigénine est ensuite liée de manière covalente à ces groupements aldéhydes et est
détectée à l'aide d'un anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline.
Mode opératoire
Une fois les glycosphingolipides séparés, la plaque d'HPTLC a été fixée par une deuxième
migration dans une solution de polyisobutylméthacrylate (7,5 g dans 200 ml d'hexane;
utilisation du surnageant après décantation). Après séchage, la plaque a été incubée pendant
10 min. à température ambiante dans un tampon A (acétate de sodium 100 mM, pH 5,5), puis
pendant 30 min. à 30°C dans le noir dans une solution de periodate de sodium (10 mM dans le
tampon A). Après quatre lavages de 5 min. dans le tampon A, la plaque a été incubée avec
une solution de digoxigénine-hydrazide (digoxigenin-3-O-succinyl-ε-aminocaproic acid
hydrazide) pendant 30 min. à température ambiante, puis lavée quatre fois dans un tampon B
114
(PBS pH 7,3, 0,05% Tween 20, 0,02% azide de sodium). Une incubation dans un tampon C
(PBS pH 7,3, 1% BSA, 0,02% azide de sodium) a ensuite été effectuée avant ajout de
l'anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline (3,75 U/ml dans tampon C). La
fixation de l'anticorps a été assurée par une incubation d'une nuit à 4°C. La plaque a ensuite
été lavée trois fois 10 min. dans le tampon B, puis trois fois 10 min. dans un tampon D
(glycine-NaOH 100 mM, pH 10,4, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2). Enfin, le substrat de la
phosphatase alcaline, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP: 0,5 mg/ml dans le
tampon D) a été ajouté pendant 1h à 3h à 30°C, et la plaque a été une dernière fois rincée à
l'eau distillée avant d'être séchée. Les glycosphingolipides apparaissent alors colorés en bleu.
4.3.3. Analyse des plaques d'HPTLC
Les films ou les plaques étaient numérisés par un scanner et l'intensité de chaque bande
était estimée par densitométrie grâce au logiciel "Molecular Analyst" (Bio-Rad). Les résultats
obtenus étaient corrigés par la quantité exacte de protéine présente dans chaque échantillon
(voire paragraphe 7.1). Pour obtenir la composition des échantillons en glycosphingolipides,
le pourcentage de chaque bande a été calculé par rapport à la totalité de la piste.
4.4. Analyse des gangliosides par chromatographie liquide haute pression
(HPLC)
L'analyse des gangliosides par HPLC a été réalisée suivant la méthode décrite par
(Gazzotti et al., 1985). Les gangliosides (environ 10 µg) ont été dissous dans 20 µl d'eau
distillée et injectés dans la colonne d'HPLC. La séparation a été assurée à 20°C par un
gradient des mélanges de solvants suivants:
- solvant A: acétonitrile/tampon phosphate 5 mM pH 5,6 (83:17, v/v)
- solvant B: acétonitrile/tampon phosphate 20 mM pH 5,6 (1:1, v/v)
Le programme d'élution était le suivant:
- 7 min. avec le solvant A
- 53 min. avec un gradient linéaire du tampon A jusqu'à un mélange tampon A/tampon B
(66:34, v/v)
- 20 min. d'un gradient linéaire depuis un mélange tampon A/tampon B (66:34) jusqu'à un
mélange tampon A/tampon B (36:64).
115
Le débit était de 1ml/min. et l'élution des gangliosides a été suivie grâce à un détecteur à
barrette de diodes (Previti et al., 1992). Les spectres de longueur d'onde ont été enregistrés de
195 à 370 nm. Parallèlement, le profil d'élution des gangliosides a été suivi à 196 nm et 215
nm.
A la fin de chaque analyse, la colonne était lavée pendant 10 min. avec le solvant B puis
ré-équilibrée pendant 15 min. avec le solvant A.
V. PURIFICATION DU GM3 A PARTIR DE LA RATE DE
BŒUF
Une rate de bœuf a été obtenue auprès des abattoirs Cibevial (Corbas, France) et
transportée jusqu’au laboratoire sur de la glace. Un morceau de la rate a été prélevée et
homogénéisée dans de l'eau à l'aide d'un broyeur électrique. A des volumes de 2,5 ml
d'homogénat ont été ajoutés 10 ml de méthanol et 5 ml de chloroforme. L'extraction lipidique
a été poursuivie pendant 2h à température ambiante. Après centrifugation (1000 g, 5 min.), le
culot a été ré-extrait deux fois avec 5 ml de chloroforme : méthanol : eau (5:10:4, v/v/v)
(Mansson et al., 1986). Les différentes classes lipidiques ont été séparées sur colonne de gel
de silice 60 (diamètre 1 cm, hauteur 2,7 cm) comme décrit dans le paragraphe 4.2.2.
