influence du 2,4-d et de l`explant embryonnaire sur la callogenèse

97
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 97-112
INFLUENCE DU 2,4-D ET DE L’EXPLANT
EMBRYONNAIRE SUR LA CALLOGENÈSE DU
BLÉ DUR (*)
Kou toua AYOLIÉ ( 1 ) , Hou da EL YACOUBI
Atm ane ROCHDI ( 1 )
(1)
,
Des explants d’embryons matures ou immatures entiers ou
coupés de moitié de variétés marocaines de Blé dur (Triticum
durum) ont été cultivés sur le milieu MS supplémenté de
différentes concentrations de 2,4-D.
Pour l’ensemble des variétés étudiées, les meilleurs taux de
croissance de la matière fraîche ont été enregistrés à 3,5 mg/l de
2,4-D avec des taux de germination très faibles.
La callogenèse dépend du génotype et est favorisée par
l’utilisation d’embryons immatures et leur fragmentation. À 3,5
mg/l de 2,4-D, le taux moyen de callogenèse atteint 64 et 79 %
pour les embryons et demi-embryons matures, et 98 et 100 % pour
les embryons et demi-embryons immatures.
INTRODUCTION
Le Blé est essentiellement amélioré par des méthodes traditionnelles
qui restent longues et onéreuses. L’obtention de cals par culture in vitro
permet une augmentation de la variabilité et peut être suivie d’une
régénération et d’un taux élevé de multiplication [13].
[4 ]
(*)
(1)
Manuscrit reçu le 10 juillet 2006.
Unité Écophysiologie et Biotechnologie de culture in vitro, Université Ibn Tofaïl,
Faculté des Sciences, BP 133, 14000 Kénitra, Maroc. [email protected]
98
Chez le Blé tendre (Triticum aestivum), l’initiation de cals a été
généralement réalisée à partir de fragments de feuilles [20], d’inflorescences
[15], d’embryons immatures [1,10-11,14] et matures [5,8] avec plus ou moins
de succès selon les variétés.
La callogenèse du Blé dur (Triticum durum) reste moins maîtrisée et
dépend des variétés.
La présente étude vise à déterminer les conditions optimales de
callogenèse à partir d’embryons matures et immatures de sept variétés de
Blé dur en présence de 2,4-D.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Matériel végétal
Sept variétés marocaines de Blé dur (Triticum durum Desf.) ont été
utilisées : Amjad (recommandée pour les zones semi-arides), Marzak
(tolérante aux principales maladies cryptogamiques), OumRabia
(recommandée pour les zones semi-arides et arides), Sebou (résistante à la
rouille et tolérante à la septoriose et l’helminthosporiose), Ourgh
(d’adaptation très large), Anouar et Tomouh (d’adaptation large). Les
semences ont été fournies par l’INRA (Institut National de Recherche
Agronomique) de Rabat (Maroc).
Les embryons matures ont été prélevés à partir des graines de six
variétés (Amjad, Marzak, OumRabia, Ourgh, Sebou, Anouar). Les
embryons immatures (1 à 1,5 mm) de trois variétés (Amjad, Marzak et
Tomouh) ont été prélevés sur les épis de plantes cultivées sous serre, 2 à 3
semaines après l’anthèse.
Désinfection et mise en culture
Les caryopses matures et immatures débarrassés de leurs glumes et
glumelles sont désinfectés par trempage et agitation, dans de l’éthanol 70°
50 et 30 secondes, puis dans de l’eau de Javel à 25 % 25 et 15 minutes
respectivement. Suivent trois rinçages à l’eau distillée stérile sous une hotte
99
à flux laminaire horizontal. Une partie des embryons matures et immatures
est sectionnée en deux demi-embryons en divisant le scutellum dans le sens
de la longueur. Les explants sont placés face scutellaire vers le haut sur le
milieu de culture solide dans des boîtes de Petri de 9 cm de diamètre.
Initiation de la callogenèse
Le milieu utilisé est celui de Murashige et Skoog (MS) [9 ]
supplémenté de différentes concentrations (1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 et 4 voire 5
mg/l) de l’auxine 2,4-D (acide 2,4-dichlorophénoxyacétique). Le pH est
ajusté à 5,7 avant autoclavage 20 minutes à 120°C. L’incubation a lieu à
l’obscurité à 25 ± 2°C. Pour chaque variété et chaque concentration en 2,4D, trois boîtes de Petri renfermant cinq embryons et cinq demi-embryons,
matures ou immatures, sont utilisées.
