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Biopathologie et Cancer:
identification de marqueurs
et cibles thérapeutiques
moléculaires Puces à ADN et
Analyse du Transcriptome
Pr François Bertucci
Oncologie Médicale - Oncologie Moléculaire
Institut Paoli-Calmettes
Définitions
•
Biopathologie
= Étude des altérations moléculaires au sein d’un échantillon (solide ou liquide)
En pleine évolution depuis plus de 30 ans (avancées scientifiques, technologiques)
Années 95: début analyses à haut débit; actuellement en plein essor +++
•
Marqueur moléculaire
= Molécule dont la présence (ou l’absence) est associée au risque d’apparition d’un cancer (m. de
prédisposition), à sa présence (m. diagnostique), à son évolution clinique (m. pronostique et/ou prédictif de
réponse thérapeutique), à sa rechute (m. de surveillance)
Spécifique, sensible, dosable, reproductible…
•
Cible thérapeutique moléculaire
= Molécule cible des « thérapies moléculaires ciblées »
Molécule identifiée, rôle prouvé dans la maladie, avec corrélation à l’évolution clinique, molécule
mesurable (test diagnostique), « droguable » (enzyme, surface cellulaire par ex.)
Pourquoi typer les cancers ?
• Fréquence et gravité:
• ~240.000 cas/an en France (~1 cas toutes les 2 mn)
• ~150.000 décès/an (~1 décès toutes les 4 mn)
• Problèmes cliniques majeurs A RESOUDRE:
• dépistage, traitement préventif insuffisants
m. de prédisposition
• diagnostic tardif
m. diagnostique
• traitements inefficaces et/ou toxiques
• hétérogénéité évolutive des tumeurs
m. pronostique
m. prédictif de réponse
anticancéreux non spécifiques
thérapeutique
cible
●
Typage des tumeurs
Pourquoi au niveau moléculaire ? (1)
Car le typage histo-clinique est insuffisant face à
l’hétérogénéité des tumeurs
• Exemple des facteurs pronostiques et/ou prédictifs de réponse:
• cliniques: âge, sexe, stade d’extension…
• histologiques: ganglions, taille, grade, récepteurs hormonaux…
• Classification des tumeurs
• Progrès, mais insuffisants:
• bon pronostic: % d’échecs
• mauvais pronostic: % d’échecs
Sous-classes
non identifiées
Pourquoi au niveau moléculaire ? (2)
Pour mieux comprendre la complexité des tumeurs …
Cancer = accumulation progressive d’un grand nombre d’altérations
moléculaires dont les effets se combinent pour aboutir à l’apparition de la
tumeur et son évolution vers un phénotype de plus en plus agressif et
résistant aux traitements
Indépendance vis-à-vis
des facteurs de croissance
Echappement
à l’apoptose
Insensibilité aux
signaux anti-prolifératifs
+ instabilité
génétique
Angiogenèse
Phénotype invasif
et métastasiant
Potentiel réplicatif
illimité
(Hanahan D. et Weinberg R.A., Cell, 2000)
… et identifier de nouvelles
cibles thérapeutiques
spécifiques
Le typage moléculaire classique (1)
Tissus, cellules (sains ou pathologiques)
Broyage et lyse cellulaire
Extraction ADN, ARN, protéines
Étalement
Analyse morphologique microscope
ET moléculaire
- ADN: séquençage, caryotype, FISH, Southern blot…
- ADN: FISH
- ARN: Northern blot, RT-PCR…
- ARN: ISH
- Protéines: Western blot…
- Protéines: IHC
Recherche de marqueurs: corrélation avec le paramètre clinique
d’intérêt (survie, réponse TRT…)
d’abord dans des études rétrospectives, puis prospectives
avant éventuelle application clinique
Le typage moléculaire classique (2)
• ADN: anomalies de structure ou de nombre des chromosomes ou des gènes
Génomique Structurelle
• ARN et Protéines: anomalies d’expression
Génomique Fonctionnelle
• Approches classiques, « gène-à-gène », « protéine-à-protéine », « tissu-à-tissu »
analysant UN SEUL paramètre moléculaire sélectionné par échantillon et
par expérience
• Développement des outils d’analyse: très nombreuses études
• Progrès compréhension oncogenèse
• Retombées cliniques majeures
Quelques retombées cliniques
• ADN
•Amplification du gène HER2 dans les cancers du sein (pronostic, TRT)
• Séquençage du gène BRCA1 dans les cancers du sein héréditaires (dépistage,
TRT préventif)
•ARN
•Recherche de transcrits de fusion dans les leucémies aiguës (surveillance)
•Protéines
•Expression des récepteurs hormonaux RE/RP et de la protéine HER2
dans les cancers du sein (pronostic, TRT)
Biologie du Cancer du Sein et Applications Cliniques
approches moléculaires CLASSIQUES,
1 seul paramètre (ADN, ARN, protéine) par expérience
Ludwig, Nat Rev Cancer, 2005
Retombées Thérapeutiques
Majeures
…MAIS relativement limitées
compréhension incomplète
peu applications cliniques