La fraction des gangliosides a ensuite été déposée sur toute la longueur d'une plaque de
chromatographie sur couche mince (gel de silice 60, épaisseur 0,25 mm, dimensions 20 x 20
cm, support plaque en verre), développée par un mélange chloroforme : méthanol : CaCl2
0,2% (55:45:10, v/v/v). Une petite partie de la plaque a été révélée par une vaporisation d'une
solution de primuline à 0,1% dans un mélange acétone/eau (4:1, v/v) avant éclairage en ultraviolet (365 nm). L'emplacement du GM3 a été repérée par co-migration avec un standard et la
bande a été grattée afin de séparer la silice de son support en verre. La silice récupérée a été
déposée dans des petites colonnes faites de pipettes pasteur étirées à la flamme et bouchées
avec de la laine de verre. Le GM3 a été élué de la silice avec successivement: 3 ml de
chloroforme : méthanol (1:1, v/v), 3 ml de chloroforme : méthanol (1:2, v/v) et 3 ml de
méthanol. Après évaporation des solvants sous flux d’azote, le résidu a été repris dans 1 ml de
chloroforme : méthanol: eau (20:20:1, v/v/v). Les tubes ont été vortexés et centrifugés à
3000g pendant 20 minutes. La phase organique a été récupérée et le culot ré-extrait deux fois
116
avec le même solvant. Les trois phases organiques ont été rassemblées et évaporées sous flux
d’azote.
Afin de déterminer la quantité de GM3 purifiée, un échantillon de la fraction a été déposé
sur plaque d'HPTLC. Sur la même plaque, des quantités croissantes (100 ng à 10 µg) d'un
standard de GM3 ont été déposées. La plaque a été développée, révélée au résorcinol-HCl et
analysée comme décrit dans le paragraphe 4.3. La quantité de GM3 déposée a été estimée par
rapport à la gamme étalon.
VI. ANALYSE DES ACIDES GRAS DU GM3 DES CELLULES
MICROVASCULAIRES
6.1. Purification du GM3
Les cellules microvasculaires de la rétine de bœuf (pericytes ou cellules endothéliales) ont
été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d'AGEs méthylglyoxal ou 3 µM de "BSAcontrôle" (cf. § 2.3.1.1). Les lipides ont alors été extraits et les gangliosides isolés et séparés
sur HPTLC comme décrit dans le chapitre 4. Le GM3 des cellules microvasculaires a été
purifié de la même manière que le GM3 de la rate de bœuf (cf. § V): révélation des plaques de
silice par vaporisation avec une solution de primuline, grattage des bandes correspondant au
GM3 (ainsi que de la silice vierge servant de blanc), et élution du GM3 de la silice.
6.2. Obtention des acides gras
Les acides gras du GM3 ont été hydrolysés suivant une méthode initialement décrite par
Aveldano and Horrocks (1983), avec quelques modifications. Le GM3 purifié a été repris
dans 300 µl d’une solution d’acide chlorhydrique 0,5 M dans un mélange acétonitrile : eau
(9:1, v/v). De l’azote gazeux a été introduit dans les tubes afin de limiter l’oxydation par le
dioxygène de l’air. Après incubation pendant 2 heures à 75°C, les acides gras ont été extraits
par 2 ml de chloroforme : eau (1:1, v/v). La phase supérieure a été éliminée et la phase
inférieure, contenant les acides gras, a été lavée deux fois par 1 ml d’eau. La phase organique
a été récupérée et évaporée sous flux d’azote.
117
6.3. Dérivation
Avant d’être analysés par chromatographie en phase gazeuse, les acides gras ont été
dérivés par le pentafluorobenzène (PFB) et le N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
(BSTFA)(figure 35). Cette double dérivation a été utilisée afin de pouvoir analyser
d'éventuels acides gras hydroxylés, présents en faible quantité.
CH 3
H 3C
Si
CH 3
O
O
F
C
O
CH 2
F
F
CH 3
H 3C
Si
F
CH 3
groupement TMS (dérivation au BSTFA)
F
F
F
CH 2
F
F
F
groupement PFB
Figure 35: Acide palmitique monohydroxylé, dérivé par le BSTFA et le PFB
La dérivation au PFB s'est effectuée à 40°C pendant 20 minutes, après avoir ajouté aux
acides gras: 60 µl d'acétonitrile anhydre, 20 µl de PFB à 75% dans l'acétonitrile, et 20 µl de
N-diisopropyléthylamine. Les tubes ont alors été évaporés à sec sous flux d'azote.
La dérivation avec le BSTFA s'est ensuite effectuée en ajoutant aux acides gras 100 µl de
BSTFA puis en chauffant à 40°C pendant 30 minutes.
118
6.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse (GC-MS)
Les acides gras dérivés ont été repris dans 50 µl d'un mélange hexane : BSTFA (5:1, v/v).
L'injection (volume de 1 µl) s'est effectuée à l'aide d'un injecteur "splitless". Le gaz porteur
était constitué d'hélium avec un débit de 1 ml/min. Le programme de température utilisé pour
la chromatographie des acides gras était le suivant: 2 min. à 57°C – 57 à 180°C (20°C/min.) –
180 à 280°C (4°C/min.) – 15 min. à 280°C.
La détection des acide gras s'est faite par un spectromètre de masse couplé au
chromatographe, en mode NICI (Negative Ion Chemical ionization). Le gaz réactant était le
méthane. Les températures des différentes parties de l'appareil étaient les suivantes: source:
150°C, interface: 280°C et quadrupole: 106°C. Les acides gras ont été identifiés à la fois selon
leur temps de rétention et leur spectre de masse.
