Monolisa™ Anti-HBs PLUS 192 tests 72566 - Bio-Rad
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Monolisa™ Anti-HBs PLUS 192 tests 72566 - Bio-Rad
Monolisa™ Anti-HBs PLUS 192 tests 72566 TROUSSE DE DÉTECTION ET DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-HBs DANS LE SÉRUM/PLASMA HUMAIN PAR MÉTHODE IMMUNOENZYMATIQUE IVD Contrôle de qualité du fabriquant Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot du produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par notre société. SOMMAIRE 1. BUT DU TEST 2. PRESENTATION DU TEST 3. PRINCIPE DU TEST 4. COMPOSITION DE LA TROUSSE 5. PRÉCAUTIONS 6. CONSIGNES D’HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ 7. MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI 8. PRÉPARATION DES RÉACTIFS 9. CONSERVATION - VALIDITÉ 10. ÉCHANTILLONS 11. MODE OPÉRATOIRE 12. VALIDATION DES RÉSULTATS POUR LES MÉTHODES QUALITATIVES ET QUANTITATIVES 13. CALCULS ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS 14. VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DES RÉACTIFS 15. LIMITES DU TEST 16. PERFORMANCES 17. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 2 1 - BUT DU TEST Monolisa™ Anti-HBs PLUS permet la détermination qualitative et quantitative par technique immunoenzymatique des anticorps dirigés contre l’antigène de surface du virus de l’hépatite B (antiHBs) éventuellement présents dans le sérum ou le plasma humain. 2 - PRÉSENTATION DU TEST La présence d’anticorps contre l’antigène de surface de l’Hépatite B est un facteur important dans le diagnostic et le pronostic d’une infection par le virus de l’Hépatite B (VHB). Chez les patient en phase d’infection aiguë, les anti-HBs sont détectés dans quasiment 80% des cas 1 à 3 mois après l’apparition des antigènes de surface de l’Hépatite B (HBs Ag). Lors de suivis épidémiologiques, l’anti-HBs est utilisé afin d’estimer les risques d’exposition au virus de l’Hépatite B chez d’éventuels receveurs du vaccin contre l’Hépatite B, de suivre les vaccinations et de sélectionner du plasma fortement concentré en anticorps pour la préparation d’immunoglobulines spécifiques. Monolisa™ Anti-HBs PLUS est un test EIA direct de type sandwich utilisant des microplaques sensibilisées à l’antigènes de surface de l’Hépatite B comme phase solide (HBs Ag, sous-types ad et ay) et un conjugué contenant de la peroxydase de raifort marquée à l’antigène de surface HBs Ag (sous-types ad et ay). Les niveaux de concentration en anti-HBs ont été établis d’après la WHO AntiHBs Reference Preparation et sont exprimés en Millième d’Unité Internationale par millilitre (mUI/ml). Un niveau supérieur ou égal à 10 mUI/ml est considéré généralement comme le niveau standard de protection contre le VHB après vaccination. Une vérification du niveau de concentration 10 mUI/ml minimum, niveau seuil d’immunité, est nécessaire pour suivre de manière appropriée des individus vaccinés ayant pu être exposés ultérieurement au VHB. 3 - PRINCIPE DU TEST Echantillons et Contrôles sont incubés dans les cupules sensibilisées à l’antigène de surface de l’Hépatite B. Les anticorps anti-HBs éventuellement présents dans l’un des échantillons ou des contrôles se lient avec les antigènes formant ainsi un complexe immunologique antigène/anticorps. L’excès d’échantillon est éliminé par une phase de lavage. Le conjugué ajouté se lie au complexes antigènes/anticorps formés précédemment dans les cupules. L’excès de conjugué est éliminé par une phase de lavage, puis une solution de révélation enzymatique est ajoutée dans chaque cupules. Il s’en suit une phase d’incubation. Si un échantillon contient des anti-corps anti-HBs, l’enzyme liée HRP entraîne une coloration du TMB de la solution chromogène qui devient bleue. Après addition de la solution d’arrêt, la coloration du substrat bleu tourne au jaune. Pour les échantillons ne contenant pas d’anti-corps anti-HBs, la coloration du substrat disparaît des cupules qui deviennent incolores pendant la phase d’incubation et après addition de la solution d’arrêt. L’intensité de coloration, mesurée par spectrophotométrie, est proportionnelle à la concentration en anti-HBs de l’échantillon. Les valeurs d’absorbance mesurées par spectrophotométrie pour chaque échantillon sont comparée à une valeur seuil (Vs) déterminée à partir du calibrateur 10 mUI/ml. 3 4 - COMPOSITION DE LA TROUSSE Tous les réactifs sont destinés exclusivement pour le diagnostic in vitro. ETIQUETAGE NATURE DES RÉACTIFS PRÉSENTATION R1 MICROPLAQUE : 12 barrettes de 8 cupules sensibilisées avec des antigènes 2 microplaques de surface du virus de l’Hépatite B, de sous-types ad et ay (humains) R2 SOLUTION DE LAVAGE CONCENTRÉE (20X) Tampon Tris NaCl, pH = 7.4 Conservateur : ProClinTM 300 (0,04%) 1 flacon 235 ml C0 CONTRÔLE NÉGATIF Tampon additionné de sérum de veau fœtal et de stabilisant de protéines Conservateur : ProClin™ 300 (0.5%) 1 flacon 2.2 ml C1 CALIBRATEUR 10 mUI/ml * Tampon additionné d’anticorps Anti-HBs (humains), de sérum de veau fœtal, de stabilisant de protéines et d’un indicateur coloré témoin de dépôt Conservateur : ProClin™ 300 (0.5%) 1 flacon 3 ml C2 CALIBRATEUR 100 mUI/ml – CONTRÔLE POSITIF Tampon additionné d’anticorps Anti-HBs (humains), de sérum de veau fœtal, de stabilisant de protéines et d’un indicateur coloré témoin de dépôt Conservateur : ProClin™ 