Complexité moléculaire des tumeurs, hétérogénéité, aspect combinatoire

Biais méthodologiques
Typage moléculaire
à haut débit
Une nouvelle dimension:
le typage moléculaire à grande échelle
100aines à 10.000ers
paramètres simultanément
« OMIQUE »
ADN
CGH-array
ARN
Puce à ADN
Génomique fonctionnelle
Protéines
2D, SM
chromato., SM
Portrait moléculaire
Génomique
structurelle
(diversité - cibles)
Tissus
Tissuemicroarray
Protéomique
…grâce aux retombées de
• Projet Génome:
– clones ADNc (clones IMAGE, …)
– séquençage de banques de clones d’ADNc (EST 5’ et EST 3’),
Insert ADNc dans un clone
ADNc
5’
EST
3’
EST
– bases de données (dbEST, UNIGENE, …)
• Progrès technologiques:
– robotique (traitement des clones, spottage, …)
– bio-informatique (alignement des séquences, sélection des
clones, analyse des données…)
– analyse d’images (acquisition, quantification, …)
Intérêts potentiels
- Analyse très grand nombre de paramètres moléculaires et sans a priori
- Plus adapté à la complexité moléculaire des tumeurs
une combinaison de molécules fait mieux que chaque molécule
prise isolément…….
- Analyse d’un très grand nombre de tumeurs (tissue microarray)
•
Fondamental:
– Oncogenèse, résistance, invasion….
– réseaux géniques, régulation expression génique…
•
Pharmaceutique:
– nouvelles cibles thérapeutiques
– mécanisme d’action des traitements…
•
Clinique:
– dépistage
– diagnostic
– pronostic et prédiction de la réponse au traitement: TRT à la carte
– surveillance
L’ère post-Génome
GENOME
inventaire
pièces
détachées:
anatomie
élémt. répétés
chromosomes
gènes
Transcriptome
POST-GENOME
annotation
fonctionnelle,
relationnelle:
physiologie
Génomique Fonctionnelle
Protéome
Interactome
Métabolome…
Niveaux multiples de régulation
de l’expression génique
60.1012 cellules
Eucaryotes +++
ADN
~25.000 gènes
Transcription
Transcrit primaire: ARNm précurseur
Maturation (cap en 5’, queue polyA en 3’, épissage….. avec nbreux transcrits alternatifs)
noyau
cytoplasme
ARNm mature
~120.000 ARNm différents gènes
Transport
ARNm
Traduction
Dégradation du messager
ARNm inactif
Protéines
Activité (modifications post-traductionnelles…)
Fonction
~150.000 protéines
différentes (+ de
500.000 protéines…)
1. Transcriptome: puces à ADN
kb
9,49
7,46
4,40
– Etalement: HIS
2,37
1,35
0,24
– Nouvelles méthodes: milliers de gènes / expérience,
voire tous les gènes d’un organisme
Testicules 8 sem.
– Broyage et lyse cellulaire: Northern, RT-PCR..: 1 gène /
expérience
Thymus 8 sem.
= ensemble des transcrits d’un échantillon
Diverses méthodes à grande échelle
Même but : niveau d’expression (ARN) de milliers de gènes simultanément
1/ Basées sur la PCR
RT-PCR d’ARNm de différents tissus avec des amorces arbitraires et comparaison des ADNc sur gel
ex: Differential Display
2/ Basées sur le séquençage
Séquençage ADNc de différents tissus, identification (comparaison bases de données) et quantification
ex: Séquençage de banques ADNc, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
3/ Basées sur l’hybridation: PUCES A ADN
Hybridation d’un jeu d’ADNc ordonnés sur un support solide
(cDNA microarray) avec une sonde complexe préparée à partir
de l’ARN d’intérêt
(Liang and Pardee, Nat Rev Cancer, 2003)
Puces à ADN = DNA microarray
50 à 40.000 Gènes cibles (clones ADNc ou oligos (3’ ARNm))
Tumeur (cellules, tissus)
dépôt ou synthèse
extraction
ARN
RT (oligodT) et marquage
Puce: support solide (cm2)
cibles ordonnées
Sonde complexe en solution
ADNc
HYBRIDATION
acquisition
quantification,
Signal = f (Conc. Sde, Qté cible, marquage, lavage, expo…)
normalisation
PROFIL D’EXPRESSION GENIQUE
bio-informatique
Analyse et visualisation
Niveau d’expression = k x
Signal
Caractéristiques de l’hybridation sonde complexe
-Sonde complexe : tous les mRNAs exprimés dans l’échantillon, rétrotranscrits;
3’ de la séquence (oligo dT priming)
- Cibles : 3’ de la séquence des cDNAs (ARN de référence des gènes)
- Hybridation en excès de cible :
signal d’un gène proportionnel à :
- la concentration de la séquence correspondante dans la sonde ++
- la durée de l’hybridation
- la quantité de cible
- Remarques :
-Faible couverture de la cible (1%) : signaux faibles,
⇒
besoin d’un système de détection sensible
et de l’absence de signal non spécifique (contrôles)
-Northern, Southern : hybridation en excès de sonde
et durée telle que toute la cible soit saturée
⇒
le signal ne dépend que de la quantité de cible
Il existe plusieurs approches
Clones d’ADNc
Cibles et production
Oligonucléotides
Synthèse in situ
ou
dépôt
Dépôt
GMS Arrayer
PCR, (bactéries)
Support
Marquage
Membrane Nylon
colorimétrie
PCR
Lame de verre
radioactivité
Lame de verre
fluorescence
Acquisition
Scanner à plat
Radio-imageur
Microscope confocal
Puces avec clones d’ADNc
dbEST
dbEST
banques
ADNc:
clones
banque
d’EST :
séquences
acgatgctagcta
gctgatcgatcga
tcgtagc
clusters
d’EST :
‘gènes’
1. sélection de gènes ou
non selon question posée
1 clone ADNc = 1 gène
2. sélection des clones
3. PCR
et
spottage
UniGene
clustering
Fabrication
des puces
I.M.A.G.E.
séquençage
En amont
des puces:
consortium
IMAGE
Images d’hybridation
Microarray Nylon
radioactivité P33
Macroarray
Nylon
radioactivité P33
8 x 12 cm2 - 1.200 cibles
simple marquage - µg ARN total
Coût moindre, ré-utilisable++
7.2 x 1.8 cm2 - 9.300 cibles
simple marquage - < µg ARN total
Coût moindre, ré-utilisable
Microarray
Nylon
colorimétrie
1,8 x 2,7 cm2 - 9.600 cibles
double marquage - µg ARNm
Coût moindre, densité+++
Microarray
Verre
fluorescence
1,8 x 1,8 cm2 - 6.400 cibles
double marquage - µg ARNm
Coût +++, densité+++
Oligonucléotides
GenBank
GenBank
dbEST
dbEST
banque de
séquences
gènes
acgatgctagcta
gctgatcgatcga
tcgtagc
synthèse puis dépôts
•robots spotteurs
•imprimantes ‘jet d’encre’
11 à 1
Oligo / gène
sélection de 20 à
60mer
spécifiques
synthèse in situ
11 20mer / 1 gène
(Affymetrix)
1 60mer/1 gene
(Agilent)
•photolithographie (Affymetrix) +
•imprimantes ‘jet d’encre’ (Agilent) +
µg ARN messager
fluorochrome
Sonde A
Sonde B
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
Oligonucléotides
Lame de silicium
12.8 x 12.8 mm
Densité
64.000 oligos,
soit 1.600 gènes
(1 gène = 20+20 oligos)
NB: double marquage
possible
Puces à oligos – Fluorescence
Coût +++, densité
(Wodicka et al, Nat Biotechnol, 1996, 15, 1359-67)
39.000 gènes
1,3 cm
Oligochips (20 mer)
Verre
fluorescence
1,3 x 1,3 cm2 - 40.000 gènes
