Étude de la capacité de fragments d`ADN promoteurs à cibler l

Transcription

AGROCAMPUS RENNES
65 rue de Saint Brieuc
35042 RENNES Cedex
INRA SCRIBE
Campus de Beaulieu
Bâtiment 16A
35042 RENNES Cedex
Mémoire de fin d’études
Pour l’obtention du
« Diplôme d’Agronomie Approfondie » (DAA)
Spécialisation Halieutique
Étude de la capacité de fragments d’ADN
promoteurs à cibler l’expression de transgènes
dans les gonades de poisson (in vivo)
Présenté par :
Maître de Stage :
DUBOIS Cyrille
LAREYRE Jean-Jacques
Soutenu le :
10 Septembre 2007
« Les analyses et les conclusions de ce travail d’étudiant n’engagent que la responsabilité
de son auteur et non celle d’Agrocampus RENNES et de l’INRA SCRIBE »
AGROCAMPUS RENNES
65 rue de Saint Brieuc
35042 RENNES Cedex
INRA SCRIBE
Campus de Beaulieu
Bâtiment 16A
35042 RENNES Cedex
Pour l’obtention du
« Diplôme d’Agronomie Approfondie » (DAA)
Spécialisation Halieutique
Étude de la capacité de fragments d’ADN
dans les gonades de poisson (in vivo)
Présenté par :
DUBOIS Cyrille
Soutenu le :
10 Septembre 2007
Devant le Jury
Mme VALLET Virginie ..............................................., INSERM.
Mme OMBREDANE Dominique....…………………...., Agrocampus RENNES
M. LE BRIS Hervé ……………………………………., Agrocampus RENNES.
M. SABATIÉ Richard ………………………………...., Agrocampus RENNES.
M. LAREYRE Jean-Jacques (Maître de stage) ........, INRA SCRIBE.
« Les analyses et les conclusions de ce travail d’étudiant n’engagent que la
responsabilité de son auteur et non celle d’Agrocampus RENNES et de l’INRA SCRIBE »
Pôle : Halieutique
Spécialisation : Sciences Halieutiques et
Aquacoles
Enseignant Responsable du stage:
Cadre réservé à la Bibliothèque Centrale
FONTENELLE Guy, LE BRIS Hervé
Auteur(s) : DUBOIS Cyrille
Organisme d’accueil : INRA - SCRIBE
Adresse complète : Campus de Beaulieu –
Bâtiment 16A – 35042 Rennes Cedex
Année de soutenance : 2007
Tél : 02-23-48-59-28
Titre du mémoire :
Fax : 02-23-48-50-20
Étude de la capacité de fragments d’ADN Courriel : [email protected]
Maître de stage : M LAREYRE Jean-Jacques
dans les gonades de poisson in vivo.
Fonction : Chargé de recherche
Résumé :
Le contrôle de la puberté chez les poissons est un enjeu économique important en aquaculture tant pour
l’amélioration de la compétitivité des piscicultures que pour la protection de la biodiversité et de l’environnement. Les
travaux engagés au laboratoire visent à mieux comprendre les mécanismes moléculaires intragonadiques impliqués dans
la régulation de la spermatogenèse. Des approches de génomique expressionnelle ont permis d’identifier des gènes
différentiellement exprimés au cours de l’initiation de la spermatogenèse. Une approche par transgenèse a été initiée au
laboratoire pour mieux comprendre la fonction de ces gènes in vivo chez les poissons. Cette démarche nécessite de
disposer de fragments d’ADN promoteurs capables de surexprimer un transgène inhibant ou exacerbant la fonction du
gène cible spécifiquement dans la gonade. L’objectif de ce stage était de participer à la mise au point des protocoles et de
la démarche permettant de produire des vecteurs de transgenèse destinés à identifier des fragments d’ADN promoteur
ciblant l’expression d’un transgène dans la gonade de poissons. Des régions promotrices potentielles de gènes
spécifiquement exprimés dans la gonade (amh, gsdf1, sycp3) ont pu être isolées à partir de l’ADN génomique de zébrafish
et insérées en amont d’un cadre de lecture codant pour une protéine fluorescente facilement détectable et sans effet sur
l’organisme. Après vérification par restriction et séquençage, la fonctionnalité de ces gènes chimériques a été testée par
transfection transitoire dans une lignée cellulaire mammalienne (COS-7) et sur des cellules de testicules de truite. Des
constructions contenant le promoteur ubiquiste du gène cmv ont également été produites et utilisées comme contrôle
positif pour les transfections. Aucune fluorescence significative n’a été détectée par observation directe dans les cellules
transfectées avec les constructions contenant les promoteurs amh, gsdf1 et sycp3. Cependant, après microinjection dans la
cellule œuf de zébrafish et médaka, une activité promotrice a pu être mise en évidence pour les fragments issus des gènes
amh et gsdf1.
Abstract :
Puberty control in fish is important for the competitiveneness of the fish farms and for the conservation of the
biodiversity and the environment. The laboratory aims to better understand the intragonadal molecular mechanisms
involved in the regulation of spermatogenesis onset. Functional genomics approaches allowed us to identify differentially
expressed genes during spermatogenesis onset. The use of the transgenesis technique is being developed in the laboratory
to better understand the functional relevance of these genes in vivo. This approach requires the use of promoter DNA
fragments able to overexpress a transgene inhibiting or increasing the function of the targetted genes specifically in the
gonad. The goal of the training stay was to participate to the improvement of the protocols and methods allowing the
production of transgenesis vectors designed to identify promoter DNA fragments targeting transgene expression to the
gonad in fish (amh, gsdf1, sycp3). Potential promoter DNA fragments of genes specifically expressed in the gonad were
isolated from zebrafish genomic DNA and inserted upstream the reporter reading frame encoding a fluorescent protein,
detectable easily and without any effect on the organism. After restriction mapping and DNA sequencing analysis, the
functional activity of the chimeric constructs was first tested by transient transfection assays in a mammalian cell line
(COS-7) and in trout testicular cells. Other constructs harboring the ubiquitous cmv promoter were generated and used as
positive controls. No significant fluorescence was observed in presence of the chimeric constructs containning the amh,
gsdf1 and sycp3 promoters. Nevertheless, after microinjection into egg-cell of zebrafish and medaka, a promoter activity
was demonstrated for the constructs carrying the DNA fragments belonging to the amh and gsdf1 genes.
Mots clés :
Spermatogenèse, vecteurs de transgenèse, zébrafish, médaka, gonade, expression spécifique.
Diffusion du mémoire
à remplir par l’auteur avec le maître de stage.
Aucune confidentialité ne sera prise en compte si la durée n’en est pas précisée.
Préciser les limites de la confidentialité
(1)
:
Consultable sur place :
5 oui non
Reproduction autorisée :
5 oui non
Prêt autorisé :
5 oui non
Confidentialité absolue :
(Ni consultation, ni prêt)
oui 5 non
Durée de la confidentialité (2) : aucune
Fiche de résumé du mémoire de fin d’études :
Résumé diffusable :
5 oui non
Si oui, l’auteur complète l’autorisation suivante :
Je soussigné(e)
DUBOIS Cyrille
, propriétaire des
droits de reproduction dudit résumé, autorise toutes les sources
bibliographiques à le signaler et le publier.
Date : 1er septembre 2007
Signature :
Rennes, le 1er Septembre 2007
Le Maître de stage (3), LAREYRE Jean-Jacques
L’auteur, DUBOIS Cyrille
L’Enseignant responsable (3), FONTENELLE Guy
(1) L’administration, les enseignants et les différents services de documentation d’Agrocampus
Rennes s’engagent à respecter cette confidentialité.
(2) La durée maximale de confidentialité est fixée à 10 ans.
(3) Signature et cachet de l’organisme.
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier Monsieur LEBAIL Pierre-Yves, Directeur de l’unité
INRA-SCRIBE pour m’avoir accueilli au sein de son établissement lors de la durée de mon
stage.
J’adresse ensuite des remerciements tout particuliers à Monsieur LAREYRE JeanJacques, mon maître de stage, d’abord pour avoir permis d’effectuer mon stage sous sa
direction et ensuite, pour son encadrement sans faille, ses explications, sa patience infinie, et
surtout pour la liberté et la confiance qu’il m’a accordé dans la conduite de mon stage et la
réalisation des expériences. Grâce à cela, j’ai réalisé que le chemin de la recherche
fondamentale était sinueux et non dénué d’embûches…
Je tiens également à remercier Madame SAMBRONI Elisabeth, pour sa bonne humeur
et sa disponibilité lorsque les ennuis de laboratoire survenaient, Mesdames CORVAISIER
Maryse et GIRARD Agnès pour leur disponibilité lors des fastidieuses recherches
bibliographiques à divers moment du stage.
Un grand merci à Madame LEGAC Florence, pour son regard critique, conseils sur le
projet scientifique et le temps passé à la relecture du manuscrit.
Il convient aussi de remercier les collaborateurs de la plate-forme de Gif-sur-Yvette
pour le temps passé sur nos constructions. Notamment Messieurs SOHM Frédéric et JOLY
Jean-Stéphane.
Un merci particulier à BERGÉ Muriel, stagiaire de l’IUT de Toulouse, pour son gros
coup de main dans la conduite des expériences liées au projet, pour les délires lors des
nombreuses gaffes de manip’ et pour sa gentillesse.
Je remercie également tous les gens du SCRIBE qui m’ont, à différents moments et
sous différentes formes, apportés leur soutien et m’ont permis d’avancer ainsi que pour leur
sympathie... catalyseur efficace dans la réussite de ce stage,
Et finalement un clin d’œil à tous les stagiaires de « l’aquarium », pour leur
enthousiasme, leur entraide et leur bonne humeur: notamment Cédric, Pierrick, Juliette,
Maxime…
C.D.
SOMMAIRE
DIFFUSION DU MEMOIRE
REMERCIEMENTS
SOMMAIRE
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
I- INTRODUCTION : CONTEXTE ÉCONOMIQUE ET SCIENTIFIQUE.................................................. 1
1- CONTEXTE SOCIO-ECONOMIQUE: ..................................................................................................................... 1
2- CONTEXTE SCIENTIFIQUE :............................................................................................................................... 2
3- PRESENTATION DU STAGE ................................................................................................................................ 2
4- PRESENTATION DU MEMOIRE : ......................................................................................................................... 3
II- NOTIONS BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................................................... 4
1- LA SPERMATOGENESE, PROCESSUS DE PRODUCTION DE GAMETES MALES ....................................................... 4
a- Le déroulement de la spermatogenèse ........................................................................................................ 4
b- Notion de compartiments ............................................................................................................................ 5
c- Aspects de la régulation de la spermatogenèse : un procédé à voies multiples.......................................... 7
2- MECANISMES DETERMINANT L’EXPRESSION TISSU- ET CELLULE- SPECIFIQUE DES GENES DANS LA GONADE ... 7
3- LES METHODES DE TRANSFERT DE GENES ET DE DETECTION DE LEUR EXPRESSION .......................................... 9
a- Principe de la transgenèse : ....................................................................................................................... 9
b- Les différentes méthodes de transfert de gène .......................................................................................... 10
c- Avantages et inconvénients des méthodes de transgenèse, choix de la méthode retenue.......................... 10
d- Choix du gène rapporteur......................................................................................................................... 12
III- OBJECTIFS CIBLES DE L’ETUDE : ...................................................................................................... 13
IV- MATERIEL ET METHODE : .................................................................................................................... 14
1- MATERIEL...................................................................................................................................................... 14
2- METHODE ..................................................................................................................................................... 15
a- Vérification de la tissu spécificité des gènes d’intérêt .............................................................................. 15
b- Identification et analyse in silico de la région susceptible de contenir le promoteur du gène d’intérêt... 15
c- Extraction d’ADN génomique de zébrafish............................................................................................... 17
d- Amplification des régions promotrices par PCR sur ADN génomique..................................................... 18
e- Insertion des fragments d’ADN promoteurs potentiel dans les vecteurs de transgenèse.......................... 18
f- Vérification moléculaire des constructions ............................................................................................... 20
g- Vérification de la fonctionnalité des vecteurs par transfection ................................................................ 20
h- Transgenèse par microinjection au stade cellule œuf............................................................................... 21
i- Vérification fonctionnelle : observation des effets du promoteur in vivo .................................................. 21
V- RESULTATS :................................................................................................................................................ 22
1- SELECTION DES GENES D’INTERET ................................................................................................................. 22
2- « IDENTIFICATION » DES REGIONS PROMOTRICES IN SILICO ........................................................................... 23
3- EXTRACTION D’ADN GENOMIQUE................................................................................................................. 24
4- PRODUCTION DES VECTEURS DE TRANSGENESE ............................................................................................. 25
a- Amplification des régions promotrices d’intérêt....................................................................................... 25
b- Clonage des régions promotrices dans les vecteurs ................................................................................. 25
c- Vérification par séquençage ..................................................................................................................... 27
d- Vérification par transfection transitoire sur cellules COS ....................................................................... 27
e- Révélation de l’expression des ARNm rétrotranscrits de GFP issus des cellules COS ............................. 28
5- VERIFICATION PAR TRANSGENESE IN VIVO DE LA FONCTIONNALITE DES VECTEURS ....................................... 29
VI- DISCUSSION, PERSPECTIVES................................................................................................................ 31
VII- CONCLUSIONS, ACQUIS DU STAGE................................................................................................... 36
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
RESUME/ABSTRACT
37
LISTES DES ABREVIATIONS
11-KT : 11-kétotestostérone
17α 20β DHP : 17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3one
A/C/T/G : Adenine/Cytosine/Thymine/Guanine
ADN
: Acide Désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
AMH : Anti-Mullerian Hormone (Hormone
antimüllérienne)
ANR : Agence Nationale de la Recherche
ARN : Acide Riboucléique
ARNm : ARN messager
BAC : Bacterial Artificial Chromosome
BET
: Bromure d’ethidium
CMV : CytoMégaloVirus
CNRS : Centre National de Recherche
Scientifique
Da
: Dalton
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
dNTP : desoxy-Nucleotide Tri-Phosphate
DO
: Densité Optique
E2
: 17β-estradiol
EDTA : Acide Ethylène Diamine Tetra-Acétique
EST
: Expressed Sequence Tag
FAO
: Food and Agriculture Organization
FSH
: Follicular Stimulating Hormone
GH
: Hormone de croissance
GnRH : Gonado libérine
GSDF : Gonadal Soma-Derived growth Factor
GtH-1/-2: Gonadotropin Hormone 1-2
hCG
: human Chorionic Gonadotropin
IGF
: Insuline Growth Factor
INSERM : Institut National Supérieur de
l’Enseignement et de la Recherche en
Médecine
Kb
: Kilo Bases
LH
: Hormone luteinisante
LMGT : Liposome Mediated Gene Transfer
Mo.
