Diapositives présentées - Académie Nationale de Pharmacie

Des premières molécules d'origine
biotechnologique à la Biologie synthétique
Jean Weissenbach
(CEA/Institut de Génomique/Genoscope)
Académie de Pharmacie
18-05-2016
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
In the early days of chemistry fermentation is an easy way to the
production of some basic chemicals and pharmaceuticals
fermentation
purification (cristallisation, distillation)
-
Ethanol
Acetic Acid
Tartric Acid *
Lactic Acid *
Citric Acid (*)
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Lactic acid
*
1780 Discovery by Carl Wilhelm Scheele from sour milk
1856 Louis Pasteur establishes the role of Lactobacillus in its production by
fermentation
1873 Chemical structure established by Johannes Wisclicenus
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Lactic acid
Medical uses
- iron lactate against anemia and chlorosis used in 1839 in
France
- proposed by Emmanuel Merck in his product catalog in 1842
- zinc lactate Pharmacopoiea Saxonia 1867 against epilepsy
- Deutsches Arznei Buch (DAB) 1872 (first issue)
-
lactic acid (uses: digestion, diphteria, mouth waters, tooth cleaning)
iron and magnesium salts : magnesia lactica (mild laxative)
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Lactic acid
1881 First commercial production in the US (Avery company) based on a bona
fide microbial process, business stops in 1889
1893 Carl Krauch (Merck) reports a procedure to produce lactic acid using
fermentation of whey.
1895 The fermentation process becomes industrial at Boehringer Ingelheim for
technical grade lactic acid, using fermentation by Lactobacillus delbrueckii
The product has many uses in dyeing, leather, textile and food industry and
more recently poly-lactic acid, a biodegradable polymer (1981)
Boehringer becomes one of the first world leading biotech company and first
producer of lactic acid
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Lactic acid
Albert Boehringer, the
founder of the company
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Lactic acid
Both chemical and microbial processes competed during a long
time and are still competing.
The fermentation process accounts for 90% of the world
production presently.
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Citric acid
Citric acid first pure cristals obtained by Scheele in 1784
obtained from lemon juice.
Was probably known by the first alchemists
Found in the Pharmacopoeia of Baden 1841
Citric acid fermentation tanks in Pfizer's
Brooklyn facility, circa 1920s.
Courtesy Pfizer, Inc.
Production in 1929: 5000 metric tons
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Ephedrine precursor (~1930) (enantioselectivity, use of whole cells as
reactor)
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Early examples of biological procedures
for synthesis of pure chemicals
Acetone and n-butanol, Chaim Weizmann (1915)
using Clostridum acetobutylicum and cornstarch as C source
Citric acid, Currie (1923), Aspergillus niger
Ephedrine precursor (~1930) (enantioselectivity, use of whole cells as
reactor)
Biocatalytic step for ascorbic acid, Reichstein (1934)
Biocatalysis in cortisone production (Starting with progesterone and
combining a chemical step and an enzymatic 11-alpha- (or beta) hydroxylation
of the steroid ring structure the Upjohn company produces hydrocortisone
(regio and stereo specific reaction with an enzyme from Rhizopus or
Cunninghamella)
antibiotics, hormones, vitamins
Biological systems engineering
The beginning of the molecular era
In the 1940s: beginning of bacterial genetics
- DNA is identified as the support of genetic information
- Importance of strain selection
- Spontaneous mutants can be selected
- Mutagenic agents are being used
Biological systems engineering
The new biotechnology era (1)
In vitro recombination (1973)
DNA sequencing (1975)
Production of recombinant insulin in E coli (1978)
New methods for strain improvement
- improvement of selection methods
- molecular screening (70s)
- DNA synthesis (1983)
In vitro mutagenesis
- PCR (1985)
- protein engineering/site directed mutagenesis
- metabolic engineering
- directed evolution
Biological systems engineering
The new biotechnology era (2)
Complete genome sequences (1995-96)
Bioinformatics algorithms for sequence alignment and assembly (1990s-2000s)
Homologous recombination in higher eukaryotes (2000s)
Modeling metabolic networks and biological systems (2000s)
Improvements in directed evolution and protein engineering (1990s – 2000s)
Progress in DNA synthesis (2008)
Genome replacement (2007, 2010)
Dès 1978 Szybalski et Skalka prévoient
_"a new era of synthetic biology"_
appuyée sur la synthèse de molécules d'ADN inédites
conduisant à des combinaisons géniques avec des
fonctionnalités nouvelles
Definition of Synthetic Biology
Synthetic biology is the design and
engineering of biologically based parts,
novel devices and systems as well as the
redesign of existing, natural biological
systems.
It has the potential to deliver important new applications
and improve existing industrial processes.
(UK Synthetic Biology Roadmap)
Chemical Synthetic Biology
Luisi et al. FEBS Lett 2012
Conséquences de la génomique
- source illimitée de gènes (mais pas de fonctions)
- connaissance de génomes dans leur intégralité (modélisation)
- référence pour les autres analyses "omiques"
Electronics
Biology
Synthetic Biology
Gardner et al. Nature 2000
Elowitz & Leibler Nature 2000
Que peut-on regrouper sous le vocable de
Biologie Synthétique ?
