Identification morphologique et moléculaire d`espèces du genre

Identification morphologique et moléculaire d’espèces du
genre Trichoderma isolées de différents sols Tunisiens.
N. Sadfi-Zouaoui1*, M. Rouaissi2, B. Essghaier 1, M.R. Hajlaoui2, M.R. Hermosa3 et A. Boudabous1
1
. Laboratoire de Microorganismes et Biomolécules Actives, Faculté des Sciences de Tunis, Campus universitaire, 2092 Tunisie ;
. Laboratoire de Protection des Végétaux, Institut National de la Recherche Agronomique de Tunisie (INRAT) 2049 Ariana
Tunisie ;
3
. Département de Microbiologie et de Génétique, Université de Salamanque, 37002 Espagne.
2
RÉSUMÉ
Le genre Trichoderma renferme des espèces connues en tant qu’agents de lutte biologique contre les champignons
phytopathogènes et comme source d’enzymes et de métabolites d'intérêts industriels. Dans le but d’exploiter le potentiel
biologique des Trichoderma indigènes, une étude a été entreprise pour établir une large collection d’espèces résidentes
dans les sols du nord Tunisien. En se basant sur l’aspect des colonies et la morphologie des fructifications, une collection
de 150 isolats a été subdivisée en 5 groupes phénotypiques. Cette identification morphologique a été confirmée par des
analyses moléculaires basées sur le séquençage de la région ITS1 de l’ADN ribosomal. Le pouvoir antagoniste de ces
espèces est en cours d’évaluation contre les moisissures de post- récolte des fruits et des légumes.
Mots-clés : Trichoderma - sol – phénotype – analyse moléculaire
ABSTRACT
Trichoderma is the most fungal strain used as biological control agent in agriculture, besides its production of enzymes
and secondary metabolites of biotechnological interest. With an aim of exploiting the biological potential of local
Trichoderma strains, a study was undertaken to establish a broad collection of species resident in north Tunisian soils.
Based on the aspect of colonies and morphology of fructifications, a collection of 150 isolates was subdivided into 5
phenotypic groups. This morphological characterization was confirmed by a molecular analysis based on the sequencing
of the ITS1 region of the ribosomal DNA. The antagonistic potential of these species is in the course of evaluation against
the post-harvest moulds of fruits and vegetables.
Key-Words: Trichoderma - soil – phenotype – molecular analysis
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Introduction
Les Trichoderma spp. sont des champignons
cosmopolites, caractérisés par leur croissance
rapide, leur capacité d’utiliser divers substrats et
leur résistance à des agents chimiques nocifs (Klein
et Eveleigh, 1998). Ils constituent les éléments
prédominants de la mycoflore des sols de divers
écosystèmes (forêts, champs agricoles, prairies,
marécages, déserts, lacs salés ……) (Danielson et
Davey, 1973 ; Roiger et al., 1991 ; Smith, 1995 ;
cellulose des végétaux (Klein et Eveleigh, 1998). Le
genre Trichoderma renferme des espèces les plus
utilisées en tant qu’agents de lutte biologique
contre les phytopathogènes et comme source
d’enzymes et de métabolites secondaires d'intérêts
biotechnologique (Kubicek et Penttilä, 1998 ;
Sivasithamparam et Ghisalberti, 1998).
La majorité des espèces de Trichoderma sont
morphologiquement très semblables et difficiles à
distinguer et elles ont été confondues pendant de
nombreuses années à l’espèce T. viride. Les
méthodes
moléculaires,
basées
sur
le
polymorphismes des séquences de l’ADN et les
amplifications par PCR, se sont montrées très utiles
dans la caractérisation des isolats de ce genre, tant
dans des études d'identification (Hjeljord et
Tronsmo, 1998) que dans l'élaboration de
classifications phylogénétiques (Kullnig-Gradinger
et al., 2002).