: Million
mosm : milliosmole
N.B
: Nota Bene
(ne)GFP : (nuclear enhanced) Green Fluorescent
Protein
pb (mer): Paires de bases
PBS
: Phosphate Buffer Saline
PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PGC
: Primordial Germinal Cells
pVT-eGFP : Plasmide Vecteur de transgenèse
portant la protéine eGFP
pVT-Venus : Plasmide Vecteur de transgenèse
portant la protéine Vénus
REL
: Réticulum Endoplasmique Lisse
RFSH : Récepteur à la FSH
rpm
: rotation par minute
RT
: Reverse Transcription
SCRIBE: Station Commune de Recherche en
Ichtyophysiologie, Biodiversité et
Environnement
SDS
: Sodium Dodécyl Sulfate
SIT
: Site d’Initiation de la Traduction
SMGT : Sperm Mediated Gene Transfer
SPI/ SPII : Spermatocyte I/II
SPS
: Spematogenesis Preventig Substance
SPT
: Spermatide
SPZ
: Spermatozoïde
SRP
: Sexualité et Reproduction des Poissons
SVF
: Sérum de Veau Fœtal
SYCP3 ou 1 : Synaptonemal Complex Protein 3 ou
1
T
: Testostérone
TAE
: Tris-Acétate-EDTA
TGF-β : Transforming Growth Factor β
Tm
: melting Temperature
UA
: Unité Arbitraire
UTR
: UnTranslated Region
UV
: Ultra Violet
ZP-2/-3 : Protéine de la zone pellucide
’ ou min.: minute
’’ ou s : seconde
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
Figures :
Figure 1 : Evolution de la production de la pêche mondiale de 1950 à 2005. ....................................................... 1
Figure 2 : Description des différentes étapes de la spermatogenèse. ..................................................................... 4
Figure 3 : Schéma des différents compartiments testiculaires chez le poisson téléostéen...................................... 5
Figure 4 : Figure récapitulative de quelques cascades de régulation endocrine et paracrine dans le processus de
la spermatogenèse chez les poissons téléostéens. ................................................................................................... 7
Figure 5 : Figure illustrant les résultats d’études ayant porté sur le promoteur du gène vasa chez nos espèces
modèles. .................................................................................................................................................................. 7
Figure 6 : Schéma récapitulatif du principe général de la méthode..................................................................... 13
Figure 7 : Schéma récapitulant deux types de structure des extrémités 5’ des gènes........................................... 17
Figure 8 : Figure récapitulative du principe du protocole Gateway® ................................................................. 19
Figure 9 : Profil d’expression des gènes sélectionnés dans le cycle spermatogenétique et dans la cellule cible..22
Figure 10 : Étude phylogénétique des membres de la superfamille TGF-β.......................................................... 23
Figure 11 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 1% par électrophorèse de l’expression des ARNm rétrotranscrits des différents tissus de zébrafish pour le gène sycp3............................................................................. 23
Figure 12 : Représentation graphique de la localisation de trois motifs conservés en séquence et position au
cours de l’évolution dans la région promotrice du gène gsdf1.............................................................................. 24
Figure 13 : Résultat d’extraction de l’ADN génomique. ...................................................................................... 24
Figure 14 : Produits d’amplification des PCR. .................................................................................................... 25
Figure 15 : Photographie (sous UV) de la migration sur gel d’agarose 1% de la restriction des vecteurs de
transgenèse.. ......................................................................................................................................................... 26
Figure 16 : Résultats des transfections dans des cellules COS............................................................................. 27
Figure 17 : Illustration du résultat de la transfection sur cellule COS des constructions contenant la portion
pGSDF1. ................................................................................................................................................................ 28
Figure 18 : Activité transcriptionnelle du promoteur potentiel du gène amh de truite chez le zébrafish. ............ 29
Figure 19 : Activité transcriptionnelle du promoteur potentiel du gène gsdf1 de zébrafish chez zébrafish .......... 30
Figures en Annexe
Figure 20 : Illustration des différences de structures testiculaires : ...................................................................... 3
Figure 21 : Évolution d’un tubule testiculaire au cours d’un cycle de reproduction chez la truite arc-en-ciel
mâle......................................................................................................................................................................... 4
Figure 22 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 1% de la PCR sur différents ADNg de zébrafish en
présence des primers de 1Kb de SYCP1. ................................................................................................................. 8
Figure 23 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 1% de la PCR sur différents ADNg de zébrafish (quantité
de matrice croissante) en présence des primers de 1Kb de SYCP1......................................................................... 8
Figure 24 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 1% de la PCR sur l ADNg de zébrafish (CR-3) (quantité
de matrice croissante) en présence des primers de 1Kb de FGF-6 & SYCP1......................................................... 9
Figure 25 : Schéma récapitulatif des deux expériences pour déterminer la quantité optimale de matrice d’ADNg
à insérer. ................................................................................................................................................................. 9
Figure 26 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 1% par électrophorèse de l’expression des ARNm rétrotranscrits des différents tissus de zébrafish pour les gène amh, rfsh, gsdf1, sycp1. et témoin d’efficacité de la RTPCR : p27 (note : vasa non effectué). ................................................................................................................... 11
Figure 27 : Séquences correspondantes aux motifs conservés présentés en Figure 12........................................ 12
Figure 28 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 1% de l’extraction par PCR du promoteur du gène sycp3
avant et après la purification au TE/PEG............................................................................................................. 13
Figure 29 : Photographie (sous UV) de la migration sur gel d’agarose 1% de la restriction des vecteurs de
transgenèse intermédiaires (dans pDONR™221)................................................................................................. 14
Figure 30 : Chromatogramme issu de la sortie brute du séquençage du promoteur du gène amh. ..................... 16
Figure 31 : Comparaison entre les séquences du promoteur AMH de truite attendu et le résultat de séquençage
corrigé de pAMH-eGFP-SP6 illustré grâce au logiciel BIOEDIT. ...................................................................... 17
Figure 32 : Illustration du résultat de la transfection sur cellule COS des constructions contenant la portion
pAMH & pSYCP3 .................................................................................................................................................. 18
Figure 33 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 2% de la RT-PCR sur les ARNm issus des cellules COS
transfectées avec les constructions pVT-AMH-neGFP et pVT-AMH-Vénus......................................................... 18
Figure 34 : Schéma récapitulatif DETAILLE du protocole GATEWAY® ............................................................. 21
Figure 35 : Schéma récapitulatif des 3 principales étapes intervenant dans une PCR ........................................ 22
Figure 36 : Principe de la PCR ancrée................................................................................................................. 22
Figure 37 : Matériel de PCR et de séquençage .................................................................................................... 24
Figure 38 : Schéma du principe de la Reverse transcription................................................................................ 25
Figure 39 : Photographie de la cuve à électrophorèse......................................................................................... 26
Figure 40 : Photographie de l’appareil Nanodrop® ND-1000 Spectrophotometer utilisé pendant l’étude. ........ 26
Figure 41 : Matériel pour la microinjection ......................................................................................................... 31
Figure 42 : Annotations des portions d’intérêt pour l’étude des plasmides utilisés ............................................. 35
Figure 43 : Images DCI de zébrafish vivant à différents stades de développement.............................................. 41
Figure 44 : Organigramme de la Station INRA SCRIBE...................................................................................... 42
Tableaux
Tableau 1 : Liste (non exhaustive) d’études ayant porté sur l’analyse de fragments 5’ et 3’ flanquantes de gènes
ciblant préférentiellement la gonade....................................................................................................................... 7
Tableau 2 : Tableau récapitulant quelques études comparatives de méthodes de transfert de gène et leur
principale conclusion............................................................................................................................................ 11
Tableau 3 : Tableau dressant une liste des principaux avantages et inconvénients des méthodes de transfert de
gènes présentées.................................................................................................................................................... 11
Tableau 4 : Tableau récapitulatif de la taille des fragments d’ADN promoteur. ................................................. 24
Tableau 5 : Tableau récapitulatif des résultats des alignements entre la séquence théorique du promoteur extrait
et le résultat des séquençages d’une extrémité des constructions......................................................................... 27
Tableaux en Annexe:
Tableau 6 : Tableau récapitulatif des gènes sélectionnés, localisés sur le génome.............................................. 10
Tableau 7 : Récapitulation des tailles de bande attendues pour la recherche de la tissu spécificité.................... 10
Tableau 8 : Liste (non exhaustive) des facteurs de transcription qui ont été impliqués dans l’expression cellulespécifique de gènes exprimés dans la gonade ....................................................................................................... 12
Tableau 9 : Tableau de résultats bruts retraçant le nombre de colonies obtenues en fonction la quantité de
solution de recombinaison insérée dans le milieu réactionnel pour le promoteur du gène rfsh........................... 13
Tableau 10 : Tableau récapitulatif des tailles attendues pour les restrictions sur les plasmides issus de la
première recombinaison........................................................................................................................................ 14
Tableau 11 : Tableau récapitulatif des tailles attendues pour les restrictions sur les plasmides issus de la
deuxième recombinaison....................................................................................................................................... 15
Tableau 12 : Tableaux récapitulatifs des amorces utilisées pendant cette étude.................................................. 20
Tableau 13 : Tableau récapitulatif des tampons de restriction). .......................................................................... 34
Tableau 14 : Tableau récapitulatif des enzymes de restrictions (endonucléases) utilisées dans l’étude avec les
séquences correspondantes................................................................................................................................... 40
Tableau 15 : Caractéristiques des protéines fluorescentes codées par les vecteurs de transgénèse. ................... 42
I- Introduction
: Contexte Économique et Scientifique
1- Contexte socio-économique:
D
epuis le début des années 1960, on a pu remarquer une diminution des ressources
halieutiques, qui s’accélère depuis les deux dernières décennies et ce, bien que la
production ne cesse d’augmenter. (Internet: FAO, Figure 1). Aussi, il est maintenant
acquis que certaines ressources sont surexploitées. L’espace naturel a atteint un palier
d’exploitation et ne peut plus pourvoir, aux besoins à venir de l’alimentation humaine d’une
part, et au renouvellement de certaines espèces, (dans une optique de maintien de la
biodiversité marine et d’eau douce), d’autre part. Face à ces constats, l’espoir repose
maintenant sur le développement des filières aquacoles pour pouvoir répondre à la demande,
sans cesse croissante, en produits aquatiques. Celle-ci représente déjà près de 40% de la
provision mondiale en poisson (toutes origines confondues), et n’a cessé d’augmenter surtout
depuis 1990 (Figure 1).
Poids (en million de tonnes)
Evolution de la production de la pêche mondiale
Figure 1 : Evolution de la
production de la pêche mondiale
de 1950 à 2005. Depuis les
années 90, on voit que la part
des ressources marines stagne
entre 80 et 85 Mo. de tonnes,
tandis que la part des ressources
aquacoles ne cesse d’augmenter.
D’après les statistiques de la
FAO disponibles sur Internet
(Internet: FAO) (N.B : Ces
statistiques tiennent compte des
statistiques chinoises).
160
140
Part de l'aquaculture
120
Pêche mondiale
100
80
60
40
20
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
19
5
19
5
19
6
19
6
19
7
19
7
19
8
19
8
19
9
19
9
20
0
20
0
0
Depuis maintenant quelques dizaines d’années, une partie de la recherche
fondamentale oriente ses études sur la compréhension des grandes fonctions de différentes
espèces de poisson d’élevage et notamment, la fonction de reproduction. Une des espèces sur
laquelle l’INRA travaille fait partie des 14 espèces représentant à elles seules près de 85% de
la production aquacole terrestre dans le Monde (Internet: FAO) : la truite arc-en-ciel
(Oncorhynchus mykiss). L’enjeu de ces études est de comprendre quels sont les mécanismes
mis en jeu dans la régulation de la gamétogenèse, et ceci dans deux optiques :
¾ D’un côté, il s’agit d’améliorer la compétitivité des élevages et la qualité des produits.
En effet, le fait de pouvoir maîtriser la fonction de reproduction pour l’obtention de géniteurs
sexuellement matures tout au long de l’année, serait une option pour le renouvellement des
stocks d’alevins en écloserie, voire dans le milieu naturel. Dans une optique diamétralement
opposée, il serait avantageux de pouvoir disposer de poissons d’élevage stériles. Certaines
pratiques actuelles, tel que l’élevage de populations monosexes femelles triploïdes stériles,
sont mal acceptées par certains consommateurs européens, en raison notamment des
pollutions occasionnées par le rejet dans l’eau de stéroïdes sexuels. La mise à disposition
d’individus stériles, ou à maturité limitée répond à une double problématique réconciliant
l’agronomie et l’environnement. D’une part, il s’agit de favoriser l’obtention plus rapide de
poissons de grande taille, commercialement intéressants. En effet, il est désormais bien
démontré que la fonction de reproduction est généralement délétère aux performances de
croissance et à la qualité organoleptique de la chair des poissons en fin de cycle sexuel
-1-
(surtout chez les salmonidés) (Le Gac et al., 1996). De plus, le problème lié à la maturation
sexuelle est d’autant plus aigu que la domestication des espèces en élevage avance l’âge de la
puberté des animaux, en particulier chez les mâles. Par exemple, chez le bar (Dicentrarchus
labrax) (autre espèce piscicole d’intérêt), la maturation précoce des mâles à un an entraîne
une baisse de 20 à 40% de la croissance chez le mâle à 2 ans (âge nécessaire pour atteindre la
taille commerciale).
¾ D’un autre côté, et d’un point de vue de la protection de l’environnement et du
maintien de la biodiversité, il semble important de posséder des techniques pour prévenir
toute reproduction d’espèces aquacoles allochtones, ou génétiquement sélectionnées avec la
(ou les) population(s) naturelles(s) préexistante(s) (préconisation Européenne). D’autre part,
la maturation sexuelle augmentant la sensibilité des animaux aux maladies, l’échappement
d’animaux d’élevage sexuellement matures constitue un risque potentiel pour le transfert de
pathogènes aux populations naturelles.
2- Contexte scientifique :
Au sein du groupe de recherche, les études des mécanismes impliqués dans la
régulation de la gamétogenèse sont focalisées sur le mâle. Bien que l’implication des
médiateurs de l’axe gonadotrope semble bien établie dans le contrôle spermatogenétique chez
les vertébrés, il demeure des zones d’ombres quant aux facteurs testiculaires paracrines qui
relayent leurs actions. Il est attendu qu’une meilleure connaissance de ces réseaux de
régulation paracrine pourrait permettre de développer de nouvelles méthodes alternatives pour
le contrôle des cycles de reproduction, et/ou de la qualité des gamètes. C’est donc dans ce
contexte que va s’orienter l’étude réalisée pendant mon stage.
3- Présentation du stage
La Station Commune de Recherche SCRIBE (Ichtyophysiologie, Biodiversité et
Environnement) qui dépend du département « Physiologie animale et systèmes d'élevage » de
l’INRA, est mobilisée dans des recherches à finalités piscicoles visant plus particulièrement la
diversification et l'amélioration de la compétitivité des élevages de poissons tout en restant
dans un contexte de développement durable respectueux du Bien-Être animal, de la
biodiversité et de l'environnement. Cette unité regroupe 4 équipes de recherches (ANNEXE
10-D), dont 3 se préoccupent de physiologie des poissons (Adaptation, Croissance,
Reproduction).
L’équipe Reproduction des Poissons, focalise son effort de recherche à la
compréhension et la maîtrise de la fonction de reproduction qui repose, selon les espèces de
poissons considérées, sur la connaissance d'une ou plusieurs des étapes du cycle de vie, de la
différenciation du sexe à la production et à la cryoconservation de gamètes et d’embryons de
qualité. Aussi, l'équipe « Reproduction des poissons » est subdivisée en 5 groupes de travail
travaillant en synergie mais axés sur les 5 thématiques suivantes :
Déterminismes physiologiques de la différenciation sexuelle de la gonade.
Physiologie testiculaire et puberté chez le mâle.
Régulations de l'ovogenèse liées à la qualité des œufs de poisson.
Cryoconservation des génomes et la régénération des poissons.
Impact des polluants chimiques de l'environnement sur la reproduction des poissons.
Mon stage s’inscrit plus particulièrement dans le programme SPERMGEN financé par
l’ANR (Agence Nationale de la Recherche) et mené par le groupe « Physiologie testiculaire et
puberté », en collaboration avec d’autres équipes de recherche de l’INRA, du CNRS et de
-2-
l’INSERM (U625). Ce programme a pour ambition d’identifier et de mieux comprendre les
réseaux de médiateurs moléculaires intragonadiques impliqués dans la régulation de la
gamétogenèse mâle chez les vertébrés. Dans cette optique, une analyse comparée des gènes
régulant la spermatogenèse chez la truite, les rongeurs et l’Homme, est proposée. Une analyse
des variations du transcriptome1 testiculaire au cours de la spermatogenèse est conduite chez
la truite et permet d’identifier des gènes différentiellement exprimés au cours de certaines
étapes clés de la spermatogenèse et d’en étudier leur régulation (Mazurais et al., 2005).
L’enjeu est désormais de démontrer l’impact réel de ces gènes sur le déroulement de la
spermatogenèse. En absence d’un modèle approprié de spermatogenèse in vitro, la fonction
des gènes sera analysée in vivo par transgenèse. Cette approche nécessite de disposer de
fragments d’ADN promoteurs2 permettant de cibler dans la gonade l’expression de
transgènes inhibant ou surexprimant la fonction du gène d’intérêt.
L’objectif ultime est de disposer d’un panel d’outils moléculaires (vecteurs de
transgenèse) permettant l’étude in vivo de la fonction de gènes impliqués dans la régulation de
la spermatogenèse.
4- Présentation du mémoire :
Étant donné la singularité de ce stage, très orienté vers la recherche fondamentale pour
une formation d’ingénieur agronome généraliste, la présentation de ce rapport se veut
volontairement didactique de façon à ce qu’il soit comprit aussi bien par un lecteur non averti,
qu’un scientifique du domaine. Aussi, certaines notions essentielles au discours sont détaillées
dans le corps du rapport, tandis que d’autres sont laissées en annexe. Je conseille au lecteur
non averti, pour qui la connaissance des principes et la mise en œuvre de certaines techniques
serait complètement inconnue, de se reporter aux annexes qui expliquent certains de ces
éléments plus basiques. La partie bibliographique de forme très « académique » n’a pas pour
objectif de faire un point exhaustif sur les connaissances des notions abordées mais de dresser
un tour d’horizon général des notions essentielles à la compréhension du projet.