VII. DOSAGES BIOCHIMIQUES
7.1. Dosage des protéines
Les protéines ont été dosées selon la méthode initialement décrite par Schaffner and
Weissmann (1973). Les protéines à doser sont précipitées par l'acide trichloroacétique avant
d'être déposées sur un filtre en nitrocellulose puis colorées spécifiquement par le noir amide.
La coloration, proportionnelle à la quantité de protéines, est éluée et quantifiée par
photométrie.
Mode opératoire
Une gamme étalon était constituée de cinq tubes contenant respectivement 2, 5, 10, 20 et
27 µg de BSA. Les échantillons contenant les protéines en solution, ainsi que la gamme
étalon, étaient complétés à 270 µl avec de l'eau distillée. A chaque tube, étaient ajoutés 30 µl
de Tris-HCl (1 M, pH 7,5) contenant 1% de SDS et 60 µl d'acide trichloroacétique (TCA) à
60%. Après deux minutes d'incubation, les échantillons étaient filtrés sur une membrane de
nitrocellulose de porosité 0,45 µm, préalablement mouillée avec du TCA 6%. Les membranes
étaient ensuite colorées pendant 3 minutes dans une solution de noir amide à 0,1% dans un
119
mélange méthanol : acide acétique : eau (45:10:45, v/v/v). La coloration non spécifique était
éliminée par plusieurs bains d'eau successifs et un bain de 2 à 3 minutes dans une solution de
décoloration (méthanol : acide acétique : eau, 90:2:8, v/v/v). Les membranes étaient alors
séchées et chaque dépôt bleu découpé. Le colorant fixé sur les protéines était élué par 1 ml
d'une solution d'élution (NaOH 25 mM et EDTA 50 µM dans un mélange éthanol: eau, 50:50,
v/v). Pour chaque échantillon, un volume de 300 µl était déposé dans une plaque 96 puits.
L'absorption était mesurée à 620 nm et la quantification était réalisée par rapport à la gamme
étalon grâce au logiciel "Biolise"
7.2. Dosage de l'acide sialique
Le dosage de l'acide sialique s'est effectué selon une méthode colorimétrique, décrite
initialement par Svennerholm (1957).
Mode opératoire
Les échantillons de gangliosides à doser ont été évaporés à sec et repris dans 300 µl d'eau.
Parallèlement, une gamme étalon a été préparée, contenant de 1 à 12 nmoles d'acide sialique
dans 300 µl d'eau. Les tubes ont reçu 60 µl d'acide periodique 40 mM et ont été incubés dans
la glace pendant 30 min. Un volume de 750 µl de réactif résorcinol-HCl-Cu2+ froid (Schnaar
and Needham, 1994) a alors été ajouté. Les tubes ont été laissés 5 min. dans la glace puis
chauffés à 100°C pendant 20 min. Après refroidissement à température ambiante, 1,1 ml de 2pentanol ont été ajoutés. Les phases ont été séparées par centrifugation (1000g, 1 min.).
L'absorption de la phase supérieure a été lue à 630 nm.
7.3. Dosage de la sphingosine
Les échantillons de glycosphingolipides à doser ou la gamme étalon (de 1à 10 nmoles de
sphingosine), ont été évaporés à sec et repris dans 500 µl de méthanol : eau : HCl (82:9:9,
v/v/v). Les tubes ont été incubés à 70°C pendant 18 h. Après refroidissement à température
ambiante, ils ont reçu 750 µl de tampon borate de sodium 0,2 M, pH 8,0 et 250 µl de NaOH 2
M. Les tubes ont ensuite été vortexés avant l'ajout de 1,5 ml d'éther, suivi de 500 µl de
fluorescamine (0,15 mg/ml dans de l'éther). Les phases ont été séparées et la fluorescence de
120
la phase supérieure a été mesurée, avec une longueur d'onde d'excitation de 380 nm, et une
longueur d'onde d'émission de 480 nm.
7.4. Dosage du glucose sanguin
La méthode utilisée est basée sur l'action de la glucose oxydase et de la peroxydase
(Schmidt, 1961). En présence de glucose oxydase, le glucose est oxydé en acide gluconique
avec formation de peroxyde d'hydrogène:
glucose oxydase
Glucose + H2O + O2
Ac. gluconique + H2O2
Sous l'action d'une peroxydase, le peroxyde d'hydrogène est décomposé et l'oxygène libéré
oxyde la o-dianisidine, dont la forme réduite est incolore et la forme oxydée est colorée.
peroxydase
H2O2 + o-dianisidine (forme réduite)
o-dianisidine (forme oxydée) + H2O
L'intensité de l'absorption à 436 nm du complexe formé est proportionnelle à la quantité de
glucose présente dans l'échantillon.
Mode opératoire
Les échantillons à doser ont été préparés à partir d'un aliquote de 10 µl de sang total,
déprotéinisé par l'ajout de 250 µl de HClO4 0,3 M et centrifugé à 3500 g pendant 10 minutes.
Les surnageants étaient prélevés et pouvaient être conservé à –20°C.