------------------------------------------------------------------------------------* Correspondance : Dr. Najla SADFI ZOUAOUI, Laboratoire de
Microorganismes et Biomolécules Actives, Faculté des Sciences,
Campus universitaire, 2092 Tunis ; Tunisie, Tel : 216 -70-850
553 ; Fax: 216-71-885 480, E-mail: [email protected]
9
Les ADNr sont organisés en domaines d'unités
invariables répétées en tandem. Une unité est
constituée des trois plus grands gènes d'ARNr (18S,
5.8S, 28S) séparés par deux espaceurs internes
transcrits (ITS). Chaque unité est séparée d'une
autre unité par un espaceur intergénique non
transcrit (IGS) (Bruns et al., 1991 ; Henson et
French, 1993) (Fig. 1). On retrouve de 60 à 200
copies des répétitions en tandem par génome
haploïde chez les champignons (Bruns et al., 1991,
Yao et al., 1992). De grandes variations génétiques
sont trouvées dans les ITS car leur évolution est plus
rapide que les portions géniques. Les ITS
permettent de différencier les espèces à l'intérieur
d'un genre ou parmi une population (Henson et
French, 1993; White et al., 1990). L'analyse des ITS
de plusieurs espèces de champignons a permis de
conclure à la validité ou non de l'emploi des critères
morphologiques utilisés dans l’identification des
espèces et la classification des champignons.
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Fig. 1. Schéma de l’unité de transcription ribosomique de champignon.
A. Organisation en tandem des unités ribosomiques, B. Structure d’une unité ribosomique.
L'analyse des séquences de l’ADNr, y compris les
séquences des espaceurs internes transcrits (ITS),
ont été utiles dans des études taxonomiques de T.
longibrachiatum (Kuhls et al., 1997), T. harzianum
(Gams et Meyer, 1998), et de T. viride (Lieckfeldt et
al., 1999) ou de biotopes associés à la colonisation
de champignons cultivés (Belle et al., 1999 ;
Samuels et al., 2002).
La plupart des espèces connues de Trichoderma
ont été isolées d’Amérique du Nord, d’Europe
Centrale (Bissett, 1991 ; Wuczkowski et al., 2003),
de Sibérie et des Himalayas (Kulling et al., 2000),
d’Asie du Sud-Est (Kubicek et al., 2003), de Chine,
d’Egypte (Gherbaway et al., 2004), et d’Amérique
Centrale et du Sud (Druzhinina et al., 2005). Aucune
étude rapportant la diversité des espèces de
Trichoderma en Tunisie n’a été jusque là effectuée.
Dans le but d’identifier les espèces de Trichoderma
rencontrées en Tunisie, une collection de 150
isolats a été obtenue à partir de différents sols du
Nord tunisien et classée en espèces en se basant sur
des critères morphologiques et l’analyse des
séquences ITS.
MATERIELS ET METHODES
10
Echantillonnage et isolement
Une centaine d’échantillons ont été collectés de
différents écosystèmes de la Tunisie (sols forestiers,
sols agricoles, fruits d’arbres fruitiers et feuilles de
légumineuses). Chaque échantillon de sol (10g) a
été vigoureusement brassé avec 20 ml d’eau
distillée stérile afin de libérer les conidies et les
hyphes adhérant aux particules de sol. Une série de
dilution de 10-1 à 10-4 a été préparée pour chaque
suspension de sol. Une aliquote de 0.1 ml de
chaque dilution a été étalée sur les milieux PDA
(Potato dextrose agar, Difco) et MEA (Malt extract
agar, Difco) additionnés de 50 mg/l d’antibiotique
(ampicilline et streptomycine, Sigma). Les boites ont
été incubées à 25°C pendant 7 à 10 jours. Les
colonies de Trichoderma ont été purifiées suite à
des repiquages successifs sur milieu PDA.