Variables suivies
L’aptitude à la callogenèse est évaluée par les paramètres suivants :
- L’induction des cals est estimée par le taux de callogenèse,
pourcentage d’explants ayant produit un cal après deux semaines de culture
pour les embryons immatures et quatre semaines pour les embryons
matures.
- Certains explants germent et le taux de germination est alors
déterminé après deux et quatre semaines respectivement chez les embryons
immatures et matures.
- Le taux d’accroissement de la masse de matière fraîche du cal après
deux semaines pour les embryons immatures et quatre semaines pour les
embryons matures est calculé à partir de la différence de masse entre
l’explant initial et le cal obtenu, divisée par la masse initiale.
Analyse statistique
L’analyse de variance a été réalisée par un logiciel de statistique et le
test de Student-Newman-Keuls (SNK) a été utilisé pour le classement des
moyennes.
100
RÉSULTATS
Données générales
L’induction des cals a débuté après trois jours de culture chez les
embryons immatures et dix jours chez les embryons matures.
Les cals provenant d’embryons matures sont jaune clair sauf pour la
concentration 5 mg/l 2,4-D ou la coloration est jaune foncé. Ceux provenant
d’embryons immatures sont jaune blanchâtre.
Les cals présentent également des différences dans la consistance,
compacte ou friable et la texture, lisse ou rugueuse (Tableaux I et II).
Tableau I :
Effet du 2,4-D sur l’initiation des cals (toutes variétés confondues) à
partir d’embryons matures après quatre semaines de culture sur le
milieu MS à 25°C à l’obscurité.
2,4-D Embryon
(mg/l)
Induction
des cals (%)
Germination
Taux
Consistance,
(%)
d’accroissement Aspect
23,3
0,4
compact, lisse
27,8
43,3
0,8
compact, lisse
1,5
entier
17,8
2
demi
entier
25,6
36,7
2,5
demi
entier
54,4
43,3
41,1
36,7
0,9
compact, lisse
3
demi
entier
demi
53,3
53,3
65,6
27,8
23,3
13,3
1,9
-
friable, lisse
3,5
entier
demi
66,7
78,9
30,0
8,9
2,7
-
friable, rugueux
4
entier
demi
65,6
78,9
20,0
6,7
2,6
-
friable, rugueux
5
entier
demi
38,9
51,1
13,3
3,3
1,6
-
friable, rugueux
101
Tableau II :
Effet du 2,4-D sur l’initiation de cals (toutes variétés confondues) à
partir d’embryons immatures après deux semaines de culture sur le
milieu MS à 25°C à l’obscurité.
2,4-D Embryon
(mg/l)
1,5
2
2,5
3
3,5
4
entier
Induction
des cals (%)
100,0
Germination
Taux
Consistance,
(%)
d’accroissement Aspect
93,3
0,5
demi
91,1
86,7
-
entier
91,1
64,5
1,9
demi
93,3
35,6
-
entier
88,9
53,3
2,3
demi
91,1
20,0
-
entier
93,3
48,9
2,5
demi
97,8
15,6
-
entier
100,0
46,7
2,7
demi
97,8
4,4
-
entier
97,8
41,1
2,6
demi
97,8
11,1
-
compact, lisse
compact, lisse
compact, lisse
peu friable, lisse
peu friable, lisse
peu friable, lisse
Le taux de germination est plus faible pour les demi-embryons que
pour les embryons entiers et il baisse avec la teneur en auxine. En outre, à
1,5 mg/l de 2,4-D, il se forme une longue racine qui tend à disparaître à
partir de 3,5 mg/l. Les demi-embryons sont moins enclins à la germination à
partir de 3,5 mg/l (Figures 1 et 2).
L’induction des cals est importante dès 1,5 mg/l de 2,4-D pour les
embryons et demi-embryons immatures alors qu’elle ne dépasse 50 % qu’à
partir de 3 mg/l pour les embryons et demi-embryons matures. Cependant, à
3,5 mg/l de 2,4-D, on a une bonne induction de cals de masse importante.