1
Le transcriptome est l'ensemble des ARN exprimé dans un tissu cellulaire ou d'un type de cellule donné.
POSTULAT : La région promotrice d’un gène sera définie ici comme étant la région minimale d’ADN située
en amont du site d’initiation de traduction et permettant la transcription du gène d’intérêt dans le tissu cible.
2
-3-
II- Notions
bibliographiques
1- La Spermatogenèse, processus de production de gamètes mâles
La spermatogenèse est le processus biologique permettant, à partir de cellules souches
germinales diploïdes, de produire chez un individu mâle, un grand nombre de cellule très
différenciées haploïdes, mobiles et ayant acquis le pouvoir de féconder un ovocyte : les
spermatozoïdes.
a- Le déroulement de la spermatogenèse
Figure 2 : Description
des différentes étapes de
la
spermatogenèse.
L’enchaînement
des
différents
types
cellulaires de la lignée
germinale mâle au cours
de la Spermatogenèse
est présenté en relation
avec le contenu en ADN
(en unité arbitraire).
(SPI : Spermatocyte I;
SPII : Spermatocyte II;
SPT :
Spermatide;
SPZ : Spermatozoïde).
(Modifié
d’après
Internet: Vacheret).
La différenciation de cellules germinales mâles hautement spécialisées à partir de
cellules souches s’effectue très progressivement au cours de différents cycles de division et de
différentes étapes de transformations morphologiques et biochimiques (Figure 2).
L’amplification du nombre de gamètes commence par des divisions mitotiques des cellules
germinales et se termine par les divisions méiotiques. Avant la puberté, les spermatogonies
souches, parfois appelées cellules germinales primordiales chez les poissons, prolifèrent
lentement au sein de la gonade et génèrent une catégorie de cellules germinales encore non
orientée vers la spermatogenèse active: les spermatogonies A. Au moment de la maturation
sexuelle, ces cellules germinales prolifèrent plus rapidement, par mitoses successives, et
génèrent des cellules filles définitivement engagées dans la transformation en gamètes,
désignées spermatogonies B chez les poissons. Ces cellules prolifèrent par division
mitotiques. Le nombre maximal de divisions est fixe pour une espèce donnée : (ex. 6 chez
Oncorhynchus mykiss). Au terme de ces divisions mitotiques, les nouvelles cellules
deviennent des spermatocytes primaires (SPI), qui initient la première division de méiose
dite réductionnelle. À ce stade, les cellules restent diploïdes mais ont dupliqué leur matériel
génétique (2 chromatides restant accolées par chromosomes). C’est lors de cette étape que le
matériel génétique peut être échangé entre chromatides homologues par recombinaison
homologue (crossing over), au niveau des chiasmas. La première division de méiose génère
des cellules contenant un lot de chromosomes dupliqués: ce sont les spermatocytes
secondaires (SPII). Une dernière division, dite équationnelle, conclut la méiose et donne des
cellules haploïdes appelées spermatides (SPT). Au terme d’une phase de différenciation
morphologique et biochimique appelée spermiogenèse, les spermatides vont acquérir des
-4-
ultrastructures très particulières, tels que le flagelle, pour former les spermatozoïdes (SPZ),
gamètes mâles caractérisés par une tête (avec ou sans acrosome selon les espèces de
vertébrés), une pièce intermédiaire (riche en mitochondries), et un flagelle. Les
spermatozoïdes sont libérés dans le canal efférent de la gonade (spermiducte) pour former le
sperme.
b- Notion de compartiments
Le processus de multiplication et de différenciation des cellules germinales se déroule
dans des tubes séminifères bordés de cellules somatiques particulières appelées cellules de
Sertoli. L’ensemble de ces tubes forme le compartiment germinal et offre aux cellules
germinales un environnement approprié unique, étroitement contrôlé et protégé du système
immunitaire. Les autres cellules somatiques de la gonade forment le compartiment interstitiel.
Le compartiment germinal
Les cellules de la lignée germinale (décrites précédemment) sont en contact direct
avec un seul type de cellules somatiques appelées cellules de Sertoli (Figure 3). Ces cellules
reposent sur une lame basale et établissent entre elles des jonctions serrées pour former la
paroi luminale sélective des tubes séminifères. L’ensemble des tubes séminifères (qui se
rejoignent au niveau du spermiducte), forme le compartiment germinal. Outre leur utilité dans
la structure des tubes séminifères, plusieurs autres fonctions ont été attribuées aux cellules de
Sertoli, notamment une fonction de nutrition des cellules germinales, ou encore une fonction
d’élimination par phagocytose des spermatozoïdes non éjaculés (Billard et al., 1972). Chez les
poissons, les cellules de Sertoli englobent une cellule germinale pour former la paroi de
spermatocystes, sorte d’enveloppes cellulaires au sein desquelles un clone de cellules
germinales se multiplie et se différencie de manière synchrone.
Figure 3 : Schéma des
différents compartiments
testiculaires
chez
le
poisson
téléostéen
(modifié d’après Billard
et al., 1982 par Vizziano
et al., 2007).
Le compartiment interstitiel
Le compartiment interstitiel est formé par le tissu séparant les tubules séminifères. Le
tissu interstitiel est complexe car il comprend plusieurs types cellulaires. Les cellules de
Leydig sont impliquées dans la production de la grande majorité des stéroïdes sexuels de
l’organisme. Ces stéroïdes sexuels, dont la nature varie au cours du stade de maturation
gonadique, sont des facteurs endocrines et paracrines de régulation de la gamétogenèse. Les
autres types cellulaires du tissu interstitiel sont les cellules myoïdes, les cellules endothéliales
des capillaires irriguant la gonade, et les terminaisons nerveuses.
-5-
Facteurs externes
Température –
Photopériode –
Facteurs sociaux –
Hypothalamus
Facteurs internes
– Facteurs de croissance
GnRH
GH
Hypophyse
Hormones
Gonadotropes
Compartiment
germinal
GtH-1
?
Sécrétion
d’IGF-1
de
Cholestérol
Prolifération des
gonies
gènes
Cellules de Leydig
Compartiment
interstitiel
T
Hormones
Stéroïdiennes
Sexuelles
11-KT
Exemples
Spermatogenèse
E2
Spermiogenèse
Sécrétion
d’AMH
Stéroïdogenèse
Sécrétion
d’activine B
17α 20DHP
Figure 4 : Figure récapitulative de quelques cascades de régulation endocrine et paracrine
dans le processus de la spermatogenèse chez les poissons téléostéens (détaillés en ANNEXE
2). Les flèches rouges montrent une voie inhibitrice, les vertes, activatrices. Les flèches en
pointillé notent les voies pas encore bien comprises. Dans l’hypophyse, les ronds blancs
signifient les cellules somatotropes, les noires les cellules gonadotropes.
Sécrétion
ZP-2 ZP-3
-7-
Renouvellement des
cellules souches
Cellules de Sertoli
PCNA
32kDa
36kDa
Maturation
GtH-2
Exemples de facteurs intrinsèques
Lumière du tubule
Aussi la spermatogenèse, et les éléments cellulaires qui l’accompagnent, semble
conservé chez tous les vertébrés (Le Gac et al., 1999 ; Miura et al., 1998). Néanmoins, ses
modalités et notamment son organisation spatio-temporelle peut-être différente d’un vertébré
à l’autre. Nous ne pouvons pas détailler toutes ces modalités ici (Grier et al., 1981). Quelques
illustrations de ces différences sont données en ANNEXE 1.
c- Aspects de la régulation de la spermatogenèse : un procédé à voies multiples
Bien que de nombreux facteurs soient impliqués dans la régulation de la
spermatogenèse chez les vertébrés, notre connaissance des interactions moléculaires reste
encore limitée. Ces facteurs ont des origines diverses et agissent soit par voie endocrine (les
hormones gonadotropes, stéroïdiennes), soit par voie paracrines. Ces régulations font
intervenir des facteurs sécrétés par les cellules de Sertoli susceptibles de réguler les phases de
prolifération ou de différenciation des cellules germinales (par la voie de l’amh, …), ou des
protéines intrinsèques des cellules germinales impliqué dans les mitoses ou les modifications
morphologiques. La Figure 4 (p.7), présente une récapitulation de quelques voies de
régulation de la spermatogenèse établies chez les poissons. Des précisions quant aux
différences recherches menées sur les voies de régulation sont présentées en ANNEXE 2.
La connaissance des molécules mises en jeu lors de la régulation paracrine reste
limitée à de rares espèces de poissons : chez l’anguille notamment, pour laquelle quelques
cascades de régulation très précises ont étés établies. Il reste cependant à déterminer dans
quelle mesure la généralisation des connaissances à d’autres modèles est possible.
2- Mécanismes déterminant l’expression tissuet cellule- spécifique des gènes dans la
gonade
De nombreux gènes exprimés dans la gonade présentent un profil d’expression tissuet cellule-spécifique très marqué. Étant donné que les cellules de la lignée germinale sont
restreintes à la gonade chez l’adulte, il n’est pas surprenant qu’un nombre important de ces
gènes soit localisé dans ces cellules (vasa (Braat et al., 2000), sycp1 et sycp3 par exemple).
Cependant, des gènes exprimés spécifiquement dans les cellules somatiques de la gonade ont
également été décrits (exemple gsdf1, amh et rfsh). Les mécanismes moléculaires qui
déterminent l’expression spatio-temporelle des gènes dans la gonade sont encore mal compris,
et ce, malgré leur importance dans la régulation de processus physiologiques aussi ciblés que
la méiose ou la spermiogenèse.
Plusieurs études reposant sur le transfert de gènes chimériques chez des animaux
transgéniques ont montré que les régions régulatrices nécessaires pour l’expression cellulaire
spécifique résidaient principalement dans les régions 5’ et 3’ flanquantes des gènes (Tableau
1).
-6-
Nom gène
Espèce origine
Espèce Hôte
Taille du fragmt
Gène
rapporteur
Cellule cible
Stade d'expression
vasa/ olvas
Oryzias latipes
Onchoryncus
mykiss
Danio rerio
Drosophilia
melanogaster
Oryzias latipes
Onchoryncus
mykiss
Danio rerio
Drosophilia
melanogaster
5'=5,1 + 3'=0,6
eGFP
PGC
6 j. post-injection
5'=4,7 + 3'=1,5
eGFP
PGC
5'=8,5 + 3'=2,3
eGFP
eGFP / vas
antiserum
PGC
vasa
Mus musculus
Mus musculus
?
Cre
?
?
Gallardo et al., 2007
amh
Homo sapiens
Mus musculus
5' = 3,6
Cre-recomb
Sertoli
20 j.
Lecureuil et al., 2002
rfsh
Homo sapiens
Mus musculus
5' = 1,5
Asp567Gly
SpermatocystesSpermatides -Cerveau
7 j.
Nordhoff et al., 2003
rlh
Myotis blythii
Mus musculus
5' = 2,1
E.coli β-GAL
Leydig - Cerveau
5 semaines
gata4
Rattus
(norvegicus?)
Mus musculus
5' = 118pb
GFP
prégranulosa, granulosa,
cellules ovariennes de la
thèque, Sertoli, Leydig,
cellules testiculaires
péritubulaires
-
pem
Mus musculus
Mus musculus
5' = 0,6 => 0,3
eGFP
Sertoli
pendant Stade IV-VIII
6 j. post-partum
Haspin / gsg2
Mus musculus
Mus musculus
5' = 193pb
eGFP
testis
-
Tokuhiro et al., 2007
cathepsin L
Rattus
(norvegicus?)
Mus musculus
5' = 3,0
LacZ
Sertoli
pendant Stades VI-VIII
-
Charron et al., 2003
vasa/pvasa
vasa/vas
vasa/vas
5' = 2,6 => 40pb
-
Référence
Tanaka et al., 2001
2,5 j. après fertilisation Yoshizaki et al., 2000
24h post injection
Krovel et al., 2002
stade X de l'ovogenèse Sano et al., 2002
Hamalainen et al., 1999
Guittot et al., 2007
Rao et al., 2003
Tableau 1 : Liste (non exhaustive) d’études ayant porté sur l’analyse de fragments 5’ et 3’
flanquantes de gènes ciblant préférentiellement la gonade (PGC : Primordial Germinal Cells).
On peut noter que parmi les promoteurs de ces gènes chez les mammifères, celui du
gène vasa a été des particulièrement étudié chez les poissons : chez la truite (Oncorhynchus
mykiss) mais aussi chez les espèces modèles, médaka (Oryzias latipes) (Figure 5B) (Tanaka et
al., 2001) et zébrafish (Danio rerio) (Figure 5 E-F) (Krovel et al., 2002).
Figure 5 : Figure illustrant les résultats d’études ayant porté sur le promoteur du gène vasa chez
nos espèces modèles. B : vue dorsale de médaka au 1er jour d’incubation (Tanaka et al., 2001) ;
E-F : Embryon de 24h et larve de 5 jours de zébrafish (Krovel et al., 2002). Les flèches montrent,
la position des cellules germinales primordiales exprimant le GFP sous contrôle du promoteur
du gène vasa.
-8-
À ce jour, aucun autre promoteur de gène ciblant une expression dans la gonade n’a
été décrit chez les poissons. Aussi, le but de notre étude est de trouver des gènes connus pour
s’exprimer dans la gonade chez d’autres ordres animaux, puis d’en chercher l’homologue3
chez nos espèces modèles. Ainsi, parmi les plus intéressants, on peut citer le gène de
l’hormone antimüllérienne (amh), ou les gènes codant pour les récepteurs FSH (rfsh) et LH
(rlh) dont l’étude des voies de régulation pouvait laisser penser que ce gène avait de
l’importance dans la spermatogenèse. Par ailleurs, L’expression de ces protéines ayant été
détectée au niveau cérébral, on pouvait s’attendre à avoir une expression non seulement dans
la gonade mais également dans les tissus cérébraux. D’autres gènes moins connus peuvent se
révéler être des gènes à bon potentiel pour notre étude : comme gata4, le gène codant pour la
cathepsinL, … Il faut également mentionner que si des études ont d’ores et déjà été réalisées
chez les promoteurs de l’amh ou vasa, aucune étude n’a, à ce jour, à notre connaissance, porté
son intérêt sur les promoteurs de gènes de sycp1, sycp3 ou gsdf1, ce que nous proposons de
faire. Aussi, comme nous l’avons d’ores et déjà mentionné, la complexité de la fonction de
reproduction est à la mesure du nombre de gènes qui la régule. On ne peut pas dresser une
liste exhaustive des gènes qui pourraient être impliqués dans cette régulation mais, cette partie
nous renseigne également sur l’importance des régions promotrices des gènes pour
l’adressage du message porté par le gène.
Outre l’importance des régions 5’ flanquantes au gène, d’autres études ont montré que
l’information permettant l’adressage pouvait résider aussi dans les régions intragéniques
(gata1) et/ou 3’ flanquantes des gènes (gata1, vasa) (Wakabayashi et al., 2003, Yoshizaki et
al., 2000). Dans tous les cas, cette information est codée sous la forme de modules constitués
de petits motifs d’ADN (de 4 à 20pb environ) appelés « éléments de régulation cis » ou
« éléments de réponse », sur lesquels se fixent les facteurs de transcription. La formation d’un
complexe de transcription efficace dépendra de la combinaison appropriée et coordonnée dans
le temps de ces facteurs de transcription, dont certains ont une distribution cellulaire et
temporelle limitée. Ainsi le fragment promoteur du gène gata4 qui cible l’expression d’un
transgène dans les cellules de Sertoli de souris transgéniques contient des sites de liaison
conservés, pour des facteurs ubiquitaires de la famille Sp1, mais aussi pour des facteurs dont
l’expression cellulaire est plus restreinte comme SF1 (cellules de Leydig, de Sertoli, ou de la
surrénale) ou USF2 (cellules de Sertoli). L’expression temporelle du gène sox9 est déterminée
par l’expression transitoire du gène sry. Un certain nombre de facteurs de transcription qui ont
été impliqués dans l’expression cellule-spécifique de gènes exprimés dans les cellules de
Sertoli sont répertoriés en ANNEXE 3-F.