Culture monosporale de Trichoderma
Une suspension sporale de chaque culture pure
de Trichoderma a été préparée après raclage des
spores en présence d’eau distillée stérile. Après une
série de dilutions et étalements sur milieu PDA puis
incubation pendant 48h à 25°C, les conidies
germées et visualisées au microscope ont été
repiquées individuellement, à l’aide d’une aiguille
sur milieu PDA et incubées pendant une semaine à
25°C. Un disque mycélien de 10 mm de diamètre de
chaque culture, dérivant d’un clone monospore, a
été ensemencé, sous hôte stérile, dans 100 ml de
milieu PDB (Potato-Dextrose-Broth, Difco) contenu
dans un Erlenmeyer de 250 ml. La culture liquide a
été ensuite incubée sous agitation à 110 rpm et
25°C pendant 7 à 10 j et le mycélium a été récupéré
par filtration et conservé à -20°C avant sa
lyophilisation.
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Extraction de l’ADN génomique
L’ADN total a été extrait selon la méthode CTAB
développée par Doyle et Doyle (1987). avec
quelques modifications. Une quantité d’environ 0, 1
g de mycélium lyophilisé a été broyé en présence de
l’azote liquide. Le broyat a été mis dans un
Eppendorf de 1,5 ml, auquel 700 µl de tampon de
lyse (CTAB, 2%) additionné de 0.2% (w/v) mercaptoéthanol ont été ajoutés. Le mélange a été
mis en incubation pendant 40 min à 65°C au bainmarie. Un volume égal de chloroforme alcoolisoamylique (24 :1) a été ajouté. Après
homogénéisation du mélange et centrifugation (10
min, 13000 rpm à + 4°C), le surnageant a été
récupérée (environ 500 µl) dans un nouveau
Eppendorf stérile. L’ADN a été précipité
sélectivement en présence d’un volume égal
d’isopropanol à froid additionné de 10 % d’acétate
de sodium (3M, pH 8). Après incubation pendant 1
nuit à + 4°C et centrifugation (12000 rpm, 10 min à
+ 4°C), le surnagent a été jeté et le culot d’ADN a
été rincé deux fois avec 500 µl d’éthanol 70%. Après
centrifugation (12000 rpm, 2 min à + 4°C), le culot a
été dissout dans 100 µl de tampon TE. L’ADN
dissout a été traité avec 3µl de RNase (100 µg/ml)
pendant 1h à 37°C.
L’ADN a été ensuite précipité dans 600 µl
d’éthanol absolu (conservé à – 20°C) en présence
de 30 µl d’acétate de sodium (3M, pH 8). Le culot a
été ensuite rincé avec 300 µl d’éthanol 70 % puis
séché sous la hotte pendant 2 h. L’ADN a été
ensuite repris dans 100 µl de TE puis conservé à 20°C.
Amplification de l’ADN par PCR et séquençage
La région ITS (Internal Transcribed Spacer) de
l’ADN ribosomique a été amplifiée avec des
amorces universelles ITS1 et ITS4 (White et al.,
1990).
ITS1: 5’-TCGGTAGGTGAACCTGCG G-3’
ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Protocole d’amplification
La réaction d’amplification a été réalisée dans un
volume réactionnel de 25 µl contenant 5 µl de
tampon coloré Taq DNA polymerase 10X (Promega),
1.5 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl dNTP(20 mM), 2 µl de
chacune des amorces (20 pmoles/µl), 0.25 µl de Taq
DNA polymerase (5U/µl) (Promega) et 11.25 µl de
H2O bidistillée stérile. Le mélange ou mix a été
réalisé pour le nombre total des isolats, puis réparti
à raison de 23 µl/tube. Deux µl d’ADN (50 ng/µl) ont
été ajoutés en dernier au mélange réactionnel.
La réaction d’amplification a été réalisée dans un
thermocycleur
(Biometra,
Allemagne).
Le
programme, de la PCR, établi a été composé d’une
pré-dénaturation à 95°C pendant 3 min suivie par
35 cycles consécutifs d’une dénaturation à 98°C
pendant 15 sec, d’une hybridation spécifique des
amorces à 59°C pendant 60 sec et d’une élongation
à 72°C pendant 2 min. Enfin une post-élongation à
72°C pendant 10 min.