102
Fig. 1 : Callogenèse d'embryons (à gauche des boîtes) et de demi-embryons
(à droite des boîtes) immatures de Blé dur après deux semaines de culture
sur le milieu MS en présence de 1,5 (photo de gauche) et 3,5 mg/l (photo de
droite) de 2,4-D.
Fig. 2 : Callogenèse d'embryons (à gauche) et de demi-embryons (à droite)
matures de Blé dur après quatre semaines de culture sur le milieu MS en
présence de 3,5 mg/l de 2,4-D.
Cas des embryons et demi-embryons matures
Les variétés étudiées présentent des taux de callogenèse différents
aussi bien pour l’embryon entier que pour le demi-embryon mature
(Figure 3b). Cette différence met en évidence l’effet génotype.
Concernant l’embryon entier, les variétés Anouar, Ourgh, Sebou et
OumRabia présentent des taux d’induction de cal supérieurs à 50 % pour
toutes les concentrations de 2,4-D utilisées, à l’exception de 1,5 mg/l où les
taux oscillent entre 13 et 26 %. Par contre, pour les variétés Amjad et
Marzak, les taux de callogenèse n’excèdent 50 % qu’à 3,5 et 4 mg/l pour
103
‘Amjad’ et 4 mg/l pour ‘Marzak’. La concentration optimale pour
l’induction du cal est de 3,5 mg/l pour les variétés Amjad, Sebou, Ourgh et
Anouar et de 4 mg/l pour les autres variétés.
Concernant le demi-embryon, les taux de callogenèse dépassent
toujours 50 % chez la variété Anouar et dans toutes les concentrations de
2,4-D utilisées, excepté 1,5 mg/l chez les variétés OumRabia, Sebou et
Ourgh. Par contre, chez ‘Amjad’ et ‘Marzak’, les taux de callogenèse
n’atteignent 50 % qu’à 3,5 et 4 mg/l.
Callogenèse (%)
100
80
60
40
20
0
Amjad
Marzak
Oum Rabia
Sebou
Ourgh
Anouar
a - Embryons entiers
1,5
Callogenèse (%)
100
2
80
2,5
60
3
40
3,5
4
20
5
0
Amjad
Marzak
Oum Rabia
Sebou
Ourgh
Anouar
b - Demi-embryons
Fig. 3 : Variation du taux de callogenèse d’embryons (a) et de
demi-embryons (b) matures de six variétés de Blé dur en fonction de la
concentration de 2,4-D après quatre semaines de culture
sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité.
Germination (%)
104
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Amjad
Marzak
Oum Rabia
Sebou
Ourgh
Anouar
Germination (%)
a - Embryons entiers
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Amjad
Marzak
Oum Rabia
Sebou
Ourgh
Anouar
b - Demi-embryons
Fig. 4 : Variation du taux de germination à partir d’embryons (a) et de
demi-embryons (b) matures lors de la callogenèse de six cultivars de Blé dur
en fonction de la concentration de 2,4-D après quatre semaines de culture sur
le milieu MS à 25°C à l’obscurité.
L’analyse de la variance (Tableau III) révèle des différences très
hautement significatives pour l’effet de la concentration en 2,4-D, du
génotype et du type d’explant. D’après le test SNK, 3,5 et 4 > 3 > 2, 2,5 et 5
> 1,5 mg/l de 2,4-D, ‘OumRabia’, ‘Anouar’ et ‘Sebou’ > ‘Ourgh’ > ‘Amjad’
et ‘Marzak’ et les demi-embryons donnent de meilleurs résultats que les
embryons.
Les pourcentages de germination des embryons et demi-embryons
varient également selon le génotype (Figure 4a et b). Ils sont les plus élevés
chez la variété Sebou (80 et 75 %) et faibles chez ‘Amjad’ et ‘Marzak’. Ils
atteignent 50 à 60 % pour les variétés Anouar, Ourgh et OumRabia.
105
Tableau III :
Analyse de la variance lors de la callogenèse d’embryons et de
demi-embryons de divers cultivars de Blé dur en présence de
différentes concentrations de 2,4-D.