300 (0.5%) 1 flacon 2.2 ml C3 CALIBRATEUR 400 mUI/ml Tampon additionné d’anticorps Anti-HBs (humains), de sérum de veau fœtal, de stabilisant de protéines et d’un indicateur coloré témoin de dépôt Conservateur : ProClin™ 300 (0.5%) 1 flacon 2.2 ml C4 CALIBRATEUR 1000 mUI/ml Tampon additionné d’anticorps Anti-HBs (humains), de sérum de veau fœtal, de stabilisant de protéines et d’un indicateur coloré témoin de dépôt Conservateur : ProClin™ 300 (0.5%) 1 flacon 2.2 ml R6 DILUANT ÉCHANTILLON Tampon additionné de sérum de veau fœtal, de stabilisant de protéines et d’un indicateur coloré témoin de dépôt Conservateur : ProClin™ 300 (0.1%) 1 flacon 27 ml R7a CONJUGUÉ CONCENTRÉ (11X) Tampon additionné d’un mélange d’Antigènes HBs des sous-types ad et ay (humains) marqués à la peroxydase et de stabilisant de protéines Conservateur : ProClin™ 300 (0.5%) 1 flacon 2.5 ml R7b DILUANT CONJUGUÉ Tampon additionné de sérum de veau et de stabilisant de protéines Conservateur : ProClin™ 300 (0.1%) 1 flacon 25 ml R8 TAMPON SUBSTRAT Solution d’Acide citrique et d’Acétate de sodium pH 4,0 contenant 0,015% H2O2 et 4% de Diméthylsulfoxyde (DMSO) 1 flacon 60 ml R9 CHROMOGÈNE Solution contenant du Tétraméthyl benzidine (TMB) 1 flacon 5 ml R10 SOLUTION D’ARRÊT Solution d’Acide sulfurique 1 N 1 flacon 28 ml * les contrôles sont calibrés à partir d’une référence interne, elle-même calibrée à partir de la préparation de référence 1st IRP WHO 1977. 4 Conserver la trousse à 2-8°C. Amener tous les réactifs excepté le Conjugué concentré à la température du laboratoire (18-30°C) avant utilisation. Remettre les réactifs à 2-8°C immédiatement après utilisation. Conserver les barrettes non utilisées dans le sachet refermé. Ne pas enlever le dessicatif. Conserver les barrettes à 2-8°C. 5 - PRÉCAUTIONS La qualité des résultats dépend du respect des bonnes pratiques de laboratoire suivantes : • Le nom du test ainsi qu’un numéro d’identification spécifique du test sont mentionnés sur le cadre de chaque microplaque. Ce numéro d’identification spécifique figure également sur chaque barrette. Monolisa™ Anti-HBs PLUS : Numéro spécifique d’identification = 63. Cette identification doit être vérifiée avant chaque utilisation. Toute barrette dont le numéro de test est absent ou différent de celui correspondant au test réalisé, ne doit pas être utilisée. • Ne pas utiliser des réactifs dont la validité est expirée. • Ne pas mélanger des réactifs de lots différents au cours d’un même essai. REMARQUE : Il est possible d'utiliser d'autres lots de solution de lavage (R2, identifié 20X en vert sur l’étiquette), de tampon substrat (R8, identifié TMB buf. en bleu), de chromogène (R9, identifié TMB 11X. en violet) et de solution d'arrêt (R10, identifié 1N en rouge), que ceux fournis dans la trousse sous réserve d'utiliser un seul et même lot de ceux-ci au cours d'un même essai. Ces réactifs peuvent être utilisés avec d'autres produits de notre société. De plus, la solution de lavage (R2, identifié 20X en vert sur l’étiquette), peut être mélangée avec l’une des deux autres solutions de lavage inclues dans les différents kits réactifs Bio-Rad (R2, identifié 10X en bleu ou 10X en orange sur l’étiquette) correctement reconstituées, à condition qu’un seul mélange soit utilisé pour une même manipulation donnée. Contacter nos services techniques pour obtenir des informations détaillées. • Avant utilisation, attendre 30 minutes que les réactifs s'équilibrent à la température ambiante. • Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination. • Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de poussières qui pourraient altérer l'activité enzymatique du conjugué. • Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de préférence du matériel à usage unique. • Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du lavage et la distribution des réactifs. • La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ions métalliques. En conséquence, aucun élément métallique ne doit entrer en contact avec les différentes solutions contenant le conjugué ou la solution substrat. • La solution de révélation (tampon substrat + chromogène) doit être colorée en rose. L'apparition d'une autre coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé. • Pour cette préparation, utiliser de préférence des récipients et du matériel de distribution en plastique à usage unique ou de la verrerie préalablement lavée à l'acide chlorhydrique 1N, rincée à l'eau distillée et séchée. Conserver cette solution à l'abri de la lumière. • Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque sérum. • Le lavage des cupules est une étape essentielle de la manipulation : respecter le nombre de cycles de lavages prescrits, et s'assurer que toutes les cupules sont complètement remplies, puis complètement vidées. Un mauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects. • Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solution de révélation. 