Lors du dosage, 300 µl de milieu réactionnel (solution de peroxydase à 0,01 U/ml et
glucose oxydase à 0,077 U/ml dans un tampon phosphate 90 mM + 158 µM de o-dianisidine)
ont été ajoutés à 10 µl de sang déprotéinisé ou à 10 µl de différentes concentrations de
glucose (0 à 50 mM), dans une plaque 96 puits. Les plaques ont été incubées pendant 40 min
à 25°C avec une agitation de 900tr/min. L'absorbance dans les puits a été mesurée à 440 nm et
la concentration en glucose des échantillons a été calculée par rapport à la gamme étalon.
121
7.5. Mesure du stress oxydant
Le stress oxydant intracellulaire a été mesuré grâce à une technique utilisant un dérivé de
la dichlorofluorescéine. En effet, le diacétate de dichlorofluorescéine (DCFH2-DA) a la
propriété de traverser les membranes cellulaires et d'être hydrolysé par les estérases
intracellulaires en dichlorofluorescéine (DCFH2), composé non fluorescent et non perméant.
En présence de dérivés actifs de l'oxygène (ROS) ,la DCFH2 est oxydée en DCF, composé
également non perméant mais fluorescent. L'oxydation de la dichlorofluorescéine peut ainsi
être suivie par un fluorimètre. Selon Jakubowski and Bartosz (2000), l'oxydation de la
dichlorofluorescéine serait un indice du stress oxydant cellulaire, prenant en compte la
quantité de ROS, mais également l'état des défenses anti-oxydantes, comme le gluthation
réduit par exemple.
Mode opératoire:
Les BRP ont été ensemencés dans une plaque de 96 puits recouverts de fibronectine (voir
chapitre 3.1). Les cellules ont été cultivées pendant 3 à 4 jours dans un milieu de culture
standard (DMEM/10% SVF). A confluence, celles ci ont été lavées avec du DPBS puis
incubées pendant 1 heure à 37°C avec 100 µl d'une solution de "chlorométhyl-2',7'dichlorofluorescein diacetate" (Molecular Probes) à 20 µM, préparée dans du DPBS. Les
cellules ont ensuite été lavées une nouvelle fois avec du DPBS puis incubées à 37°C dans du
DPBS contenant 3 µM de BSA ou d'AGE. La fluorescence des puits (485/530 nm) a été
mesurée à différents temps, allant de 30 minutes à 48 heures.
VIII. DOSAGES D'ACTIVITES ENZYMATIQUES
8.1. Dosage des activités α2,3 et α2,8-sialyltransferase (GM3 et GD3synthase)
Principe
Les activités de l'α2,3 et l'α2,8-sialyltransferase ont été déterminées grâce à l'incorporation
sur un substrat accepteur, d'acide N-acétyl neuraminique marqué au
14
C, à partir de CMP-
[14C]-acide N-acétyl neuraminique (CMP-[14C]-NeuAc). Le substrat accepteur est le CDH
122
(lactosylcéramide) pour le dosage de l'α2,3-sialyltransferase et le GM3 pour le dosage de
l'α2,8-sialyltransferase. Les activités enzymatiques sont estimées en fonction de la quantité de
produit radioactif formé.
Gal
Gluc
Ceramide
α2,3-sialyltransferase
[14C]NeuAc
(CDH)
Gal
Gluc
Gluc
Ceramide
(GM3)
CMP-[14C]-NeuAc
NeuAc
Gal
Ceramide
CMP
α2,8-sialyltransferase
[14C]NeuAc
(GM3)
NeuAc
Gal
Gluc
Ceramide
(GD3)
CMP-[14C]-NeuAc
CMP
Mode opératoire
Les pericytes rétiniens de bœuf ont été incubés pendant deux passages avec 3 µM d'AGEs
methylglyoxal ou 3 µM de BSA-contrôle. Une fois à confluence, les cellules ont été
récupérées par trypsination et rincées trois fois avec du PBS. Les cellules ont été comptées
dans un hématimètre afin de prélever la même quantité de cellules "BSA" et "AGE". Le culot
cellulaire a ensuite été immédiatement lysé pendant une heure à 4°C dans un tampon
cacodylate de sodium 10 mM, pH 6,5, comprenant 1 % de Triton CF-32, 20 % de glycérol et
0,5 mM de dithiothreitol (environ 100 µl de tampon pour 3,5x106 cellules).
Pour chaque essai, le milieu réactionnel (volume final de 120 µl) était composé de:
-
45 µg de CDH pour le dosage de l'α2,3-sialyltransferase et 60 µg de GM3 pour le
dosage de l'α2,8-sialyltransferase. Le solvant du CDH et du GM3 (mélange
chloroforme : méthanol (2:1, v/v)) a été évaporé directement dans le tube de réaction.
-
0,87 nmol de CMP-[14C]-acide N-acétyl neuraminique (287 mCi/mmol) + 6,1 nmol de
CMP-acide N-acétyl neuraminique froid. Là encore, le solvant (eau) a été évaporé dans
le tube de réaction.
-
40 µl de lysat cellulaire
-
80 µl de tampon de réaction (tampon cacodylate de sodium 100 mM, pH 6,5,
comprenant 0.5% de Triton CF-32 et 8.3 mM de MnCl2).
123
Après un temps d'incubation de 4 heures à 37°C, la réaction enzymatique a été stoppée par
addition de 1 ml de chloroforme : méthanol (1:1, v/v). Les gangliosides ont alors été extraits,
purifiés sur colonne de silice C18 et séparés par HPTLC comme décrit dans le chapitre IV.