Coût+++, densité+++
Analyse des résultats:
deux approches
200 gènes candidats – cDNA macroarrays nylon – radioactivité
34 cancers du sein localisés et 1 SN
Deux types d’analyse: approche différentielle et approche profils d’expression
« Approche
différentielle » (« screening »)
Tumeur RE+
Tumeur RE-
Différentiels
Reproductibilité
100
Tumeur RE-
Hybridation
Hybridation22
100
10
1
0.1
0.01
10
1
Liste de gènes
différentiels
0.1
0.01
0.001
0.001
0.1
10
Hybridation 1
1000
0.001
0.001
0.01
0.1
1
Tumeur RE+
10
100
Approche différentielle
Cancer du sein
Clone ID
207378
129757
235947
154343
120649
153275
109677
172152
Gene / Protein identity
Gene symbol
MYB Related Protein B
GATA-binding protein 3
Stromelysin 3
Granzyme H
T-Lymphocyte surface CD2 antigen
Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2
CREB Binding Protein
EGFR-binding protein GRB2
MYBL2
GATA3
STMY3
GZMH
CD2
CRABP2
CREBBP
GRB2
***
T / NB
(a )
17.8
15.9
9.5
7.5
7.2
5.1
5.0
Avantages:
Clone ID
147016
179197
231424
111461
195022
220451
125413
290007
Gene / Protein identity
Gene symbol
*
ERBB2 Receptor Protein-Tyrosine Kinase ERBB2
Protein Phosphatase PP2A, 55 kD Subunit PP2A BR gamma
Glutathione S Transferase Pi
GSTP1
SOX4 Protein
SOX4
Interleukin 2 Receptor Beta chain
IL2RB
Zinc Finger protein 144
ZNF144
Mucin 1
MUC1
CD44 antigen, epithelial form
CD44
10N+ / N5.0
5.0
2.7
2.7
2.4
1.9
1.8
1.7
-nombre d’échantillons
-analyse « simple » (replicates,
Bonferroni)
Inconvénient:
information limitée
Clone ID
129757
356763
248613
211999
235947
229839
153275
301950
Gene / Protein identity
Gene symbol
GATA-binding protein 3
Granzyme A
MYB proto-oncogene
KIAA1075 protein
Stromelysin 3
Macrophage Stimulating 1
Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2
X-box Binding Protein 1
GATA3
GZMA
MYB
KIAA1075
STMY3
MST1
CRABP2
XBP1
*
*
*
ER+ / ER28.6
5.7
3.4
3.3
3.1
2.8
2.7
2.7
NT45 ER+
NT44 ER-
AT20 ER-
NT43 ER-
AT19 ER+
NT41 ER+
NT40 ER+
AT18 ER-
b
10
NB
a
AT17 ER-
L’expression de GATA3 est corrélée
à celle de RE
1
4.0 kb
GATA3
1.8 kb
β ACTIN
0.1
NB
0.01
0.001
ER-
ER+
Macroarray - p = 0.001 (Mann-Witney test)
Northern blot , 79 tumeurs - p < 0.0001 (Mann-Witney test)
« Approche Profils d’Expression »:
Signatures Moléculaires définissant des Classes de Tumeurs
Masse de données produites ++++
Dissymétrie +++++
Bioinformatique (Analyse et Visualisation)
Supervisées
Non supervisées
« Découverte de classes » non connues « Prédiction de classes » phénotypiques connues
Validation ?
% classification correcte
Recherche de corrélations:
- classes de T et facteurs histo-cliniques ?
- classes de gènes et fonction, chromosome…?
% classification correcte ? Sensibilité, spécificité ?
Hybridations
Exemple d’Analyse Non Supervisée:
Clustering hiérarchique
Quantification
Echantillons
E01 E02 E03 E04 E05 E06 E07
E08
G01 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78
0,00
G02 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00
8,22
Mesure des corrélations
entre gènes
et entre échantillons
G03 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66
0,41
Gènes
G04 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00
3,85
Cluster I
G05 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78
0,00
G06 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00
8,22
G07 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66
0,41
G08 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00
3,85
G09 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66
0,41
G10 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00
3,85
G11 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78
0,00
G12 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00
8,22
G13 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66
0,41
Colorisation
G14 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00
3,85
G15 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66
0,41
G16 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00
3,85
G17 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78
0,00
G18 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00
8,22
G19 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66
0,41
Cluster II
Classification des gènes
et des échantillons
selon leur similarité
Classification
Recherche de corrélations:
- classes de T et facteurs histo-cliniques ?
- classes de gènes et fonction, chromosome…?
Profils d’expression
Patterns:
-type cellulaire (microdissection virtuelle)
-fonction
Avantages
« Débrouillage »: qualité données
Information supplémentaire:gènes, échantillons
Inconvénients:
-nombre d’échantillons
-analyse statistique
(Ross et al, Nat Genet, 2000, 24, 227-35)
CH sur 88 échantillons et 11.000 gènes, soit ~970.000 mesures
Lymphomes B Diffus à Grandes Cellules
Cliniquement relevantes
Probabilité de Survie Globale
CB
activées
sang
et
CB CG
CB repos
Analyse non supervisée
Deux classes
Biologiquement
19 patients, 6 décès
21 patients, 16 décès
Années après le diagnostic
LBDGC de type CB CG
LBDGC de type CB activées
(Alizadeh et al, Nature, 2000, 403, 503-11)
Hybridations
Analyse Supervisée:
« Prédiction de classes »
Quantification
Population divisée en
2 sets indépendants
-training, learning
- validation set
% classification correcte
Validation ?
Performances: % classification correcte, sensibilité, spécificité,….
Applications en Cancérologie
•
ARN
•
Fondamental
lignées cellulaires, cellules, tissus; sain ou tumoral; avant, pendant, après TRT; modèles
expérimentaux (transfection, RNAi)…
–
–
•
Clinique
–
–
•
Oncogenèse (gènes impliqués dans la progression, la résistance…)
Caractérisation des gènes co-exprimés:
annotation fonctionnelle, étude de la régulation (promoteurs…),
réseaux géniques (cinétiques d’activation ou d’inhibition…)
Nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques
Nouvelles classes diagnostiques et pronostiques
Pharmaceutique
–
–
–
–
–
Identification de nouvelles cibles thérapeutiques
Effets du gène cible sur le transcriptome
Mécanisme d’action des drogues (validation, cibles secondaires)
Effets secondaires des drogues
Identification de populations homogènes (essais thérapeutiques)
Classifications pronostiques
basées sur les profils
d’expression
Ça marche: lignées cellulaires
13 lignées
1.200 gènes
(Khan et al, Cancer Res, 1998, 58, 5009-13)
Etudes Pronostiques Cancer du Sein
1. Approches non supervisées sur tumeurs