6 - CONSIGNES D’HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ Certains réactifs contiennent du ProClin™ 300 (0.04%, 0.1% et/ou 0.5%) R43 : Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau S28-37 : Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec Xi Irritant de l'eau et du savon. Porter des gants appropriés 5 • La trousse Monolisa™ Anti-HBs PLUS contient des composants d’origine humaine qui ont été testés et trouvés non-réactif en antigène de surface du virus de l’Hépatite B (VHB), en anticorps dirigés contre le virus de l’Hépatite C (VHC), et en anticorps dirigés contre les virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2). Cependant, aucune méthode ne peut garantir de façon absolue l’absence de virus VIH, Hépatites B ou C ou d’autres agents infectieux. Considérer ces réactifs, ainsi que les échantillons de patients, comme potentiellement infectieux et les manipuler avec les précautions d’usage. • Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons et les réactifs, ainsi que les solutions de lavage, comme des produits contaminés et les traiter comme tels. • Eviter les éclaboussures d'échantillons ou de solution les contenant. • Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs. • Ne pas "pipeter à la bouche". • Les échantillons, les réactifs d'origine humaine ainsi que le matériel et les produits contaminés seront éliminés après décontamination : - Soit par trempage dans de l'eau de javel à la concentration finale de 5% d'hypochlorite de sodium (1 volume d'eau de javel pour 10 volumes de liquide contaminé ou d'eau) pendant 30 minutes - Soit par autoclavage à 121°C pendant 2 heures minimum. L’autoclavage à 121°C, pendant une heure minimum, est le meilleur procédé d’inactivation des virus VIH et du virus de l’hépatite B. ATTENTION : NE PAS INTRODUIRE DANS L’AUTOCLAVE DE SOLUTIONS CONTENANT DE L’HYPOCHLORITE DE SODIUM. Les surfaces souillées seront nettoyées par de l'eau de javel diluée à 10%. Si le liquide contaminant est un acide, les surfaces souillées seront neutralisées au préalable avec du bicarbonate de soude, puis nettoyées à l'aide d'eau de javel et séchées avec du papier absorbant. Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un conteneur spécial pour déchets contaminés. • Ne pas omettre de neutraliser et/ou d'autoclaver les solutions effluents ou tout liquide contenant des échantillons biologiques avant de les jeter dans l'évier. • La fiche de données de sécurité est disponible sur demande. 7 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI • Eau distillée. • Hypochlorite de sodium (eau de javel) et bicarbonate de sodium. • Pipettes, multipipettes automatiques ou semi-automatiques, réglables ou fixes, pour mesurer et délivrer 10 µl à 200 µl, 1 ml, 5 ml, 10 ml. • Eprouvettes graduées 25 ml; 100 ml; 1 000 ml. • Conteneur de déchets contaminés. • Bain-marie ou incubateur de microplaques thermostaté à 37°C ± 1°C. • Dispositif de lavage manuel, semi-automatique ou appareil de lavage pour plaque de microtitration. • Appareil de lecture pour microplaques équipé de filtres 405 nm, 450 nm et 620 nm • Papier absorbant. • Gants • Containers propres en polypropylène pour la préparation du TMB 8 - PRÉPARATION DES RÉACTIFS Avant utilisation des réactifs de la trousse Monolisa™ Anti-HBs PLUS, les laisser s’équilibrer à température ambiante (18-30°C) pendant 30 minutes. 1) Réactifs prêts à l'emploi Microplaque (R1) Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionné en sachet scellé. Couper le sachet à l’aide de ciseaux ou scalpel 0,5 à 1 cm au-dessus de la soudure. Ouvrir le sachet et sortir le cadre. Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8°C. 6 Diluant échantillon (R6) Contrôle Négatif Anti-HBs (C0) Calibrateur 10 mUI/ml (C1) Calibrateur 100 mUI/ml - Contrôle Positif Anti-HBs (C2) Calibrateur 400 mUI/ml (C3) Calibrateur 1000 mUI/ml (C4) Homogénéiser les réactifs au vortex ou par retournement avant utilisation. 2) Réactifs à reconstituer Solution de lavage concentrée (20X) : R2 Diluer 20 fois la solution dans l’eau distillée. On obtient ainsi la solution de lavage prête à l’emploi. Prévoir 800 ml pour une plaque de 12 barrettes. Solution de conjugué (R7a + R7b) Amener le Diluant Conjugué (R7b) à la température du laboratoire. Mélanger par retournement le Diluant (R7b, Incolore à jaune pâle) et le Conjugué Anti-HBs (R7a, vert) avant utilisation. Pour chaque barrette à tester, diluer le réactif R7a dans le réactif R7b au 1/11e (exemple : 100 µl de Conjugué Anti-HBs (R7a) dans 1 ml de Diluant Conjugué (R7b) dans un tube de polypropylène propre). Utiliser la table comme guide. Mélanger doucement pour éviter la formation de mousse. La solution de conjugué doit être à l’abri de la lumière, lorsqu’elle est conservée à la température du laboratoire ou à +2-8°C. La solution de conjugué doit être verte. Elle est stable 8 heures à la température du laboratoire, et 24 heures si conservée à +2-8°C. La solution de conjugué peut être préparée en pipetant la totalité du flacon de Conjugué Anti-HBs (R7a) et en l’introduisant dans le flacon de Diluant Conjugué (R7b). Toujours mélanger par retournement la solution de travail juste avant utilisation. Immédiatement après utilisation, remettre le Conjugué Anti-HBs (R7a) au réfrigérateur. Afin d’éviter la contamination du conjugué, porter des gants propres et ne pas toucher les embouts de pipettes. Préparation de la solution de conjugué par barrette. Nombre de barrettes 1 à utiliser Quantité de Conjugué 100 Concentré (µl) R7a Quantité de Diluant 1 (ml) R7b * 1 plaque complète 2 3 4 5 6 7 8 9 200 300 400 500 600 700 800 900 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24** 1000 1100 1200 2400 10 11 12 24 ** 2 