Ingénieries :
- acides nucléiques (gènes, génomes, ADN recombinant)
- protéines
- circuits de contrôle de l'expression
- métabolisme
- processus biologiques
communications inter-cellulaires
interactions milieu extérieur
…
Ingénierie des acides nucléiques
Technologies de l'ADN recombinant
- clonage (années 70)
- modifications dirigées/aléatoires (1971-79)
- synthèse d'ADN jusqu'à génomes complets
- "chirurgie génomique" (nucléases) (depuis les années 90)
- génome minimal, brassage génomique (depuis la fin des
années 90)
- transplantation de génomes (années 2000)
Ingénierie à l’échelle du Génome
- Transplantation de génome
Transformation d'une espèce en une autre
Mycoplasma capricolum
+
40 M$
15 years
milieu de sélection
Mycoplasma mycoides
Venter et al. Science 2010
Ingénierie à l’échelle du Génome
Ingénierie à l’échelle du Génome
- Compatibilité entre les systèmes
Ingénierie à l’échelle du Génome
Compatibilité entre
les systèmes
90-94%
Lartigue et al.
Ingénierie à l’échelle du Génome
- Compatibilité entre les systèmes
- Réduction de génome/Génome minimal
Ingénierie à l’échelle du Génome
Réduction de génome
-
éviter le fardeau des séquences inutiles
-
séquences sans fonctions
-
fonctions inutiles
-
élements contraires au but
2013
Ingénierie à l’échelle du Génome
- Compatibilité entre les systèmes
- Réduction de génome/Génome minimal
- Dessine-moi un génome !
Ingénierie à l’échelle du Génome
- Compatibilité entre les systèmes
- Réduction de génome/Génome minimal
- Dessine-moi un génome !
-
Quels gènes ?
Comment les arranger entre eux ?
Comment les réguler ?
Comment prédire ou évaluer leur compatibilité ?
Ingénierie à l’échelle du Génome
- Compatibilité entre les systèmes
- Réduction de génome/Génome minimal
- Dessine-moi un génome !
James Collins
(2011)
Ingénierie à l’échelle du Génome
Carroll D. 2014
CRISPR/Cas citations
Results found:
Sum of Times Cited without self-citations :
Citing Articles without self-citations :
769
8963
3120
(16/03/2015)
Ingénierie des protéines
- mutagénèse et évolution dirigée/brassage
(shuffling)
- anticorps catalytiques
- fonction aléatoire non évoluée ("mRNA display")
- conception de novo
- extension du code (aminoacides non naturels)
Ingénierie des protéines
Faire du neuf : composer de nouvelles fonctions (enzymes)
-
ex nihilo
-
-
conception avec connaissances préalables
-
-
mRNA display
Conception assistée par ordinateur
Anticorps catalytiques
faire du neuf avec du vieux
-
Evolution dirigée (nombreux procédés)
“Redesign” rationnel (information structurale détaillée requise)
“Redesign” semi-rationnel (connaissance du site actif requise)
Le vieux renferme encore du neuf : 20% des familles de
domaines protéiques sont des "DUFs"
Conception de nouvelles fonctions
Conception assistée par ordinateur
- Diels-Alder cycloaddition
- proton transfer
- multistep retroaldol transformations
- hydrolysis of phosphotriesters (metalmediated)
- ….
kcat/KM très bas
Extension du code génétique
Isaacs FJ Nature 2015
Ingénierie métabolique
fermentation
N
bacteria
N
enzyme 1
P
P
N enzyme 1 B enzyme 2 C enzyme 3 D enzyme 4 E enzyme 5 P
Ingénierie métabolique
Dans le but d'optimiser des processus existants de production de molécules
(petites ou macro) ou de constructions génétiques ad hoc.
-
recrutement d'activités hétérologues pour améliorer les souches
- extension de voie métaboliques existantes
- transplantation de voies métaboliques hétérologues
- modification de l'ingestion et du flux métabolique de nutriments
-
redirection de flux métaboliques
- canaliser le flux vers la voie utile
- réduire les autres flux
- réduire d'autres activités
- agir sur la régulation de l'expression
Ingénierie métabolique
conception/optimisation de voies métaboliques
"pathway engineering/design"
fermentation
N
bacterie
P
N enzyme 1 B enzyme 2 C enzyme 3 D enzyme 4 E enzyme 5 P
Ingénierie métabolique
1,3-propanediol
Nakamura 2003
Biosynthèse du
cortisol dans la levure
Szczebara et al. Nature
Biotec.2003
1995
2000
2005
2010
2015
Acide artémisinique
dans E coli
Keasling et al. Nature.2003
Production commerciale
par fermentation d'acide
artémisinique cloné
Sanofi
Ingénierie des circuits de
régulation de l'expression
Ingénierie des circuits de
régulation de l'expression
circuits logiques
bascules
verrous
portes logiques
dispositifs de mémoire
dispositifs de comptage
"Ingénierie aléatoire"
Stephanopoulos, Curr Op Chem Biol 2008
Programming cells by
multiplex genome
engineering
and accelerated evolution
Harris H. Wang1,2,3*, Farren J. Isaacs1*, Peter A.
Carr4,5, Zachary Z. Sun6, George Xu6, Craig R.
Forest7& George M. Church1
NATURE 2009
"Ingénierie aléatoire"
Relaxing medium
Stressing medium
CLU (3 µM) + THY (3 µM)
CLU (3 µM)
"Ingénierie aléatoire"
Le pouvoir de prédiction reste limité en biologie
A ce jour la biologie synthétique est une ingénierie
essentiellement empirique
Cette approche empirique s'appuie sur des procédés
expérimentaux souvent massivement parallèles
développés durant les décennies récentes
Biologie synthétique pour quoi faire ?
Certaines propriétés des systèmes biologiques peuvent être
mises à profit
- énergie : récupération et stockage
- transformations chimiques
- reconnaissance de signaux
- logistique, ciblage et biodisponibilité (vecteurs etc.)
- mémoire/comptage