Electrophorèse sur gel d’agarose
Un gel d’agarose à 1,5 % a été préparé avec un
tampon standard TBE 0,5× (4,5 mM Tris, 4,5 mM
d’acide borique et 1mM EDTA, pH 8) contenant 0,5
mg/ml de bromure d’éthidium. Cinq µl de
l’échantillon PCR a été mélangé avec 1 µl de
tampon de charge sur une feuille de parafilm. Les
échantillons et un marqueur de poids moléculaire
(100 pb) ont été chargés séparément dans les puits
du gel (moyen gel, cuve Eurogentec, Belgique).
L’électrophorèse a été effectuée à 100 V dans du
tampon TBE 0,5× pendant 40 min. Les produits
d’amplification ont été visualisés sous lumière UV,
grâce au bromure d’éthidium incorporé au part
avant dans le gel. Les photos ont été prises grâce à
un Gel doc de type Biorad.
Séquençage des ITS amplifiés
Les produits PCR (ITS amplifiés) ont été purifiés
TM
par centrifugation sur minicolonne (Wizard PCR
Preps DNA Purification System, Promega) selon le
protocole de la compagnie. Le séquençage a été
réalisé dans les deux directions avec les amorces
utilisées pour leur amplification dans un ABI 377
Prism sequencer automate (Applied Biosystems).
Analyse des séquences
Les séquences ont été initialement analysées en
utilisant le programme MegAlign inclus dans le
paquet informatique DNASTAR ; et, les alignements
des séquences ont été effectués en utilisant le
programme CLUSTALX 1.81 (Thompson et al., 1997).
Dans les alignements ont été incluses les
séquences, déposées dans des bases de données,
espèces ou génotypes représentants des différentes
sections du genre Trichoderma. Les analyses
phylogénétiques ont été effectuées avec le
programme PAUP (Phylogenetic Analysis Using
Parsimony, Version 4.0, UTILISE).
11
Résultats & Discussion
Tr. 1
Tr. 4
9,00
Tr. 2
Tr. 5
Tr. 3
Une collection de 150 isolats de Trichoderma
a été établie essentiellement à partir d’échantillons
de sol collectés de différents écosystèmes de la
Tunisie. Une identification préliminaire du genre a
été effectuée par l’analyse des caractères
morphologiques basés sur la vitesse de croissance
de la colonie (Fig. 2), la pigmentation et l’aspect du
conidiophore, des phialides et des conidies (Fig. 3,
4). Cette analyse a permis de subdiviser la collection
en 5 groupes phénotypiques.
Diamètre de la colonie (mm )
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
18h
24h
38h
44h
48h
Temps
Fig.2. Mesure de la croissance des colonies fongiques de
Trichoderma durant 48 h de culture sur milieu PDA
Fig. 3 Aspect macroscopique des colonies des isolats représentant les cinq groupes phénotypiques de Trichoderma.
(a): T. citrinoviride, (b): T. atroviride, (c): T. hamatum, (d): T. harzianum, (e): T. longibrachiatum
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Fig. 4 Aspect microscopique du mycélium (a), des spores (b) et des phialides (c) de Trichoderma spp.
Ces caractéristiques morphologiques n’étaient pas
suffisantes pour distinguer les espèces de
Trichoderma en raison des ressemblances
morphologiques des colonies et des fructifications.
Les travaux pionniers de Rifai (1969) ont proposé de
distribuer Trichoderma dans neuf ensembles
spécifiques alors que la révision du genre
Trichoderma par Bisset (1991) avait inclus plusieurs
anamorphes d’Hypocrea établissant ainsi cinq
nouvelles
sections,
parmi
lesquelles
correspondaient les ensembles déjà décris par Rifai.