Classification moléculaire du cancer du sein
2. Approches supervisées sur tumeurs

Signatures moléculaires
3. Approches supervisées basées sur une hypothèse
biologique

Signatures moléculaires avec un sens biologique
ensuite appliquées aux tumeurs
1. Non supervisée: Classification Moléculaire
Nature 2000
Hétérogénéité transcriptionnelle+++++
5 sous-types homogènes
- biologiquement relevants
- Luminal: RH+, CK8/18+
- lum.A: RE++, prolif- lum.B: RE+, prolif+, survie- / lum.A
cibles TRT: RE - autres?
- Her2+: RH-/+, Her2+
- cliniquement relevants
TP53 mutations, grade+,
survie < lum.A
cibles TRT: Her2 - autres?
- Basal: RH-, Her2-, CK5/6/17+
TP53 mutations, grade+,
survie < lum.A
cibles TRT: EGFR? autres?
Robustesse des sous-types moléculaires
Sorlie: 115 T, 5 classes
Data dispo web: van’t Veer: 97 T, 5 classes
Hétérogénéité IBC avec
- existence de sous-types moléculaires
- associés à différences de survie
- et
différences de taux RCH
Her2 et basal > luminal
22.000 gènes Puces Affymetrix - 82 T1-T4 avec CT néo-adjuvante séquentielle (Taxol x 12 / FAC x 4)
Sous-types moléculaires et Réponse Histologique à la CT (21 RCH et 61 non-RCH)
Sous-types
moléculaires
Corrélation
avec RCH
Corrélations histo-cliniques
Age (jeune et basal)
Type histologique (médullaire et basal; lobulaire et luminal A ou normal-like)
Grade (faible et luminal; élevé et basal; luminal A vs B)
Expression RH (luminal A/B)
Expression HER2 (Her2 sous-type)
Mutations TP53 (basal)
Amplifications TOP2A (Her2 sous-type)
Corrélations+++
Avec paramètres pronostiques majeurs: RH, HER2, prolifération
Intérêt pronostique / paramètres classiques: pas certain
Evolutions attendues (nombre de tumeurs analysées)
Kit diagnostique: Breast BioClassifier (ARUP aux USA)
50 gènes en QRT-PCR
Sous-type BASAL
KRT5,6,7,17,23
EGFR
KIT
CRYAB
MKI67
MET
Aurora B
LYN
FOXM1C
CDH3…
10-20% - le plus homogène
Corrélation pT / pN non significative
Grade élevé
Souvent RH-, Her2-, CK5/6/14+
mutations TP53, mutations BRCA1
Métastases viscérales (foie, poumon, cerveau)
Survie défavorable, mais Réponse CT
Basal aussi (voire plus) différent de luminal … que de K colon….
Basal
Colon
14.500 gènes
Luminal
….des maladies très différentes au sein du cancer du sein….
Intérêt clinique
=
définition d’entités plus homogènes
- pour rechercher des facteurs pronostiques/prédictifs
dans un environnement moléculaire homogène
- pour définir et tester des thérapies ciblées spécifiques
des sous-types (basal+++)
2a. Analyses supervisées sur tumeurs:
Signatures Moléculaires et Pronostic