plaques complètes Solution de révélation enzymatique (R8 + R9) Amener le Chromogène (R9) et le Tampon substrat (R8) à la température du laboratoire. Mélanger par retournement le Chromogène (R9) et le tampon substrat (R8) avant utilisation. Diluer le réactif R9 dans le réactif R8 au 1/11ème (exemple : 1 ml de réactif R9 dans 10 ml de réactif R8) sachant que 10 ml sont nécessaires et suffisants pour traiter 12 barrettes. Homogénéiser. Mélanger doucement la solution de révélation enzymatique avant utilisation. Attendre 5 minutes avant utilisation. Cette solution doit être utilisée dans les 8 heures et conservée à la température ambiante à l’obscurité. Le Chromogène doit être rose. Toute autre couleur indique que le réactif a été contaminé : dans ce cas, il ne doit pas être utilisé. Ne préparer que la quantité de réactif à utiliser dans les 6 heures. S’assurer que le volume de réactif dilué sera suffisant pour la totalité de l’essai en cours. Utiliser la table comme guide. 7 Préparation de la solution de révélation enzymatique par barrette Nombre de barrettes à utiliser Quantité de Chromogène (µl) R9 Quantité de Tampon Substrat (ml) R8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 2 3 4 5 6 7 8 9 * 1 plaque complète 10 11 12* 24** 1000 1100 1200 2400 10 11 12 24 ** 2 plaques complètes 9 - CONSERVATION ET VALIDITÉ La trousse doit être gardée à +2-8°C. Chaque élément de la trousse conservé à +2-8°C peut être utilisé jusqu’à la date de péremption indiquée sur le coffret (sauf indication spécifique). • R1 : Après ouverture du sachet sous vide, les barrettes conservées à +2-8°C dans leur sachet d’origine, refermé avec soin, sont stables pendant 1 mois. • R2 : La solution de lavage diluée peut être conservée à +2-30°C pendant 2 semaines. La solution de lavage concentrée (R2) peut être conservée à +2-30°C. • R7a + R7b : La solution de conjugué doit être à l’abri de la lumière, lorsqu’elle est conservée à la température du laboratoire ou à +2-8°C. La solution de conjugué est utilisable pendant 8 heures à température ambiante (18-30°C) et pendant 24 heures si conservée à +2-8°C. • R8 + R9 : Après reconstitution, les réactifs conservés à l'obscurité sont utilisables pendant 6 heures à la température ambiante (18-30°C). Après ouverture tous les autres réactifs sont stables jusqu'à la date de péremption indiquée sur le coffret, si conservés à 2-8°C. 10 - ÉCHANTILLONS Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage. Les tests sont effectués sur des échantillons de sérum ou de plasma. Seuls les échantillons suivant ont été testés : sérum recueilli sur tubes standards ou contenant un gel séparateur, plasma recueilli sur EDTA ou héparine. En cas d’utilisation de plasma recueilli sur citrate ou ACD, les résultats obtenus sont inférieurs d’environs 20% à ceux obtenus sur sérum (collecté avec des anticoagulants comme l’EDTA et l’héparine). Les échantillons présentant des agrégats doivent être clarifiés par centrifugation avant d'être testés, en effet des particules ou agrégats de fibrine peuvent donner des résultats faussement positifs. Les échantillons seront conservés à + 2 - 8°C si le dépistage est effectué dans les 7 jours ou peuvent être conservés congelés à -20°C. Eviter les congélations/ décongélations répétées. Les échantillons ayant subi plus de 3 cycles de congélation/décongélation ne doivent pas être utilisés. Si les échantillons doivent voyager, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents étiologiques et les transporter préférablement congelés. REMARQUE : Aucune interférence n’a été mise en évidence sur des échantillons contenant jusqu’à 90 g/l d’albumine, et 100 mg/l de bilirubine, ainsi que sur des échantillons lipémiques contenant jusqu’à 36 g/l de triglycérides et sur des échantillons contenant jusqu’à 2,55 g/l d’hémoglobine. Ne pas utiliser des échantillons après traitement à 56°C pendant 30 minutes. 11 - MODE OPÉRATOIRE Suivre strictement le protocole proposé. Utiliser les sérums de contrôle négatif et positif à chaque mise en œuvre du test pour valider la qualité du test. Appliquer les bonnes pratiques de laboratoire. 8 Protocole 1. Etablir soigneusement le plan de distribution et d’identification des échantillons. 2. Amener tous les réactifs à la température du laboratoire avant la mise en œuvre du test. 3. Préparer la solution de conjugué (R7a+R7b), la solution de révélation enzymatique (R8+R9) et la solution de lavage diluée R2. 4. Sortir le cadre support et les barrettes (R1) de l’emballage protecteur. Enlever les barrettes non nécessaires à l’essai et les remplacer avec des barrettes vides. 5. Diluer les échantillons, calibrateurs et contrôles aux 3/4 dans le diluant échantillon R6 selon l’une des deux méthodes suivantes : a.Directement dans la cupule (ajouter 25 µl de diluant échantillon à chaque cupule puis 75 µl d’échantillon ou contrôle, mélanger par aspiration refoulement 2 fois, doucement pour éviter la formation de mousse). b.Avant addition dans les cupules (exemple : diluer 150 µl d’échantillon dans 50 µl de diluant échantillon, mélanger doucement pour éviter la formation de mousse, et transférer 100 µl dans la cupule). N.B.: Après addition de l’échantillon, le diluant va passer du pourpre au bleu. Il est possible de vérifier la présence de l’échantillon dans les puits par lecture spectrophotométrique à 620 nm (cf. Chapitre 14 : VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DES RÉACTIFS). 