Variables
considérées
Source de
variation
Concentration
en 2,4-D
F observé
Embryons matures
Embryons immatures
Nombre de Nombre
Masse
Nombre
Nombre
Masse
cals
d’explants fraîche des
de cals
d’explants fraîche des
germés
cals
germés
cals
31,99 ***
14,88 ***
196,42 ***
2,48 *
25,76 *** 125,78 ***
Génotype
30,76 ***
37,02 ***
38,88 ***
10,77 ***
3,77 *
4,40 *
Type
d’explant
29,22 ***
18,70 ***
-
0,05 ns
70,74 ***
-
ns: non significatif ; *** significatif à 1 ‰ ; * significatif à 5 %.
Par ailleurs, le taux de germination est généralement plus faible pour
les demi-embryons que pour les embryons entiers.
L’analyse statistique (Tableau III) met en évidence un effet très
hautement significatif de la concentration en 2,4-D et du génotype sur la
germination. D’après le test SNK, 5 > 4 > 3,5 > 3 > 1,5 > 2,5 > 2 mg/l de
2,4-D, ‘Amjad’ et ‘Marzak’ > ‘OumRabia’, ‘Anouar’ et ‘Ourgh’ > ‘Sebou’
et les demi-embryons donnent moins de germination que les embryons.
La croissance des cals des embryons matures est importante à 3,5 et
4 mg/l de 2,4-D (Figure 5).
L’analyse de la variance (Tableau III) montre un effet très hautement
significatif de la concentration en 2,4-D et du génotype sur la croissance des
cals. D’après le test SNK, 3,5 et 4 > 3 > 5 > 2,5 et 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D,
‘Ourgh’ et ‘Sebou’ > ‘OumRabia’ et ‘Anouar’ > ‘Amjad’ et Marzak pour la
croissance des cals.
106
Taux de croissance de la
matière fraîche des cals
3,5
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Amjad
Marzak
Oum Rabia
Sebou
Ourgh
Anouar
Variétés
Fig. 5 : Variation du taux de croissance des cals induits à partir
d’embryons matures de six variétés de Blé dur en fonction de la
concentration de 2,4-D après quatre semaines de culture
sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité.
Cas des embryons et demi-embryons immatures
1,5
2
2,5
3
3,5
4
110
110
100
90
80
70
60
50
Callogenèse (%)
Callogenèse (%)
Le taux de callogenèse des embryons et demi-embrons immatures
(Figure 6a et b) est élevé pour toutes les concentrations testées. Il est proche
de 100 % pour ‘Amjad’ et ‘Tomouh’ et de 80 % pour ‘Marzah’.
100
90
80
70
60
50
Amjad
Marzak
Tomouh
a - Embryons entiers
Amjad
Marzak Tomouh
b - Demi-embryons
Fig. 6 : Variation du taux de callogenèse d’embryons (a) et de demiembryons (b) immatures de trois cultivars de Blé dur en fonction de la
concentration de 2,4-D après deux semaines de culture
sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité.
107
L’analyse de la variance (Tableau II) révèle un effet significatif de la
concentration de 2,4-D et du génotype, mais pas pour le type d’explant.
D’après le test SNK, 3,5 > 4 > 1,5 et 3 > 2 > 2,5 mg/l de 2,4-D, ‘Tomouh’ et
‘Amjad’ > ‘Marzak’ pour l’induction de cals.
Les taux de germination après deux semaines de culture (Figure 7)
sont plus importants chez l’embryon entier que le demi-embryon. Les taux
les plus élevés (> 80 %) sont observés aux faibles concentrations. Le taux
est supérieur à 50 % avec l’embryon de la variété Tomouh. Les plus faibles
taux ont été observés à 3,5 mg/l avec le demi-embryon pour ‘Amjad’ et
‘Marzak’.
100
80
Callogenèse (%)
Callogenèse (%)
100
60
40
20
0
Amjad
Marzak
Tomouh
a - Embryons entiers
80
1,5
60
2
2,5
40
3
20
3,5
4
0
Amjad
Marzak
Tomouh
b - Demi-embryons
Fig. 7 : Variation du taux de germination d’embryons (a) et de demiembryons (b) immatures lors de la callogenèse de trois cultivars de Blé dur
en fonction de la concentration de 2,4-D après deux semaines de culture sur
le milieu MS à 25°C à l’obscurité.
L’analyse de la variance montre un effet très hautement significatif
de la concentration en 2,4-D et du type d’explant sur la germination
(Tableau III). D’après le test SNK, 4, 3,5 et 3 et 2,5 > 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D
et ‘Amjad’ et ‘Marzak’ > ‘Tomouh’.