Après autoradiographie de la plaque de silice pendant 15 jours, les bandes radioactives
correspondant au GM3 pour le dosage de l'α2,3-sialyltransferase, et au GD3 pour le dosage de
l'α2,8-sialyltransferase, ont été analysées par densitométrie comme décrit dans le chapitre
4.3.3. La silice contenant les bandes de GM3 ou de GD3 a ensuite été grattée du support de la
plaque d’HPTLC et transférée dans des fioles de comptage. Cinq ml de liquide de scintillation
(Hionic Fluor, Packard) ont été ajoutés puis la radioactivité a été mesurée dans un compteur
beta à scintillation.
8.2. Détermination des paramètres cinétiques de l'α2,8-sialyltransferase
(GD3-synthase)
8.2.1. Activité enzymatique en fonction du temps d'incubation
Afin de déterminer les paramètres enzymatiques apparents (Vmax et Km) de l'enzyme,
nous nous sommes placés à un temps pour lequel la réaction se fait en vitesse initiale. Pour
déterminer ce temps, l'activité de l'α2,8-sialyltransferase a été mesurée selon le protocole
décrit précédemment, en fonction de différents temps d'incubation variant de 15 à 240
minutes. Le temps choisi pour la suite est le temps maximal pour lequel l'activité enzymatique
est linéaire.
8.2.2. Détermination des paramètres cinétiques pour le CMP-acide N-acétyl
neuraminique
Afin de déterminer la vitesse maximale (Vmax) et la constante d'affinité apparente (Km)
de l’α2,8-sialyltransferase pour le CMP-acide N-acétyl neuraminique, le protocole décrit en
5.1 a été utilisé avec quelques modifications. La concentration en GM3 a été fixée à 420 µM
(concentration saturante) tandis que la concentration en CMP-[14C]-acide N-acétyl
neuraminique a varié de 2,4 à 180 µM. La réaction enzymatique s'est effectuée à 37°C
pendant 2h (temps pour lequel la réaction se fait en vitesse initiale). Les différentes
124
concentrations en CMP-[14C]-acide N-acétyl neuraminique ont été préparées à partir d'une
solution mère composée de 87 µM de CMP-[14C]-acide N-acétyl neuraminique (287
mCi/mmol) et 2,4 mM de CMP-acide N-acétyl neuraminique froid.
Les résultats ont été présentés suivant la représentation graphique de LineweaverBurk, soit 1/V=f(1/[S]). Selon l'équation de Michaelis-Menten, on a :
1/V= (Km/Vmax)*(1/[S]) + 1/Vmax
Par régression linéaire, on peut calculer Vmax (pour 1/[S]=0) et Km (pour 1/V=0).
8.2.3. Détermination des paramètres cinétiques pour le GM3
La vitesse maximale (Vmax) et la constante d’affinité apparente (Km) de l’α2,8sialyltransferase pour le GM3 ont également été déterminées suivant le protocole décrit en
5.1. Cette fois ci, la concentration en CMP-[14C]-acide N-acétyl neuraminique a été maintenue
fixe à 240 µM (87 µM de CMP-[14C]-acide N-acétyl neuraminique (287 mCi/mmol) + 2,4
mM de CMP-acide N-acétyl neuraminique froid). La concentration en GM3 a varié de 14 µM
à 420 µM.
La réaction enzymatique s’est effectuée pendant 2 heures à 37°C. Les paramètres Vmax et
Km ont été déterminés comme décrit dans le paragraphe 8.2.2.
125
IX. TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
9.1. Séquençage d'un fragment de l'ADNc de l' α2,8-sialyltransferase
Le séquençage d'un fragment de l'ADNc de la GD3-synthase bovine a été effectué par la
société Génome Express (Meylan, France).
9.1.1. Dessin des amorces
La recherche bio-informatique des séquences existantes de la GD3-synthase a été effectuée
dans la banque de séquences RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/refseq.html).
Trois séquences ont ainsi été obtenues:
- GD3-synthase chez l'homme (n°accès RefSeq NM 003034)
- GD3-synthase chez le rat (n°accès RefSeq NM 012813)
- GD3-synthase chez la souris (n°accès RefSeq NM 011374)
De même, une recherche d'homologie sur une banque d'ESTs (Expressed sequence tags) de
bœuf a permis d'identifier 3 ESTs homologues aux GD3-synthases précédentes:
- EST 1: n°accès GenBank AW344922
- EST 2: n°accès GenBank AW345220
- EST 3: n°accès GenBank BE668969
Ces six séquences ont été alignées entre elles, afin de définir les zones d'homologies
permettant le dessin de deux amorces. L'amorce 1 a été dessinée uniquement sur la base d'une
séquence homologue entre les trois espèces (homme, rat, souris). L'amorce 2 a été dessinée en
fonction de l'homologie des ESTs de bœuf.