6. Déposer directement, sans prélavage de la plaque, successivement (plan de plaque suggéré), suivant la méthode choisie: Méthode Qualitative - Contrôle négatif Anti-HBs (C0) en A1, - Calibrateur 10 mUI/ml (C1) en B1, C1, D1, - Calibrateur 100 mUI/ml - Contrôle Positif (C2) en E1, - Echantillons en F1, G1, etc.… Méthode Quantitative - Contrôle négatif Anti-HBs (C0) en A1, - Calibrateur 10 mUI/ml (C1) en B1, C1, - Calibrateur 100 mUI/ml – Contrôle Positif (C2) en D1, - Calibrateur 400 mUI/ml (C3) en E1, - Calibrateur 1000 mUI/ml (C4) en F1, - Echantillons en G1, etc... En fonction du système utilisé, il est possible de modifier la position ou l’ordre de distribution des contrôles. 7. Couvrir si possible d'un film autocollant en appuyant bien sur toute la surface pour assurer l'étanchéité. 8. Incuber la microplaque 60 ± 5 minutes à 37°C ± 1°C. 9. Retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés et ajouter immédiatement dans chacune d'elles un minimum de 0,375 ml de solution de lavage. Respecter un temps de trempage (temps d'attente) minimum de 30 secondes et maximum de 60 secondes. Aspirer de nouveau. Répéter le lavage au moins 4 fois (soit un minimum de 5 lavages au total). Le volume résiduel doit être inférieur à 10 µl (si nécessaire sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant). 10. Si l'on dispose d'un laveur automatique, respecter le même cycle opératoire. . 11. Distribuer rapidement 100 µl de la solution de conjugué (R7a+R7b) dans toutes les cupules. Recouvrir, si possible, d'un film neuf et incuber sans attendre 60 ± 5 minutes à 37°C ± 1 °C. N.B.: Le conjugué est de couleur verte. Il est possible de vérifier la présence de conjugué dans les puits par lecture photométrique à 620 nm (cf. Chapitre 14 : VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DES RÉACTIFS). 12. Retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets contaminés et ajouter immédiatement dans chacune d'elles un minimum de 0,375 ml de solution de lavage. Respecter un temps de trempage (temps d'attente) minimum de 30 secondes et maximum de 60 secondes. Aspirer de nouveau. Répéter le lavage au moins 4 fois (soit un minimum de 5 lavages au total). Le volume résiduel doit être inférieur à 10 µl (si nécessaire sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant). 13. Si l'on dispose d'un laveur automatique, respecter le même cycle opératoire. 14. Distribuer rapidement dans toutes les cupules 100 µl de solution de révélation de l’activité enzymatique (R8+R9). Laisser la réaction se développer à l'obscurité pendant 30 ± 5 minutes à température ambiante (18 à 30°C). Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif. 9 N.B.: La solution de révélation est de couleur Rose. Il est possible de vérifier la présence de substrat dans les puits par lecture photométrique à 490 nm (cf. Chapitre 14 : VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DES RÉACTIFS). 15. Ajouter 100 µl de la solution d'arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de distribution que pour la solution de révélation. Homogénéiser le mélange réactionnel. 16. Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Attendre au moins 4 minutes après la distribution de la solution d'arrêt, et, dans les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique à 450/620-700 nm et 405/620-700 nm à l'aide d'un lecteur de plaques. S'assurer, avant la transcription des résultats, de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et d'identification des plaques et des échantillons. 12 - VALIDATION DES RÉSULTATS POUR LES MÉTHODES QUALITATIVES ET QUANTITATIVES La valeur seuil (Vs) correspond à la moyenne des DO mesurées pour le calibrateur 10 mUI/ml (C1). Pour le Contrôle Négatif (C0) L’absorbance mesurée doit être doit être supérieure à 0,000 et inférieure ou égale à 0,070 (0,000 < DOC0 ≤ 0,070). Pour le Contrôle Positif (C2) L’absorbance mesurée doit être supérieure ou égale à 0,400 (DOC2 ≥ 0,400). Pour les Contrôles Négatif (C0) et Positif (C2), si l’un des ces critères n’est pas observé dans les méthodes qualitative et quantitative, le test est invalidé et doit être recommencé. Pour le Calibrateur 10 mUI/ml (C1) L’absorbance mesurée doit être supérieure ou égale à 0,050 et inférieure ou égale à 0,200 (0,050 ≤ DOC1 ≤ 0,200). Chaque valeur d’absorbance mesurée doit être supérieure ou égale à 1,5 fois la valeur de la DO du contrôle Négatif C0 : DOC1 ≥ (1,5 x DOC0). Dans le cas de la méthode qualitative, si l’une des trois valeurs de DOC1 mesurée sort de l’échelle des valeurs de validation (la DOC1 mesurée doit être supérieure ou égale à 0,050 et inférieure ou égale à 0,200), la moyenne sera calculée à partir des deux valeurs restantes. Le test sera donc validé. Si plusieurs valeurs de DOC1 mesurées sortent de l’échelle des valeurs de validation, le test est invalidé et doit être recommencé. Dans le cas de la méthode quantitative, si l’une des deux valeurs de DOC1 mesurée sort de l’échelle des valeurs de validation (la DOC1 mesurée doit être supérieure ou égale à 0,050 et inférieure ou égale à 0,200), le test est invalidé et doit être recommencé. 13 - CALCUL ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS La présence ou l'absence des anticorps anti-HBs est déterminée en comparant pour chaque échantillon l'absorbance enregistrée à celle de la valeur seuil calculée. 