Cancer du sein localisé ou localement avancé
Signatures moléculaires associées à la survie ?
- Sans CT adjuvante:
- van’t Veer et al, Nature, 2002; van de Vijver et al, NEJM, 2002
70-gene signature (Amsterdam)
- Wang et al, Lancet, 2005; Foekens et al, JCO, 2006 (Rotterdam)
Essai prospectif
MINDACT
- Avec HT adjuvante:
- Ma et al, Cancer Cell, 2004
- Paik et al, NEJM, 2004 (21-gene signature: Oncotype)
- Avec CT adjuvante:
Bertucci et al, Hum Mol Genet, 2000, 2002, en cours
- Avec et Sans CT adjuvante:
Pawitan et al, Breast Cancer Res, 2005
Essai prospectif
TAILORx
Essais prospectifs
Sans CT adjuvante
Signature d’Amsterdam
dans le cancer du sein localisé N-
CT adjuvante ?
Traitement inutile
Succès du
traitement
Succès du traitement
mais toxicité majeure
à long terme (IC, LA…)
Rechute malgré
le traitement
Déjà guéris par la chirurgie
Mieux identifier
les patientes qui n’ont pas besoin de CT
Supervisée
Learning set: 78
25.000 gènes
97 T localisées, âge < 55 ans, N-, pT1-T2,
sans CT ou HT adjuvante
70 gènes discriminants
Signature d’Amsterdam
2 groupes MFS différente
Evite « sur-traitement »
Validation set: 19
Validation du « prédicteur » à 70 gènes en analyses multivariées
1/
25.000 gènes - 295 T localisées consécutives, unicentriques
pT1-2, âge < 53 ans, de bon et de mauvais pronostic
2/
Puces Mammaprint (Agendia) - 307 T localisées,
localisées 5 centres
pT1-2, N-, âge < 60 ans
Kit Mammaprint
CE, puis FDA (Février puis Juin 2007)
1er test Puce à ADN commercialisé (Europe, puis USA)
70 gènes x 3
+ contrôles
RH pos et neg
Réponse dans les 10 jours
~3.200 dollars, remboursement ?
Pronostic: ni diagnostic, ni prédiction réponse TRT
Orienter ou non vers une CT adjuvante chez NIntérêt clinique? Essai MINDACT (TransBIG EORTC)
Essai prospectif randomisé testant la supériorité
d’un pronostic défini par la signature génique (genomic arm) par rapport
au pronostic défini sur les critères histo-cliniques (clinical arm Adjuvant OnLine !)
dans le cancer du sein pN0 (et récemment 1 à 3 N+)
N = 6000
Europe
Objectif principal:
démontrer une
survie meilleure
ou
équivalente
dans le bras
Génomique
MALGRE
~15% de CT en moins
Début: Août 2007…Inclusion+…
Faisabilité clinique en temps réel ?
Etude RASTER
(Lancet Oncol, 2007)
Pays-Bas, 16 centres
RNA later et envoi au NCI Amsterdam
Si N-, envoi à Agendia Amsterdam
Extraction ARN, Puce Mammaprint
« Bon » ou « mauvais » groupe
Retour centre et TRT adjuvant
Faisable
Echecs génomique = 23%
Avec HT adjuvante
Objectif: signature d’expression, par RQ-PCR sur échantillons en paraffine,
associée à la rechute à distance dans le K sein, RH+, N- après Tam adjuvant
Objectif: éviter le rajout de la CT
1/ Identification du modèle multigénique
250 genes sélectionnés - RQ-PCR - 447 N- avec Tam +/- CT adjuvante – corrélation avec la rechute
21 gènes (16 gènes et 5 contrôles), calcul Recurrence Score (RS)
RS (0 à 100), 3 classes: faible, intermédiaire, haut risque de rechute
2/ Validation du modèle
Calcul du score RS sur 668 N- avec Tam adjuvant (NSABP B-14): 3 classes associées à rechute
OK en multivariée
Etudes complémentaires sur le Recurrence Score
Validation N- : 770 patientes sans CT (Habel et al, Breast Cancer Res 2006)
avec effet plus fort avec HT que sans HT
Validation N+ : 78 patientes (Cobleigh et al, Clin Cancer Res 2005)
Bénéfice chimiothérapie selon le risque ? OUI si Risque Elevé
- adjuvant: 660 NSABP B-20 HT +/- CT (Paik et al, J Clin Oncol 2006)
pas bénéfice CT si risque faible ou intermédiaire
bénéfice CT si risque élevé
- néo-adjuvant:
Chang et al, Breast Cancer Res 2008 - Gianni et al, J Clin Oncol 2005)
Oncotype and Economic Studies
Economic analysis of targeting chemotherapy using a 21-gene RT-PCR assay in lymph-node-negative, estrogen-receptor-positive, earlyHornberger et.al. Am J Manag Care. 2005
Impact of a 21-gene RT-PCR assay on treatment decisions in early-stage breast cancer: An economic analysis based on prognostic and p
Lyman et al. Cancer 2007
Oncotype DX and Adjuvant Treatment Decisions
Prospective multi-center study of the impact of the 21-gene recurrence score assay on patient satisfaction, anxiety and decisional conflict