3- Les méthodes de transfert de gènes et de détection de leur expression
a- Principe de la transgenèse :
La transgenèse est une méthode indispensable pour étudier le fonctionnement des
gènes ainsi que leur rôle dans l’expression des grandes fonctions biologiques. Elle consiste à
introduire une molécule d’ADN exogène (transgène) dans un embryon au stade une cellule
pour permettre son intégration dans le génome de l’individu. Les mécanismes de cette étape
d’insertion restent encore mal compris. L’insertion interviendrait au niveau de cassure
aléatoire de l’ADN et ferait intervenir les enzymes de réparation de l’ADN. Vieille d’une
vingtaine d’année, se cache derrière ce mot un panel de techniques dont nous allons détailler
3
: En biologie de l’évolution, une homologie désigne une similarité entre deux traits (en général anatomiques)
observés chez deux espèces différentes, qui est due au fait que toutes deux l’ont hérité d’un ancêtre commun. Ces
traits sont alors dits homologues. (Définition, Encyclopérie en ligne Wikipédia®).
-9-
les principales étapes avant d’en déterminer les avantages et les inconvénients pour notre
étude, afin de sélectionner la plus pertinente.
b- Les différentes méthodes de transfert de gène
Loin de dresser ici une liste exhaustive de toutes les méthodes existantes, nous allons
voir quelles sont les plus usitées chez les poissons.
o L’électroporation est une méthode qui utilise une série de courts chocs électriques
pour rendre la membrane de la cellule œuf perméable et ainsi permettre au transgène de
pénétrer la cellule (Sarmasik, 2003). Il a été reporté une efficacité certaine de cette méthode
pour transférer différents transgènes de tailles différentes chez le médaka (Oryzias latipes)
(Hostetler et al., 2003).
o La méthode SMGT (Sperm Mediated Gene Transfer) est une méthode voisine de
l’électroporation. Le sperme préalablement mis au contact d’une solution contenant l’ADN à
introduire, est soumis à un choc électrique qui permet l’introduction de l’ADN dans le
gamète. Une fois cette étape réalisée, il est procédé à la fécondation de l’œuf (Sin et al.,
2000).
o Bien qu’elle n’ait été que récemment testée chez les poissons (chez la dorade (Sparus
sarba), (Lu et al., 2002)), la technique de lipofection (ou LMGT pour Liposome Mediated
Gene Transfer), est une autre possibilité pour la transgenèse. Elle consiste à encapsuler
l’ADN à transférer dans des liposomes. Cette solution est ensuite injectée dans la gonade de
l’individu parent avant la fécondation. Une méthode apparentée sur les cellules germinales
primordiales nommée Cell-mediated gene transfer a été testée chez le zébrafish mais est
toujours en cours de développement (Fan et al., 2002).
o L’utilisation de rétrovirus pour la transgenèse se révèle être un procédé très efficace.
Il repose sur la capacité des virus à transmettre à une ou plusieurs cellules une copie de son
ADN qui sera rétro-transcrit par l’équipement enzymatique de la cellule infectée. Ainsi, en
intégrant dans le génome d’un virus la séquence transgénique, on peut avoir intégration de la
portion d’intérêt (transposon) dans la cellule cible. Cette méthode peut également être utilisée
ante fécondation, en transférant le transposon dans le gamète mâle (Kurita et al., 2004).
L’intérêt de procéder à la transgenèse avant la fécondation permet de diminuer le
mosaïcisme4 (mais pas de l’annuler) (Jesuthasan et al., 2002).
o La dernière méthode, très utilisée chez les poissons, est la microinjection (au stade 1
cellule ou gamète). Elle consiste à injecter grâce à une fine aiguille, une solution contenant
une grande quantité de plasmide possédant la séquence à intégrer dans la cellule cible
(Gilmour et al., 2002). Cette méthode a été perfectionnée en co-injectant des enzymes de
restriction rares (Sce-I), avec le plasmide contenant des séquences de restriction
correspondantes (I-SceI) de part et d’autre du fragment à insérer. Ceci permet d’augmenter
significativement le nombre d’individus transgéniques capables de transmettre le transgène à
leur descendance (Thermes et al., 2002).
c- Avantages et inconvénients des méthodes de transgenèse, choix de la méthode retenue
Des études comparatives ont été réalisées pour essayer de classer les méthodes en
terme d’efficacité (5). Ainsi, le tableau suivant résume les principaux résultats pour des études
portant sur les espèces de poisson.
4
Le mosaïcisme désigne le fait que l’individu porte à la fois les cellules exprimant le gène et des cellules non.
Les critères d’efficacité: le nombre d’animaux transgéniques utilisés, le moment d’insertion, (qui conditionne
le chimérisme et la transmission à la descendance), la stabilité du transgène et la variabilité d’expression.
5
- 10 -
Méthodes comparées
Espèce cible Gène utilisé
Conclusion
Référence
Même efficacité dans l'expression du
Zébrafish
Linney et al., 1999
eGFP
Microinjection vs Rétrovirus
transgène.
(Danio rerio)
Avec les transposons Tol2 ou Sleeping
Zébrafish
Beauty, meilleurs taux d’intégration et de
Microinjection vs Rétrovirus
eGFP
Kawakami, 2005
transmission à la descendance que pour la
(Danio rerio)
méthode de microinjection.
Obtention d'individus transgéniques et
Dorade
rtGH transmission à la descendance similaire entre
Lu et al., 2002
SMGT
vs
LMGT
(Sparus sarba)
les deux méthodes.
Fréquence d'intégration d'ADN exogène
Saumon
Microinjection vs Électroporation
IGF
inférieure
en
électroporation
qu'en
Sin et al., 2000
(Salmo salar)
microinjection.
Tableau 2 : Tableau récapitulant quelques études comparatives de méthodes de transfert de
gène et leur principale conclusion.
Pour nous aider à juger, nous avons également dressé un tableau récapitulatif des
principaux avantages et inconvénients des différentes méthodes.
Nom de la méthode
Électroporation
Avantages
Rapidité
Facilement mis en place
SMGT
Rapidité
Lipofection (TMGT) Rapidité
Insertion d'une seule copie dans le génome hôte pour
Rétrovirus
certains éléments de transposition
Meilleure transmission à la descendance
Une fois établit, peu de manutention
Taux de réussite sensiblement meilleurs
Facilité de mise en place
Microinjection
Faible mortalité
Collaboration possible avec une plateforme qui maîtrise
la technique
Inconvénients
La présence d'un chorion épais autour de l'œuf
réduit l'efficacité de la méthode
Moins efficace que microinjection
Peu utilisée chez les poissons
Moins efficace que microinjection
Peu utilisée chez poisson
Probablement moins efficace que microinjection
Lourds moyens à mettre en œuvre financièrement
Laborieux à mettre en oeuvre
Dangerosité des techniques (laboratoire non
agrémenté
Plus de manutention
Œuf pas toujours transparent
Tableau 3 : Tableau dressant une liste des principaux avantages et inconvénients des méthodes
de transfert de gènes présentées.
Les données bibliographiques montrent qu’aucune de ces méthodes ne présente une
réussite systématique. Par ailleurs, pour toutes ces méthodes, de nombreux facteurs ne sont
toujours pas maîtrisés, que se soit au niveau moléculaire : comme le nombre de copies de
gènes insérés dans le génome, le site(s) d’intégration(s), le moment de l’insertion, ou
phénotypique comme les phénomènes de mosaïcisme, ou encore la transmission à la
descendance qui repose sur l’insertion du transgène dans le génome des cellules de la lignée
germinale. Bien que l’utilisation de rétrovirus semble être plus efficace, la méthode de
microinjection au stade 1-cellule a été retenue pour notre étude pour transférer les
constructions géniques du fait des contraintes fortes imposées par la méthode rétrovirus. En
effet, la méthode de microinjection est moins laborieuse à mettre en place, moins coûteuse, et
plus adaptée à l’étude d’un grand nombre de transgènes. De plus, cette technique est autorisée
dans le laboratoire et maîtrisée à l’INRA pour les deux poissons modèles : zébrafish et
médaka.
- 11 -
d- Choix du gène rapporteur
Depuis la genèse des techniques de transfert de gène, les scientifiques se sont heurtés
au problème de la détection de l’expression des transgènes dans l’organisme cible. Pour
répondre à ce problème, un gène dit « rapporteur » codant pour une activité enzymatique
facilement détectable, non présente naturellement dans le génome, et n’interférant pas avec la
biologie de l’organisme cible est classiquement utilisé. Plusieurs gènes rapporteurs ont ainsi
été utilisés pour la transgénèse (glucoronidase, β-galactosidase, chloramphenicol acétyl
transférase, luciferase). Cependant, l’utilisation de ces gènes nécessite le sacrifice de
l’organisme pour pouvoir mesurer les activités enzymatiques correspondantes. Bien qu’elle
soit moins sensible que les méthodes enzymatiques, la détection de la fluorescence présente
l’avantage majeur d’être non invasive pour l’organisme induit (au moins dans les premiers
stades de développement). Étant donné que nous souhaitions pouvoir observer un effet
temporel de l’action de nos gènes, il était nécessaire de ne pas léser l’organisme pour
permettre une observation « continue ». Aussi, le gène rapporteur fluorescent eGFP présent
naturellement chez la méduse Aequorea victoria a été choisi. Il est sans effet délétère pour les
organismes et l’expression de la GFP est observable au cours du développement précoce de
ces poissons téléostéens (grâce à leurs œufs transparents) jusqu’à un stade assez avancé de
l’organisme (plus de 1 mois pour nos espèces modèles, âge ou le nombre de cellules
pigmentées auto-fluorescentes devient très important).
- 12 -
III- Objectifs
ciblés de l’étude :
Objectif
L’objectif du stage est de mettre en œuvre la démarche expérimentale permettant
d’identifier et de caractériser des portions d’ADN génomique susceptibles de contenir un
fragment promoteur capable d’exprimer un gène artificiel (transgène) dans la gonade des
poissons in vivo.
Démarche générale
La démarche du projet vise d’abord à identifier les régions promotrices des gènes
exprimés spécifiquement dans la gonade en insérant la région 5’ flanquante6 de ces gènes en
amont du cadre de lecture codant pour la protéine d’expression fluorescente verte (GFP). La
fonctionnalité des gènes chimériques ainsi constitués sera séquencée et testée, in vitro sur
culture de cellules eucaryotes (COS-7 et cellules testiculaires de truite) et in vivo par
transgenèse après microinjection d’embryons au stade une cellule (Figure 6).
Figure 6 : Schéma récapitulatif du principe général de la méthode. (Photos, Darren et al., 2002,
Shinomiya et al., 2000).
6
La région accolée en amont du gène
- 13 -
IV- Matériel
et Méthode :
1- Matériel
Choix des poissons modèles :
Comme nous l’avons déjà mentionné, le travail original de l’équipe porte sur la truite
(Oncorhynchus mykiss). Cependant, pour ce projet, concernant l’étude fonctionnelle des gènes
par transgenèse, il a été choisi d’utiliser deux autres espèces modèle : le médaka (Oryzias
latipes) et le zébrafish (Danio rerio). Ces deux espèces présentent plusieurs avantages
majeurs :
- Leur génome est en grande partie séquencé et annoté (notamment en ce qui concerne
les EST 5’ non codantes).
- La puberté est précoce (3 mois pour avoir un individu mature) et le temps de
génération est court.
- La transparence du développement embryonnaire (bien documenté), facilite la
microinjection et l’observation du gène rapporteur.
- Intérêts techniques et financiers: espèces de petites tailles qui nécessitent moins
d’eau et d’espace, se développant en eau chaude, ce qui présente un moindre coût
d’installations et d’entretient.
Origine de l’ADN transféré :
L’ADN génomique est extrait de zébrafish (souche Tübingen) pour l’obtention des
promoteurs sycp3, gsdf1 et rfsh. Le promoteur du gène de l’amh a été obtenu à partir d’une
banque d’ADN génomique de truites Arc-en-ciel (Pisciculture Expérimentale INRA, Drennec,
France). Les microinjections ont été faite dans les souches sauvage (Tübingen) de zébrafish et
la souche CAB de médaka (originaire de la compagnie Carolina Biological Supply, USA, de
la plateforme de Gif-sur-Yvette (78).
Origine des cellules pour transfection transitoire
Les cellules COS-7 sont issues de la lignée CV1 de rein de singe vert d’Afrique
(Cercopithecus aethiops) transformées avec l’antigène T du Simian Virus 40 (SV40).
Souches bactériennes (génotype précisé en ANNEXE 10)
Escherichia coli : DH5α, DB3.1, TOP10 : (Invitrogen™ ).
Vecteurs de clonage et vecteurs de transgenèse :
Les vecteurs de propagation procaryotes utilisés sont les suivants :
o Le vecteur navette pDONR™221 est un plasmide commercialisé par
Invitrogen™ (Cergy Pontoise, France).
o Les vecteurs de transgenèse pVT-neGFP et pVT-venus ont été fournis par la
plateforme de transgenèse AMAGEN (Sohm, F., Joly, J-S., Deschet, K., Développement,
Evolution, Plasticité du Système Nerveux, UPR2197 CNRS Institut de Neurobiologie).
Noms réels : pVT-neGFP : p1.72BSSPE/ISceI/RfA:H2B:EGFP ;
pVT-Venus : p1.72BSSPE/ISceI/RfA-Venus.
(Illustration des vecteurs et composition génique en ANNEXE 8)
- 14 -
2- Méthode (7)
a- Vérification de la tissu spécificité des gènes d’intérêt
Afin de vérifier la tissu spécificité des gènes sélectionnés, nous avons extrait au Trizol/
Chloroforme les ARNm de broyats de différents organes. 2µg d’ARN total ont été rétrotranscrits dans 2µl en présence d’oligodT15 (0,5 µg/µg dARN) par 200 unités de la reverse
transcriptase Moloney Murine Leukemia virus (MMLV) selon les recommandations du
distributeur (Promega™, France). Les transcrits correspondant au gène d’intérêt ont été
amplifiés par PCR en utilisant des amorces localisés de part et d’autres du gène d’intérêt
(détail en ANNEXE 4). Les réactions de PCR ont été réalisées dans 20µl en présence de
100ng d’ARN rétro-transcrits, de 0,5 µM de chacune des amorces sens et antisens, et de 0,5U
de Hotstartaq DNA polymerase (QIAGEN®) selon les recommandations du fabricant. Les
amplifications ont été conduites avec une première étape d’activation de la Taq polymérase de
15’ à 95°C suivie de 35 cycles composés des étapes suivantes (dénaturation 1’ - 94°C ;
amorçage 1’ - 50°C ; élongation 1’ - 72°C). Les produits de PCR ont analysés sur un gel
d’agarose 1,5%/TAE 1X. Les produits de PCR ont été mis à migrer sur gel d’agarose 2%.
b- Identification et analyse in silico de la région susceptible de contenir le promoteur du gène
d’intérêt
Recherche de l’orthologue dans les espèces modèles :
Étant donné que le génome de truite n’est pas encore séquencé et que l’obtention des
régions promotrices par criblage de banques d’ADN génomique (en phage ou en BAC) reste
laborieux et coûteux, nous avons entrepris le clonage systématique des régions d’intérêt chez
des espèces dont le génome est connu et pour lesquelles les techniques de transgenèse sont
maîtrisées. Ainsi nous avons recherché les promoteurs des gènes d’intérêt chez le zébrafish
(Danio rerio) et le médaka (Oryzias latipes), espèces pour lesquelles la technique de
transgenèse est maîtrisée. Afin de s’assurer de travailler sur les mêmes gènes, il est nécessaire
d’établir, in silico, l’orthologie8 entre les gènes d’intérêt identifiés chez la truite (séquence
connue) et les gènes homologues3 retrouvés chez les deux espèces que nous avons choisis
comme source de promoteur. Deux gènes sont dits orthologues lorsque deux gènes
homologues ont divergé suite à un évènement de spéciation (Walter, 1970).