1. Méthode Qualitative Calculer la moyenne des absorbances mesurées pour le calibrateur 10 mUI/ml (C1) Exemple : Calibrateur 10 mUI/ml C1 B1 0,078 C1 0,079 D1 0,089 Somme = 0,246 Moyenne DOC1 = 0,246 / 3 = 0,082 Si l’une des valeurs de DOC1 mesurée sort de l’échelle des valeurs de validation (la DOC1 mesurée doit être supérieure ou égale à 0,050 et inférieure ou égale à 0,200), la moyenne sera calculée à partir des deux valeurs restantes. Calcul de la valeur seuil (Vs) La valeur seuil correspond à la moyenne des DO mesurées pour le calibrateur 10 mUI/ml (C1) : Vs = Moyenne DOC1 10 Interprétation des résultats Les échantillons dont la densité optique mesurée est supérieure ou égale à la valeur seuil sont considérés comme initialement réactifs. Les échantillons dont la densité optique mesurée est inférieure à la valeur seuil sont considérés nonréactifs. Ceux dont la densité optique mesurée est supérieure à la limite supérieure de détection du lecteur devront être considérés comme réactifs. REMARQUES : En raison de la diversité des anticorps et de la diversité des antigènes utilisés dans chaque test, les résultats obtenus peuvent être différents selon le test utilisé. Stratégies de vaccination : différentes recommandations sont proposées selon les régions et les pays concernés. En cas de changement de méthode d’analyse au cours d’un suivi de vaccination, le taux d’anticorps anti-HBs doit être déterminé en parallèle par les deux méthodes pendant une période transitoires. 2. Méthode Quantitative Afin de déterminer la concentration en anticorps Anti-HBs des échantillons (sérum ou plasma), les calibrateurs C0 (0 mUI/ml), C1(10 mUI/ml), C2 (100 mUI/ml), C3 (400 mUI/ml) et C4 (1000 mUI/ml) doivent être utilisés. Les calibrateurs sont déposés directement dans chaque cupule, sans prélavage de la plaque, successivement comme indiqué dans le protocole (cf. Chapitre 10 : MODE OPÉRATOIRE : Méthode Quantitative). Lire la densité optique à 450/620-700 nm à l’aide d’un lecteur de plaque. Pour les échantillons dont l’absorbance mesurée à 450 nm (A450) est supérieure ou égale à celle du Calibrateur 400mUI/ml C3 (A450 ≥ DOC3), lire la densité optique à 405/620-700 nm. L’absorbance mesurée à 450 nm (A450) pour les 4 calibrateurs C0, C1, C2 et C3, est reportée graphiquement en fonction de leur concentration respective suivant une régression polynomiale d’ordre 2. L’A450 du calibrateur C4 (1000 mUI/ml) ne peut pas être utilisée sur ce graphique, la valeur d’absorbance pouvant être en dehors des limites de détection du lecteur, d’où la nécessité du deuxième graphique. Les échantillons dont les D.O. mesurées sont inférieures à la D.O. du C3 sont interprétés avec la courbe établie à 450 nm. L’absorbance mesurée à 405 nm (A405) pour les calibrateurs C3 (400 mUI/ml) et C4 (1000 mUI/ml) est reportée graphiquement en fonction de leur concentration respective, point par point. Une droite reliant ces points est tracée. La concentration en anticorps Anti-HBs (mUI/ml) de chaque échantillon peut ainsi être lue à l’intersection de la valeur d’absorbance mesurée. Cette courbe d’absorbance à 405 nm est utilisée pour déterminer la concentration en anticorps Anti-HBs des échantillons (sérum ou plasma) dont la valeur est supérieure à 400 mUI/ml et inférieure ou égale à 1000 mUI/ml. Les échantillons dont la concentration en anticorps anti-HBs est supérieure à 1000 mUI/ml peuvent être dilués en utilisant la solution de lavage (R2 dilué) et re-testés. 14 - VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DES RÉACTIFS (OPTIONNEL) VÉRIFICATION DU DÉPÔT DU DILUANT (R6) ET DES ÉCHANTILLONS Après ajout de l'échantillon, le diluent R6 vire du violet au bleu. La présence simultanée du diluant R6 et de l’échantillon ou du contrôle peut être vérifiée par une lecture spectrophotométrique à 620 nm : la valeur de DO mesurée pour chaque cupule devra être supérieure ou égale à 0,150 (une valeur se situant en dessous de cette norme indique une mauvaise distribution de l’échantillon ou du contrôle). VÉRIFICATION DU DÉPÔT DE LA SOLUTION DE CONJUGUÉ (R7a + R7b) La solution de conjugué (R7a + R7b) est de coloration verte. La présence de la solution de conjugué dans les cupules peut être vérifiée par lecture spectrophotométrique à 620 nm : la valeur de DO mesurée pour chaque cupule devra être supérieure ou égale à 0.070 (une valeur se situant en dessous de cette norme indique une mauvaise distribution de la solution de conjugué). VÉRIFICATION DU DÉPÔT DE LA SOLUTION DE RÉVÉLATION (R8 + R9) La solution de révélation est de couleur rose. Il est possible de vérifier la présence de la solution de révélation rosée par lecture automatique à 490 nm : une cupule contenant la solution de révélation doit avoir une densité optique supérieure à 0,100 (une DO plus faible indique une mauvaise distribution de la solution de révélation) Il y a une 11 différence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de révélation rosée. 