conflic
Mumby et al. 2007 SABCS San Antonio, Texas. Abstract #1092
A retrospective analysis of the impact of oncotype
DX low recurrence score results on treatment decisions in a single academic breast cancer center.
Liang et al. 2007 SABCS San Antonio, Texas. Abstract #2061
Evaluation of practice patterns in the treatment of node-negative, hormone-receptor positive breast cancer patients with the use of the
oncotype DX assay at the University of Pennsylvania.
Erb et al. 2007 SABCS San Antonio, Texas. Abstract #3082
Prospective multi-center study of the impact of the 21-gene Recurrence Score (RS) assay on medical oncologist (MO) and patient (pt) ad
Lo et al. J Clin Oncol 2007
Impact of a Commercial Reference Laboratory Test Recurrence Score on Decision Making in Early-Stage Breast Cancer.
Oratz et al. J Oncol Pract. 2007
Kit Oncotype DX
USA, pas agrément FDA
ASCO2007 – NCNN2008
~3.500 dollars
remboursement OK
Pronostic et prédiction réponse TRT
Utilisation+++ (>40.000 tests entre 2004 et 2008)
New guidelines
Oncotype DX® is included in both
the ASCO 2007 Update of Recommendations for the
Use of Tumor Markers in Breast Cancer and
the NCCN 2008 Clinical Practice Guidelines in
Oncology Breast Cancer
to identify certain subgroups of patients with N-, HR+
breast cancer who may be successfully treated with HT
alone and may not need CT.
ASCO: The Oncotype DX assay is recommended to identify:
Patients with low recurrence risk who may not benefit from adjuvant CT (specifically CMF/MF)
Patients with high recurrence risk who may derive significant benefit from adjuvant CT (specifically CMF/MF)
NCCN: The NCCN expert panel recommended in their 2008 Clinical Practice Guidelines consideration of the use of
the Oncotype DX test for HR+ patients with the following clinical features:
Tumor size 0.6-1.0cm, moderate/poorly differentiated or unfavorable features*; or
Tumor size >1cm
Orienter ou non vers une CT adjuvante chez N- RH+
Intérêt clinique? Essai TAILORx (US NCI)
Essai prospectif randomisé testant
la non-infériorité en terme de DFS de HT seule par rapport à HT+CT
chez les patientes de risque intermédiaire selon Oncotype
dans le cancer du sein pN0 RH+ Her2-, ≥1cm
N >10.000
1.000 centres américains
Protocoles libres HT et CT
Début: Mai 2006…Inclusion+++…
Avec CT adjuvante
1ère étude:
200 gènes (ADNc) - 34 T localisées
Signature pronostique à 23 gènes pour les T de mauvais pronostic avec CT adjuvante à base d’A
2ème étude:
1000 gènes (ADNc) - 55 T localisées de mauvais pronostic avec CT adjuvante à base d’A
1. Validation de la signature
2. Amélioration
40 gènes discriminants (2 métagènes) - 3 classes de T équilibrées
3ème étude: multicentrique
468 T localisées traitées par CT adjuvante à base d’anthracycline
IPC (213) - CLB (110) - Bergonie (17) - FNCLCC: PACS 01 (FEC100: 128)
MFS à 5 ans 75%
Puces à ADN Ipsogen (~9.000 gènes) → Modèle à 3 métagènes
Learning set n=323
5y-MFS 79% vs 52%
p<0.0001
HR: 2.35 (1.50-3.5)
Validation set n=145
5y-MFS 86% vs 61%
p=0.001
HR: 3.49 (1.6-7.5)
Multivariate analysis
The model is the strongest
prognostic factor
Deux groupes de patientes de survie différente après CT adjuvante à base
d’Anthracycline:
– « Bon pronostic: ~80% 5y-MFS
– « Mauvais pronostic: ~60% 5y-MFS : Anthracycline-résistance ?
Application potentielle:
Sélection du protocole optimal de CT adjuvante:
« Ne pas donner tout et la même chose à tout le monde »
– Groupe de bon pronostic :
• Donner CT à base d’A sans taxane (« ne pas donner tout ») = SA02
Transfert clinique = Essai SA02
Cohorte Prospective
Utilisation d’une Signature Génomique
comme Facteur Décisionnel de la Chimiothérapie
Adjuvante des Cancers du Sein
Promoteur: Institut Paoli-Calmettes
Multicentrique (IPC Marseille, CAL Nice, CHG Toulon, CLB Lyon)
•
•
Cancer du sein non métastatique N+
sélectionné sur le profil génomique «bon pronostic» de leur tumeur
Traité par CT avec anthracyclines (6 FEC 100)
•
Objectif principal: confirmer la MFS à 5 ans observée dans les séries rétrospectives
après FEC100 sans taxane dans ce groupe sélectionné par la signature multigénique
•
Objectifs secondaires:
– 5y-OS
– Faisabilité en temps réel de la génomique
– Recherche de transfert génomique et protéomique
– Evaluation socio-économique
•
Inclusion: 200 patientes nécessaires, soit 375 à inclure sur 2 ans
en cours depuis 2008
2b. Analyses supervisées: Signatures Moléculaires
et Prédiction de la Réponse à la CT
Cancer du sein localisé ou localement avancé dont inflammatoire
Signature moléculaire associée à la réponse?
Chang et al, Lancet, 2003; Chang et al, JCO, 2005 (Baylor; docetaxel)
Ayers et al, JCO, 2004 (MD Anderson, paclitaxel, then FAC)
Bertucci et al, Cancer Res, 2004-2005: IBC
Rouzier et al, Clin Cancer Res, 2005 (MD Anderson, same CT, molecular sub-types)
Gianni et al, JCO, 2005 (Milan - MD Anderson, AT, then paclitaxel, RQ-PCR
paraffine 384 gènes et validation signature 21 gènes)
- Hannemann et al, JCO, 2005 (Amsterdam, AC ou AT: pas de signature RCH)
- Hess et al, JCO, 2006 (MD Anderson, paclitaxel, FAC)
-
12.000 gènes Puces Affymetrix - 24 T local. avancées avec CT néo-adjuvante (Taxotère x 4)
Supervisée sur Réponse Clinique à la chimiothérapie (12 répondeurs et 12 non-répondeurs)
p<0.001
Validation sur
6 nouveaux cas
(tous répondeurs)
30.721 cDNA Puces MD Anderson - 42 T2-T4 avec CT néo-adjuvante (Taxol x 12 / FAC x 4)
Supervisée sur Réponse Histologique à la chimiothérapie (13 RCH et 11 non-RCH)
N=24
N=18
Validation
74 cDNA
~8.000 gènes - 81 Tumeurs
44 NIBC
37 Inflammatory BC
5
10
15
20
25
Réponse Histologique à la CT néo-adjuvante
(anthracyclines)
N=26 : 9 RCH+ et 17 RCH-
85 gènes
Supervisée sur
Type IBC vs NIBC
et sur
RCH
1
85 gènes discriminants
0
-1
2 groupes IBC
RCH
70%
RCH
0%
3. Approches supervisées basées sur une
hypothèse biologique:
Signatures moléculaires avec sens biologique
Identification d’une signature multigénique associée à un
processus biologique pertinent en cancérologie
Paramètre
biologique
agressivité
Facteur
pronostique
- Cicatrisation: signature fibroblastes stimulés par du sérum
(Chang et al, PLoS Biol, 2004; Chang et al, PNAS, 2005)
- Hypoxie: signature épithélium en hypoxie
(Chi et al, PLoS Med, 2006)
- Cellules souches cancéreuses
(Glinsky et al, J Clin Invest, 2005; Liu et al, NEJM, 2007)
- Grade histologique
(Sotiriou et al, JNCI, 2006)
- Mutation P53 (Miller et al, PNAS, 2005)
PUIS application sur données d’expression publiques de
tumeurs avec annotations cliniques pour évaluer l’impact
pronostique de la signature
9 échantillons:
6 « cellules souches cancer »
vs 3 épithélium mammaire Nl
sur Affymetrix U133A/B
Signature 186 gènes (IGS)
Application IGS à données publiques
295 T sein
Application IGS à données publiques
de 3 autres cancers
Grade histologique… et grade génomique
Grade histologique:
3 critères: degré de différenciation, pléïomorphisme nucléaire, activité mitotique
Reflet direct de certaines caractéristiques biologiques de la tumeur
GH1 GH2 GH3
25%
50%
25%
Facteur pronostique et facteur prédictif de réponse à la CT
Mais imparfait
- reproductibilité faible pour les grades II
- valeur pronostique du grade II intermédiaire donc pas claire
- difficile à évaluer sur biopsie
Définir une mesure plus objective,
reproductible et fiable
GG1
GG3
Analyse de 661 tumeurs
Training set (N = 64): comparaison grade I vs II
signature
score = GGI
Validation set (N = 597): application du GGI: grade I vs III ? Grade II ? Pronostic ?
Training set
64 tumeurs dont 33 GH1 et 31 GH3 – Puces Affymetrix UI33A
GH1
GH3
Comparaison GH1 vs GH3
128 probe sets
97 gènes (cycle cellulaire++)
Score = GGI
Validation set
597 tumeurs (4 datasets) dont GH1, GH2 et GH3 – puces différentes
Validation signature GH1 vs GH3
Deux types de GH2 selon GGI (GH1-like et GH3-like)
de survie différente (GH2/GG1 mieux que GH2/GG3)
GH2
GG1
GG1
GG1 GG1
GG3
GG3
GH2
GG3
GG3
GG1
GG1
GG1
GG1
GG3
GG3
GG3
GG3
N = 570 - GH et GG - Survie sans rechute
Même différence
Mêmes différences entre les 5 sites
Grading à 3 classes (histologique) remplacé par
Grading à 2 classes (génomique) plus performant au niveau pronostique
pour les grades 2 histologiques
Commercialisé Juin 2008
Marquage CE diagnostic
Bilan Puces à ADN et Pronostic du Cancer du Sein