Pour déterminer la localisation chromosomique des gènes sélectionnés, les bases de
données nucléiques du génome de zébrafish et du médaka ont été interrogées in silico sur le
site Internet d’ensembl! (Internet: The European Bioinformatics Institute and Genome
Research Limited) (zébrafish version Zv6 46.6, médaka, version HdrR 46.1c) à partir de la
séquence nucléotidique d’ADNc de truite et l’algorithme TBLASTX. Cet outil permet de
rechercher des homologies après traduction du génome dans six phases de lecture possible, et
d'identifier tous les cadres de lectures du génome codant pour tout ou partie de la protéine
correspondant au gène recherché (une protéine est en général codée par plusieurs exons). Un
gène étant composé de plusieurs exons, cette interrogation aboutit à l’identification de
plusieurs régions localisées sur un même locus. Les loci présentant la plus forte similarité de
séquence (Evalue la plus faible) et la plus longue région d’homologie (score le plus élevé) ont
été retenues et analysées plus attentivement. En effet, l’homologie ne suffisant pas pour
établir une orthologie, une étude phylogénétique a été réalisée pour établir les relations de
parenté. L’analyse phylogénétique a consisté à rechercher dans les bases de données
7
Tous les principes et techniques sont détaillés en ANNEXE 5 et 6, les Solutions et tampons en ANNEXE 7.
En biologie de l'évolution, une orthologie désigne un degré de similarité entre deux gènes existants chez deux
espèces différentes. (Définition, Encyclopédie en ligne Wikipédia®).
8
- 15 -
nucléiques et protéiques (Genbank et swiss prot) des gènes paralogues9 et homologues
présents chez d’autres espèces (principalement chez les Gnathostomes10). Les séquences ont
été alignées à l’aide du logiciel CLUSTALW puis l’alignement a été analysé à l’aide de deux
algorithmes différents (UPGMA et NJ) à l’aide du logiciel MEGA3 pour hiérarchiser les
niveaux de parenté entre les différents gènes. L’intérêt de procéder de la sorte (plutôt que se
reporter directement aux annotations de génomes, quand elles existaient), permettait de
vérifier que les portions de gènes annotées correspondaient réellement au meilleur homologue
possible.
Sélection des « promoteurs»
Bien qu’il n’existe pas de définition consensuelle d’un promoteur de gène, nous
entendons désigner par ce terme un fragment d’ADN génomique non codant délimité en
amont par le gène qui le précède et en aval par un site d’initiation de transcription. D’autre
part, ce fragment doit être capable d’initier la transcription mais sans forcément porter toute
l’information nécessaire à la régulation spatio-temporelle du gène (qui peut se situer ailleurs
dans le génome). Précisons cette notion en définissant les extrémités des fragments que nous
avons choisis comme susceptibles de contenir les promoteurs.
Recherche de l’extrémité 5’ des promoteurs :
La séquence nucléotidique de la région située en amont du site d'initiation de la
traduction (ATG) de la protéine codée par ces gènes a été téléchargée à partir de la base de
données d’ensembl! sur environ 5Kb. La présence d’un gène situé sur les fragments
téléchargés pouvant être utilisée comme marqueur de l’extrémité 5’ des promoteurs (la
présence de régions régulatrice plus éloignées n’étant cependant pas à exclure), une recherche
de gènes sur ces fragments de 5Kb a été réalisée par interrogation des bases de données
nucléiques d’ensembl! et du NCBI à l’aide des algorithmes TBLASTX et TBLASTN. Aucune
des régions analysées ne comportaient de régions transcrites connues.
Nous avons ensuite restreint la région de 5Kb à environ 2Kb en amont du site ATG
initiateur, principalement pour faciliter les étapes ultérieures de clonage et d’autre part parce
que de nombreuses données bibliographiques (§ Mécanismes déterminant l’expression tissuet cellule- spécifique des gènes dans la gonade) démontrent que de telles tailles de fragments
sont susceptibles de diriger l’expression de transgène de manière tissu-spécifique. De plus,
l’amplification d’un fragment de 2Kb reste raisonnable pour assurer une efficacité des
réactions ultérieures de PCR et de clonage.
Recherche de l’extrémité 3’ des promoteurs :
Chaque séquence de fragment de 2Kb a été alignée avec celle des ADNc ou ESTs
connus chez le zébrafish ou le médaka de manière à annoter la structure exon-intron en 5’ des
gènes et déterminer le site d’initiation de transcription (que nous n’avons pas déterminé
expérimentalement) des gènes qui délimitent l’extrémité 3’ des promoteurs (là encore notre
définition n’exclut pas la présence d’éléments de régulation de la transcription éloignés situés
en aval). Cette analyse nous a permis d’identifier dans certains cas la présence d’exon 5’ non
codant sur certains de nos gènes d’intérêt. De nombreux exemples issus de la littérature
décrivent la présence d’éléments de régulation de la transcription dans les introns, en
particulier l’intron 1 (Claessens et al., 1989, Tanaka et al., 2007, Creekmore et al., 2007). De
plus, étant donné la faible taille des exons 5’ non codant et des introns les séparant de l’exon
9
Deux, ou davantage, séquences de bases sont dites paralogues en génétique si elles sont hautement conservées,
c'est-à-dire qu'elles ont une séquence ancestrale commune directe. Des gènes paralogues sont des gènes
homologues au sein d'une même espèce. (Définition, Encyclopédie en ligne Wikipédia®).
10
Clade ancestral dont la caractéristique principale est la présence de mâchoires cartilagineuses qui sont
interprétées par les anatomistes comme dérivant du premier arc branchial. (D’après l’Encyclopédie en ligne
Wikipédia®).
- 16 -
contenant l’ATG initiateur, nous avons choisi de garder ces exons et introns sur les fragments
promoteurs à amplifier.
Figure 7 : Schéma récapitulant deux types de structure des extrémités 5’ des gènes, l’une avec
un exon leader (exon 1) portant l’ATG initiateur, l’autre avec un exon leader non codant. En
raison de la pression de sélection conduisant à une meilleure conservation des régions codantes,
la première structure est plus facile à prédire même en absence d’ESTs correspondantes à
l’espèce.
Note : Par abus de langage, dans la suite de l’exposé, le terme promoteur sera employé pour
définir « la région d’ADN génomique susceptible de contenir les facteurs permettant une
transcription efficace et spécifique dans la gonade».
Probablement en raison du plus grand nombre d’ESTs séquencés chez le zébrafish par
rapport au médaka (1367159 contre 344468), nous avons observé que les régions 5’ non
traduites connues étaient plus longues chez le zébrafish, rendant plus fiable la détection des
exons leader non codant et la prédiction des bornes 3’ des promoteurs. Nous avons donc
choisi de cloner les promoteurs chez le zébrafish.
Recherche des sites de liaison de facteur de transcription conservé
Dans le but d’annoter les sites de liaison pour des facteurs de transcription présent
dans la région promotrice et pertinent en terme de fonctionnalité, la recherche des promoteurs
a été élargie aux autres espèces appartenant à des taxons différents et dont le génome est
connu ou en cours de séquençage (Takifugu rubripes (tétraodontiforme), Tétraodon
nigroviridis (tétraodontiforme), (Gasterosteus aculeatus) (Perciforme)). L’alignement des
séquences nucléotidiques correspondant à la région 5’ flanquante d’un gène donné mais issues
de plusieurs espèces a été réalisé 1) pour localiser plus précisément le site d’initiation de
transcription et 2) pour identifier des modules de régulation potentiels et conservés au cours
de l’évolution. Cette deuxième étape a été réalisée grâce à l’interface de l’outil en ligne
MEME (Internet: Timothy L.B. et al.) Les facteurs de transcription pouvant se lier à ces
motifs ont été répertoriés à partir de la base de données Transfac (Internet).
c- Extraction d’ADN génomique de zébrafish
Après le sacrifice des poissons par section cervicale, les tissus sont immergés dans
15mL de tampon de lyse (Annexe 7-B) à 55°C et incubés une nuit sous agitation circulaire.
Une purification au phénol/Chloroforme a été réalisée (ANNEXE 6-C). Les ARN résiduels
sont alors dégradés en incubant l’ADN deux heures à 37°C en présence de 0,1 mg/ml de
RNAse A. Les protéines contaminantes sont alors dégradées par ajout de 0,1 mg/ml de
protéinase K et incubation à 37°C pendant une nuit. Finalement, l’ADN est reconcentré par
précipitation alcoolique, resuspendu dans de l’eau et dosé au Nanodrop à 260 nm. La qualité
de l’ADN génomique a été appréciée sur un gel d’agarose à 1%.
- 17 -
d- Amplification des régions promotrices par PCR sur ADN génomique
N’ayant pas pu obtenir de résultat par l’amplification directe du segment d’ADN
génomique contenant le promoteur d’intérêt avec des amorces spécifiques contenant les sites
de recombinaison attB depuis l’ADN génomique, la technique de PCR ancrée a été utilisée.
Lors de la 1ère PCR, un premier couple d’amorces spécifiques, dit externe, est choisie11
in silico12, de manière à encadrer la portion de 2Kb en amont du codon initiateur de traduction
du gène d’intérêt. La réaction de PCR a été réalisée en présence de 100ng d’ADN génomique
avec le kit AccuPrime™ Pfx DNA selon les recommandations du fabricant (Invitrogen™,
Cergy-Pontoise, France). Conditions: 2’ – 95°C puis 35 cycles : 94°C - 1’ ; 50°C - 1’ ; 68°C 3’.
Une deuxième PCR est réalisée à l’aide d’un nouveau couple d’amorces spécifiques
permettant d’amplifier un fragment plus interne. Les extrémités 5’ de ces amorces comportent
des séquences supplémentaires correspondant aux sites attB qui seront nécessaires
ultérieurement aux étapes de clonage. Cette réaction de PCR a été conduite comme
précédemment avec le kit AccuPrime™ Pfx DNA en présence de 1µl du produit de la
première PCR dilué au 1/50ème. Les paramètres des 35 cycles d’amplification ont été modifiés
comme suit : 94°C – 1’ ; 55°C – 1’ ; 68°C – 3’. Au terme de cette deuxième PCR, un aliquot
de 5µl du produit de PCR a été analysé par électrophorèse sur gel d’agarose 1% dans du
tampon TAE 1X. Le reste de la réaction a été purifié en présence de PEG 30% pour éliminer
les fragments inférieurs à 100pb. Après une centrifugation de 30’ – 4°C, le surnageant a été
éliminé et le culot d’ADN a été resuspendu dans 10µl d’eau ultrapure. Un dosage de la
suspension d’ADN a été effectué sur 1,2µl au NanoDrop à 260 nm. Les produits de PCR
purifiés ont enfin été analysés sur gel d’agarose à 1%/TAE 1X.
e- Insertion des fragments d’ADN promoteurs potentiel dans les vecteurs de transgenèse
Principe général
Le principe du système GATEWAY® (Invirogen™) (Figure 8) consiste à intégrer lors
d’une première étape de recombinaison les fragments d’ADN linéaire d’intérêt (promoteur)
amplifiés par PCR par recombinaison dans un premier plasmide dit « donneur » qui possède
un gène de sélection négatif (cassette ccdB). Une deuxième recombinaison est ensuite réalisée
pour échanger ce fragment avec celui d’un vecteur circulaire contenant le cadre de lecture de
la protéine fluorescente en aval du site d’échange. L’insertion du promoteur potentiel en
amont du cadre de lecture codant pour la protéine fluorescente conduit à la création d’un gène
chimérique. Les réactions de recombinaison ont été conduites selon le protocole détaillé dans
le manuel technique du distributeur « Gateway® technology, A universal technology to clone
DNA sequences for functional analysis and expression in multiple systems, Version E,
Septembre 2003 (Invitrogen™, Cergy Pontoise, France).
1ère recombinaison :
Brièvement, pour la première recombinaison, 300pmol de produit de PCR-attB (voir
détail calcul en ANNEXE 10-A) ont été recombinés avec 300pmol de vecteur pDONR™221
en présence de la clonase BP (kit GATEWAY® BP Clonase™ Enzyme Mix de Invitrogen™).
La réaction de recombinaison a été prolongée sur une nuit à 25°C. Les plasmides
recombinés ont été insérés dans les cellules bactériennes DH5α par un choc thermique. Après
11
Séquence optimale : Tm le plus bas possible, proportion de bases G/C limité et faible probabilité d’avoir une
structure secondaire dans le primer). On sélectionne donc des séquences oligotiques d’environ 25 mer chacun.
12
Outil du site Internet : idtdna.com : Internet: Integrated DNA Technologies ou l’outil Primer3 Rozen et al.,
2000.
- 18 -
une incubation de 30’ dans la glace d’un mélange contenant 3µl de la réaction de
recombinaison et 25µl de cellules bactériennes chimiquement compétente (Invitrogen™), les
cellules ont été exposées à 42°C pendant 45’’ avant d’être de nouveau incubées sur glace 5’.
Une incubation de 45’ à 37°C sous agitation et dans 250µl de milieu SOC a été réalisée pour
permettre aux cellules de régénérer leur paroi. Les colonies bactériennes ayant incorporé les
plasmides non recombinés ne se développent pas car la cassette ccdB entraîne la mort des
cellules DH5α. Les colonies bactériennes contenant les plasmides qui ont échangé la casette
ccdB pour le fragment promoteur potentiel ont été sélectionnées sur gélose LB contenant
50ng/ml de kanamycine. Cinq colonies ont été individuellement mises en culture dans 5 ml de
milieu LB en présence de 50ng/ml de kanamycine. Après une nuit de culture à 37°C sous
agitation circulaire à 250rpm, l’ADN plasmidique a ensuite été purifié sur colonne Spin
MiniPrep (QIAGEN™) après lyse alcaline des cellules selon les recommandations du
distributeur. Les plasmides purifiés ont été analysés par restriction et électrophorèse sur gel
d’agarose 1% dans du tampon TAE 1X.
2ème recombinaison
La deuxième recombinaison a été conduite dans 25µl en présence de 150ng du
plasmide recombiné obtenu lors de la première recombinaison, de 150ng des vecteurs de
transgénèse de base préalablement amplifiés (pVT- Vénus ou pVT-neGFP) et de la clonase
LR (kit GATEWAY® LR Clonase™ Enzyme Mix de Invitrogen™). Après transformation des
cellules DH5α comme indiqué précédemment les colonies ayant incorporé les plasmides
recombinés ont été sélectionnées sur gélose LB contenant 100ng/ml d’ampicilline. Cinq
colonies ont été prélevées et mises individuellement en culture dans du milieu LB contenant
100ng/ml d’ampicilline. L’ADN plasmidique a été purifié sur colonne MAXIprep
Endonuclease free (QIAGEN™) en suivant les recommandations du fabricant.
Figure 8 : Figure récapitulative du principe du protocole Gateway® (Invirogen™). Le schéma
montre également les sites de restrictions détaillés plus tard.
- 19 -
f- Vérification moléculaire des constructions
Vérification par cartographie de sites de restrictions
La taille et l’orientation des fragments d’ADN insérés dans les vecteurs ont été
analysées par restriction à l’aide d’endonucléases choisies de manière appropriée : présence
de deux sites localisés à chacune des extrémités du fragment pour déterminer la taille globale
ou présence de deux sites, l’un sur le plasmide l’autre à l’extrémité de l’insert pour déterminer
l’orientation. Les restrictions ont été réalisées sur 200 à 500ng d’ADN selon les
recommandations du distributeur. Les fragments d’ADN obtenus ont été séparés sur un gel
d’agarose 1%/TAE 1X par électrophorèse (50V – 30’).
Vérification par séquençage d’ADN
La réaction de séquençage est réalisée dans 10µl à l’aide du kit PRISM AmpliTaq FS
Big Dye™ Terminator, (Applied Biosystems, Foster city) à partir de 400ng de plasmide et
une seule amorce 0,3µM selon les recommandations du fabricant. La technique de référence a
été décrite par Sanger et al., 1977. Les ddNTP* non incorporés ont été éliminés par
chromatographie d’exclusion sur des plaques Multiscreen (Millipore) contenant du Sephadex
G50, selon les recommandations du distributeur. Les réactions de séquençage ont été
déposées dans l’automate ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems. Les
résultats sont collectés dans un logiciel « 310 Genetic Analyzer Data Collection 1.0.4 », puis
analysés grâce au logiciel « Sequencing Analysis 3.3 ». Les séquences obtenues ont été
alignées avec les séquences attendues des promoteurs à l’aide du module d’alignement
CLUSTALW du logiciel BioEdit (Hall, 1999). (13)
g- Vérification de la fonctionnalité des vecteurs par transfection
Vérification par transfection dans les cellules COS de rein de singe
Observation microscopique :
Les vecteurs de transgenèse ont été transférés par transfection transitoire dans les
cellules eucaryotes COS-7 pour tester l’activité promotrice des fragments insérés en amont du
gène rapporteur fluorescent. Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM supplémenté
avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 2mM de glutamine et un mélange d’antibiotiques
(pénicilline 10000 U/ml 400µg/ml streptomycine) à 37°C sous atmosphère humide et sous 5%
CO2. 500 000 cellules ont été étalées la veille de la transfection dans un puit de plaque 6 puits.