Amorce 1: 5'CAGCTGCCATTGAAGAAATG3'
Amorce 2: 5'GCCAGAAGCCATAGATGG3'
9.1.2. Extraction des ARNm des cellules
Des pericytes rétiniens de bœuf (environ 106 cellules) ont été cultivés comme décrit dans le
chapitre 3.1. A confluence, ceux ci ont été récupérés par trypsination, lavés deux fois dans du
126
DPBS et repris dans 500 µl de DPBS. Ils ont été conservés à –20°C après addition de 5 ml
d'une solution "RNAlater" (Clinisciences) destinée à protéger les ARN de leur dégradation.
Juste avant l'extraction des ARNm, la solution "RNAlater" a été éliminée par
centrifugation (2000 g, 15 min.). L'extraction a été réalisée en utilisant le kit "Oligotex Direct
mRNA Mini Kit" (Qiagen). Ce kit est basé sur l'utilisation de billes de polystyrène-latex oligo
dT30 qui permettent la capture des ARNm polyA.
Les cellules ont été lysées et mises en présence des billes de polystyrène pendant 10 min. à
température ambiante. Le complexe oligotex/ARNm formé a été déposé sur colonne. Après
deux lavages successifs, les ARNm ont été élués par 45 µl de tampon OEB (Tris-HCl 5 mM,
pH 7,5) chauffé à 70°C. Les ARNm extraits ont été conservés à –80°C.
9.1.3. Transcription inverse à partir des amorces spécifiques
Les RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) ont été réalisées selon le
protocole "Titan One Tube RT-PCR Kit" (Roche Diagnostics). Deux RT-PCR ont été faites à
partir de 2 et 10 µl d'ARNm extraits en présence de 0,8 µM d'amorces spécifiques (amorces 1
et 2 définis dans le chapitre 9.1.1), 0,2 mM de dNTP, 5 mM de DTT et 5 U d'inhibiteur de
RNase (qsp 25 µl).
Ce premier mélange a été ajouté à un deuxième mélange de 25 µl contenant du tampon
RT-PCR 1X et les enzymes (AMV Reverse Transcriptase et Expand High Fidelity). La
transcription inverse s'est faite à 50°C pendant 30 min. puis le mélange réactionnel a été
incubé 20 min. à 37°C en présence de 2 U de RNase H (Gibco BRL).
La PCR a été réalisée selon le cycle suivant:
94°C
3 min.
94°C
55°C
68°C
30s
30s
1 min. 30
68°C
4°C
7 min.
35 cycles
127
9.1.4. Purification des produits de la RT-PCR
Le produit d'amplification correspondant aux 10 µl d'ARNm a été déposé sur gel d'agarose
1%. La bande correspondant à 496 pb a été extraite du gel en utilisant le kit "QIAquick Gel
Extraction" (Qiagen). Après extraction, le produit de PCR a été dosé par fluorimétrie.
9.1.5. Séquençage
Le produit de RT-PCR de 496 pb a été séquencé en utilisant le kit Big Dye terminator
(Applied Biosystems) et les amorces 1 et 2. Les réactions de séquences ont été déposées sur
séquenceur capillaire 3100 (Applied Biosystems).
9.2 Technique de PCR quantitative
9.2.1. Choix des paires d'amorces
La réaction de PCR nécessite une paire d'amorces pour chaque fragment d’ADN à
amplifier: une amorce "sens" et une amorce "antisens". Chaque amorce est composée de 20
nucléotides. Les deux amorces d’une même paire doivent avoir une température de fusion
(Tm) proche, une similarité de 100% avec la séquence de l’ADNc, ils doivent former le moins
de dimères et trimères possibles (liaison des deux amorces par deux ou trois nucléotides),
ainsi que de "boucles" (liaison d’une amorce avec elle même par deux ou trois nucléotides).
Pour la GD3-synthase, deux paires d'amorces (246-247 et 248-249) ont été définies à partir
de la séquence déterminée pour la GD3-synthase bovine (Tableau 1), grâce au logiciel
"Vector NTI Suite 7.0" (InforMax). De plus, pour la PCR quantitative, deux gènes de
référence ont été choisis: la β-actine et la GAPDH. En effet, ces protéines sont exprimées en
quantité importante dans les pericytes rétiniens, elles ont déjà été séquencées chez le bœuf et
sont donc classiquement utilisées comme protéines de référence. Une paire d'amorces a été
choisie pour chaque protéine (β-actine: 250-251, GAPDH: 252-253) (Tableau 1).
128
Protéine
N° d’accession de N° du primer
la
Séquence de l'amorce
séquence
bovine
___
β-actine bovine AF191490
GAPDH
bovine
U85042
du
produit
(GenBank)
GD3-synthase
Longueur
d’amplification
246 (sens)
GCAATCTTCCTCCGTTGTCA
117 pb (de 73 à
247 (antisens)
TTCTGGACCACAGCAGGTTC
189)
248 (sens)
GAACCTGCTGTGGTCCAGAA
156 pb (de 170 à
249 (antisens)
AGCACTGTCTGATTGGCACC
325)
250 (sens)
AGAGCAAGAGAGGCATCCTG
100 pb (de 76 à
251 (antisens)
TTGTAGAAGGTGTGGTGCCA
175)
252 (sens)
AAGTGGACATCGTCGCCATC
100 pb (de 44 à
253 (antisens)
ACTGTGCCGTTGAACTTGCC
143)
Tableau 1 : Différentes paires d'amorces définies pour la GD3-synthase, la β-actine et la
GAPDH.