15 - LIMITES DU TEST • Le protocole et l’interprétation des résultats doivent être respectés lors de l’analyse d’échantillons de sérum ou de plasma pour la détection d’anticorps anti-HBs. Il est conseillé, pour chaque utilisateur de ce kit, de lire attentivement la notice avant de commencer toute manipulation. Plus particulièrement, le protocole concernant la distribution des échantillons et des réactifs, les étapes de lavage ainsi que les étapes d’incubation doit être scrupuleusement suivi. • Une mauvaise distribution des échantillons ou des réactifs peut induire des résultats faussement négatifs. Il est conseillé de re tester les échantillons pour lesquels un doute subsiste dans le suivi du protocole. • Les facteurs pouvant affecter la validité des résultats sont : une mauvaise distribution des échantillons dans les cupules, une étape de lavage des cupules inefficace, des températures ou des temps d’incubation incorrects, l’ajout de mauvais réactifs dans les cupules, la présence de métaux ou d’eau de javel dans les cupules. • En raison de la variabilité des réponses immunologiques d’un individu à un autre, aussi bien après une infection par le virus de l’Hépatite B que suite à une vaccination ou à une injection d’immunoglobulines thérapeutiques, il est recommandé d’interpréter avec précaution les résultats en basse valeur. 16 - PERFORMANCES Les performances analytiques ci-dessous ont été obtenues lors d’évaluations du test Monolisa™ Anti-HBs PLUS. Les résultats obtenus au laboratoire peuvent différer de celles-ci. 1. Intra-série Cinq échantillons positifs et un négatif ont été testés 10 fois en triplicate dans la même série Echantillon Anti-HBs Négatif Anti-HBs Positif ~ 20 mUI/ml Anti-HBs Positif ~ 50 mUI/ml Anti-HBs Positif ~ 100 mUI/ml Anti-HBs Positif ~ 150 mUI/ml Anti-HBs Positif ~ 300 mUI/ml Moyenne DO 0.023 0.143 0.358 0.715 1.231 1.982 DS 0.003 0.005 0.012 0.019 0.037 0.048 CV% 13.6 3.4 3.3 2.6 3.0 2.4 2. Inter-série 3 échantillons positifs et un négatif ont été testés en duplicate et deux fois par jour pendant 20 jours selon la procédure EP5 NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) Echantillon Anti-HBs Négatif Anti-HBs Positif ~ 20 mUI/ml Anti-HBs Positif ~ 150 mUI/ml Anti-HBs Positif ~ 300 mUI/ml Moyenne DO 0.023 0.146 1.284 2.015 DS 0.004 0.008 0.060 0.067 CV% 15.5 5.5 4.9 3.6 3. Justesse de la technique Les résultats quantitatifs sont donnés en mUI/mL calibrés à la préparation internationale de référence : 1st IRP WHO Reference Standard 1977. Une étude de corrélation a été réalisée en testant les concentrations de 0, 10, 100,400 et 1000 mUI/mL obtenues par dilution du standard international WHO versus les calibrateurs fournis dans la trousse. Le coefficient de corrélation ainsi que la pente de la droite de corrélation obtenue sont R2 =0,99 et a= 0,96. 4. Sensibilité analytique ( = Limite inférieure de détection qui correspond à la concentration mesurable d’analyte la plus faible distincte de zéro calculée à partir des moyennes et des déviations standards obtenues sur les point 0 et 10 mIU/ml) : Elle a été obtenue inférieure à 2 mUI/ml. 12 5. Linéarité de la méthode 5 échantillons fortement positifs en anti-HBs (titre 924 mUI/ml, 330mUI/ml, 326 mUI/ml, 544 mUI/ml et 857 mUI/ml) ont été testés non dilués, ainsi qu’à différents taux de dilution (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 et, pour certains, 1/64). Les pourcentages de recouvrement sont compris entre 92% et 116%. 6. Domaine de mesure Le domaine de mesure se situe entre 2 et 1000 mUI/ml, il est défini par la limite inférieure de détection et le maximum de la courbe de référence. Les titres situés au-dessous de la limite de détection sont exprimés de la manière suivante : < 2,00 mUI/ml, et les titres situés au-dessus du domaine de mesure de la manière suivante : > 1000 mUI/ml. 7. Effet crochet 4 échantillons non dilués dont les concentrations en Anticorps anti-HBs ont été évaluées à 200000 mUI/ml, 5500 mUI/ml, 28000 et 9000 mUI/ml ont été testés. Concentration 200000 mUI/ml 28000 mUI/ml 9000 mUI/ml 5500 mUI/ml DO 450 Lire à 405 nm Lire à 405 nm Lire à 405 nm Lire à 405 nm DO 405 1.342 1.596 1.629 1.310 Résultat >1000 mUI/ml > 1000 mUI/ml > 1000 mUI/ml > 1000 mUI/ml Aucun effet crochet n’a été mis en évidence durant l’évaluation des performances. 8. Spécificité a) Un échantillonnage de 179 sérums de patient atteint des pathologies suivantes a été testé hépatite A, hépatite C, VIH1, VIH2, HTLV, HSV, EBV, Rubéole, Toxoplasmose, Myélome (IgG, IgM), RF, ANA, HAMA, Cirrhose et multitransfusion. 21 échantillons ont été trouvés positifs avec Monolisa™ Anti-HBs PLUS et avec deux autres tests de détection des anti-HBs marqués CE. 1 échantillons ANA positif a présenté une réactivité avec le seul test Monolisa™ 2 autres échantillons, 1 HIV1 et 1HIV2, ont présentés une réactivité avec Monolisa™ et un test concurrent. b) La spécificité du test a été déterminée à partir d’échantillons de donneurs de sang et de patients hospitalisés pris au hasard Site 1 Donneurs et hospitalisés Site 2 Donneurs Site 3 Hospitalisés TOTAL 511 300 240 1051 3 0 3 6 99.4% 100% 98.7% 99.4% Nb échantillons Nb Positifs % Spécificité La spécificité est de 99.4% (98.8% - 99.8% avec un intervalle de confiance de 95%). 