Les transfections ont été réalisées à l’aide du transfectant « FuGENE® HD Transfection
Reagent », en utilisant le rapport 8:2 (8µg d’ADN pour 2µl de transfectant), selon les
recommandations du fabricant (Roche). L’expression du gène rapporteur GFP a d’abord été
analysée en suivant l’apparition de la florescence dans les cellules entre 12 et 48h après
transfection, sous microscope Olympus IX71 inversé avec l’objectif ×20. Les images ont été
analysées avec la caméra Olympus DP71 et le logiciel View Finder. Pour l’observation de la
fluorescence de la GFP, une lampe au mercure qui émet une lumière UV incidente de 460 à
480 nm et un filtre GFP de bande passante de 495 à 540 nm ont été utilisés. (14)
Vérification par reverse transcription des ARNm des cellules transfectées
L’expression du gène rapporteur a ensuite été analysée par RT-PCR. Les ARN totaux
des cellules transfectées ont été extraits 48h après transfection, à l’aide du Trizol, selon les
recommandations du fabricant. 2µg d’ARN total ont été rétro-transcrits comme détaillé
13
Le séquençage est optimal pour une longueur d’ADN d’environ 500pb. Pour permettre un séquençage complet
du vecteur de transgenèse, il faut superposer les réactions de séquençage.
14
On cherche ici à vérifier la fonctionnalité du promoteur créé. Bien que l’expression du gène soit censée être
dirigée vers les cellules de la gonade par le promoteur introduit, il y a toujours une expression basale de tous les
gènes dans toutes les cellules de l’organisme. Ainsi, on espère détecter un peu de fluorescence, exprimé dans ces
cellules, ou une expression (même faible) en RT-PCR.
- 20 -
précédemment. Les transcrits correspondant au gène rapporteur de la GFP ont été amplifiés
par PCR en utilisant des amorces localisées de part et d’autres de l’intron du gène SV40 pour
ne détecter que les transcrits épissés. La qualité de la rétro-transcription a été appréciée en
utilisant un couple d’amorces amplifiant le gène de ménage codant pour la beta-actine. Les
réactions de PCR ont été réalisées dans 20µl en présence de 100ng d’ARN rétro-transcrits, de
0,5 µM de chacune des amorces sens et antisens, et de 0,5U de Hotstartaq DNA polymérase
(QIAGEN®), selon les recommandations du fabricant. L’amplification s’est déroulée suivant
les mêmes conditions que précédemment décrites.
Transfection transitoire dans les cellules testiculaires de truite
Des cultures de cellules testiculaires de truite sacrifiées au stade gonadique II
(spermatogenèse initiée mais absence de cellules germinales méiotiques) ont été
précédemment obtenues au laboratoire après dissociation du tissu à la collagénase. Ces
cellules encore mal caractérisées ont été maintenues en culture à 16°C, sous air et dans le
milieu de culture de base L15 contenant 10% SVF. À confluence, les cellules ont été
régulièrement recueillies par trypsinisation puis réensemencées à faible densité (50%) sur des
puits de plaque 6 puits pré-coatés avec de la gélatine. La veille de la transfection, 50 000
cellules ont été ensemencées par puit de plaque 6 puits. Les cellules ont été transfectées à
l’aide du réactif FuGENE® HD Transfection Reagent (Roche) comme indiqué précédemment
pour les cellules COS-7. L’observation des cellules fluorescentes a été réalisée sous
microscope inversé équipé d’un filtre GFP, 12, 24 et 48h après transfection.
h- Transgenèse par microinjection au stade cellule œuf
Les microinjections ont été effectuées par la plate-forme de transgenèse AMAGEN de
la station mixte INRA/CNRS de Gif-sur-Yvette (78) : Les œufs de médaka et zébrafish ont été
collectés immédiatement après la ponte et leur fécondation (au moment de la mise en
éclairage matinale) et placés dans le milieu de Yamamoto (Yamamoto, 1975) préalablement
refroidi dans le cas des médaka ou dans le milieu 1X pour embryons (Nüsslein-Volhard et al.,
2002) dans le cas des zébrafish. Avant la microinjection, les embryons de médaka sont
transférés à 4°C pour arrêter leur développement. Les œufs fécondés sont ensuite placés dans
des rigoles d’un gel d’agarose à 3% immergé dans une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre
contenant du milieu pour embryon (ANNEXE 6-H).
Les microinjections ont été réalisées avec un injecteur à pression (FemtoJet,
Eppendorf, Allemagne) connecté à un micro capillaire en verre borosilicate (GC100T(F),
Clark Electromedical Instruments, Royaume-Uni). Les capillaires ont été préalablement étirés
à l’aide de l’étireuse verticale PP-830 (Narisshige, Japon) puis remplis avec le mélange à
microinjecter : ADN circulaire 15 et 100ng/µl final pour le médaka et le zébrafish
respectivement, rouge de phénol 0,1%. Les constructions ont été microinjectées au travers du
chorion dans le cytoplasme de la première cellule des embryons. Après injection, les œufs ont
été maintenus à 28°C dans le milieu pour embryon approprié jusqu’à l’éclosion. Les alevins
ont ensuite été transférés dans les élevages et nourris avec des artémias vivants et de la
nourriture en poudre ou en granulé suivant leur stade de développement.
i- Vérification fonctionnelle : observation des effets du promoteur in vivo
La fluorescence dans les embryons microinjectés a été oservée à l’aide d’un stéréomicroscope LEICA équipé d’un filtre GFP et couplé à une source UV avec un régulateur de
puissance ebq 100. Les images ont été prises à l’aide d’une caméra numérique (Nikon digital
camera, dmx1200). Les embryons encore non éclos ont été placés dans une boîte de Pétri
contenant du milieu d’incubation puis observés directement sous le microscope. Les alevins
ont été préalablement anesthésiés par immersion de 5 à 15 minutes dans du MS 222 (Sigma®)
dilué à 6 mg/ml.
- 21 -
V- Résultats
:
1- Sélection des gènes d’intérêt
Gènes sélectionnés
Dans le but d’obtenir des fragments d’ADN promoteurs susceptibles de permettre
l’expression de transgène spécifiquement dans la gonade, six gènes ont été sélectionnés pour
notre étude sur la base de leur profil d’expression gonade spécifique, décrit dans la littérature
chez les vertébrés (vasa, amh, rfsh, sycp1, sycp3) et/ou déterminé expérimentalement au
laboratoire chez la truite (vasa, amh, gsdf1, sycp1). Ces gènes ont été choisis en raison de leur
spécificité tissulaire et cellulaire d’expression mais également en raison de leur profil
d’expression temporel, différent dans les cellules somatiques ou les cellules germinales Ainsi,
les gènes gsdf1, amh, et rfsh sont exprimés dans les cellules de Sertoli, mais contrairement au
gène rfsh, l’expression des gènes gsdf1 et amh déclinent progressivement au cours de la
spermatogenèse. Les gènes vasa, sycp1 et sycp3 sont eux exprimés par les cellules germinales
mais à des stades spécifiques de leur différenciation : spermatogonies pour vasa et
spermatocytes primaires pour sycp1 et sycp3.
Figure 9 : Profil d’expression des gènes sélectionnés dans le cycle spermatogenétique et dans la
cellule cible. (PGC : Cellules germinales primordiales ; SPI : spermatocyte I).
Identification des gènes in silico
Grâce au module d’interrogation des bases de données de séquence d'ensembl!, nous
avons pu identifier des gènes homologues aux gènes sélectionnés sur les deux espèces
modèles à l’exception du gène rfsh qui n’est pas présent sur l’assemblage actuel du génome
de médaka (détail des gènes, et localisation dans la base de donnée en ANNEXE 3-C).
Vérification de l’orthologie : l’exemple de l’amh & gsdf1
Les protéines codées par ces gènes ont ensuite été incluses dans des études
phylogénétiques afin de s’assurer de l’orthologie de ces gènes par rapport aux gènes des
mammifères ou des autres poissons. Ces études montrent que tous les gènes répertoriés sont
bien orthologues en terme de séquence et sont présents en copie unique chez les poissons
(Figure 10). Une telle analyse est en cours de réalisation pour les autres gènes sélectionnés.
- 22 -
99
BMP2-4
18
BMP5-6-7-8
96
16
hGDF3
hGDF1
18
96
ckBMP10
83
hGDF2
17
37
GDF6-7 radar dynamo
65
99
Inhibin beta
55
42
100
17
modal
100
GDF8
58
TGF
22
99
99
100
BMP10
BMP3
96
BMP15 - GDF9
91
35
eelAMH
90
rtAMH
100
73
64
50
salAMH
pigAMH
mouseAMH
85
100
ratAMH
ckAMH
Inhibin alpha
99
mkGSDF1
rtGSDF2
98
Figure 10 : Étude phylogénétique des
membres de la superfamille TGF-β. On
s’aperçoit que les deux gènes : amh et gsdf1,
sont agrégés dans des branches distinctes
quelle que soit l’espèce d’origine. Parmi ces
deux groupes, on voit clairement le fort
degré d’homologie entre espèces pour une
famille de gène. (rt = truite ; zf = zébrafish ;
mk = médaka ; gasteo = épinoche ; sal =
saumon ; ck = poulet ; pig = cochon ; mouse
= souris ; rat ; eel = anguille. L’outsider est
le gène de GDFN humaine (en bas de
l’arbre). La barre d’échelle représente le
nombre de changement d’acides aminés par
position et par unité de taille de branche.
zfGSDF1
39
gasteoGSDF1
32
50
rtGSDF1
100 salGSDF1
hGDNF
0.2
Vérification de la tissu spécificité chez le zébrafish
L’étude de ta tissu-spécificité des gènes sélectionnés a été étudiée chez le zébrafish par
RT-PCR sur des ARN totaux extraits de différents tissus. Les résultats obtenus montrent que
les gènes sycp1 et sycp3 (Figure 11) sont exprimés préférentiellement dans la gonade mâle et
femelle. Cependant, le gène sycp3 pourrait aussi être exprimé de manière plus modeste dans
d’autres tissus (rate et foie notamment). Aucune conclusion n’a été portée pour les autres
gènes analysés car les amorces utilisées ont amplifiées des régions d’ADN génomique
contaminant les ARN extraits. (Les tailles attendues et autres résultats montrés en ANNEXE
3-D).
Taille de
bande
attendue
(≈ 433)
Dimères de
primer
Figure 11 : Résultat de la migration sur gel d’agarose 1% par électrophorèse de l’expression des
ARNm rétro- transcrits des différents tissus de zébrafish pour le gène sycp3.
2- « Identification » des régions promotrices in silico
Obtention de la zone promotrice des gènes d’intérêt
Grâce à l'interface graphique d'ensembl! la séquence nucléotidique (5000pb) de la
région située en amont du site d'initiation de la traduction de la protéine (ATG) a été
téléchargée. Nous avons ensuite réduit cette région à environ 2Kb, taille de fragment
raisonable pour les étapes ultérieures d’amplification par PCR et de clonage.
- 23 -
Nom promot. Taille fragmt
pVASA
2061
pAMH
1374
pSYCP1
2345
pSYCP3
pRFSH
pGSDF1
1862
2011
2065
Tableau 4 : Tableau récapitulatif de la taille des
fragments d’ADN promoteur. (Les séquences annotées
des régions promotrices des gènes téléchargés, ainsi que le
détail des amorces qui ont permis de les isoler sont
disponibles en ANNEXE 9 & ANNEXE 4).
Recherche de sites de liaisons de facteurs de transcription conservés : exemple de gsdf1
Toutes les séquences des régions promotrices des gènes sélectionnés ont été extraites
de la base de donnée des génomes de zébrafish, médaka, épinoche, fugu et tétratodon
lorsqu’elles étaient disponibles. L’étude de la comparaison de ces séquences a montré que les
régions 5’ flanquantes au codon d’initiation de traduction des gènes amh, sycp1 et sycp3 sont
peu conservées entre poissons téléostéens (résultats non illustrés). En revanche, la région
promotrice potentielle du gène gsdf1 montre un fort degré de conservation de plusieurs
modules pouvant fixer des facteurs de transcription connus pour être impliqués dans
l’expression Sertoli-spécifique de gènes chez les mammifères (ex : GATA, Sox, SRY et Sp1).
Figure 12 : Représentation graphique de la localisation de trois motifs (bleu, cyan, rouge)
conservés en séquence et position au cours de l’évolution dans la région promotrice du gène
gsdf1. tf : Takifugu rubripes ; ga : Gasterosteus aculeatus ; mk : médaka ; zf : zébrafish. (La
séquence des motifs conservés est montrée en ANNEXE 3-E). scale : échelle en pb..
3- Extraction d’ADN génomique
Afin de démontrer l’activité promotrice des fragments d’ADN analysés
précédemment, leur clonage physique a été réalisé par PCR à partir d’ADN génomique. Nous
avons donc procédé au préalable, à l’extraction d’ADN génomique sur des individus juvéniles
ou sur des pools d’alevins de zébrafish et de médaka (Figure 13). La qualité de l’extraction a
été vérifiée sur gel d’agarose et par PCR, uniquement sur les ADN génomique de zébrafish à
l’aide d’un couple d’amorces dirigé contre la région promotrice proximale du gène sycp1
(résultats non illustrés).
ADNg
Figure 13 : Résultat d’extraction de
l’ADN génomique d’un juvénile de
Zébrafish (Zf-juvénile), de 3 pools
d’alevins de Zébrafish (Zf-alevins 1, 2
&3), et de 3 extractions médaka (Mk1, 2 & 3).
Mk- 3
Mk- 2
Mk- 1
Zf-alevin 3
Zf-alevin 2
Zf-alevin 1
Zf-juvénile
Kb
10 -8 -5 -3 -2 -1,5 -1 -0,8 -0,6 --
Très peu d’ARN
résiduel
- 24 -
4- Production des vecteurs de transgenèse
a- Amplification des régions promotrices d’intérêt
Les amplifications des régions promotrices des gènes vasa, gsdf1, rfsh, sycp1, sycp3 ont
été réalisées par PCR en prenant l’ADN génomique extrait de zébrafish (souche identique)
comme matrice (15). Dans un premier temps, nous avons testé mais sans succès l’amplification
directe avec des amorces spécifiques en 3’ de la séquence à amplifier mais comportant aussi
des bases supplémentaires en 5’ correspondantes aux sites de recombinaison attB nécessaires
aux étapes ultérieures de clonage. Pour résoudre ce problème nous avons opté pour une
nouvelle stratégie dite de PCR ancrée. Bien que la première étape de PCR réalisée sur l’ADN
génomique de zébrafish en présence d’amorces sens et antisens strictement spécifiques n’ait
pas toujours conduit à l’amplification d’un fragment unique de la taille désirée (Figure 14a), la
deuxième PCR faite sur une dilution au 50ème de la première PCR et utilisant un deuxième
couple d’amorces spécifiques plus interne (incluant à leur extrémité 5’ les sites attB) a permis
d’amplifier avec un fort enrichissement des régions d’ADN génomique de taille attendue pour
les gènes sycp3, rfsh, et gsdf1 (Figure 14b). Cependant, aucune amplification n’a pu être
obtenue pour les gènes vasa et sycp1 malgré plusieurs modifications apportées aux paramètres
d’amplification (température d’hybridation des amorces, quantité d’ADN, changement
d’amorces sens et/ou antisens, changement du lot d’ADN génomique, purification des
fragments au TE/PEG, pour détails voir ANNEXE 3-G).
Figure
14 :
Produits
d’amplification des PCR. a :
Produits de la PCR-1. On observe
des « smears » autours de la taille
attendue (aspécificité due à la
température plus basse) (seul
pGSDF1 possède une bande plus
nette). b : Produits de la PCR-2.