9.2.2. Extraction des ARN des cellules
Des pericytes rétiniens de bœuf ont été cultivés comme décrit dans le paragraphe 3.1., en
présence de BSA ou d’AGEs. A confluence, ceux ci ont été récupérés et conservés comme
décrit dans le paragraphe 9.1.2.
Le culot cellulaire a ensuite été repris par 1 ml de Trizol (Gibco-BRL) et remis en
suspension complète au vortex. La suspension a été laissée 5 minutes à température ambiante,
avant l’ajout de 200 µl de chloroforme. Les tubes ont alors été vortexés et laissés de nouveau
5 minutes à température ambiante. Ils ont ensuite été centrifugés (10000 g, 5 min., 4°C) et la
phase supérieure incolore, qui contient les ARN, a été récupérée. Cette phase supérieure a
reçu 500 µl d’isopropane-2-ol, puis elle a été vortexée quelques secondes et incubée à –20°C
pendant 2 heures au minimum. Après centrifugation (10000 g, 20 min., 4°C), le culot a été
lavé par 1 ml d’éthanol 70% froid. Une nouvelle centrifugation a été effectuée (10000 g, 10
min., 4°C) et le surnageant a été éliminé. Le culot a alors été laissé 5 minutes à température
ambiante avant d’être repris par 15 µl d’un mélange eau/DEPC (diethyl pyrocarbonate) stérile
froid. Les ARN ont été utilisés tout de suite ou stockés à -80°C.
La quantité d’ARN extraite a ensuite été déterminée par mesure photométrique à 260 nm,
d’après le coefficient d’extinction molaire de l’ARN. La contamination en protéines a été
vérifiée par une mesure photométrique à 280 nm.
129
9.2.3. Transcription inverse
Les ARN ont ensuite été transcrits en ADN à l’aide d'un kit de Gibco-BRL (ref.
11904.018). Les mélanges ARN/amorces/dNTP ont été préparés selon les indications du kit à
partir de 5 µg d’ARN cellulaire (Tableau 2). Deux types d'amorces ont été utilisés: soit un
mélange contenant des oligomères non spécifiques (Oligo(dT)12-18), soit un mélange contenant
les amorces définies pour la GD3-synthase, la β-actine et la GAPDH (GSP). Les tubes ont été
incubés 5 minutes à 65°C afin de dénaturer les ARN, puis laissés dans la glace 1 minute au
minimum. Le mélange réactionnel a été préparé selon les indications du kit (Tableau 2) et
ajouté au mélange ARN/amorces/dNTP. Après incubation pendant 2 minutes à 42°C, la
transcriptase inverse (Superscript II RT) a été ajoutée et la réaction a été effectuée à 42°C
pendant 50 minutes, puis terminée à 70°C pendant 15 minutes. Les tubes ont ensuite été
placés dans la glace et les ARNs restants ont été détruits par incubation à 37°C pendant 20
minutes avec la RNase H. L’ADN a été utilisé tout de suite pour la PCR ou stocké à –20°C.
Mélange ARN/amorces/dNTP
Mélange réactionnel
Composé
Volume
Composé
Volume
5 µg d’ARN
n µl
Tampon RT 10x
2 µl
Mélange dNTP à 10 1 µl
MgCl2 (25 mM)
4 µl
DTT (0,1 mM)
2 µl
Inhibiteur de RNase
1 µl
mM
Oligo(dT)12-18
(0,5 1 µl
µg/µl) ou GSP (2 µM)
Eau/DEPC
qsp 10 µl
Tableau 2 : Composition des mélanges utilisés pour la transcription inverse.
130
9.2.4. PCR quantitative
L’expression de la GD3-synthase dans les pericytes incubés en présence de BSA ou
d’AGEs a été quantifiée par PCR quantitative à l’aide d’un Light Cycler (Roche Diagnostic).
Principe :
Le Light Cycler est un appareil permettant de combiner dans un même tube,
l’amplification d’ADN par PCR, le suivi de l’amplification en temps réel grâce à un
fluorochrome, et l’analyse de la qualité de l’amplification à l’aide d’une courbe de fusion.
Pour suivre la réaction, nous avons ici utilisé le SYBR Green I Dye. La fluorescence de ce
produit augmente fortement lorsqu’il se lie à l’ADN double brin. Lorsque la quantité d’ADN
dans la PCR augmente, la fluorescence augmente ainsi proportionnellement. La fluorescence
est mesurée à la fin de chaque cycle de PCR. Dans les premiers cycles, la quantité d’ADN est
trop faible pour être détectée. Puis la fluorescence augmente de manière logarithmique avant
d’atteindre un plateau dans les derniers cycles (Figure 36).
131
Dénaturation des 2 brins
Hybridation de l’amorce
hν
SYBR Green I Dye
Fin du cycle, mesure de la
fluorescence (rectangle vert sur
la figure de droite)
Fluorescence
Elongation du brin
complémentaire
Nombre de cycles
Figure 36: Principe de la PCR avec le SYBR Green I Dye effectuée par le Light Cycler
On peut déterminer le "crossing point", point d’intersection entre la ligne de base et la
tangente à la pente de la courbe (Figure 37). Plus la quantité d’ADN était importante au
départ, plus la réaction "démarre" vite, et plus le "crossing point" est faible.