Les données moléculaires dérivant de l’ADN et des
enzymes étaient très utiles pour une caractérisation
objective de Trichoderma comparativement aux
méthodes
classiques
(Lieckfeldt
et
Muthumeenakshi, 1998). L’étude moléculaire que
nous avions menée a concerné 48 souches de la
collection. L’amplification par PCR a montré une
12
seule bande d’environ 600 pb pour tous les isolats
de Trichoderma (Fig. 5). Les Trichoderma isolés ont
été identifiés au niveau de l’espèce grâce à l’analyse
des séquences ITS (ITS1). L’identité des isolats est
présentée au Tableau 1. Sept isolats de sol forestier
ont été identifiés comme appartenant à l’espèce T.
harzianum. Nos résultats sont en concordance avec
les travaux de Wuczkowski et al. (2003) montrant la
prédominance de T. harzianum en sol forestier.
Cette espèce est largement exploitée dans la lutte
biologique
contre
les
champignons
phytopathogènes à côté de Gliocladium virens et T.
viride (Papavizas, 1985 ; Samuels, 1996). T.
harzianum a été commercialisé sous forme de
biofongicide (Trichodex®) (Elad et al. 1995) et a
montré un grand pouvoir inhibiteur contre la
pourriture grise de la tomate (Utkhede et Mathur,
2002).
Tableau 1. Origine et identité des isolats de Trichoderma.
Origine
Isolat
Espèce
Rhizosphère de sol forestier
TNS 1, 2, 3, 4, 16, 17, 18
T. harzianum
TNS 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
T. longibrachiatum
TNS 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27
TNS 28, 29
TNS 30, 31, 32, 33, 34
T. atroviride
T. hamatum
Trichoderma spp.
TNS 35, 36
TNS 37, 38, 39, 40, 44, 41, 42, 43
T. hamatum
T. longibrachiatum
TNS 45, 47
TNS 46
TNS 48
T. citrinoviride
T. hamatum
T. viride
Rhizosphère de sol agricole
Arbres fruitiers
Fruits de citronnier
Fruits de pêcher
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Légumineuses
Feuilles de fève
Fig. 5. Séparation sur gel d’agarose (1.5%) des produits d’amplification par PCR de l’ADN des isolats de Trichoderma en
utilisant les amorces ITS1 et ITS4.
M: marqueur de poids moléculaire 100 pb, pistes 1-26 (isolats TNS1-TNS26); T: témoin négatif, pistes 27-48 (isolats
TNS27-TNS48).
TNS 1-18 (isolats de sol forestier); TNS 19-34 (isolats de sol agricole); TNS 35-44 (isolés sur fruits de citronnier et de
pêcher) et TNS 45-48 (isolés sur feuilles de fève)
L’espèce la plus dominante de la collection
appartient à T. longibrachiatum (37,5 %), isolée de
sol forestier et de fruits. Les souches issues de sol
agricole (vergers d’Agrumes) appartiennent à T.
atroviride et à T. hamatum. Trois souches
appartenant à T. citrinoviride, deux à T. hamatum et
une à T. viride ont été aussi isolées de feuilles et de
fruits pourris. L’arbre phylogénétique établi à partir
de l’analyse des séquences des 48 souches a montré
que l’ensemble des isolats sont distribués dans les
trois grandes sections de Trichoderma. Des 48
souches séquencées, 14.58 % (7 isolats) sont
classées dans la section Pachybasium, 31.25 % (15
isolats) dans la section Trichoderma et 43.75 % (21
isolats) dans la section Longibrachiatum (Fig. 6). Sept
isolats classés dans la section Pachybasium sont
groupés dans le complexe incluant T. inhamatum et
T. harzianum. Dans la section Trichoderma, 15
isolats sont inclus dans 3 groupes à savoir T.
hamatum, T. atroviride et T. viride et 18 isolats de
la section Longibrachiatum sont inclus dans les
13
groupes T. longibrachiatum et T. citrinoviride
(Hermosa et al., 2004).
Cette étude a en effet montré une diversité
importante des espèces de Trichoderma en Tunisie.