Hétérogénéité moléculaire du cancer du sein +++

Amélioration de l’information pronostique par l’identification, à partir de
signatures moléculaires de dizaines de gènes, de nouvelles sous-classes dans des
classes histo-cliniques a priori homogènes, mais d’évolution différente

Modification des essais cliniques
 Incorporation systématique de la collecte et congélation des tissus
signatures prédictives, signatures d’activité
 Mise en place d’essais basés sur la génomique
- Validation signatures (MINDACT, TailorX, SA02)
- Définition de groupes plus homogènes (même profil génomique):
interprétation des résultats, effectif plus réduit, essai plus rapide
Questions

Validité scientifique ?
- Sous-types moléculaires: OK
- Signatures supervisées « directes »: critiquées,
MAIS validation indépendante ET concordance en terme de prédiction
- Signatures supervisées « indirectes » biologiques: OK

Amélioration information pronostique, mais jusqu’à quel degré ?
mais possibilité d’incorporer sur la même puce plusieurs signatures
(pronostic, prédiction réponse TRT, grade génomique, ER, HER2…)

Réelle utilité clinique ?
réponse dans plusieurs années

Ratio coût/bénéfice

Echantillons disponibles
congélation ou solution conservation qualité ARN (RNA later): doit suivre
Application des 5 signatures aux données publiques
de van de Vijver et al
295 tumeurs
Bonne concordance en terme de prédiction des 5 signatures
Challenges avant transfert clinique
• Echantillons tumoraux :
–
–
Tumorothèque (annotations, base de données, consentements)
ARN: qualité (tissus congelés: paraffine?) et quantité (amplification?)
• Technologie :
–
–
–
Variabilité des mesures: expérimentale (contrôles qualité) et biologique (hétérogénéité des cellules
cancéreuses et des tissus cancéreux)
Comparaison et reproductibilité inter plate-formes++++; standardisation (ARN référence?)
Traitement des données: normalisation, signification statistique des corrélations (robustesse et
validation +++++), interprétation
• Autres challenges :
–
–
–
–
–
Confrontation autres analyses moléculaires à grande échelle (CGH array, protéome; tissue array TMA,…)
Validation sur grandes séries (TMA, RQ-PCR)
Etudes cognitives sur cibles moléculaires potentielles de thérapie ciblée ++
Futur au lit du patient (puce spécialisée ? RQ-PCR ? IHC ?)
Essais cliniques
6 plates-formes ≠ avec 3 laboratoires ≠ / plate-forme
4 échantillons ≠ avec 5 replicates / échantillon
intra-labs
inter-labs
Affx vs TaqMan
Ratio d’expression éch. A sur B
3 laboratoires
n=nbre de gènes testés
Résultats reproductibles et robustes
2. Autre analyse moléculaire
à haut débit
CGH array
Hybridation Génomique
Comparative sur Puces à ADN
CGH classique
Recherche de régions chromosomiques
amplifiées (oncogènes) ou délétées (gènes suppresseurs)
Mais faible résolution de la cible d’hybridation (5 –10 Mb),
identification difficile des gènes cibles.
CGH array
Cibles = clones ADN = gènes ordonnés
selon leur localisation chromosomique
Identification à haute résolution
de gènes amplifiés ou délétés
(Forozan F, Trends Genet, 13, 405-9)
3. Un nouvel outil de
Pathologie Moléculaire
Tissue microarray
Permet analyse des altérations moléculaires
d’une population cellulaire sélectionnée
dans le contexte de son microenvironnement tissulaire
dans un très grand nombre d’échantillons simultanément
Tissue microarray
Analyses de 1.000 tumeurs simultanément
section
Lame de verre: ~1.000 tumeurs
taille des spots: 0.6 mm
écart inter-spot: 0.7 mm
(Kononen K, Nat Med, 4, 844-7)
Tissue microarray
HES:
morphologie
ARN (ISH), protéines (IHC)
ADN (FISH)
Gain de temps, réactifs, argent
ET
reproductibilité
•
Complementarity : validation of discriminator
genes or proteins on larger series of samples
DNA microarray
Tissue microarray
Prognostic value of NM23 expression in colon cancer
DNA microarrays
22 K colon – 9.000 genes
« Metastase signature »: 244 genes
Tissue microarrays
191 K colon – Ab NM23
Negative correlation between NM23 status and metastatic relapse
Meta - / NM23 +
NM23 pos
NM23 neg
NM23
overexpressed
in samples
without
metastatic relapse
p=0.03
Meta + / NM23 -
2. Identification of molecular signatures
26 proteins IHC - 552 T (stage I-III) on TMA
Supervised analysis: metastatic relapse
Identification
Learning set: 368 T
26-protein signature
Validation
Validation set: 184 T
552 T
Potentiel énorme
Médecine moléculaire « à la carte »
à suivre….

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