132
Fluorescence
Nombre de cycles
Crossing point
Figure 37: Détermination du "crossing point"
De plus, la pureté du produit d’amplification peut être contrôlée sans faire de gel
d’électrophorèse, en effectuant des courbes de fusion. En effet, chaque fragment d’ADN est
dénaturé à une température caractéristique appelée température de fusion (Tm), qui dépend de
la taille du fragment et de la composition en nucléotides. Dans le Light Cycler, lorsque tous
les cycles de PCR sont terminés, il est possible d’augmenter lentement la température et de
mesurer la fluorescence de manière continue. Lorsque la température de fusion du produit
d’amplification est atteinte, la fluorescence chute brutalement (Figure 38). Le calcul de la
dérivée négative de la fluorescence en fonction de la température (-dF/dT) permet de
visualiser sous forme de pics les différents composés ayant été amplifiés (Figure 38). Chaque
pic correspond à un produit d’amplification.
133
Figure 38: Courbes de fusion
La comparaison entre la quantité d’ADNc de la GD3-synthase dans les pericytes incubés
en présence de BSA ou d’AGEs a été effectuée comme décrit dans la Figure 39, par rapport à
la quantité d’ADNc de deux protéines de référence: la β-actine et la GAPDH, présentes en
grande quantité dans les pericytes rétiniens.
PCR ADNc X
PCR ADNc de référence
L ’ADNc X est 4x plus
abondant dans la cellule
A/B
Cellule A:
Cellule B:
Figure 39: Exemple de l’analyse d’un ADNc X par rapport à un ADNc de référence R,
dans deux cellules différentes A et B.
Dans notre cas : les cellules A pourraient par exemple correspondre aux pericytes "BSA"
et les cellule B aux pericytes "AGE", l’ADNc X représenterait alors l’ADNc de la GD3synthase et l’ADNc R celui de la β-actine ou de la GAPDH.
134
Mode opératoire :
Les réactions de PCR dans le Light Cycler ont été effectuées en utilisant le kit "LC faststart
DNA master SYBR Green I" (Roche Diagnostic). Les réactions ont été effectuées dans des
capillaires très fins (LC capillaires, Roche Diagnostic), permettant des changements de
température très rapides. Dans chaque capillaire, a été déposé le mélange suivant :
MgCl2 : 3, 4 ou 5 mM (1 mM/0,8 µl)
PCR Mix : 2 µl
Mélange paires d'amorces : 0,4 µl (0,28 µg/µl)
ADNc : 2 µl
H2O : qsp 20 µl
La concentration optimale en MgCl2 a dû être déterminée pour chaque paire d'amorces.
Trois concentrations différentes ont été testées : 3, 4 ou 5 mM. De même, la dilution des
ADNc a dû être optimisée. Un mélange contrôle contenant tous les produits ci-dessus sauf
l’ADNc a été effectué.
Lorsque le mélange réactionnel a été dans les capillaires, ceux-ci ont été bouchés et
centrifugés brièvement pour faire descendre les échantillons au fond. Ils ont ensuite été placés
dans le Light Cycler où les réactions de PCR et de fusion ont été effectuées selon le protocole
suivant :
Programme
Température à Pente (°C/sec) Temps de maintien de Mesure de la Nombre de
atteindre (°C)
la température (sec)
fluorescence
cycles
Dénaturation
95
20
480
Non
1
PCR
95
20
15
Non
55
52
20
6
Non
72
20
15
Une fois
95
20
0
Non
62
20
15
Non
95
0,1
0
En continu
40
20
45
Non
Fusion
Refroidissement
1
1
135
X. ANALYSE STATISTIQUE DES RESULTATS
Les résultats présentés dans les figures et tableaux sont les moyennes ± SD de n
expériences indépendantes. Pour comparer les moyennes entre deux groupes, le test non
paramétrique de Mann-Withney a été utilisé. La limite de significativité a été fixée à p<0,05.
XI. RECAPITULATIF DES TECHNIQUES UTILISEES
Expérimentation « in vitro »
Expérimentation « ex vivo »
Rats diabétiques
(induction par
streptozotocine)
Rétines de boeuf
Isolation et culture des cellules microvasculaires
rétiniennes: pericytes (BRP) et cellules
endothéliales (BREC)
Modèle de mini-porcs
diabétiques
Mesure de la glycémie
Prélèvement des rétines
Reproduction d’un environnement diabétique:
forte concentration de glucose ou
produits finaux de glycation avancée (AGEs)
pendant 15 jours
Homogénéisation
ou
Marquage métabolique des glycosphingolipides au
14C-galactose (pour l’analyse des
glycosphingolipides uniquement)
Isolation des microvaisseaux par la
technique du choc osmotique
Récupération des cellules
Dosages enzymatiques
(GM3-synthase et GD3synthase)
Mesure du stress oxydant
Techniques de biologie moléculaire:
-extraction des ARN
-séquençage de la GD3-synthase
-PCR quantitative
Analyse des acides gras du
GM3 par GC-MS
Analyse des glycosphingolipides:
-extraction lipidique
-isolation et purification des
glycopshingolipides
-HPTLC
Dosage de protéines
136
137