Noter la présence d’un produit de
PCR majeur de la taille attendue
(environ 2kb) et en quantité
importante.
b- Clonage des régions promotrices dans les vecteurs
Résultat 1er clonage : dans le vecteur pDONR™221
Notre stratégie d’insertion des promoteurs en amont du cadre de lecture codant pour la
GFP nécessite leur insertion préalable dans un vecteur intermédiaire (pDONR™221) par
recombinaison nommée BP en raison des sites de recombinaison mis en jeu. En effet, les sites
de recombinaison attB1 et attB2 introduits respectivement aux extrémités 5’ et 3’ du fragment
de PCR grâce aux amorces sens et antisens respectivement, recombinent, avec les sites attP1
et attP2 présents sur le vecteur donneur. Cette étape de recombinaison BP a été réalisée sans
problème particulier pour le fragment issu de l’amplification pAMH (1,4Kb), mais a été plus
15
La provenance des deux autres régions promotrices ne sont pas issus directement de l’étude : le gène de
l’ amh qui avait été séquencée précédemment au laboratoire chez la truite (Y. Guiguen et collaborateurs, non
publié). L’obtention de cette région promotrice a été réalisée en une seule étape de PCR en prenant comme
matrice un clone BAC disponible au laboratoire et contenant un fragment ADN génomique de environ 1,4Kb de
truite portant cette région d’intérêt.
La deuxième exception a été faite pour le clonage d’un promoteur fort et ubiquitaire (qui s’exprime
dans l’ensemble des types cellulaires d’un organisme) du cytomégalovirus (CMV, 654pb). Il a été amplifié
directement à partir d’un plasmide commercial pcDNA3 (Invitogen™) et sera utilisé ultérieurement dans cette
étude comme témoin positif pour valider la fonctionnalité des constructions de transgenèse.
- 25 -
laborieuse pour les fragments pGSDF1 (2,1Kb) et pSYCP3 (2Kb) car plusieurs tentatives ont
été nécessaires. De plus, la proportion de colonies recombinantes ayant inséré le fragment
désiré est restée très faible pour ces deux fragments (de l’ordre de 1 colonie sur 25 testées
contre 5/5 pour le fragment pAMH). Nous n’avons pas pu aboutir au clonage de la région
pRFSH dans le vecteur pDONR™221. La recombinaison BP est donc apparue comme une
étape technique limitante de notre approche.
Plusieurs paramètres de la réaction de recombinaison ont été modifiés pour essayer
d’améliorer son efficacité. Différents rapports de proportion (2:1, 1:1, 1:2) entre les fragments
de PCR et le vecteur ont été testés sans qu’aucune différence notable ne soit observée. Le
temps d’incubation de la réaction de recombinaison BP a été prolongé de 1 heure à une nuit
sans permettre pour autant une amélioration nette de l’efficacité de clonage. Le volume
réactionnel a également été augmenté sans conséquence. L’utilisation de bactéries électrocompétentes (Top10, Invitrogen™) a été testée mais n’a aboutit qu’à l’obtention d’un bruit de
fond très important de colonies faux-positifs portant des vecteurs dépourvus de la cassette
ccdB. Bien que la recombinaison de grands fragments proche de 5Kb ait été reportée (Chen et
al., 2006), nos observations suggèrent que la taille du fragment à insérer est un des facteurs
majeurs influençant l’efficacité de la réaction BP. Il faut noter qu’au terme de cette étude,
nous sommes toujours à la recherche d’un protocole qui soit efficace quelque soit la taille et la
nature du fragment mis en jeu.
Les plasmides recombinés ayant inséré les promoteurs ont été analysés par
cartographie de sites de restriction pour déterminer d’une part la taille du fragment inséré et
d’autre part son orientation. La triple digestion EcoRV/ApaI/SmaI des plasmides a montré
que la taille des fragments insérés était conforme à la taille attendue des régions amplifiées
par PCR (SmaI est le témoin de recombinaison car il existe uniquement sur pDONR™221
natif). Une autre double digestion avec l’enzyme ApaI dont le site de coupure unique était
localisé sur le plasmide et une autre enzyme coupant exclusivement à une des extrémités du
fragment attendu a permis d’une part de conforter l’idée que le fragment amplifié par PCR
était bien le bon et que d’autre part, l’orientation du clonage était conforme aux résultats
attendus (cf. ANNEXE 3-H).
Clonage dans les vecteurs de transgenèse pVT-Vénus & pVT-neGFP
La réalisation des constructions s’est ensuite poursuivie par une 2ème recombinaison
(LR) avec un vecteur possédant le cadre de lecture d’une GFP cytoplasmique (pVT-Vénus) ou
nucléaire (pVT-neGFP). Cette recombinaison LR s’est révélée être bien plus efficace que la
précédente. Nous avons ainsi, également vérifié nos constructions par restriction Les résultats
observés (Figure 15) sont conformes aux résultats théoriques (ANNEXE 3-I).
Figure 15 : Photographie (sous UV) de la migration sur gel d’agarose 1% de la restriction des
vecteurs de transgenèse. 1 : Vérification de l’insertion et taille du promoteur 2 : Vérification de
l’orientation de l’insert. (ND : plasmide non digéré).
- 26 -
c- Vérification par séquençage
Avant de procéder à la suite et notamment à la transgenèse, nous avons vérifié par
séquençage la composition nucléotidique de nos fragments. Les séquences des fragments
insérés ont été alignées avec les séquences attendues correspondantes (issus de la base de
donnée ensembl!). Une forte identité (99 à 100%) de séquence a été obtenue pour tous les
fragments validant ainsi l’identité des fragments promoteurs potentiels et les constructions de
transgénèse. (données brutes de séquençage en ANNEXE 3-J).
Nom
Taille du
promot. promoteur
pAMH
1374
pGSDF1
2065
pSYCP3
1862
Nom du vecteur séquencé
Taille fragmt
séquencé
1ère base
reconnue
pAMH-eGFP-SP6
pAMH-Vénus-SP6
pGSDF1-eGFP-SP6
pGSDF1-Vénus-SP6
pSYCP3-eGFP-SP6
pSYCP3-Vénus-SP6
510
362
555
492
511
505
1
1
24
24
289
289
% homologie
Dernière base
reconnue avant corr. après corr.
440
292
504
441
728
721
99,55
98,29
100,00
99,76
99,77
100,00
99,55
99,32
100,00
100,00
100,00
100,00
Tableau 5 : Tableau récapitulatif des résultats des alignements entre la séquence théorique du
promoteur extrait et le résultat des séquençages d’une extrémité des constructions (comparaison
réalisée avec le module CLUSTALW du logiciel BIOEDIT).
d- Vérification par transfection transitoire sur cellules COS
Figure 16 : Résultats des transfections dans des cellules COS. Les photographiess prises avec le
filtre GFP avaient pour réglage une exposition de 1/80ème de seconde. Noter qu’en absence de
transfection, quelques cellules montrent une légère auto fluorescence. Les constructions réalisées
avec le promoteur fort et ubiquiste pCMV montrent une forte fluorescence (A). On peut ici
clairement observer une différence d’expression entre les deux protéines fluorescentes (B). pVTvénus s’exprime dans tout le cytoplasme de la cellule (a), alors que pVT-neGFP a une expression
concentrée dans le noyau de la cellule (on distingue des spots de fluorescence qui pourraient être
colocalisés avec les nucléoles) (b).
- 27 -
Nous avons voulu tester l’aptitude des régions promotrices des gènes d’intérêt à
diriger l’expression de la GFP en les transfectant dans une lignée cellulaire eucaryote de rein
de singe (cellules COS-7) par transfection transitoire. Les vecteur pVT-CMV-eGFP et pVTCMV-Vénus contenant le promoteur ubiquiste pCMV dirigeant l’expression de la GFP a été
utilisé comme témoin positif pour tester la méthode, valider l’efficacité des transfections et
localiser (cytoplasmique ou nucléaire) les protéines des GFP venus et neGFP (Figure 16).
Contrairement aux cellules non transfectées, on a pu observer une forte fluorescence
dans le cytoplasme de certaines cellules COS-7 en présence du témoin positif avec nos
constructions pVT-CMV-neGFP et pVT-CMV-Vénus respectivement, dans le noyau et le
cytoplasme de certaines cellules COS-7, dès 24h après transfection. Un plus grand nombre de
cellules fortement fluorescentes a pu être observé 72h après transfection. En revanche, les
vecteurs de transgenèse contenant les promoteurs pGSDF1, pAMH et pSYCP3 n’ont montré
aucune fluorescence significative (Figure 17) (les deux derniers sont illustrés en ANNEXE 3K). Quelques cellules se sont avérées plus intenses que d’autres mais leur intensité différait
peu du bruit de fond observé sur les cellules transfectées en absence d’ADN (témoin négatif).
Figure 17 : Illustration du
résultat de la transfection sur
cellule COS des constructions
contenant la portion pGSDF1.
Noter qu’en absence de
transfection, quelques cellules
montrent une légère auto
fluorescence.
Lumière blanche
UV + Filtre GFP
e- Révélation de l’expression des ARNm rétrotranscrits de GFP issus des cellules COS
L’absence d’expression de la GFP en présence de vecteurs de transgenèse contenant
les promoteurs des gènes amh ou gsdf1 ou encore sycp3 pouvant être dû au fait que ces
promoteurs nécessitent un contexte cellulaire approprié, nous avons tenté de transfecter des
lignées de cellules testiculaires de truite en cours d’établissement. Malheureusement, aucune
fluorescence n’a pu être observé, et ce, quelque soit les constructions transfectées (résultat
non illustrés).
Nous avons donc tenté une méthode plus fine pour détecter l’expression des gènes
exprimés. En effet, tout gène présent dans une cellule a une expression basale. C’est cette
expression que nous avons tenté de mettre en évidence par PCR après rétro-transcription des
ARNm issus des cellules COS transfectées. Cependant, les résultats obtenus ne sont guère
interprétable du fait d’une amplification d’ADN génomique contaminant les ARN extraits
(illustration pour l’amh en ANNEXE 3-L). La manipulation nécessite d’être reproduite en
prétraitant les ARN par la DNAse I.
- 28 -
5- Vérification par transgenèse in vivo de la fonctionnalité des vecteurs
Pour des raisons de temps et de coût, seules les constructions avec le gène
d’expression Venus ont été injectés dans les deux espèces modèles (médaka – zébrafish).
Deux séries de microinjections avec les constructions pVT-GSDF1-Vénus et pVT-AMHVénus ont été menées sur le zébrafish (la première le 30/05/07 et l’autre le 04/07/07) et une
seule chez le médaka (le 30/05/07). Les embryons microinjectés ont été observés 24h après
microinjection. Certains embryons de zébrafish microinjectés avec les constructions pVTAMH-Vénus (Figure 18 A-B-C) ou pVT-GSDF1-Vénus (Figure 19F) ont présenté une
fluorescence significative dans quelques cellules de la région médio-basale de l’embryon
pouvant correspondre à la crête neurale, territoire à l’origine des cellules somatiques
testiculaires (Figure 18 C-E). De plus, le profil d’expression de la construction pVT-AMHVénus obtenu chez le médaka (Figure 18 D-E) est similaire à celui précédemment décrit chez
le zébrafish (Figure 18 A-B-C). Ainsi nos observations indiquent que les fragments d’ADN
génomique correspondant aux gènes amh et gsdf1, insérés en amont du cadre de lecture de la
GFP Vénus, possèdent bien une activité promotrice. Toutefois, il faudra attendre la production
de générations F1 pour déterminer si ces fragments possèdent toute l’information pour cibler
l’expression d’un gène dans le testicule.
A
mb
B
C
Œ
avant
vit
zébrafish
queue
0,5mm
D
E
vit
médaka
Figure 18 : Activité transcriptionnelle du promoteur potentiel du gène amh de truite chez le
zébrafish (A-B-C) et le médaka (D-E). Les illustrations (A-B-C) sont prises sur le même
embryon 1 jour après l’injection, les illustrations (D-E) aussi. Les photographies A et D
présentent une vue latérale de l’embryon prise en lumière blanche. On distingue très nettement
le chorion de l’œuf (mb) ainsi que le vitellus (vit). La partie avant de l’embryon reste solidaire
du vitellus tandis que la queue a tendance à se décoller légèrement. B et E montrent les mêmes
vues mais sous le filtre GFP. L’encadré blanc en B correspond à la zone détaillée en C. C est une
vue dorsale de la partie antérieure de l’embryon (on peut distinguer l’œil (Œ)). Sur cette vue, on
distingue très clairement les cellules fluorescentes exprimant le gène Vénus, partant de derrière
l’axe cérébral en descendant vers le tronc de l’embryon (flèches blanches). Sur la photographie
E, on distingue une ou un agglomérat de cellule(s) fluorescente(s) dans la région mediane de
l’embryon (flèche).
- 29 -
F
queue
Figure 19 : Activité transcriptionnelle du promoteur potentiel du gène gsdf1 de zébrafish chez
zébrafish sur la photographie, on distingue la partie postérieure de l’animal (queue) et on peut
voir un agglomérat de cellules où doit se développer a gonade exprimant la GFP (encerclé).
Une série de microinjection a également été réalisée chez le zébrafish avec la
construction pVT-SYCP3-Vénus mais les embryons ne présentaient toujours pas de
fluorescence 15 jours après la date de microinjection.
Bilan :
L’étude présentée a permis de mettre en œuvre les approches méthodologiques
conduisant à la production de vecteur de transgénèse pour étudier la capacité de certains
fragments d’ADN promoteurs à cibler l’expression de transgènes dans la gonade de poissons.
Ainsi, 6 vecteurs de transgénèse ont été produits à partir des 3 promoteurs pAMH, pGSDF1 et
pSYCP3 et microinjectés chez le zébrafish ou le médaka. Deux autres constructions contenant
le promoteur pCMV connu pour être ubiquiste ont été également réalisées et utilisées comme
contrôle. Les résultats préliminaires suggèrent que les promoteurs pAMH et pGSDF1 ont une
activité promotrice in vivo.
- 30 -
VI- Discussion,
Perspectives
Recherche d’orthologues et choix de l’espèce modèle pour les études fonctionnelles des promoteurs
La sélection des promoteurs de gènes à analyser dans cette étude a été basée sur les
connaissances acquises chez les mammifères et sur le fait que l’expression des gènes
correspondants dans la gonade de truite ait été confirmée au laboratoire par les approches de
génomique expressionnelle. En raison des coûts d’entretien des truites en circuit fermé et de la
méconnaissance de leur génome, nous avons dû choisir une autre espèce de poisson pour
réaliser l’étude fonctionnelle des promoteurs. La recherche de gènes orthologues dans les
génomes de poissons modèles est particulièrement délicate chez les poissons téléostéens en
raison d’un ou plusieurs évènements de duplication de leur génome, suivi de pertes de gènes
intervenus dans chacun des taxons après leur divergence avec le phylum des tétrapodes
(Steinke et al., 2006, Meyer et al., 2005, Hoegg et al., 2004). Ces évènements de duplication
se sont traduits par une tétraploïdisation partielle de leur génome et ont conduit à une
diversification accrue, du nombre de copies, et/ou de la nature (le gène ancestral pouvant ou
non avoir été éliminé au profit d’une copie) des gènes chez les poissons téléostéens. Une autre
limitation à la recherche de gènes orthologues résidait dans le degré de couverture du
séquençage des génomes, très variable d’une espèce à l’autre. Malgré ces limitations nous
avons pu identifier tous les gènes orthologues aux gènes sélectionnés présent chez le zébrafish
et le médaka (à l’exception du gène rfsh).
Certains orthologues ont été identifiés sur les autres génomes de poissons connus mais
pas de manière systématique en raison : du plus faible nombre d’ESTs séquencés limitant
l’annotation des gènes, de la complexité de certaines organisations géniques (présence de
nombreux petits exons), ou de la plus faible couverture de séquençage. L’identification des
gènes orthologues chez un grand nombre d’espèces de poissons téléostéens nous a permis de
renforcer les études phylogénétiques et donc l’orthologie des gènes, mais aussi l’analyse des
fragments promoteurs réalisée, pour identifier des éléments de régulation de la transcription
intervenant dans la spécificité cellulaire et/ou tissulaire d’expression. Ainsi, nos observations
effectuées sur le promoteur potentiel du gène gsdf1 (Figure 12) suggèrent la conservation au
cours de l’évolution des poissons téléostéens de trois motifs nucléiques juste en amont de la
région transcrite dont certains pourraient fixer des facteurs de transcription connus pour être
préférentiellement exprimés dans le testicule (ex : gata1, gata4, sox). La conservation de
motifs au cours de l’évolution suggère un rôle fonctionnel comme il a été démontré pour le
gène amh chez les mammifères (Pask et al., 2004). Chez ces derniers, les premières 500 pb du
promoteur sont très conservés et confèrent une expression spécifique dans les cellules de
Sertoli (Lecureuil et al., 2002). Cependant, la conservation des éléments de régulation ne
semble pas aussi systématique d’un gène à l’autre. Contrairement à ce qui a été observé chez
les mammifères, la région promotrice potentielle du gène amh chez les poissons téléostéens,
ne montre pas d’éléments de régulation conservés. Il en est de même pour les gènes sycp1 et
sycp3. L’éloignement phylogénétique très important des différents génomes de poissons
téléostéens disponibles à ce jour, et une moindre pression de sélection sur les régions non
codantes, pourraient expliquer cette observation.