Les représentants des trois sections de Trichoderma
on été identifiés à partir de l’analyse de souches
issues essentiellement de sols forestiers et
agricoles. L’efficacité de ces souches contre des
pathogènes de post-récolte est en cours
d’évaluation. La collection locale sera élargie afin
d’inclure des isolats provenant d’autres niches
écologiques de plusieurs régions de la Tunisie.
Fig. 6. Phylogramme basé sur les séquences de la région ITS1 du gène ARNr démontrant la position phylogénétique des
48 isolats (TNS 1-46) à l’intérieur des sections établies de Trichoderma (T.) (Hermosa et al., 2004).
Remerciements
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Ces travaux ont bénéficié de fonds émanant du
Projet de Coopération Tuniso-Espgnole (n°
A/6826/06).
EladY., Gullino M.L., Shtienberg D., Aloi C., 1995. Managing
Botrytis cinerea on tomatoes in greenhouses in the
Mediterranean. Crop Protection 14: 105-109.
Gams W., Meyer. W., 1998. What exactly is Trichoderma
harzianum? Mycologia 90: 940-915.
Bisset J., 1991. A revision of the genus Trichoderma. III. Section
Pachybasium. Canadian Journal of Botany 69: 2373–2417.
Gerbawy Y., Druzhinina I., Shaban G.M., Wucskowsky M., Yaser
M., El-Naghy M.A., Prillinger H.J., Kubicek C.P. 2004
Trichoderma populations from alkaline agricultural soil in the
Nile Valley, Egypt consist of only two species. Mycological
Progress 3: 211-218.
Bruns T.D., White T.J., Taylor J.T., 1991. Fungal molecular
systematics. Annual Review of Ecology and Systematic 22: 525564.
Hawksworth D.L., 1991. The fungal dimension of biodiversity
magnitude, significance, and conservation. Mycological
Research 95: 641-655.
Danielson R.M., Davey D.E., 1973. The abundance of
Trichoderma propagules and the distribution of species in
forest soils. Soil Biology and Biochemistry 5: 486-494.
Henson J.M., French. R., 1993. The polymerase chain reaction
and plant disease diagnosis. Annual Review of Phytopathology
31:81-109.
Doyle J.J., Doyle J.L, 1987. A rapid DNA isolation procedure for
small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19:
11-15.
Hermosa M.R., Keck E.J., Chamorro I., Rubio M.B., Sanz L.,
Vizcaíno J.A., Grondona I. Monte E., 2004. Genetic variability
shown by a collection of biocontrol isolates of Trichoderma.
Mycological Research 108: 897-906
Bibliographie
Druzhinina I., Koptchinski A., komon M., Bisset J., Szakacs G.,
Kubicek C.P., 2005. An oligonucleotide barcode for species
identification in Hypocrea and Trichoderma. Fungal Genetics
and Biology 42: 813-828.
14
Hjeljord L., Tronsmo A, 1998. Trichoderma and Glicoladium in
biological control: an overview. In Trichoderma and
Glicoladium. Enzymes, biological control and commercial
applications, pp. 131-151.Taylor and Francis Ltd, London, UK,
Klein D., Eveleigh D.E., 1998. Ecology of Trichoderma In
Trichoderma and Glicoladium; Basic biology, taxonomy and
genetics, pp.57- 74. Taylor and Francis Ltd, London, UK.
Kubicek C.P., Bissett J., Druzhinina I., Kullnig-Gradinger C.,
Szakacs G., 2003. Genetic and metabolic diversity of
Trichoderma: a case on South-East Asian isolates. Fungal
Genetics and Biology 38: 310-319.
Kubicek C.P., Penttilä M.E., 1998. Regulation of production of
plant polysaccharide degrading enzyme by Trichoderma. In
Trichoderma and Glicoladium. Vol 2 Enzymes, biological
control and commercial applications, pp. 49-71. Taylor and
Francis Ltd, London.
Samuels G.J., Dodd S.L., Gams W., Castlebury L.A., Petrini O.,
2002. Trichoderma species associated with the green mold
epidemic of commercially grown Agaricus bisporus. Mycologia
94: 146-170.