Le taux de croissance de la masse de matière fraîche des cals après
deux semaines de culture augmente avec la concentration de 2,4-D
(Figure 8) et atteint 380 % à 3,5-4 mg/l. Ce taux de croissance reste
relativement important pour les autres concentrations à l’exception
d’1,5 mg/l.
108
Taux de croissance de la
matière fraîche des cals
L’analyse de la variance (Tableau III) a montré un effet très
hautement significatif de la concentration en 2,4-D sur la croissance du cal à
partir d’embryons immatures entiers. D’après le test SNK, 3,5 > 4 > 3 > 2,5
> 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D, ‘Marzak’ > ‘Amjad’ et ‘Tomouh’.
1,5
2
2,5
3
3,5
4
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Amjad
Marzak
Oum Rabia
Variétés
Fig. 8 : Variation du taux de croissance des cals de trois cultivars de Blé
dur en fonction de la concentration de 2,4-D après deux semaines de culture
sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Chez le Blé tendre, la callogenèse a été induite en présence du 2,4-D
seul
ou en combinaison avec une deuxième auxine, l’ANA [19]. Dans
cette étude, le 2,4-D seul a été suffisant pour l’induction et la croissance des
cals chez plusieurs variétés de Blé dur.
L’influence de la concentration en 2,4-D et des embryons ou demiembryons comme explants a été mise en évidence. Ainsi, les cals sont
induits à toutes les concentrations testées, avec un meilleur taux de
callogenèse à 3,5 et 4 mg/l. Dans d’autres travaux, des cals ont été obtenus à
des concentrations plus faibles de 2,4-D (1 mg/l chez le Blé tendre [7] ;
1,5 [2] ou 2 mg/l chez le Blé dur [12 ]) ou beaucoup plus élevées (6 et
8 mg/l [3]).
La croissance des cals a presque quadruplé à 3,5 et 4 mg/l de 2,4-D
alors que le taux de germination est faible.
L’utilisation d’embryons immatures a permis l’amélioration de la
callogenèse in vitro chez le Blé [11]. L’induction callogène chez les explants
immatures en seulement trois jours pourrait être due à la fragilité de leurs
structures membranaires permettant ainsi une pénétration rapide de l’auxine.
[17-18]
109
La pénétration pourrait aussi être favorisée en coupant l’embryon. Certains
auteurs estiment que le niveau endogène de régulateur de croissance
relativement important chez les embryons immatures explique la formation
rapide de cals surmontés souvent de jeunes pousses [10 ]. Le niveau de
phytohormones endogènes serait par contre très faible chez l’embryon
mature [16], ce qui est à mettre en rapport avec les dix jours d’incubation
nécessaires au déclenchement de la callogenèse.
Du présent travail, il ressort également que le problème de la
germination se pose beaucoup plus aux faibles concentrations de 2,4-D,
notamment pour les explants non sectionnés.
L’expression de la compétence morphogénétique in vitro est
complexe et influencée par des facteurs physiologiques et d’ordre génétique.
Ainsi, l’effet du cultivar a été significatif sur la formation du cal en accord
avec d’autres travaux [6] effectués sur le Blé dur.
En définitive, la callogenèse dépend du génotype, du type d’explant
et de la concentration en 2,4-D. Si l’embryon immature n’est disponible que
pendant une période très courte du cycle végétatif du Blé, son utilisation
permet une nette amélioration de l’aptitude à la callogenèse. La
fragmentation des explants embryonnaires améliore la callogenèse et évite
une germination.
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112
ABSTRACT
Importance of 2.4-D and embryonic explants for the callogenesis of
durum wheat
Explants of mature and immature entire and/or half embryos of
Moroccan durum wheat (Triticum durum) varieties were cultivated on MS
medium supplemented with various concentrations of 2.4-D.
For all of the varieties studied, the best average rate of growth was
recorded at 3.5 mg/l 2.4-D with very low germination rates.
The aptitude for callogenesis depended on the genotype and was
improved by the use of immature embryos and their fragmentation. At
3.5 mg 2.4-D, the average callogenesis rate reached 64 and 79% for mature
embryos and half embryos and 98 and 100% for immature embryos and half
embryos, respectively.
Key-words: 2.4-D, callogenesis, immature/mature embryos, Triticum
durum, wheat.
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