Outre la maîtrise des techniques de transgenèse, un chorion translucide, un coût
d’entretien moins élevé, le grand nombre de connaissances acquis sur son développement
embryo-larvaire, le zébrafish apparaît être une espèce modèle de choix pour notre étude de
fonctionnalité des promoteurs géniques en raison du degré de couverture de séquençage de
son génome et du plus grand nombre d’ESTs connus chez cette espèce qui conditionnent
l’identification des gènes orthologues et la fiabilité de prédiction des sites d’initiation de
transcription.
- 31 -
Choix de la région promotrice pertinente
N’ayant aucune information fonctionnelle sur la localisation des sites d’initiation de la
transcription, nous avons été confrontés à des choix concernant la taille du fragment
promoteur à étudier et la stratégie permettant de créer un gène de fusion. Le choix de la taille
des promoteurs étudiés a été défini en fonction des contraintes méthodologiques (PCR) et sur
la base de données bibliographiques montrant que des fragments d’ADNg inférieurs à 2Kb
pouvaient conférer une expression spécifique dans la gonade (Tableau 1). Cependant,
l’existence d’éléments de régulation plus éloignés de la région promotrice pourrait être
nécessaire à l’expression tissu-spécifique des gènes sélectionnés (Wakabayashi et al., 2003).
D’autre part, nous avons systématiquement choisi de fusionner le cadre de lecture de
la GFP en aval des deux premières bases du codon ATG initiateur du gène d’intérêt pour
éviter la création de sites d’épissage artificiels ou la présence d’exon leader non codant. Ainsi,
la région promotrice potentielle étudiée s’est retrouvée être inférieure aux 2Kb initialement
prévue, diminuant d’autant les chances d’apporter toute l’information pour l’expression tissuspécifique.
Vérification de la tissu spécificité des gènes
Dans cette étude, la distribution tissulaire de l’expression des gènes sélectionnés a été
étudiée chez le zébrafish par RT-PCR à partir d’ARN totaux. L’utilisation de couples
d’amorces spécifiques pour les gènes sycp1, sycp3, amh chevauchant des bornes exon/intron
ou localisés sur des exons différents suggère que ces gènes ont une expression préférentielle
dans la gonade. L’identité des produits de PCR reste cependant à démontrer par clonage ou
par southern blot. L’utilisation d’une technique aussi sensible que la PCR suggère une
expression de ces gènes dans d’autres tissus que la gonade. Celle-ci pourrait être la
conséquence d’une contamination des tissus lors de la dissection bien que la gonade ait été
prélevée en dernier. Elle pourrait aussi être le fait d’une transcription basale du gène
également appelée « transcription illégitime » lorsque l’expression du gène n’interfère pas
avec la biologie de la cellule ou de l’organisme. Les résultats obtenus avec les autres gènes
rfsh et gsdf1 montrant une expression de ces gènes dans tous les tissus restent à être confirmé
car les produits de PCR observé pourraient être le fait d’une amplification à partir d’ADN
génomique contaminant. Pour éviter ce problème, un traitement préalable des ARN totaux par
une DNAse I devra être réalisé avant leur rétro-transcription. D’autre part, des amorces
localisées sur les jonctions exons-intron devront être employées.
Production des vecteurs de transgenèse :
L’un des objectifs de l’étude était de mettre en œuvre et d’optimiser les méthodologies
permettant la construction d’un nombre important de vecteurs de transgénèse. Le choix de la
technique de PCR ancrée sur ADN génomique pour l’obtention des promoteurs de zébrafish,
s’est révélée relativement efficace, car 3 des promoteurs (gsdf1, rfsh, sycp3) ont été amplifiés
sur les 5 testés. L’absence d’amplification des promoteurs vasa et sycp1 pourrait s’expliquer
par exemple par un mauvais choix d’amorces, une structure conformationnelle du fragment
difficile à amplifier, un polymorphisme, ou une erreur dans l’assemblage de référence du
génome.
Le choix de la technique de clonage par recombinaison (système GATEWAY®) a
donc été mis en œuvre en raison de son efficacité supposée supérieure à la ligation.
Cependant, la technologie GATEWAY® a aussi présenté quelques limites puisque un
promoteurs sur les 4 testés n’a pu être recombiné dans les vecteurs de clonage. Nous avons été
confrontés à la difficulté de cloner les promoteurs par la recombinaison (BP), alors que la
- 32 -
deuxième recombinaison (LR) s’est avérée efficace à 100%. L’efficacité de la recombinaison
pourrait dépendre de la nature ou de la conformation spatiale de la séquence à cloner mais nos
résultats suggèrent que la taille des fragments à cloner pourrait également être un facteur
limitant. D’autre part, le fait que la recombinaison LR qui a lieu entre deux molécules
circulaires soit efficace à 100% pourrait nous amener à modifier la stratégie de clonage
initiale. Les vecteurs de clonage ayant des extrémités 3’ T protubérants sont très efficaces
pour cloner les produits de PCR car la Taq Polymérase ajoute un résidu A supplémentaires
aux extrémité des fragments amplifiés. Ainsi, le fragment promoteur linéaire et amplifié par
PCR pourrait être clonés plus efficacement dans un vecteur de clonage de type « TA cloning »
contenant les séquences attL nécessaires pour une recombinaison LR ultérieure
(pCR8/GW/TOPO, Invitrogen).
Vérification moléculaire des constructions :
Les constructions chimériques générées ont été vérifiées par séquençage de l’une des
extrémités. Ainsi nous avons vu que l’identité avec les séquences attendues était, sinon
optimale après correction, au moins très proche de 100%. Plusieurs hypothèses pourraient
expliquer les quelques divergences observées. Une erreur de réplication lors de
l’amplification par PCR est possible même si la fréquence d’erreur de la Taq polymerase
employée a été évaluée par le fournisseur aux alentours d’1/105 bases. Des erreurs de
séquençage du laboratoire ayant séquencé le génome du zébrafish sont également
envisageables. Enfin, le polymorphisme inter-individuelle peut également expliquer ces
différences. Quoiqu’il en soit les promoteurs devront être séquencés dans leur totalité pour
tenir compte de toutes les différences par rapport au génome de zébrafish de référence.
D’autre part, le clonage des promoteurs issus de réaction de PCR indépendante permettra de
déterminer l’origine artéfactuelle ou non des divergences de séquence.
Vérification fonctionnelle des constructions :
Les constructions ont été ensuite transfectées dans les cellules COS-7 pour essayer
d’identifier une activité promotrice des fragments d’ADN (supposés promoteurs) testés. Cette
approche a été satisfaisante dans le cas du promoteur cmv qui est un promoteur à très forte
activité classiquement utilisé pour surexprimer des protéines dans de nombreuses cellules
mammaliennes. L’utilisation de ce promoteur a permis de vérifier la fonctionnalité des
vecteurs de transgenèse natifs (notamment le cadre de lecture de la protéine fluorescente et les
signaux de maturation des transcrits) et la localisation cellulaire (cytoplasmique ou nucléaire)
attendue des différentes protéines fluorescentes testées. Aucune cellule significativement
fluorescente n’a pu être observée dans les cultures cellulaires transfectées avec les
constructions pAMH, pGSDF1 et pSYCP3. Ce résultat pourrait s’expliquer par une mauvaise
prédiction des régions promotrices car les sites d’initiation de transcription n’ont pas été
déterminés expérimentalement. Cependant, l’activité des promoteurs testés pourrait être trop
faible pour être détectable par simple observation directe de la fluorescence. L’analyse de
l’expression des constructions chimériques a donc été testée par RT-PCR mais les résultats se
sont révélés être inexploitables, du fait d’une contamination par l’ADN génomique
plasmidique mis en évidence par PCR sur des ARN non rétro-transcrits. Cette étude devra être
renouvelée en prétraitant les ARN extraits avec une DNAse I. L’activité promotrice de nos
constructions pourrait aussi dépendre du contexte cellulaire, c'est-à-dire de la présence ou
non, dans les cellules transfectées, d’un ensemble de facteurs de transcription appropriés pour
former un complexe de préinitiation de la transcription efficace. L’absence d’expression de
nos constructions dans les cellules COS-7 peut ainsi être considérée comme un résultat
prévisible dans la mesure où tous les facteurs de transcription nécessaires pour l’activité
promotrice ne sont peut être pas présents dans les cellules COS-7 ou que ces cellules
synthétisent un facteur inhibiteur. Bien que nous ayons essayé de transférer nos constructions
- 33 -
dans les cellules de testicule de truite, il ne nous est pas possible de confirmer ou d’infirmer
cette hypothèse étant donné l’absence de fluorescence dans les cellules transfectées avec le
vecteur contrôle pCMV-eGFP du laboratoire. L’amélioration de l’efficacité de transfection
des cellules de testicule de truite est une étape préalable essentielle à l’utilisation de ces
cellules pour contrôler l’activité promotrice de nos gènes chimériques. D’autre part, ces
cellules de truite ne sont pas encore caractérisées et il est possible que les cellules cultivées ne
correspondent pas à tous les types cellulaires d’intérêt pour notre étude (cellule de Sertoli et
germinales).
De plus, la plupart des promoteurs que nous avons étudiés ont un profil d’expression
dépendant du stade de maturation de la gonade. En effet, l’amh et gsdf1 sont fortement
exprimés chez la truite immature mais leur expression décroît fortement chez les animaux
maturant sexuellement pour devenir presque indétectable chez les animaux en spermiation.
De même, le gène sycp3 n’est exprimé qu’au moment de la première division de la méiose
dans les spermatocytes primaires. Nous n’avons pas observé le maintien des cellules
germinales dans nos cultures de cellules testiculaires. Il sera nécessaire de vérifier
l’expression des gènes dont sont issus les promoteurs dans ces cultures de cellules en cours
d’établissement. En effet, il est probable que la mise en culture des cellules testiculaires et
leur maintien sur une longue durée sélectionnent les cellules à forte activité prolifératrice.
Dans bien des cas, l’augmentation de la prolifération s’accompagne souvent d’un processus
de dédifférenciation cellulaire.
Enfin, les transfection transitoires ne permettant pas l’insertion des constructions dans
le génome, il est possible que l’expression de nos constructions dépende d’un environnement
chromatinien particulier fourni par exemple par le phasage des nucléosomes. La technique de
transgenèse qui a pour objectif d’insérer la construction dans le génome de l’hôte pourrait de
ce point de vue être plus favorable pour permettre l’expression de nos constructions.
Microinjection et expression des constructions
La caractérisation des animaux transgéniques est particulièrement importante pour
déterminer si l’absence éventuelle de fluorescence est due à un problème de transgenèse, ou à
un promoteur inefficace. L’absence d’efficacité du promoteur pourrait avoir plusieurs
origines. L’information nécessaire à l’expression gonade spécifique pourrait être portée par
une région située en amont ou en aval de la région promotrice testée et il faudrait alors
envisager de tester des promoteurs de plus grande taille.
Les constructions contenant les promoteurs des gènes de l’amh, gsdf1, sycp3 ont été
injectées dans les œufs de zébrafish. Chez la truite, l’expression des gènes de l’amh et gsdf1
est bien caractérisée et est observée chez les embryons peu après la première prise alimentaire
(55 jours post fécondation) (Guiguen et al., communication personnelle). Bien que le
développement du médaka et du zébrafish soit plus rapide, aucune expression des
constructions contenant les promoteurs potentiels des gènes amh ou gsdf1 ne devait survenir
dans les premières 24h de survie des embryons ; ceci en raison de l’expression tardive de ces
gènes. Cependant, étant donné que nous avons observé des cellules fluorescentes chez
certains embryons, le profil d’expression de ces gènes devra être revu.
Bien que nous ayons observé une fluorescence dans des territoires présomptifs de la
gonade chez certains individus microinjectés, il faudra attendre l’analyse de leur descendance
obtenue par un croisement avec la souche sauvage pour déterminer la reproductibilité du
profil d’expression spatio-temporel. En effet, les vecteurs microinjectés pourraient ne pas
s’insérer dans le génome de l’individu, mais perdurer dans les cellules sous la forme
d’épisomes. Ces fragments d’ADN extra-chromosomiques capables de se répliquer pourraient
être à l’origine d’expression ectopique des transgènes. L’analyse de la descendance (F1 et F2)
- 34 -
devrait permettre de vérifier la stabilité de l’insertion et la transmission mendélienne du
transgène.
Dans le cas du gène sycp3, une expression différée dans le temps en fonction du sexe
est attendue, car la méiose des cellules germinales est précoce chez la femelle (stade alevin) et
plus tardive chez le mâle (stade adulte maturant). Ainsi, l’absence de fluorescence dans les
embryons âgés de 24 h et microinjectés avec la construction contenant le promoteur sycp3 est
conforme à notre attente. La caractérisation des individus transgéniques correspondant ne
pourra être réalisée que tardivement après la mise en place de la maturation sexuelle chez ces
animaux.
L’identification des animaux transgéniques sera réalisée non seulement sur la base de
l’analyse de l’expression des transgènes fluorescents mais surtout sur la base d’une l’analyse
de leur génotype en vérifiant l’insertion ou non du transgène à partir d’ADN génomique de
nageoire (individus âgés d‘au moins 1 mois).
- 35 -
VII- Conclusions,
acquis du stage
Le travail réalisé pendant ces 6 mois de stage a permis de démontrer la fonctionnalité
des deux promoteurs : amh et gsdf1 in vivo. D’autre part, certaines étapes limitantes des
approches méthodologiques initialement choisies ont été mises en évidence. De nouvelles ont
été proposées (parfois avec succès) pour remédier aux problèmes. Il reste toutefois à optimiser
certaines étapes de la stratégie de construction pour arriver à un clonage à haut débit des
autres promoteurs candidats (notamment l’étape d’insertion dans un vecteur « donneur » de
type Gateway® des promoteurs géniques amplifiés par PCR).
Les perspectives à court terme du travail réalisé, auront pour but de déterminer si les
promoteurs obtenus portent bien toute l’information nécessaire pour cibler l’expression d’un
transgène dans la gonade. Si cela était le cas, les lignées transgéniques ainsi créées
constitueront des modèles animaux de choix pour l’isolement de fractions cellulaires purifiées
ou pour des études de lignages cellulaires. À plus long terme, les fragments promoteurs
pourront être utilisés afin d’étudier la fonction de gènes d’intérêt in vivo en permettant la
surexpression de transgène spécifiquement dans la gonade inhibant ou exacerbant la fonction
du gène ciblé.
Outre l’intérêt pour l’entreprise, d’un point de vue plus personnel, ce stage a permis
d’appréhender une nouvelle fois le monde de la recherche fondamentale, ses exigences, sa
rigueur, ses contraintes, ses difficultés mais aussi l’enthousiasme de ses réussites. Il m’a aussi
permis d’acquérir de nouvelles compétences : notamment la maîtrise des techniques de base
de biologie moléculaire dont on n’apprend en général que le principe théorique. D’un point de
vue de la maîtrise d’outils, il a permis l’utilisation des logiciels et/ou d’interfaces
informatiques, pour le traitement des informations des banques de données liées à la
génomique. Finalement, du fait de l’éloignement de la formation générale avec la
spécialisation de la recherche aquacole, la prise en main du sujet a nécessité un gros travail
bibliographique en parallèle du travail expérimental, qui permet une ouverture d’esprit
importante en ce qui concerne la mise à jour des connaissances. Il a du reste permis de me
responsabiliser et d’affiner mes compétences en terme de gestion de temps et d’information.
Ce stage a également tenu toutes ses promesses quant à la compréhension de la place
de l’ingénieur sensible aux questions de recherche dans la filière aquacole. Ce dernier peut
être amené à formaliser les difficultés de production rencontrés par les professionnels, en
questions scientifiques compréhensibles par les chercheurs, qui apporteront des connaissances
nouvelles permettant d’y répondre.
- 36 -
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