Samuels G.J., 1996. Trichoderma: a review of biology and
systematics of the genus. Mycological research 100: 923-935.
Sivasithamparam K., Ghisalberti E.L., 1998. Seondary metabolism
in Trichoderma and Glicoladium. In Trichoderma and
Glicoladium. Basic biology, taxonomy and genetics, pp. 131191.Taylor and Francis Ltd, London.
Smith W.H., 1995. Forest occurrence of Trichoderma species:
emphasis
of
potential
organochlorine
(xenobiotic)
degradation. Ecotoxicol. Environmental Safety 32: 179-183
Kulling C.M., Szakas G., Kubicek C.P., 2000. Molecular
identification of Trichoderma species from Russia, Siberia and
the Himalaya. Mycological Research 104: 1117-1125.
Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins
D.G., 1997. The clustalX windows interface: flexible strategies
for multiple sequence alignment aided by quality analysis
tools. Nucleic Acids Research 24: 4876-4882.
Kulling-Gradinger C.M., Szakacs G. Kubicek C.P., 2002.
Phylogenetic and evolution of the genus Trichoderma: a
multigene approach. Mycological Research 155: 1-9.
Utkhede R.S., Mathur S., 2002. Biological control of stem canker
of greenhouse tomatoes caused by Botrytis cinerea. Canadian
Journal of Microbiology 48: 550-554.
Kuhls K., Lieckfeldt E., Samuels G.J., Meyer W., Kubicek C.P.,
Börner T. 1997. Revision of Trichoderma section
Longibrachiatum including related teleomorphs based on an
analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer
sequences. Mycologia 89: 442-460.
Wardle D.A., Parkinson S., Waller J.E. 1993. Interspecific
competitive interactions between pairs of fungal species in
natural substrates. Oecologia 94: 165-172.
Lieckfeldt E., Khuls K. Muthumeenakshi S., 1998. Molecular
taxonomy of Trichoderma and Glicoladium and their
teleomorphs. In Trichoderma and Glicoladium. Vol 1. basic
biology, Taxonomy and genetics, pp. 35-37. Taylor and
Francis, London.
Lieckfeldt E., Samuels G.J., Nirenberg HI., Petrini O., 1999. A
morphological and molecular perspective of Trichoderma
viride: is it one or two species. Applied and Environmental
Microbiology 65: 2418-2428.
Papavizas G.C., 1985. Trichoderma and Glicoladium: biology and
potential for biological control. Annual Review of
Phytopathology 23: 23-54.
White T.J., Bruns T., Lee S. Taylor J. 1990a. Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In
PCR protocols: a guide to methods and applications, pp. 315322. Academic Press, San Diego.
White, T., Bruns T., Lee S. & Taylor J. 1990b. Analysis of
phylogenetic relationships by amplification and direct
sequencing of ribosomal RNA genes tiré de PCR Protocols: A
guide to Methods and Applications. M. A. Innis, D. H. Gelfand,
J. J. Sninsky, T. J. White, eds. Academic Press. New York. USA.
pp 31 5-322.
Wuczkowski M., Druzhinina I., Gherbaway Y., Klug B., Prillinger
H., kubicek C.P. 2003. Species pattern and genetic diversity of
Trichoderma in a mid-European, primeval floodplain-forest.
Microbiological Research 158: 125-133.
Microbiol. Hyg. Alim.-Vol 20, N° 57 – Mars 2008
Yao C., Frederiksen R.A., Magill C.W., 1992. Length heterogeneity
Rifai M.A., 1969. A revision of the genus Trichoderma. Mycological Papers
in ITS2 and the rnethylation status of CCGG and GCGC sites in
116: 1-56.
the rRNA genes of the genus Peronosclerospora. Current
Roiger D.J., Jeffers S.N., Cladwell R.W., 1991. Occurrence of
Genetics 22:415-420.
Trichoderma species in apple orchard and woodland soils. Soil
Biology and Biochemistry 23: 353-359
15