9. Sensibilité 654 échantillons provenant de différentes populations de patients vaccinés ou infectés naturellement ont été testés avec le test Monolisa™ Anti-HBs PLUS et un autre test anti-HBs. Les discordants ont été testés avec une troisième technique marquée CE Concordance Monolisa™ Profil Patients N Test 1 marqué Test 2 marqué* Vaccinés 347 98.8% 99.1% Hépatite B résolue 71 95.8% 100% Hépatites B chronique 37 100% Non testé Patients hospitalisés 199 98.6% Non testé Total 654 98.5% 99.5% Parmi ces 654 patients testés, 617 ont été trouvés positifs en anti-HBs et 37 négatifs (patients atteints d’hépatite chronique) avec le test 1. Pour ces 617 patients, la concordance est de 98,4% (intervalle de confiance 95%, 97% - 99,2%). *La sensibilité du test évaluée, après résolution des discordants avec le test 2, est égale à 99,2% (intervalle de confiance 95%, 98.1% - 99,7%). 13 17 - RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Lai CL, Ratziu V, Yuen M-F, Poynard T: Viral hepatitis B. Lancet 362 : 2089-2094, 2003. 2. Maddrey WC: Hepatitis B : an important public health issue. J Med Virol 61: 362-366, 2000. 3. Delmonico FL, Snydman DR: Organ donor screening for infectious diseases. Transplantation 65 : 603-610, 1998. 4. Centers for Disease Control : Recommendations for preventing transmission of infections among chronic hemodialysis patients. MMWR 50 (No. RR-5): 1-43, 2001. 5. Tiollais P, Pourcel C, Dejean A : The hepatitis B virus. Nature 317: 489-495, 1985. 6. Lee WM: Hepatitis B infection. New Engl J Med 337 : 1733-1745, 1997. 7. Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, McGrath LC, Decker RH, Overby LR Interpretation of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 76: 773-777, 1981. 8. McMahon BJ, Alward WLM, Hall DB, et al.: Acute hepatitis B infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis 151: 599-603, 1985. 9. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM: Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis 11: 73-83, 1991. 10. Centers for Disease Control: Hepatitis B vaccination—United States, 1982-2002. MMWR 51(No. 25): 549-563, 2002. 11. Yu AS, Cheung RC, and Keefe EB : Hepatitis B vaccines. Clin Liver Dis 8: 283-300, 2004. 12. Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AHWM : 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J Immunoassay 2 : 187-204, 1981. 13. Garner RC, Walpole AL, Rose FL : Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1 : 39-42, 1975. 14. Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, Ebert JW : Inactivation of hepatitis B virus by intermediateto-high-level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol 18: 535-538, 1983. 15. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Solid Waste : EPA Guide for Infectious Waste Management, Washington D.C., 1987. (USG PO 530-SW-86-014). 16. Sehulster LM, Hollinger FB, Dreesman GR, Melnick JL : Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl and Envi Microbiol 42 : 762767, 1981. 14 (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) CE ( 98/79/CE in vitro ) (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ) - For in vitro diagnostic use Pour diagnostic in vitro Para diagnóstico in vitro Per uso diagnostico in vitro In-vitro-Diagnostikum Para uso em diagnóstico in vitro In vitro-diagnostik In vitro diagnose in vitro (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ) - Manufacturer Fabricant Fabricante Produttore Hersteller Fabricante Tillverkad av Fremstillet af (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ) - Batch code Code du lot Código de lote Codice del lotto Chargen-Bezeichnung Código do lote Batchnr Batchkoden CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) IVD Do stosowania in vitro in vitro diagnostikai Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra In vitro diagnostiliseks kasutamiseks Na diagnostiku in vitro Pro diagnostiku in vitro (NO) - Til in vitro-diagnostikk (RO) - Pentru diagnostic in vitro (BG) - За ин витро диагностика Producent Gamintojas Gyártó Tootja Výrobca Výrobce (NO) - Produsent (RO) - Producător (BG) - Производител Numer serii Serijos numeris Gyártási szám Partii kood Číslo šarže Číslo šarže (NO) - Partikode (RO) - Număr de lot (BG) - Партиден номер (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ) - Catalogue number - Référence catalogue - Número de catálogo - Numero di catalogo - Bestellnummer - Número de catálogo - Katalognummer - Katalognummer - - Numer katalogu - Katalogo numeris - Cikkszám - Katalooginumber - Katalógové číslo - Katalogové číslo (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ) - Authorised Representative Représentant agréé Representante autorizado Distributore autorizzato Bevollmächtigter Representante Autorizado Auktoriserad representant Autoriseret repræsentant (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ) - Expiry date YYYY/MM/DD Date de peremption AAAA/MM/JJ Estable hasta AAAA/MM/DD Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG Verwendbar bis JJJJ/MM/TT Data de expiração AAAA/MM/DD Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD YYYY/MM/DD (NO) - Katalognummer (RO) - Număr de catalog (BG) - Каталожен номер Upoważniony Przedstawiciel Įgaliotasis atstovas Meghatalmazott Képviselő Volitatud esindaja Autorizovaný zástupca Zplnomocněný zástupce (NO) - Autorisert representant (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Упълномощен представител Data ważności YYYY/MM/DD Galioja iki YYYY/MM/DD Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP Použiteľné do RRRR/MM/DD Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - 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